JP5464462B2 - Nitric oxide measuring method and measuring apparatus - Google Patents
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本発明は一酸化窒素（NO）、特には試料ガス中の微量のNOを即時に検出するのに好適な測定方法およびその測定装置に関する。 The present invention relates to a measurement method suitable for immediately detecting nitric oxide (NO), particularly a trace amount of NO in a sample gas, and a measurement apparatus therefor.
一酸化窒素（NO）は大気汚染の原因物質であるNOxの一つであり、環境基準として大気中のNO濃度が測定されている。一方、NOは気道上皮で炎症が生じると呼気中に排出される量が増加し、その量が炎症の程度とよく相関することから、近年、喘息を含む気道疾患のマーカーとしても注目されるようになってきた。1997年には欧州呼吸器学会（Eur. Respir. J., 10, 1683-1693（1997））で、1999年には米国胸部学会で（Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 160, 2104-2117（1999））で、それぞれ呼気中NOのモニタリング方法に関するガイドラインが採択されている。 Nitric oxide (NO) is one of the NOx that cause air pollution, and NO concentration in the atmosphere is measured as an environmental standard. On the other hand, NO is increased in the amount of exhaled air when inflammation occurs in the airway epithelium, and the amount correlates well with the degree of inflammation, so in recent years, it will be noted as a marker for airway diseases including asthma It has become. In 1997 the European Respiratory Society (Eur. Respir. J., 10, 1683-1693 (1997)) and in 1999 at the American Thoracic Society (Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 160 , 2104-2117 (1999)), guidelines for monitoring exhaled NO are adopted.
大気や呼気などの気体試料中のNOを測定する場合、ppbレベルの測定感度が求められている。従来、ドライ（乾式）なNOの測定法としてはオゾンを用いる化学発光法が、ウェット（湿式）なNOの測定法としては、ガス吸収液に測定対象ガスを取り込み、ザルツマン試薬と反応させるザルツマン法（吸光光度法）が実用に供されている。 When measuring NO in gas samples such as air and exhaled air, ppb level measurement sensitivity is required. Conventionally, chemiluminescence using ozone is used as a dry NO measurement method, and as a wet NO measurement method, the target gas is taken into the gas absorption liquid and reacted with the Salzmann reagent. (Absorptiometry) is in practical use.
化学発光法は、ガス状のNOとオゾンを反応させることにより生成する励起状態のNO2が基底状態に戻るときの発光を利用して気体試料中のNOを測定する方法である（Palmer, R.M., et al., Nature, 327, 524-526(1987)）。該方法は非常に高感度であり、リアルタイムに大気中のNO測定が可能であるが、反応に使用するオゾンを生成させるためのオゾン発生装置（オゾニエーター）が必要であり、該オゾニエーターには一定のオゾン条件を得るための暖機に時間がかかるという問題がある。また、ppbレベルでNOを測定するための高感度化及び試料ガス中に共存する二酸化炭素によるクエンチングの影響回避のために真空ポンプを用い減圧条件で測定することが必要である。このように化学発光法による気体試料中のNO測定には、測定装置の軽量化・体積の小型化が困難であり、装置や測定に係わるコストが高くなるという欠点があった。このため、例えば、定点設置して環境中のNOを測定する場合にはあまり問題にならないが、自動車で立ち入ることが出来ない複数の場所（地点）における環境中のNOを、地点を移動して測定することや、医療現場において呼吸器疾患患者、例えば気管支喘息患者のベットサイドへ測定装置を運んで、または、患者自身が測定装置を携帯して呼気中のNOを測定することは困難であり、化学発光法は装置に起因して使用可能な環境が限られるという問題があった。 The chemiluminescence method is a method for measuring NO in a gas sample by using luminescence when the excited NO 2 produced by reacting gaseous NO and ozone returns to the ground state (Palmer, RM , et al., Nature, 327, 524-526 (1987)). Although this method is very sensitive and can measure NO in the air in real time, it requires an ozone generator (ozonator) to generate ozone for use in the reaction. There is a problem that it takes time to warm up to obtain ozone conditions. In order to increase the sensitivity for measuring NO at the ppb level and to avoid the influence of quenching by carbon dioxide coexisting in the sample gas, it is necessary to measure under reduced pressure conditions using a vacuum pump. As described above, the NO measurement in a gas sample by the chemiluminescence method has a drawback that it is difficult to reduce the weight and volume of the measuring device, and the cost for the device and the measurement becomes high. For this reason, for example, it is not a big problem when measuring NO in the environment by installing a fixed point, but moving the NO in the environment in multiple places (points) where you can not enter by car It is difficult to measure, carry a measuring device to the bedside of a patient with respiratory illness such as bronchial asthma in the medical field, or carry the measuring device by itself to measure NO in exhaled breath The chemiluminescence method has a problem that the usable environment is limited due to the apparatus.
ザルツマン法は、気体試料中のNO2をバブラーなどを使用して水性のガス吸収液に取り込ませ、水（H2O）とNO2とを反応させて亜硝酸イオン（NO2 -）生じさせ、該NO2 -とスルファニル酸とを反応させてジアゾ化スルファニル酸塩とし、次いでＮ−１−ナフチルエチレンジアミンとアゾカップリングさせて生成するアゾ色素の吸光度を測定して気体試料中のNO2濃度を測定する方法である。しかし、NOそれ自体は、スルファニル酸、Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン、酢酸から成る前記ザルツマン試薬とは反応しないため、ザルツマン法ではNOを直接測定することが出来ない。ザルツマン法でNOを測定するためには、まずNOを過マンガン酸カリウムなどの酸化剤によりNO2に酸化する必要があり、測定試料中にNOガスとNO2ガスが共存する場合には、NOガスのNO2への酸化に先立ち試料由来のNO2ガスを分離・除去して測定を行う必要があった。また、ザルツマン法は色素の発色を測定する方法であるため感度が低く、測定対象（試料）が大気のような場合には問題はないが、試料が少量、NOが低濃度の場合には測定できないという欠点があった。 Salzmann method, the NO 2 gas in a sample using such bubbler incorporated into the gas absorbing liquid aqueous, water (H 2 O) is reacted with NO 2 nitrite ions (NO 2 -) cause Then, the NO 2 concentration in the gas sample is measured by measuring the absorbance of the azo dye formed by reacting the NO 2 - with sulfanilic acid to form a diazotized sulfanilate and then azo-coupling with N-1-naphthylethylenediamine. Is a method of measuring. However, since NO itself does not react with the Salzmann reagent consisting of sulfanilic acid, N-1-naphthylethylenediamine, and acetic acid, NO cannot be directly measured by the Salzmann method. In order to measure NO by the Salzmann method, it is necessary to first oxidize NO to NO 2 with an oxidizing agent such as potassium permanganate. When NO gas and NO 2 gas coexist in the measurement sample, NO Prior to the oxidation of gas to NO 2 , it was necessary to perform measurement by separating and removing NO 2 gas derived from the sample. In addition, the Salzmann method is a method that measures the color development of the dye, so the sensitivity is low and there is no problem when the measurement target (sample) is air, but it is measured when the sample is small and NO is low in concentration. There was a disadvantage that it was not possible.
