JP5464641B2

JP5464641B2 - 制御性ｔ細胞製造方法及び制御性ｔ細胞増幅装置

Info

Publication number: JP5464641B2
Application number: JP2009010523A
Authority: JP
Inventors: 登紀子長村; 有伸東條; 昭雄白数; 義洋吉川; 奈穂美中谷
Original assignee: Nipro Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Nipro Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2008-01-21
Filing date: 2009-01-21
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2029-01-21
Also published as: JP2009195228A

Description

本発明は、制御性Ｔ細胞を効率的に製造する方法、及び制御性Ｔ細胞を効率的に増幅する装置に関する。

制御性Ｔ細胞（Treg：Regulatory T cells）は、ＣＤ２５陽性（以下、「ＣＤ２５^＋」とも記される。）、ＣＤ４陽性（以下、「ＣＤ４^＋」とも記される。）の表面形質を有する特殊なＴ細胞系列に属する細胞であり、その発生及び分化は転写因子であるＦｏｘＰ３（Forkhead box P3）によってプログラムされている。制御性Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞（Effector T cells）と相反する免疫応答を示し、免疫寛容の維持において重要な役割を担っている。ヒトにおける制御性Ｔ細胞の減少乃至機能異常は、自己免疫疾患やアレルギーの発症原因となる。したがって、制御性Ｔ細胞の量的又は質的なコントロールは、自己免疫疾患やアレルギーの治療に有用であり、さらには、難治性移植片対宿主病（GVHD：Graft Versus Host Disease）の治療など、移植免疫や腫瘍免疫の分野における新たな細胞療法となることが期待されている。

特許文献１には、ヒトの制御性Ｔ細胞を製造する方法が開示されている。この方法では、ヒト末梢血からナイーブ表現型のＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞が分離され、この細胞が、ＩＬ２やＩＦＮ−γなどのＴ細胞増殖因子、及び抗ヒトＣＤ３抗体などＴ細胞受容体を介して細胞を刺激する物質の存在下で培養される。その結果、ナイーブ表現型のＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞が１００倍以上に増殖され、増殖された細胞が制御性Ｔ細胞としての機能を発揮すると示されている。

特許文献２には、ヒトの活性化Ｔリンパ球の誘導において、抗ＣＤ３抗体を固定した不溶性担体を用いることが開示されている。また、リンパ球の増殖を促進させるために、ＩＬ２などのサイトカインを培養補助剤として培地中に含有させることが開示されている。これらを用いることにより、少量のリンパ球から５００〜１００００倍の細胞が誘導できるとされている。

特開２００６−２８０３０７号公報特開２０００−２１２２００号公報

患者の末梢血から制御性Ｔ細胞を特異的に増幅する手法として、主として次の二つが考えられる。一つは、末梢血から制御性Ｔ細胞を分離してから増幅する手法である。もう一つは、末梢血から制御性Ｔ細胞を含む細胞群を分離して増幅し、その増幅過程において或いは最終的に制御性Ｔ細胞を選択する手法である。しかし、前者において、治療に必要な量の制御性Ｔ細胞を得るには、多量の末梢血を患者から採取するか、増幅効率を極めて高める必要がある。現実には極度に高い増幅効率の培養方法が実現されていないので、患者から多量の末梢血を採る必要があり、患者負担が大きいという問題がある。後者においては、増幅された多種多量の細胞群から制御性Ｔ細胞を選別する作業が難しいという問題がある。例えば、ＣＤ２５は活性化Ｔ細胞でも発現されているので、ＣＤ２５の＋／−をもって制御性Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞とを区別することができない。また、ＦｏｘＰ３は制御性Ｔ細胞に特異的に発現するが細胞内分子であるので、ＦｏｘＰ３の発現の有無により制御性Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞とを区別できるとしても、ＦｏｘＰ３を確認するためには、細胞膜の透過処理を施して染色をする必要があり、その後は、生きた細胞として治療に用いることができない。したがって、制御性Ｔ細胞を前述された様々な細胞療法に用いるために、少ない量の末梢血から制御性Ｔ細胞が特異的かつ効率的に増幅できる手法が望まれる。

本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトから採取された血液中から制御性Ｔ細胞を特異的かつ効率的に増幅できる手段を提供することにある。

(1) 本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法は、ヒトから採取された血液中からＣＤ４陽性を示すＴ細胞を分離する第１ステップと、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液中において、上記Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が不溶担体に固定された固相化抗体と反応させる第２ステップと、上記固相化抗体からＴ細胞を分離して、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中において当該Ｔ細胞を増幅させる第３ステップと、を含む。

制御性Ｔ細胞とは、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けることによって反応性Ｔ細胞の活性化を阻害しうる免疫応答を示す細胞を言う。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５陽性かつＣＤ４陽性の表面形質を有する。また、制御性Ｔ細胞は、その発生及び分化のマスター制御分子が転写因子ＦｏｘＰ３である。

ヒトから採取された血液は、増幅された制御性Ｔ細胞を用いて細胞療法を行うべき患者などから得られた末梢血又は臍帯血である。末梢血とは、体の末梢を流れている血液であり、例えば静脈から採血されることによって得られる。臍帯血とは、胎児と母体とを繋ぐ臍帯に含まれる血液である。

第１ステップにおいて、ヒトから採取された血液中からＣＤ４陽性を示すＴ細胞（以下、「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」とも称される。）を分離する方法は、フィコール比重遠心法や免疫磁気ビーズ法などの公知の方法を採用することができる。例えば免疫磁気ビーズ法であれば、ヒト末梢血若しくは臍帯血、又はバフィーコートに含まれる単核球に対して、抗ＣＤ４抗体を含む液体を加えて反応させ、さらに抗ＣＤ４抗体と特異的に反応する２次抗体が固定された磁気ビーズを加えて反応させる。この反応により、単核球のうちＣＤ４^＋Ｔ細胞が磁気ビーズに結合する。その後、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が結合した磁気ビーズと残液とを分離して、磁気ビーズからＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離する。これにより、ヒトから採取された血液からＣＤ４^＋Ｔ細胞が分離される。

第２ステップにおいては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を第１液中において固相化抗体と反応させる。

