JP5496669B2 - リンパ除去化合物、および抗原配列を含みかつプロフェッショナル抗原提示細胞をターゲットとする分子を含んでなる、特異的ctl応答を誘発する組成物 - Google Patents
リンパ除去化合物、および抗原配列を含みかつプロフェッショナル抗原提示細胞をターゲットとする分子を含んでなる、特異的ctl応答を誘発する組成物 Download PDFInfo
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Description
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、該分子が上記T細胞エピトープと関連しているもの、および
所望におり、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物に関する。
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、感染性疾患病原因子由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる医薬組成物に関する。
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物に関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
少なくとも1つのT細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなるプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に対して選択的親和性を有する分子
を、それを必要とする哺乳類に投与することを含んでなる方法に関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原を有する分子を含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、方法に関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物、
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープと関連しているかまたはそれぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原と関連している分子、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる組成物に関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原を有する少なくとも1つのT細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物
を含んでなる上記キットに関する。
上記感染症の原因である病原因子が少なくとも一つのT細胞エピトープを含む特異抗原を発現し、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記感染症の原因である上記病原因子に特異的な上記抗原を含んでなる少なくとも1つの上記T細胞エピトープまたは上記抗原に含まれる少なくとも1つのT細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子
を含んでなる組成物を、
それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
腫瘍細胞がヒトCEAタンパク質を発現し、
リンパ球減少症を誘発するウサギまたはウマポリクローナル抗リンパ球または抗胸腺細胞抗体(ATG)を含んでなる組成物、およびさらに、
ヒトCEAタンパク質のA3-B3領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
腫瘍細胞がHPVのE7癌遺伝子を発現し、
リンパ球減少症を誘発するウサギまたはウマポリクローナルATGを含んでなる組成物、およびさらに
HPV由来のE7癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
1. APC上のCD11b結合モティーフについて削除されたCyaAベクターは、もはやAPCをターゲットとせず、CyaAベクターより活性が低いだけでなく、試験動物に免疫涸渇化合物を先験的に投与したときには、挿入された異種抗原(CEAA3B3)に対する免疫応答の誘発を測定可能に向上させない: ワクチンのCD11bターゲッティング機能による増強、
2. APCに選択的親和性を有する分子を持たないCpGまたはポリICLCまたはモノホスホリルAで補強したCEA抗原は、免疫原性を検出するのに用いた手法によってはCEAに対する有意な免疫応答を誘発する。対照的に、試験動物に免疫涸渇化合物を先験的に投与したときには、異種抗原(CEA)に対する免疫応答の誘発は測定可能に向上しない: 特異細胞をターゲッティングしないアジュバントによる無増強、
