JP5467297B2 - Biosurfactant manufacturing method - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、サトウキビ由来の成分を有効利用してバイオサーファクタント生産菌を培養する、バイオサーファクタントの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a biosurfactant, in which a biosurfactant-producing bacterium is cultured by effectively utilizing sugarcane-derived components.
サトウキビやトウモロコシは、燃料用エタノール(バイオエタノール)などの工業用アルコールを発酵により製造するための原料として、世界中において用いられている(例えば非特許文献1)。また、サトウキビは、バイオプラスチックの原料としても注目されており、今後もバイオプロセスの出発材料としての需要が増加するものと予想される。例えば、特許文献1には、サトウキビなどのシュクロースを含む原料から糸状菌アミロミセス・ルキシイによってL−乳酸を製造する方法が記載されている。 Sugarcane and corn are used all over the world as raw materials for producing industrial alcohol such as ethanol for fuel (bioethanol) by fermentation (for example, Non-Patent Document 1). Sugarcane is also attracting attention as a raw material for bioplastics, and it is expected that the demand for it as a starting material for bioprocess will increase in the future. For example, Patent Document 1 describes a method for producing L-lactic acid from a raw material containing sucrose such as sugarcane, using the filamentous fungus Amyromyces luxeii.
しかし、サトウキビやトウモロコシなどの農作物は高価であるため、安価なバイオエタノールなどの原料として使用するのは効率的ではない。また、将来、地球規模での食料不足が予測される点からも、食料としても貴重なこれらの農作物をエタノール発酵の原料として用いることは効率的とはいえない。 However, since crops such as sugar cane and corn are expensive, it is not efficient to use them as raw materials such as inexpensive bioethanol. In addition, it is not efficient to use these agricultural crops, which are valuable as food, as a raw material for ethanol fermentation, from the perspective of predicting food shortages on a global scale in the future.
したがって、微生物による生産プロセスにおいてサトウキビを効率よく活用するためには、より高い付加価値を有するバイオ素材を製造する技術の開発が望まれており、またこのような開発は、サトウキビ産業にとって重要な研究課題である。 Therefore, in order to efficiently use sugarcane in the production process using microorganisms, it is desired to develop technologies for producing biomaterials with higher added value, and such development is important research for the sugarcane industry. It is a problem.
ところで、高い付加価値を有するバイオ素材になりうるものとして、バイオサーファクタントが知られている。バイオサーファクタントは、微生物が生産する両親媒性の物質であり、優れた界面活性剤である。さらに、自己組織化可能であり、また特異な生化学的特性を示すことから、単なる界面活性剤としてではなく、高機能なバイオ素材として、幅広い産業での実用化が期待されている。 By the way, a biosurfactant is known as a biomaterial having a high added value. Biosurfactants are amphiphilic substances produced by microorganisms and are excellent surfactants. Furthermore, since it can be self-assembled and exhibits unique biochemical properties, it is expected to be put to practical use in a wide range of industries as a highly functional biomaterial, not just as a surfactant.
従来、バイオサーファクタントは油脂系バイオマスを原料として生産されているが、この方法では油脂類が生産物に混在し、生産物の回収が困難であるという問題を有している。したがって、バイオサーファクタントの製造技術においても、生産物の回収コストを低減させて製造コストを削減できる、効率よい技術の開発が望まれる。 Conventionally, biosurfactants are produced using oil-based biomass as a raw material, but this method has a problem that oils and fats are mixed in the product and it is difficult to recover the product. Therefore, in the biosurfactant manufacturing technique, it is desired to develop an efficient technique that can reduce the production cost by reducing the recovery cost of the product.
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、サトウキビを効率よく活用し、かつ製造コストを削減できる、バイオサーファクタントの製造方法を提供することにある。 This invention is made | formed in view of said subject, The objective is to provide the manufacturing method of the biosurfactant which can utilize sugarcane efficiently and can reduce manufacturing cost.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、サトウキビの液状成分と、サトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質とを混合することで、バイオサーファクタント生産に適した組成物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor is suitable for biosurfactant production by mixing sugar cane liquid components and colloidal substances other than sugar recovered from the sugar cane liquid components. The present inventors have found that a composition can be obtained and have completed the present invention.
すなわち、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法は、成分A及びBを含む培地を用いて、微生物を培養することを特徴としている。
成分A:サトウキビの液状成分、
成分B:サトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質。
That is, the method for producing a biosurfactant according to the present invention is characterized in that a microorganism is cultured using a medium containing components A and B.
Component A: Liquid component of sugarcane,
Component B: Colloidal material other than sugar recovered from the sugar cane liquid component.
また、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法では、上記成分Aが、サトウキビ搾汁であることが好ましい。 Moreover, in the manufacturing method of the biosurfactant which concerns on this invention, it is preferable that the said component A is sugarcane juice.
