JP5461460B2

JP5461460B2 - Amplification of HIV-1 sequences for detection of sequences associated with drug resistance mutations

Info

Publication number: JP5461460B2
Application number: JP2011043837A
Authority: JP
Inventors: ヤン，イエーズィン・ワイ; ブレンターノ，スティーブン・ティー; バボーラ，オディル; トラン，ナタリー; ヴェルネット，ギ
Original assignee: ジェン−プローブ・インコーポレーテッド; ビヨメリュー・ソシエテ・アノニム
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2020-09-01
Also published as: JP2011135891A

Description

発明の分野
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の診断的検出に関し、そしてより具体的には、核酸増幅、および増幅された配列、特にＨＩＶ−１薬剤耐性の発展に関連する配列の検出を用いて、ＨＩＶ−１核酸配列を検出するための組成物およびアッセイに関する。 The present invention relates to diagnostic detection of human immunodeficiency virus (HIV-1), and more specifically, nucleic acid amplification, and amplified sequences, particularly those related to the development of HIV-1 drug resistance. The present invention relates to compositions and assays for detecting HIV-1 nucleic acid sequences.

発明の背景
ＨＩＶ−１は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因病原体である。感染した個体が症状を明らかにする前であっても、感染の有効な治療を決定し、そして体液中の感染性ウイルスの伝播を避けるため、ＨＩＶ−１感染の早期検出が重要である。感染した組織または体液においてＨＩＶ−１核酸配列の存在を早期に検出すれば、他へのウイルスの伝播を予防するため、より早い治療および工程につなげることが可能である。早期診断に有効であるためには、ＨＩＶ−１核酸配列を検出する試薬および方法は、試験する試料中の、比較的少数のウイルスコピー（例えば血漿ｍｌあたり、数百コピー）を検出可能でなければならない。さらに、ＨＩＶ−１サブタイプおよび／またはウイルス薬剤耐性に関連する突然変異的変化などの、感染した個体に存在するＨＩＶ−１に関するさらなる情報を提供する診断法が、予後のために有用である。 BACKGROUND OF THE INVENTION HIV-1 is the causative agent of acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Even before an infected individual reveals symptoms, early detection of HIV-1 infection is important to determine an effective treatment for the infection and to avoid the transmission of infectious viruses in body fluids. Early detection of the presence of HIV-1 nucleic acid sequences in infected tissues or body fluids can lead to faster treatment and processes to prevent the spread of the virus to others. To be effective for early diagnosis, reagents and methods for detecting HIV-1 nucleic acid sequences must be able to detect relatively small numbers of viral copies (eg, hundreds of copies per ml of plasma) in the sample being tested. I must. In addition, diagnostic methods that provide additional information about HIV-1 present in infected individuals, such as mutational changes associated with HIV-1 subtypes and / or viral drug resistance, are useful for prognosis.

薬剤で治療され、そしてＨＩＶ−１増殖および症状の再燃を経験しているＨＩＶ−１患者において、薬剤耐性突然変異（１以上の核酸塩基の置換、欠失または挿入）が発見されてきている。表現型の変化を生じ、それによってウイルスが抗レトロウイルス薬剤に耐性になる、こうした突然変異は、ｇａｇ遺伝子で発見され、これはしばしば、プロテアーゼ切断部位に影響を与え、そしてプロテアーゼおよび逆転写酵素（ＲＴ）コード領域両方において、ｐｏｌ遺伝子で発見されている（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，１９９１，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４（６）：１０６６−１０７４；Ｒｉｃｈｍａｎら，１９９１，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４（６）：１０７５−１０８１；Ｓｃｈｉｎａｚｉら，１９９３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７（４）：８７５−８８１；Ｎａｊｅｒａら，１９９４，ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１０（１１）：１４７９−１４８８；Ｅａｓｔｍａｎら，１９９５，Ｊ．ＡＩＤＳＨｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．９（３）：２６４−２７３；Ｆｒｅｎｋｅｌら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（２）：３４２−３４７；Ｓｈｉｒａｓａｋａら，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２（６）：２３９８−２４０２；Ｌｅａｌら，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２６（６）：４７６−４８０；Ｃｌｅｌａｎｄら，１９９６，Ｊ．ＡＩＤＳＨｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．１２（１）：６−１８；Ｓｃｈｍｉｔら，１９９６，ＡＩＤＳ１０（９）：９９５−９９９；Ｖａｓｕｄｅｖｅｃｈａｒｉら，１９９６，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０（１１）：２５３５−２５４１；Ｗｉｎｓｌｏｗら，１９９６，ＡＩＤＳ１０（１１）：１２０５−１２０９；Ｆｏｎｔｅｎｏｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９０（１）：１−１０；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（９）：６３４８−６３５８；Ｉｖｅｓら，１９９７，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９（６）：７７１−７７９）。 Drug resistance mutations (one or more nucleobase substitutions, deletions or insertions) have been discovered in HIV-1 patients treated with drugs and experiencing HIV-1 proliferation and relapse of symptoms. Such mutations, which cause phenotypic changes and thereby make the virus resistant to antiretroviral drugs, are found in the gag gene, which often affects the protease cleavage site and protease and reverse transcriptase ( (RT) coding region has been found in the pol gene (Gingeras et al., 1991, J. Infect. Dis. 164 (6): 1066-1074; Richman et al., 1991, J. Infect. Dis. 164 (6). Schinazi et al., 1993, Antimicrob. Agents Chemother. 37 (4): 875-881; Najera et al., 1994, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10 (1 ): 1479-1488; Eastman et al., 1995, J. AIDS Hum. Retroviol. 9 (3): 264-273; Frenkel et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33 (2): 342-347; 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (6): 2398-2402; Leal et al., 1996, Eur. J. Clin.Invest. 26 (6): 476-480; Celland et al., 1996, J. AIDS. Retrovirol.12 (1): 6-18; Schmit et al., 1996, AIDS 10 (9): 995-999; Vasudevechari et al., 1996, Antimicrob. Agents Chemother.40 (11): 2535-2541; Winslow et al., 1996, AIDS 10 (11): 1205-1209; Fontenot et al., Virology 190 (1): 1-10; Cornissen et al., 1997, J. Virol. (9): 6348-6358; Ives et al., 1997, J. Antimicrob. Chemother. 39 (6): 771-779).

ＨＩＶ−１に感染した患者に存在するウイルス突然変異に関する情報は、臨床家が使用して、特定の抗レトロウイルス療法を患者で開始するかまたは持続するかどうかなど、適切な治療を決定することが可能である。さらに、治療中、ＨＩＶ−１の性質決定を可能にする、患者試料の試験を継続すれば、薬剤耐性ウイルスの出現を示すことが可能であり、それによって、臨床家が、療法をより有効なものに改変することが可能になる。薬剤耐性試験が臨床的に有用であることを示唆する証拠は、遡及的および前向き介入に基づく研究から得られる（Ｄｕｒａｎｔら，１９９９，Ｌａｎｃｅｔ３５３：２１９５−２１９９；Ｃｌｅｖｅｎｂｅｒｇｈら，１９９９，ＡｎｔｉｖｉｒａｌＴｈｅｒ．４：抄録６０；Ｂａｘｔｅｒら，１９９９，ＡｎｔｉｖｉｒａｌＴｈｅｒ．４：抄録６１；Ｃｏｈｅｎら，２０００，第７回レトロウイルスおよび日和見感染に関する会議（カリフォルニア州サンフランシスコ）、抄録２３７）。薬剤耐性を与えることが知られるいくつかの突然変異は、プロテアーゼコード配列の２０のコドンおよび逆転写酵素（ＲＴ）コード配列の２７のコドンに影響を及ぼす（Ｈｉｒｓｃｈら，２０００，ＪＡＭＡ１８：２４１７−２４２６）。ｐｏｌにおける１９０の突然変異の包括的リストが、Ｓｃｈｉｎａｚｉら（Ｉｎｔ’ｌＡｎｔｉｖｉｒａｌＮｅｗｓ８：６５−９１（２０００））に報告された。ｇａｇ切断部位に影響を及ぼす突然変異は、プロテアーゼにおける耐性突然変異による酵素活性の損失を補償することが示されている。したがって、適切なコドンに関する配列情報を提供する遺伝子型アッセイに対する必要性があり、これは、こうしたアッセイが、患者のウイルス集団のより少数の構成要素であったとしても薬剤失敗に寄与しうるウイルス突然変異体を検出可能であるためである。 Information on viral mutations present in patients infected with HIV-1 should be used by clinicians to determine appropriate treatments, such as whether specific antiretroviral therapy should be initiated or sustained in the patient. Is possible. In addition, continued testing of patient samples that allow for the characterization of HIV-1 during treatment can indicate the emergence of drug resistant viruses, which allows clinicians to make therapy more effective It becomes possible to modify it. Evidence suggesting that drug resistance testing is clinically useful comes from studies based on retrospective and prospective interventions (Durant et al., 1999, Lancet 353: 2195-2199; Clevelenberg et al., 1999, Anti-Ther. 4). : Abstract 60; Baxter et al., 1999, Antiviral Ther. 4: Abstract 61; Cohen et al., 2000, 7th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (San Francisco, Calif., Abstract 237). Several mutations known to confer drug resistance affect 20 codons of the protease coding sequence and 27 codons of the reverse transcriptase (RT) coding sequence (Hirsch et al., 2000, JAMA 18: 2417- 2426). A comprehensive list of 190 mutations in pol was reported by Schinazi et al. (Int'l Antinews 8: 65-91 (2000)). Mutations affecting the gag cleavage site have been shown to compensate for the loss of enzyme activity due to resistance mutations in the protease. Thus, there is a need for genotypic assays that provide sequence information about the appropriate codons, which can be a viral suddenness that can contribute to drug failure even though these assays are a smaller component of the patient's viral population. This is because the mutant can be detected.

ＨＩＶ−１ゲノムは非常に可変性であり、その遺伝的関連性に基づいて、３群（Ｍ、ＯおよびＮ）が記載される。最も蔓延している群、Ｍは、サブタイプ（ＡからＪ）を含有し、サブタイプＡ、ＢおよびＣが、世界中で発見されるウイルスサブタイプの約９５％を占める。アジアで頻繁に見られるサブタイプＥは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子中にサブタイプＡ配列を含む組換えウイルスである。したがって、有効な診断アッセイは、Ａ、ＢおよびＣサブタイプの少なくとも１つを、そして好ましくはすべてを検出可能でなければならない。 The HIV-1 genome is highly variable and based on its genetic relevance, three groups (M, O and N) are described. The most prevalent group, M, contains subtypes (A to J), with subtypes A, B and C accounting for about 95% of the viral subtypes found worldwide. Subtype E, frequently found in Asia, is a recombinant virus that contains subtype A sequences in the gag and pol genes. Thus, an effective diagnostic assay should be able to detect at least one and preferably all of the A, B and C subtypes.

多様なアッセイおよび試薬を用いたＨＩＶ−１の検出が、先に記載されてきている。例えば米国特許第５，５９４，１２３号、第５，１７６，９９５号および第５，００８，１８２号（Ｓｎｉｎｓｋｙら）は、ＨＩＶ−１核酸を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく検出を開示する。米国特許第５，６８８，６３７号（Ｍｏｎｃａｎｙら）は、ＨＩＶ−１遺伝子の選択された領域のオリゴヌクレオチドプライマー配列、および該プライマーを用いて、ウイルス配列を増幅し、そして増幅された産物を検出する方法を開示する。米国特許第５，７１２，３８５号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）および第５，８５６，０８８号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）は、ＨＩＶ−１配列を検出するための増幅オリゴヌクレオチド、プローブおよび方法を開示する。米国特許第５，７８６，１７７号（Ｍｏｎｃａｎｙら）は、遺伝子発現のため、ＨＩＶ−１ヌクレオチド配列を増幅する方法、および産生したポリペプチドを精製する方法を開示する。ＨＩＶ−１の存在を検出するのに有用なＨＩＶ−１核酸配列は、米国特許第５，７７３，６０２号およびＥＰ０１７８９７８（Ａｌｉｚｏｎら）、米国特許第５，８４３，６３８号（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら）、第６，００１，９７７号（Ｃｈａｎｇら）、第５，４２０，０３０号（Ｒｅｉｔｚら）および第５，８６９，３１３号（Ｒｅｉｔｚら）、およびＥＰ０１８１１５０（Ｌｕｃｉｗら）に開示されてきている。ＰＣＴ第ＷＯ９９６１６６６号は、ＨＩＶ遺伝子配列における多型突然変異を検出する方法を開示し、該方法は、切迫したウイルス薬剤耐性突然変異のリスクが増加している指標を提供する。 Detection of HIV-1 using a variety of assays and reagents has been described previously. For example, US Pat. Nos. 5,594,123, 5,176,995, and 5,008,182 (Sninsky et al.) Disclose polymerase chain reaction (PCR) based detection that amplifies HIV-1 nucleic acid. To do. US Pat. No. 5,688,637 (Moncany et al.) Uses oligonucleotide primer sequences for selected regions of the HIV-1 gene, and using the primers to amplify viral sequences and detect amplified products A method is disclosed. US Pat. Nos. 5,712,385 (McDonough et al.) And 5,856,088 (McDonough et al.) Disclose amplification oligonucleotides, probes and methods for detecting HIV-1 sequences. US Pat. No. 5,786,177 (Moncany et al.) Discloses a method for amplifying HIV-1 nucleotide sequences for gene expression and a method for purifying the produced polypeptide. HIV-1 nucleic acid sequences useful for detecting the presence of HIV-1 are described in US Pat. No. 5,773,602 and EP 0 178 978 (Alizon et al.), US Pat. No. 5,843,638 (Montagnier et al.). ), 6,001,977 (Chang et al.), 5,420,030 (Reitz et al.) And 5,869,313 (Reitz et al.), And EP 0 181 150 (Luciw et al.). It is coming. PCT WO9961666 discloses a method for detecting polymorphic mutations in HIV gene sequences, which provides an indication that the risk of imminent viral drug resistance mutations is increased.

核酸を増幅して、標的配列の、より多くのコピーを産生する方法が、先に記載されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら）は、変性および重合反応の一連の熱周期を用いて、多コピーの標的配列を産生する、ＰＣＲ増幅を開示する。ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写に頼る増幅法は、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）、米国特許第５，４３７，９９０号（Ｂｕｒｇら）、ＰＣＴ第ＷＯ８８０１３０２号および第ＷＯ８８１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）、米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）；並びに米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号（Ｕｒｄｅａら）に開示されている。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、４つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の周期を用いることによって、標的およびその相補鎖を増幅する（ＥＰ第０３２０３０８号）。鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、半修飾ＤＮＡ標的二重鎖の一方の鎖にニックを形成する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用い、その後、プライマー伸長および鎖置換工程が続く（米国特許第５，４２２，２５２号（Ｗａｌｋｅｒら））。 Methods for amplifying nucleic acids to produce more copies of the target sequence have been described previously. For example, US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159 (Mullis et al.) Use a series of thermal cycles of modification and polymerization reactions to produce multiple copies. Disclose PCR amplification to produce a target sequence. Amplification methods that rely on transcription using RNA polymerase are described in US Pat. Nos. 5,399,491 and 5,554,516 (Kacian et al.), US Pat. No. 5,437,990 (Burg et al.), PCT No. Disclosed in WO88001302 and WO8810315 (Gingeras et al.), US Pat. No. 5,130,238 (Malek et al.); And US Pat. Nos. 4,868,105 and 5,124,246 (Urdea et al.). ing. Ligase chain reaction (LCR) uses four different oligonucleotides to amplify the target and its complementary strand by using a cycle of hybridization, ligation, and denaturation (EP 0 320 308). Strand displacement amplification (SDA) uses a primer containing a recognition site for a restriction endonuclease that nicks one strand of a half-modified DNA target duplex, followed by a primer extension and strand displacement step (US Patent) 5,422,252 (Walker et al.)).