3. 本発明者らは、類似の免疫増強をHsp65とCEAA3B3との融合タンパク質によって得ることができることを示唆している予備的証拠を有している。CEAA3B3を有するHsp65タンパク質ベクターは、表面上でトル様受容体(TLR4)を認識することによってAPCをターゲットとする: ワクチンのAPCターゲッティング機能による増強により引き出すことができる。
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記T細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物。
好ましい態様によれば、哺乳類はヒトである。
患者の感染性疾患の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための配合製剤としての、医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、感染性疾患病原因子由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物に関する。
それぞれ患者の細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための配合製剤としての、医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物にも関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなるもの
を、それを必要とする哺乳類に投与することを含んでなる方法に関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の抗原を有する少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
本発明によれば、上記哺乳類患者はヒトであってもよい。
リンパ球減少症を誘発する化合物、
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記T細胞エピトープと関連しているかまたはそれぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原と関連している分子、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、上記組成物に関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子、または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の抗原を有する少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物
を含んでなる、上記キットに関する。
本発明によれば、医薬組成物またはキットはワクチンであってもよい。
癌胎児性抗原(CEA)、特にA3-B3領域、MAGE-A3、TERT、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のE7癌遺伝子、およびP53のものからなる群から選択される腫瘍抗原由来のT細胞エピトープ、および
HPV、HIV、HBV、HCV、トラコーマクラミジアおよびヒト結核菌からなる群から選択される感染性病原因子由来のT細胞エピトープ
からなる群から選択される。
腫瘍細胞が特異的腫瘍関連抗原を発現し、上記腫瘍関連抗原はT細胞エピトープを提示し、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記腫瘍に特異的な上記腫瘍関連抗原または上記腫瘍関連抗原に含まれる上記T細胞エピトープを含んでなる、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる、分子
を含んでなる組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、上記方法に関する。
腫瘍細胞が特異的腫瘍関連抗原を発現し、上記腫瘍関連抗原はT細胞エピトープを提示し、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記腫瘍に特異的な上記腫瘍関連抗原または上記腫瘍関連抗原に含まれる上記T細胞エピトープを含んでなる、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる、分子
を含んでなる組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、上記方法にも関する。
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記感染症の上記病原因子に特異的な上記抗原または上記抗原に含まれる少なくとも一つのT細胞エピトープを含んでなる、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる、分子
