JP5499270B2 - アフィニティー機能を有する多孔膜を製造する方法およびタンパク質を分離精製する方法 - Google Patents
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Description
(1)ポリマーと、ポリマーに対して親和性を有する有機液体と、アフィニティーリガンド及びこれに結合した疎水性鎖を有する有機化合物と、を含有し、ポリマーの濃度が高い濃厚相と、濃厚相よりもポリマーの濃度が低い希薄相とに相分離している相分離混合物を形成させる工程を備える、多孔膜を製造する方法。
(2)疎水性鎖がオレイン酸に由来する基である、(1)の方法。
(3)アフィニティーリガンドがニトリロ三酢酸に由来する基である、(1)又は(2)の方法。
(4)有機化合物のポリマーに対する質量比が、0.05〜0.1である(1)〜(3)のいずれかの方法。
(5)ポリマーがセルロース誘導体である(1)〜(4)のいずれかの方法。
(6)(1)〜(5)のいずれかの方法によって得ることのできる多孔膜を用いたろ過により、目的タンパク質を分離精製する方法。
(7)目的タンパク質がヒスチジン残基を末端に有するタンパク質である(6)の方法。
本実施形態に係る方法は、ポリマーと、ポリマーに対して親和性を有する有機液体と、アフィニティーリガンド及びこれに結合した疎水性鎖を有する有機化合物(以下場合により「リガンド化合物」という。)と、を含有し、ポリマーの濃度が高い濃厚相と、濃厚相よりもポリマーの濃度が低い希薄相とに相分離している相分離混合物を形成させる工程と、相分離混合物から、ポリマーが細孔を形成している多孔質膜を形成させる工程と、を備える。
本実施形態に係るアフィニティー機能を有する多孔膜を用いて、目的タンパク質を分離精製することができる。以下、分離精製方法に関して詳細に説明する。
(リガンド及びこれに結合した疎水性鎖を有する有機化合物の合成:AB−NTA化合物)
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)1mLに、1mmolのオレイン酸、1mmolのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、及び1.1mmolのN,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)を混合し、40℃で20時間反応を進行させて、NHSエステル化オレイン酸を得た。得られたNHSエステル化オレイン酸0.11mmol、0.1mmolのアミノブチルニトリロトリアセテート(AB−NTA)、DMF470μL、トリエチルアミン200μL及び水30μLを混合し、混合物を40℃で20時間攪拌し、反応を進行させた。反応生成物の分子量をマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI−TOF MS法)により測定し、反応生成物中に含まる結合をNMR法により同定し、さらに、反応生成物の元素分析を質量分析法(CHN定量法)により行った。その結果、反応生成物は、ニトリロ三酢酸に由来するリガンドと、リガンドに結合した、オレイン酸に由来する疎水性鎖とを有する有機化合物(AB−NTA化合物)であることが確認された。
セルロースアセテート(20質量%)及びAB−NTA化合物(1質量%)を、有機液体であるトリエチレングリコール(79質量%)に150℃にて溶解し、均一なポリマー溶液(製膜原液)を得た。このポリマー溶液を加熱したホットステージ上に置いたガラス板に塗布し、塗布されたポリマー溶液の上からガラス板を被せた。その後、室温雰囲気下で徐冷することによりポリマー溶液を固化させて、相分離混合物であるポリマー薄膜を形成させた。得られたポリマー薄膜を水で洗浄することにより、膜中に残留するトリエチレングリコールを除去し、薄膜状の多孔膜を得た。得られた多孔膜の表面、裏面及び断面をFE−SEMを用いて観察したところ、400nm程度の孔径を有する細孔がセルロースアセテートによって形成されていることが確認された。
上記で作成した、リガンドを有するAB−NTA化合物が固定化された多孔膜から、直径25mmの円形のサンプルを切り出した。サンプルを0.1Mの硫酸ニッケル水溶液に2時間浸漬し、その後、純水洗浄により余分な硫酸ニッケルを除去し、ニッケルとAB−NTAの錯体を形成させた。次に、50mMのエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩に2時間浸漬することにより、AB−NTA化合物と錯形成していたニッケルを遊離させ、遊離したニッケルをCIP発光分光分析装置を用いて分析した。その結果、1.2×10−4mmolのニッケルが観測され、タンパク質の分離精製に十分な量のAB−NTA化合物を固定化できたことが確認された。
目的タンパク質としての、ヒスチジン残基(His−tag)をN末端に有するenhanced green fluorescence protein(His−tag EGFP)と、不純物タンパク質としての(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate)-BSA(TRITC−BSA)とを含む混合液からの、上記の多孔膜を用いた目的タンパク質の分離精製を、下記(1)〜(6)の操作に従って行った。直径25mmの円形に切り出された多孔膜をホルダーにセットし、このホルダーをシリンダーに取り付け、ろ過を行った。