ザルツマン試薬の代わりに蛍光試薬である２,３‐ジアミノナフタレン（DAN）を用いて、NOをザルツマン試薬で測定する場合よりも１００倍程度高感度に測定する方法（DAN法）も知られている。しかし該DAN法は、試料中のNOを先ずNO2に変換した後、アルカリ性水溶液で吸収し、該アルカリ性水溶液をpH２以下の酸性とした上でDANと反応させ、再度pH１０以上のアルカリ性に調整した後に生成した蛍光物質を測定する必要があり、測定操作が極めて煩雑になるという問題がある。前記したようにDAN法はザルツマン法よりも高感度ではあるものの、ザルツマン法と同様にNOからNO2への変換が測定に必須であり、NOからNO2への変換効率（酸化率）のバラツキが測定の信頼性を損なう原因となることは解消されていない。 There is also known a method (DAN method) that uses a fluorescent reagent 2,3-diaminonaphthalene (DAN) instead of the Salzmann reagent to measure NO about 100 times more sensitively than when using a Salzman reagent. . However, in the DAN method, NO in the sample is first converted to NO 2 and then absorbed by an alkaline aqueous solution. The alkaline aqueous solution is made acidic at pH 2 or lower, reacted with DAN, and adjusted again to alkaline at pH 10 or higher. There is a problem that it is necessary to measure the fluorescent substance produced later, and the measurement operation becomes extremely complicated. As described above, although the DAN method is more sensitive than the Salzmann method, the conversion from NO to NO 2 is essential for measurement as in the Salzman method, and the conversion efficiency (oxidation rate) from NO to NO 2 varies. However, it has not been solved that causes the measurement reliability to be impaired.
前記ザルツマン法のような、ガス吸収液に測定対象ガスを取り込みケミカルに測定対象ガスを測定する手法は簡便であり、古くから用いられている。しかし、測定試料をバブリング等して測定対象ガスを吸収させるためのガス吸収液量が少なくとも１０〜５０mL程度は必要であり、このガス吸収液の体積の大きさが測定対象を希薄化する原因となる。よって、ppbレベルの成分を計測する場合には数十分から数時間もの長時間にわたり試料ガスをサンプリングしガス吸収液中の測定対象濃度を高めた後に測定する必要があり、経時変化が測定できないという問題点もある。 A technique of taking a measurement target gas into a gas absorption liquid and measuring the measurement target gas as a chemical, such as the Salzmann method, is simple and has been used for a long time. However, the amount of gas absorption liquid for absorbing the measurement target gas by bubbling the measurement sample is required to be at least about 10 to 50 mL, and the volume of the gas absorption liquid causes the measurement target to be diluted. Become. Therefore, when measuring components at the ppb level, it is necessary to sample the sample gas over a long period of time from several tens of minutes to several hours to increase the concentration of the measurement target in the gas absorption liquid, and it is impossible to measure changes over time. There is also a problem.
このような問題点を解決する方法として、特許文献１〜３ 、非特許文献１にはブロック（基板）に設けたマイクロチャネルを用いるガス捕集器が開示され、測定対象ガスのガス吸収液への吸収時間の短縮（試料ガスの濃縮）が果せたことが記載されている。しかしながら、これらの文献の何れにおいても、水への溶解性が高い測定対象ガス（二酸化炭素、硫化水素、二酸化硫黄）を、水性のガス吸収液に取り込んで測定しており、水への溶解性の低いNOガスをNO2への変換なしに直接ガス吸収液に取り込んで測定した例はこれまでに報告されていない。
本発明が解決しようとする課題は、水への溶解性の低いNOガスをNO2への変換なしに、NOの状態で直接ガス吸収液に取り込んで、迅速にNO濃度を測定する方法およびこの測定方法を実施するための装置を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is a method for quickly measuring NO concentration by taking NO gas having low solubility in water directly into the gas absorption liquid in the state of NO without conversion to NO 2 and this. It is to provide an apparatus for carrying out the measuring method.
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意、研究を進めた結果、NOを、ガス透過膜を介してNO蛍光プローブ水溶液と接触させると、NOが水溶液中に取り込まれ、溶存酸素の存在下にNO蛍光プローブと反応して蛍光を発し、NOの濃度を測定できるということを見出した。さらに、上記測定において、試料ガスに対して、試料ガス中の濃度が一定濃度となるように外部からNO2を添加してNOの濃度を測定すると、NO2を添加しない場合と比べて極めて検出感度が向上することを見出した。 As a result of earnestly researching the present inventors to solve the above problems, when NO is brought into contact with the NO fluorescent probe aqueous solution through the gas permeable membrane, NO is taken into the aqueous solution and dissolved oxygen is dissolved. It was found that the concentration of NO can be measured by reacting with a NO fluorescent probe in the presence of NO and emitting fluorescence. Furthermore, in the above measurement, if NO 2 is added from outside to measure the concentration of the sample gas so that the concentration in the sample gas becomes a constant concentration, the concentration of NO is measured much more than when NO 2 is not added. It was found that the sensitivity was improved.
本発明は、上記知見に基づくもので、次の通りである。
（１）一酸化窒素（NO）を含む試料ガスとNO蛍光プローブを含むガス吸収液とをガス透過膜を介して接触させて、試料ガス中の一酸化窒素を前記ガス吸収液に取り込み、このガス吸収液における蛍光量を測定することからなる一酸化窒素の測定方法。
The present invention is based on the above findings and is as follows.
(1) A sample gas containing nitric oxide (NO) and a gas absorbing liquid containing a NO fluorescent probe are brought into contact with each other through a gas permeable membrane, and nitrogen monoxide in the sample gas is taken into the gas absorbing liquid. A method for measuring nitric oxide, comprising measuring the amount of fluorescence in a gas absorbing solution.
（２）前記一酸化窒素を含む試料ガスが、２０〜３０００容量ppbの範囲で二酸化窒素（NO2）を含むものである請求項１に記載の一酸化窒素の測定方法。
（３）前記一酸化窒素を含む試料ガスとガス吸収液との接触をハニカム構造のマイクロチャネルスクラバーで行う上記（１）または（２）に記載の一酸化窒素の測定方法。
（４）前記NO蛍光プローブが、NOの存在下に分子内にトリアゾール環構造を形成して蛍光を発するフルオレセイン誘導体又はローダミン誘導体である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の一酸化窒素の測定方法。
（５）前記NO蛍光プルーブが、４，５‐ジアミノフルオレセイン（DAF-2）、３‐アミノ‐４‐（メチルアミノ）‐２’，７’‐ジフルオロフルオレセイン（DAF-FM）、３‐アミノ‐４‐（メチルアミノ）‐テトラメチルローダミン（DAR-4M）からなる群より選ばれるものである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の一酸化窒素の測定方法。
（６）前記ガス吸収液のpHが、５以上である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の一酸化窒素の測定方法。
（７）前記ガス吸収液が、１０〜４０％の濃度でジメチルホルムアミドを含むものである上記（１）〜（６）のいずれかに記載の一酸化窒素の測定方法。
（８）前記一酸化窒素を含む試料ガスが、大気である上記（１）〜（７）のいずれかに記載の一酸化窒素の測定方法。
（９）前記一酸化窒素を含む試料ガスが、呼気である上記（１）〜（７）のいずれかに記載の一酸化窒素の測定方法
(2) sample gas containing nitric oxide, method for measuring nitric oxide according to claim 1 is intended to include nitrogen dioxide (NO 2) in the range of 20 to 3000 volume ppb.
(3) The method for measuring nitric oxide according to the above (1) or (2), wherein the sample gas containing nitrogen monoxide and the gas absorbing liquid are contacted with a microchannel scrubber having a honeycomb structure.
(4) The nitric oxide according to any one of (1) to (3), wherein the NO fluorescent probe is a fluorescein derivative or rhodamine derivative that emits fluorescence by forming a triazole ring structure in the molecule in the presence of NO. Nitrogen measurement method.
(5) The NO fluorescent probe is 4,5-diaminofluorescein (DAF-2), 3-amino-4- (methylamino) -2 ′, 7′-difluorofluorescein (DAF-FM), 3-amino- The method for measuring nitric oxide according to any one of (1) to (4) above, which is selected from the group consisting of 4- (methylamino) -tetramethylrhodamine (DAR-4M).
(6) The method for measuring nitric oxide according to any one of (1) to (5), wherein the pH of the gas absorbing solution is 5 or more.
(7) The method for measuring nitric oxide according to any one of (1) to (6), wherein the gas absorbing liquid contains dimethylformamide at a concentration of 10 to 40%.
