JP5484320B2 - ナリンゲニンとナリンジンを形質転換成長因子−β１のシグナル経路阻害剤とする使用 - Google Patents
ナリンゲニンとナリンジンを形質転換成長因子−β１のシグナル経路阻害剤とする使用 Download PDFInfo
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Description
本発明はナリンゲニン（naringenin）とナリンジン（naringin）の使用に関し、特に、形質転換成長因子-β1（transforming growth factor beta 1,略称TGFβ-1）シグナル経路阻害剤として製薬分野における使用に関する。
繊維化は、いろいろな慢性疾患の共通な病理基礎及び組織器官硬化乃至腫瘍発生の重要な中関節であり、それが主に各種の病因因子が組織臓器細胞を刺激して壊死させ、組織内の細胞外マトリックス（extracellular matrix，ECM）の異常増加及び過度的堆積の病理過程を指し、その特徴としては、大量の繊維組織増生と沈殿であり、コラーゲン含有量が4〜7 倍増加する「Won-II Jeong et al,. Hepatology, 44(6):1441-1451, (2006)」。組織器官の繊維化過程中において、線維芽細胞は、部分的繊維化の多種の表象の基礎であり、活性化された線維芽細胞がコラーゲンを産生と組み替え能力を強く有し、組織損傷又は炎症発生中のいくつの細胞因子、例えば、細胞接着分子因子１、血管内皮成長因子、結合組織成長因子などが線維芽細胞の活性化を制御する「Jurgen J.W.et al, Annals of Surgery, 242(6):880-887, (2005)」。多くの研究により、TGF-β が繊維化過程において、取分け、病理性繊維化過程において主に作用し、直接的に静態的な線維芽細胞から筋線維芽細胞になることを活性化させ、また、PDGFの産生及びその受容体が線維芽細胞における発現を誘導し、間接的に線維芽細胞の増殖及び活性化を刺激し、線維芽細胞のコラーゲン、フィブロネクチン及び蛋白多糖などの細胞外マトリックス合成を促進し、ECMの合成を増加させることが示唆される「Victorino R. Briones R. Briones et al, Biochem Biophys Res Commun, 345(2):595-601, (2006)」。また、TGF-β もMMPs 発現をダウンレギュレーションしてECM を正常に分解させることができなくし、同時に、PAI とTIMPsの発現を増加してECM 分解を阻害することにより、ECMの蓄積を加速させ、最終的に繊維化の発生を引き起こす。従って、TGF-β を阻害することが、繊維化疾患を阻止及び治療することができる「Christelle Guyot et al, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 38:135-151, (2006)」。
TGF-β は繊維化形成の主なレギュレーターであるだけでなく、細胞成長、分化及び移動の強いレギュレーターであり、腫瘍の発生、発展及び転移に対しても重要な作用をし、臨床ではすでに、TGF-βの過剰発現が少なくとも人の乳癌、直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、膵臓癌の腫瘍発症に関わり、取り分け、TGF-β1の過剰発現が腫瘍の進行及び転移、新生血管形成と悪すぎる予後に関わることが証明される「Brian Bierie et al, Cytokine &Growth Factor Reviews, 17:29-40, (2006)」。TGF-β は、腫瘍発生の開始において、腫瘍の成長に対して一定の阻害作用を有するが、その後、腫瘍の発展を促進してなり、これが主に3 つの方面に表される：(1) 細胞の成長阻害制御を失わせる；(2) 腫瘍細胞を転移性が獲得させる；(3) 腫瘍細胞を免疫監視から逃げさせる。その中に、腫瘍細胞を免疫監視から逃げさせる主なメカニズムは、TGF-β1がCD4+ T細胞の開始及び記憶段階において、違う方式でインターフェロン−γ (interferon-γ, IEN-γ)の産生を阻害する。従って、TGF-β を阻害することが、腫瘍疾患を阻止及び治療することができる「Brian Bierie et al, Nature Reviews/Cancer, 6:50-520. (2006)」。
近年以来、癌の線維芽細胞に関わる概念の提出は、繊維化疾患も腫瘍の発生に関することが人々の注意を呼びかけ「Akira Orimo et al, Cell Cycle, 5(15):1597-1601, (2006)」、本出願人は研究において、繊維化が腫瘍のためにそれの発展することに有利する微環境を提供し、TGF-β シグナル経路がこの過程において主に作用する
現在、TGF-β シグナル経路をターゲットとする治療では、改変後の免疫成分及び小分子阻害剤、可溶性蛋白、アンチセンス複合体阻害剤が含まれるが、TGF-β シグナル経路を干渉する薬物の販売がまだ１つもなく、臨床上で繊維化に対する治療が従来の組み換えIEN-γ 以外、理想的な薬物もない「Eiji Suzuki et al, Cancer Res, 67(5):2351-2359(2007)」。
フラボン類化合物は漢方薬において一般的に存在する有効成分であり、抗菌、消炎、ラジカル消去、抗腫瘍などの多種類の薬理作用を有する「Mouming Zhao et al, International Immunopharmacology, 7:162-166, (2007)」。