核酸配列は、相補配列（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とのハイブリダイゼーションを用いることによって、検出可能である（米国特許第５，５０３，９８０号（Ｃａｎｔｏｒ）、第５，２０２，２３１号（Ｄｒｍａｎａｃら）、第５，１４９，６２５号（Ｃｈｕｒｃｈら）、第５，１１２，７３６号（Ｃａｌｄｗｅｌｌら）、第５，０６８，１７６号（Ｖｉｊｇら）、および第５，００２，８６７号（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）を参照されたい）。ハイブリダイゼーション検出法は、ＤＮＡチップ上のプローブアレイを用いて、１ヌクレオチドが異なる、４つの関連プローブ配列の組において、正確に相補的なプローブ配列に選択的にハイブリダイズする、標的核酸に関する配列情報を提供することが可能である（米国特許第５，８３７，８３２号および第５，８６１，２４２号（Ｃｈｅｅら）を参照されたい）。 Nucleic acid sequences can be detected by using hybridization with complementary sequences (eg, oligonucleotide probes) (US Pat. Nos. 5,503,980 (Cantor), 5,202,231 (Drmanac et al.)). 5,149,625 (Church et al.), 5,112,736 (Caldwell et al.), 5,068,176 (Vijg et al.), And 5,002,867 (Macevicz). I want to be) The hybridization detection method uses a probe array on a DNA chip to selectively hybridize to an exactly complementary probe sequence in a set of four related probe sequences that differ in one nucleotide, and is related to the target nucleic acid. (See US Pat. Nos. 5,837,832 and 5,861,242 (Chee et al.)).

発明の概要
本発明の１つの側面にしたがって、ＨＩＶ−１のｇａｇまたはｐｏｌ遺伝子の一部を増幅するための核酸オリゴマーであって、配列番号５から配列番号２２および配列番号３３から配列番号６８からなる群より選択される配列を含み、所望により、核酸主鎖中に、１以上の２’−Ｏ−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれることが可能である、前記核酸オリゴマーを提供する。１つの態様において、オリゴマーは、配列番号５から配列番号１０および配列番号３３から配列番号４５からなる群より選択される配列を有するプロモーター−プライマーであり、該配列の５’部分にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列が含まれる。別の態様において、核酸オリゴマーは：第一のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号５、配列番号１１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４６、または配列番号４７および配列番号１７または配列番号５９；第二のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号６、配列番号１２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４８または配列番号４９および配列番号１８または配列番号６０；ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ配列を増幅するための、配列番号７、配列番号１３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号５０または配列番号５１および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２；ｐｏｌ遺伝子の第一の逆転写酵素（ＲＴ）配列を増幅するための、配列番号８、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号５２、配列番号５３または配列番号５４および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５；ｐｏｌ遺伝子の第二のＲＴ配列を増幅するための、配列番号９、配列番号１５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５５または配列番号５６および配列番号２１または配列番号６６；並びにｐｏｌ遺伝子の第三のＲＴ配列を増幅するための、配列番号１０、配列番号１６、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５７または配列番号５８および配列番号２２、配列番号６７または配列番号６８からなる群より選択されるオリゴマーの混合物である。 SUMMARY OF THE INVENTION In accordance with one aspect of the present invention, a nucleic acid oligomer for amplifying a portion of the HIV-1 gag or pol gene comprising SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 68. Optionally comprising one or more 2′-O-methoxy linkages, peptide nucleic acid linkages, phosphorothioate linkages, methylphosphonate linkages, or any combination thereof in the nucleic acid backbone. It is possible to provide said nucleic acid oligomer. In one embodiment, the oligomer is a promoter-primer having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 45, and for the T7 RNA polymerase in the 5 ′ portion of the sequence Of the promoter sequence. In another embodiment, the nucleic acid oligomer is: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 46, or SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 17 or sequence for amplifying the first gag sequence. No. 59; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49, and SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 60 for amplifying a second gag sequence; pol gene protease SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 61 or SEQ ID NO: 62; first inversion of the pol gene to amplify the sequence SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, sequence for amplifying a transcriptase (RT) sequence No. 52, SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64 or SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, sequence for amplifying the second RT sequence of the pol gene SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 44 for amplifying the third RT sequence of the pol gene; It is a mixture of oligomers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 67 or SEQ ID NO: 68.

本発明の別の側面にしたがって、ｇａｇまたはｐｏｌ配列由来のＨＩＶ−１配列に特異的にハイブリダイズし、配列番号２３から配列番号２９からなる群より選択される塩基配列および検出可能シグナルを生じる標識を有する、標識オリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドには、所望により、核酸主鎖中に、１以上の２’−Ｏ−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれることが可能である。１つの態様において、標識オリゴヌクレオチドには、発光シグナルを生じる化合物である、標識が含まれ、そして好ましくは、該標識は、均質検出系で検出可能な化学発光シグナルを生じる。１つの態様において、標識オリゴヌクレオチドは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識され、そして：第一のｇａｇ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２３；第二のｇａｇ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２４；第三のｇａｇ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２５；プロテアーゼ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２６；第一のＲＴ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２７；第二のＲＴ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２８；および第三のＲＴ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２９からなる群より選択される配列を含有する。 In accordance with another aspect of the present invention, a label that specifically hybridizes to an HIV-1 sequence derived from a gag or pol sequence and produces a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 29 and a detectable signal A labeled oligonucleotide is provided. The oligonucleotide can optionally include one or more 2′-O-methoxy linkages, peptide nucleic acid linkages, phosphorothioate linkages, methylphosphonate linkages, or any combination thereof in the nucleic acid backbone. is there. In one embodiment, the labeled oligonucleotide includes a label, which is a compound that produces a luminescent signal, and preferably the label produces a chemiluminescent signal that is detectable with a homogeneous detection system. In one embodiment, the labeled oligonucleotide is labeled with an acridinium ester (AE) compound and: specifically hybridizes to the first gag sequence; SEQ ID NO: 23; specifically hybridizes to the second gag sequence. SEQ ID NO: 24 which specifically hybridizes to a third gag sequence; SEQ ID NO: 26 which specifically hybridizes to a protease sequence; SEQ ID NO: 27 which specifically hybridizes to a first RT sequence Contains a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 28, which specifically hybridizes to a second RT sequence; and SEQ ID NO: 29, which specifically hybridizes to a third RT sequence.

本発明の別の側面にしたがって、生物学的試料におけるＨＩＶ−１を検出する方法であって：ＨＩＶ−１核酸を含有する試料を提供し；ｇａｇおよびｐｏｌ配列内に含有される、少なくとも１つのＨＩＶ−１標的配列を特異的に増幅する、２以上の増幅オリゴマーと、試料とを、核酸の増幅を可能にする条件下で混合し、ここで増幅オリゴマーは：
第一のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号５、配列番号１１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４６、または配列番号４７および配列番号１７または配列番号５９；
第二のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号６、配列番号１２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４８または配列番号４９および配列番号１８または配列番号６０；
プロテアーゼ配列である第一のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号７、配列番号１３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号５０または配列番号５１および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２；
第一の逆転写酵素（ＲＴ）配列である第二のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号８、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号５２、配列番号５３または配列番号５４および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５；
第二のＲＴ配列である第三のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号９、配列番号１５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５５または配列番号５６および配列番号２１または配列番号６６；並びに
第三のＲＴ配列である第四のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号１０、配列番号１６、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５７または配列番号５８および配列番号２２、配列番号６７または配列番号６８；あるいは
少なくとも１つのｇａｇ配列および少なくとも１つのｐｏｌ配列の増幅を可能にする、それらの組み合わせ
からなる群より選択される配列を有し、
標的配列を増幅して、増幅された核酸産物を産生し；そして増幅された核酸産物の存在を検出する工程を含んでなる、前記方法を提供する。１つの態様において、増幅工程は、実質的に等温条件下で行う転写仲介増幅法を用いる。別の態様において、検出工程は：ｇａｇ配列から産生される増幅された核酸にハイブリダイズするための、配列番号２３、配列番号２４もしくは配列番号２５の配列を有する標識オリゴマー、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するオリゴマーの混合物；ｐｏｌ配列から産生される増幅された核酸にハイブリダイズするための、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９の配列を有する標識オリゴマー、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するオリゴマーの混合物；あるいは２以上の標的配列から産生される増幅された核酸にハイブリダイズするための、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９の配列を有する、少なくとも２つの標識オリゴマーの混合物を用いる。別の態様において、検出工程は、核酸プローブアレイへの増幅された核酸のハイブリダイゼーションを検出する。１つの態様には、ＨＩＶ−１核酸を含有する試料と、ＨＩＶ−１核酸に特異的にハイブリダイズする配列を有する、少なくとも１つの捕捉オリゴマーとを接触させ、こうしてＨＩＶ−１核酸が含まれるハイブリダイゼーション複合体を形成し、そして他の試料構成要素から該ハイブリダイゼーション複合体を分離する工程がさらに含まれる。 According to another aspect of the invention, a method for detecting HIV-1 in a biological sample comprising: providing a sample containing HIV-1 nucleic acid; at least one contained within gag and pol sequences Two or more amplification oligomers that specifically amplify an HIV-1 target sequence and a sample are mixed under conditions that allow nucleic acid amplification, where the amplification oligomers are:
SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 46, or SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 59 for amplifying the first gag sequence;
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 60 for amplifying a second gag sequence;
SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 61 or SEQ ID NO: 62 for amplifying a first pol sequence that is a protease sequence. ;
SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 for amplifying the second pol sequence which is the first reverse transcriptase (RT) sequence Or SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64 or SEQ ID NO: 65;
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 66 for amplifying a third pol sequence that is the second RT sequence; And SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 67 for amplifying the fourth pol sequence that is the third RT sequence. Or SEQ ID NO: 68; or having a sequence selected from the group consisting of combinations thereof that allows amplification of at least one gag sequence and at least one pol sequence;
A method is provided comprising the steps of amplifying the target sequence to produce an amplified nucleic acid product; and detecting the presence of the amplified nucleic acid product. In one embodiment, the amplification step uses a transcription-mediated amplification method performed under substantially isothermal conditions. In another embodiment, the detecting step comprises: a labeled oligomer having a sequence of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 25, or any of them for hybridizing to an amplified nucleic acid produced from a gag sequence A mixture of oligomers having a combination; a labeled oligomer having the sequence of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29, or any of them for hybridizing to amplified nucleic acids produced from pol sequences A mixture of oligomers having such a combination; or SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, for hybridizing to amplified nucleic acids produced from two or more target sequences. At least two standards having the sequence of SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29; A mixture of oligomers. In another embodiment, the detecting step detects hybridization of the amplified nucleic acid to the nucleic acid probe array. In one embodiment, a sample containing an HIV-1 nucleic acid is contacted with at least one capture oligomer having a sequence that specifically hybridizes to the HIV-1 nucleic acid, thus comprising a HIV-1 nucleic acid containing HIV-1 nucleic acid. The method further includes forming a hybridization complex and separating the hybridization complex from other sample components.

付随する図は、本発明のいくつかの態様を例示する。図は、説明と合わせ、本発明の原理を説明し、そして例示するのに役立つ。 The accompanying figures illustrate some aspects of the present invention. The drawings, together with the description, serve to explain and illustrate the principles of the present invention.

図１は、ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子領域（上部に、左から右へ、５’から３’方向に示す）の模式図であり、本発明の増幅オリゴヌクレオチドおよび方法を用いて産生される、増幅される配列（ｇａｇおよびｐｏｌ領域の下に示す、Ｇａｇ１、Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４）の相対的な位置およびサイズを示す。１つの態様において、上のＧａｇ１、Ｇａｇ２およびＲＴ３領域の群が、１つの多重反応中で増幅され、そして下のＰｒｔ、ＲＴ１およびＲＴ４領域の群が、別の多重反応中で増幅される。FIG. 1 is a schematic diagram of the HIV-1 gag and pol gene regions (shown at the top, from left to right, 5 ′ to 3 ′ direction), produced using the amplification oligonucleotides and methods of the present invention. , Shows the relative position and size of the amplified sequences (Gag1, Gag2, Prt, RT1, RT3 and RT4, shown below the gag and pol regions). In one embodiment, the upper group of Gag1, Gag2, and RT3 regions are amplified in one multiplex reaction, and the lower group of Prt, RT1, and RT4 regions are amplified in another multiplex reaction. 図２は、図１に記載するような、ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｐｏｌ領域、並びに増幅される配列の模式図であるが、この態様では、上のＧａｇ１、ＰｒｔおよびＲＴ３領域の群が、１つの多重反応中で共に増幅され、そして下のＧａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４領域の群が、別の多重反応中で増幅される。FIG. 2 is a schematic diagram of the HIV-1 gag and pol regions and the sequences to be amplified as described in FIG. 1, but in this embodiment, the group of Gag1, Prt and RT3 regions above is one Amplified together in a multiplex reaction, and the group of lower Gag2, RT1, and RT4 regions is amplified in another multiplex reaction.

発明の詳細な説明
本発明には、１以上のＨＩＶ−１標的領域を増幅し、そして増幅された配列を検出することによって、生物学的試料におけるＨＩＶ−１核酸を検出する方法およびオリゴヌクレオチドが含まれる。増幅される標的領域は、ＨＩＶ−１ウイルスが薬剤耐性になる際に、潜在的に突然変異される可能性がある多くのコドンが含まれるものである。検出工程は、増幅産物を、標識プローブとハイブリダイズさせ、そして標識プローブから生じるシグナルを検出することによるなど、増幅された標的配列と特異的に関連するシグナルを検出する、既知の多様な方法のいずれかを用いて行うことが可能である。検出工程はまた、核酸塩基配列のすべてまたは一部などの、増幅された配列に関するさらなる情報を提供することも可能である。本発明の組成物および方法は、ＨＩＶ−１配列の存在を検出し、そして検出可能配列情報に基づく遺伝的下位群または薬剤耐性表現型などの、感染性病原体に関するさらなる情報を提供するのに有用である。したがって、本発明は、医療従事者および患者に、ＨＩＶ−１感染に関する有用な診断および予後情報を提供する。好ましい態様において、ＨＩＶ−１ゲノムの多数の異なる部分を多重反応中で増幅して、単一反応容器中で異なるＨＩＶ−１配列の多数のコピーを産生する。その後、異なる領域から増幅された産物を検出し、そして／またはさらに解析する。多重反応は、試料に関して行う個々の反応数を最小限にし、そして多数の領域が増幅されるため、１つの領域が十分に増幅されていなくても、偽陰性結果の可能性を回避する。１つの態様において、該方法は、２つの異なる多重反応中で、増幅オリゴヌクレオチドを用いて、ＨＩＶ−１ゲノムの多数の異なる部分を増幅し、累積して約２．５ｋｂのＨＩＶ−１配列を増幅する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention includes a method and oligonucleotide for detecting HIV-1 nucleic acid in a biological sample by amplifying one or more HIV-1 target regions and detecting the amplified sequence. included. The target region that is amplified is one that contains many codons that can potentially be mutated when the HIV-1 virus becomes drug resistant. The detection step involves a variety of known methods that detect signals specifically associated with the amplified target sequence, such as by hybridizing the amplification product with a labeled probe and detecting the signal resulting from the labeled probe. It is possible to use either one. The detection step can also provide further information about the amplified sequence, such as all or part of the nucleobase sequence. The compositions and methods of the present invention are useful for detecting the presence of HIV-1 sequences and providing further information regarding infectious agents such as genetic subgroups or drug resistance phenotypes based on detectable sequence information It is. Thus, the present invention provides medical staff and patients with useful diagnostic and prognostic information regarding HIV-1 infection. In a preferred embodiment, multiple different portions of the HIV-1 genome are amplified in a multiplex reaction to produce multiple copies of different HIV-1 sequences in a single reaction vessel. Thereafter, amplified products from different regions are detected and / or further analyzed. Multiplex reaction minimizes the number of individual reactions performed on the sample and avoids the possibility of false negative results even if one region is not sufficiently amplified because multiple regions are amplified. In one embodiment, the method amplifies a number of different portions of the HIV-1 genome using amplification oligonucleotides in two different multiplex reactions and accumulates approximately 2.5 kb of HIV-1 sequence. Amplify.

