JP5461581B2 - 自己免疫疾患を診断するための合成ペプチド、方法およびキット - Google Patents
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Description
被験者から生体試料を得ること、および
合成ペプチドと自己抗体が反応して、それにより免疫反応で複合体を形成するように、本発明の1つの好ましい例に記載された手順に従って製造された合成ペプチドと生体試料を混合することにより生体試料中の自己抗体を検出すること、
からなる方法を提供する。
本発明は、HSPの発生の指標としての、自己抗原に由来する特定のマーカーまたはペプチドを提供する。そのようなペプチドはHSPの検出、診断または確定に有用である。
に限定されない、本発明の診断を受けることになっている任意の動物(例えば哺乳動物)を指す。一般に、用語「患者」および「被験者」は、ヒトの被験者に関して本明細書では互換的に使用される。
アメリカ合衆国カリフォルニア州所在)を用いて合成された。合成ペプチドは、P−1(配列番号1)、P−2(配列番号2)、P−3(配列番号3)、P−4(配列番号4)、P−5(配列番号5)、P−6(配列番号6)、P−7(配列番号7)、P−8(配列番号8)、P−9(配列番号9)、P−10(配列番号10)、P−11(配列番号11)、P−12(配列番号12)、P−13(配列番号13)、P−14(配列番号14)およびP−15(配列番号15)と名付けられ、これらは1つの好ましい例で表1に詳細に記載されている。
び(h)C、M。
合成β2−GP1ペプチドは、被験者のHSPに特異的な自己抗体を検出するかまたは該自己抗体に結合するツールとして使用された。従って、本発明は、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(Henoch-Schoenlein purpura)に罹患しているかその疑いがある被験者を検
出または診断する方法であって、被験者から生体試料を得ること、および上述の通りに調製した合成β2GP1ペプチドと自己抗体とが反応して、免疫反応において複合体を形成するように、生体試料を合成ペプチドと混合することにより生体試料中の自己抗体を検出すること、からなる方法を提供する。好ましくは、合成β2GP1ペプチドは、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号11および配列番号12から成るグループから選択された配列と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、合成β2−GP1ペプチドは、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号11および配列番号12から成るグループから選択された配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 98%、99%または100%同一のアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、合成β2−GP1ペプチドは、配列番号3と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する。同一性のパーセンテージは、特定長の標的ポリペプチド配列と比較された場合の、あるポリペプチドの中断されない直線配列における同一のアミノ酸残基の数の測定値である。本明細書に使用する場合、配列の「同一性」とは、2つの別個の配列中の比較されたアミノ酸残基が同一であることを意味する。したがって100%の同一性とは、例えば、2つの異なる分子中の20個の連続するアミノ酸残基を比較すると、その2つの異なる分子中の20個の残基がいずれも同一であることを意味する。御本明細書で使用する場合、「生体試料」には、皮膚の生検サンプル、全血試料、血清試料、血漿試料、尿サンプル、粘液サンプル、およびそれらの精製された形態または濾過された形態が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
HSP診断のためのキットを提供する。キットに含まれる構成要素は以下の通りである:容器;生体試料中の自己抗体を検出する試薬;容器に結合され、生体試料中の自己抗体を検出するためのペプチドの使用方法を示す説明手段。試薬は、本発明の1つの例に記載された手順に従って合成された少なくとも1つのβ2−GPI由来ペプチドを含み、ペプチドは配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号11および配列番号12から成るグループから選択された配列と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を有する。説明手段は、パンフレット、テープ、CD、VCDまたはDVDの形式であってもよい。キットはさらに、健康な被験者における配列番号3、5、7、11および12のいずれかと少なくとも80%同一なアミノ酸配列を有する合成β2−GPIペプチドと複合体を形成する自己抗体の正常レベルを示す陰性対照をさらに備えてもよい。
実施例
以下の実施例を、本発明の特定の態様を説明し、かつ当業者が本発明を実施するのを支援するために提供する。これらの実施例は本発明の範囲をいかようにも限定するものではない。
材料および方法
患者 本研究では、アメリカリューマチ学会(American College of Rheumatology, ACR)で定義された基準(Mills JA et al., Arthritis Rheum 1990 33:1114-1121)に従って急性HSPに罹患していると診断された25人の子供を国立台湾大学病院(台湾、台北市)に登録し、年齢および性別が一致する23人の健康な子供を対照として登録した。両方の群から血清試料を採取し、退行時期にある(25人の患者のうち)15人の患者からは血清試料をさらに集めた。