ナリンジン（naringin）は、ナリンゴサイド（naringoside）、アウランティン（aurantiin）、イソヘスペリジン（isohesperidin）とも呼ばれ、分子式はC27H32O14 で、分子量は580.53であり、主にミカン科植物のグレープフルーツ、みかん、オレンジの果皮と果肉に存在し、漢方薬のシノブ、枳実、Fructus Aurantii、Exocarpium Citri Rubrumの主な有効成分である。ラットにナリンジン100mg/kg を皮下注射した場合、明らかな抗炎作用を有することと報告され、200mg/L 濃度のナリンジンは、水疱性口内炎ウイルスに対して強い阻害作用を有する。また、ナリンジンは血液の粘度を降下させ、血栓の形成を減少させ、そして、鎮痛、鎮静及び比較的強い実験動物の胆汁分泌を増加させる作用を有する。また、ナリンジンは脱感作と抗過敏、活血鎮痙、局部微循環と栄養供給を改善する性能を有し、薬物の***の促進、ストレプトマイセスの第8対脳神経に対する損害の解除、ストレプトマイセスの毒性・副作用の緩和に対して、独特な効果がある「Bok, S.H et al, Nutr.Res.20, 1007-1015(2000)」。
ナリンゲニン（naringenin）はナリンジンのアグリコンであり、ナリンジンの薬理作用を産生させる構造部分でもあり、分子式はC15H12O5で、分子量は272.25であり、抗菌、消炎、鎮痙と利胆などの作用も有する「Chul-Ho Lee et al, Biochemical and Biophysical Research Communications 284, 681-688 (2001)」。ナリンゲニンとナリンジンの構造は以下に示す：
Won-II Jeong et al,. Hepatology, 44(6):1441-1451, (2006)
Jurgen J.W.et al, Annals of Surgery, 242(6):880-887, (2005)
Victorino R. Briones R. Briones et al, Biochem Biophys Res Commun, 345(2):595-601, (2006)
Christelle Guyot et al, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 38:135-151, (2006)
Brian Bierie et al, Cytokine &Growth Factor Reviews, 17:29-40, (2006)
Brian Bierie et al, Nature Reviews/Cancer, 6:50-520. (2006)
Akira Orimo et al, Cell Cycle, 5(15):1597-1601, (2006)
Eiji Suzuki et al, Cancer Res, 67(5):2351-2359(2007)
Mouming Zhao et al, International Immunopharmacology, 7:162-166, (2007)
Bok, S.H et al, Nutr.Res.20, 1007-1015(2000)
Chul-Ho Lee et al, Biochemical and Biophysical Research Communications 284, 681-688 (2001)
本出願人は初めて、レモン、葡萄ジュース、ミカンなどにおいて自然存在する天然フラボン類小分子化合物ナリンゲニン及びナリンジンが、TGF-βシグナル経路を阻害することができ、血清IEN-γを向上させることを発見し、インビボ、インビドロ実験により、それが繊維化及び腫瘍を治療又は予防する作用を有することを証明し、さらにその潜在する臨床作用に対して深い研究を行った。
本発明の具体的な内容は以下である：
（1） ナリンゲニンとナリンジンが形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤とする使用。
（2） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が繊維化を治療又は予防するための薬物の調製における使用を含む、（1）に記載の使用。
（3） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が腫瘍を治療
又は予防するための薬物の調製における使用を含む、（1）に記載の使用。
（4） 前記繊維化がそれぞれの組織器官の繊維化を含む、（2）に記載の使用。
（5） 前記繊維化が肝臓繊維化と肺繊維化を含む、（4）に記載の使用。
（6） 前記腫瘍がそれぞれの固形腫瘍、非固形腫瘍と転移性腫瘍を含む、（3）に記載の使用。
（7） 前記腫瘍が肝癌と肺癌を含む、（6）に記載の使用。
（8） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が繊維化を治療又は予防するための動物用有効量の範囲が：経口投与10〜300mg/kg体重／日、皮下注射4〜200mg/kg体重／日、静脈注射1〜30mg/kg体重／日、好ましい剤量が、経口投与50〜200mg/kg体重／日、皮下注射10〜100mg/kg体重／日、静脈注射5〜20mg/kg体重／日であり、推定されたヒト用の有効量範囲が、経口投与0.8〜24mg/kg体重／日、皮下注射0.2〜6mg/kg体重／日、静脈注射0.8〜4mg/kg体重／日、好ましい剤量が経口投与4〜12mg/kg体重／日であり、皮下注射0.6〜2mg/kg体重／日、静脈注射0.1〜0.4mg/kg体重／日である、（2）、（4）及び（5）のいずれか一項に記載の使用。
（9） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が腫瘍を治療又は予防するための動物用有効量の範囲が：経口投与10〜300mg/kg体重／日、皮下注射4〜200mg/kg体重／日、静脈注射1〜30mg/kg体重／日、好ましい剤量が経口投与50〜200mg/kg体重／日、皮下注射10〜100mg/kg体重／日、静脈注射5〜20mg/kg体重／日であり、推定されたヒト用の有効量範囲が経口投与0.8〜24mg/kg体重／日、皮下注射0.2〜6 mg/kg体重／日、静脈注射0.8〜4mg/kg体重／日、好ましい剤量が経口投与4〜12mg/kg体重／日であり：皮下注射0.6〜2mg/kg体重／日、静脈注射0.1〜0.4mg/kg体重／日である、（3）、6）及び（7）のいずれか一項に記載の使用。