本発明の方法には、好ましくは、先に、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）に詳細に開示されたような、等温転写仲介核酸増幅法を用いた増幅が含まれる。該方法には、プローブオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、核酸の存在を検出する、既知の多様な方法のいずれを用いることも可能な検出工程が含まれる。好ましくは、検出工程は、先に、ＡｒｎｏｌｄらＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：１５８８−１５９４（１９８９）、並びに米国特許第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、および第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号（Ｌｉｚａｒｄｉら）に詳細に記載されるような、均質検出法を用いる。本発明の方法にはまた、既知の多様な精製法のいずれかを用いて、増幅前に他の試料構成要素から標的ＨＩＶ−１を精製する、所望による工程が含まれることも可能である。核酸を精製する方法は、当該技術分野に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９）§§１．２３−１．４０、２．７３−２．８０、４．２６−４．３２および７．３−７．３５）。好ましい態様は、ＰＣＴ第ＷＯ９８５０５８３号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）に詳細に開示される溶液相ハイブリダイゼーションなどの、最小限の工程を伴う、比較的迅速な精製工程を用いる。簡潔には、精製は、標的に、そして磁気粒子（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、米国特許第４，５５４，０８８号および第４，６９５，３９２号）などの除去可能固体支持体上の固定オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、他の試料構成要素から標的核酸を分離する、オリゴヌクレオチドを用いる。 The method of the present invention preferably comprises an isothermal transcription-mediated nucleic acid amplification method as previously disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,399,491 and 5,554,516 (Kacian et al.). The amplification used is included. The method includes a detection step that can use any of a variety of known methods for detecting the presence of a nucleic acid by hybridization to a probe oligonucleotide. Preferably, the detection step is as previously described in Arnold et al. Clinical Chemistry 35: 1588-1594 (1989), and US Pat. Nos. 5,658,737 (Nelson et al.), And 5,118,801 and A homogeneous detection method is used, as described in detail in US Pat. No. 312,728 (Lizardi et al.). The methods of the invention can also include an optional step that purifies the target HIV-1 from other sample components prior to amplification using any of a variety of known purification methods. Methods for purifying nucleic acids are known in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) §§ 1.23-1 .40, 2.73-2.80, 4.26-4.32, and 7.3-7.35). A preferred embodiment uses a relatively rapid purification step with minimal steps, such as solution phase hybridization disclosed in detail in PCT WO 9850583 (Weisburg et al.). Briefly, purification hybridizes to a target and immobilized oligonucleotides on a removable solid support such as magnetic particles (Whitehead et al., US Pat. Nos. 4,554,088 and 4,695,392). Thus, an oligonucleotide is used that separates the target nucleic acid from other sample components.

本発明は、組織または体液試料などのヒト生物学的試料に存在するＨＩＶ−１核酸を検出する方法を提供する。「生物学的試料」には、ＨＩＶ−１核酸を含有する可能性がある、生存しているまたは死亡したヒト由来のいずれかの組織、体液または材料が含まれ、例えば、末梢血、血漿、血清、リンパ液、骨髄、子宮頚スワブ試料、リンパ節組織、呼吸組織または滲出物、胃腸組織、尿、糞便、***または他の体液、組織または材料が含まれる。標準法を用いて、生物学的試料を処理して、物理的または機械的に組織または細胞構造を破壊し、水性または有機溶液中に、細胞内構成要素を遊離させて、さらなる解析のため、核酸を調製することが可能である。 The present invention provides a method for detecting HIV-1 nucleic acid present in a human biological sample, such as a tissue or body fluid sample. A “biological sample” includes any tissue, body fluid or material from a living or dead human that may contain HIV-1 nucleic acid, such as peripheral blood, plasma, Serum, lymph fluid, bone marrow, cervical swab sample, lymph node tissue, respiratory tissue or exudate, gastrointestinal tissue, urine, feces, semen or other body fluid, tissue or material. Using standard methods, biological samples are processed to physically or mechanically disrupt tissue or cellular structures, releasing intracellular components into aqueous or organic solutions for further analysis. Nucleic acids can be prepared.

「核酸」は、窒素性複素環塩基類、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）類を有し、ホスホジエステル結合によって共に連結されて、ポリヌクレオチドを形成する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含んでなる多量体化合物を指す。核酸には、慣用的なＲＮＡおよびＤＮＡ、並びにその類似体が含まれる。核酸の「主鎖」は、既知の多様な連結で構成されることが可能であり、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（米国特許第５，５３９，０８２号（Ｎｉｅｌｓｅｎら）に記載されるような「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」に見られるもの）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは、２’メトキシおよび２’ハロゲン化物置換物（例えば２’−Ｆ）など、こうした糖の既知の置換物であることが可能である。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体、例えばイノシン（「Ｉ」）またはネブラリン（「Ｎ」）あるいは合成類似体（ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ５−３６，Ａｄａｍｓら監修，第１１版，１９９２；Ｌｉｎ＆Ｂｒｏｗｎ，１９８９，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：１０３７３−８３；Ｌｉｎ＆Ｂｒｏｗｎ，１９９２，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：５１４９−５２）、プリンまたはピリミジン塩基類の誘導体（例えば、Ｎ^４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン類、およびデアザ−またはアザ−ピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、２、６または８位に置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ^６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ^４−アルキル−ピリミジン類；ＰＣＴ第ＷＯ９３１３１２１号（Ｃｏｏｋ）を参照されたい）およびその位でポリマー主鎖に窒素性塩基が含まれない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（米国特許第５，５８５，４８１号（Ａｒｎｏｌｄら））であることが可能である。核酸は、天然存在ＲＮＡまたはＤＮＡに見られるような慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることが可能であるし、または慣用的な構成要素および置換の組み合わせ（例えば２’メトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の塩基類似体を含むポリマー）が含まれることが可能である。 A “nucleic acid” is a multimer comprising nucleosides or nucleoside analogs having nitrogenous heterocyclic bases, or base analogs, joined together by phosphodiester bonds to form a polynucleotide. Refers to a compound. Nucleic acids include conventional RNA and DNA, and analogs thereof. The “backbone” of a nucleic acid can be composed of a variety of known linkages, including one or more sugar-phosphodiester linkages, peptide nucleic acid linkages (US Pat. No. 5,539,082). (As found in "peptide nucleic acids" or "PNA" as described in Nielsen et al.)), Phosphorothioate linkages, methylphosphonate linkages or combinations thereof. The sugar moiety can be a known substitute for such sugars, such as ribose or deoxyribose, or 2 ′ methoxy and 2 ′ halide substitutions (eg, 2′-F). Nitrogen bases are conventional bases (A, G, C, T, U), analogs thereof such as inosine (“I”) or nebulaline (“N”) or synthetic analogs (The Biochemistry of the Nucleic Acids. 5-36, supervised by Adams et al., 11th edition, 1992; Lin & Brown, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 10373-83; Lin & Brown, 1992, Nucl. Acids Res. 20: 5149-52), Pudding Or derivatives of pyrimidine bases (eg N ⁴ -methyldeoxyguanosine, deaza- or aza-purines, and deaza- or aza-pyrimidines, pyrimidine bases having a substituent in the 5 or 6 position, 2, 6 or Purine bases having a substituent at the 8-position, 2 - amino-6-methylamino purine, ^{O 6} - methylguanine, 4-thio - pyrimidines, 4-amino - pyrimidines, 4-dimethylhydrazine - pyrimidines, and ^{O 4} - alkyl - pyrimidines; PCT No. WO9313121 (See Cook)) and at that position the polymer backbone does not contain a nitrogenous base, with an “abbasic” residue (US Pat. No. 5,585,481 (Arnold et al.)). It is possible that there is. A nucleic acid can comprise only conventional sugars, bases and linkages such as found in naturally occurring RNA or DNA, or a combination of conventional components and substitutions (eg, a 2 ′ methoxy backbone). Conventional bases linked via, or polymers comprising conventional bases and one or more base analogs).

オリゴマーの主鎖組成は、オリゴマーおよび相補核酸鎖間に形成される、ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を与える可能性がある。本発明のオリゴマーの態様には、ＰＮＡ、糖−ホスホジエステル連結、オリゴマーの一部またはすべてにおける２’メトキシ連結、またはその誘導体が含まれることが可能である。改変されたオリゴマー主鎖は、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡに相対して、ハイブリダイゼーション複合体安定性を増進することが可能である。例えば、ＰＮＡであるか、あるいは２’−メトキシ連結（２’−Ｏ−メチルリボフラノシル部分を含有する；ＰＣＴ第ＷＯ９８／０２５８２号）または２’−Ｆ置換ＲＮＡ基を有するオリゴマーは、相補的２’ＯＨＲＮＡと安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する。２つの糖基を連結する連結は、全体の電荷または電荷密度、あるいは立体相互作用に影響を与えることによって、ハイブリダイゼーション複合体安定性に影響を与えることが可能である。オリゴマーの態様には、複合体安定性に影響を与える荷電（例えばホスホロチオエート）または中性（例えばメチルホスホネート）基を用いた連結が含まれることが可能である。 The backbone composition of the oligomer can affect the stability of the hybridization complex formed between the oligomer and the complementary nucleic acid strand. Oligomer embodiments of the invention can include PNA, sugar-phosphodiester linkages, 2 'methoxy linkages in some or all of the oligomers, or derivatives thereof. The modified oligomer backbone can enhance hybridization complex stability relative to standard DNA or RNA. For example, an oligomer that is PNA or has a 2′-methoxy linkage (containing a 2′-O-methylribofuranosyl moiety; PCT WO 98/02582) or a 2′-F substituted RNA group is complementary Forms stable hybridization complexes with 2'OH RNA. The linkage connecting two sugar groups can affect the stability of the hybridization complex by affecting the overall charge or charge density, or steric interaction. Oligomer embodiments can include ligation with charged (eg, phosphorothioate) or neutral (eg, methylphosphonate) groups that affect complex stability.

本発明には、ＨＩＶ−１標的配列を特異的に増幅する増幅オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー、およびＨＩＶ−１標的配列またはその増幅産物を検出するプローブオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、一般的に１，０００残基未満を有するポリマー核酸を指し、約２から５残基の下限および約５００から９００残基の上限を有するサイズ範囲にあるポリマーが含まれる。好ましい態様において、オリゴマーは、約５から約１５残基の下限および約１００から２００残基の上限を有するサイズ範囲にある。より好ましくは、本発明のオリゴマーは、約１０から約１５残基の下限および約１７から１００残基の上限を有するサイズ範囲にある。オリゴマーは、天然に存在する核酸から精製することが可能であるが、一般的には、多様な公知の酵素的または化学的方法のいずれかを用いて、合成する。 The present invention includes amplification oligonucleotides or oligomers that specifically amplify HIV-1 target sequences, and probe oligonucleotides or oligomers that detect HIV-1 target sequences or amplification products thereof. "Oligonucleotide" and "oligomer" generally refer to polymer nucleic acids having less than 1,000 residues, polymers in a size range having a lower limit of about 2 to 5 residues and an upper limit of about 500 to 900 residues Is included. In preferred embodiments, the oligomer is in a size range having a lower limit of about 5 to about 15 residues and an upper limit of about 100 to 200 residues. More preferably, the oligomers of the invention are in a size range having a lower limit of about 10 to about 15 residues and an upper limit of about 17 to 100 residues. Oligomers can be purified from naturally occurring nucleic acids, but are generally synthesized using any of a variety of known enzymatic or chemical methods.

「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴマーには、テンプレートとして別の核酸鎖を用いて、オリゴマーの３’端が酵素的に伸長される、プライマーおよびプロモーター−プライマーが含まれる。いくつかの態様において、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（またはその相補鎖）の領域に相補的である、少なくとも約１０の隣接する塩基、そしてより好ましくは約１２の隣接する塩基を含有し、そして所望により、標的配列またはその相補体に結合しない他の塩基を含有することが可能である。例えば、プロモーター−プライマーは、標的結合塩基、および標的配列にハイブリダイズしないプロモーター配列が含まれる、さらなる５’塩基を含有することが可能である。隣接する標的結合塩基は、該塩基が結合する配列に、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは約９０％から１００％相補的である。増幅オリゴマーは、好ましくは、約１０から約６０塩基長であり、そして修飾ヌクレオチドまたは塩基類似体が含まれることが可能である。 An “amplification oligonucleotide” or “amplification oligomer” is an oligonucleotide that hybridizes to a target nucleic acid or its complement and participates in a nucleic acid amplification reaction. Amplification oligomers include primers and promoter-primers in which the 3 'end of the oligomer is enzymatically extended using another nucleic acid strand as a template. In some embodiments, the amplification oligonucleotide contains at least about 10 contiguous bases, and more preferably about 12 contiguous bases that are complementary to a region of the target sequence (or its complementary strand), and If desired, it can contain other bases that do not bind to the target sequence or its complement. For example, a promoter-primer can contain an additional 5 'base that includes a target binding base and a promoter sequence that does not hybridize to the target sequence. Adjacent target binding bases are preferably at least about 80%, and more preferably about 90% to 100% complementary to the sequence to which the base binds. Amplification oligomers are preferably about 10 to about 60 bases in length and can include modified nucleotides or base analogs.

本発明の態様は、ＨＩＶ−１ゲノムの領域、特にｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子配列の領域を特異的に増幅する、増幅オリゴマーを用いる。これらの増幅オリゴヌクレオチドには、配列番号５から配列番号２２および配列番号３３から配列番号６８の配列が含まれる。プロモーター−プライマーである、いくつかの増幅オリゴマーには、プロモーター配列が含まれる（配列番号５から配列番号１０および配列番号３３から配列番号４５）。プロモーター−プライマーに含まれる、好ましいＴ７プロモーター配列は、配列番号１から配列番号４に示す。当業者は、プライマーとして機能可能なオリゴマー（すなわち標的配列に特異的にハイブリダイズし、そして３’ポリメラーゼ伸長可能端を有するもの）を修飾して、５’プロモーター配列を含ませ、そしてこうしてプロモーター−プライマーにすることが可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター−プライマー配列も、そのプロモーター配列と独立にプライマーとして機能可能である（配列番号１１から配列番号１６および配列番号４６から配列番号５８における、プロモーターを含まずに示す配列など）。 Embodiments of the invention use amplification oligomers that specifically amplify regions of the HIV-1 genome, particularly regions of the gag and pol gene sequences. These amplification oligonucleotides include the sequences of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 68. Some amplification oligomers that are promoter-primers include promoter sequences (SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 45). Preferred T7 promoter sequences included in the promoter-primer are shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. One skilled in the art will modify an oligomer that can function as a primer (ie, one that specifically hybridizes to a target sequence and has a 3 ′ polymerase extendable end) to include a 5 ′ promoter sequence, and thus a promoter- It will be appreciated that it can be a primer. Similarly, any promoter-primer sequence can function as a primer independent of the promoter sequence (such as the sequences shown in SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 58 without the promoter).