(8) The method for measuring nitric oxide according to any one of (1) to (7), wherein the sample gas containing nitric oxide is the atmosphere.
(9) The method for measuring nitric oxide according to any one of (1) to (7), wherein the sample gas containing nitric oxide is exhaled air.
（１０）
以下の[１]〜[３]を備えた一酸化窒素の測定装置。
[１]一酸化窒素を含む試料ガスが流れるガス流路、
[２]該ガス流路と境界面のガス透過膜を介して接触するように配置されたNO蛍光プローブを含むガス吸収液が流れるガス吸収液流路、を有するガス捕集器、
[３]該ガス捕集器のガス吸収液出口側流路に接続された蛍光検出器
(10)
An apparatus for measuring nitric oxide comprising the following [1] to [3].
[1] a gas flow path through which a sample gas containing nitric oxide flows,
[2] A gas collector having a gas absorption liquid channel through which a gas absorption liquid including a NO fluorescent probe arranged so as to come into contact with the gas channel via a gas permeable membrane on the boundary surface;
[3] Fluorescence detector connected to the gas absorption liquid outlet side channel of the gas collector
（１１）前記ガス捕集器がハニカム構造のマイクロチャネルスクラバーである上記（１０）に記載の一酸化窒素の測定装置。 (11) The measurement apparatus for nitrogen monoxide according to (10), wherein the gas collector is a microchannel scrubber having a honeycomb structure.
先述したように、これまで気体試料中のNOを湿式で測定するには、共存するNO2を取り除いた後、NOをNO2に変換し、そのNO2を間接的に測定していた。これに対し、本発明の方法では、ガス捕集器とNO蛍光プローブの組み合わせで、数１０ppbの測定感度でNOを直接測定できるようになった。また、驚くべきことに、従来、NOガスの測定では、事前に取り除く必要があった共存するNO2を、除去するのではなく逆に一定濃度となるように外部から試料ガス中に添加してNOの濃度を測定すると、NO2を添加しない場合と比べて著しく検出感度が向上し、さらに高感度にNOを直接測定できるようになった。さらに、本発明の測定装置は、従来の化学発光装置に比べ、重量、体積を１／１０以下とすることもできる上、測定感度はヒト呼気のNOにも応答可能である。よってポータブルで持ち運び可能なNOガス測定装置として使用でき、環境測定や呼吸器疾患の評価に使用することができる。 As mentioned previously, the NO gas in the sample is measured in a wet far, after removal of the NO 2 coexisting, converts NO to NO 2, it has been measuring the NO 2 indirectly. In contrast, according to the method of the present invention, NO can be directly measured with a measurement sensitivity of several tens of ppb by a combination of a gas collector and a NO fluorescent probe. Surprisingly, in the conventional measurement of NO gas, coexisting NO 2 that had to be removed in advance is added to the sample gas from the outside so as to obtain a constant concentration instead of removing it. When the concentration of NO was measured, the detection sensitivity was remarkably improved compared to the case where NO 2 was not added, and NO could be directly measured with higher sensitivity. Furthermore, the measurement device of the present invention can be reduced to 1/10 or less in weight and volume as compared with the conventional chemiluminescence device, and the measurement sensitivity can respond to NO of human breath. Therefore, it can be used as a portable and portable NO gas measuring device, and can be used for environmental measurement and evaluation of respiratory diseases.
本発明において、測定の対象となる一酸化窒素（NO）を含む試料ガスは、どのようなガスであっても特には制限されるものではないが、測定の必要性が高い大気や呼気、あるいは自動車の排気ガス等を対象とすることが好ましい。該一酸化窒素を含む試料ガスは、そのまま測定に用いても、二酸化炭素ガスを試料ガスから除去するためのソダライムカラムの使用など、通常使用される方法を用いて共存する他のガスを除去した後に測定に用いても、共存する他のガスを適当な化学物質等により別の化学物質に変換した後に測定に用いる等をしても構わない。また本発明には、「一酸化窒素を含む試料ガスが、２０〜３０００容量ppbの範囲で二酸化窒素（NO2）を含むものである一酸化窒素の測定方法」に関する発明も含まれるが、そのような試料ガスを測定する場合であっても、ガス透過膜を介して本発明のガス吸収液と試料ガスが接触する時点で、試料ガス中に所定濃度のNO2が含まれていることを限度として、トリエタノールアミンを含浸したモレキュラーシーブを充填したカラム等で、あらかじめNO2を除去する工程（ANALYTICAL CHIMICA ACTA, 603,60-66(2007)等）が含まれていることも排除しない。
なお、本明細書において一酸化窒素あるいはNOの語句は、いずれも化学物質の名称あるいは一酸化窒素ガス、NOガスを指す語として使用している。
In the present invention, the sample gas containing nitric oxide (NO) to be measured is not particularly limited by any gas, but the atmosphere or breath having a high necessity for measurement, or It is preferable to target automobile exhaust gas and the like. The sample gas containing nitric oxide removes other coexisting gases using commonly used methods, such as using a soda lime column to remove carbon dioxide gas from the sample gas, even if it is used for measurement. It may be used for the measurement after it has been performed, or may be used for the measurement after the other coexisting gas is converted into another chemical substance by an appropriate chemical substance or the like. The present invention also includes an invention relating to “a method of measuring nitric oxide in which the sample gas containing nitric oxide contains nitrogen dioxide (NO 2 ) in the range of 20 to 3000 ppb”. Even when measuring the sample gas, the sample gas contains NO 2 at a predetermined concentration at the time when the gas absorbing liquid of the present invention and the sample gas come into contact with each other through the gas permeable membrane. Further, it is not excluded that a step of removing NO 2 in advance (ANALYTICAL CHIMICA ACTA, 603, 60-66 (2007), etc.) is included in a column packed with molecular sieve impregnated with triethanolamine.
Note that in this specification, the term “nitrogen monoxide” or “NO” is used to indicate the name of a chemical substance, or nitric oxide gas or NO gas.
本発明において、NO蛍光プローブは、溶存酸素の共存下で、NOと反応して分子内にトリアゾール環構造を形成して蛍光を発するフルオレセイン誘導体又はローダミン誘導体が使用できる。例えば、下記一般式化１で示した化合物；４,５‐ジアミノフルオレセイン（DAF-2）（特開平10-226688など）、３‐アミノ‐４‐（メチルアミノ）‐２’,７’‐ジフルオロフルオレセイン（DAF-FM）（US6,441,197など）、３‐アミノ‐４‐（メチルアミノ）‐テトラメチルローダミン（DAR-4M）（WO99/1447，US6,756,231など）のほか、フルオレセインのカルボキシル基がアルキル基などで置換されたフルオレセイン誘導体（TokyoGreen：登録商標）を母核としフェニル環上の隣接した位置に二つのアミノ基が置換しているNO蛍光プローブ（WO2004/005917号公報）、ローダミンのカルボキシル基がアルキル基などで置換されたローダミン誘導体を母核としフェニル環上の隣接した位置に二つのアミノ基が置換しているNO蛍光プローブ（WO2005/085811号公報）などが好適に使用できるが、これらに限定されない。なお、該フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体に置換しうる置換基の種類などは、前記各文献に記載されており、当業者であれば本発明に使用する際、適宜に選択することができる。 In the present invention, a fluorescein derivative or a rhodamine derivative that emits fluorescence by reacting with NO to form a triazole ring structure in the molecule in the presence of dissolved oxygen can be used as the NO fluorescent probe. For example, a compound represented by the following general formula 1; 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) (JP-A-10-226688, etc.), 3-amino-4- (methylamino) -2 ′, 7′-difluoro Fluorescein (DAF-FM) (US6,441,197, etc.), 3-amino-4- (methylamino) -tetramethylrhodamine (DAR-4M) (WO99 / 1447, US6,756,231, etc.), as well as the carboxyl group of fluorescein NO fluorescent probe (WO2004 / 005917) in which two amino groups are substituted at adjacent positions on the phenyl ring using a fluorescein derivative (TokyoGreen: registered trademark) substituted with an alkyl group or the like as a nucleus, carboxyl of rhodamine A NO fluorescent probe (WO2005 / 085811) in which two amino groups are substituted at adjacent positions on the phenyl ring using a rhodamine derivative in which the group is substituted with an alkyl group as a nucleus is preferably used. It is, but is not limited thereto. The types of substituents that can be substituted for the fluorescein derivative and rhodamine derivative are described in the above-mentioned documents, and those skilled in the art can appropriately select them when used in the present invention.