（1） ナリンゲニンとナリンジンが形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤とする使用。
（2） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が繊維化を治療又は予防するための薬物の調製における使用を含む、（1）に記載の使用。
（3） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が腫瘍を治療
又は予防するための薬物の調製における使用を含む、（1）に記載の使用。
（4） 前記繊維化がそれぞれの組織器官の繊維化を含む、（2）に記載の使用。
（5） 前記繊維化が肝臓繊維化と肺繊維化を含む、（4）に記載の使用。
（6） 前記腫瘍がそれぞれの固形腫瘍、非固形腫瘍と転移性腫瘍を含む、（3）に記載の使用。
（7） 前記腫瘍が肝癌と肺癌を含む、（6）に記載の使用。
（8） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が繊維化を治療又は予防するための動物用有効量の範囲が：経口投与10〜300mg/kg体重／日、皮下注射4〜200mg/kg体重／日、静脈注射1〜30mg/kg体重／日、好ましい剤量が、経口投与50〜200mg/kg体重／日、皮下注射10〜100mg/kg体重／日、静脈注射5〜20mg/kg体重／日であり、推定されたヒト用の有効量範囲が、経口投与0.8〜24mg/kg体重／日、皮下注射0.2〜6mg/kg体重／日、静脈注射0.8〜4mg/kg体重／日、好ましい剤量が経口投与4〜12mg/kg体重／日であり、皮下注射0.6〜2mg/kg体重／日、静脈注射0.1〜0.4mg/kg体重／日である、（2）、（4）及び（5）のいずれか一項に記載の使用。
（9） 前記形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤が腫瘍を治療又は予防するための動物用有効量の範囲が：経口投与10〜300mg/kg体重／日、皮下注射4〜200mg/kg体重／日、静脈注射1〜30mg/kg体重／日、好ましい剤量が経口投与50〜200mg/kg体重／日、皮下注射10〜100mg/kg体重／日、静脈注射5〜20mg/kg体重／日であり、推定されたヒト用の有効量範囲が経口投与0.8〜24mg/kg体重／日、皮下注射0.2〜6 mg/kg体重／日、静脈注射0.8〜4mg/kg体重／日、好ましい剤量が経口投与4〜12mg/kg体重／日であり：皮下注射0.6〜2mg/kg体重／日、静脈注射0.1〜0.4mg/kg体重／日である、（3）、6）及び（7）のいずれか一項に記載の使用。
本発明において、ナリンゲニンとナリンジンがTGF-β1のシグナル経路阻害剤として繊維化及び腫瘍を治療又は予防し得ることが提示された。ナリンゲニンがラット肝星細胞の増殖及びその細胞マトリックスとコラーゲン蛋白の分泌を阻害する（図1と図2）。ナリンゲニンがラット肝星細胞の増殖に対して明らかな阻害作用を有し、且つプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1 (PAI-1)、フィブロネクチン(FN)とコラーゲン1α (Col Ialphal)の発現を明らかに阻害する。上記結果により、ナリンゲニンが潜在的な抗繊維化作用を有することが示唆された。
ナリンゲニンが四塩化炭素(CCL4)により引き起こされたマウスの肝臓損傷（繊維化）に対し、保護作用を有する。肝臓のサイズは、肝臓の損傷腫脹程度を直接反映し、ナリンゲニンの高、中剤量がCCL4により引き起こされた肝臓繊維化マウスの肝臓増大に対し、明らかな阻害作用を有する(p<0.01、図3に示す)。
MDA (malondialdehyde,マロンジアルデヒド)は生体脂質の過酸化損傷後の産物であり、その含有量が高ければ、機体の損傷程度が酷く、ナリンゲニンの高、中、低剤量がCCL4により引き起こされた肝臓繊維化マウスの血清MDAに対して、明らかな低下作用を有する(p<0.05、図4に示す)；CAT(catalase, カタラーゼ)、POD(peroxidase, ペルオキシダーゼ) は生体H2O2を消去し、自身損害を減少する作用を有し、体内のH2O2 濃度の上昇が、CAT とPODの活性増加を刺激する主な因子であり、ナリンゲニンの高、中、低剤量がCCL4により引き起こされた肝臓繊維化マウスの血清CAT とPOD ストレス性上昇に対して低下作用を有し(p<0.05、図4に示す)、データによりナリンゲニンが体内ラジカルを減少作用を有することが示唆される。
ALT (Alanine aminotransferase, アラニンアミノトランスラーゼ)、AST (Aspartate aminotransferase, アスパラギン酸アミノトランスラーゼ)活性は、肝臓損害程度を直接反映し、その活性が高ければ、肝臓損害の程度が酷く、ナリンゲニンの高、中、低剤量がCCL4により引き起こされた肝臓繊維化マウスの血清ALT、AST上昇に対して低下作用を有する(p<0.01、図5に示す)。上記結果により、ナリンゲニンはCCL4により引き起こされたマウスの肝臓損傷（繊維化）に対し明らかな保護作用を有することが示唆される。
また、ナリンゲニンの経口投与200、100、50mg/kg体重／日又は静脈注射20、10、5mg/kg体重／日又は皮下注射40、20、10mg/kg体重／日の3 つの剤量で治療と、同モル量のナリンジンがマウス肝癌H22皮下腫瘍の成長に対して、明らかな阻害作用を有する(p<0.01、図6、図7、図8に示す)。
三つの剤量群のナリンゲニンが、Lewis肺癌の肺転移数を低下させることができ(p<0.01、図9に示す)、肺転移腫瘍の成長を遅らせ(p<0.01、図10に示す)、ナリンゲニンが抗腫瘍転移作用を有することが示唆される。