「増幅する」または「増幅」により、多コピーの標的核酸配列あるいはその相補体または断片を生じるための方法を意味する（すなわち増幅された産物は、完全標的配列より少ない配列を含有することが可能である）。例えば、断片は、標的核酸の内部位にハイブリダイズし、そして該位から重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを用いることにより、標的核酸の一部を増幅することによって、産生可能である。既知の増幅法には、例えば、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写関連または転写仲介増幅（ＴＭＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、ＱＢレプリカーゼを用いて、ＲＮＡ配列を増幅する（米国特許第４，７８６，６００号（Ｋｒａｍｅｒら）；ＰＣＴ第ＷＯ９０１４４３９号）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、向かい合う鎖のプライマーおよび熱反復を用いて、多コピーのＤＮＡまたはｃＤＮＡを合成する（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｍｕｌｌｉｓら，１９８７，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５５：３３５−３５０）。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の周期を用いることにより、標的の相補鎖を増幅する（ＥＰ第０３２０３０８号）。ＳＤＡは、標的配列が含まれる半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを形成する制限エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用い、その後、プライマー伸長および鎖置換工程が続く（米国特許第５，４２２，２５２号および第５，４７０，７２３号（Ｗａｌｋｅｒら））。エンドヌクレアーゼニック形成に頼らない等温鎖置換増幅法もまた知られる（米国特許第６，０８７，１３３号（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら））。転写関連または転写仲介増幅は、プロモーター配列が含まれるプライマー、および該プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼを用いて、標的配列から多数の転写物を産生し、こうして標的配列を増幅する（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，８２４，５１８号および第５，８８８，７７９号（Ｋａｃｉａｎら）、第５，４３７，９９０号（Ｂｕｒｇら）、第５，４０９，８１８号（Ｄａｖｅｙら）、第５，５５４，５１６号および第５，７６６，８４９号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）、第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）、第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号（Ｕｒｄｅａら）、および第５，７８６，１８３号（Ｒｙｄｅｒら）、ＰＣＴ第ＷＯ８８０１３０２号および第ＷＯ８８１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら））。 By “amplify” or “amplify” is meant a method for generating multiple copies of a target nucleic acid sequence or complement or fragment thereof (ie, the amplified product can contain fewer sequences than the complete target sequence) Is). For example, fragments can be produced by amplifying a portion of the target nucleic acid by using an amplification oligonucleotide that hybridizes to an internal site of the target nucleic acid and initiates polymerization from that position. Known amplification methods include, for example, replicase-mediated amplification, polymerase chain reaction (PCR) amplification, ligase chain reaction (LCR) amplification, strand displacement amplification (SDA) and transcription-related or transcription-mediated amplification (TMA). Replicase-mediated amplification uses QB replicase to amplify RNA sequences (US Pat. No. 4,786,600 (Kramer et al.); PCT WO 9014439). PCR amplification synthesizes multiple copies of DNA or cDNA using DNA polymerase, opposing strand primers and thermal repeats (US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4, 800, 159 (Mullis et al.); Mullis et al., 1987, Methods in Enzymology 155: 335-350). LCR amplification uses at least four different oligonucleotides to amplify the complementary strand of a target by using a cycle of hybridization, ligation, and denaturation (EP 0 320 308). SDA uses a primer containing a restriction endonuclease and an endonuclease recognition site that nicks one strand of a half-modified DNA duplex containing the target sequence, followed by a primer extension and strand displacement step ( US Pat. Nos. 5,422,252 and 5,470,723 (Walker et al.)). Isothermal strand displacement amplification methods that do not rely on endonuclease nick formation are also known (US Pat. No. 6,087,133 (Dattagupta et al.)). Transcription-related or transcription-mediated amplification uses a primer containing a promoter sequence and an RNA polymerase specific for the promoter to produce multiple transcripts from the target sequence, thus amplifying the target sequence (US Pat. No. 5 , 399,491, 5,480,784, 5,824,518 and 5,888,779 (Kacian et al.), 5,437,990 (Burg et al.), 5,409. , 818 (Davey et al.), 5,554,516 and 5,766,849 (McDonough et al.), 5,130,238 (Malek et al.), 4,868,105 and 5 , 124,246 (Urdea et al.), And 5,786,183 (Ryder et al.), PCT WO88001302 and WO88. 0315 No. (Gingeras et al.)).

本発明の好ましい態様は、転写仲介増幅（ＴＭＡ）反応において、本増幅オリゴマーを用いて、ＨＩＶ−１標的配列を増幅する。当業者は、ポリメラーゼ仲介プライマー伸長を用いる核酸増幅の他の方法において、これらの増幅オリゴヌクレオチドが容易に使用可能であることを認識するであろう。 In a preferred embodiment of the present invention, the HIV-1 target sequence is amplified using the present amplification oligomer in a transcription-mediated amplification (TMA) reaction. One skilled in the art will recognize that these amplification oligonucleotides can be readily used in other methods of nucleic acid amplification using polymerase-mediated primer extension.

「転写仲介増幅」は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅を指す。増幅反応は、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨ活性、リボヌクレオシド三リン酸、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−プライマーを使用し、そして１以上のさらなる増幅オリゴヌクレオチドが含まれることが可能である。好ましい態様は、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，８２４，５１８号および第５，８８８，７７９号（Ｋａｃｉａｎら）、第５，５５４，５１６号および第５，７６６，８４９号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）、および第５，７８６，１８３号（Ｒｙｄｅｒら）に詳細に開示される方法を用いる。 “Transcription-mediated amplification” refers to nucleic acid amplification that uses RNA polymerase to produce multiple RNA transcripts from a nucleic acid template. The amplification reaction uses RNA polymerase, DNA polymerase, RNase H activity, ribonucleoside triphosphates, deoxyribonucleoside triphosphates, and promoter-primers, and can include one or more additional amplification oligonucleotides. is there. Preferred embodiments include US Pat. Nos. 5,399,491, 5,480,784, 5,824,518 and 5,888,779 (Kacian et al.), 5,554,516 and The methods disclosed in detail in US Pat. No. 5,766,849 (McDonough et al.) And 5,786,183 (Ryder et al.) Are used.

ＨＩＶ−１標的配列の増幅後、増幅された配列およびプローブオリゴヌクレオチド配列間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にするプローブへのハイブリダイゼーションを用いて、増幅された産物を検出する。いくつかの態様において、プローブを標識し、そしてハイブリダイゼーション複合体から検出されるシグナルは、標識プローブから生じる。他の態様において、増幅された産物を標識し、そしてプローブにハイブリダイズさせ、そして検出されるシグナルは、ハイブリダイゼーション複合体中の標識産物から生じる。検出工程で、配列情報を提供する態様において、増幅された核酸を、オリゴヌクレオチドプローブのアレイ（米国特許第５，８３７，８３２号および第５，８６１，２４２号（Ｃｈｅｅら））にハイブリダイズさせ、そしてコンピューター化システムを用いて、検出されたシグナルを解析し（米国特許第５，７３３，７２９号および第６，０６６，４５４号（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら））、システムによって、「塩基コール」から核酸配列を生じる。 After amplification of the HIV-1 target sequence, the amplified product is detected using hybridization to a probe that allows detection of the hybridization complex formed between the amplified sequence and the probe oligonucleotide sequence. In some embodiments, the probe is labeled and the signal detected from the hybridization complex arises from the labeled probe. In other embodiments, the amplified product is labeled and hybridized to the probe, and the signal detected is derived from the labeled product in the hybridization complex. In embodiments where the detection step provides sequence information, the amplified nucleic acid is hybridized to an array of oligonucleotide probes (US Pat. Nos. 5,837,832 and 5,861,242 (Chee et al.)). , And using a computerized system to analyze the detected signal (US Pat. Nos. 5,733,729 and 6,066,454 (Lipshutz et al.)), Produce.

「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸標的配列に特異的にハイブリダイズし、それにより、標的配列の検出を可能にする核酸オリゴマーを指す。検出は、直接（すなわち標的配列に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブおよび標的配列を連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的配列」は、プローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、核酸内、好ましくは増幅された核酸中の配列を指す。プローブは、標的特異的配列およびプローブの三次元コンホメーションに貢献する他の配列（米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号（Ｌｉｚａｒｄｉら）を参照されたい）を含んでなることが可能である。「十分に相補的な」配列は、プローブおよび標的配列が、標準的塩基対形成（Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）により完全に相補的でなくても、ハイブリダイゼーション条件下で、標的配列へのプローブオリゴマーの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。「十分に相補的な」プローブ配列は、１００％相補的ではないが、プローブの全塩基配列によって、ハイブリダイゼーション条件において、別の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能である、１以上の残基（無塩基性残基が含まれる）を含有することが可能である。適切なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野に公知であり、塩基配列組成に基づいて、容易に予測可能であるか、または日常的な試験を用いることによって、実験的に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。好ましい態様において、プローブには、標的配列に、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である、隣接塩基が含まれる。 “Probe” refers to a nucleic acid oligomer that specifically hybridizes to a nucleic acid target sequence under conditions that promote hybridization, thereby allowing detection of the target sequence. Detection may be direct (ie, resulting from a probe that hybridizes directly to the target sequence) or indirect (ie, resulting from a probe that hybridizes to an intermediate molecular structure linking the probe and target sequence). . The “target sequence” of a probe refers to a sequence within a nucleic acid, preferably in an amplified nucleic acid, that specifically hybridizes to at least a portion of the probe oligomer. Probes include target specific sequences and other sequences that contribute to the three-dimensional conformation of the probe (see US Pat. Nos. 5,118,801 and 5,312,728 (Lizardi et al.)). It is possible to be A “sufficiently complementary” sequence can be used under hybridization conditions even if the probe and target sequences are not perfectly complementary by standard base pairing (G: C, A: T or A: U pairing). Allows stable hybridization of the probe oligomer to the target sequence. A “sufficiently complementary” probe sequence is one or more that is not 100% complementary but is capable of specifically hybridizing to another sequence under hybridization conditions by the entire base sequence of the probe. It is possible to contain residues (including abasic residues). Appropriate hybridization conditions are known in the art and can be readily predicted based on the base sequence composition or can be determined experimentally by using routine tests. (See, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9. .47-9.51 and 11.47-11.57, in particular §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 and 11.5-15-1157. See). In a preferred embodiment, the probe includes adjacent bases that are at least about 80%, more preferably at least about 90%, and most preferably about 100% complementary to the target sequence.

検出のため、プローブは、標識されることが可能であり、すなわち、検出可能分子部分または検出可能シグナルを導く化合物に、直接または間接的に連結することが可能である。直接標識は、共有結合および非共有相互作用（例えば水素結合、疎水性およびイオン性相互作用）を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じて、あるいはキレートまたは配位複合体の形成を通じて、生じることが可能である。間接的標識は、標識をプローブに連結し、そして検出可能シグナルを増幅することが可能な、架橋部分（「リンカー」）の使用を通じて、生じる（例えば、ＰＣＴ第ＷＯ９５／１６０５５号（Ｕｒｄｅａら）を参照されたい）。標識は公知であり、そして例えば、放射性核種、リガンド（例えばビオチン、アビジン）、酵素および／または酵素基質、反応性基、遷移金属などの酸化還元活性部分（例えばＲｕ）、発色団（例えば検出可能な色を与える部分）、発光化合物（例えば、生物発光、燐光または化学発光標識）および蛍光化合物が含まれる。当業者は、標識プローブが、検出のため、プローブ試薬の比活性を最適化するのに、標的配列に特異的にハイブリダイズする、標識および非標識オリゴヌクレオチドの混合物であることが可能であると認識するであろう。いくつかの態様において、プローブ上の標識は、均質アッセイ系で検出可能であり、すなわち、混合物において、非結合標識プローブに比較して、結合した標識プローブが、安定性または差別的分解などの検出可能な変化を示す。均質アッセイで使用するのに好ましい標識は、化学発光化合物（米国特許第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、および第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．ら））である。好ましい化学発光標識にはアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物が含まれ、これは標準的ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）であることが可能である。核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９），第１０章；米国特許第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，５４７，８４２号（Ｈｏｇａｎら）、および第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．ら）、並びにＰＣＴ第ＷＯ９８０２５８２号（Ｂｅｃｋｅｒ）を参照されたい）。 For detection, the probe can be labeled, i.e., linked directly or indirectly to a detectable molecular moiety or compound that leads to a detectable signal. Direct labeling is through bonds or interactions that link the label to the probe, including covalent and non-covalent interactions (eg, hydrogen bonding, hydrophobic and ionic interactions), or through the formation of chelates or coordination complexes. Can occur. Indirect labeling occurs through the use of a bridging moiety (“linker”) that can link the label to the probe and amplify the detectable signal (eg, PCT WO 95/16055 (Urdea et al.)). See). Labels are known and include, for example, radionuclides, ligands (eg biotin, avidin), enzymes and / or enzyme substrates, reactive groups, redox active moieties such as transition metals (eg Ru), chromophores (eg detectable) Color-providing moieties), luminescent compounds (eg, bioluminescent, phosphorescent or chemiluminescent labels) and fluorescent compounds. One skilled in the art will recognize that the labeled probe can be a mixture of labeled and unlabeled oligonucleotides that specifically hybridize to the target sequence to optimize the specific activity of the probe reagent for detection. You will recognize. In some embodiments, the label on the probe is detectable in a homogeneous assay system, i.e., the bound labeled probe detects in the mixture, such as stability or differential degradation, compared to unbound labeled probe. Show possible changes. Preferred labels for use in homogeneous assays are chemiluminescent compounds (US Pat. Nos. 5,656,207 (Woodhead et al.), 5,658,737 (Nelson et al.), And 5,639,604 ( Arnold, Jr. et al.)). Preferred chemiluminescent labels include acridinium ester (“AE”) compounds, which are standard AE or derivatives thereof (eg, naphthyl-AE, ortho-AE, 1- or 3-methyl-AE, 2, 7-dimethyl-AE, 4,5-dimethyl-AE, ortho-dibromo-AE, ortho-dimethyl-AE, meta-dimethyl-AE, ortho-methoxy-AE, ortho-methoxy (cinnamyl) -AE, ortho-methyl -AE, ortho-fluoro-AE, 1- or 3-methyl-ortho-fluoro-AE, 1- or 3-methyl-meta-difluoro-AE, and 2-methyl-AE). Methods for attaching labels to nucleic acids and detecting labels are known in the art (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Chapter 10; US Pat. Nos. 5,658,737 (Nelson et al.), 5,656,207 (Woodhead et al.), 5,547,842 (Hogan et al.), And 5,283. , 174 (Arnold, Jr. et al.) And PCT No. WO9802582 (Becker)).