これらの中でも、４,５‐ジアミノフルオレセイン（DAF-2）は、蛍光強度に優れており、本発明に好適に使用できる。DAF-2を例として、本発明のNO蛍光プローブが、水溶液中で溶存酸素の存在下にNOと反応して蛍光を生じる機序を下記化２に示す。 Among these, 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) is excellent in fluorescence intensity and can be suitably used in the present invention. Taking DAF-2 as an example, the mechanism by which the NO fluorescent probe of the present invention reacts with NO in the presence of dissolved oxygen in an aqueous solution to generate fluorescence is shown in the following chemical formula 2.
上記機序をより詳細に説明する。NOは水溶液中に取り込まれると溶存酸素と反応してNO2を生成する（式A）。この生成したNO2とNOが反応するとN2O3が生成する（式B）。このN2O3は、強いニトロソ化能を有し、DAF-2のフェニル環上の隣接した位置に置換している二つのアミノ基と瞬時に反応して分子内にトリアゾール環構造を形成し、蛍光物質DAF-2Tを与える。このように、溶存酸素を利用してDAF-2を蛍光物質のDAF-2Tに変換するためには通常２分子のNOが必要となる。
NO + 1/2 O2 → NO2 （式A）
NO + NO2 → N2O3 （式B）
DAF-FM、DAR-4M等もDAF-2と同様にフェニル環上の隣接した位置に置換している二つのアミノ基を有し、水溶液中、溶存酸素の存在下にNOと反応してトリアゾール環を形成して蛍光を発する性質を有する。
The above mechanism will be described in more detail. When NO is taken into the aqueous solution, it reacts with dissolved oxygen to produce NO 2 (Formula A). When this produced NO 2 reacts with NO, N 2 O 3 is produced (formula B). This N 2 O 3 has a strong nitrosation ability and reacts instantaneously with two amino groups substituted at adjacent positions on the phenyl ring of DAF-2 to form a triazole ring structure in the molecule. Give the fluorescent substance DAF-2T. Thus, two molecules of NO are usually required to convert DAF-2 to the fluorescent substance DAF-2T using dissolved oxygen.
NO + 1/2 O 2 → NO 2 (Formula A)
NO + NO 2 → N 2 O 3 (Formula B)
DAF-FM, DAR-4M, etc. also have two amino groups substituted at adjacent positions on the phenyl ring, like DAF-2, and reacts with NO in the presence of dissolved oxygen in aqueous solution to triazole. It has the property of forming a ring and emitting fluorescence.
通常、ウェットな方法でNOガスを測定する場合には、予めNO2を除去して測定する必要があるが、本発明の測定方法では、試料ガスに対して、試料ガス中の濃度が一定濃度となるように外部からNO2を添加することで著しく検出感度を向上させることが出来た。これは、一定量のNO2存在下でNOを測定する場合には、式Aの反応を必要とせずに式Bの反応が進行するため、DAF-2を蛍光性のDAF-2Tに変換するのにNOが1分子で済むためと考えられる。さらに、式Aの反応速度は式Bの反応速度に比べ非常に遅く、結果としてNO2を添加しない場合には、DAF-2と反応するN2O3の生成が遅くなりNOとDAF-2の反応が十分に進まないうちに蛍光検出器に送液されて測定されてしまうが、NO2を添加した場合には、速い式Bの反応だけが進行すれば良く、NOとDAF-2の反応が迅速に進行してほとんど全てのNOがDAF-2と反応した後に蛍光検出器送液されて測定できるためと考えられる。なお、上記説明におけるNO分子数の数え方等は、上記した式A，Bを前提としており、式の書き方により分子数の数え方が異なる場合もある。また上記機序は、発明者が推定する機序の一例であって、この機序に拘泥するものではない。 Normally, when measuring NO gas by a wet method, it is necessary to measure NO 2 in advance, but in the measurement method of the present invention, the concentration in the sample gas is a constant concentration relative to the sample gas. The detection sensitivity could be remarkably improved by adding NO 2 from the outside. This means that when measuring NO in the presence of a certain amount of NO 2 , DAF-2 is converted to fluorescent DAF-2T because the reaction of Formula B proceeds without the need for the reaction of Formula A This is probably because only one molecule of NO is required. Furthermore, the reaction rate of Formula A is very slow compared to the reaction rate of Formula B. As a result, when NO 2 is not added, the production of N 2 O 3 that reacts with DAF-2 is slowed and NO and DAF-2 Before the reaction proceeds sufficiently, it is sent to the fluorescence detector and measured, but when NO 2 is added, only the reaction of fast formula B needs to proceed, and NO and DAF-2 This is thought to be because the reaction proceeds rapidly and almost all NO reacts with DAF-2 and then sent to the fluorescence detector for measurement. The number of NO molecules in the above description is based on the above formulas A and B, and the number of molecules may be different depending on how the formula is written. The above mechanism is an example of a mechanism estimated by the inventor, and is not limited to this mechanism.
本発明においては、NO蛍光プローブを水に溶解して、ガス吸収液として使用する。この場合、NO蛍光プローブの濃度は、使用するNO蛍光プローブの種類や測定試料中のNO濃度により、実験的に適宜設定することができるが、例えばDAF-2の場合には、通常、０.１〜５０μM、特には、１〜１０μMとすることが好ましい。また、このガス吸収液としては、DAF-2などのフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体がpH5以上で蛍光を発するため、pH５以上の水溶液を使用することができるが、NOのガス吸収液への取り込みとNOとNO蛍光プローブの反応を向上させるため、pHを７以上にすることが好ましく、特に１０以上にすることが好ましい。ガス吸収液は、リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、ホウ砂バッファー、紫外スペクトル測定用広域バッファー（日本化学会編、「化学便覧 基礎編II」、改訂３版、３５５、昭和５９年）の他、水酸化ナトリウム水溶液等を用い、前記好適なpHに調整することが好ましい。さらに、上記ガス吸収液には、NOの難溶性を改善し、測定感度を上げるために、水と混和する有機溶媒を添加してもよい。例えばジメチルホルムアミドなどの有機溶媒を、１０〜４０％加えることができる。
なお、このガス吸収液中の溶存酸素は、大気中で水に通常溶解している１〜２０ppm程度の濃度でを含まれておれば本発明の実施には十分であるが、オゾンやオキシド化合物等の酸素源を別途添加してもよい。
NO2を添加して測定する場合には、試料ガスに対し、試料ガス中のNO2濃度が２０容量ppb以上、好ましくは２０〜３００容量ppbの範囲で一定濃度となるように外部からNO2を添加することが出来る。特に２００容量ppb以上となるように添加することが好ましい。ただし、測定装置の設計やNO2の供給源に起因し、該濃度範囲にコントロールすることが困難な場合などには、NO測定の障害にならないことを限度として、３０００容量ppb程度まで添加共存することも許容される。
In the present invention, the NO fluorescent probe is dissolved in water and used as a gas absorbing solution. In this case, the concentration of the NO fluorescent probe can be appropriately set experimentally depending on the type of the NO fluorescent probe to be used and the NO concentration in the measurement sample. For example, in the case of DAF-2, the concentration is usually 0. It is preferably 1 to 50 μM, particularly 1 to 10 μM. Moreover, as this gas absorption liquid, since fluorescein and fluorescein derivatives such as DAF-2 emit fluorescence at pH 5 or higher, an aqueous solution of pH 5 or higher can be used. In order to improve the reaction of the NO fluorescent probe, the pH is preferably 7 or more, particularly preferably 10 or more. Gas absorption liquids include phosphate buffer, borate buffer, borax buffer, wide-area buffer for ultraviolet spectrum measurement (The Chemical Society of Japan, "Chemical Handbook Basics II", revised 3rd edition, 355, 1984), It is preferable to adjust to the suitable pH using an aqueous sodium hydroxide solution or the like. Furthermore, an organic solvent miscible with water may be added to the gas absorption liquid in order to improve the poor solubility of NO and increase the measurement sensitivity. For example, an organic solvent such as dimethylformamide can be added in an amount of 10 to 40%.
