JP5470597B2 - 希少糖d−アロースを利用した細胞・組織・臓器保存液及び該液を用いる保存方法 - Google Patents
希少糖d−アロースを利用した細胞・組織・臓器保存液及び該液を用いる保存方法 Download PDFInfo
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
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Description
特に、移植臓器にあっては、低温保存が主流であり、約4〜24時間が保存限界であるため、早急な保存、蘇生技術の確立が要望されている。実際には、University of Wisconsin Solution(UW液)を使用したラット、うさぎ、ひひの摘出心臓の低温保存および蘇生にあっても、6〜18時間が限度である。また、このUW液とパーフルオロカーボン媒体とを組合せて用い、ラットの心臓を保存し、移植に成功したのは、24時間(5匹全部)から48時間(5匹中4匹)である。この理由は、摘出心臓が4℃の低温や虚血傷害に曝されると、細胞膜に損害が与えられるため、組織細胞が蘇生できないことによる。
斯かる欠点のない臓器保存剤として、特許文献1においては、トレハロース、ヒドロキシエチル澱粉及び諸種の電解質を含んでなる臓器保存剤が提案され、また、特許文献2〜4においては、合成物質であるL−アスコルビン酸 DL−α−トコフェロール燐酸ジエステルカリウム(以下、「EPC−K」と略記する。)を含んでなる臓器保存剤が提案されている。しかしながら、前者の臓器保存剤は、合成物質であるヒドロキシエチル澱粉の分子量と置換度をごく限られた範囲に調整しなければならないので、製剤の調製と恒常性の維持が難しいという問題がある。また、後者の臓器保存剤で用いられるEPC−Kは、水に対する溶解度が低いうえに、諸種の薬理作用も具備するので、被提供者の事情によっては、EPC−Kの配合量を下げたり、場合によっては、使用そのものを見合わせざるを得ない場合がある。
具体的には、本発明は、(1)D-アロースを用いてUW液を特定の器官(腎臓)に適する保存溶液として改良することができることを実験的に裏付けようとするものである。また、(2)動物またはヒト臓器、動植物の組織または細胞を低温保存(−5乃至20℃)で延長保存することを可能にする、商業的に実施可能で有効な保存溶液、(3)動物またはヒト臓器、動植物の組織または細胞を低温保存(凍結が始まる温度から−196℃)で延長保存することを可能にする、商業的に実施可能で有効な保存溶液を提供することを目的とする。
さらに、(4)最近、***または卵子の機能異常にOxidative stressが原因であるとする報告が散見されるところ、本発明は、希少糖(特に、希少糖のうち抗酸化作用を有するD-アロース)を用いて***および/または卵子および/または受精卵の低温保存液または凍結保存液の改良を行うことを目的とする。
(1)動物またはヒト臓器の−5乃至20℃の間の、および、動植物の細胞の凍結が始まる温度から−196℃までの間の低温保存のための保存液であって、前記液が0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含有する保存液。
(2)動物またはヒト臓器が、ヒト腎臓である上記(1)の保存液。
(3)動植物の細胞が、動物またはヒト由来の細胞である上記(1)の保存液。
(4)動物またはヒト由来の細胞が、ヒトまたは動物***および/または卵子および/または受精卵である上記(3)の保存液。
(5)低温での動物またはヒト臓器、および、動植物の細胞の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロース含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液を該臓器に灌流すること、もしくは該保存液に該臓器を浸漬すること、または該保存液に該細胞を混合すること、および
(b)次いで、−5乃至20℃の間の低温に該臓器を冷やすこと、または凍結が始まる温度から−196℃までの温度の間の低温で該細胞を凍結すること、を具備する方法。
(6)低温での動物またはヒト臓器の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液を該臓器に灌流すること、もしくは該保存液に該臓器を浸漬すること、または該保存液に該細胞を混合すること、および
(b)次いで、−5乃至20℃の間の低温に該臓器を冷やすこと、を具備する方法。
(7)低温で動物またはヒト細胞の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液と該細胞を混合すること、(b)次いで、凍結が始まる温度から−196℃までの温度の間の低温で該細胞を凍結すること、を具備する方法。