本発明の方法は、所望により、増幅前に他の試料構成要素からＨＩＶ−１標的核酸を精製する工程を含むことが可能である。「精製」によって、標的が生物学的試料の１以上の構成要素（例えば他の核酸、タンパク質、炭水化物または脂質）から分離されていることを意味する。好ましくは、精製工程は、少なくとも約７０％、そしてより好ましくは約９０％以上の他の試料構成要素を除去する。こうした精製工程が含まれる態様において、ＨＩＶ−１標的核酸は、先に詳細に記載されるように（ＰＣＴ第ＷＯ９８／５０５８３号）、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて、ＨＩＶ−１標的配列を固定（すなわち固体支持体に付着した）オリゴマーに特異的に連結する、「捕捉オリゴマー」にハイブリダイズされる。この工程は、他の試料構成要素からの標的の迅速な分離を可能にする、２溶液相ハイブリダイゼーション（捕捉オリゴマーおよび標的のハイブリダイゼーション、その後、固定オリゴマーへの標的：捕捉オリゴマー複合体のハイブリダイゼーション、標的：捕捉オリゴマー：固定オリゴマー複合体を生じる）を伴うため、好適である。 The methods of the invention can optionally include the step of purifying the HIV-1 target nucleic acid from other sample components prior to amplification. By “purification” is meant that the target has been separated from one or more components of a biological sample (eg, other nucleic acids, proteins, carbohydrates or lipids). Preferably, the purification step removes at least about 70%, and more preferably about 90% or more of other sample components. In embodiments involving such purification steps, the HIV-1 target nucleic acid is immobilized (ie, based on nucleic acid hybridization (ie, as described in detail above (PCT WO 98/50583)). It is hybridized to a “capture oligomer” that specifically links to the oligomer (attached to the solid support). This step allows for rapid separation of the target from other sample components, two solution phase hybridization (capture oligomer and target hybridization, followed by target: capture oligomer complex hybridization to immobilized oligomer). , Resulting in a target: capture oligomer: fixed oligomer complex).

「本質的にからなる」によって、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させない、さらなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物あるいは単数または複数の方法工程が、本発明の組成物または方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、試料に存在するＨＩＶ−１配列を増幅し、そして検出する能力が含まれる。 By “consisting essentially of” additional singular or plural components, singular or plural compositions or singular or plural method steps that do not substantially alter the basic and novel characteristics of the present invention It means that it may be included in the composition or method of the invention. Such properties include the ability to amplify and detect HIV-1 sequences present in the sample.

別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての科学的および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に用いる多くの用語の一般的な定義は、例えば、ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，１９９４，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）に提供される。別に言及しない限り、本明細書に使用されるかまたは意図される技術は、一般の当業者の１人に公知の標準的方法である。実施例は、好ましい態様のいくつかを例示する。 Unless defined otherwise, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the relevant art. General definitions of many terms used herein are provided, for example, in Dictionary of Microbiology and Molecular Biology , 2nd edition (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY). Unless stated otherwise, the techniques used or intended herein are standard methods known to one of ordinary skill in the art. The examples illustrate some of the preferred embodiments.

本発明には、ヒト生物学的試料に存在するＨＩＶ−１核酸を検出するための核酸オリゴマーおよび方法が含まれる。増幅オリゴマーとして使用するのに適したＤＮＡ配列を決定するため、同一または同様の配列領域をマッチングすることによって、一般的には既知のサブタイプのものであり、そして公的にアクセス可能なデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能な部分的または相補的配列が含まれる、既知のＨＩＶ−１配列を並列させ、そして公知の分子生物学的技術を用いて比較した。アルゴリズムの使用は、配列比較を容易にすることが可能であるが、当業者は、アルゴリズムの助けを借りず、容易にこうした比較を行うことが可能である。オリゴマー配列が既知の薬剤耐性突然変異を含有せず、オリゴマーの組み合わせが各々、約３００から６００ｎｔを増幅し、オリゴマーが、核酸構造を予測する公知の方法に基づいて予測される二次構造を最小限しか含有せず、配列が既知の多型塩基（サブタイプ内またはサブタイプ間多型）をほとんど含有せず、そして多型が生じる残基に関しては、比較される配列の大部分において、その位で見出される塩基または塩基類似体（例えばネブラリン）をその位で用いることを条件として、ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の一部を増幅するであろう、増幅オリゴマーを設計した（ＨＩＶ−１ＨＸＢ２、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＫＯ３４５５に基づく）。増幅オリゴマーを設計する際に用いた配列比較は、一般的に：ｇａｇ領域に関しては、２２のサブタイプＡ、４１のサブタイプＢ、１２のサブタイプＣ、１１のサブタイプＤ、６のサブタイプＦ、４のサブタイプＧ、３のサブタイプＨ、および２のサブタイプＪ配列；プロテアーゼ領域に関しては、２２−３４のサブタイプＡ、３６−４１のサブタイプＢ、１５のサブタイプＤ、２６のサブタイプＦ、および８のサブタイプＧ配列；そしてＲＴ領域に関しては、３２−４４のサブタイプＡ、３８−４６のサブタイプＢ、２４のサブタイプＣ、９−１５のサブタイプＤ、５−２６のサブタイプＦ、および８のサブタイプＧ配列であった。 The present invention includes nucleic acid oligomers and methods for detecting HIV-1 nucleic acid present in human biological samples. To determine a DNA sequence suitable for use as an amplification oligomer, a database of commonly known subtypes and publicly accessible by matching identical or similar sequence regions ( For example, known HIV-1 sequences, including partial or complementary sequences available from GenBank) were juxtaposed and compared using known molecular biology techniques. The use of algorithms can facilitate sequence comparisons, but those skilled in the art can easily make such comparisons without the aid of algorithms. The oligomer sequences do not contain known drug resistance mutations, each combination of oligomers amplifies approximately 300 to 600 nt, and the oligomers minimize the predicted secondary structure based on known methods of predicting nucleic acid structure Contains only limited polymorphic bases (intra-subtype or intersubtype polymorphism) and the residues where the polymorphism occurs, in most of the compared sequences, An amplification oligomer was designed (HIV-1 HXB2) that would amplify a portion of the HIV-1 gag and pol genes, provided that a base or base analog (eg, nebulaline) found at that position is used at that position. , Based on GenBank deposit number KO3455). The sequence comparisons used in designing amplification oligomers are generally: for the gag region, 22 subtypes A, 41 subtypes B, 12 subtypes C, 11 subtypes D, 6 subtypes F, 4 subtype G, 3 subtype H, and 2 subtype J sequences; with respect to the protease region, 22-34 subtype A, 36-41 subtype B, 15 subtype D, 26 Subtype F and 8 subtype G sequences; and for the RT region, 32-44 subtype A, 38-46 subtype B, 24 subtype C, 9-15 subtype D, 5 -26 subtype F and 8 subtype G sequences.

増幅された配列内に生じるものに相補的な配列に関して選択して、プローブオリゴマーを同様に設計した。公知の合成法を用いて、ＤＮＡオリゴマーを合成し、そして増幅またはプローブオリゴマーとしての有効性に関して試験した。標識プローブは、実質的に米国特許第５，６３９，６０４号（１０欄６行から１１欄３行、および実施例８を参照されたい）に詳細に記載されるように、リンカーを介して付着させたＡＥ化合物で標識した。オリゴマーの有効性を、本明細書に記載する増幅および検出系で試験し、そしていくつかの場合、例えば１以上の残基を変化させるか、塩基類似体を置換するか、あるいはオリゴマー主鎖の一部またはすべてを修飾する（例えばＤＮＡに対して２’−Ｏ−メチルＲＮＡを置換する）ことによって、オリゴマー配列を修飾して、増幅または検出を最適にした。 Probe oligomers were similarly designed with selections for sequences complementary to those occurring within the amplified sequence. DNA oligomers were synthesized using known synthetic methods and tested for effectiveness as amplification or probe oligomers. The labeled probe is attached via a linker, substantially as described in detail in US Pat. No. 5,639,604 (see column 10, line 6 to column 11, line 3, and Example 8). Labeled with the AE compound. The effectiveness of the oligomer is tested with the amplification and detection systems described herein, and in some cases, for example, changing one or more residues, substituting base analogs, or of the oligomer backbone The oligomer sequence was modified to optimize amplification or detection by modifying some or all (eg, substituting 2′-O-methyl RNA for DNA).

これらの解析に基づいて、本明細書に記載する増幅オリゴヌクレオチドを同定した。増幅オリゴヌクレオチドには、所望により、増幅された標的配列から転写物を産生するためのプロモーター配列が含まれることが可能であり、そして好ましいＴ７プロモーター配列を配列番号１から配列番号４に示す。Ｔ７プロモーター配列が含まれる増幅オリゴマーに関しては、プライマー配列は、Ｔ７プロモーター配列を含み（配列番号５から配列番号１０および配列番号３３から配列番号４５）、そしてＴ７プロモーター配列を含まず（配列番号１１から配列番号１６および配列番号４６から配列番号５８）示している。当業者は、プロモーター配列を含むまたは含まない、ＨＩＶ−１に特異的な増幅オリゴマーが、適切な増幅条件下で、プライマーとして有用である可能性があると認識するであろう。 Based on these analyses, the amplification oligonucleotides described herein were identified. Amplification oligonucleotides can optionally include a promoter sequence for producing transcripts from the amplified target sequence, and preferred T7 promoter sequences are shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. For amplification oligomers that include a T7 promoter sequence, the primer sequence includes a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 45) and does not include a T7 promoter sequence (from SEQ ID NO: 11). SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 58). Those skilled in the art will recognize that amplification oligomers specific for HIV-1 with or without promoter sequences may be useful as primers under appropriate amplification conditions.

図１および２を参照すると、上部は、ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇおよびｐｏｌ領域（ｇａｇおよびｐｏｌと標示する、重複する斜線領域）を例示し、そして下部は、増幅プライマーを用いて増幅される領域（Ｇａｇ１、Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４と下に標示する二重線）のおよそのサイズおよび位置を示す。これらの増幅される領域には特徴が含まれ：Ｇａｇ１はＧａｇＰ２４およびＧａｇＰ１７間の切断部位を含有し；Ｇａｇ２は他のＧａｇ切断部位を含有し；ＰｒｔはＧａｇの３’端の２つの切断部位、プロテアーゼ領域、並びにプロテアーゼおよび逆転写酵素（ＲＴ）間の切断部位を含有し；ＲＴ１はＲＴの４１および１９０間のコドンを含有し；ＲＴ３はＲＴの２００および３５０間のコドンを含有し；そしてＲＴ４はＲＴの３’端のコドン、並びにＲＴおよびＲＮアーゼＨ間の切断部位を含有する。図１および２は、増幅される領域の相対サイズおよび位置を例示するが、増幅される領域の絶対サイズは、用いる増幅オリゴマーの特定の組み合わせに応じて、わずかに変化する可能性がある。例えば、配列番号５および配列番号１７の配列を有するプライマーを用いて増幅されるＧａｇ配列は、２６０ｎｔ増幅産物（Ｇａｇ１）を産生し、そして配列番号６および配列番号１８は、４１５ｎｔ増幅産物（Ｇａｇ２）を産生する。配列番号７および配列番号１９の配列を有するプライマーを用いて増幅されるプロテアーゼ（Ｐｒｔ）領域は、５７４ｎｔ増幅産物を産生する。ｐｏｌ遺伝子の３つの逆転写酵素（ＲＴ）配列は：５３２ｎｔ産物（ＲＴ１）を産生する配列番号８および配列番号２０、４６４ｎｔ産物（ＲＴ３）を産生する配列番号９および配列番号２１、並びに３８４ｎｔ産物（ＲＴ４）を産生する配列番号１０および配列番号２２の配列を有するプライマーを用いる増幅から生じる。関連増幅オリゴマー配列の他の組み合わせを同様に用いて、例えば：Ｇａｇ１に関して（配列番号３３および配列番号１７または配列番号５９）、Ｇａｇ２に関して（配列番号３４または配列番号３６および配列番号６０）、Ｐｒｔに関して（配列番号３７または配列番号３８および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２）、ＲＴ１に関して（配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５）、ＲＴ３に関して（配列番号４２または配列番号４３および配列番号６６）、そしてＲＴ４に関して（配列番号４４または配列番号４５および配列番号６７または配列番号６８）、これらの領域を増幅することが可能である。好ましい態様において、配列番号１８から配列番号２２、および配列番号３５の増幅オリゴマーには、１以上の５’残基の主鎖に関して、好ましくは残基１から４に関して、２’−Ｏ−メトキシ連結が含まれる。 Referring to FIGS. 1 and 2, the upper portion illustrates the gag and pol regions of the HIV-1 genome (overlapping hatched regions labeled gag and pol), and the lower portion is the region that is amplified using amplification primers. Approximate sizes and positions are shown (Gag1, Gag2, Prt, RT1, RT3 and RT4 and the double line labeled below). These amplified regions include features: Gag1 contains the cleavage site between Gag P24 and Gag P17; Gag2 contains the other Gag cleavage sites; Prt is the two cleavages at the 3 ′ end of Gag. Contains a site, a protease region, and a cleavage site between the protease and reverse transcriptase (RT); RT1 contains a codon between RT 41 and 190; RT3 contains a codon between RT 200 and 350; And RT4 contains a codon at the 3 ′ end of RT and a cleavage site between RT and RNase H. 1 and 2 illustrate the relative size and location of the amplified region, but the absolute size of the amplified region can vary slightly depending on the particular combination of amplification oligomers used. For example, a Gag sequence that is amplified using primers having the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 17 produces a 260 nt amplification product (Gag1), and SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 18 are 415 nt amplification products (Gag2) Produce. A protease (Prt) region that is amplified using primers having the sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 19 produces a 574 nt amplification product. The three reverse transcriptase (RT) sequences of the pol gene are: SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 20, which produce a 532 nt product (RT1), SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 21, which produce a 464 nt product (RT3), and a 384 nt product ( Resulting from amplification with primers having the sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 22 producing RT4). Other combinations of related amplification oligomer sequences are used as well, for example: for Gag1 (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 59), for Gag2 (SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 60), for Prt (SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 61 or SEQ ID NO: 62) for RT1 (SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64 or sequence) No. 65), for RT3 (SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 66) and for RT4 (SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 67 or SEQ ID NO: 68), these regions can be amplified It is. In a preferred embodiment, the amplification oligomers of SEQ ID NO: 18 to SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 35 are 2′-O-methoxy linked with respect to the backbone of one or more 5 ′ residues, preferably with respect to residues 1 to 4. Is included.

