JP5494351B2 - 蛍光強度補正方法、蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置並びに蛍光強度補正プログラム - Google Patents
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Description
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順。
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順。
分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。なお、この手順では、スペクトル集団を、独立成分分析又は主成分分析などにより、複数のスペクトル小集団に分離することができる。
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の予め取得された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順。
この蛍光強度補正方法等では、蛍光色素を多重標識した微小粒子の測定により取得されたスペクトル集団から各蛍光色素の蛍光波長分布を抽出して蛍光強度の算出に利用できる。そして、蛍光波長分布を抽出できなかった蛍光色素がある場合には、その蛍光色素についてのみ、予め取得された蛍光波長分布を用いて蛍光強度を算出するようにできる。
具体的には、例えば、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を列ベクトルとして配列し、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を列ベクトルとして配列した漏れ込み行列の逆行列を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出できる。
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る測定手段。
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離し、分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する算出手段。
この蛍光強度測定装置は、さらに、微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素に関する情報の入力を受け付ける入力手段と、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布を保持する記憶手段と、を備える。
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つの集団として得たスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離するステップ。
分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップ。
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップ。
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出するステップ。
1.蛍光強度補正方法
(1)ステップS10:蛍光色素情報の入力
(2)ステップS20:ネガティブコントロールの測定
(3)ステップS30:サンプルの測定
(4)ステップS40:解析微小粒子集団のゲーティング
(5)ステップS50:スペクトル小集団の分離
(6)ステップS60:各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定
(6−1)ステップS100:スペクトル小集団の選択
(6−2)ステップS200:リファレンスデータの参照
(6−3)ステップS600:差分スペクトルの算出
(6−4)ステップS700:リファレンスデータの参照
(7)ステップS70:蛍光補正演算
(8)ステップS80:データ表示
2.ステップS50(スペクトル小集団の分離)とステップS60(各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定)の処理の具体例
(1)ステップS50:スペクトル小集団の分離
(2)ステップS60:各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定
3.蛍光強度算出装置・蛍光強度算出プログラム
図1及び図2は、本発明に係る蛍光強度補正方法の手順を説明するフローチャートである。図2は、図1中のステップS60の手順を詳しく説明するフローチャートである。本発明に係る蛍光強度補正方法は、以下の手順を含むことを特徴とする。
「ステップS30」:複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順と、
「ステップS50」:得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順。
「ステップS60(S200)」:分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布(リファレンスデータ)と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。
「ステップS60(S600・S700)」:いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素のリファレンスデータと比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。
「ステップS70」:スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素についてはリファレンスデータを用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順。
まず、測定対象とする微小粒子を複数の蛍光色素を用いて多重標識する。微小粒子の蛍光色素標識は従来公知の手法によって行うことができる。例えば測定対象を細胞とする場合には、細胞表面分子に対する蛍光標識抗体と細胞とを混合し、細胞表面分子に抗体を結合させる。蛍光標識抗体は、抗体に直接蛍光色素を結合させたものであってよく、ビオチン標識した抗体にアビジンを結合した蛍光色素をアビジン・ビオチン反応によって結合させたものであってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
図1中、ステップS20では、ユーザによって、蛍光色素による標識を行っていない微小粒子(ネガティブコントロール)の測定が行われる。微小粒子の測定は、従来公知のマルチカラー測定フローサイトメータを用いた方法と同様にして行うことができる。本ステップでは、微小粒子の自家蛍光の蛍光スペクトル(バックグランド値)が取得され、これと同時にサンプルの蛍光色素標識の特異性が確認される。
図1中、ステップS30では、ユーザによって、蛍光色素を標識した微小粒子(サンプル)の測定が行われる。本ステップでは、複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に対して光を照射することによって、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光する。そして、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として取得する。
図1中、ステップS40は、必要に応じてユーザによって行われる手順であり、サンプルの中から解析を行う微小粒子集団を抽出(ゲーティング)する。本ステップは、例えば、血液細胞サンプルの中からリンパ球のみを解析する場合や、サンプル中の生細胞のみを解析する場合に行われる。サンプルが解析を行う微小粒子集団のみからなる場合には、本ステップは不要である。本ステップを行うことで、各光検出器の検出値から解析微小粒子集団に対応する蛍光スペクトル集団を適切に抽出できる。