(8)低温でヒトまたは動物***および/または卵子および/または受精卵の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液と該***および/または卵子および/または受精卵を混合すること、(b)次いで、凍結が始まる温度から−196℃までの温度の間の低で該***および/または卵子および/または受精卵を凍結すること、を具備する方法。
2)動物またはヒト臓器、および、動植物の組織または細胞を低温保存(−5乃至20℃)で延長保存することを可能にする、商業的に実施可能で有効な保存溶液を提供することができる。
3)動物またはヒト臓器、および、動植物の組織または細胞を低温保存(凍結が始まる温度から−196℃)で延長保存することを可能にする、商業的に実施可能で有効な保存溶液を提供することができる。
4)最近、***または卵子の機能異常にOxidative stressが原因であるとする報告が散見されるところ、本発明は、希少糖のうち抗酸化作用を有する希少糖(特に、D-アロース)を用いて***および/または卵子および/または受精卵の生存率、***の運動率を向上する低温保存液または凍結保存液、並びに、それらの液を用いた保存方法を提供することができる。
以下、これらの単糖の関係を一層容易に理解するために提案されたイズモリング(Izumoring、登録商標、以下省略)に基づき説明を加える(WO 03/097820参照)。
図17で示される生産過程と分子構造(D型、L型)により、炭素数4から6の単糖全てをつないだ連携図がイズモリング(Izumoring)の全体図である。すなわち、図17から理解できることは、単糖は、炭素数4、5、6全てがつながっているということである。全体図は、イズモリングC6の中でのつながりと、イズモリングC5の中でのつながりと、イズモリングC4の中でのつながりと、C4、C5、C6が全てつながっていることである。この考え方は重要である。炭素数を減少させるには主に発酵法を用いる。炭素数の異なる単糖全てをつなぐという大きな連携図であることも特徴である。
しかしながら、これまでの研究では上のグループ、真ん中のグループ、下のグループは酵素反応でつながっていなかった。つまり、上のグループに属しているD-グルコース(ブドウ糖)やD-フラクトースは自然界に多量に存在する糖であり安価であるが、これらから希少糖を合成することができなかった。ところが、本発明者らの研究の過程で、これを結ぶ酵素が発見された。それはガラクチトールからD-タガトースを合成する酵素を持つ菌の培養液中に、全く予期しなかったD-ソルボースが発見されたことに端を発する。その原因を調べた結果、この菌がD-タガトース3エピメラーゼ(DTE)という酵素を産生していることを発見した。
図18の下段および図19に示すように、このDTEはこれまで切れていたD-タガトースとD-ソルボースの間をつなぐ酵素であることがわかる。そしてさらに驚くことに、このDTEは全てのケトースの3位をエピ化する酵素であり、これまで合成接続できなかったD-フラクトースとD-プシコース、L-ソルボースとL-タガトース、D-タガトースとD-ソルボース、L-プシコースとL-フラクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有するユニークな酵素であることが分かった。このDTEの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング(Izumoring)と名付けた。
この図19をよく見てみると、左側にL型、右側にD型、真ん中にDL型があり、しかもリングの中央(星印)を中心としてL型とD型が点対称になっていることもわかる。例えば、D-グルコースとL-グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリング(Izumoring)の価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、D-グルコースを出発点としてL-グルコースを生産しようと思えば、D-グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとL-グルコースが作れることを示している。
炭素数が6つの単糖(ヘキソース)のイズモリング(Izumoring)を使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。D-グルコース、D-フラクトース、D-マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるD-ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。DTEの発見によって、D-グルコースからD-フラクトース、D-プシコースを製造し、さらにD-アロース、アリトール、D-タリトールを製造することができるようになった。