第１液は、少なくともＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む液であるが、一般にはＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む培地である。この培地として、制御性Ｔ細胞に適する公知のものが使用でき、例えば、Ａｌｙｓ培地シリーズ（細胞科学研究所社製）があげられる。この培地は、有機酸、アミノ酸、還元剤、緩衝剤、抗生物質、サイトカイン、血清などの添加物を予め含んで調製されたものや、複数の培地の混合物であってもよい。

第１液に含まれるＩＬ２及びＴＧＦ−βの濃度は特に限定されない。通常、ＩＬ２の濃度は、５０〜２，０００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは１００〜７００Ｕ／ｍＬであり、とくに好ましくは２００〜７００Ｕ／ｍＬである。また、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１が好適であり、その濃度は、１〜５０ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは５〜１０ｎｇ／ｍＬである。

固相化抗体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が不溶担体に固定されたものである。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシなどの動物由来、及びヒト由来のものが使用でき、特にヒト由来のものが好適であるが、これに限定されるものではない。不溶担体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を物理的又は化学的に結合できる部材であって、水溶液に対して不溶なものを用いることができる。例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を物理的に吸着可能な素材として、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂やガラスなどがあげられる。不溶担体の形状は特に限定されず、例えば、プレート形状やビーズ形状、容器形状などが採用できる。

物理的吸着により、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を不溶担体に結合するには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、及びリン酸緩衝液などの溶媒を含む抗体水溶液を不溶担体に接触させた状態で所定時間放置すればよい。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の疎水性により、これら抗体が不溶担体の表面に物理的に吸着する。

抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定された不溶担体は、第１液を保持可能なバッグなどの容器に予め封入されていてもよい。この容器に、ヒトから採取された血液から分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞及び第１液を注入して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞と固相化抗体とを反応させることができる。

第１液中においてＣＤ４^＋Ｔ細胞を固相化抗体と反応させると、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の抗原受容体に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体がそれぞれ結合する。これにより、抗原受容体を介してＣＤ４^＋Ｔ細胞が刺激を受ける。さらに、第１液に含まれるＩＬ２及びＴＧＦ−βによってもＣＤ４^＋Ｔ細胞が刺激を受ける。このＣＤ４^＋Ｔ細胞には、ＣＤ２５陰性（−）ＦｏｘＰ３陰性（−）Ｔ細胞も含まれるが、これらの刺激によってＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＦｏｘＰ３⁻Ｔ細胞がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞に転換されると想定される。つまり、これら刺激によって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞が選択的に増幅される。

第１液中におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞と固相化抗体との反応は、通常、温度約３０〜４０℃の範囲で、１〜１０％ＣＯ_２の存在下で、１〜１０日間行われ、とくに好ましくは、温度３７℃、５％ＣＯ_２、７日間である。

第３ステップにおいて、固相化抗体からＣＤ４^＋Ｔ細胞が分離されて、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中においてＣＤ４^＋Ｔ細胞が増幅される。

第２液は、少なくともＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む液であるが、一般には培地である。この培地として、第１液で例示されたように、制御性Ｔ細胞に適する公知のものが使用できる。この培地は、有機酸、アミノ酸、還元剤、緩衝剤、抗生物質、サイトカイン、血清などの添加物を予め含んで調製されたものや、複数の培地の混合物であってもよい。

第２液に含まれるＩＬ２及びＴＧＦ−βの濃度は特に限定されない。通常、ＩＬ２の濃度は、５０〜２，０００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは１００〜７００Ｕ／ｍＬであり、とくに好ましくは２００〜７００Ｕ／ｍＬである。また、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１が好適であり、その濃度は、１〜５０ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは５〜１０ｎｇ／ｍＬである。

固相化抗体からのＣＤ４^＋Ｔ細胞の分離は、公知の用具を用いて行うことができる。例えば、セルリフターを用いてバッグ越しに不溶担体に結合されたＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を掻き取った後に細胞を回収すればよい。また、ビーズ形状の不溶担体がバッグに封入されている場合には、バッグの上からビーズ形状の不溶担体を揉み解すように擦り合わせることによって、不溶担体に結合されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を剥がし取ることができる。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増幅は、培養バッグなどの公知の容器を用いて行うことができる。この培養バッグに、固相化抗体から分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞及び第２液を注入して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を増幅させることができる。なお、固相化抗体から分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞には、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞以外のＣＤ４^＋Ｔ細胞も含まれる場合があるが、ここでは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞のみを選別する必要はない。

第２液中におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞の増幅は、通常、温度約３０〜４０℃の範囲で、１〜１０％ＣＯ_２の存在下で、１〜１０日間行われ、とくに好ましくは、温度３７℃、５％ＣＯ_２、７日間である。

これにより、ヒトから採取された血液から制御性Ｔ細胞が特異的かつ効率的に増幅される。

(2) 上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞に、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、かつＦｏｘＰ３陽性のＴ細胞が含まれることが好適である。

本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＴ細胞が制御性Ｔ細胞であることを確認する手段として、第３ステップにより増幅されたＴ細胞の抗原受容体及び転写因子を確認する手法があげられる。Ｔ細胞の抗原受容体は、フローサイトメトリー解析などの公知の手法により確認することができる。ＦｏｘＰ３は、Ｔ細胞の細胞膜の透過処理を施してからＦｏｘＰ３抗体を用いて免疫染色を施すなどの公知の手法により確認することができる。

(3) 上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞に、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、当該ヒトに対して自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応において、当該レスポンダーＴ細胞の増殖を抑制するＴ細胞が含まれることが好適である。

本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＴ細胞が制御性Ｔ細胞であることを確認する手段として、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、当該ヒトに対して自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応（ＭＬＲ：Mixed Lympfocyte Reaction）を用いることができる。ここで、ヒトとは、例えば、健常人、患者及びドナーなどをいう。ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、当該ヒトに対して自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応の系に、本制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＴ細胞を添加して培養して、レスポンダーＴ細胞の増殖抑制効果を判定する。増殖抑制効果の判定は、主にフローサイトメトリーにより行われる。

(4) 上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に対して、制御性Ｔ細胞が占める細胞数の割合が４５％以上であることが好適である。これにより、少量のヒトから採取された血液から制御性Ｔ細胞を増幅して細胞療法に用いることができる。

(5) 上記第１ステップにおいて分離された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞に対する、上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞の増幅率が１０，０００倍以上であることが好適であり、さらに好ましくは２０，０００倍以上である。これにより、少量のヒトから採取された血液から制御性Ｔ細胞を増幅して細胞療法に用いることができる。