増幅される標的配列の検出のため、増幅される配列に相補的なプローブ配列を設計し、そしてこうしたプローブの好ましい態様は、配列番号２３から配列番号２９、配列番号６９および配列番号７０の配列を有する。より具体的には、配列番号２３のプローブは、Ｇａｇ１増幅産物または単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）にハイブリダイズし、配列番号２４のプローブは、ＨＩＶ−１サブタイプＡテンプレートから産生されるＧａｇ１単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２５および配列番号６９のプローブはＧａｇ２単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２６のプローブはＰｒｔ単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２７および配列番号７０のプローブはＲＴ１単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２８のプローブはＲＴ３単位複製配列にハイブリダイズし、そして配列番号２９のプローブはＲＴ４単位複製配列にハイブリダイズする。いかなる主鎖を用いて、プローブオリゴマーの塩基配列を連結することも可能であり、そしていくつかの態様には、例えば配列番号２４から配列番号２９、配列番号６９および配列番号７０に関して、１以上の２’−Ｏ−メトキシ連結が含まれる。標識プローブとして用いる際、プローブオリゴマーには、いかなる既知の検出可能標識または検出可能シグナルの産生を導く標識が含まれることも可能である。いくつかの態様において、プローブオリゴマーは、先に記載されるように（米国特許第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．ら））、リンカーを介してアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識する。例えば、プローブのいくつかの態様は、以下のように標識する：配列番号２３、残基９および１０の間、配列番号２４、残基１０および１１の間、配列番号２５、残基１７および１８の間、配列番号２６、残基９および１０の間、配列番号２７、残基１６および１７の間、配列番号２８、残基９および１０の間、配列番号２９、残基１０および１１の間、配列番号６９、残基１１および１２の間、並びに配列番号７０、残基１１および１２の間。 For detection of the amplified target sequence, a probe sequence complementary to the amplified sequence is designed, and preferred embodiments of such probes are the sequences of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 70. Have. More specifically, the probe of SEQ ID NO: 23 hybridizes to a Gag1 amplification product or amplicon, and the probe of SEQ ID NO: 24 is a Gag1 amplicon produced from an HIV-1 subtype A template. The probes of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 69 hybridize to the Gag2 amplicon, the probe of SEQ ID NO: 26 hybridizes to the Prt amplicon, and the probes of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 70 are RT1 Hybridizes to an amplicon, the probe of SEQ ID NO: 28 hybridizes to the RT3 amplicon and the probe of SEQ ID NO: 29 hybridizes to the RT4 amplicon. Any backbone can be used to link the base sequences of the probe oligomers, and in some embodiments, for example with respect to SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 70, one or more A 2'-O-methoxy linkage is included. When used as a labeled probe, probe oligomers can include any known detectable label or label that leads to the production of a detectable signal. In some embodiments, the probe oligomer is labeled with an acridinium ester (AE) compound via a linker, as described previously (US Pat. No. 5,639,604 (Arnold, Jr. et al.)). To do. For example, some embodiments of the probe are labeled as follows: SEQ ID NO: 23, between residues 9 and 10, SEQ ID NO: 24, between residues 10 and 11, SEQ ID NO: 25, residues 17 and 18 Between SEQ ID NO: 26, residues 9 and 10, SEQ ID NO: 27, between residues 16 and 17, SEQ ID NO: 28, between residues 9 and 10, SEQ ID NO: 29, between residues 10 and 11 , SEQ ID NO: 69, between residues 11 and 12, and SEQ ID NO: 70, between residues 11 and 12.

捕捉オリゴマーを用いて、他の試料構成要素からＨＩＶ−１標的を精製する態様では、捕捉オリゴマー配列は、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２の組み合わせであった。これらの捕捉プローブには、ＨＩＶ−１配列（ｐｏｌまたはＬＴＲ配列）と特異的にハイブリダイズする配列の５’部分および固体支持体（例えば常磁性粒子）上の相補的固定オリゴマー（ｄＴ_１４）とハイブリダイズする３’ポリＡ「テール」部分が含まれる。当業者は、ポリ−ｄＡテールの代わりに、相補的固定配列に結合する、いかなる３’部分を用いてもよく、そしてハイブリダイゼーションを可能にするいかなる主鎖を用いて、捕捉オリゴマーの塩基配列を連結してもよいことを認識するであろう。 In embodiments where the capture oligomer was used to purify the HIV-1 target from other sample components, the capture oligomer sequence was a combination of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32. These capture probes include a 5 ′ portion of a sequence that specifically hybridizes with the HIV-1 sequence (pol or LTR sequence) and a complementary immobilized oligomer (dT ₁₄ ) on a solid support (eg, paramagnetic particles). A hybridizing 3 ′ poly A “tail” portion is included. One skilled in the art may use any 3 'moiety that binds to a complementary fixation sequence in place of the poly-dA tail, and use any backbone that allows for hybridization to determine the base sequence of the capture oligomer. It will be appreciated that they may be linked.

これらの構成要素を用いて、生物学的試料におけるＨＩＶ−１配列を検出するアッセイには、所望により、１以上の捕捉オリゴマーを用いて、試料から標的ＨＩＶ−１核酸を精製し、少なくとも２つのプライマーを用いて、好ましくは転写仲介増幅反応を用いることによって、標的ＨＩＶ−１領域を増幅し、そして増幅された核酸に特異的にハイブリダイズする１以上のプローブと、増幅された核酸とをハイブリダイズさせることによって、増幅された核酸を検出する工程が含まれる。検出工程が標識プローブを用いるならば、結合した標識プローブから生じるシグナルを検出する。検出工程が固体支持体に付着したプローブアレイ（「ＤＮＡチップ」）へのハイブリダイゼーションを用いるならば、増幅された産物に特異的に結合するプローブ位置を検出するため、増幅産物を、ＤＮＡチップにハイブリダイズさせる前に、標識することが可能である。単位複製配列は、増幅工程の一部として、または増幅後に標識可能である。増幅後に単位複製配列を標識するのに好ましい方法はまた、ＤＮＡチップ上での検出のため、産物をより小さい部分に寸断する（詳細に関しては、ＰＣＴ第ＷＯ００／６５９２６号およびＰＣＴ第ＰＣＴ／ＩＢ９９／０２０７３号を参照されたい）。 With these components, assays for detecting HIV-1 sequences in biological samples optionally purify target HIV-1 nucleic acid from the sample using one or more capture oligomers, and at least two One or more probes that specifically amplify the target HIV-1 region and specifically hybridize to the amplified nucleic acid are hybridized with the amplified nucleic acid using primers, preferably by using a transcription-mediated amplification reaction. A step of detecting the amplified nucleic acid by making it soy is included. If the detection step uses a labeled probe, the signal generated from the bound labeled probe is detected. If the detection step uses hybridization to a probe array (“DNA chip”) attached to a solid support, the amplified product is applied to the DNA chip to detect probe positions that specifically bind to the amplified product. It is possible to label before hybridization. The amplicon can be labeled as part of the amplification step or after amplification. Preferred methods for labeling amplicons after amplification also shred the product into smaller portions for detection on a DNA chip (for details see PCT WO 00/65926 and PCT No. PCT / IB99 / No. 02073).

増幅前に、所望による精製工程を用いる場合、好ましくは、ＰＣＴ第ＷＯ９８／５０５８３号に記載される２工程ハイブリダイゼーション法を用いることによるなど、最小限の取り扱い工程を用いて、単一反応容器中で行う。簡潔には、第一のハイブリダイズ条件下で、ＨＩＶ−１標的核酸を含有する試料に捕捉オリゴマーを添加し、ここで捕捉オリゴマーの１つの部分がＨＩＶ−１標的配列に特異的にハイブリダイズし、捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１ＲＮＡ複合体を生じる。その後、第二のハイブリダイズ条件下で、捕捉プローブの第二の部分が、磁気ビーズなどの固体支持体上に固定した相補的オリゴマー配列にハイブリダイズし、固定オリゴマー：捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１ＲＮＡ複合体を生じる。どちらのハイブリダイゼーション条件でも、試料は、塩、界面活性剤および緩衝剤（例えば４００ｍＭＨＥＰＥＳ、１−１０％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、２４０−８３２ｍＭＬｉＯＨ、０−７８３ｍＭＬｉＣｌ、ｐＨ７．６−８．０）、捕捉オリゴマー（類）、および固体粒子上の固定オリゴマーの混合物中にあり、そして２つの異なるハイブリダイゼーション条件は、第一および第二の温度でインキュベーションすることによって得られる。その後、付着した固定オリゴマー：捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１ＲＮＡ複合体を含む固体支持体を、他の試料構成要素から物理的に分離して、標的ＨＩＶ−１ＲＮＡを精製する。付着した核酸複合体を含む固体支持体は、標準的方法を用いて洗浄し（例えば核酸複合体がハイブリダイズしたままであることを可能にする条件下で、緩衝水性溶液でリンスして）、ＨＩＶ−１ＲＮＡをさらに精製することが可能である。磁気粒子が固体支持体である場合、物理的分離は、容器に磁場を適用することによって、容易に達成可能である。精製後、支持体に付着したＨＩＶ−１ＲＮＡ含有複合体は、増幅に直接使用可能である。 When using optional purification steps prior to amplification, preferably in a single reaction vessel with minimal handling steps, such as by using the two-step hybridization method described in PCT WO 98/50583. To do. Briefly, under a first hybridization condition, a capture oligomer is added to a sample containing an HIV-1 target nucleic acid, where one portion of the capture oligomer specifically hybridizes to the HIV-1 target sequence. , Yielding a capture oligomer: HIV-1 RNA complex. Thereafter, under the second hybridization conditions, the second portion of the capture probe hybridizes to a complementary oligomer sequence immobilized on a solid support such as a magnetic bead, and the immobilized oligomer: capture oligomer: HIV-1 RNA. This produces a complex. Under both hybridization conditions, the samples were prepared from salts, detergents and buffers (eg, 400 mM HEPES, 1-10% lithium lauryl sulfate (LLS), 240-832 mM LiOH, 0-783 mM LiCl, pH 7.6-8. 0), capture oligomer (s), and a mixture of immobilized oligomers on solid particles, and two different hybridization conditions are obtained by incubating at first and second temperatures. The solid support containing the attached immobilized oligomer: capture oligomer: HIV-1 RNA complex is then physically separated from other sample components to purify the target HIV-1 RNA. The solid support containing the attached nucleic acid complex is washed using standard methods (eg, rinsed with a buffered aqueous solution under conditions that allow the nucleic acid complex to remain hybridized); HIV-1 RNA can be further purified. If the magnetic particles are a solid support, physical separation can be easily achieved by applying a magnetic field to the vessel. After purification, the HIV-1 RNA-containing complex attached to the support can be used directly for amplification.

２以上の増幅オリゴマーを用いたＨＩＶ−１標的の増幅は、多コピーの標的配列またはその相補体を産生するプライマー伸長に頼る、既知の多様な核酸増幅反応を用いて、達成可能である。１つの態様は、実質的に先に詳細に記載されるような、転写仲介増幅を用いる（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，５５４，５１６号、第５，７６６，８４９号、第５，７８６，１８３号、第５，８２４，５１８号、および第５，８８８，７７９号）。簡潔には、転写仲介増幅は、２つのプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列を含有するプロモーター−プライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ、およびヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を、適切な塩および緩衝剤と共に、溶液中で用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。まず、プロモーター−プライマー（Ｐ１プライマーとも称される）が標的配列に特異的にハイブリダイズし、そして逆転写酵素が、プロモーター−プライマーの３’端の伸長によって、第一鎖ｃＤＮＡを生成し、そしてそのＲＮアーゼＨ活性がＲＮＡ：ｃＤＮＡ複合体中のＲＮＡ標的鎖を消化する。第一鎖ｃＤＮＡは、プロモーター−プライマー配列の３’の位置で第二のプライマー（Ｐ２プライマーとも称される）とハイブリダイズし、そして逆転写酵素が、Ｐ２プライマーの３’端の伸長によって新規ＤＮＡコピーを生成し、それにより一端に機能するプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡを生成する。ＲＮＡポリメラーゼが機能するプロモーター配列に結合し、そして転写して、多数の転写物（増幅産物または単位複製配列）を産生する。各転写物は、別の周期の複製のテンプレートとして働くことが可能であり、すなわちＰ２プライマーが単位複製配列に結合し、そして逆転写酵素がｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡにＰ１プロモーターが結合し、そして逆転写酵素が、一端に機能するプロモーターを持つ二本鎖ＤＮＡを作成し、このプロモーターがＲＮＡポリメラーゼに結合してより多くの転写物を産生する。したがって、実質的に等温の条件下で、転写仲介増幅は多くの単位複製配列、すなわち単一のテンプレートから約１００から約３，０００のＲＮＡ転写物を産生する。実施例に記載する態様は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター配列が含まれるＰ１プロモーター−プライマーを用いるが、当業者は、プロモーター配列およびその対応するＲＮＡポリメラーゼのいかなる組み合わせも使用可能であることを認識するであろう（例えばＴ３ポリメラーゼ）。 Amplification of an HIV-1 target using two or more amplification oligomers can be accomplished using a variety of known nucleic acid amplification reactions that rely on primer extension to produce multiple copies of the target sequence or its complement. One embodiment uses transcription-mediated amplification substantially as described in detail above (US Pat. Nos. 5,399,491, 5,480,784, 5,554,516, 5,766,849, 5,786,183, 5,824,518, and 5,888,779). Briefly, transcription-mediated amplification consists of two primers (one promoter-primer containing a promoter sequence for RNA polymerase), DNA polymerase (reverse transcriptase), RNA polymerase, and nucleoside (deoxyribonucleoside triphosphate, Ribonucleoside triphosphate) is used in solution with appropriate salts and buffers to produce multiple RNA transcripts from the nucleic acid template. First, a promoter-primer (also referred to as P1 primer) specifically hybridizes to the target sequence, and reverse transcriptase generates first strand cDNA by extension of the 3 ′ end of the promoter-primer, and Its RNase H activity digests the RNA target strand in the RNA: cDNA complex. The first strand cDNA hybridizes with a second primer (also called P2 primer) at position 3 ′ of the promoter-primer sequence, and reverse transcriptase becomes a new DNA by extension of the 3 ′ end of the P2 primer. A copy is generated, thereby generating double stranded DNA having a promoter sequence that functions at one end. RNA polymerase binds to a functioning promoter sequence and transcribes to produce multiple transcripts (amplified products or amplicons). Each transcript can serve as a template for another cycle of replication, i.e., a P2 primer binds to the amplicon and reverse transcriptase generates cDNA, to which the P1 promoter binds, The reverse transcriptase then creates a double-stranded DNA having a promoter that functions at one end, and this promoter binds to RNA polymerase to produce more transcripts. Thus, under substantially isothermal conditions, transcription-mediated amplification produces many amplicons, ie, about 100 to about 3,000 RNA transcripts from a single template. The embodiments described in the examples use a P1 promoter-primer that includes a promoter sequence recognized by T7 RNA polymerase, but one skilled in the art will recognize that any combination of promoter sequence and its corresponding RNA polymerase can be used. You will recognize (eg T3 polymerase).

転写仲介増幅のための増幅反応混合物は、一般的に、１−２．５ｍＭＭｇ^＋２、１８−４０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５−３．５ｍＭＡＴＰ、１．７５−７．０ｍＭＵＴＰ、５−１６ｍＭＧＴＰ、１．７５−５．６ｍＭＣＴＰ、０．７５ｍＭｄＮＴＰ、２５−３７．５ｍＭＫＣｌ、最適な量の各プライマー、２６００−３０００Ｕ逆転写酵素および２６００−３６００ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する。典型的な反応混合物には、１ｍＭＭｇ^＋２、３２．５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５−１．０ｍＭＡＴＰ、５．０ｍＭＵＴＰ、５−９ｍＭＧＴＰ、５ｍＭＣＴＰ、０．７５ｍＭｄＮＴＰ、３７．５ｍＭＫＣｌ、プライマー、並びに各３０００Ｕの逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。 Amplification reaction mixtures for transcription-mediated amplification are generally 1-2.5 mM Mg ⁺² , 18-40 mM Tris (pH 8), 0.5-3.5 mM ATP, 1.75-7.0 mM UTP, 5 Contains -16 mM GTP, 1.75-5.6 mM CTP, 0.75 mM dNTP, 25-37.5 mM KCl, optimal amounts of each primer, 2600-3000 U reverse transcriptase and 2600-3600 U T7 RNA polymerase. Typical reaction mixtures include 1 mM Mg ⁺² , 32.5 mM Tris (pH 8), 0.5-1.0 mM ATP, 5.0 mM UTP, 5-9 mM GTP, 5 mM CTP, 0.75 mM dNTP, 37.5 mM KCl, primers, and 3000 U of reverse transcriptase and T7 RNA polymerase each are included.