ン(CL)エタノール溶液でコーティングし、空気乾燥させた。4℃で一晩インキュベートした後、プレートを10%ウシ血清のリン酸緩衝液(PBS、pH7.4)でブロックした。その後、血漿試料(IgGおよびIgMの場合1:100、IgAの場合1:50)および10%ウシ血清/PBS中の患者からのIgA分画(示された濃度)を二連にしてウェルに分配し、室温で1.5時間インキュベートした。プールした正常なヒトのIgA(Jackson ImmunoResearch、アメリカ合衆国ペンシルベニア州West Grove所在)を同じ濃度で陰性対照として使用した。TBSで洗浄した後、結合したヒトIgG/A/Mを、HRP共役ヤギ抗ヒトIgG/A/M(BioSource International、アメリカ合衆国カリ
フォルニア州Camarillo所在)およびペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジ
ン(Kirkegaard & Perry Laboratories、アメリカ合衆国メリーランド州Gaithersburg)
により検出した。結果を、Thermomaxプレートリーダ(Molecular Devices社、アメリカ合衆国カリフォルニア州Sunnyvale所在)を使用して、650nmのバックグラウンドに対
して450nmの波長で読み取った。
ト(Nunc(商標)、デンマーク)に接種した。細胞増殖が3−4日後にコンフルエントに達すると、細胞を0.2% グルタルアルデヒドのPBS溶液で室温で10分間固定し、1% ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS溶液で37℃で1時間ブロックした。PBSで洗浄した後、1% BSA/PBSに希釈(IgG/IgM検出の場合1:100、IgA検出の場合1:50)した血漿試料を、HRP共役ヤギ抗ヒトIgG/A/M(BioSource International、アメリカ合衆国カリフォルニア州Camarillo所在)およびペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories、ア
メリカ合衆国メリーランド州Gaithersburg)により検出した。結果を、Thermomaxプレー
トリーダ(Molecular Devices社、アメリカ合衆国カリフォルニア州Sunnyvale所在)を使用して、650nmのバックグラウンドに対して450nmの波長で読み取った。
衝液(TBS, 0.05M Tris-HClおよびNaCl, pH7.5)に溶かしたヒトβ2GPI(Haematologic Technologies, アメリカ合衆国バーモント州)または他の無関係のタンパク質(プロ
トロンビンおよびオボアルブミン)でコーティングする。4℃で一晩インキュベートした後、プレートを0.3%ゼラチンを含むTBSでブロックする。その後、血漿試料(IgGおよびIgMの場合1:100、IgAの場合1:50)およびTBS/0.1%ゼラチン中の患者からのIgA分画(示された濃度)を二連にしてウェルに分配し、室温で1.5時間インキュベートする。プールした正常なヒトのIgA(Jackson ImmunoResearch、アメリカ合衆国ペンシルベニア州West Grove所在)を同じ濃度で陰性対照として使用した。TBSで洗浄した後、結合したヒトIgG/A/Mを、HRP共役ヤギ抗ヒトIgG/A/M(BioSource International、アメリカ合衆国カリフォルニア州Camarillo所在)およびペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories、アメリカ合衆国メリーランド州Gaithersburg)により検出した。結果を、The rmomaxプレートリーダ(Molecular Devices社、アメリカ合衆国カリフォルニア州Sunnyvale所在)を使用して、650nmのバックグラウンドに対して450nmの波長で読み取
った。
7つの血漿サンプルから分離した。
β2−グリコプロテイン−1のその自己抗体への結合エピトープの位置を決定するために、β2−グリコプロテイン−1を15個のペプチドの断片に無作為に分割した。これは自動固相ペプチド合成装置(ABI433Aペプチド合成装置、Applied Biosystems Inc., Life Technologies Corp., Foster City,アメリカ合衆国カリフォルニア州所在)を使用して調製された。Nα−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学の標準手順を使用して、かかるペプチドを調製した。各ペプチドの一時配列を表1に示す。
.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含むアセトニトリル/水溶媒系である。220nmの波長で検出を行い、ピークを記録および定量化した。精製の各実行からの溶離液を収集し、同一成分の分画を一つにプールし、次に、真空状態の凍結乾燥により回収した。各収集したペプチドの最終精製度を分析RP−HPLCにより決定した。また、95%以上の精製度が達成された。例えば配列番号11の合成ペプチドの精製度は95.23%と決定された。合成ペプチドは使用されるまで−20℃で冷凍保存された。
の濃度でTris緩衝液(TBS, 0.05M Tris-HClおよびNaCl, pH7.5)に溶かした1〜15のヒトβ2−GPIペプチドでコーティングした。4℃で一晩インキュベートした後、プレートを0.3%ゼラチンを含むTBSでブロックする。その後、血漿試料(IgAの場