(6) 本発明にかかる制御性Ｔ細胞増幅装置は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定可能な不溶担体と、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定された上記不溶担体に、ヒトから採取された血液から分離されたＣＤ４陽性を示すＴ細胞が付着した状態で、当該固相化抗体をＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液と共に保持する容器と、を具備する。

本制御性Ｔ細胞増幅装置は、任意のＴ細胞の増幅にも用いることができるが、特に、前述された制御性Ｔ細胞製造方法に好適に用いられる。

(7) 上記不溶担体が、上記容器が第１液を保持する空間の少なくとも一部を構成し、かつ保持された第１液と接触しうる部材であってもよい。

つまり、不溶担体を容器と一体にしてもよい。例えば、ボトル形状やバッグ形状の壁の一部を不溶担体として、その壁の内面（第１液と接触しうる面）に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定してもよい。

本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法によれば、ヒトから採取された血液から分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液中において抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体により刺激した後、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体から分離して増幅させるので、ＣＤ４^＋Ｔ細胞からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞が選択的に増幅されて、制御性Ｔ細胞を特異的かつ効率的に得ることができる。これにより、採血量を少なくして患者への負担を軽減し、かつ細胞療法に必要な量の制御性Ｔ細胞を簡易に得ることができる。

本発明にかかる制御性Ｔ細胞増幅装置によれば、前述された制御性Ｔ細胞製造方法の如く、ＣＤ４^＋Ｔ細胞への刺激によるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の選択的増幅を簡便に実施することができる。

図１は、本発明の実施形態にかかる制御性Ｔ細胞増幅装置１０の外観構成を示す斜視図である。図２は、本発明の実施形態にかかる制御性Ｔ細胞製造方法の手順を示すフローチャートである。図３は、プレート１２に抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）が固定された状態を示す模式的な断面図である。図４は、プレート１２に固定された抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）にＣＤ４^＋Ｔ細胞２０が結合した状態を示す模式的な断面図である。図５は、本発明の第１変形例にかかる制御性Ｔ細胞増幅装置１０を示す斜視図である。図６は、本発明の第２変形例にかかる制御性Ｔ細胞増幅装置のバッグ３２を示す斜視図である。図７は、実施例における自己のＴ細胞を刺激細胞とする混合リンパ球反応におけるフローサイトメトリー測定結果を示す図である。図８は、実施例における同種のＴ細胞を刺激細胞とする混合リンパ球反応におけるフローサイトメトリー測定結果を示す図である。図９は、実験例３におけるＣＣＤカメラシステムの観察結果を示す図である。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。

［制御性Ｔ細胞増幅装置１０］
図１に示されるように、制御性Ｔ細胞増幅装置１０は、バッグ１１とプレート１２とを具備する。バッグ１１が、本発明における容器に相当する。プレート１２が、本発明における不溶担体に相当する。

バッグ１１は、平面視において矩形であって、その内部に一定容量の培地を封入可能なものである。なお、バッグ１１の形状は特に限定されるものではなく、培地（第１液体、第２液体）の容量や操作性などを考慮して、形状及び容量が設定される。要するに、バッグ１１は、所望の容量の培地を保持できるものであればよい。本実施形態にように、バッグ１１が培地を保持する密閉空間を形成するものであれば、バッグ１１の内部空間に雑菌などが侵入するおそれが低減される。バッグ１１の容量としては、例えば、２０〜４００ｍＬが採用される。

バッグ１１は、平面視において矩形の樹脂シート２枚が、その周縁領域が熱溶着されてバッグ形状をなしている。そして、２枚の樹脂シートが溶着されていない中央の領域が、バッグ１１において培地が封入される所定容量の内部空間である。バッグ１１を形成する樹脂シートは、公知のものを採用することができ、例えば、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリエチレン−ポリテトラフルオロエチレン共重合体、ポリエチレン−１，２−ジクロロエタン共重合体などのポリオレフィン系樹脂からなるシートがあげられる。

バッグ１１には、内部空間に細胞や培地などを流出入するためのポート１３，１４が設けられている。ポート１３，１４は、バッグ１１の周縁領域において、前述された２枚の樹脂シートの間に樹脂チューブが介在されることにより形成されている。なお、本実施形態では、バッグ１１に２つのポート１３，１４が設けられているが、ポートの数は適宜変更されてよい。

バッグ１１の内部空間には、プレート１２が配置されている。本実施形態では、前述されたように２枚の樹脂シートが溶着されてバッグ形状とされる際に、バッグ１１の内部空間となる位置にプレート１２が配置されて、バッグ１１の内部空間に封入されているが、ポート１３，１４以外にプレート１２を内部空間へ挿入可能な開口をバッグ１１に形成して、任意のタイミングでプレート１２をバッグ１１の内部空間へ挿入できるようにしてもよい。その場合には、プレート１２を挿入するための開口は、プレート１２挿入後に封止できることが好ましい。

プレート１２は、矩形の平板であるが、バッグ１１の内部空間に封入可能であれば、形状や厚みなどは特に限定されない。プレート１２は、培地や緩衝液などに対して不溶であり、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定可能な素材からなる。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定可能な素材は、抗体の固定方法を考慮して選択されるが、例えば物理的吸着により抗体を固定する場合には、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂を用いることができる。なお、プレート１２において抗体が固定される表面が前述された合成樹脂であればよく、例えばプレート１２の内部に磁性体などが用いられてもよい。

［制御性Ｔ細胞製造方法］
以下に、制御性Ｔ細胞増幅装置１０を用いた制御性Ｔ細胞製造方法が説明される。本制御性Ｔ細胞製造方法は、以下に示される第１ステップから第３ステップの３つのステップを含む。
（１）ヒトから採取された血液中からＣＤ４陽性を示すＴ細胞（以下、「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」とも称される。）を分離する第１ステップ。
（２）ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液中において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞をプレート１２に固定された抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と反応させる第２ステップ。
（３）プレート１２からＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離して、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中においてＣＤ４^＋Ｔ細胞を増幅させる第３ステップ。

［抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の固定］
プレート１２に抗ＣＤ３抗体（図３における参照符号１５）及び抗ＣＤ２８抗体（図３における参照符号１６）が固定されて、本発明における固相化抗体が作製される（図２：Ｓ１）。この工程は、第１ステップの直前に行われても、制御性Ｔ細胞増幅装置１０が作製される際に予め行われていてもよい。固定すべき抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）は、リン酸緩衝液などを用いて所定の濃度に調製される。抗体の濃度は、抗体の活性などの特性を考慮して適宜設定されるが、通常、１〜１００μｇ／ｍＬ程度に調製される。

調製された抗体溶液がポート１３，１４を通じてバッグ１１の内部空間へ注入される。注入される抗体溶液の量はバッグ１１の容量やプレート１２の大きさなどを考慮して設定されるが、バッグ１１の内部空間においてプレート１２が抗体溶液で浸される程度の量であることが好ましい。

抗体溶液を注入した後、プレート１２を内包するバッグ１１を、冷蔵乃至室温で所定時間放置する。これにより、図３に示されるように、プレート１２の表面に抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）が物理的に吸着する。所定時間放置後に抗体溶液をバッグ１１から排出して、バッグ１１の内部空間及びプレート１２をリン酸緩衝液などで洗浄する。

［第１ステップ］
第１ステップでは、先ず、ヒトの末梢血又は臍帯血を採血する（図２：Ｓ２）。ヒトは患者でも健常人でもよいが、ＧＶＨＤにおける細胞療法などを目的とする場合には、移植を行った患者又はドナーから採血する。採血量は、目的とする制御性Ｔ細胞の量により異なるが、通常、１０〜５０ｍＬ程度である。採血は、採血管や注射器などを用いて公知の手法により行う。また、採血に際して末梢血又は臍帯血にヘパリンなどの凝固防止剤が加えられてもよい。

得られた末梢血又は臍帯血から、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離する（図２：Ｓ３）。具体的には、フィコール比重遠心法を用いて末梢血又は臍帯血から単核球を分離する。次いで、免疫ビーズ法を用いて単核球からＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離する。ここで、単核球とは、リンパ球及び単球を含む総称である。まず、採血により得られた末梢血又は臍帯血に対してフィコール比重遠心法における遠心分離を行ってバフィーコートを得る。このバフィーコートに、抗ＣＤ４抗体を含む液体を加えて反応させる。これにより、末梢血若しくは臍帯血、又はバフィーコート中の単核球であって、表面マーカーとしてＣＤ４分子を有する細胞、つまりＣＤ４^＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）に抗ＣＤ４抗体が免疫結合する。つづいて、抗ＣＤ４抗体と特異的に反応する２次抗体が固定された磁気ビーズを加えて反応させる。この反応により、抗ＣＤ４抗体が免疫結合したＣＤ４^＋Ｔ細胞が磁気ビーズに結合する。したがって、磁気ビーズをマグネットに吸着させることにより、反応残液を除去することができる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞が結合した磁気ビーズと反応残液とを分離してから、磁気ビーズからＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離する。分離したＣＤ４^＋Ｔ細胞は液中に浮遊するので、この液と磁気ビーズとを分離することにより、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の浮遊液が得られる。なお、本工程（図２：Ｓ３）は、末梢血又は臍帯血にＣＤ４抗体を含む液体を直接加えて反応させ、次いで免疫磁気ビーズ法によりＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離する手法であってもよい。また、ＣＤ４⁻Ｔ細胞を除去してＣＤ４^＋Ｔ細胞を得る手法であってもよい。

［第２ステップ］
第２ステップでは、第１液を充填されたバッグ１１の内部空間において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、プレート１２に固定された抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）と反応させる（図２：Ｓ４）。

バッグ１１に充填される第１液は、Ａｌｙｓ培地に、５％ヒトＡＢ型血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ＩＬ２（図４における参照符号１７）、ＴＧＦ−β（図４における参照符号１８）を添加した液である。この第１液をポート１３，１４を通じてバッグ１１の内部空間へ注入する。つづいて、前述されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の浮遊液を、ポート１３，１４を通じてバッグ１１の内部空間へ注入する。このバッグ１１を、ＣＯ_２インキュベータに入れて、３７℃、５％ＣＯ_２で７日間放置する。なお、放置期間中においては、適宜、第１液などをバッグ１１へ追加したり、バッグ１１を裏返したりする。この放置期間中に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）と反応するとともに、ＩＬ２（１７）、ＴＧＦ−β（１８）により刺激を受ける。

詳細には、第１液中において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０の抗原受容体であるＣＤ３（図４における参照符号２１）及びＣＤ２８（図４における参照符号２２）に抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）がそれぞれ結合する。これにより、ＣＤ３（２１）及びＣＤ２８（２２）を介してＣＤ４^＋Ｔ細胞２０が刺激を受ける。

さらに、第１液に含まれるＩＬ２（１７）及びＴＧＦ−β（１８）によってもＣＤ４^＋Ｔ細胞２０が刺激を受ける。ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０には、ＣＤ２５陰性（−）ＦｏｘＰ３陰性（−）Ｔ細胞も含まれるが、これらの刺激によってＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＦｏｘＰ３⁻Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞に転換されると想定される。つまり、プレート１２に固定された抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）と結合したＣＤ４^＋Ｔ細胞２０がＩＬ２（１７）及びＴＧＦ−β（１８）に刺激されることによって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞が選択的に増幅される。この選択的な増幅により、バッグ１１におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞２０の大半がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞となる。

［第３ステップ］
第３ステップでは、プレート１２からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞が分離されて（図２：Ｓ５）、第２液中においてＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞が増幅される（図２：Ｓ６）。

プレート１２からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の分離は、セルリフターを用いてバッグ１１の壁越しにプレート１２に結合されたＣＤ４^＋Ｔ細胞２０を掻き取ることにより行われる。掻き取られたＣＤ４^＋Ｔ細胞２０はバッグ１１内において第１液中に浮遊する。そして、バッグ１１の同様のバッグをポート１３又はポート１４に連結して、バッグ１１内の第１液を移し取る。移し取られた第１液にはＣＤ４^＋Ｔ細胞２０が浮遊しているので、遠心分離により、このＣＤ４^＋Ｔ細胞２０の細胞浮遊液を収集する。