また、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法では、上記培地における上記サトウキビ搾汁が5重量%以上50重量%以下であることが好ましい。 Moreover, in the manufacturing method of the biosurfactant which concerns on this invention, it is preferable that the said sugarcane juice in the said culture medium is 5 to 50 weight%.
また、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法では、上記成分Bがサトウキビの液状成分のライミング残渣であることが好ましい。 In the method for producing a biosurfactant according to the present invention, the component B is preferably a rimming residue of a liquid component of sugarcane.
また、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法では、上記培地における上記成分Bが1重量%以上5重量%以下であることが好ましい。 In the method for producing a biosurfactant according to the present invention, the component B in the medium is preferably 1% by weight to 5% by weight.
また、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法では、上記微生物を、3日間以上14日間以内において培養することが好ましい。 Moreover, in the method for producing a biosurfactant according to the present invention, the microorganism is preferably cultured for 3 days to 14 days.
また、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法では、上記微生物は、クロボキン科(Ustilaginaceae)に属する微生物、ならびにキャンディダ(Candida)属及びスターメレラ(Starmerela)属の微生物からなる群より選択されるバイオサーファクタント生産菌であることが好ましい。 In the method for producing a biosurfactant according to the present invention, the microorganism is selected from the group consisting of a microorganism belonging to the family Ustylaginaceae, and a microorganism belonging to the genus Candida and the genus Starmerella. A producing bacterium is preferred.
また、本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法では、上記微生物は、シュードザイマ(Pseudozyma)属又はウスチラゴ(Ustilago)属のバイオサーファクタント生産菌であることが好ましい。 In the biosurfactant production method according to the present invention, the microorganism is preferably a biosurfactant-producing bacterium of the genus Pseudozyma or the genus Ustilago.
本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法は、上述したように、サトウキビの液状成分と、サトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質とを含む培地を用いて、微生物を培養するので、サトウキビを効率よく活用することができるとともに、製造コストを削減することができるので、付加価値の高いバイオサーファクタントを製造することができる。 As described above, the method for producing a biosurfactant according to the present invention cultivates a microorganism using a medium containing a liquid component of sugarcane and a colloidal substance other than sugar recovered from the liquid component of sugarcane. Since it can be utilized efficiently and the manufacturing cost can be reduced, a biosurfactant with high added value can be manufactured.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明に係るバイオサーファクタントの製造方法は、サトウキビの液状成分と、サトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質とを含む培地を用いて、微生物を培養すればよい。 The method for producing a biosurfactant according to the present invention may cultivate a microorganism using a medium containing a liquid component of sugarcane and a colloidal substance other than sugar recovered from the liquid component of sugarcane.
〔バイオサーファクタント〕
バイオサーファクタント(以下、「BS」と略記することもある)とは、微生物が生産する両親媒性の物質であればよい。
[Biosurfactant]
The biosurfactant (hereinafter sometimes abbreviated as “BS”) may be an amphipathic substance produced by a microorganism.
バイオサーファクタントとしては、例えば、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質等が挙げられる。糖脂質系の界面活性物質としては、マンノシルエリスリトールリピッド(mannosyl erythritol lipid、以下、「MEL」と略記することもある)、ソホロリピッド(以下、「SL」と略記することもある)、セロビオースリピッド(以下、「CL」と略記することもある)等が挙げられる。 Examples of the biosurfactant include glycolipid-based, acyl peptide-based, phospholipid-based, fatty acid-based and polymer-based surfactants. Examples of the glycolipid-based surfactant include mannosyl erythritol lipid (hereinafter sometimes abbreviated as “MEL”), sophorolipid (hereinafter also abbreviated as “SL”), cellobiose lipid (hereinafter referred to as “SL”). , And may be abbreviated as “CL”).
なお、MELはマンノースにエリスリトールと0〜2個の脂肪酸と2個のアセチル基が結合した糖脂質であり、アセチル基の結合位置と数によって、4種類のMEL(MEL‐A、MEL‐B、MEL‐C、MEL‐D)が存在することが知られている。また、MELは、界面活性能以外にも抗微生物活性、白血病細胞、神経系細胞などの細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症・抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、癌細胞増殖抑制活性など多様な機能が知られている。 MEL is a glycolipid in which erythritol, 0 to 2 fatty acids, and 2 acetyl groups are bound to mannose. Depending on the binding position and number of acetyl groups, MEL (MEL-A, MEL-B, MEL-C, MEL-D) are known to exist. In addition to its surface activity, MEL has antimicrobial activity, cell differentiation induction activity such as leukemia cells and nervous system cells, glycoprotein binding activity, anti-inflammatory / antiallergic activity, apoptosis induction activity, cancer cell growth inhibition activity, etc. Various functions are known.