(1)多孔膜の洗浄:多孔膜に脱イオン水10mLを通水することにより、多孔膜を洗浄した。
(2)金属イオンの添加:0.1Mの硫酸ニッケル溶液5mLを多孔膜に通水し、Ni(II)とAB−NTA化合物との錯体を形成させた。
(3)多孔膜の洗浄:脱イオン水10mLを通水することにより多孔膜を洗浄した後、pH7.4のリン酸緩衝液(20mMのリン酸緩衝液及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む混合水溶液)10mLを通水し、多孔質膜のコンディショニングを行った。
(4)目的タンパク質及び不純物タンパク質の添加:0.04mg/mLのHis−tag EGFPと、1mg/mLのTRITC−BSAとを含む混合液2mLを、多孔膜に通液した。原液中のタンパク質の質量(以下「原液画分」という。)と、ろ過液中のタンパク質の質量(以下「非吸着画分」という。)とを、混合液中のHis−tag EGFP及びTRITC−BSAの濃度を蛍光測定(励起波長:488nm、蛍光波長:510nm)することにより求めた。結果を図2に示した。His−tag EGFPの原液画分は90μgであり、TRITC−BSAの原液画分は2000μgであった。His−tag EGFPの非吸着画分は3μgであり、TRITC−BSAの非吸着画分は1200μgであった。目的タンパク質であるHis−tag EGFPの95質量%以上が多孔膜中に固定化できた。一方、不純物タンパク質であるTRITC−BSAの約60質量%が多孔膜に吸着せずに透過した。
(5)多孔膜の洗浄:多孔膜にリン酸緩衝液10mLを通水することにより、多孔膜を洗浄した。このときのろ過液中のタンパク質の質量(以下「素通り画分」という。)は、His−tag EGFPが25μgであり、TRITC−BSAが700μgであった。不純物タンパク質であるTRITC−BSAは、上記の非吸着画分と素通り画分を合わせると95質量%以上が多孔膜に吸着されずに多孔膜を透過し、非特異的な吸着が抑制できることが確認された。一方、洗浄の際に溶出したHis−tag EGFPは、主に、ホルダー又はシリンダー中に残留した成分である。
(6)目的タンパク質の溶出:多孔膜にpH7.4の溶出緩衝液(20mMのリン酸緩衝液、0.5Mの塩化ナトリウム及び500mMのイミダゾールを含む混合液)10mLを通液し、目的タンパク質を溶出した。得られたろ過液中のタンパク質の質量(以下「溶出画分」という。)は、目的タンパク質であるHis−tag EGFPが45μg(9.2μg/cm2)であり、不純物タンパク質であるTRITC−BSAは0であった。
実施例1で作成した多孔膜を用い、手順(4)においてHis−tag EGFPの発現を誘導させた大腸菌の破砕物が共存するHis−tag EGFP溶液を、濃度0.04mg/mLで2mLろ過したこと以外は、実施例1の(タンパク質の分離精製)の手順に従い、てHis−tag EGFPの分離精製を行った。結果を図3に示した。His−tag EGFPが35μg回収された。得られたろ過液の純度を確認するため、電気泳動法(SDS−PAGE)により、原液中およびろ過液中の成分の分析を行った。その結果、原液中には不純物タンパク質に由来する多数のバンドが確認されたが、ろ過液中には、His−tag EGFPに由来する分子量43000のバンドのみが観測された。得られたろ過液は清澄であり、大腸菌の破砕物の除去も同時に行うことができた。この様に、アフィニティー機能を有する多孔膜によれば、大腸菌の破砕物を予め前処理で分離することなく、一段のプロセスの分離精製により、高純度の目的タンパク質を回収できることが示された。
実施例1の(アフィニティー機能を有する多孔膜の製造)と同様の操作において、セルロースジアセテートに対するAB−NTA化合物の質量の比率を0〜0.1の範囲で変化させ、薄膜状の多孔膜を得た。さらに、得られた種々の量のAB−NTA化合物を含有する多孔膜を用い、実施例1に記載の(タンパク質の分離精製)の手順に従って、0.04mg/mLのHis−tag EGFP溶液2mLをろ過し、His−tag EGFPが多孔膜に捕捉された量を調べた。得られた結果を図4に示した。その結果、AB−NTA化合物の比率が0.05〜0.1の範囲でHis−tag EGFPの捕捉量は飽和した。
Claims (4)
- ポリマーと、前記ポリマーに対して親和性を有する有機液体と、アフィニティーリガンド及びこれに結合した疎水性鎖を有する有機化合物と、を含有し、前記ポリマーの濃度が高い濃厚相と、前記濃厚相よりも前記ポリマーの濃度が低い希薄相とに相分離している相分離混合物を形成させる工程を備え、
前記疎水性鎖がオレイン酸に由来する基であり、
前記アフィニティーリガンドがニトリロ三酢酸に由来する基であり、
前記ポリマーがセルロース誘導体である、多孔膜を製造する方法。 - 前記有機化合物の前記ポリマーに対する質量比が、0.05〜0.1である請求項1記載の多孔膜を製造する方法。
- 請求項1又は2記載の多孔膜を製造する方法によって得ることのできる多孔膜を用いたろ過により、目的タンパク質を分離精製する方法。
- 前記目的タンパク質がヒスチジン残基を末端に有するタンパク質である請求項3記載の目的タンパク質を分離精製する方法。
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