収集されたＣＤ４^＋Ｔ細胞２０の細胞浮遊液を、公知の培養バッグなどに注入して培養する。この培養バッグには第２液を充填する。本実施形態で用いられる第２液は、前述された第１液と同じ組成であり、Ａｌｙｓ培地（細胞科学研究所社製）に、５％ヒトＡＢ型血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ＩＬ２、ＴＧＦ−βを添加した液である。この第２液を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０を培養する。この培養は、３７℃、５％ＣＯ_２で７日間行う。なお、培養期間中においては、適宜、第２液などを培養バッグへ追加する。培養後に、遠心分離により、培養バッグからＣＤ４^＋Ｔ細胞２０を収集する。このＣＤ４^＋Ｔ細胞２０の大半がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞である。得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞２０の細胞浮遊液は、Ａｌｙｓ培地及びＤＭＳＯを含む液体中で凍結保存することもできる（図２：Ｓ７）。

［制御性Ｔ細胞の確認］
前述された制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞２０に制御性Ｔ細胞が含まれることは、以下の２つの方法により確認される。

［確認方法１］
確認方法の１つめとしては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞が含まれることを直接フローサイトメトリーを用いて判定する方法があげられる。この方法では、主に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０の細胞膜の透過処理を施してから、ＣＤ２５抗体及びＦｏｘＰ３抗体を用いて免疫染色を施すことにより、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞を確認することができる。また、この方法によれば、全ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の存在比率を算出することもできる。

［確認方法２］
確認方法の２つめとしては、混合リンパ球反応系に上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞を加えることにより、レスポンダーＴ細胞の増殖が抑制されることを確認する方法があげられる。この判定は、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応（ＭＬＲ：Mixed Lympfocyte Reaction）を用いて行うことができる。具体的には、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応の系に、上記第３ステップにより得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞２０を添加して培養する。レスポンダーＴ細胞に対する増殖抑制効果の判定は、主にフローサイトメトリーにより、レスポンダーＴ細胞を染色した化合物の輝度の減衰度にて行われる。この確認手法において、レスポンダーＴ細胞が染色される。染色は、例えば、ＣＦＳＥ染色キット（Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit、ダイナール・インビトロゲン社製）を用いて行うことができる。

［本実施形態の効果］
本制御性Ｔ細胞製造方法によれば、ヒト末梢血又は臍帯血から分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞２０を、ＩＬ２（１７）及びＴＧＦ−β（１８）を含む第１液中において抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）により刺激した後、抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）から分離して増幅させるので、ＣＤ４^＋Ｔ細胞２０からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞が選択的に増幅されて、制御性Ｔ細胞を特異的かつ効率的に得ることができる。これにより、採血量を少なくしてヒトへの負担を軽減し、かつ細胞療法に必要な量の制御性Ｔ細胞を簡易に得ることができる。特に、制御性Ｔ細胞増幅装置１０を用いることにより、本制御性Ｔ細胞製造方法を簡便に実施できる。

［第１変形例］
前述された実施形態では、バッグ１１の内部空間にプレート１２が封入されているが、本発明における不溶担体は、プレート形状以外の他の形状が採用されてもよい。例えば、図５に示されるように、バッグ１１の内部空間に複数のビーズ３１が封入されてもよい。ビーズ３１の素材として、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂を用いることができる。また、ビーズ３１は、その内部に磁性体が用いられた磁性ビーズであってもよい。このビーズ３１への抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の固定は、プレート１２と同様の手法を用いることができる。

［第２変形例］
前述された実施形態では、本発明における不溶担体として、バッグ１１とは別のプレート１２が用いられているが、本発明における不溶担体は、バッグなどの容器と一体に構成されていてもよい。不溶担体を容器と一体に構成する場合には、不溶担体は、容器が第１液を保持する空間の少なくとも一部を構成し、かつ保持された第１液と接触しうる部材である。

例えば、図６に示されるように、バッグ３２の内壁の一部を不溶担体としてもよい。バッグ３２は、バッグ１１と同様に２枚の樹脂シート３３，３４から構成されているが、これら樹脂シート３３，３４は、第１液を保持した状態で撓むことなく形状を維持する曲げ剛性を有する。この曲げ剛性は、樹脂シート３３，３４の素材、厚み、ラミネート構造などによって達成される。例えば、樹脂シート３３，３４の素材として低密度ポリエチレンを選択した場合には厚みを２００μｍ以上とすることにより適度な曲げ剛性が得られる。また、樹脂シート３３，３４の素材として超高分子量ポリエチレンを選択した場合には厚みを２５μｍ以上とし、環状ポリオレフィン系樹脂を選択した場合には厚みを１００μｍ以上とすることにより適度な曲げ剛性が得られる。

そして、樹脂シート３３，３４の内壁の一部を抗体固定領域３５（図６において２点鎖線で囲まれた領域）とする。この抗体固定領域３５は、抗体を固定可能な樹脂素材を樹脂シート３３，３４の内壁側に積層して形成されている。この抗体固定領域３５に、前述された手法によって抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定される。そして、バッグ３２の内部空間に第１液が充填されることにより、抗体固定領域３５が第１液と接触する。

以下に、本発明の実施例が説明される。本実施例は、本発明の一実施形態であり、本発明が実施例に記載された態様に限定されないことは言うまでもない。

［実施例１］
制御性Ｔ細胞増幅装置１０のバッグ１１及びプレート１２は、ニプロ社にて製造されたものを用いた。抗ヒトＣＤ３抗体（オルソクローン、ヤンセン協和／協和発酵社製）及び抗ヒトＣＤ２８抗体（eBiosience社製）をリン酸緩衝液で希釈して各々５μg/ｍＬとして抗体溶液を調製した。予め内部をリン酸緩衝液で洗浄したバッグ１１に、この抗体溶液５ｍＬを注入し、室温に３０分間放置した後、４℃で冷蔵保存した。そして、後述される制御性Ｔ細胞製造方法を実施する前に、バッグ１１内から抗体溶液を排出してリン酸緩衝液で洗浄した（Ｓ１）。

５例の健常人から末梢血２０ｍＬをそれぞれヘパリン加採血し（Ｓ２）、予め３ｍＬフィコール（GE-Amersham Pharmacia社製）を分注したコニカルチューブ（１５ｍＬ、コーニング社製）社に、各末梢血をそれぞれ重層した。そのコニカルチューブを、１８００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、分離されたバフィーコートを採取した。得られたバフィーコートにリン酸緩衝液を加えて２度遠心分離し（１，５００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、Ａｌｙｓ培地（Alys505Nw/oIL2、細胞化学研究所製）を加えて細胞浮遊液を得た。