ナリンゲニンがプレオマイシンにより誘導された肺繊維化マウス血清TGF-β1に対して明らかな阻害作用を有し(p<0.01、図11に示す)、血清中のIEN-γ レベルを顕著に向上させる(p<0.05、図12に示す)；ナリンゲニンがプレオマイシンにより誘導された肺組織iregの上昇に対して阻止作用を有し(p<0.05、図13に示す)、これにより肺繊維化マウス肺組織IEN- γ を上昇させ(p<0.05、図14に示す)る；ナリンゲニンがプレオマイシンにより誘導された肺繊維化マウスの腫瘍肺転移に対しても阻害作用を有し(p<0.01、図15に示す)、腫瘍肺転移を発生する肺繊維化マウスの生存時間を延長させることができる(p<0.01、図16に示す)。これらの結果により、ナリンゲニンがTGF-βの阻害、IEN-γの誘導により、繊維化と腫瘍疾患を治療することに寄与することが示唆される。同時に、ナリンゲニンがマウス血清MDA を低下させた(p<0.01、図12に示す)。
以上により、上記発明内容を踏まえて、本発明の有効効果を以下の五つの面にまとめる：
(1) ナリンゲニンとナリンジンが、四塩化炭素により引き起こされたマウス肝臓繊維化に対して治療または予防作用を有し、肝臓繊維化程度を低減させ、肝臓機能のレベルを正常に調節させることができる。
(2) ナリンゲニンとナリンジンが、プレオマイシンにより引き起こされたマウス肝臓繊維化に対して治療または予防作用を有し、肝臓繊維化程度を明らかに低減させ、肺損傷を阻止することができる。
(3) ナリンゲニンとナリンジンが、マウス肝癌H22皮下腫瘍に対して明らかな成長阻害作用を有し、腫瘍の成長速度を遅らせ、マウスの生存時間を延長させることができる。
(4) ナリンゲニンとナリンジンが、マウスLewis肺癌転移に対して明らかな阻害作用を有し、Lewis肺癌転移の発生率を減少させ、肺転移腫瘍の成長速度を阻止することができる。
(5) ナリンゲニンとナリンジンが、繊維化により引き起こされたマウス血清TGF-β1及びMDAの上昇に対して明らかな低下作用を有し、それを正常レベルに調節させ、同時に、ナリンゲニンがTGF-β1の上昇により惹起されたマウス血清IEN- γの低下に対しても明らかな上昇作用を有する。
(1) ナリンゲニンとナリンジンが、四塩化炭素により引き起こされたマウス肝臓繊維化に対して治療または予防作用を有し、肝臓繊維化程度を低減させ、肝臓機能のレベルを正常に調節させることができる。
(2) ナリンゲニンとナリンジンが、プレオマイシンにより引き起こされたマウス肝臓繊維化に対して治療または予防作用を有し、肝臓繊維化程度を明らかに低減させ、肺損傷を阻止することができる。
(3) ナリンゲニンとナリンジンが、マウス肝癌H22皮下腫瘍に対して明らかな成長阻害作用を有し、腫瘍の成長速度を遅らせ、マウスの生存時間を延長させることができる。
(4) ナリンゲニンとナリンジンが、マウスLewis肺癌転移に対して明らかな阻害作用を有し、Lewis肺癌転移の発生率を減少させ、肺転移腫瘍の成長速度を阻止することができる。
(5) ナリンゲニンとナリンジンが、繊維化により引き起こされたマウス血清TGF-β1及びMDAの上昇に対して明らかな低下作用を有し、それを正常レベルに調節させ、同時に、ナリンゲニンがTGF-β1の上昇により惹起されたマウス血清IEN- γの低下に対しても明らかな上昇作用を有する。
本発明のナリンゲニンとナリンジンをTGF-β1 シグナル経路阻害剤として繊維化及び癌を治療又は予防するために用いる。本発明は、ナリンゲニンとナリンジンの抗繊維化及び抗腫瘍活性に対して試験を行い、ナリンジンが同モル量において、その作用がナリンゲニンに相当し、従って、以下の試験はナリンゲニンのみを例とする。本発明のナリンゲニンとナリンジンは陝西慧科植物開発有限公司により購入された。
実施例1．ナリンゲニンがラット肝星細胞増殖および細胞マトリックスコラーゲンタンパク分泌に及ぼす影響
実験方法：ラット肝星細胞（HST-T6, Hepatic stellate cell, 米国Mount Sinai 医学センターFriedman 教授により提供された）を、牛胎児血清10％ (米国PPA 社)、ペニシリンとストレプトマイセスをそれぞれ100U/ml 含有するRPMI1640 培地(Sigma 社)において、5%CO2、37°Cで(FIL-TER 型インキュベータ, ドイツThermo社)培養させる。存在率90％の細胞をトリプシン0.25%で消化させた後、細胞数を5×104/ml まで調整し、100μl/穴で96ウェルプレートで接種し、細胞付着して一晩過ぎてから、異なる濃度のナリンゲニンを含有する培地100μl/穴、濃度ごとに4〜6 個の重複で、続けて48時間培養した後、培地を除去し、100μl/穴で0.5mg/ml MMT (dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma 社)含有するリン酸塩バーファー（PBS)を添加し、4時間培養した後MTTを除去し、ジメチルスルホキシドDMSO(dimethyl sulfoxide) 100μl/穴で添加し、マイクロプレートポリーダーで590nmの吸光度を測定した（MK3 型、ドイツThermo 社）。対照穴（ナリンゲニンを含まない）の吸光度を100％とし、薬穴と対照穴との吸光度比例を細胞生存パーセンテージとして、細胞生存曲線を作成し、ナリンゲニンがラット肝星細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。ナリンゲニンがラット肝星細胞マトリックスコラーゲン分泌に及ぼす影響に対し、細胞を2×105/ml で6 ウェルプレートに接種し、1つ穴あたり3つ重複で、薬物の処理方式が96ウェルプレートと同じである。薬物処理48時間後、細胞をパンクレアチンで消化し、PBSで3回洗浄した後、Western blottingの方法で、コラーゲン1α（Col Ialphal, collagen Ial）とフィブロネクチン(FN,fibronectin)、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1)を検出した。本実施例において、人組換え細胞因子TGF-β1 が米国R&D 社により購入され、標準タンパク及びタンパク分子量標準が米国Bio-Rad 社により購入され、全部の抗体（基礎抗体とニ次抗体を含む）が米国Santa Crus 生物技術公司により購入された。