It should be noted that the dissolved oxygen in the gas absorption liquid is sufficient for the practice of the present invention as long as it is contained at a concentration of about 1 to 20 ppm that is normally dissolved in water in the atmosphere. An oxygen source such as may be added separately.
When measuring by adding NO 2 , the NO 2 concentration in the sample gas is 20 volume ppb or more, preferably from the outside so that the NO 2 concentration is constant within the range of 20 to 300 volume ppb. Can be added. In particular, it is preferable to add so that it becomes 200 capacity ppb or more. However, when it is difficult to control the concentration range due to the design of the measurement device or the supply source of NO 2 , up to 3000 capacities ppb is added and coexists, so long as it does not hinder NO measurement. It is also acceptable.
本発明において、測定対象ガスとガス吸収液との接触は、ガス透過膜を介して行う。このガス透過膜は、疎水性で、多孔性のポリオレフィン樹脂やフッ素樹脂等を用いることができる。ポリオレフィン樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ１‐ブテン、ポリ４‐メチル‐１‐ペンテン樹脂などであり、またフッ素樹脂としては、ポリテトラフルルエチレン、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン・パーフルオロ（ アルキルビニルエーテル） 共重合体、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン及びフッ化ビニリデン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体などが好適である。 In the present invention, the measurement object gas and the gas absorbing liquid are contacted via a gas permeable membrane. The gas permeable membrane can be made of a hydrophobic, porous polyolefin resin, fluororesin, or the like. Examples of polyolefin resins include polyethylene, polypropylene, poly-1-butene, and poly-4-methyl-1-pentene resins. Examples of fluororesins include polytetrafluoroethylene, tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer, tetra Fluoroethylene / perfluoro (alkyl vinyl ether) copolymers, tetrafluoroethylene / ethylene copolymers, polychlorotrifluoroethylene, polyvinylidene fluoride, vinylidene fluoride / hexafluoropropylene copolymers, and the like are suitable.
この測定対象ガスとガス吸収液との接触には、高い効率でガスを捕集できる本発明者が開発したハニカム構造のマイクロチャネルスクラバー（特許文献３及び非特許文献１参照）を用いることが好ましい。 For the contact between the gas to be measured and the gas absorbing liquid, it is preferable to use a microchannel scrubber having a honeycomb structure developed by the present inventor (see Patent Document 3 and Non-Patent Document 1) that can collect gas with high efficiency. .
本発明における蛍光量の測定は、一般に市販されている小型の蛍光検知器を用いることができる。また、一般に市販されているLEDランプを光源とし、小型のフォトマルチプライアーモジュールと組み合わせて蛍光検出器としてもよい。 In the present invention, the fluorescence amount can be measured using a small fluorescent detector that is generally commercially available. Further, a commercially available LED lamp may be used as a light source, and a fluorescence detector may be combined with a small photomultiplier module.
次に本発明の測定装置について、一実施態様を示した図１〜３に基づいて説明する。
図１は、測定装置の構成とその流路を示す概略図である。
Next, the measuring apparatus of the present invention will be described with reference to FIGS.
FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the measuring apparatus and its flow path.
この測定装置は、（１）一酸化窒素を含む試料ガスが流れるガス流路１と、（２）該ガス流路１と境界面のガス透過膜３を介して接触するように配置されたNO蛍光プローブを含むガス吸収液が流れるガス吸収液流路２、を設けたガス捕集器４と、（３）該ガス捕集器４のガス吸収液出口側流路に蛍光検出器５が設けられている。 This measuring apparatus includes (1) a gas flow path 1 through which a sample gas containing nitric oxide flows, and (2) NO disposed so as to be in contact with the gas flow path 1 through a gas permeable membrane 3 on the boundary surface. A gas collector 4 provided with a gas absorbing liquid flow path 2 through which a gas absorbing liquid containing a fluorescent probe flows, and (3) a fluorescence detector 5 provided in the gas absorbing liquid outlet side flow path of the gas collector 4 It has been.
そして、この装置を用いる測定においては、NO蛍光プローブを含むガス吸収液は貯蔵タンク６からポンプ７によりガス捕集器４に供給され、ガス捕集器４中のガス吸収液流路２を通り、ガス透過膜３を介してNOを取り込む。NOを取り込んだガス吸収液は、蛍光検知器５へ送られ、蛍光量が測定されて、排出される。一方、一酸化窒素を含む試料ガスは、図示していない試料ガス供給器より、測定試料流入路１１を通ってガス流入口８から供給され、ガス流路１を通り、ガス透過膜３を介してガス吸収液と接触した後、ガス排出口９から排出される。試料ガスに二酸化窒素を添加する場合には、二酸化窒素を含むガスを、図示しないガス供給器（本図面では前述の試料ガス供給器とは別のものを想定）より添加ガス流入路１２を通ってマスフローコントローラー１０に供給し、マスフローコントローラー１０で流量を調節して一酸化窒素を含む試料ガス中の二酸化窒素濃度が一定となるように供給される。二酸化窒素を含むガスのガス供給器としてはNO2の標準ガスボンベの他、恒温に保持するとチューブ内の液化ガスの浸透拡散する量が一定となるパーミエーションチューブなどを使用できる。 In the measurement using this apparatus, the gas absorbing liquid containing the NO fluorescent probe is supplied from the storage tank 6 to the gas collector 4 by the pump 7 and passes through the gas absorbing liquid channel 2 in the gas collector 4. Then, NO is taken in through the gas permeable membrane 3. The gas absorbing liquid that has taken in NO is sent to the fluorescence detector 5 where the amount of fluorescence is measured and discharged. On the other hand, a sample gas containing nitric oxide is supplied from a sample gas supply unit (not shown) through the measurement sample inflow passage 11 from the gas inlet 8, passes through the gas passage 1, and passes through the gas permeable membrane 3. Then, after coming into contact with the gas absorbing liquid, the gas is discharged from the gas outlet 9. When adding nitrogen dioxide to the sample gas, the gas containing nitrogen dioxide is passed through the additive gas inflow passage 12 from a gas supply device (not shown in the drawing, which is different from the above-mentioned sample gas supply device). To the mass flow controller 10, and the flow rate is adjusted by the mass flow controller 10 so that the nitrogen dioxide concentration in the sample gas containing nitric oxide becomes constant. As a gas supply device for the gas containing nitrogen dioxide, in addition to a standard gas cylinder of NO 2 , a permeation tube in which the amount of liquefied gas permeating and diffusing in the tube becomes constant when held at a constant temperature can be used.