を含んでなる組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、上記方法に関する。
腫瘍細胞がCEAを発現し、
リンパ球減少症を誘発する化合物ATGを含んでなる組成物、および続いて
CEAタンパク質のA3-B3領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
腫瘍細胞がHPVのE7癌遺伝子を発現し、
リンパ球減少症を誘発するウサギまたはウマポリクローナルATGを含んでなる組成物、および続いて
HPV由来のE7癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
腫瘍抗原、優先的にはCEA、E7、MAGE-A3、TERTおよびP53ポリペプチド配列であって、それぞれが独立してAPCターゲッティングワクチンベクター、優先的にはアデニル酸シクラーゼ(CyaA)ベクター、熱ショックタンパク質ベクター(Hsp65)、志賀毒素、またはLAG-3のようなAPCリガンド配列を含む組換えタンパク質ベクターのような組換えタンパク質ベクターに一緒に挿入されるものを特異的に発現する悪性または新生物性細胞にターゲットを絞った癌の改良した適応免疫療法。
感染性疾患病原因子、優先的にはウイルス、特にHPV、HIV、HBVおよびHCVまたはトラコーマクラミジア、ヒト結核菌のような細胞内細菌の抗原であって、APCターゲッティングワクチンベクター、優先的にはCyaAベクター、または熱ショックタンパク質(hsp)、志賀毒素またはLAG-3のようなAPCリガンド配列を含む組換えタンパク質ベクターに挿入されるものを特異的に発現する患者の感染細胞にターゲットを絞った潜伏性または慢性の感染性疾患の改良した適応免疫療法。 改良したワクチンs comprising an CyaA、Hsp65、Hsp70、志賀毒素、LAG-3、抗原配列 好ましくは、CEA、E7、MAGE-A3、TERT、P53、HPV、HIV、HBV、HCV、トラコーマクラミジア、ヒト結核菌由来のものなどのAPCターゲッティングベクターを含んでなり、ベクターおよびフルダラビン、ATGのような免疫涸渇分子に結合または挿入されることにより、免疫涸渇成分を他の成分の前に、または同時に、その場で混合して患者に優先的に投与する改良ワクチン。
この実施例は、百日咳菌アデニル酸シクラーゼに基づくプライムブースト免疫療法前のリンパ除去法のネズミモデルにおける使用に関する。低用量のウサギ抗胸腺細胞グロブリンまたはフルダラビンによって送達される免疫抑制は一過性であり、免疫療法による治療時に抗原特異的T細胞が一層高頻度で誘発された。これは、目的の抗原を発現する侵襲性腫瘍細胞の増殖を制御/拒絶するマウスの一層高い能力と相関した。この方法は、癌または他の感染性疾患におけるこのベクターの治療潜在能力を向上させるための新たな可能性を示している。
1.1.1 マウス、細胞系
特異的病原体のない6-10週齢の雌C57BL/6マウスは、CER Janvier (Le Gesnet St-IsIe,フランス)から入手した。動物を含む実験は、動物ケアのガイドラインに準じて行った。免疫抑制治療薬はip投与し、腫瘍細胞はscで、免疫はiv (後眼窩)および耳の真皮にidで投与した。血液採取は、尾からの放血によって行った。脾臓摘出およびリンパ節採取は、屠殺した動物で行った(CO2)。腋窩、腸間膜および鼠蹊リンパ節を採取して表現型判別(phenotyping)分析用にプールした。
血液、リンパ節細胞および脾臓細胞を、計数用の上記方法(28, 29)およびフローサイトメトリー補助表現型判別に準じて処理した。血液リンパ球は、トルコブルーを用いて計数した。
マウスATGは、6週齢C57BL/6マウスで採取した5x108個の胸腺細胞をウサギにsc投与することによって調製した。この免疫を、14日後に同一材料をiv投与することによってブーストした。7日後に、動物から採血し、血清IgGを固定タンパク質Gカラム(Pierce)上で精製した。純度はSDS PAGE分析によって管理し、既知濃度のウサギIgGを標準として用いるBradford法によって量を評価した。ウサギATGを20mg/kgの濃度で用い、単回投与した。コントロールとしては、正常なウサギ血清を用いた。
フルダラビン(Sigma)を200mg/kg/日の濃度で6日間連続で用いた。モノクローナル抗体である抗CD4-APC、抗CD8-PerCP、抗B220-FITCおよび抗IFN-γ-FITCは、BD Biosciencesから入手した。
この項目で用いた組換えアデニル酸シクラーゼを、酵素的に不活性なCyaAをコードするプラスミドpkTRAC-HPV16E7Δ30-42の誘導体を用いて大腸菌で発現させた(21)。
組換えCEAA3B3タンパク質の産生および精製