増幅産物の検出は、１以上のプローブ配列への単位複製配列の特異的ハイブリダイゼーションを検出する、いかなる工程も使用可能である。標識プローブが単位複製配列にハイブリダイズするならば、標識は、好ましくは、均質系で検出可能なもの（すなわち、結合したプローブの検出のため、未結合プローブが単位複製配列：プローブ複合体から分離されることを要しないもの）である。いくつかの態様において、標識はＡＥ化合物であり、該化合物から、先に詳細に記載されるように検出される、化学発光シグナルが生じる（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号および第５，６５８，７３７号）。あるいは、単位複製配列またはその断片は、ＤＮＡチップ上のようなプローブアレイにハイブリダイズさせることが可能であり、そして単位複製配列に特異的にハイブリダイズするプローブを検出して、単位複製配列を産生するＨＩＶ−１標的に関する配列情報を提供する。当業者は、１より多い方法を用いて、単一の増幅反応から生じる増幅産物を検出可能であることを認識するであろう。例えば、増幅反応の一部を、陽性または陰性反応を提供する標識プローブハイブリダイゼーション法に供して、反応中のＨＩＶ−１特異的増幅産物の存在または非存在を示し、それによって、試料がＨＩＶ−１に関して陽性であるかまたは陰性であるかを示すことが可能である。陽性に試験された反応に関しては、ＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーションを用いて、増幅反応の別の一部をさらにアッセイして、試料に存在するＨＩＶ−１に関する配列情報を提供し、それによってさらにより詳細な診断情報を提供することが可能である。 Detection of amplification products can use any process that detects specific hybridization of amplicons to one or more probe sequences. If the labeled probe hybridizes to the amplicon, the label is preferably one that is detectable in a homogeneous system (ie, unbound probe is separated from the amplicon: probe complex for detection of bound probe). That do not need to be done). In some embodiments, the label is an AE compound that produces a chemiluminescent signal that is detected as described in detail above (US Pat. Nos. 5,283,174, 5,656). , 744 and 5,658,737). Alternatively, the amplicon or fragment thereof can be hybridized to a probe array, such as on a DNA chip, and a probe that specifically hybridizes to the amplicon is detected to produce an amplicon. Provides sequence information about the HIV-1 target. One skilled in the art will recognize that more than one method can be used to detect the amplification product resulting from a single amplification reaction. For example, a portion of the amplification reaction is subjected to a labeled probe hybridization method that provides a positive or negative reaction to indicate the presence or absence of an HIV-1 specific amplification product in the reaction, whereby the sample is HIV- It is possible to indicate positive or negative for 1. For positively tested reactions, hybridization to a DNA probe array is used to further assay another portion of the amplification reaction to provide sequence information regarding HIV-1 present in the sample, thereby further More detailed diagnostic information can be provided.

開示する増幅オリゴマーを用いることによって増幅されるｇａｇおよびｐｏｌ領域のいずれか１つを検出して、試料に関する診断情報を提供することが可能であるが、１より多い領域の増幅および検出は、例えば薬剤耐性に関連する多数の遺伝子マーカーを検出することによって、潜在的に、より多くの診断情報を提供する。個々のｇａｇおよびｐｏｌ領域は別個に増幅し、そしてその後、検出のため、単位複製配列をプールすることが可能であるが、アッセイを単純にするため、多重反応で、多数の領域を増幅した。すなわち、各多重反応は、多数の増幅オリゴマーを含み、単一反応容器中で多数のＨＩＶ−１標的領域を増幅する。 While any one of the gag and pol regions amplified by using the disclosed amplification oligomers can be detected to provide diagnostic information about the sample, amplification and detection of more than one region can include, for example, Detecting a large number of genetic markers associated with drug resistance potentially provides more diagnostic information. Individual gag and pol regions were amplified separately and then amplicons could be pooled for detection, but to simplify the assay, multiple regions were amplified in a multiplex reaction. That is, each multiplex reaction includes multiple amplification oligomers and amplifies multiple HIV-1 target regions in a single reaction vessel.

多重反応は、それぞれの標的配列へのハイブリダイゼーションに関する増幅オリゴマー間の潜在的な干渉または比較的小さい単位複製配列の産生を回避しながら、多数の標的配列を増幅するように設計した。例えば、図１を参照すると、ＲＴ１およびＲＴ３と標識した標的領域は重複し、ＲＴ３およびＲＴ４標的領域も同様である。したがって、多重反応が、重複する標的用の増幅オリゴマーを含む場合、例えば配列番号９または配列番号１５（ＲＴ３のＰ１プライマー）および配列番号２２（ＲＴ４のＰ２プライマー）の組み合わせの使用から、比較的小さい標的領域が増幅される可能性がある。したがって、多重反応は、多くの診断情報を提供しないが増幅中に基質を消費する、小さい単位複製配列を産生しないであろうプライマーの組み合わせを含むように設計した。（１）１つの容器において、Ｇａｇ１、ＲＴ１およびＲＴ４標的領域を増幅する増幅オリゴマー、並びに別の容器において、Ｇａｇ２、ＰｒｔおよびＲＴ３標的領域を増幅する増幅オリゴマー、（２）１つの容器において、Ｇａｇ１、Ｇａｇ２およびＲＴ３標的領域を増幅する増幅オリゴマー、並びに別の容器において、Ｐｒｔ、ＲＴ１およびＲＴ４標的領域を増幅する増幅オリゴマー（図１に例示される）、並びに（３）１つの容器において、Ｇａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４標的領域を増幅する増幅オリゴマー、並びに別の容器において、Ｇａｇ１、ＰｒｔおよびＲＴ３標的領域を増幅する増幅オリゴマー（図２に例示される）を含む、異なる組み合わせの増幅オリゴマーを多重反応で試験した。これらの多重組み合わせの反応各々は、１ｋｂを超えるＨＩＶ−１標的核酸を増幅し、そして各組み合わせに関して２つの多重反応を組み合わせると、累積して２．５ｋｂを超えるＨＩＶ−１配列が増幅される。 The multiplex reaction was designed to amplify multiple target sequences while avoiding potential interference between amplification oligomers or the production of relatively small amplicons for hybridization to each target sequence. For example, referring to FIG. 1, the target regions labeled RT1 and RT3 overlap, as are the RT3 and RT4 target regions. Thus, if the multiplex reaction includes overlapping amplification oligomers for the target, it is relatively small, eg from the use of the combination of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 15 (RT3 P1 primer) and SEQ ID NO: 22 (RT4 P2 primer) The target region can be amplified. Therefore, the multiplex reaction was designed to include primer combinations that would not provide much diagnostic information but would consume substrate during amplification and would not produce small amplicons. (1) An amplification oligomer that amplifies the Gag1, RT1, and RT4 target regions in one container, and an amplification oligomer that amplifies the Gag2, Prt, and RT3 target regions in another container, (2) Gag1, in one container, An amplification oligomer that amplifies the Gag2 and RT3 target regions, and in another vessel, an amplification oligomer that amplifies the Prt, RT1 and RT4 target regions (illustrated in FIG. 1), and (3) Gag2, RT1 in one vessel Different combinations of amplification oligomers were tested in multiple reactions, including amplification oligomers that amplify the RT4 and RT4 target regions, and amplification oligomers (exemplified in FIG. 2) that amplify the Gag1, Prt, and RT3 target regions in separate containers . Each of these multiple combination reactions amplifies more than 1 kb of HIV-1 target nucleic acid, and the combination of two multiple reactions for each combination amplifies more than 2.5 kb of HIV-1 sequence.

本発明のいくつかの態様は、以下の実施例によって例示される。これらの実施例において、核酸増幅に用いるＨＩＶ−１ＲＮＡは、ウイルスサブタイプＡ、ＢまたはＣに感染したリンパ球培養の上清に存在するウイルス、培養上清から単離した精製ＨＩＶ−１ＲＮＡ、クローニングしたＨＩＶ−１配列から産生した転写物、またはＨＩＶ−１感染患者から得た血漿由来であり、血漿由来の場合、ウイルスサブタイプは、配列決定によって、または血漿中のウイルスのウイルスエンベロープに存在する抗原によって決定した。 Some aspects of the invention are illustrated by the following examples. In these examples, the HIV-1 RNA used for nucleic acid amplification is the virus present in the supernatant of lymphocyte cultures infected with virus subtype A, B or C, purified HIV-1 RNA isolated from the culture supernatant , Transcripts produced from cloned HIV-1 sequences, or plasma from HIV-1 infected patients, where the virus subtype is either by sequencing or in the viral envelope of the virus in the plasma Determined by the antigen present.

実施例１
ＨＩＶ−１の異なるサブタイプからのＧａｇ標的配列の増幅および検出
３つの異なるサブタイプ（Ａ、ＢおよびＣ）由来のＨＩＶ−１ＲＮＡの既知の量を含有する試料を調製し、その後、転写仲介増幅反応において、Ｇａｇ１標的領域に特異的なプライマーを用いて増幅した。増幅後、Ｇａｇ１単位複製配列の２つの異なる標識プローブ、および２つの異なる標識プローブの混合物を用いることによって、増幅産物を検出した。 Example 1
Amplification and detection of Gag target sequences from different subtypes of HIV-1 A sample containing a known amount of HIV-1 RNA from three different subtypes (A, B and C) was prepared and then transcription mediated In the amplification reaction, amplification was performed using a primer specific for the Gag1 target region. After amplification, amplification products were detected by using two different labeled probes of Gag1 amplicon and a mixture of two different labeled probes.

第一の試験では、ＨＩＶ−１サブタイプＢＲＮＡを水と混合して、反応試験管あたり５００コピーを達成し、そしてＨＩＶ−１サブタイプＡウイルス上清を緩衝液（４００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、３５０ｍＭＬｉＯＨ、７８３ｍＭＬｉＣｌ）と混合して、反応試験管あたり５００コピーを達成した。増幅のため、各反応は、反応混合物（４０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１７．５ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、５％ポリビニルピロリドン、各１ｍＭｄＮＴＰ、各４ｍＭｒＮＴＰ）中に、試料、並びに配列番号５（Ｔ７プライマー−プロモーターまたはＰ１プライマー）および配列番号１７（Ｐ２プライマー）を有する増幅オリゴマー各々７．５ｐｍｏｌを含有した。反応混合物を不活性油の層（２００μｌ）で覆って蒸発を防ぎ、そして６０℃で１０−１５分間、そしてその後、４１．５−４２℃で５分間、インキュベーションした。各反応混合物に関して、各々約３０００Ｕの逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを添加し、混合し、そして標的ＨＩＶ−１核酸は、４１．５−４２℃で２時間増幅した。 In the first test, HIV-1 subtype B RNA was mixed with water to achieve 500 copies per reaction tube, and HIV-1 subtype A virus supernatant was buffered (400 mM HEPES, pH 7.6). Mixed with 10% (w / v) lithium lauryl sulfate (LLS), 350 mM LiOH, 783 mM LiCl) to achieve 500 copies per reaction tube. For amplification, each reaction was performed in a reaction mixture (40 mM Tris, pH 7.5, 17.5 mM KCl, 20 mM MgCl ₂ , 5% polyvinyl pyrrolidone, 1 mM dNTP each, 4 mM rNTP each), as well as a sample as well as SEQ ID NO: 5 ( T7 primer-promoter or P1 primer) and amplification oligomers having SEQ ID NO: 17 (P2 primer) each contained 7.5 pmol. The reaction mixture was covered with a layer of inert oil (200 μl) to prevent evaporation and incubated at 60 ° C. for 10-15 minutes and then at 41.5-42 ° C. for 5 minutes. For each reaction mixture, approximately 3000 U of reverse transcriptase and T7 RNA polymerase each were added, mixed, and the target HIV-1 nucleic acid was amplified at 41.5-42 ° C. for 2 hours.

増幅後、増幅されたＧａｇ標的領域は、配列番号２３、配列番号２４を有するＡＥ標識プローブ、またはこれらのプローブの混合物（各０．０５−０．１ｐｍｏｌ）を用いることによって検出し、そして先に記載される方法（米国特許第５，６５８，７３７号、第２５欄、２７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：８４２９−８４３８の８４３２）を用いて、結合したプローブからの化学発光を検出した。検出した化学発光は、相対光単位（ＲＬＵ）で表した。陰性対照は同様に処理したが、ＨＩＶ−１標的核酸をまったく含有しなかった。 After amplification, the amplified Gag target region is detected by using SEQ ID NO: 23, an AE labeled probe having SEQ ID NO: 24, or a mixture of these probes (each 0.05-0.1 pmol) and Chemiluminescence from bound probes using the method described (US Pat. No. 5,658,737, column 25, lines 27-46; Nelson et al., 1996, Biochem. 35: 8429-8438). Was detected. The detected chemiluminescence was expressed in relative light units (RLU). The negative control was treated in the same way but did not contain any HIV-1 target nucleic acid.

表１は、各プローブに関して検出されたＲＬＵ結果を示す（「プローブ混合物」に関して、陰性対照アッセイが１回であったのを例外として、三つ組アッセイの平均）。これらの結果は、Ｇａｇ１標的領域用の増幅オリゴマーを用いて、ＨＩＶ−１の両方のサブタイプが増幅されたが、配列番号２３のプローブは、サブタイプＢから増幅されたＧａｇ１産物のみを検出し、一方、配列番号２４のプローブは、サブタイプＡおよびＢから増幅された産物両方を検出したことを示す。プローブ混合物を用いて得た結果は、２つのサブタイプ用の個々のプローブで得た結果を付加したものに見える。 Table 1 shows the RLU results detected for each probe (average of triplicate assays with the exception of one negative control assay for “probe mixture”). These results show that both subtypes of HIV-1 were amplified using amplification oligomers for the Gag1 target region, but the probe of SEQ ID NO: 23 detected only the Gag1 product amplified from subtype B. On the other hand, the probe of SEQ ID NO: 24 indicates that both amplified products from subtypes A and B were detected. The results obtained with the probe mixture appear to add the results obtained with the individual probes for the two subtypes.

表１：ＨＩＶ−１サブタイプＡおよびサブタイプＢＧａｇ１標的領域の増幅および検出（ＲＬＵ）Table 1: Amplification and detection (RLU) of HIV-1 subtype A and subtype B Gag1 target regions

別の試験において、反応あたり２５０、５０または２５コピーのウイルスＲＮＡのＨＩＶ−１サブタイプＡ、ＢおよびＣを用いて、そしてプローブ混合物（配列番号２３および配列番号２４）を用いて、同様のアッセイを行った。サブタイプＢおよびＣに関しては、ＨＩＶ−１ＲＮＡが標的であり、そしてサブタイプＡに関してはウイルス上清が標的核酸を含有した。表２は、この試験の結果を示す（各条件に関して６試料の平均ＲＬＵ）。陰性対照、すなわちＨＩＶ−１標的が存在しないものは、１．３７ｘ１０^４ＲＬＵを生じた（二つ組アッセイの平均）。 In another test, a similar assay using 250, 50, or 25 copies of viral RNA HIV-1 subtypes A, B, and C per reaction and using a probe mixture (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24). Went. For subtypes B and C, HIV-1 RNA was the target, and for subtype A, the viral supernatant contained the target nucleic acid. Table 2 shows the results of this test (average RLU of 6 samples for each condition). The negative control, i.e. the absence of HIV-1 target, yielded 1.37 x 10 < ⁴ > RLU (average of duplicate assays).