炭素数が6つの単糖(ヘキソース)のイズモリング(Izumoring)の意義をまとめると、生産過程と分子構造(D型、L型)により、すべての単糖が構造的に整理され(知識の構造化)、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。
D-アロースに変換可能な基質を酵素反応でD-アロースに変換する際に用いる酵素の種類は限定されないが、D-プシコースからD-アロースを生産することができる酵素「L-ラムノースイソメラーゼ」を好ましいものとして例示される。L-ラムノースイソメラーゼは、「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング(Journal of Fermentation and Bioengineering)」第85巻、539乃至541頁(1998年)で発表された公知酵素である。L-ラムノースからL-ラムニュロースへの異性化反応ならびにL-ラムニュロースからL-ラムノースへの異性化を触媒する酵素である。L-ラムノースイソメラーゼは、D-アロースとD-プシコースの間の異性化にも作用するので、D-プシコースからD-アロースを生産することができる酵素である。
本発明の保存液は従来公知の動物またはヒト臓器、および、動植物の組織または細胞の保存液と同様にして用いることができる。臓器保存液として用いる場合は、公知の臓器保存容器や潅流装置と組合せることによって、いわゆる、「単純冷却保存法」及び「低温持続潅流保存法」を適用することができ、例えば、摘出直後の臓器の初期潅流液、初期潅流後の浸漬保存液及び潅流保存液、さらには、血液を再潅流させる前のリンス液として用いることができる。臓器を浸漬又は潅流するときの浸透圧は250乃至500mOsm/l、望ましくは、300乃至450mOsm/lの範囲に、また、pHは3乃至10、望ましくは、6.5乃至8.0の範囲にそれぞれ設定すればよい。使用時における希少糖D-アロースの濃度は、通常、0.01mM以上、望ましくは、0.1乃至200mMの範囲とする。したがって、臓器保存液の形態によっては、使用に先立って、斯かる濃度になるように適宜溶解・希釈する。また、臓器を浸漬又は浸漬して保存する温度は、臓器の種類、摘出時の状態及び保存時間にもよるが、通常、体温を下回る温度、望ましくは、−5乃至20℃、さらに望ましくは、−3乃至15℃に設定する。
1.使用した細胞:Hela (ヒト子宮頸癌)、OVCAR-3(ヒト卵巣癌)、HuH-7(ヒト肝臓癌)、HaCaT(ヒト皮膚角化細胞)、HFB(ヒト繊維芽細胞)、NIH3T3(マウス繊維芽細胞)である。2.凍結保存
培地、Cell Bunker(市販保存液)、DMSOの上で各細胞にD-アロースなど糖類を25,50mMの濃度で添加し用いた。単糖類として用いたのは、自然に多量に存在するD-グルコース、D-フラクトース、D-マンノース、D-ガラクトースと、希少糖としてD-アロース、D-プシコース、D-アルトロース、アリトール、D-タリトール、L-ソルボースを使用した。また二糖類であるトレハロース(Trehalose)も用いた。細胞は-80℃凍結で24時間保存した。
3.測定
1)細胞生存率:一日後、細胞を解凍し、トリパンブルー染色法で生存率を判定した。
2)細胞増殖:一日後、細胞を解凍し、細胞を0.25 x 104/well/0.1ml - 2 x 104/well/0.1mlとなるように96wellプレートにいた。一定の時間後で、MTT assayにより、細胞増殖を測定した。
1)培養液単独での細胞解凍後の生存率については、より多くのHFB細胞が、希少糖添加により生き残ることを明らかにした(図1)。一般的に自然に多量に存在するD-グルコース、D-フラクトース、D-マンノース、D-ガラクトースに比べ、希少糖類を添加したものにおいて生存率が高かった。
2)冷凍細胞の機能を見る実験として、細胞解凍後の増殖を調べたところ、D-アロースなどの希少糖を添加により保存したHFB細胞では、そうでないものに比べて増殖速度が速く、機能的にも傷害を受けていないことが判った(図2)。文献的にもよく使用されているトレハロースと比較したが、ほぼ同様の効果が得られた。NIH3T3細胞を用いて同様の実験を行ったが、同じ結果が得られた。
3)次に細胞の冷凍保存に汎用されているCell Bankerに希少糖を添加し、保存能力に対する効果を比較検討した。Cell Bankerに希少糖を加えた保存液で凍結保存したHFB細胞およびNIH3T3細胞は、Cell Bankerのみに比べて、より強い増殖力があることが認められた(図3、NIH3T3の場合)。トレハロースと比較したが、ほぼ同様の効果が得られた。