実験方法：ラット肝星細胞（HST-T6, Hepatic stellate cell, 米国Mount Sinai 医学センターFriedman 教授により提供された）を、牛胎児血清10％ (米国PPA 社)、ペニシリンとストレプトマイセスをそれぞれ100U/ml 含有するRPMI1640 培地(Sigma 社)において、5%CO2、37°Cで(FIL-TER 型インキュベータ, ドイツThermo社)培養させる。存在率90％の細胞をトリプシン0.25%で消化させた後、細胞数を5×104/ml まで調整し、100μl/穴で96ウェルプレートで接種し、細胞付着して一晩過ぎてから、異なる濃度のナリンゲニンを含有する培地100μl/穴、濃度ごとに4〜6 個の重複で、続けて48時間培養した後、培地を除去し、100μl/穴で0.5mg/ml MMT (dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma 社)含有するリン酸塩バーファー（PBS)を添加し、4時間培養した後MTTを除去し、ジメチルスルホキシドDMSO(dimethyl sulfoxide) 100μl/穴で添加し、マイクロプレートポリーダーで590nmの吸光度を測定した（MK3 型、ドイツThermo 社）。対照穴（ナリンゲニンを含まない）の吸光度を100％とし、薬穴と対照穴との吸光度比例を細胞生存パーセンテージとして、細胞生存曲線を作成し、ナリンゲニンがラット肝星細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。ナリンゲニンがラット肝星細胞マトリックスコラーゲン分泌に及ぼす影響に対し、細胞を2×105/ml で6 ウェルプレートに接種し、1つ穴あたり3つ重複で、薬物の処理方式が96ウェルプレートと同じである。薬物処理48時間後、細胞をパンクレアチンで消化し、PBSで3回洗浄した後、Western blottingの方法で、コラーゲン1α（Col Ialphal, collagen Ial）とフィブロネクチン(FN,fibronectin)、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1)を検出した。本実施例において、人組換え細胞因子TGF-β1 が米国R&D 社により購入され、標準タンパク及びタンパク分子量標準が米国Bio-Rad 社により購入され、全部の抗体（基礎抗体とニ次抗体を含む）が米国Santa Crus 生物技術公司により購入された。
結果としては、肝星細胞の活性化増殖が肝繊維化形成された基礎であり、ナリンゲニンがラット肝星細胞の増殖に対して明らかな阻害作用を有する（p<0.05、図１に示す）。プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1)、フィブロネクチン(FN)及びコラーゲン1α（Col Ialphal）が活性化された星細胞により分泌され、繊維化形成の場合必要されたマトリックスコラーゲン物質である。ナリンゲニンが3種類のマトリックスコラーゲンに対して、ダウンレギュレーション作用を有する（図2に示す）。以上の結果により、ナリンゲニンが抗繊維化作用を有することが示唆された。
実験例2．ナリンゲニンが四塩化炭素（CCL4）により誘起された肝繊維化に及ぼす影響
実験方法：雌性balb/c マウス（北京維通利華実験動物公司により提供され）に10％四塩化炭素CCL4 (四塩化炭素：carbon tetrachloride)を皮下注射し、0.2ml/匹、2回/週、4週連続により肝繊維化モデルを作製した。第2週から、治療群がナリンゲニン(Nar)の高(100mg/kg)、中(50mg/kg)と低(25mg/kg)の3つの剤量で胃内投与(ig)又は静脈注射(iv)(5mg/kg)及び皮下注射(sc) (20mg/kg) で治療し、また、繊維化モデルに作製されないマウスを正常対照マウス群とし、10匹/群、1日1回、3週間連続投与した。28日目に目周り静脈採血をして血液指標の検出に用いられ、その後、マウスを死亡させ、肝臓を採り、重さを測定した。本実施例中のMDA及びCAT、POD キットが中国南京建成生物技術公司により購入され、ALTとASTキットが中国北京中生北控生物技術公司により購入された。
実験方法：雌性balb/c マウス（北京維通利華実験動物公司により提供され）に10％四塩化炭素CCL4 (四塩化炭素：carbon tetrachloride)を皮下注射し、0.2ml/匹、2回/週、4週連続により肝繊維化モデルを作製した。第2週から、治療群がナリンゲニン(Nar)の高(100mg/kg)、中(50mg/kg)と低(25mg/kg)の3つの剤量で胃内投与(ig)又は静脈注射(iv)(5mg/kg)及び皮下注射(sc) (20mg/kg) で治療し、また、繊維化モデルに作製されないマウスを正常対照マウス群とし、10匹/群、1日1回、3週間連続投与した。28日目に目周り静脈採血をして血液指標の検出に用いられ、その後、マウスを死亡させ、肝臓を採り、重さを測定した。本実施例中のMDA及びCAT、POD キットが中国南京建成生物技術公司により購入され、ALTとASTキットが中国北京中生北控生物技術公司により購入された。