前述された細胞浮遊液に、抗ＣＤ４抗体（Dynabeads FlowComp Human CD4、ダイナール・インビトロゲン社製）を５μＬ／１×１０^７ｃｅｌｌの割合で添加して、４℃、１０分間放置して反応させた。１回、分離用の緩衝液（PBS, 0.1% AB serum, 2mM EDTA）にて洗浄後、分離用の緩衝液２００μＬ／１×１０^７ｃｅｌｌの割合で細胞を浮遊させ、磁性ビーズ（Dynabeads FlowComp Human CD4、ダイナール・インビトロゲン社製）を１５μＬ／１×１０^７ｃｅｌｌの割合でそれぞれ加えて、４℃、１５分間撹拌した。マグネットにより磁性ビーズを固定して上清を廃棄及び洗浄した後、製品添付のリリース緩衝液（Dynabeads FlowComp Human CD4、ダイナール・インビトロゲン社製）を加えて室温で１０分間撹拌して、磁性ビーズからＣＤ４^＋Ｔ細胞を遊離させた（Ｓ３）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の浮遊液の一部を試験して、純度が９５％以上であることを確認した。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞の浮遊液を、第１液（Alys 505N, 5% AB serum, Penicilin, Streptomycin, Amphotericin B, recombinat human IL2 200U/ml, recombinant human TGF-β1, 10ng/ml）を用いて５×１０^５ｃｅｌｌ／５ｍＬに調製して、１０ｍＬをバッグ１１に注入した。そのバッグ１１をＣＯ_２インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れて、１日毎にバッグ１１を裏返し、３日目に第１液を適宜追加した（Ｓ４）。

７日目に、セルリフターを用いてバッグ１１の壁越しにプレート１２からＣＤ４^＋Ｔ細胞を剥がし取り、バッグ１１内の細胞浮遊液５０ｍＬをコニカルチューブへ移した（Ｓ５）。このコニカルチューブ内の細胞浮遊液を遠心分離（４００Ｇ、１０分間、４℃）した後、上清を廃棄した。このコニカルチューブに第２液（Alys 505N, 5% AB serum, Penicilin, Streptomycin, Amphotericin B, recombinat human IL2 200U/ml, recombinant human TGF-β1, 5ng/ml）を１×１０^７cellあたり５０ｍＬを加え、これを２次培養バッグ（ニプロ社製）に移した。その２次培養バッグをＣＯ_２インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れて培養した（Ｓ６）。３日目及び６日目（初期から１０日目及び１３日目）に第２液を適宜追加した。

１４日目に、２次培養バッグから評価試験用サンプルを採取すると共に、前述と同様にコニカルチューブを用いて２次培養バッグの細胞浮遊液を得た。

［実施例２］
５例の健常人の末梢血（サンプルＮｏ．１〜５）に代えて、予めインフォームドコンセントを得た慢性ＧＶＨＤ患者の末梢血（サンプルＮｏ．６）及び臍帯血移植患者の末梢血（サンプルＮｏ．７）を用いたこと以外は、前述された実施例１と同様に行った。

［比較例１］
第１液及び第２液においてＴＧＦ−β１を加えなかったこと以外は実施例１と同様に行った。

［実験例１］
実施例１、実施例２及び比較例１におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の確認をフローサイトメトリーを用いて行った。

フローサイトメトリー測定用のチューブに、上記で採取した実施例１及び比較例１の評価試験用サンプルを０．５〜１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬチューブ添加し、１００μＬリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に浮遊させた。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２５抗体５μＬ、ＥＣＤ標識抗ＣＤ４（若しくはＣＤ６９）抗体を２μＬ添加し細胞表面を公知の方法でまず標識した。死細胞を区別するためにエチジウムモノアジドブロマイド（ＥＭＡ、Molecular Probe社製）を最終濃度５μｇ／ｍＬとなるように加え、一旦氷上で近距離（蛍光灯下１０〜２０ｃｍ）から蛍光灯の光を１０分間あてた。光を当てた後に、PE antihuman Foxp3 Staining Set（eBioScience社製）の方法に準じて染色した。即ち、Fixation/Permealization buffer（１：３で希釈、PE antihuman Foxp3 Staining Set付属）を加え、３０分間から１時間４℃遮光にて放置した。その後１回ＰＢＳにて洗浄後、０．５ｍＬのPermealization buffer（PE antihuman Foxp3 Staining Set付属）にてさらに２回洗浄後、デカントで上清を廃棄した。残りの細胞浮遊液に２％(０．５μＬ) normal rat serum（PE antihuman Foxp3 Staining Set付属）およびＰＥ標識抗ＦｏｘＰ３抗体（eBioScience社製）を１０μＬ添加し４℃、３０分間静置した。Permealization buffer ０．５ｍＬにて２回洗浄後、適量のＰＢＳに浮遊させた。この細胞浮遊液の入ったフローサイトメトリー測定用のチューブをフローサイトメトリー（EPICS XL、ベックマン・コールター株式会社製）にセットし、測定を行った。その結果を解析し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞数におけるＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の存在比率を算出した。その結果を表１に示す。

表１から明らかなように、実施例により培養された全Ｔ細胞数に対する制御性Ｔ細胞が占める細胞数の割合は、少なくとも４５％以上であった。一方、比較例１では、最も高い割合で４２％であった。このことから、本制御性Ｔ細胞製造方法により、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞が効率的に増幅されることが明らかとなった。

また、上記第１ステップにおいて分離された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞）に対して、上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞）の増幅率を、前述されたフローサイトメトリーの測定結果から算出して表２に示した。なお、増幅率は、実施例１及び比較例１については５例（サンプルＮｏ．１〜５）の平均値±ＳＤが示され、実施例２については各例（サンプルＮｏ．６，７）において算出された値が示されている。

実施例１では、培養０日目の細胞数に対して６２，２４９±３３，５９７倍の細胞が得られた。また、実施例２のサンプルＮｏ．６では、培養０日目の細胞数に対して８６，７６７倍の細胞が得られ、サンプルＮｏ．７では、培養０日目の細胞数に対して６０２，７８４倍の細胞が得られた。一方、比較例１では、２６，３４０±２７，７８１倍であった。この結果から、本制御性Ｔ細胞製造方法が、当業者の予測を遙かに超えた倍率でＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の増幅を可能とすることが明らかとなった。