4)DMSO(dimethyl-sulfoxide)も通常10%を培養液に添加して冷凍保存に用いられているのでDMSOの系においても希少糖の作用を検討した。10%のDMSOを用いた系では、希少糖の効果の差がでにくいので、DMSOの濃度を1%に落としsub-optimalな条件での細胞保存効果を比較検討した。細胞としてはNIH3T3、OVCAR-3、HaCaT、HFB細胞などを用いた。DMSOによる保存効果が、D-アロースの添加により改善することが認められた(図4、NIH3T3細胞の場合、図5、OVCAR-3細胞の場合)。
1)D-アロースなどの希少糖は、D-グルコースなどの天然型単糖に比べて生存率の向上において細胞保存効果が強い傾向が認められた。またその後の細胞の増殖を調べたところ、希少糖(D-アロース)存在下で保存したものは、そうでないものに比べて高かった。
2)上記効果は、細胞保存効果があるとの報告(Biol Reprod. 2003 Oct;69 (4):1245-50. Epub 2003 Jun 11.など)があるトレハロースとの比較検討で、少なくとも同程度の効果があることが判明した。
3)D-アロースなど希少糖を添加した細胞の冷凍保存効果があることから、D-アロースは細胞や臓器を長時間保存する有効な保存液を開発することが可能となるであろう。
4)今後は、これまでの研究を継続し、通常用いている冷凍保存液に各種糖を添加した保存液を作製し、マイナス80度冷凍庫または液体窒素中に保存し、細胞の生存率および機能に対する影響を検討する。
5)糖類の種類、濃度、希少糖の組み合わせ、保存期間をさまざまに変えて有効率を検討し、最良の条件を明らかにしていく。
1. 使用した細胞:Hela (ヒト子宮頸癌)、OVCAR-3(ヒト卵巣癌)、HaCaT(ヒト皮膚角化細胞)、HFB(ヒト繊維芽細胞)、NIH3T3 (マウス繊維芽細胞) である。
2. 凍結保存
培地、Cell Banker(市販保存液)、DMSOの上で各細胞にD-alloseなど糖類を0.2, 0.4, 0.6,0.8, 1Mの濃度で添加し用いた。単糖類として用いたのは、自然に多量に存在するD-glucose,D-fructose, D-mannose, D-galactoseと、希少糖としてD-allose, D-altrose, D-psicose, L-psicose, D-sorbose, L-sorbose, D-tagatose, L-tagatos, L-fructoseを使用した。また二糖類であるtrehaloseも用いた。D-allose冷凍の細胞は-80℃及び液体窒素で24時間、1週間、4週間で凍結保存した。
3. 測定
1) 細胞生存率:細胞を解凍し、トリパンブルー染色法で生存率を判定した。
2) 細胞増殖:D-allose、trehaloseの最適濃度で細胞を24時間冷凍保存し、解凍後、細胞を0.5−1 x 104/well/0.1mlとなるように96 well プレートにまいた。 一定の時間後で、MTTassay により、細胞増殖を測定した。
1)培養液単独の上でD-allose添加した時の解凍後の細胞の生存効果については、各細胞でのD-allose の最適濃度は0.4M-0.6Mである。その際の細胞生存率は約40-70%であることが判った(図6)。
2)解凍後の細胞生存率についてほかの希少糖及び一般的に自然に多量に存在する糖(0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1M)との比較対照は現在進行中ではあるが、D-alloseを添加したものにおいてはほかの希少糖と比べると生存率が一番高い傾向がある。
3)D-allose含有medium、Cell Banker細胞保存液、mediumのみ、trehalose含有mediumで保存した細胞のトリパンブルー染色を行った。白く見える細胞が生細胞であり、黒く見える細胞がトリパンブルーを取り込んだ死細胞である。Mediumのみと比べるとD-allose含有mediumで保存した場合に生き残った細胞が多く、これは文献的にもよく使用されているtrehalose含有保存液と程度のものであった(図7)。
4)冷凍細胞の機能を見る実験として、D-alloseを添加し保存した細胞は、そうでないものに比べて増殖速度が速く、機能的にも通常用いている市販のCell Banker細胞保存液と比べて障害をあまり受けていないことが判った。trehaloseとも比較したが、ほぼ同様の効果が得られた(図8)。
5)細胞の冷凍保存に汎用されている10%DMSO(dimethyl-sulfoxide)及びCell BankerにD-alloseを添加し、保存能力に対する効果を比較検討した。DMSO とCell Bankerのみに比べて、D-alloseの濃度が高いほど細胞の生存率が下がった。