結果：肝臓のサイズが肝臓の損傷腫脹程度を直接反映し、ナリンゲニンigの高、中剤量がCCL4によりを引き起こされた肝繊維化マウス肝臓の増大に対して明らかな阻害作用を有し、ナリンゲニンiv 及びscの投与も同様に有効である（p<0.01、図3に示す）。MDA (malondialdehyde,マロンジアルデヒド)は機体脂質過酸化損傷後の産物であり、その含有量が高ければ集団損傷がひどく、ナリンゲニンの高、中と低剤量がCCL4により引き起こされた肝繊維化マウス血清MDAに対して明らかな低下作用を有する；CAT (Catalase，カタラーゼ)、POD (peroxidase，ペルオキシダーゼ)は、機体H2O2の消去、自体損傷の減少作用を有し、体内H2O2 濃度の上昇がCAT とPODの活性増加を刺激する主な因子であり、ナリンゲニンの高、中と低剤量がCCL4により引き起こされた肝繊維化マウス血清のCAT 及びPODのストレス上昇に対して低下作用を有する；ナリンゲニンiv 及びscの投与も同様に有効であり（p<0.05、図4に示す）、ナリンゲニンが体内フリーラジカルを低下させる作用を間接に証明した。ALT (Alanine aminotransferase, アラニンアミノトランスラーゼ)、AST (Aspartate aminotransferase, アスパラギン酸アミノトランスラーゼ)の活性が肝臓の損傷度を直接反映し、その活性が高ければ肝臓の損傷がひどく、ナリンゲニンの高、中と低剤量がCCL4により引き起こされた肝繊維化マウス血清のALT 及びASTの上昇に対して低下作用を有する；ナリンゲニンiv 及びscの投与も同様に有効である（p<0.01、図5に示す）。上記結果により、ナリンゲニンがCCL4により引き起こされた肝繊維化に対して阻害作用を有する。
実施例3：ナリンゲニンがマウス肝癌H22皮下腫瘍の成長に及ぼす影響
実験方法：マウス肝癌H22皮下腫瘍（中国医学科学院薬物研究所により提供され）をPBS で細胞懸濁液を調整した後、細胞数5×106/mlに調整し、0.2ml/匹で雌性balb/c マウスの前肢腋部皮下に接種した。腫瘍接種した後、翌日から、治療群がナリンゲニン（Nar）で胃内投与(ig)200mg/kg、100mg/kg)と50mg/kgの3 つの剤量又は静脈注射(iv) 20mg/kg、10mg/kg)と5mg/kgの3 つの剤量又は皮下注射(sc) 40mg/kg、20mg/kg)と10mg/kgの3 つの剤量で治療し、マウス10 匹/群、1日1回、2週間連続投与した。腫瘍ができた後、2 日おきノギスで腫瘍体積を測定し、長さ×幅×0.5幅で腫瘍体積を表し、腫瘍の生長曲線を作成した。
結果：ナリンゲニンig 又はivの高、中と低の3つの剤量及びナリンゲニンscの高、中の2 つの剤量が、マウス肝癌H22 皮下腫瘍の成長に対して阻害作用を有し（p<0.01又はp<0.05、図6、図7又は図8に示す）、ナリンゲニンが抗腫瘍作用を有することが示唆された。
実験方法：マウス肝癌H22皮下腫瘍（中国医学科学院薬物研究所により提供され）をPBS で細胞懸濁液を調整した後、細胞数5×106/mlに調整し、0.2ml/匹で雌性balb/c マウスの前肢腋部皮下に接種した。腫瘍接種した後、翌日から、治療群がナリンゲニン（Nar）で胃内投与(ig)200mg/kg、100mg/kg)と50mg/kgの3 つの剤量又は静脈注射(iv) 20mg/kg、10mg/kg)と5mg/kgの3 つの剤量又は皮下注射(sc) 40mg/kg、20mg/kg)と10mg/kgの3 つの剤量で治療し、マウス10 匹/群、1日1回、2週間連続投与した。腫瘍ができた後、2 日おきノギスで腫瘍体積を測定し、長さ×幅×0.5幅で腫瘍体積を表し、腫瘍の生長曲線を作成した。
結果：ナリンゲニンig 又はivの高、中と低の3つの剤量及びナリンゲニンscの高、中の2 つの剤量が、マウス肝癌H22 皮下腫瘍の成長に対して阻害作用を有し（p<0.01又はp<0.05、図6、図7又は図8に示す）、ナリンゲニンが抗腫瘍作用を有することが示唆された。
実施例4．ナリンゲニンがLewis肺癌転移に及ぼす影響
実験方法：マウスLewis肺癌皮下腫瘍（中国医学科学院薬物研究所により提供され）をPBS で細胞懸濁液を調整した後、細胞数1×106/mlに調整し、0.2ml/匹ivで雌性balb/cマウスに接種した。腫瘍接種した後、翌日から、治療群がナリンゲニン（Nar）で高100mg/kg、中50mg/kg)と低25mg/kgの3つの剤量で胃内投与(ig)又は静脈注射(iv) 5mg/kg 又は皮下注射(sc) 20mg/kg)で治療し、マウス10 匹/群、1日1回、3週間連続投与した。腫瘍接種した後の22 日目にマウスを死亡させ、肺臓を採り、重さを測り、肺臓の肉眼で見られる腫瘍結節数を計算した。結果：ナリンゲニンigの高、中剤量がLewis 肺癌の転移数を減少させることができ（p<0.09、図9に示す）、肺臓の転移した腫瘍の成長を緩和させ（p<0.01、図10に示す）、ナリンゲニンiv又はsc投与が同様に有効し、ナリンゲニンが抗腫瘍作用を有することが示唆された。
実験方法：マウスLewis肺癌皮下腫瘍（中国医学科学院薬物研究所により提供され）をPBS で細胞懸濁液を調整した後、細胞数1×106/mlに調整し、0.2ml/匹ivで雌性balb/cマウスに接種した。腫瘍接種した後、翌日から、治療群がナリンゲニン（Nar）で高100mg/kg、中50mg/kg)と低25mg/kgの3つの剤量で胃内投与(ig)又は静脈注射(iv) 5mg/kg 又は皮下注射(sc) 20mg/kg)で治療し、マウス10 匹/群、1日1回、3週間連続投与した。腫瘍接種した後の22 日目にマウスを死亡させ、肺臓を採り、重さを測り、肺臓の肉眼で見られる腫瘍結節数を計算した。結果：ナリンゲニンigの高、中剤量がLewis 肺癌の転移数を減少させることができ（p<0.09、図9に示す）、肺臓の転移した腫瘍の成長を緩和させ（p<0.01、図10に示す）、ナリンゲニンiv又はsc投与が同様に有効し、ナリンゲニンが抗腫瘍作用を有することが示唆された。
実施例5．ナリンゲニンがプレオマイシンにより引き起こされた肺繊維化マウス血清TGF-β1、IEN-γ及びMDAに及ぼす影響