〔微生物〕
本発明における微生物としては、バイオサーファクタント生産菌を用いることが好ましい。バイオサーファクタント生産菌とは、バイオサーファクタント生産能を有する菌株であればよく、例えば既にバイオサーファクタント生産菌として知られているものでもよいし、新たに見出されたものであってもよい。
[Microorganisms]
As the microorganism in the present invention, a biosurfactant-producing bacterium is preferably used. The biosurfactant-producing bacterium may be a strain having a biosurfactant-producing ability. For example, it may already be known as a biosurfactant-producing bacterium, or may be newly found.
本発明における微生物としては、例えば、クロボキン科に属するバイオサーファクタント生産菌、キャンディダ属、スターメレラ属等に属するバイオサーファクタント生産菌等が挙げられる。クロボキン科に属するバイオサーファクタント生産菌としては、シュードザイマ属、ウスチラゴ属等が挙げられる。 Examples of the microorganism in the present invention include biosurfactant-producing bacteria belonging to the family Kerobokin, biosurfactant-producing bacteria belonging to the genus Candida, genus Starmerella, and the like. Examples of the biosurfactant-producing bacterium belonging to the family Klobokin include the genus Pseudozyma and the genus Ustilago.
バイオサーファクタント生産菌の例としては、マンノシルエリスリトールリピッド生産菌、ソホロリピッド生産菌、セロビオースリピッド生産菌等が挙げられる。マンノシルエリスリトールリピッド生産菌としては、シュードザイマ アンタークティカ(Pseudozyma antarctica)、シュードザイマ ルグローザ(P. rugurosa)、シュードザイマ アヒディス(P. aphidis)、シュードザイマ ツクバエンシス(P. tsukubaensis)、シュードザイマ クラッサ(P. crassa)、シュードザイマ シアメンシス(P. siamensis)、シュードザイマ ヒュベイエンシス(P. hubeiensis)、シュードザイマ グラミニコーラ(P. graminicola)、シュードザイマ シャンクシエンシス(P. shanxiensis)、シュードザイマ パランタークティカ(P. parantarctica)、ウスチラゴ メイディス(Ustilago maydis)、ウスチラゴ シノドンティス(U. cynodontis)、ウスチラゴ サイタミネア(U. scitaminea)等が挙げられる。ソホロリピッド生産菌としては、スターメレラ ボンビコーラ(Starmerela bombicola)、キャンディダ アピコーラ(Candida apicola)等が挙げられる。セロビオースリピッド生産菌としては、ウスチラゴ メイディス(Ustilago maydis)等が挙げられる。 Examples of biosurfactant producing bacteria include mannosyl erythritol lipid producing bacteria, sophorolipid producing bacteria, cellobiose lipid producing bacteria, and the like. Mannosyl erythritol lipid-producing bacteria include Pseudozyma antartica, P. rugurosa, P. aphidis, P. abdi, P. abd. Pr. Examples include Lago Meidis, Ustyago Shinodontis, U. sitaminea and the like. Examples of the sophorolipid-producing bacterium include Starmerella bombicola and Candida apicola. Examples of cellobiose lipid-producing bacteria include Ustylago maydis (Ustilago maydis).
また、本発明における微生物として用いる菌株は、上述した微生物の菌株であれば、微生物株保存機関のものでもよいし、自然界から分離したものでもよい。 In addition, the strain used as the microorganism in the present invention may be that of the above-described microorganism strain, and may be that of a microorganism strain storage institution or isolated from nature.
〔培養〕
次に、本発明に係る製造方法における培養について、以下に説明する。
〔culture〕
Next, culture in the production method according to the present invention will be described below.
本発明における培養とは、上述したような微生物を、成分A及びBを含む培地を用いて培養すればよい。成分Aとはサトウキビの液状成分を表し、成分Bとはサトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質を表す。 What is necessary is just to culture | cultivate the microorganisms mentioned above using the culture medium containing the component A and B with the culture | cultivation in this invention. Component A represents a sugar cane liquid component, and component B represents a colloidal substance other than sugar recovered from the sugar cane liquid component.
成分A、つまりサトウキビの液状成分とは、サトウキビ由来の液状成分であればよく、例えばサトウキビから圧搾又は抽出した液状成分などを用いることができる。このような液状成分としては、例えば、サトウキビ搾汁、糖蜜等が挙げられる。サトウキビ搾汁とは、サトウキビを搾って得られるサトウキビの搾り汁(サトウキビジュース)、あるいはこれに相当するサトウキビ由来の液状の成分を含むものであればよい。糖蜜とは、サトウキビから糖を製造する過程において、糖液を濃縮結晶させた残りの液などであってもよい。また、これらの液状成分は、サトウキビを加工する際に生じる副産物として得られるものであってもよい。 The component A, that is, the liquid component of sugarcane, may be a liquid component derived from sugarcane, and for example, a liquid component compressed or extracted from sugarcane can be used. Examples of such liquid components include sugarcane juice and molasses. The sugarcane juice may be any sugarcane juice obtained by squeezing sugarcane (sugarcane juice) or a liquid component derived from sugarcane corresponding thereto. The molasses may be a remaining liquid obtained by concentrating and crystallizing a sugar liquid in the process of producing sugar from sugarcane. In addition, these liquid components may be obtained as by-products generated when processing sugarcane.