図２は、ガス捕集器の一例としてマイクロチャネルスクラバーを示した概略図である。図２に示すように、基板１３に、深さが２０〜２００μm、幅が１００〜１０００μmのマイクロチャネル１４（ガス吸収液流路２の一態様）を形成し、厚さが３０μm以下のガス透過膜３を基板１３に固着してガス吸収液流路が形成されている。なお、マイクロチャネル１４はガス流路とガス透過膜を介して接するガス吸収液流路の面積が吸収液流路部全体の面積の２０％以上となるように形成されている。マイクロチャネル１４はガス吸収液が一様に流れるものであれば直線状の他どのような構造でもよいが、ガス透過膜を介して接するガス吸収液流路の面積を大きくするために蛇行もしくは折曲させたり、整流のための島を設けてガス吸収液流路を分岐することが好ましく、特にハニカム構造のマイクロチャネルであることが好ましい。このマイクロチャネルスクラバー上に、ガス流路を設けたブロックを固着する（なお図１は図２と上下逆に描かれている）ことにより、マイクロチャネルスクラバーで試料ガス中のNOを吸収することができる。なお、基板１３の材質は、特許文献３の記載などを参照して適宜に選択できる。好適な材質の一例として、ポリジメチルシロキサンがあげられる。 FIG. 2 is a schematic view showing a microchannel scrubber as an example of a gas collector. As shown in FIG. 2, the microchannel 14 (one aspect of the gas absorption liquid flow path 2) having a depth of 20 to 200 μm and a width of 100 to 1000 μm is formed on the substrate 13, and a gas permeation having a thickness of 30 μm or less is formed. The film 3 is fixed to the substrate 13 to form a gas absorption liquid channel. Note that the microchannel 14 is formed so that the area of the gas absorption liquid flow path contacting the gas flow path through the gas permeable membrane is 20% or more of the total area of the absorption liquid flow path section. The microchannel 14 may be of any other structure as long as the gas absorption liquid flows uniformly. However, the microchannel 14 is meandered or folded in order to increase the area of the gas absorption liquid flow path in contact with the gas absorption film. It is preferable to bend or provide an island for rectification to branch the gas absorption liquid flow path, and it is particularly preferable to be a honeycomb-structured microchannel. By fixing a block provided with a gas flow path on this microchannel scrubber (note that FIG. 1 is drawn upside down from FIG. 2), the microchannel scrubber can absorb NO in the sample gas. it can. In addition, the material of the board | substrate 13 can be suitably selected with reference to the description of patent document 3, etc. An example of a suitable material is polydimethylsiloxane.
図３にマイクロチャネルスクラバーの構造として特に好ましいハニカム構造を示す。このようなハニカム構造のマイクロチャネルスクラバーをガス捕集器として用いる場合は、前記ガス吸収液の流量は、５〜２００μL/min、ガスの流量は、１００〜４００mL/minとすることが好ましい。 FIG. 3 shows a particularly preferable honeycomb structure as the structure of the microchannel scrubber. When such a microchannel scrubber having a honeycomb structure is used as a gas collector, the flow rate of the gas absorbing liquid is preferably 5 to 200 μL / min, and the gas flow rate is preferably 100 to 400 mL / min.
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[実施例１] ガス吸収液の組成検討（pH）
サクションフィルターを用いたバブリング法によりガス吸収液に試料NOガスを通気した後、ガス吸収液の蛍光強度を測定して、本発明のガス吸収液の組成（pH）を検討した。
[Example 1] Compositional examination of gas absorption liquid (pH)
After a sample NO gas was passed through the gas absorbing solution by a bubbling method using a suction filter, the fluorescence intensity of the gas absorbing solution was measured to examine the composition (pH) of the gas absorbing solution of the present invention.
ガス吸収液は、２μMのDAF-2を含む１０ｍM紫外スペクトル測定用広域バッファー（pH７〜１２、日本化学会編、「化学便覧 基礎編II」、改訂３版、３５５、昭和５９年）を用いた。試料NOガスとしてNO標準ガスを使用し、マスフローコントローラーによって１容量ppmに流量調整したガスを各ガス吸収液１５mLに対して１０分間バブリングした。各pHのガス吸収液それぞれについて、バブリング前及びバブリング終了後５分後に蛍光分光光度計（島津製作所 ＲＦ−５３００ＰＣ）を用い、励起波長４９５nm、蛍光波長５１５nmで蛍光強度を測定し、バブリング終了後５分後の蛍光強度からバブリング前の蛍光強度を差し引いて蛍光強度上昇量を求めた。得られた蛍光強度上昇量は、pH７のガス吸収液における蛍光強度上昇量を１とする相対値で示した。 The gas absorption solution used was a 10 mM UV spectrum wide-area buffer containing 2 μM DAF-2 (pH 7-12, edited by the Chemical Society of Japan, “Basic Guide to Chemistry II”, revised 3rd edition, 355, 1984). . A NO standard gas was used as the sample NO gas, and a gas whose flow rate was adjusted to 1 ppm by mass with a mass flow controller was bubbled for 10 minutes against 15 mL of each gas absorbent. For each gas absorbing solution at each pH, fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 495 nm and a fluorescence wavelength of 515 nm using a fluorescence spectrophotometer (Shimadzu RF-5300PC) before bubbling and 5 minutes after bubbling was completed. The amount of increase in fluorescence intensity was determined by subtracting the fluorescence intensity before bubbling from the fluorescence intensity after minutes. The amount of increase in fluorescence intensity obtained was shown as a relative value where the amount of increase in fluorescence intensity in the gas absorption liquid at pH 7 was 1.
測定結果を図４に示した。各pHにおける相対蛍光強度上昇量を比較すると、pH７〜９の間でほぼ一定の値を示した後、pH１０以上で顕著な増大が観察された。以上より、DAF-2をNO蛍光プローブとして使用する場合、ガス吸収液のpHはpH１０以上が特に好適であることがわかった。 The measurement results are shown in FIG. When the amount of increase in relative fluorescence intensity at each pH was compared, a remarkable increase was observed at pH 10 or higher after showing a substantially constant value between pH 7 and 9. From the above, it was found that when DAF-2 is used as the NO fluorescent probe, the pH of the gas absorbing solution is particularly preferably pH 10 or higher.
[実施例２] 本発明の方法及び装置によるNOの測定
ガス捕集器として、ガス吸収液流路の深さが７０μm、幅が２００μmであり、ガス透過膜を介してガス流路と接触しているガス吸収液流路の面積が吸収液流路部全体の３０％以上であるハニカム構造のマイクロチャネルスクラバーを使用した。ガス吸収液は、１０μMのDAF-2を含む０.０１M ＮａＯＨ水溶液（pH１１．７）を使用した。試料NOガスは、NO標準ガスをマスフローコントローラーによって流量調整し、NO及びNO2を含まない空気でその希釈率を変えることにより５０〜２５０容量ppbのNO濃度に調整して作製した。マイクロチャンネルスクラバーへの試料NOガスの供給は２００mL/minで行った。ガス吸収液はポンプで流量を１０ μL/minに調整し、マイクロチャネルスクラバーに導入した。DAF-2と反応して生成するDAF-2Tの蛍光強度は蛍光検出器にて測定した。蛍光検出器としては、光源として４６０nm LED（２０mA）を用い、小型のフォトマルチプライアーモジュールを光検出器として採用した。光検出器には５２０nmのカットフィルターを装着して励起光の影響を防止して測定した。試料NOガスは従来法（化学発光法）による装置で、常時同時モニターした。
[Example 2] Measurement of NO by the method and apparatus of the present invention As the gas collector, the depth of the gas absorption liquid channel is 70 µm and the width is 200 µm, and it contacts the gas channel via the gas permeable membrane. A microchannel scrubber having a honeycomb structure in which the area of the gas absorption liquid flow path is 30% or more of the entire absorption liquid flow path portion was used. As the gas absorbing solution, 0.01 M NaOH aqueous solution (pH 11.7) containing 10 μM DAF-2 was used. The sample NO gas was prepared by adjusting the flow rate of NO standard gas using a mass flow controller and adjusting the NO concentration to 50 to 250 ppb by changing the dilution rate with air containing no NO and NO 2 . Sample NO gas was supplied to the microchannel scrubber at 200 mL / min. The gas absorption liquid was adjusted to a flow rate of 10 μL / min with a pump and introduced into a microchannel scrubber. The fluorescence intensity of DAF-2T produced by reaction with DAF-2 was measured with a fluorescence detector. As the fluorescence detector, a 460 nm LED (20 mA) was used as the light source, and a small photomultiplier module was adopted as the photodetector. The light detector was equipped with a 520 nm cut filter to prevent the influence of excitation light. The sample NO gas was always monitored simultaneously with an apparatus based on the conventional method (chemiluminescence method).