実験方法：ネンブタール30mg/kg（0.3％、0.2ml/匹）で雌性balb/cマウスを麻酔させた後、プレオマイシン100μg/匹（日本化薬株式会社製品、2μg/ ml、50μl/匹）で、鼻に一時的点鼻して肺繊維化モデルを作製した。腫瘍接種した後、翌日から、治療群がナリンゲニン（Nar）ig（50mg/kg）又はiv （5mg/kg)又はsc（20mg/kg）で治療し、マウス10匹/群、1 日1 回、3 週間連続投与した。モデル作製された後の22 日目に採血して血清を分離し、ELISA キットでTGF-β1、IEN-γ及びMDAを検出した。本実施例中のTGF-β1、IEN- γ キットが米国Genzyme 社により提供された。
実験方法：ネンブタール30mg/kg（0.3％、0.2ml/匹）で雌性balb/cマウスを麻酔させた後、プレオマイシン100μg/匹（日本化薬株式会社製品、2μg/ ml、50μl/匹）で、鼻に一時的点鼻して肺繊維化モデルを作製した。腫瘍接種した後、翌日から、治療群がナリンゲニン（Nar）ig（50mg/kg）又はiv （5mg/kg)又はsc（20mg/kg）で治療し、マウス10匹/群、1 日1 回、3 週間連続投与した。モデル作製された後の22 日目に採血して血清を分離し、ELISA キットでTGF-β1、IEN-γ及びMDAを検出した。本実施例中のTGF-β1、IEN- γ キットが米国Genzyme 社により提供された。
結果：TGF-β1（形質転換成長因子β1）は、繊維化形成の主な細胞因
子であり、腫瘍発生、進行の促進因子である； IEN- γ(インターフェロンγ)がTGF-β1 と相反な作用を有し、繊維化を減少し、腫瘍生長を阻止することができる。ナリンゲニン３種類の投与経路がプレオマイシンにより誘起された肺繊維化マウス血清TGF-β1の上昇に対して明らかな阻害作用を有し（p<0.01、図11に示す）、IEN-γ分泌を促進することができ（p<0.05、図12に示す）、ナリンゲニンがTGF-β1の阻害、IEN-γの誘発することにより、繊維化と腫瘍疾患を治療することに寄与することが明らかになった。ナリンゲニンがマウス血清MDAを低下させる（p<0.01、図12に示す）ことは、ナリンゲニンが機体損傷を阻止することができるもう一つの証明である。
子であり、腫瘍発生、進行の促進因子である； IEN- γ(インターフェロンγ)がTGF-β1 と相反な作用を有し、繊維化を減少し、腫瘍生長を阻止することができる。ナリンゲニン３種類の投与経路がプレオマイシンにより誘起された肺繊維化マウス血清TGF-β1の上昇に対して明らかな阻害作用を有し（p<0.01、図11に示す）、IEN-γ分泌を促進することができ（p<0.05、図12に示す）、ナリンゲニンがTGF-β1の阻害、IEN-γの誘発することにより、繊維化と腫瘍疾患を治療することに寄与することが明らかになった。ナリンゲニンがマウス血清MDAを低下させる（p<0.01、図12に示す）ことは、ナリンゲニンが機体損傷を阻止することができるもう一つの証明である。
実施例6．ナリンゲニンがプレオマイシンにより誘起された肺繊維化マウス肺臓組織ireg 及びIEN-γに及ぼす影響
実験方法：プレオマイシンにより誘起された肺繊維化モデルを利用し、肺繊維化雌性Balb/c マウス20匹を確立するとともに、肺繊維化モデルと平行で、10 匹を生理食塩水で点鼻したものを正常マウス対照とし、即ち、マウスの分配は以下になる：(1) 正常対照（Normal）：生理食塩水で点鼻し、0.5％ CMC-Naで胃内投与した；(2) モデル対照(Control) ：プレオマイシンで点鼻し、0.5％ CMC-Naで胃内投与した；(3) ナリンゲニン治療群(Nar 100mg/kg)：プレオマイシンで点鼻し、0.5％CMC-Naで混合懸濁したナリンゲニン100mg/kg体重で胃内投与し、20匹/群、実験の1日目、プレオマイシン点鼻してマウス肺繊維化モデルを作製した；2日目、治療群がナリンゲニンで胃内投与をし、未治療群が同容量溶媒（0.1ml/10g体重）で胃内投与をし、1日1回；21日目にマウスを死亡させ、肺臓を切り除き、せん断され、1 mg/mlコラーゲナーゼDと0.02mg/ml DNA 酵素Iを含有するHBSS溶液37°Cで90分間消化して単細胞になり、70μm 細胞濾過器で細胞断片を除去し、HBSS 溶液で2回洗浄し、35％Percoll PBSに懸濁して、70％Percollの上部に加入し、2500rpm、20分間遠心分離し、リンパ細胞を収集し、先に25ng/ml PMA と500 ng/ml イオノマイシン(Ionomycin)で刺激培養5時間、ブレフェルジン(Brefeldin) A 溶液を添加してさらに3h 培養した。キットの説明により、細胞固定、透過後に対してFITC-カップリングした抗-CD4、Percp-cy5.5-カップリングした抗-CD8、PE-カップリングした抗IEN-γの染色した後のフローサイトメトリーでリンパ細胞亜群においてIEN-γを発現する比例及び発現強度を分別選択して定量した。CD4+CD25＋リンパ細胞亜群における細胞内のFoxp3を発現する比例及び発現強度が調節性T 細胞染色キットのプロファイルに基づいて行った。
実験方法：プレオマイシンにより誘起された肺繊維化モデルを利用し、肺繊維化雌性Balb/c マウス20匹を確立するとともに、肺繊維化モデルと平行で、10 匹を生理食塩水で点鼻したものを正常マウス対照とし、即ち、マウスの分配は以下になる：(1) 正常対照（Normal）：生理食塩水で点鼻し、0.5％ CMC-Naで胃内投与した；(2) モデル対照(Control) ：プレオマイシンで点鼻し、0.5％ CMC-Naで胃内投与した；(3) ナリンゲニン治療群(Nar 100mg/kg)：プレオマイシンで点鼻し、0.5％CMC-Naで混合懸濁したナリンゲニン100mg/kg体重で胃内投与し、20匹/群、実験の1日目、プレオマイシン点鼻してマウス肺繊維化モデルを作製した；2日目、治療群がナリンゲニンで胃内投与をし、未治療群が同容量溶媒（0.1ml/10g体重）で胃内投与をし、1日1回；21日目にマウスを死亡させ、肺臓を切り除き、せん断され、1 mg/mlコラーゲナーゼDと0.02mg/ml DNA 酵素Iを含有するHBSS溶液37°Cで90分間消化して単細胞になり、70μm 細胞濾過器で細胞断片を除去し、HBSS 溶液で2回洗浄し、35％Percoll PBSに懸濁して、70％Percollの上部に加入し、2500rpm、20分間遠心分離し、リンパ細胞を収集し、先に25ng/ml PMA と500 ng/ml イオノマイシン(Ionomycin)で刺激培養5時間、ブレフェルジン(Brefeldin) A 溶液を添加してさらに3h 培養した。キットの説明により、細胞固定、透過後に対してFITC-カップリングした抗-CD4、Percp-cy5.5-カップリングした抗-CD8、PE-カップリングした抗IEN-γの染色した後のフローサイトメトリーでリンパ細胞亜群においてIEN-γを発現する比例及び発現強度を分別選択して定量した。CD4+CD25＋リンパ細胞亜群における細胞内のFoxp3を発現する比例及び発現強度が調節性T 細胞染色キットのプロファイルに基づいて行った。