本発明では、サトウキビの液状成分として、サトウキビ搾汁を用いることが好ましい。また、培地におけるサトウキビ搾汁の含有量は、5重量%以上50重量%以下であることがより好ましい。 In the present invention, it is preferable to use sugarcane juice as a liquid component of sugarcane. The content of sugar cane juice in the medium is more preferably 5% by weight or more and 50% by weight or less.
また、本発明では、サトウキビの液状成分として、糖蜜を用いてもよい。この場合には、培地における糖蜜の含有量は、1重量%以上20重量%以下であることが好ましい。 In the present invention, molasses may be used as a liquid component of sugarcane. In this case, the molasses content in the medium is preferably 1% by weight or more and 20% by weight or less.
成分B、つまりサトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質とは、サトウキビの液状成分に含まれる糖以外のコロイド物質を回収したものであればよい。例えば、サトウキビを圧搾して得られる液状成分、またはサトウキビを用いた抽出工程から得られた液状成分などのpHを中性付近に調整し、その結果析出した糖以外のコロイド物質を、沈殿物として分離したものなどを用いることができる。 The colloidal substance other than the sugar recovered from the component B, that is, the liquid component of sugarcane, may be any colloidal substance other than the sugar contained in the liquid component of sugarcane. For example, the liquid component obtained by squeezing sugarcane, or the liquid component obtained from the extraction process using sugarcane, etc., is adjusted to near neutral pH, and as a result, colloidal substances other than the precipitated sugar are used as precipitates. Separated ones can be used.
本明細書において、糖とは糖類をさすものである。また、コロイド物質とは、コロイド粒子などともよばれる微粒子であればよく、またはこれに類似する物質であってもよい。また、コロイド物質とは、液体中に分散してコロイド状態になっているものだけでなく、互いに凝集して沈殿したものであってもよい。つまり、本発明におけるコロイド物質とは、サトウキビの液状成分中に含まれる微粒子などであり、これらが凝集して沈殿した沈殿物をも含むものである。 In this specification, sugar refers to sugar. Further, the colloidal substance may be fine particles called colloidal particles or the like, or may be a substance similar to this. Further, the colloidal substance is not limited to those dispersed in a liquid and in a colloidal state, but may be those that aggregate and precipitate with each other. That is, the colloidal substance in the present invention is fine particles contained in the sugar cane liquid component, and also includes a precipitate in which these are aggregated and precipitated.
成分Bとしては、例えば、ライミング残渣などを用いることが好ましい。ライミング残渣とは、サトウキビの液状成分をライミング処理して得られる残渣であり、例えばサトウキビからの原料糖の製造工程(製糖工程)におけるライミング処理により得られる沈殿物などである。ライミング処理とは、例えば、サトウキビを圧搾又は抽出することなどによって得られる、サトウキビの液状成分に、石灰を添加してpHを中性付近に調整し、糖以外のコロイド物質を析出させ、沈殿物として分離する処理である。なお、ライミング処理には、加温工程及び冷却工程などが含まれることがある。 As component B, it is preferable to use a rimming residue, for example. The rimming residue is a residue obtained by liming a liquid component of sugarcane, and is, for example, a precipitate obtained by a rimming treatment in a production process (sugar production process) of raw sugar from sugarcane. Liming treatment is, for example, obtained by squeezing or extracting sugarcane, and adding lime to the liquid component of sugarcane to adjust the pH to around neutral, precipitating colloidal substances other than sugar, It is a process to separate as. The rimming process may include a heating process and a cooling process.
また、成分Bとしては、上述したライミング残渣のように製糖工程において得られるものに限らず、サトウキビを加工する際に生じる副産物として得られるものを用いてもよい。 Moreover, as a component B, you may use what is obtained as a by-product produced when processing sugarcane, not only what is obtained in a sugar-making process like the rimming residue mentioned above.
本発明における培地には、サトウキビの液状成分と、当該液状成分とは別のサトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質とが含まれているので、培地における糖以外のコロイド物質の含有量を高めることができる。なお、本発明において、成分Bは、培地における糖以外のコロイド物質の含有量を高めることを目的とするものであり、糖の含有量が少しでも高くなることを排除することを目的とするものではない。つまり、成分Bを得る際に、成分B中に糖が残存しても本発明の範疇である。 The medium according to the present invention contains a liquid component of sugarcane and a colloidal substance other than sugar recovered from the liquid component of sugarcane that is different from the liquid component. Can be increased. In the present invention, Component B is intended to increase the content of colloidal substances other than sugar in the medium, and is intended to exclude any increase in the sugar content. is not. That is, even when sugar remains in component B when component B is obtained, it is within the scope of the present invention.