6)DMSOの濃度を1、2, 3%に落としsub-optimalな条件での細胞保存効果を比較検討した。細胞としてはOVCAR-3、HaCaT、HDF細胞を用いた。DMSOによる保存効果が、D-alloseの添加により1, 2% DMSO使用しても生存率は約70%以上になることが認められた (図9)。
7)冷凍保存の時間が1ヶ月ほど伸びても細胞の生存率はあまり変わらなかった。
8)冷凍保存の温度については液体窒素よりー80℃での生存率が、ずっとよかった。
1)今までの研究において、D-alloseの使用濃度は50mMであったが、余り大幅な改善効果が得られなかった。D-alloseの保存剤としての有効性を高めるためにはD-alloseの使用濃度は0.4―0.6Mが最適だった。
2)D-alloseは細胞保存効果が強い傾向が認められた。また、解凍後の細胞の増殖能力について、D-allose存在下で保存したものは、そうでないものに比べて高かった。
3)上記効果は、細胞保存効果があるとの報告(Biol Reprod. 2003 Oct;69 (4):1245-50. Epub 2003 Jun 11.など)があるtrehaloseとの比較検討でも、同様の効果があることが判明した。
4)D-alloseは細胞に傷害性がある冷凍保存液DMSOの使用量を減少することができると思われる。
5)D-allose冷凍保存剤としての保存温度は、−80℃で保存するのが最適である。
6)D-alloseなど希少糖を添加した細胞には冷凍保存効果があることから、D-alloseは細胞や臓器を長時間保存するのに有効な保存液を開発することが可能となるであろう。
7)今後は、これまでの研究を継続し、希少糖の種類、濃度、冷凍保存液の組み合わせなど変えて細胞の生存率および機能に対する影響を検討し、最良の条件を明らかにしていく。
[はじめに]
腎移植後の腎の生着率はUW液の開発とともに、飛躍的に改善した。しかし、移植腎の虚血は移植腎の急性拒絶反応や機能低下を引き起こし、生着率に大きく関与している。
腎虚血時、血管内皮ではATPが枯渇し、カルシウムや活性酸素(reactive oxygen species:ROS)が産生され、好中球活性化とICAM-1などの接着因子が発現する。また血球系ではマクロファージが活性化し、TNF(Tumor necrosis factor)やROSが放出され、その結果、好中球が活性化され、発現した接着因子により集積し、血管内皮から組織中に入り込み、エラスターゼなどの組織融解酵素を放出し、組織障害へと進展する。腎移植後の移植腎の機能障害および拒絶反応の予防には、各種の抗サイトカイン製剤、ICAM-1などの接着因子の阻害などが試みられている。
一方、虚血性腎不全からの尿細管細胞の再生にはEpidermal Growth Factor(EGF)、Hepatocyte Growth Factor(HGF)等の成長因子が関与している。これらの成長因子を虚血後に投与することで、腎障害を抑制し、腎の回復を促進するといわれている。
今まで以上に、保存液中の腎の障害性因子の産生を抑え、再生因子の産生を維持し、または増加させる働きのある腎保存液を改良することで、腎の保存時間の延長や移植腎の拒絶反応や機能障害を軽減することが可能となり、移植腎の生着が飛躍的に改善されることが期待される。
腎移植時には、(1)保存液中の腎の障害性因子の産生を抑え、再生因子の産生を維持または増加させる作用のもつ腎保存液への改良、および(2)移植後に組織障害の原因となる好中球の活性化および集積を抑制、の2点が腎の保存時間の延長や移植腎の拒絶反応や機能障害を軽減することが可能となり、移植腎の生着が飛躍的に改善されることが期待される。
そこで、本実施例では、
1.D-アロースのUW保存液への添加による腎での白血球接着因子であるICAM-1と再生因子であるEGFに及ぼす影響、2.D-アロースの腎虚血再灌流後の白血球の活性化因子であるCINC-1および白血球の集積(MPO)に及ぼす影響を検討した。
1.
対象: 200g〜280g、雄 ラット
実験準備:実験12時間前に絶食。ラットをネンブタールの腹腔内投与で麻酔後、腹を電気カミソリで剃毛し、エーテルで拭き、開腹する。腎動脈上の腹部大動脈をクランプする。腎動脈下の腹部大動脈からUW液を灌流できるようにする。
グループ分け:対照群 :UW液のみ、D-アロース群:UW液にD-アロースを5mg/mlの濃度になるよう添加する。
実験方法:対照群、D-アロース群はそれぞれのUW液で灌流後に腎臓を取り出し、対照群、D-アロース群それぞれのUW液に入れ、pre、12、24、48、72時間、4℃で保存する。
評価:障害因子ICAM-1および、再生因子EGFの mRNAの発現をノーザンブロットにて検討した。
2.