結果：阻害性T 調節細胞ireg は、主な免疫阻害の主なレギュレーターであり、TGF-β1 免疫阻害の実行者でもある。プレオマイシンでモデルを作製した21 日目、マウス繊維化肺臓組織中でireg マーカーFoxp3 を発現するCD4+CD25＋細胞の比例が増加し（p<0.05、図13a,13bに示す）、対応しているIEN-γレベルがCD4＋及びCD8＋において低下した（p<0.05、図14a,14bに示す）。ナリンゲニンig 100mg/kg で治療した後、マウス繊維化肺臓組織中のこれらを改変して正常に回復させ（p<0.05、図13,14に示す）、ナリンゲニンがTGF-β1を阻害することにより繊維化肺臓組織内の免疫阻害を解除することができることが示唆された。
実施例7．ナリンゲニンが腫瘍肺転移した肺繊維化マウスに及ぼす影響
実験方法：プレオマイシンにより誘起された肺繊維化モデルを利用し、肺繊維化雌性Balb/c マウス40 匹を確立するとともに、肺繊維化モデルと平行で、20匹Balb/c が生理食塩水で点鼻したものを正常マウス対照とし、即ち、マウスの分配は以下になる：(1) 正常対照（Normal）：生理食塩水で点鼻し、0.5％CMC-Naで胃内投与した；(2) モデル対照(Control) ：プレオマイシンで点鼻し、0.5％CMC-Naで胃内投与した；(3) ナリンゲニン治療群(Nar 100mg/kg)：プレオマイシンで点鼻し、0.5％CMC-Na で混合懸濁したナリンゲニン100mg/kg体重で胃内投与し、プレオマイシンで点鼻した後7日目、インビトロ培養されたマウス乳がん4Ｔ1細胞をトリプシンで消化して単細胞懸濁液を調整し、細胞数を5×105/mlに調節し、0.2ml/匹尾静脈注射によりマウスを接種した。同じ日に、治療群がナリンゲニンで胃内投与し、未治療群が同容量溶媒（0.1ml /10g体重）で胃内投与をし、1日1回、4週間連続して行った。腫瘍接種して28日後、マウスを死亡させ、10匹/群、肺臓を取り、重さを測り、肺臓の肉眼で見られる腫瘍結節数を計算し、腫瘍肺転移の発生率及び転移された腫瘍のサイズを比較した。また、10匹が生存期間観察に用いられ、腫瘍接種した後70 日以内に肺転移に死亡されたマウスの数を記録し、マウスの生存を分析して比較した。
実験方法：プレオマイシンにより誘起された肺繊維化モデルを利用し、肺繊維化雌性Balb/c マウス40 匹を確立するとともに、肺繊維化モデルと平行で、20匹Balb/c が生理食塩水で点鼻したものを正常マウス対照とし、即ち、マウスの分配は以下になる：(1) 正常対照（Normal）：生理食塩水で点鼻し、0.5％CMC-Naで胃内投与した；(2) モデル対照(Control) ：プレオマイシンで点鼻し、0.5％CMC-Naで胃内投与した；(3) ナリンゲニン治療群(Nar 100mg/kg)：プレオマイシンで点鼻し、0.5％CMC-Na で混合懸濁したナリンゲニン100mg/kg体重で胃内投与し、プレオマイシンで点鼻した後7日目、インビトロ培養されたマウス乳がん4Ｔ1細胞をトリプシンで消化して単細胞懸濁液を調整し、細胞数を5×105/mlに調節し、0.2ml/匹尾静脈注射によりマウスを接種した。同じ日に、治療群がナリンゲニンで胃内投与し、未治療群が同容量溶媒（0.1ml /10g体重）で胃内投与をし、1日1回、4週間連続して行った。腫瘍接種して28日後、マウスを死亡させ、10匹/群、肺臓を取り、重さを測り、肺臓の肉眼で見られる腫瘍結節数を計算し、腫瘍肺転移の発生率及び転移された腫瘍のサイズを比較した。また、10匹が生存期間観察に用いられ、腫瘍接種した後70 日以内に肺転移に死亡されたマウスの数を記録し、マウスの生存を分析して比較した。
結果：腫瘍細胞静脈でプレオマイシンでモデル作製した7 日後のマウスに接種し、肺繊維化マウスに腫瘍を接種した後28日目の腫瘍負荷肺臓の重さが0.584g で、未肺繊維化対照マウス腫瘍負荷肺臓の重さ（0.254g）の2.3倍になり、ナリンゲニンig 100mg/kg で治療した肺繊維化マウス腫瘍負荷肺臓の重さ0.263gで、未治療の肺繊維化マウス腫瘍負荷肺臓の重さより54.95％減少し、未肺繊維化対照マウス腫瘍負荷肺臓の重さに相当した（p<0.05、図15に示す）。
生存期間の観察において、10匹の肺繊維化の肺転移マウスのメディアン生存日数が39日で、未肺繊維化の10匹の肺転移マウスのメディアン生存日数63日より24日短縮し（38.1％）、ナリンゲニンig 100mg/kgで治療した10匹の肺繊維化の肺転移マウスのメディアン生存日数が56日で、未治療の肺繊維化の肺転移マウスのメディアン生存日数より17日延長した（43.6％）（p<0.01、図16に示す）。
Claims (2)
- 肺繊維化に罹患している被験者における転移性腫瘍の治療及び／または予防のための医薬の調製のための、形質転換成長因子-β1のシグナル経路阻害剤としてのナリンゲニンまたはナリンジンの使用。
- 前記医薬が、経口錠剤、皮下注射剤、静脈注射剤またはその凍結乾燥形態である、請求項１に記載の使用。
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