また、培地における成分Bの含有量は、1重量%以上5重量%以下であることが好ましい。 Moreover, it is preferable that content of the component B in a culture medium is 1 to 5 weight%.
このように、本発明においては、サトウキビを加工する際に生じる副産物を用いることができるので、バイオマス資源としてのサトウキビを再利用することにより有効活用することができる。また、これらの材料は、比較的安価に入手可能であるため、製造コストを削減することができる。 Thus, in the present invention, by-products generated when processing sugar cane can be used, it can be effectively utilized by reusing sugar cane as a biomass resource. In addition, since these materials are available at a relatively low cost, the manufacturing cost can be reduced.
本発明において用いる培地は、サトウキビの液状成分と、サトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質とを含んでいればよいが、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、当該技術分野で通常用いられる炭素源、窒素源、有機栄養源等が用いられる。 The medium used in the present invention may contain a liquid component of sugar cane and a colloidal substance other than sugar recovered from the liquid component of sugar cane, but may further contain other components. As other components, a carbon source, a nitrogen source, an organic nutrient source and the like which are usually used in the technical field are used.
炭素源としては、上述した微生物が資化し得るものであればよく、炭水化物(グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等)、有機酸(酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等)、アルコール類(エタノール、プロパノール等)などが用いられる。 Any carbon source may be used as long as it can be assimilated by the above-described microorganisms, and includes carbohydrates (monosaccharides such as glucose, mannose, glycerol, and mannitol, oligosaccharides such as sucrose, maltose, and lactose, starch), organic acids ( Acetic acid, propionic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, etc.) and alcohols (ethanol, propanol, etc.) are used.
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。 As the nitrogen source, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium phosphate, or nitrogen-containing compounds such as peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, corn steep liquor and the like are used.
以上のような成分を培地に含ませることにより、菌体の生育、及びバイオサーファクタントの生産量をさらに向上させることができる。 By including the above components in the medium, the growth of the bacterial cells and the production amount of the biosurfactant can be further improved.
なお、本発明では、サトウキビに含まれるスクロース、グルコース等の糖質バイオマスのみを原料とすることができるので、培地に油脂類を添加しなくてもよい。培地に油脂類を添加しない場合には、生産物に油脂類が混在しないため、生産物を回収する際にカラム精製等による精製プロセスを行わなくてもよく、生産物の取り扱いが容易になる。例えば、溶媒抽出のみにより、90%以上の純度を有するバイオサーファクタント抽出液を調製することが可能となる。したがって、本発明では、培地に油脂類を添加しないことが好ましい。これにより、バイオサーファクタントの製造プロセスをさらに改良でき、製造をより容易にすることができるとともに、コスト低減がさらに可能になる。 In addition, in this invention, since only sugar biomass, such as sucrose and glucose contained in sugarcane, can be used as a raw material, it is not necessary to add fats and oils to a culture medium. When the fats and oils are not added to the culture medium, the fats and oils are not mixed in the product. Therefore, when collecting the product, it is not necessary to perform a purification process such as column purification, and the product is easily handled. For example, a biosurfactant extract having a purity of 90% or more can be prepared only by solvent extraction. Therefore, in this invention, it is preferable not to add fats and oils to a culture medium. As a result, the biosurfactant production process can be further improved, the production can be facilitated, and the cost can be further reduced.
培地の調製方法は、例えば、まずサトウキビの液状成分に水を加えて希釈した溶液を作成し、次に、該溶液にサトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質を添加して調製することができる。 For example, the medium is prepared by first preparing a diluted solution by adding water to the sugar cane liquid component, and then adding a colloidal substance other than sugar recovered from the sugar cane liquid component to the solution. Can do.
培養温度は、例えば、室温であることが好ましく、具体的には、好ましくは20〜30℃であり、より好ましくは22〜28℃である。培養日数としては、バイオサーファクタントの生産量に応じて適宜設定すればよいが、3日以上14日以下であれば、生産速度が速く効率がよいため好ましく、5日間以上10日以下であることがより好ましい。これにより、十分な量のバイオサーファクタントを生産することができる。 The culture temperature is preferably room temperature, for example, specifically preferably 20 to 30 ° C, more preferably 22 to 28 ° C. The culture days may be appropriately set according to the production amount of the biosurfactant, but if it is 3 days or more and 14 days or less, the production rate is fast and efficient, and it is preferably 5 days or more and 10 days or less. More preferred. Thereby, a sufficient amount of biosurfactant can be produced.