図1中、ステップS50では、ユーザあるいはプログラムによって、ステップS30で取得されたスペクトル集団から、主要な成分集団(以下、「スペクトル小集団」と称する)を複数分離する。スペクトル小集団の分離は、ユーザによって行われる場合には、ディスプレイやマウス、キーボード等のユーザインタフェースを用いて、スペクトル集団のスペクトログラム上で成分集団を指定することにより行う。また、プログラムによってスペクトル小集団を分離する場合には、独立成分分析や主成分分析などの通常用いられる成分分析アルゴリズムが適用される。
図1中、ステップS60では、プログラムによって、ステップS50で分離されたスペクトル小集団と、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布(リファレンスデータ)と、を用いて、各蛍光色素の蛍光スペクトルを特定する。図2を参照して、本ステップの詳しい手順を説明する。
本ステップでは、まず、ステップS50で分離された複数のスペクトル小集団の1つを選択する。選択するスペクトル小集団は、ステップS50で分離された複数のスペクトル小集団の中から、他のスペクトル小集団と最も明確に分離されたものとすることが好ましい。
本ステップでは、ステップS100で選択されたスペクトル小集団とリファレンスデータとを比較して、このスペクトル小集団に蛍光波長分布パターンが一致するリファレンスデータを検索する。
ステップS500では、ステップS10で蛍光色素情報が入力された蛍光色素の全てについて、そのリファレンスデータと蛍光波長分布パターンが一致するスペクトル小集団が確定したかを確認する。すなわち、微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素の全てについて、その蛍光スペクトルとみなされるスペクトル小集団が確定しているか否かが確認される(ステップS500参照)。
ステップS700では、ステップS600で算出された差分スペクトルとリファレンスデータとを比較して、この差分スペクトルに蛍光波長分布パターンが一致するリファレンスデータを検索する。
図1中、ステップS70では、プログラムによって、ステップS60において特定された各蛍光色素の蛍光スペクトルを用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する。
図1中、ステップS80は、プログラムによって、蛍光強度の算出結果をディスプレイ等のユーザインタフェースに表示する。本ステップは、従来公知のフローサイトメータにおける方法と同様にして行うことができる。具体的には、各微小粒子について異なる2種類の蛍光色素の蛍光強度をそれぞれX軸又はY軸にプロットした2次元相関図による表示が採用できる。
図3〜7を参照して、本発明に係る蛍光強度補正方法のステップS50,S60の具体的な処理内容について説明する。32チャンネルのマルチカラー測定フローサイトメータを用いて、FITC,PE,PE−TR,PE−Cy5の4種の蛍光色素により多重標識した微小粒子を測定(ステップS30参照)して得たスペクトル集団(A)と、このスペクトル集団から分離されるスペクトル小集団のスペクトログラム(B)〜(G)を図3に例示する。また、FITC,PE,PE−TR,PE−Cy5について単標識微小粒子の解析によって予め取得した蛍光波長分布(リファレンスデータ)のスペクトログラムをそれぞれ図4〜7に例示する。リファレンスデータは、励起レーザ(640 nm)からの漏れ込みを防ぐために設けられたノッチフィルタの特性を含んだデータとなっているため、色素自身のスペクトル情報と完全に一致せずに、機器特有のものとなる。
スペクトル集団(A)からのスペクトル小集団の分離は、ポピュレーションごとの染色性の特徴に基づいて分離することが可能である。例えば、まず、チャネル25の検出値の大小(あるいは有無)によって分離できる。チャネル25の検出値によって分離すると、スペクトル集団(A)は、スペクトル小集団(B)と(C)に分離される。次に、スペクトル小集団(C)を、チャネル16の検出値の大小によって分離すると、スペクトル小集団(D)と(E)に分離できる。さらに、スペクトル小集団(E)を、チャネル16の検出値の大小によって分離すると、スペクトル小集団(F)と(G)に分離できる。
ステップS100で、スペクトル小集団(B)を選択する。ステップS200で、リファレンスデータを参照すると、スペクトル小集団(B)は、FITCの蛍光波長分布パターンに一致する(図4参照)。従って、ステップS300で、スペクトル小集団(B)をFITCの蛍光スペクトルとして確定、保持する。ステップS400で、スペクトル小集団(D),(F),(G)が処理されていないため、ステップS100に戻る。
本発明に係る蛍光強度算出装置と蛍光強度算出プログラムは、上述の蛍光強度補正方法の各手順を実行するための手段を備え、各手順を実行するステップを備える。図8に、本発明に係る蛍光強度算出装置1の機能的構成をブロック図により示す。蛍光強度算出装置1は、フローサイトメータ10とCPU20、メモリ30、ハードディスク40、ユーザインタフェースを有する。
Claims (7)
- 複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順と、
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順と、
分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の予め取得された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順と、を含む蛍光強度補正方法。 - スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を列ベクトルとして配列し、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を列ベクトルとして配列した漏れ込み行列の逆行列を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する請求項1記載の蛍光強度補正方法。
- スペクトル集団を、独立成分分析又は主成分分析により、複数のスペクトル小集団に分離する請求項2記載の蛍光強度補正方法。
- 複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順と、
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順と、
分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の予め取得された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順と、を含む蛍光強度算出方法。 - 複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る測定手段と、
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離し、
分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する算出手段と、を備える蛍光強度算出装置。 - 微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素に関する情報の入力を受け付ける入力手段と、
予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布を保持する記憶手段と、を備える請求項5記載の蛍光強度算出装置。 - 複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つの集団として得たスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離するステップと、
分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップと、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップと、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出するステップと、を実行する蛍光強度補正プログラム。
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