測定結果を図５に示した。図５上段は、本発明の装置での測定結果であり、図５下段は化学発光法（CL）装置で同時モニターした結果である。上段図の応答と下段図の応答は一致しており、本発明の装置でNOガスの測定ができることが確認された。さらに下段の従来法により求められたNO濃度をＸ、上段の本発明での応答強度をＹとしてプロットすると、図６に示すように相関係数Ｒ=０.９９９３の直線が得られた。これにより本発明の方法では、NO濃度に依存した応答が得られることが確認された。 The measurement results are shown in FIG. The upper part of FIG. 5 shows the measurement results with the apparatus of the present invention, and the lower part of FIG. 5 shows the results of simultaneous monitoring with a chemiluminescence (CL) apparatus. The response in the upper diagram and the response in the lower diagram are in agreement, and it was confirmed that NO gas can be measured with the apparatus of the present invention. Further, when the NO concentration obtained by the conventional method in the lower stage is plotted as X, and the response intensity in the present invention in the upper stage is plotted as Y, a straight line having a correlation coefficient R = 0.9993 is obtained as shown in FIG. Thus, it was confirmed that the method of the present invention can obtain a response depending on the NO concentration.
[実施例３] 呼気試料中のNOの測定
ガス吸収液として、１０μMの DAF-2を含む０.０１M ＮａＯＨを用い、これを１０μL/minの流量で、前記のマイクロチャネルスクラバーへ導入した。一方、健常者の呼気をマイラーバッグに採取し、バッグから９００秒、１５００秒、２１００秒のタイミングで吸引して２００mL/minで前記のマイクロチャネルスクラバーへ導入し、測定を行った。
Example 3 Measurement of NO in Breath Sample Using 0.01 M NaOH containing 10 μM DAF-2 as a gas absorbing solution, this was introduced into the microchannel scrubber at a flow rate of 10 μL / min. On the other hand, the breath of a healthy person was collected in a mylar bag, sucked from the bag at a timing of 900 seconds, 1500 seconds, and 2100 seconds and introduced into the microchannel scrubber at 200 mL / min for measurement.
測定結果を図７に示した。呼気吸引のタイミングと一致した応答が確認された。以上より本発明の方法及び装置は、呼気中のNO検出が可能であることが確認できた。 The measurement results are shown in FIG. A response consistent with the timing of exhalation was confirmed. From the above, it was confirmed that the method and apparatus of the present invention can detect NO during expiration.
[実施例４] ガス吸収液の組成検討（有機溶媒）
サクションフィルターを用いたバブリング法によりガス吸収液に試料ガスを通気した後、ガス吸収液の蛍光強度を測定して、本発明のガス吸収液の組成（有機溶媒）を検討した。
[Example 4] Composition examination of gas absorption liquid (organic solvent)
The sample gas was passed through the gas absorption liquid by a bubbling method using a suction filter, and then the fluorescence intensity of the gas absorption liquid was measured to examine the composition (organic solvent) of the gas absorption liquid of the present invention.
ガス吸収液は、２μMのDAF-2及び０〜６０%(v/v)のジメチルホルムアミド（DMF）を含む１０mM紫外スペクトル測定用広域バッファー（pH１１）を用いた。試験用のNOにはNO標準ガスを用い、マスフローコントローラーによって１容量ppmに流量調整したガスを各ガス吸収液１５mLに対して１０分間バブリングした。各ガス吸収液について、実施例１と同様にして蛍光強度上昇量を求めた。得られた蛍光強度上昇量は、DMF非添加（０%）のガス吸収液における蛍光強度上昇量を１とした相対値で示した。 As the gas absorbing solution, a 10 mM ultraviolet spectrum measurement wide-area buffer (pH 11) containing 2 μM DAF-2 and 0 to 60% (v / v) dimethylformamide (DMF) was used. NO standard gas was used as test NO, and a gas whose flow rate was adjusted to 1 ppm by mass with a mass flow controller was bubbled for 10 minutes against 15 mL of each gas absorbent. For each gas absorbent, the amount of increase in fluorescence intensity was determined in the same manner as in Example 1. The amount of increase in the fluorescence intensity obtained was shown as a relative value with the amount of increase in the fluorescence intensity in the gas absorption liquid without addition of DMF (0%) being 1.
測定結果を図８に示した。各DMF濃度のガス吸収液における相対蛍光強度上昇量を比較すると、DMF１０〜４０%の範囲の添加により、相対蛍光強度上昇量の顕著な増大が観察された。このとき、DMF１０〜４０%の範囲で非添加に対して５倍以上の増大であった。以上より、DAF-2をNO蛍光プローブとして使用する場合、ガス吸収液中に１０〜４０%DMFを共存させることが好適であることがわかった。 The measurement results are shown in FIG. Comparing the amount of increase in relative fluorescence intensity in the gas absorption liquids of each DMF concentration, a significant increase in the amount of increase in relative fluorescence intensity was observed with the addition of DMF in the range of 10 to 40%. At this time, in the range of 10 to 40% DMF, the increase was 5 times or more with respect to the non-addition. From the above, it was found that when DAF-2 is used as a NO fluorescent probe, it is preferable that 10 to 40% DMF coexist in the gas absorbing solution.
[実施例５] NO2共存の効果確認（NO濃度一定）
種々の濃度のNO2を添加してNOの測定を行った。NO2の標準ガスとNOの標準ガスを各々マスフローコントローラーによってNO2が０〜３００容量ppb、NOが１００容量ppbとなるように調整し、２００mL/minでガス捕集器のマイクロチャネルスクラバーに供給した。ガス吸収液は、１０μM DAF-2 / ０．０１ M NaOHを用い、２０μL/minの流量でマイクロチャネルスクラバーに導入し、DAF-2と反応して生成するDAF-2Tの蛍光強度を蛍光検出器にて測定した。
[Example 5] Confirmation of NO 2 coexistence effect (constant NO concentration)
Various concentrations of NO 2 were added to measure NO. Adjust the standard gas of NO 2 and standard gas of NO with the mass flow controller so that NO 2 is 0 to 300 volume ppb and NO is 100 volume ppb respectively, and supply to the microchannel scrubber of the gas collector at 200 mL / min did. The gas absorption solution is 10 μM DAF-2 / 0.01 M NaOH, introduced into a microchannel scrubber at a flow rate of 20 μL / min, and the fluorescence intensity of DAF-2T produced by reacting with DAF-2 is detected by a fluorescence detector. Measured with
この結果を図９に示した。NO2濃度の上昇と共に１００容量ppb のNOに対する応答が大きくなり、２００容量ppb以上でほぼプラトーとなった。このとき、NO2を添加しなかった時と比べ約１０倍の応答が得られており、試料ガスにNO2を添加すると、より高感度にNOが測定できることがわかった。 The results are shown in FIG. As the NO 2 concentration increased, the response to 100 capacity ppb NO increased, and it almost reached a plateau above 200 capacity ppb. At this time, a response about 10 times that obtained when NO 2 was not added was obtained, and it was found that NO can be measured with higher sensitivity when NO 2 is added to the sample gas.