培養方法としては、好気培養が好ましい。好気培養するためには、培養液に酸素を供給すればよく、例えば培養液に空気を通気しながら撹拌する、振とう培養を行う等の方法が挙げられる。例えば、振盪培養、通気撹拌培養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用することができる。これにより、微生物を良好に生育させ、かつバイオサーファクタントを良好に生産させることができる。 As the culture method, aerobic culture is preferable. In order to perform aerobic culture, oxygen may be supplied to the culture solution. Examples thereof include agitation while aeration of air is passed through the culture solution and shaking culture. For example, well-known general methods for culturing microorganisms such as shaking culture and aeration stirring culture can be applied. Thereby, microorganisms can be grown well and a biosurfactant can be produced well.
また、微生物の菌体を培養する前に、該菌体の前培養を行うことが好ましい。前培養は、例えば、数mlの培養液を用いて、上述した培養方法等により行うことができる。その後、バイオサーファクタント生産のための培養(以下、「本培養」ともいう)に用いる培養液に、前培養した培養液を混和することが好ましい。例えば、本培養における培養液1Lあたり、前培養液を10〜200mL、好ましくは50〜100mL用いることが好ましい。これにより、該菌体を活性化してその増殖能を高めることができるため、その結果、単位培養液及び単位時間あたりのバイオサーファクタントの生産量をも高めることができる。 Moreover, it is preferable to pre-culture the microbial cells before culturing the microbial cells. The preculture can be performed by, for example, the above-described culture method using several ml of culture solution. Thereafter, it is preferable to mix the pre-cultured culture solution with the culture solution used for culture for biosurfactant production (hereinafter also referred to as “main culture”). For example, it is preferable to use 10 to 200 mL, preferably 50 to 100 mL of the preculture solution per 1 L of the culture solution in the main culture. Thereby, since this microbial cell can be activated and the growth ability can be improved, as a result, the production amount of the biosurfactant per unit culture solution and unit time can also be increased.
また、培養液中の所望のバイオサーファクタント蓄積量が最高に達した時点で、本発明における培養を終了させることができるように、培養液中のバイオサーファクタントをガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが好ましい。 In addition, the biosurfactant in the culture solution can be gas chromatographed, high performance liquid chromatography, thin film so that the culture in the present invention can be terminated when the desired amount of biosurfactant accumulation in the culture solution reaches the maximum. It is preferable to perform the measurement while using a known method such as layer chromatography.
上記培養において、微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物(例えば、菌体破砕物)などをいう。 In the above culture, the form of the microorganism is not particularly limited, and refers to a microorganism cell, a treated cell of the microorganism (for example, a disrupted cell).
微生物の菌体または菌体処理物は、固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定させればよい。固定する方法としては、物理的吸着、イオン結合、共有結合などを用いることができる。また、担体としては、多糖(アセチルセルロース、アガロース)、無機物質(多孔質ガラス、金属酸化物)、合成高分子(ポリアクリルアミド、ポリスチレン)等を用いることができる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖(アルギン酸、カラギーナン等)、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセル等により菌体を包み込むことによって固定化する。 The microbial cells or processed microbial cells can be used after being immobilized. Examples of the immobilization method include conventionally known methods such as a carrier binding method, a crosslinking method, and a comprehensive method. In the carrier binding method, the cells may be fixed to the carrier. As a fixing method, physical adsorption, ionic bond, covalent bond, or the like can be used. As the carrier, polysaccharides (acetylcellulose, agarose), inorganic substances (porous glass, metal oxide), synthetic polymers (polyacrylamide, polystyrene) and the like can be used. In the crosslinking method, the cells are immobilized by crosslinking and bonding with each other using a bifunctional reagent such as glutaraldehyde. In the inclusion method, the cells are immobilized by wrapping the cells with a lattice of a polymer gel such as a polysaccharide (alginic acid, carrageenan, etc.), polyacrylamide, collagen, polyurethane, or a semipermeable membrane capsule.
培養液中に蓄積されたバイオサーファクタントは、培養終了後、培養液を抽出することによって回収できる。 The biosurfactant accumulated in the culture solution can be recovered by extracting the culture solution after completion of the culture.
抽出は、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて行うことができる。抽出は当該分野において通常行われる方法に従って行えばよく、例えば、培養液1Lあたり0.5〜1.5L程度の有機溶媒を用いて1〜数回抽出操作を行ない、有機溶媒層を合わせて溶媒を留去する。 Extraction can be performed using an organic solvent such as ethyl acetate. Extraction may be carried out according to a method usually performed in the art. For example, the extraction operation is performed once or several times using about 0.5 to 1.5 L of organic solvent per 1 L of the culture solution, and the organic solvent layer is combined with the solvent. Is distilled off.
なお、回収したバイオサーファクタントは、冷暗所で保管することが好ましい。 The recovered biosurfactant is preferably stored in a cool and dark place.