CEAA3B3タンパク質をコードする大腸菌で最適化したcDNAを、プライマーCEA7 (配列番号:7: 5'-gcggccgcaccatcaccgtctctgcg-3')とCEA8 (配列番号:8: 5'-cccgctcgagggcacccgcagacagacc-3')でPCR増幅した後、NotIとXhoI制限部位の間のpTriEx-1.1ハイグロベクター(Novagen)にサブクローニングした。生成するプラスミドを、大腸菌BL21λDE3株(Novagen)に形質転換した。His-Tag-CEAA3B3タンパク質を0.5ミリモルのイソプロピル-h-D-チオガラクトピラノシド(Euromedex)で誘導することによって発現させ、Ni-NTAアガロース(Qiagen)上で精製した。イソプロパノール洗浄液を用いて、リポ多糖類混入物を除去した。
脾臓細胞を、完全CEAA3B3ペプスキャンプールの存在下(または非存在下)にてイン・ビトロで36時間刺激した。1時間インキュベーションした後、ブレフェルジン-Aを加えた。細胞をFACSPerm2 (BD Biosciences)を用いて透過性にし、モノクローナル抗体である抗CD4-APC、抗CD8-PerCPおよび抗IFN-γ-FITCで染色した。細胞をFACScalibur(登録商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて分析し、サイトカイン分泌細胞を、CD4+またはCD8+細胞上での最初のゲーティングの後に測定した。
1.2.1 精製組換えタンパク質のSDS PAGE分析
CyaAベクターがCEA特異的T細胞応答を誘発する能力を検討するため、CEA分子のA3およびB3ドメインを含む3種類の異なる組換え分子を構築した。このCEAの領域は、多くのヒトCTLおよびヘルパーエピトープ(32)並びに現在までのところ記載されている2種類のH-2b制限エピトープ(33, 34)を含むことが示されている。イン・ビトロおよびイン・ビボ分析法を可能にするため、構築物を大腸菌に産生させ、均質になるまで精製した(図1)。リポ多糖類除去処置を精製プロトコル(21)に導入し、1mg当たり内毒素を<300単位含む組換えタンパク質を得た(データーは示さず)。
従来の研究は、目的の抗原を有する組換えCyaAが異なる投与経路によりTh1型の細胞性T細胞応答を誘発することができることを示している(21, 35)。本発明者らは、プライムブースト法により異なる投与経路を組み合わせることによって、細胞性免疫応答の大きさを増加させることができるかどうかを検討した。図2に示されるように、IFN-γを分泌するCEA特異的CD4+およびCD8+脾臓細胞の頻度は、CEA組換えタンパク質50μgを1回静脈内(iv)投与後には既にかなり高かった。注目すべきことには、CD11bとの相互作用ドメインを欠いているCyaAΔ-CEAA3B3は、実質的にそのベクター能を喪失したことである。対照的に、アジュバント(CpG)を用いて処方したCEAA3B3タンパク質は、Th1型の細胞性免疫応答を発生することができた。CEA特異的IL-5 CD4+T細胞は、CyaAΔ-CEAA3B3で免疫したマウス由来の秘蔵細胞のみで有意な量で検出された(データーは示さず)。
ウサギATGは、現在では極めて長い間固形臓器移植に用いられているポリクローナルIgGである。サルで行った研究から、用量依存性のリンパ球涸渇がウサギATGで達成することができることが明らかになった(28)。フルダラビンは、慢性のリンパ性白血病の治療に一般に用いられているアデニンのフッ素化類似体である(39)。フルダラビンはリンパ球減少症を引き起こし、Bリンパ球より顕著にTリンパ球を涸渇させる(40)。
血液コンパートメントは、身体のリンパ質量全体の1-2%に過ぎない。免疫抑制開始の10日後に、TおよびB細胞、脾臓およびリンパ節についての表現型によるリンパ球涸渇を測定した。血液コンパートメントにおける状況と同様に、ATGおよびフルダラビンに基づく免疫抑制療法はリンパ様臓器におけるTリンパ球プールの涸渇を誘発した(表1)。
次に、上記条件で行われるリンパ涸渇によりその免疫モデルにおけるCEA特異的T細胞応答の大きさを増加させることができるかどうかを検討した。プライム-ブースト免疫(50μg ivおよび7日後に10μg id)の10日前に、動物に上記のようにATGまたはフルダラビンを投与した。コントロールと比較して、 the magnitude ofCyaA-CEAA3B3で免疫したATGおよびフルダラビン投与動物ではCEA特異的細胞性免疫応答の大きさが顕著に増加した。実際に、図4は、IFN-γを分泌するCEA特異的CD4+およびCD8+ T細胞の頻度がリンパ除去前処理を受けた動物では二倍になったことを示している。このような効果はCyaAΔ-CEAA3B3で免疫した動物では見られなかったので、CyaAに基づく療法についてのCD11bターゲッティングの重要性が際立った。注目すべきことには、CEAA3B3+CpG免疫によって、前リンパ涸渇によりIFN-γを分泌するCEA特異的CD4+ T細胞の頻度が著しく増加したが、この効果はCEA特異的CD8+ T細胞については見られなかった。