[実施例６] NO2共存の効果確認（NO2濃度一定）
２００容量ppbのNO2を添加してNOの測定を行った。 NO2の標準ガスとNOの標準ガスを各々マスフローコントローラーによって流量調整し、その希釈率を変えることによって、測定開始から１２５min の間はNO2が２００容量ppb（１２５min以降はNO2を０容量ppbとした）、NOが順に１０容量ppb（２回測定）、２０容量ppb（２回測定）、４０容量ppb（２回測定）、６０容量ppb（２回測定），８０容量ppb（２回測定）、１００容量ppb（NO2が２００容量ppbの時に４回測定し、１２５min以降にNO2が０容量ppb時に４回測定）となるよう調製し、２００mL/minでガス捕集器のマイクロチャネルスクラバーに供給した。ガス吸収液は、１０μM DAF-2 / ０．０１ M NaOHを用い、２０ μL/minの流量でマイクロチャネルスクラバーに導入した。試験ガスは従来法（化学発光法）による装置で、常時同時モニターした。
[Example 6] Confirmation of effect of NO 2 coexistence (constant NO 2 concentration)
NO was measured by adding 200 ppb of NO 2 . NO 2 standard gas and NO standard gas are respectively adjusted by the mass flow controller and the dilution ratio is changed to change NO 2 to 200 capacity ppb for 125 min from the start of measurement (NO 2 ppb for NO 2 after 125 min). NO) in order 10 capacity ppb (2 times measurement), 20 capacity ppb (2 times measurement), 40 capacity ppb (2 times measurement), 60 capacity ppb (2 times measurement), 80 capacity ppb (2 times measurement) ), 100 capacity ppb (measured 4 times when NO 2 is 200 capacity ppb and measured 4 times when NO 2 is 0 capacity ppb after 125 min), and microchannel of gas collector at 200 mL / min The scrubber was fed. The gas absorption solution was introduced into the microchannel scrubber at a flow rate of 20 μL / min using 10 μM DAF-2 / 0.01 M NaOH. The test gas was continuously monitored by a conventional method (chemiluminescence method).
測定結果を図１０に示した。（ａ）図上段は本発明の方法及び装置による測定結果であり、下段は化学発光法（CL）装置で同時分析を行ったものである。（ｂ）は（ａ）の８０−１２０minと１２５−１６５minの測定結果を重ねて１００容量ppb の濃度のNO に対する応答を比較したものである。（ａ）においてNO2を添加しなかった場合には、１００容量ppb の濃度のNOに対する応答は僅かであるが、NO2を添加した場合には、１０容量ppb の濃度のNOに対しても十分な応答が得られている。（ｂ）において、NO2を添加しなかった場合には、１００容量ppb の濃度のNOに対する応答は約０．１５Vで僅かであるが、NO2を添加した場合には１．５V以上の応答があり、NO2を添加することで１０倍以上の応答が得られることが分かる。このようにNO2を添加することによって、より高感度にNOが測定できることがわかった。 The measurement results are shown in FIG. (A) The upper part of the figure shows the results of measurement by the method and apparatus of the present invention, and the lower part shows the result of simultaneous analysis using a chemiluminescence (CL) apparatus. (B) is a comparison of the response to NO at a concentration of 100 ppb by overlapping the measurement results of 80-120 min and 125-165 min of (a). When NO 2 is not added in (a), the response to NO at a concentration of 100 ppb is slight, but when NO 2 is added, it is also to NO at a concentration of 10 ppb. Sufficient response is obtained. In (b), when NO 2 is not added, the response to NO at a concentration of 100 ppb is slight at about 0.15V, but when NO 2 is added, the response is 1.5V or more. It can be seen that a response of 10 times or more can be obtained by adding NO 2 . Thus, it was found that NO can be measured with higher sensitivity by adding NO 2 .
[実施例７] 呼気試料中のNOの測定（NO2共存下）
２００容量ppbのNO2を添加して呼気サンプルのNO測定を行った。ガス吸収液として、１０μM DAF-2 / ０.０１M NaOHを用い、これを３０μL/minの流量で、前記のマイクロチャネルスクラバーへ導入した。一方、健常者３人の呼気（ＢｒｅａｔｈＡ、Ｂ及びＣ）をそれぞれマイラーバッグに採取し、バッグから吸引した呼気にNO2濃度が２００容量ppbとなるようにNO2の標準ガスをマスフローコントローラーによって調整して添加した。NO2を添加した呼気サンプルは２００mL/minで前記のマイクロチャネルスクラバーへ導入し、測定を行った。
[Example 7] Measurement of NO in breath sample (in the presence of NO 2 )
The NO sample of the breath sample was measured by adding 200 ppb of NO 2 . 10 μM DAF-2 / 0.01 M NaOH was used as a gas absorbing solution, and this was introduced into the microchannel scrubber at a flow rate of 30 μL / min. Meanwhile adjustment, healthy subjects three exhalation (Breatha, B and C) were collected into Mylar bags respectively, the mass flow controllers standard gas NO 2 as NO 2 concentration aspirated breath from the bag is 200 volume ppb And added. The exhaled breath sample to which NO 2 was added was introduced into the microchannel scrubber at 200 mL / min and measured.
測定結果を図１１に示した。図中、中央のラインが本発明の方法及び装置によるNOの測定結果であり、上のラインは化学発光法（CL）装置でNO2の同時分析を行った結果であり、下のラインは化学発光法（CL）装置でNOの同時分析を行った結果である。本発明の方法及び装置で測定した健常者３人の呼気（ＢｒｅａｔｈＡ、Ｂ及びＣ）は、化学発光法（CL）装置で測定した値と相関のある応答を示し、呼気中のNO濃度に依存した応答が得られることが確認された。 The measurement results are shown in FIG. In the figure, the center line is the NO measurement result by the method and apparatus of the present invention, the upper line is the result of simultaneous analysis of NO 2 with a chemiluminescence (CL) apparatus, and the lower line is the chemical result. It is the result of having performed simultaneous analysis of NO with a luminescence method (CL) device. Exhaled breath (Breath A, B and C) of three healthy subjects measured with the method and apparatus of the present invention shows a response correlated with the value measured with a chemiluminescence (CL) apparatus and depends on the NO concentration in the expired air It was confirmed that the obtained response was obtained.
本発明の測定装置は、従来の化学発光装置に比べ、重量、体積が１／１０以下であり、ヒト呼気のNOにも応答する。よってポータブルで持ち運び可能なNOガス測定装置として使用でき、環境測定や呼吸器疾患の評価に使用することができる。 The measuring device of the present invention is 1/10 or less in weight and volume as compared with conventional chemiluminescent devices, and responds to NO of human breath. Therefore, it can be used as a portable and portable NO gas measuring device, and can be used for environmental measurement and evaluation of respiratory diseases.
１．ガス流路
２．ガス吸収液流路
３．ガス透過膜
４．ガス捕集器
５．蛍光検出器
６．貯蔵タンク
７．ポンプ
８．ガス流入口
９．ガス排出口
１０．マスフローコントローラー
１１．測定試料流入路
１２．添加ガス流入路
１３．基板
1. 1. Gas flow path 2. Gas absorption liquid flow path 3. Gas permeable membrane 4. Gas collector Fluorescence detector 6. 6. Storage tank Pump 8. 8. Gas inlet Gas outlet 10. Mass flow controller 11. Measurement sample inflow path 12. Additive gas inflow path 13. substrate
Claims (10)
（１）一端にガス流入口、他端にガス排出口を設けた一酸化窒素を含む試料ガスが流れるガス流路、
（２）一端にガス吸収液入口、他端にガス吸収液出口を設け、該ガス流路と境界面のガス透過膜を介して接触するように配置されたＮＯ蛍光プローブを含むガス吸収液が流れるガス吸収液流路、を有するガス捕集器、
（３）該ガス捕集器のガス吸収液出口側流路に接続された蛍光検出器 An apparatus for measuring nitric oxide comprising the following (1) to (3).
(1) a gas flow path through which a sample gas containing nitric oxide is provided with a gas inlet at one end and a gas outlet at the other end ;
(2) A gas absorbing liquid including an NO fluorescent probe disposed so as to be in contact with the gas flow path through a gas permeable film on the boundary surface, provided with a gas absorbing liquid inlet at one end and a gas absorbing liquid outlet at the other end. A gas collector having a flowing gas absorption liquid channel,
(3) Fluorescence detector connected to the gas absorption liquid outlet side channel of the gas collector
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