上述したように、本発明によれば、安価に入手可能なサトウキビの液状成分と、サトウキビの液状成分から回収した糖以外のコロイド物質とから、付加価値の高い高機能なバイオサーファクタントを生産できるので、利潤を高くすることができる。また、サトウキビの加工の際に生じる材料を原料として用いることができるので、サトウキビを無駄なく活用することができる。したがって、本発明によれば、バイオマス資源としてのサトウキビを有効活用することが可能となり、サトウキビ産業の活性化への貢献が期待できる。また、本発明によれば、バイオサーファクタントを効率よく生産・回収することができ、製造コストを削減することが可能となるので、付加価値の高いバイオサーファクタントを製造することができる。 As described above, according to the present invention, a highly functional biosurfactant with high added value can be produced from a liquid component of sugarcane that can be obtained at low cost and a colloidal substance other than sugar recovered from the liquid component of sugarcane. Profit can be increased. Moreover, since the material produced in the process of sugarcane can be used as a raw material, sugarcane can be utilized without waste. Therefore, according to the present invention, it is possible to effectively use sugarcane as a biomass resource, and it can be expected to contribute to the revitalization of the sugarcane industry. Furthermore, according to the present invention, biosurfactants can be produced and recovered efficiently, and the production cost can be reduced, so that biosurfactants with high added value can be produced.
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope shown in the claims. That is, embodiments obtained by combining technical means appropriately modified within the scope of the claims are also included in the technical scope of the present invention.
〔実施例1〕
実施例1では、培地における成分Aとしてサトウキビ搾汁、及び成分Bとしてライミング残渣を用い、バイオサーファクタント(BS)生産菌のバイオサーファクタント生産量に対する、サトウキビ搾汁及びライミング残渣の培養液における含有量の効果について調べた。その結果を図1に示す。図1は、実施例1における、バイオサーファクタント生産に対するサトウキビ搾汁及びライミング残渣の効果を示す図である。
[Example 1]
In Example 1, sugarcane juice is used as component A in the medium, and lime residue is used as component B, and the amount of sugarcane juice and rimming residue contained in the culture solution relative to the amount of biosurfactant produced by the biosurfactant (BS) -producing bacterium The effect was investigated. The result is shown in FIG. FIG. 1 is a diagram showing the effect of sugarcane juice and rimming residue on biosurfactant production in Example 1. FIG.
MEL及びCL生産菌であり、MEL−A、MEL−C及びCLを主生産物とするU. maydis、MEL生産菌であり、MEL−A、MEL−C及びmono−MELを主生産物とするP. antarctica JCM 10317株、ならびにMEL生産菌であり、MEL−A及びMEL−Cを主生産物とするP. antarctica T−34株を、それぞれ図1に示す組成にてサトウキビ搾汁(搾汁)及びライミング残渣を含む培養液中において、25℃で7日間振とう培養した。 U.M. and CL-producing bacteria, which are mainly produced from MEL-A, MEL-C and CL. Maydis, a MEL-producing bacterium, and P. aeruginosa, which mainly contains MEL-A, MEL-C and mono-MEL. antarctica JCM 10317 strain and P. aeruginosa MEL-producing bacteria, the main products of which are MEL-A and MEL-C. Antarctica T-34 strain was cultured with shaking at 25 ° C. for 7 days in a culture solution containing sugarcane juice (squeezed) and a rimming residue with the composition shown in FIG.
各菌株における培養液中に蓄積した脂質成分を、等量の酢酸エチルで回収し、薄層クロマトグラフィー(TLC)により展開した後、アンスロン発色試薬を用いて糖脂質の検出を行った。 The lipid components accumulated in the culture solution in each strain were collected with an equal amount of ethyl acetate and developed by thin layer chromatography (TLC), and then glycolipids were detected using an anthrone coloring reagent.
その結果、上述した3株とも、サトウキビ搾汁を含む培養液中でバイオサーファクタントを生産可能であり、さらに図1に矢印で示すように、ライミング残渣を添加することで生産量が大幅に増加した。これらの結果から、サトウキビ搾汁とライミング残渣とを含む培養液が、バイオサーファクタント生産に適していることが示された。さらに、本実施例の結果から、培地におけるサトウキビ搾汁の含有量は5%以上であることが好ましく、ライミング残渣の含有量は1%以上であることが好ましいことが示された。 As a result, all three strains described above can produce biosurfactant in a culture solution containing sugarcane juice, and the production amount increased significantly by adding a rimming residue as indicated by the arrows in FIG. . From these results, it was shown that the culture solution containing sugarcane juice and rimming residue is suitable for biosurfactant production. Furthermore, from the results of this example, it was shown that the content of sugar cane juice in the medium is preferably 5% or more, and the content of the rimming residue is preferably 1% or more.
〔比較例1〕
比較例1では、サトウキビ搾汁を含む培養液を用いて数種のバイオサーファクタント生産菌を培養し、培養液に蓄積するバイオサーファクタントの種類及び量について調べた。
[Comparative Example 1]
In Comparative Example 1, several types of biosurfactant-producing bacteria were cultured using a culture solution containing sugarcane juice, and the type and amount of biosurfactant accumulated in the culture solution were examined.