次に、この観察の関連性を、腫瘍拒絶モデルで試験した。本発明者らは、CEAタンパク質を安定に発現するB16細胞を確立した。2x104個の腫瘍細胞を投与したところ、総ての模造品およびCyaAΔ-CEAA3B3投与動物は腫瘍を発現し、瀕死状態になり、安楽死の必要があった(図5)。これらの条件では、動物の生存メジアン値はそれぞれ15および17日であった。対照的に、腫瘍投与の3日後にCyaA-CEAA3B3およびCEAA3B3+CpGで免疫した動物は、生存メジアン値が高くなった(それぞれ、35および33日)。これらの動物の少数には、B16F0CEA-GFP細胞投与の50日後に腫瘍が見られなかった(図5A)。ATGまたはフルダラビンによるリンパ涸渇の際には、CyaA-CEAA3B3投与マウスの生存メジアン値はそれぞれ45および41日に高まったが、CEAA3B3+CpGで免疫した動物のそれは変化が見られなかった。腫瘍がないままの動物の割合は、変化がなかった。図5Bに示されるように、腫瘍をCyaA-CEAA3B3による治療免疫前5日間増殖させた動物は、コントロールと比較してリンパ涸渇時の生存数が劇的に増加した。実際に、この設定では、CyaA-CEAA3B3およびCEAA3B3+CpG投与マウスの生存メジアン値はそれぞれ27および23日に減少し、腫瘍を持たないままの動物は50日目には見られなかった。リンパ涸渇は、CEAA3B3+CpGで免疫したマウスの生存メジアン値に効果がなかった。対照的に、ATGまたはフルダラビン投与動物の生存数は、CyaA-CEAA3B3で免役することによって劇的に増加し、50日無腫瘍はそれぞれ80%および60%にまで増加した。
細胞に基づく養子腫瘍免疫療法の分野において、多くの問題が前臨床の結果の臨床への移行を妨げている。それらの1つは、目的とする腫瘍関連抗原に対して誘導された養子応答の大きさである。実際に、ヒトでは、抗原特異的T細胞の増殖および効力は、腫瘍発生に関する多数の要因によって限定されている。これらには、TAAに対して高親和性を有するT細胞クローンの誘導の欠如、調節細胞からのネガティブシグナル、腫瘍ストロマおよび恒常的T細胞調節が挙げられる。養子T細胞導入療法のネズミモデルでは、リンパ涸渇は導入細胞の移植および持続性を増加させることが示されている(43-46)。このような手法は、ごく最近臨床へ極めて良好に移行されている(36-38)。特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答を誘発する強力な手段である百日咳菌由来のアデニル酸シクラーゼを用いて、特異的T細胞応答の誘発を目的とする能動免疫に対するリンパ涸渇の影響を測定する方法が検討されてきた。多くの種類の癌でのその過剰発現により、癌胎児性抗原をターゲットとすることが選択されてきた。
2.1 材料および方法
2.1.1 マウス、細胞系
特異的病原体のない6-10週齢の雌C57BL/6マウスは、CER Janvier (Le Gesnet St-IsIe,フランス)から入手した。動物を含む実験は、動物ケアのガイドラインに準じて行った。免疫抑制治療薬はip投与し、腫瘍細胞はscで、免疫はiv (後眼窩)および耳の真皮にidで投与した。血液採取は、尾からの放血によって行った。脾臓摘出およびリンパ節採取は、屠殺した動物で行った(CO2)。上顎リンパ節を採取して表現型判別(phenotyping)分析用にプールした。
血液、リンパ節細胞および脾臓細胞を、計数用の上記方法(28, 29)およびフローサイトメトリー補助表現型判別に準じて処理した。血液リンパ球は、トリパンブルーを用いて計数した。
マウスATGは、6週齢C57BL/6マウスで採取した5x108個の胸腺細胞をウサギにsc投与することによって調製した。この免疫を、14日後に同一材料をiv投与することによってブーストした。7日後に、動物から採血し、血清IgGを固定タンパク質Gカラム(Pierce)上で精製した。純度はSDS PAGE分析によって管理し、既知濃度のウサギIgGを標準として用いるBradford法によって量を評価した。ウサギATGを20mg/kgの濃度で用い、単回投与した。コントロールとしては、正常なウサギ血清を用いた。
フルダラビン(Sigma)を200mg/kg/日の濃度で6日間用いた。モノクローナル抗体である抗CD4-APC、抗CD8-PerCP、抗B220-FITCおよび抗IFN-γ-FITCは、BD Biosciencesから入手した。
この項目で用いた組換えアデニル酸シクラーゼを、酵素的に不活性なCyaAをコードするプラスミドpkTRAC-HPV16E7Δ30-42の誘導体を用いて大腸菌で発現させた(21)。
CEAタンパク質をコードする大腸菌で最適化したcDNAを、プライマーCEA7 (配列番号:7: 5'-gcggccgcaccatcaccgtctctgcg-3')とCEA8 (配列番号:8: 5'-cccgctcgagggcacccgcagacagacc-3')でPCR増幅した後、NcoIとXhoI制限部位の間のpIvcx 2.4b Ndeベクター(Roche)にサブクローニングした。生成するプラスミドを、大腸菌BL21λDE3株(Novagen)に形質転換した。His-Tag-CEAタンパク質を1ミリモルのイソプロピル-h-D-チオガラクトピラノシド(Euromedex)で誘導することによって発現させ、Ni-NTAアガロース(Qiagen)上で精製した。エンドトラップ(Endtrap)樹脂を用いて、リポ多糖類混入物を除去した。