［実験例２］
実施例１及び比較例１におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の増殖抑制効果の確認を、混合リンパ球反応とフローサイトメトリーを組み合わせた方法により評価を行った。

（１）レスポンダーＴ細胞の懸濁液の調製
まず、レスポンダーＴ細胞を調製した。具体的には、サンプルＮｏ．1の提供者の末梢血２０ｍＬをヘパリン加採血し、予め３ｍＬのLymphoprep液（AXIS-SHIELD PoC AS社製）を分注したコニカルチューブに、各個体の末梢血をそれぞれ重層した。そのコニカルチューブを、１，８００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、分離された単核球を採取した。得られた単核球にリン酸緩衝液を加えて２度遠心分離し（１，５００ｒｐｍ、５分間）、リン酸緩衝液を加えて、１〜５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのレスポンダーＴ細胞懸濁液を得た。これに、ＣＦＳＥ最終濃度１μＭ（１ｍＭのストックを１０００倍希釈）となるように添加し、約１５分間、３７℃、遮光環境下で、培養した。培養は、途中で撹拌しながら行った。その後、４℃で、２％ＡＢ型血清のリン酸緩衝溶液を１ｍＬ添加し、さらにリン酸緩衝液を加えて、染色の反応を止めた。遠心分離後、リン酸緩衝液をAssay Medium（Alys 505N, 10% AB serum）に置き換えて、レスポンダーＴ細胞を再度洗浄した。その後、適量のAssay Mediumを添加後、血球計算板（萱垣製作所社製）により、レスポンダーＴ細胞の細胞数をカウントした。そして、Assay Mediumを用いて、細胞濃度が２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、レスポンダーＴ細胞の懸濁液を調製した。また、後述の混合リンパ球反応における、コントロールとしてこのレスポンダーＴ細胞の懸濁液を、ポジティブコントロールとしてこのレスポンダーＴ細胞の懸濁液にPHA-L (5μg／ｍＬ添加)をそれぞれ用意した。

（２）樹状細胞の懸濁液の調製
次に、樹状細胞を調製した。制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞と同一者を自己、他人を同種として上記（１）の採血(混合リンパ球反応試験日)より概ね１週間前に採取し、それぞれの単核球を、リン酸緩衝液を用いて、細胞濃度が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製した。次に、１０ｃｍＤｉｓｈにこの細胞懸濁液１０ｍＬを入れ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、約２時間培養した。浮遊細胞を除去した後、培養液を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地に置換し、サイトカインとして、ＩＬ４を５００Ｕ／ｍＬ、ＧＭ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍＬを加えて、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、約６日間培養した。これにより、未熟樹状細胞が作製される。さらに、浮遊細胞を除去した後、再度１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、ＴＮＦ−α ２０ｎｇ／ｍＬを加えて約２日間培養した。これにより、成熟樹状細胞が作製される。スクレーパー又はセルリプターを用いて付着細胞を剥離し、浮遊細胞も含めて細胞を回収した。そして、Assay Mediumを用いて、細胞濃度が２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、樹状細胞の懸濁液を調製した。なお、この懸濁液は、５０Ｇｙのγ線を照射して、樹状細胞自体の増殖はできないようにした。また、同種の樹状細胞の懸濁液を調製するために、サンプルＮｏ．３の提供者にも協力いただいた。

（３）制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の懸濁液の調製
まず、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の懸濁液を調製した。具体的には、上記で採取した実施例１の評価試験用サンプル（サンプルＮｏ．１、１×１０^７ｃｅｌｌｓ）を回収した後、無血清・無抗生剤ＲＰＭＩ培地にて２回洗浄し、２５μＬ以下となるように、上清を除去した。次に、ＰＫＨ２６染色キット（Mini26-1KT PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, for General Cell Membrane Labeling, #037K0464, Sigma社製）を用いて、この評価試験用サンプルの制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞を染色した。具体的には、洗浄した実施例１及び比較例１の評価試験用サンプルに、上記キット添付のDiluent Cを０．５ｍＬを加え、次いで、ＰＫＨ２６溶液（４×１０^−６M）を０．５ｍＬを加えた。そして、ときどき撹拌しながら室温（２５℃）で、５分間培養した。その後、２％ＡＢ型血清のリン酸緩衝溶液を１ｍＬ添加して反応を止め、１分間室温（２５℃）で放置した。その後、Assay Mediumを加え、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、Assay Mediumで３回洗浄した。血球計算板（萱垣製作所社製）により、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞数をカウントした。最後に、Assay Mediumを用いて、細胞濃度が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の懸濁液を調製した。

（４）混合リンパ球反応
上記（１）〜（３）の各細胞懸濁液を用いて、混合リンパ球反応を行った。詳細には、上記（１）〜（３）の各細胞懸濁液を、下記表３の混合比（細胞数として）に従って、96 well plate U 型に播種した。全容量が２００μＬとなるようにAssay Mediumを加えた後、抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍＬ）のAssay Medium溶液を２μＬずつさらに各Wellに加え、約５日間培養した。下記表３における系（ａ）〜（ｄ）は、樹状細胞若しくはリンパ球が同種の場合と、自己の場合のそれぞれで行った。

（５）フローサイトメトリーによる評価
上記（４）における混合リンパ球反応の結果を、フローサイトメトリーを用いて、レスポンダーＴ細胞に染色したＣＦＳＥの輝度の減衰により評価した。詳細には、フローサイトメトリー測定用のチューブに、ＥＣＤ抗ＣＤ４抗体を１μＬ添加した。一方で、別途用意したフローサイトメトリー測定用のチューブに、ＥＣＤ抗ＣＤ８抗体を１μＬ添加した。そして、各チューブに、上記（４）における混合リンパ球反応後に採取した細胞懸濁液をそれぞれ９５μＬずつ添加し、４℃、３０分間、遮光環境下で静置した。リン酸緩衝液で洗浄後、ＰＩ（Propidium Iodine）を添加した。この懸濁液を収容したフローサイトメトリー測定用のチューブを、フローサイトメトリー（EPICS XL、ベックマン・コールター株式会社製）にセットし、レスポンダーＴ細胞のうち各ＣＤ４^＋Ｔ細胞又はＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの輝度の測定を行った。