MEL及びCL生産菌として知られるUstilago maydis、MEL生産菌として知られるPseudozyma hubeiensis、P. tsukubaensis、P. graminicola、P. shanxiensis、P. crassa、P. antarctica、P. rugulosa、P. aphidis、P. parantarcticaを、それぞれ、蒸留水で2倍希釈したサトウキビ搾汁(オートクレイブ滅菌済み)中において、25℃で7日間振とう培養した。 Ustilago maydis known as MEL and CL producing bacteria, Pseudozyma hubiensis known as MEL producing bacteria, P. tsukubaensis, P.M. gramicola, P.M. shanxiensis, P.M. crassa, P.M. antarctica, P.M. rugulosa, P.M. aphidis, P.A. Each of parantactica was cultured with shaking at 25 ° C. for 7 days in sugarcane juice (autoclaved) diluted 2-fold with distilled water.
各菌株における培養液中に蓄積した脂質成分を、等量の酢酸エチルで回収し、薄層クロマトグラフィー(TLC)により展開した後、アンスロン発色試薬を用いて糖脂質の検出を行った。その結果を図2に示す。図2は、比較例1における、各バイオサーファクタント生産菌により生産されたMELの種類及び量を示す図である。 The lipid components accumulated in the culture solution in each strain were collected with an equal amount of ethyl acetate and developed by thin layer chromatography (TLC), and then glycolipids were detected using an anthrone coloring reagent. The result is shown in FIG. FIG. 2 is a diagram showing the types and amounts of MEL produced by each biosurfactant-producing bacterium in Comparative Example 1.
図2に示すように、TLCの結果から、各バイオサーファクタント生産菌は、MELのうちMEL−A、MEL−B及びMEL−Cに相当する糖脂質成分を培地中に蓄積していた。また、図には示していないが、TLCの結果から、CL生産菌及びSL生産菌は、CL及びSLに相当する糖脂質成分を培地中に蓄積していた。なお、CL及びSLについては、本比較例に記載の条件において得られるCL及びSLのTLCにおける移動度が分かっていること、ならびに既知のCL生産菌及びSL生産菌を用いていることから、TLC中におけるスポットを、それぞれCL及びSLに相当するものと判定した。 As shown in FIG. 2, from the results of TLC, each biosurfactant-producing bacterium accumulated glycolipid components corresponding to MEL-A, MEL-B and MEL-C in the medium. Although not shown in the figure, from the results of TLC, CL-producing bacteria and SL-producing bacteria accumulated glycolipid components corresponding to CL and SL in the medium. In addition, about CL and SL, since the mobility in CL and SL of TLC obtained on the conditions as described in this comparative example is known, and since known CL-producing bacteria and SL-producing bacteria are used, TLC The inside spots were determined to correspond to CL and SL, respectively.
また、このとき、溶媒抽出液中には油脂成分がほとんど含まれておらず、上記TLC及びさらなるHPLCの結果から、それぞれのバイオサーファクタントの純度が少なくとも90%以上であることが明らかになった。 At this time, the oil and fat component was hardly contained in the solvent extract, and the results of the TLC and further HPLC revealed that the purity of each biosurfactant was at least 90% or more.
上述した結果により、試験した全てのバイオサーファクタント生産菌が、サトウキビ搾汁を含む培養液中においてバイオサーファクタントを生産できることが示された。したがって、サトウキビ搾汁が、バイオサーファクタント生産に必要な成分を十分に含んでいることが明らかになった。 The results described above showed that all tested biosurfactant producing bacteria can produce biosurfactants in a culture solution containing sugarcane juice. Therefore, it became clear that sugarcane juice sufficiently contained components necessary for biosurfactant production.
本発明は、サトウキビを効率よく活用し、かつ製造コストを削減できる、バイオサーファクタントの製造方法を提供することができるので、サトウキビ産業の活性化に貢献するだけでなく、化粧品・食品からライフサイエンス領域までの幅広い産業分野において機能性バイオ素材として実用化が期待されている、各種のバイオサーファクタント製造に、好適に利用することができる。 The present invention can provide a biosurfactant manufacturing method that can efficiently use sugarcane and reduce manufacturing costs, so that it not only contributes to the revitalization of the sugarcane industry, but also from cosmetics and foods to the life science field. It can be suitably used for the production of various biosurfactants that are expected to be put to practical use as functional biomaterials in a wide range of industrial fields.
Claims (7)
成分A:サトウキビの液状成分、
成分B:サトウキビの液状成分のライミング残渣。 A method for producing a biosurfactant, wherein a microorganism is cultured using a medium containing components A and B;
Component A: Liquid component of sugarcane,
Component B: Lime residue of liquid component of sugarcane .
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