マルチスクリーン濾過プレート(96穴; Millipore,フランス)に、ラット抗マウスγインターフェロン(IFN-γ)抗体(クローンR4-6A2; PharMingen,サンディエゴ, カリフォルニア)4μg/mlを室温にて一晩コーティングした。免疫マウス由来の脾臓細胞をウェルに加え、1μg/mlのCEAペプスキャンの存在下または非存在下にて20時間インキュベーションした。十分に洗浄した後、プレートを、ビオチン化ラット抗マウスIFN-γ抗体(クローンXMG 1.2; PharMingen) 5μg/mlでインキュベーションした後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ(PharMingen)でインキュベーションすることによって明らかにした。最後に、スポットを、BCIP/NBTを基質として用いて明らかにした。γ-IFN産生細胞の数は、それぞれのウェル(C.T.L., ドイツ)におけるスポット形成コロニー(SFC)の数を数えることによって測定し、結果は1 x 106個の脾臓細胞当たりのSFCの数として表した(20)。
2.2.1 精製組換えタンパク質のSDS PAGE分析
CyaAベクターがCEA特異的T細胞応答を誘発する能力を検討するため、本発明者らはCEA分子のサブフラグメントであるA3およびB3ドメインを含む2種類の異なる組換え分子を構築した。このCEAの領域は、多くのヒトCTLおよびヘルパーエピトープ(32)を含むことが示されている。イン・ビトロおよびイン・ビボ分析法を可能にするため、構築物を大腸菌に産生させ、均質になるまで精製した(図6)。リポ多糖類除去処置を精製プロトコル(21)に導入し、1mg当たり内毒素を<300単位含む組換えタンパク質を得た(データーは示さず)。
従来の研究は、目的の抗原を有する組換えCyaAが異なる投与経路によりTh1型の細胞性T細胞応答を誘発することができることを示している(21, 35)。本発明者らは、プライムブースト法により異なる投与経路を組み合わせることによって、細胞性免疫応答の大きさを増加させることができるかどうかを検討した。図7に示されるように、IFN-γを分泌するCEA特異的CD8+脾臓細胞の頻度は、CEA組換えタンパク質50μgを1回静脈内(iv)投与後には既にかなり高かった。対照的に、CpGのようなアジュバントを用いて処方したCyaAΔ-CEAA3B3またはHis-tag-CEAタンパク質は、γ-IFN分泌を特徴とする細胞性免疫応答を示すことができなかった。
フルダラビンは、慢性のリンパ性白血病の治療に一般に用いられているアデニンのフッ素化類似体である(39)。フルダラビンはリンパ球減少症を引き起こし、Bリンパ球より顕著にTリンパ球を涸渇させる(40)。ウサギATGは、現在では極めて長い間固形臓器移植に用いられているポリクローナルIgGである。サルで行った研究から、用量依存性のリンパ球涸渇がこの治療薬で達成することができることが明らかになった(28)。
血液コンパートメントは、身体のリンパ質量全体の1-2%に過ぎない。従って、本発明者らは、免疫抑制開始の14日後に、TおよびB細胞、脾臓およびリンパ節についての表現型によるリンパ球涸渇を測定した。コントロール(PBSおよびNRS)と比較すると、フルダラビンおよびATGに基づく免疫抑制療法はリンパ様臓器におけるリンパ球の割合の変化を誘発した(表2)。
本発明者らは、次に免疫モデルにおけるCEA特異的T細胞応答の大きさに対する上記条件で行ったリンパ涸渇の影響を測定した。プライム-ブースト免疫の7日前に、動物に上記と同様にフルダラビンまたはATGを投与した。PBSコントロールと比較して、CEA特異的細胞性免疫応答の大きさはCpGアジュバントの存在下にてCyaA-CEAA3B3で免疫したフルダラビン投与動物で減少した。意外なことには、ATG投与動物の群では、CEA特異的細胞性免疫応答の大きさはコントロールに比較して二倍であった。CEA特異的細胞性免疫応答は、HPV16E7抗原を有する非関連組換えCyaAで免疫したときにも検出された。低めのCEA特異的細胞性免疫応答がCpGで処方したHis-tag CEAおよびCyaAΔ-CEAA3B3免疫時に検出され、上記効果を最大にするCD11bターゲッティングの重要性が強調された。