合1:50)およびTBS/0.1%ゼラチン中の患者からのIgA分画(示された濃度)を二連にしてウェルに分配し、室温で1.5時間インキュベートする。プールした正常なヒトのIgA(Jackson ImmunoResearch、アメリカ合衆国ペンシルベニア州West Grove所在)を同じ濃度で陰性対照として使用した。TBSで洗浄した後、結合したヒトIgG/A/Mを、HRP共役ヤギ抗ヒトIgG/A/M(BioSource International、アメリ
カ合衆国カリフォルニア州Camarillo所在)およびペルオキシダーゼ基質であるテトラメ
チルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories、アメリカ合衆国メリーランド州Gaithersburg)により検出した。結果を、Thermomaxプレートリーダ(Molecular Devices社
、アメリカ合衆国カリフォルニア州Sunnyvale所在)を使用して、650nmのバックグ
ラウンドに対して450nmの波長で読み取った。
結果
β2−GPIは、急性HSPの発生の原因となる抗原である
本研究の発明者らは、急性HSPと診断された患者が、健常人のものより有意に高い量のIgA抗カルジオリピン(aCL)(図1)、IgA抗内皮細胞(IgA AECA)(図2)およびIgA抗β2−GPI抗体(図3)を示すと共に、IgA抗β2−GPI抗体とIgA aCLまたはIgA AECAとの間にも正の相関が見出されることを同定した(図4)。このことは、β2−GPIがHSP発生の抗原であり、したがってHSPに離間した患者を検出および診断するための有用なバイオマーカーとなり得ることを示唆している。
β2−GPIの結合エピトープの位置を決定するために、β2−GPIを15個のより小さいペプチド断片に無作為に切断し、上記手順に従って合成した。合成ペプチドをそれぞれP1〜P15と名づけ、各ぺプチドは配列番号1〜15で記載されるアミノ酸配列を有した。
本発明は、特異性抗原またはバイオマーカー(例えばβ2−GPI由来抗体)を使用してHSPの患者を早期に検出または診断するための新規かつ迅速な解決策を提供する。本
発明による合成ペプチド、方法およびキットは、医師が、履歴や、医師の経験または患者の症状の発達に基づいて医師がくだす判断のような主観的手段の代わりに、客観的手段すなわちマーカー(つまりβ2−GPI由来ペプチド)に基づくことにより、医師がHSP患者を容易に検出または診断することを可能にする。
Claims (7)
- 免疫反応において、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(Henoch-Schoenlein purpura)に罹患しているかその疑いがある被験者の生体試料中のIgA自己抗体と複合体を形成することが可能な合成ペプチドであって、配列番号11からなる合成ペプチド。
- ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(Henoch-Schoenlein purpura)に罹患しているかその疑いがある被験者を検出または診断することを補助する方法であって、
請求項1に記載の合成ペプチドとIgA自己抗体とが反応して、前記免疫反応において複合体を形成するように、前記被験者から得られた、全血試料、血清試料、血漿試料、およびそれらの精製された形態または濾過された形態から成るグループから選択される生体試料を請求項1に記載の合成ペプチドと混合することにより前記生体試料中のIgA自己抗体を検出すること、および
前記IgA自己抗体と請求項1に記載の前記合成ペプチドとの前記複合体の量を、健常人における免疫反応の結果である対照の量と比較することと、からなり、
前記対照の量と比較して、前記IgA自己抗体と請求項1に記載の前記合成ペプチドとの前記複合体の量が高いことは、前記被験者がヘノッホ・シェーンライン紫斑病に罹患していることを示す、方法。 - 配列番号3、配列番号5、配列番号7、および配列番号12から成るグループから選択された少なくとも1つの他の合成ペプチドと前記IgA自己抗体とが反応して、前記免疫反応において複合体を形成するように、該少なくとも1つの他の合成ペプチドと前記生体試料とを混合することにより、前記生体試料中の前記IgA自己抗体を検出すること、
前記IgA自己抗体と前記少なくとも1つの他の合成ペプチドとの前記複合体の量を、健常人における免疫反応の結果である対照の量と比較すること、をさらに含み、
前記対照の量と比較して、前記IgA自己抗体と前記少なくとも1つの他の合成ペプチドとの前記複合体の量が高いことは、前記被験者がヘノッホ・シェーンライン紫斑病に罹患していることを示す、請求項2に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の合成ペプチドが、配列番号3と同一である請求項3に記載の方法。
- 前記免疫反応はELISAである請求項2に記載の方法。
- ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(Henoch-Schoenlein purpura)に罹患しているかその疑いがある被験者を検出または診断するためのキットであって、
容器、
請求項1に記載の合成ペプチド、および
前記容器に結合され、被験者の前記生体試料中の前記IgA自己抗体を検出するための前記ペプチドの使用方法を示す説明手段、
を備え、前記生体試料は、全血試料、血清試料、血漿試料、およびそれらの精製された形態または濾過された形態から成るグループから選択される、キット。 - 配列番号3、配列番号5、配列番号7、および配列番号12から成るグループから選択された少なくとも1つの他の合成ペプチドをさらに備える請求項6に記載のキット。
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