対象:体重200〜250g前後の雄性ラット
実験方法:ラットをネンブタールで麻酔後に腎虚血モデルを作製。
腎虚血モデル:右腎摘出後、左腎血管を45分間クランプ
D-アロース群は腎虚血30分前に400mg/kgを静脈内投与する。対照は生食投与とする。
評価:虚血再灌流後のCINC-1蛋白量, 白血球の集積の指標であるMPOの経時変化
1.アロース添加UW液によるICAM-1mRNA発現に及ぼす影響を図10に示す。
腎保存中のICAM-1mRNAの発現は、対照群では徐々に増加し24時間後に最高となっている。一方D-アロース群では、その発現は軽減している。特に12時間、24時間で明らかである。
アロース添加UW液によるEGFmRNA発現に及ぼす影響を図11に示す。
対照群のEGF mRNAの発現は保存時間とともに低下しており再生因子の減少を示しているが、D-アロース群では48時間、72時間でも発現が維持されている。
2.虚血再灌流後のCINC-1蛋白量は2時間をピークとなり以後減少するが、アロースの前投与で有意に減少させることができた。(図12)
白血球の集積の指標であるMPOは再灌流6時間後にピークとなるが、アロースにより抑制された。(図13)
上記の結果から、D-アロースをUW液に添加すること腎移植後の移植腎の機能障害の原因となる接着因子であるICAM-1の発現を抑制し、腎の再生に作用するEGFの発現を保持している可能性が示唆された。さらに移植後と同じ状態である虚血再灌流後のCINC-1を産生を抑制し、MPOの抑制から腎への白血球の集積を減少することできる可能性が示唆された。
D-アロースには、抗酸化作用があることが証明されている(Murata et al. J. Bioengineering and Bioscience, 2003)。この作用は培養細胞の保存や、***などの保存に有効であるという成績も得られている。こうした作用が移植腎の機能障害に対する保護作用につながることは十分に考えられたが、それに加えて上記作用が確認されたわけであり、より有効な保存液として使用できる可能性がある。
今後は、D-アロースの添加量の検討、ICAM-1やEGFの蛋白レベルでの有効性の確認と移植後の腎機能をBUN、Crなどで評価する必要がある。すでに、本発明者らはD-アロースの前投与でラット腎虚血再灌流後に好中球の活性化、遊走が阻害され、腎機能障害が軽減されることを証明している(WO 03/097820)。
これらの結果とともに、最終的には腎移植時の保存液の改良のみならず、移植腎を取り出す前から、D-アロースを投与し、その後腎臓を取り出し、D-アロース添加保存液で腎臓を保存することが考えられる。さらに移植後もD-アロースを継続投与することで、移植後の腎機能障害および拒絶反応を予防できる可能性が示唆された。このようなD-アロースによる新しい腎移植システムの確立を目指していく。
腎臓で観察されたこのD-アロースの効果は、他の臓器(肝臓、心臓、肺臓など)においても同様に有効であることが想定される。
最近、Oxidative stressが***の生存率、運動率に影響を与えるとする報告が散見され、注目されている。
本実施例では、本発明者らは、希少糖のうち抗酸化作用を有するD-アロースを用いて***凍結保存液の改良を行い、その効果を検討した。
正常***所見を示す24〜44歳(mean:29.9)の健常男子10名の***を対象とした。すべての被検者から承諾を得るとともに、***採取法の均一化を図った。
***は3〜5日間の禁欲後に用手的に採取し、室温で液化させた後、80%Percoll液攪拌密度勾配法で洗浄濃縮した。得られた***混濁液(0.2ml)と凍結保存液を等量混合して凍結用チューブ(住友ベークライト、セラムチューブ)に充填し、液体窒素蒸気凍結法にて凍結した後、液体窒素タンク内で保存した。凍結保存液(図14参照)はKS-II***保存液内の糖モル数は変化させずにD-アロースとD-グルコースとの添加配分を変化させ(A群=1:0 B群=3:1 C群=1:1 D群=1:3 E群=0:1)使用した。1ヵ月後、凍結***の融解は微温湯中(30℃)で振盪して行い、更に凍結保存液の除去および再濃縮の目的で密度勾配遠心法を行い作製した***浮遊液を検討に供した。
検討法として、***運動率はMakler Counting Chamberによる目視法とC-IMAGING SYSTEMSとで計測し、生存率は0.5%Eosin Y染色により算定した。