本発明者らは、次に腫瘍拒絶モデルでのこの観察の関連性を試験した。CEAタンパク質を安定に発現するMC38ネズミ結腸腺癌細胞を用いた(48)。5 x 105個の腫瘍細胞を投与すると、偽薬、CyaAΔ-CEAA3B3およびHis-Tag-CEA-投与動物は腫瘍を発生して瀕死状態になり、安楽死の必要があった(図10)。これらの条件では、動物の生存メジアン値はそれぞれ13-15日であった。対照的に、腫瘍投与の10日後にCyaA-CEAA3B3 + CpGで免疫した動物では、生存メジアン値が増加した(27日)。ATGを投与したときには、偽薬投与動物の生存メジアン値は19-21日まで高まった。この群では、CyaA-CEAA3B3 + CpG投与動物の80%は腫瘍が完全に縮退し、さらに60日生存した。フルダラビン投与動物は、全く異なる腫瘍増殖パターンを示した。MCa32A増殖は、フルダラビンを6日間継続することによって部分的に阻害された。結果的に、偽薬投与動物の生存メジアン値は21-25日まで増加した。CyaA-CEAA3B3 + CpG投与動物の60%では、腫瘍が完全に縮退し、さらに60間生存した。
細胞に基づく養子腫瘍免疫療法の分野において、多くの問題が前臨床の結果の臨床への移行を妨げている。それらの1つは、目的とする腫瘍関連抗原(TAA)に対して誘導された養子応答の大きさである。実際に、ヒトでは、抗原特異的T細胞の増殖および効力は、腫瘍発生に関する多数の要因によって限定されている。これらには、TAAに対して高親和性を有するT細胞クローンの誘導の欠如、調節細胞からのネガティブシグナル、腫瘍ストロマおよび恒常的T細胞調節が挙げられる。養子T細胞導入療法のネズミモデルでは、リンパ涸渇は導入細胞の移植および持続性を増加させることが示されている(43-46)。このような手法は、ごく最近臨床へ極めて良好に移行されている(36-38)。特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答を誘発する強力な手段である百日咳菌由来のアデニル酸シクラーゼを用いて、本発明者らは、特異的T細胞応答の誘発を目的とする能動免疫に対するリンパ涸渇の影響を分析した。本発明者らは、多くの種類の癌でのその過剰発現により、癌胎児性抗原をターゲットとすることを選択した。
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Claims (25)
- 哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発する医薬組成物であって、
ポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン(ATG)、
プリン、
ピリミジン類似体、
アルキル化剤、並びに
抗CD8、抗CD4、抗CD25、抗CD3および抗CD52モノクローナル抗体からなる群から選択され、末梢および/または中枢で、T、BおよびNKリンパ球を涸渇させることができるモノクローナル抗体
からなる群から選択されるリンパ球減少症を誘発する第一の化合物と、
第二化合物として、
アデニル酸シクラーゼ(CyaA)、
熱ショックタンパク質(HSP)、
志賀毒素、および、
LAG−3
からなる群から選択されるプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、前記T細胞エピトープと融合している分子と
を含んでなる、医薬組成物。 - 前記第一の化合物が、一過性T細胞涸渇を誘発することができる、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記アデニル酸シクラーゼが、Bordetella pertussis由来であり、HSPがhsp65およびhsp70からなる群から選択され、前記志賀毒素がShigella dysenteriae由来である、請求項1に記載の医薬組成物。
- アジュバントをさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記アジュバントが、クラス3のTLRリガンド、クラス9のTLRリガンド、およびクラス4のTLRリガンドからなる群から選択されるトル様受容体(TLR)リガンドである、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記アジュバントが第二の化合物とともに溶液状である、請求項4または5に記載の医薬組成物。
- 前記APCに選択的親和性を有する分子が、前記少なくとも一つのT細胞エピトープに共有結合してなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記APCに選択的親和性を有する分子および前記少なくとも一つのT細胞エピトープが、組換えDNA技術によって融合したDNA配列によってコードされたポリペプチドである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞エピトープが、感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の由来抗原に由来する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記感染性疾患病原因子が、ヒトパピローマウイルス(HPV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、 トラコーマクラミジアおよびヒト結核菌からなる群から選択されるものである、請求項9に記載の医薬組成物。