得られた結果を図７及び図８に示す。自己又は同種ともに樹状細胞若しくはリンパ球の存在によって、各図（ａ）と比較して、ＣＦＳＥの輝度が減衰していることがわかる（図７（ｂ）及び図８（ｂ））。これは、樹状細胞若しくはリンパ球の存在によりレスポンダーＴ細胞が活性化され、増幅していることを示す結果である。

しかしながら、さらに、本制御性Ｔ細胞製造方法により得られた制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞を存在させると、各図（ａ）と比較して、ＣＦＳＥの輝度がほとんど減衰していないことがわかる（図７（ｃ）及び図８（ｃ））。これは、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の存在により、レスポンダーＴ細胞の増幅が抑制されていることを示す結果である。

そして、各図（ｃ）における制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の存在比よりも、その存在比を低くすると、各図（ａ）と比較して、ＣＦＳＥの輝度が若干ではあるが減衰していることがわかる（図７（ｄ）及び図８（ｄ））。これは、レスポンダーＴ細胞の増幅抑制効果が、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の存在比に依存していることを示す結果である。

［実験例３］
Ｉｎｖｉｖｏでの制御性Ｔ細胞の投与効果を確認した。

（１）Xenogenetic-GVHD発症モデルマウス
生後８〜１４日目の４匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（重症免疫力不全マウス）を、日本ＳＬＣ社から得た。これらのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、国立大学法人東京大学医科学研究所のガイドラインに従って取り扱った。Xenogenetic-GVHD（Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ）発症用の細胞として、ある２人のドナー（以下、各々がドナー１、ドナー２と称される。）から得られた末梢血単核細胞（以下、「ＰＢＭＣ」とも称される。）を用いた。このＰＢＭＣを、抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体をコートしたフラスコにて培養することによって、活性化Ｔ細胞とした。この培養は、ＩＬ−２（２００units/mL）を含むＡｌｙｓ５０５Ｎ培地（細胞科学研究所製）を用い、６ウェル−プレートに細胞を播種して行った。培養開始から２日後に、活性化Ｔ細胞に対してルシフェラーゼ発現（HIV-EF1a-Luciferase）第３世代レンチウイルスベクターで遺伝子導入を行った。実際には、細胞ペレットにＭＯＩ（multiplicity of infection）２０のレンチウイルスとともに２時間培養して感染、洗浄した。遺伝子導入後の細胞を、さらに１週間、抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体をコートしたフラスコにて培養し、Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞とした。

前述された各ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対して、細胞を投与する前に、３５０cGyのγ線を照射した。そして、２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、形質転換されたドナー１のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞３０×１０^６個を腹腔内投与し、別の２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、形質転換されたドナー２のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞３０×１０^６個を腹腔内投与することによって、Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスを作成した。

（２）制御性Ｔ細胞の投与
ドナー１のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞投与によるＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症から１３日経過後の１匹のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに、実施例１に従って製造された制御性Ｔ細胞１０×１０^６個を投与した（マウス１）。また、ドナー２のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞投与によるＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症から１３日経過後の１匹のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスにも、実施例１に従って製造された制御性Ｔ細胞１０×１０^６個を投与した（マウス２）。一方、ドナーがそれぞれ異なる残りの２匹のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに対しては、制御性Ｔ細胞を投与せずに、それぞれの比較対象とした（マウス３，４）。

（３）Ｉｎｖｉｖｏでの評価
Ｉｎｖｉｖｏでの制御性Ｔ細胞の投与効果を、ＣＣＤカメラシステム（Xenogen社製、IVIS Image System）を用いて行った。具体的には、ＣＣＤカメラシステムにて観察する直前に、各Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに、７５mg/kgのＤ−ルシフェリン（Promega社製）を皮下投与した。そして、Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに対してイソフルランで麻酔しながら、ＣＣＤカメラシステムの試料室にＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスを置いて、イソフルラン投与１０分後のマウスの腹部を各３回ずつ撮影した。撮影は、制御性Ｔ細胞の投与前と、制御性Ｔ細胞投与後の３〜７６日後の任意の複数の日とにおいてそれぞれ行った。マウス１〜４の撮影結果を図９に示す。

マウス１，２においては、いずれも活性化Ｔ細胞の増加が抑制されることが確認された。マウス３，４においては、いずれも活性化Ｔ細胞の増加が確認され、マウス３では４６日後にマウスが死亡し、マウス４では７６日後にマウスが死亡した。このことから、ＧＶＨＤ患者に対して制御性Ｔ細胞を投与することによって、活性化Ｔ細胞の増加が抑制されることがＩｎｖｉｖｏで証明された。

１０・・・制御性Ｔ細胞増幅装置
１１，３２・・・バッグ（容器）
１２・・・プレート（不溶担体）
３１・・・ビーズ（不溶担体）
３５・・・抗体固定領域（不溶担体）

Claims

ヒトから採取された血液中からＣＤ４陽性を示すＴ細胞を分離する第１ステップと、
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固相化抗体として固定された不溶担体を内部空間に有する可撓性のバッグに、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液と共に上記Ｔ細胞を注入して、当該バッグ内において上記Ｔ細胞と固相化担体とを反応させる第２ステップと、
上記バッグの外側からアクセスして上記不溶担体から上記Ｔ細胞を剥がし取って上記バッグから取り出し、取り出されたＴ細胞を別のバッグに充填されたＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中において増幅させる第３ステップと、を含み、
上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に対して、制御性Ｔ細胞が占める細胞数の割合が４５％以上であり、
上記第１ステップにおいて分離された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞に対する、上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞の増幅率が１００００倍以上である制御性Ｔ細胞製造方法。
上記不溶担体が、上記バッグの内壁の少なくとも一部である請求項１に記載の制御性Ｔ細胞製造方法。
上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞に、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、かつＦｏｘＰ３陽性のＴ細胞が含まれる請求項１又は２に記載の制御性Ｔ細胞製造方法。
上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞に、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、当該ヒトに対して自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応において、当該レスポンダーＴ細胞の増殖を抑制するＴ細胞が含まれる請求項３に記載の制御性Ｔ細胞製造方法。