図15に***凍結法を示した。まず液状化***を80%パーコール液を用いて攪拌密度勾配法を施行し洗浄濃縮***を得る。次に***保存液と混合、液体窒素蒸気凍結法にて保存***を凍結した後、液体窒素タンク内にて1ヶ月保存した。解凍後すぐにハンクス液で希釈、80%パーコール液を用いて攪拌密度勾配法による保存液除去と再濃縮を行った。
1)C-IMAGING SYSTEMSによる計測は***の密度、不純物、温度等の影響をうけ、再現性を欠いたため、今回は目視法による結果を供覧した。
2)10検体の内、1検体はセラムチューブの破損により結果を得られなかった。
3)D-アロースのみ用いた凍結保存液は、グルコースのみ用いた既存KS-II保存液と比べ、9例中8例で融解***運動率が高かった。(P=0.0469、Mann-Whitney U-test、図16参照)
4)D-アロースを用いた凍結保存液は、生存率においては、はっきりとした効果を示さなかった。(図17参照)
1)D-アロースの持つ生理活性が融解***の運動率の向上に有益に働いている可能性が高い。
2)D-アロースが持つ生理活性と***に対する作用機序を今後検討していく必要がある。
3)まず、D-アロースを用いた***培養液を用いて、***運動率の経時的変化を観察する実験系を確立、施行していく。
4)卵子についても同様の実験を検討する。
5)動物の***、卵子、受精卵を用いて保存実験を行う。
6)実施例2で認められたように、D-アロースの高濃度領域において、細胞冷凍保存効果が高いことが検証されている。***の保存においても、高濃度のD-アロースを用いた解析が必要である。
また本発明者らはすでに虚血障害保護作用を、肝臓、心臓、皮膚など他の臓器においても観察している。腎臓のみならず多くの臓器の保存剤へのD-アロースの応用が期待できる。
さらに***のみならず、卵子あるいは受精卵の冷凍保存も重要になってきている。これらの対象に対しても有効な保存液の開発の可能性がある。
Claims (8)
- 動物またはヒト臓器の−5乃至20℃の間の、および、動植物の細胞の凍結が始まる温度から−196℃までの間の低温保存のための保存液であって、前記液が0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含有する保存液。
- 動物またはヒト臓器が、ヒト腎臓である請求項1の保存液。
- 動植物の細胞が、動物またはヒト由来の細胞である請求項1の保存液。
- 動物またはヒト由来の細胞が、ヒトまたは動物***および/または卵子および/または受精卵である請求項3の保存液。
- 低温での動物またはヒト臓器、および、動植物の細胞の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液を該臓器に灌流することもしくは該保存液に該臓器を浸漬すること、または該保存液に該細胞を混合すること、および
(b)次いで、−5乃至20℃の間の低温に該臓器を冷やすこと、または凍結が始まる温度から−196℃までの温度の間の低温で該細胞を凍結すること、を具備する方法。 - 低温での動物またはヒト臓器の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液を該臓器に灌流すること、もしくは該保存液に該臓器を浸漬すること、および
(b)次いで、−5乃至20℃の間の低温に該臓器を冷やすこと、を具備する方法。 - 低温で動物またはヒト細胞の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液と該細胞を混合すること、(b)次いで、凍結が始まる温度から−196℃までの温度の間の低温で該細胞を凍結すること、を具備する方法。
- 低温でヒトまたは動物***および/または卵子および/または受精卵の低温保存方法であって、0.025M−0.6Mの濃度領域の希少糖D-アロースを含む低温保存のための保存液を用いて、(a)まず、該保存液と該***および/または卵子および/または受精卵を混合すること、(b)次いで、凍結が始まる温度から−196℃までの温度の間の低で該***および/または卵子および/または受精卵を凍結すること、を具備する方法。
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