- 細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の由来抗原が、癌胎児性抗原(CEA)、MAGE−A3、テロメラーゼ(TERT)、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のE7癌遺伝子、およびP53からなる群から選択されるものである、請求項9に記載の医薬組成物。
- 予防ワクチンまたは治療ワクチンとして用いられる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 筋肉内、静脈内、皮内、皮膚、皮下、腹腔内、粘膜または経口投与用に処方されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- ポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン(ATG)、
プリン、
ピリミジン類似体、
アルキル化剤、並びに
抗CD8、抗CD4、抗CD25、抗CD3および抗CD52モノクローナル抗体からなる群から選択され、末梢および/または中枢で、T、BおよびNKリンパ球を涸渇させることができるモノクローナル抗体
からなる群から選択される第一のリンパ球減少症を誘発する化合物と、
第二の化合物として、
アデニル酸シクラーゼ(CyaA)、
熱ショックタンパク質(HSP)、
志賀毒素、および、
LAG−3
からなる群から選択されるAPCに選択的親和性を有する分子であって、感染性疾患病原因子由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと融合している分子と
を含んでなる、患者の感染性疾患の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための組み合わせ製剤。 - 前記第一の化合物を、前記第二の化合物の前に投与する、請求項15に記載の組み合わせ製剤。
- 前記第二の化合物がアジュバントとともに溶液状である、請求項16に記載の組み合わせ製剤。
- ポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン(ATG)、
プリン、
ピリミジン類似体、
アルキル化剤、並びに
抗CD8、抗CD4、抗CD25、抗CD3および抗CD52モノクローナル抗体からなる群から選択され、末梢および/または中枢で、T、BおよびNKリンパ球を涸渇させることができるモノクローナル抗体
からなる群から選択されるリンパ球減少症を誘発する第一の化合物と、
第二の化合物として、
アデニル酸シクラーゼ(CyaA)、
熱ショックタンパク質(HSP)、
志賀毒素、および、
LAG−3
からなる群から選択されるAPCに選択的親和性を有する分子であって、細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと融合している分子と
を含んでなる、それぞれ患者の細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための組み合わせ製剤。 - 前記第一の化合物を、前記第二の化合物の前に投与する、請求項18に記載の組み合わせ製剤。
- 前記第二の化合物がアジュバントとともに溶液状である、請求項19に記載の組み合わせ製剤。
- 癌細胞がCEAタンパク質を発現し、前記第一の化合物がウサギまたはウマポリクローナルATGであり、前記第二の化合物がヒトCEAタンパク質のA3−B3領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼであり、癌の治療および/または予防に用いられる、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組み合わせ製剤。
- 癌細胞がHPVのE7癌遺伝子を発現し、前記第一の化合物がウサギまたはウマポリクローナルATGであり、前記第二の化合物がHPVのE7癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼであり、HPVによって誘発される癌の治療および/または予防に用いられる、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組み合わせ製剤。
- hsp65およびhsp70が、Mycobacterium bovis由来である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 呼吸器および消化器の癌の治療および/または予防に用いられる、請求項21に記載の組み合わせ製剤。
- 薬学上許容可能なキャリヤーをさらに含んでなる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の医薬組成物または組み合わせ製剤。
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