表２：標識プローブ混合物を用いることによる、増幅されたＧａｇ１標的領域の検出Table 2: Detection of amplified Gag1 target region by using labeled probe mixture

これらの結果は、増幅オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ−１サブタイプＡ、ＢおよびＣに関してＧａｇ１標的領域を増幅し、そして増幅された配列をプローブが検出したことを示す。アッセイ系は、すべてのサブタイプに関して、少なくとも標的５０コピーの感度を有した。反応あたり２５コピーの標的では、反応の少なくとも半数で、すべてのサブタイプが増幅され、そして検出された（陰性対照より、少なくとも１０倍多いＲＬＵを生じた）（データ未提示）。これらの結果は、本発明の方法を用い、生物学的試料において、ＨＩＶ−１が容易に検出可能であることを示す。 These results indicate that the amplification oligonucleotides amplified the Gag1 target region for HIV-1 subtypes A, B, and C, and the probe detected the amplified sequence. The assay system had a sensitivity of at least 50 copies of target for all subtypes. At 25 copies of target per reaction, all subtypes were amplified and detected in at least half of the reactions (resulting at least 10-fold more RLU than the negative control) (data not shown). These results show that HIV-1 can be easily detected in biological samples using the method of the present invention.

増幅される他の個々の標的配列（Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４）各々の増幅オリゴマーの組み合わせを用いて、同様の実験を行った。プローブオリゴマーはまた、同様の均質検出アッセイで、それぞれの標的各々に特異的にハイブリダイズして、増幅反応で生じる増幅された産物の量に比例した、検出可能発光シグナルを生じた。 Similar experiments were performed using combinations of amplification oligomers for each of the other individual target sequences to be amplified (Gag2, Prt, RT1, RT3 and RT4). The probe oligomers also hybridized specifically to each respective target in a similar homogeneous detection assay, yielding a detectable luminescent signal proportional to the amount of amplified product generated in the amplification reaction.

実施例２
サブタイプＡ、ＢおよびＣのＨＩＶ−１標的配列検出の感度
本実施例は、増幅オリゴマーが、世界中で最も蔓延しているＨＩＶ−１の３つのサブタイプである、サブタイプＡ、Ｂ、およびＣから、標的配列を効率的に増幅可能であることを示す。これらの実験において、ウイルスＲＮＡ、クローニングしたＨＩＶ−１配列からのＲＮＡ転写物または血漿に存在するウイルスから得たＨＩＶ−１標的ＲＮＡを、反応あたり２５、５０、１００、２５０、５００または１０００コピーで、転写仲介増幅反応に用いた。個々の標的配列（Ｇａｇ１、Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４）を別個の反応で増幅し、そして実質的に実施例１に記載した条件を用いて、ＡＥ標識プローブとのハイブリダイゼーションによって検出した。これらの実験のいくつかの結果（各サブタイプに関するＲＬＵ）を表３に示す（１回の試験からの結果である、血漿ウイルス検出に関して報告したＰｒｔ結果を例外として、少なくとも三つ組反応から得た平均ＲＬＵを報告する）。感度は、増幅した試料に存在する標的（ウイルス（「Ｖ」）、転写物（「Ｔ」）または感染血漿（「Ｐ」）の異なる供給源に関する）のコピー数によって示す。 Example 2
Sensitivity of HIV-1 target sequence detection of subtypes A, B and C This example demonstrates that amplification oligomers are the three most prevalent HIV-1 subtypes in the world, subtypes A, B, And C show that the target sequence can be efficiently amplified. In these experiments, viral RNA, RNA transcripts from cloned HIV-1 sequences or HIV-1 target RNA obtained from virus present in plasma at 25, 50, 100, 250, 500 or 1000 copies per reaction. Used for transcription-mediated amplification reaction. Individual target sequences (Gag1, Gag2, Prt, RT1, RT3 and RT4) were amplified in separate reactions and detected by hybridization with an AE labeled probe substantially using the conditions described in Example 1. . Some results of these experiments (RLU for each subtype) are shown in Table 3 (average from at least triplicate reactions, with the exception of the Prt results reported for plasma virus detection, which are the results from one study). Report RLU). Sensitivity is indicated by the copy number of the target (for different sources of virus (“V”), transcript (“T”) or infected plasma (“P”)) present in the amplified sample.

表３：ＡＥ標識プローブを用いて増幅されたＨＩＶ−１標的領域検出の感度Table 3: Sensitivity of detection of HIV-1 target region amplified using AE-labeled probe

これらの結果は、３つのサブタイプすべてで、検出感度が少なくとも標的１００コピーであり、そしてしばしば１００コピー未満であったことを示す（例えば、３つのサブタイプすべてのＧａｇ１に関してウイルス２５−５０コピー）。他のＨＩＶ−１標的領域に関して同様の結果が得られ（データ未提示）、本発明の増幅オリゴマーおよび検出プローブを用いて行ったアッセイの大部分で、３つのサブタイプに関して、すべて、少なくとも標的２００コピーの検出感度を有した。 These results indicate that for all three subtypes, the detection sensitivity was at least 100 copies of the target and often less than 100 copies (eg, 25-50 copies of virus for all three subtypes of Gag1). . Similar results were obtained for other HIV-1 target regions (data not shown), and for the majority of assays performed using the amplification oligomers and detection probes of the present invention, for all three subtypes, at least target 200 It had a copy detection sensitivity.

実施例３
多重反応中のＨＩＶ−１標的配列の検出
この実験では、各々３つのＨＩＶ−１標的領域を増幅する、２つの別個の多重反応を用いて、個々の標的領域を増幅して検出可能単位複製配列を産生可能であることを示した。各増幅試験管は、２００コピーのＨＩＶ−１サブタイプＢＲＮＡおよび実質的に実施例１に記載するような増幅試薬を含有した。増幅試験管１は、Ｇａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４領域を増幅するプライマー（配列番号６および配列番号１８、配列番号８の３’遮断オリゴマーを含む、配列番号８および配列番号２０、並びに配列番号１０および配列番号２２）を含有した。増幅試験管２は、Ｇａｇ１、ＰｒｔおよびＲＴ３領域を増幅するプライマー（配列番号５および配列番号１７、配列番号７および配列番号１９、並びに配列番号９および配列番号２１）を含有した。これらのプライマー各々の反応あたりの量は、以下のとおりであった：試験管１において、各４ｐｍｏｌの配列番号６、配列番号１０、配列番号１８および配列番号２２、２．４ｐｍｏｌの配列番号８、１２ｐｍｏｌの配列番号２０および９．６ｐｍｏｌの３’遮断配列番号８；そして試験管２において、１ｐｍｏｌの配列番号５、４ｐｍｏｌの配列番号１７、４．５ｐｍｏｌの配列番号７、各５ｐｍｏｌの配列番号９および配列番号１９、並びに９．８５ｐｍｏｌの配列番号２１。反応各組に関して、５つの個別の試験管を調製し、そして増幅した。増幅反応は、実質的に実施例１に記載したように行い、そしてその後、反応の半量（すなわち標的ＨＩＶ−１ＲＮＡ１００コピーから産生される単位複製配列と同等なもの）を検出工程に用いた。 Example 3
Detection of HIV-1 target sequences in multiplex reactions In this experiment, two separate multiplex reactions, each amplifying three HIV-1 target regions, were used to amplify individual target regions to detect detectable amplicons. It was shown that can be produced. Each amplification tube contained 200 copies of HIV-1 subtype B RNA and amplification reagents substantially as described in Example 1. Amplification tube 1 contains primers that amplify the Gag2, RT1 and RT4 regions (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 18, including 3 ′ blocking oligomers of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 10 and sequence Number 22). Amplification tube 2 contained primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 21) for amplifying the Gag1, Prt and RT3 regions. The amount of each of these primers per reaction was as follows: in test tube 1, 4 pmol each of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 22, 2.4 pmol of SEQ ID NO: 8, 12 pmol of SEQ ID NO: 20 and 9.6 pmol of 3 ′ blocking SEQ ID NO: 8; and in test tube 2, 1 pmol of SEQ ID NO: 5, 4 pmol of SEQ ID NO: 17, 4.5 pmol of SEQ ID NO: 7, 5 pmol of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 19, and 9.85 pmol of SEQ ID NO: 21. For each reaction set, 5 individual tubes were prepared and amplified. The amplification reaction was performed substantially as described in Example 1, and then half of the reaction (ie, equivalent to an amplicon produced from 100 copies of target HIV-1 RNA) was used for the detection step.

検出は、実質的に先に記載されるような（米国特許第５，６５８，７３７号、第２５欄、２７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：８４２９−８４３８の８４３２）均質検出アッセイを用い、ＡＥ標識プローブを用いて行い、そして化学発光は、較正した発光測定装置（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ４５０、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、各増幅反応に関して、そして各プローブに関して、ＲＬＵとして検出した。用いた標識プローブ（０．１ｐｍｏｌ／反応）は：Ｇａｇ１を検出する配列番号２４、Ｇａｇ２を検出する配列番号６９、Ｐｒｔを検出する配列番号２６、ＲＴ１を検出する配列番号７０、ＲＴ３を検出する配列番号２８、およびＲＴ４を検出する配列番号２９であった。検出用のプローブの比活性を最適化するため、プローブ試薬は、一般的に、プローブオリゴマー各々に関して、標識および未標識プローブの混合物であった。 Detection is substantially as described previously (US Pat. No. 5,658,737, column 25, lines 27-46; Nelson et al., 1996, Biochem. 35: 8429-8438, 8432). Assays are performed using AE-labeled probes and chemiluminescence is measured for each amplification reaction using a calibrated luminescence measuring device (LEEADER® HC450, Gen-Probe Incorporated, San Diego, Calif.) And for each Regarding the probe, it was detected as RLU. Labeled probes (0.1 pmol / reaction) used were: SEQ ID NO: 24 for detecting Gag1, SEQ ID NO: 69 for detecting Gag2, SEQ ID NO: 26 for detecting Prt, SEQ ID NO: 70 for detecting RT1, and SEQ ID NO: 70 for detecting RT3. No. 28, and SEQ ID NO: 29 to detect RT4. In order to optimize the specific activity of the probe for detection, the probe reagent was generally a mixture of labeled and unlabeled probe for each probe oligomer.

各条件に関して５つの反応の平均として報告する、これらの試験の結果は、表４に示す（陰性対照は示さない）。これらの結果は、３つの標的配列すべてが、多重反応各々で増幅され、増幅された配列に特異的な、対応するプローブによって特異的に検出される単位複製配列を生じたことを示す。 The results of these tests, reported as an average of 5 responses for each condition, are shown in Table 4 (no negative controls are shown). These results indicate that all three target sequences were amplified in each of the multiplex reactions, resulting in amplicons that were specific for the amplified sequence and were specifically detected by the corresponding probe.

表４：標識プローブハイブリダイゼーションによって検出された、多重増幅反応産物（ＲＬＵ）Table 4: Multiplexed amplification reaction products (RLU) detected by labeled probe hybridization

他の実験において、上で試験したのと同一の多重の組み合わせで、異なる比率の増幅オリゴマーを用いて、同様の増幅結果を提供した。例えば、別の多重の組み合わせは、反応試験管１あたり、以下の量のプライマーを用いた：各４ｐｍｏｌの配列番号６、配列番号１０、および配列番号２２、３ｐｍｏｌの配列番号１８、２．４ｐｍｏｌの配列番号８、各９．６ｐｍｏｌの配列番号２０および３’遮断配列番号８．
実施例４
臨床試料からのＨＩＶ−１標的配列の検出
本実施例は、症状によって、感染が薬剤耐性になったことが示される（薬剤治療中のウイルスリバウンド）ＨＩＶ−１患者から採取した生物学的試料に存在するＨＩＶ−１標的配列の検出を記載する。多重増幅反応を用いて、検出のための単一反応試験管において、多数の標的から増幅された核酸を産生する。該方法は、ＤＮＡプローブのアレイにハイブリダイズした、増幅された産物を検出して、Ｇａｇ、プロテアーゼおよびＲＴ領域中のＨＩＶ−１薬剤耐性に共通して関連する残基のアミノ酸情報を提供した。 In other experiments, similar amplification results were provided using different ratios of amplification oligomers in the same multiplex combination tested above. For example, another multiple combination used the following amounts of primers per reaction tube: 4 pmol of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 22, 3 pmol of SEQ ID NO: 18, 2.4 pmol of SEQ ID NO: 8, 9.6 pmol each of SEQ ID NO: 20 and 3 ′ blocking SEQ ID NO: 8.
Example 4
Detection of HIV-1 Target Sequences from Clinical Samples This example shows that biological samples taken from HIV-1 patients whose symptoms indicate that the infection has become drug resistant (virus rebound during drug treatment). The detection of the HIV-1 target sequence present is described. Multiplex amplification reactions are used to produce amplified nucleic acids from multiple targets in a single reaction tube for detection. The method detected amplified products that hybridized to an array of DNA probes and provided amino acid information of residues commonly associated with HIV-1 drug resistance in the Gag, protease, and RT regions.

ウイルス負荷の増加を経験している、薬剤併用治療中の３人のＨＩＶ陽性患者から血漿を収集した。患者１および２は、どちらも、１種類の薬剤併用（ｄ４Ｔ、３ＴＣおよびネルフィナビル^ＴＭ）で治療され、そしてそれぞれ６，１３０および１０，０００コピー／ｍｌのウイルス負荷を有し；患者３は、別の薬剤併用（アバカビル^ＴＭ、エファビレンツ^ＴＭおよびネルフィナビル^ＴＭ）で治療され、そして１０，０００コピー／ｍｌのウイルス負荷を有した。各患者から、０．５ｍｌの血漿を２つの別個の試験管に分配し、そして０．５ｍｌの溶解緩衝液（０．４ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．３５ＭＬｉＯＨ、０．２２ＭＬＬＳ）と混合し、そして６０℃で２０分間インキュベーションした。混合に添加した３つの捕捉オリゴヌクレオチド（各３．５ｐｍｏｌ／試験の配列番号３０および配列番号３２、並びに１０ｐｍｏｌ／試験の配列番号３１）および磁気粒子上に固定したｄＴ_１４オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって、他の試料構成要素から遊離したウイルスＲＮＡを精製し；混合物を５５−６０℃で１５−２０分間、そしてその後、１８−２５℃で１０−１５分間インキュベーションした。磁場を用いて磁気粒子をペレット化し、そして未結合試料構成要素を吸引し；結合したＨＩＶ−１ＲＮＡを含む磁気粒子を２回洗浄した（１．５ｍｌの洗浄緩衝液）。洗浄した粒子を７５μｌの増幅緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、ＭｇＣｌ_２、ＫＣｌ、グリセロール、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよび増幅オリゴヌクレオチド）に懸濁した。各標的領域用の増幅オリゴヌクレオチドは：Ｇａｇ１用の配列番号３３および配列番号１７；Ｇａｇ２用の配列番号３４および配列番号６０；プロテアーゼ用の配列番号４１および配列番号１９；ＲＴ１用の配列番号４１および配列番号２０；ＲＴ３用の配列番号９および配列番号２１；並びにＲＴ４用の配列番号１０および配列番号２２であった。増幅反応試験管１は、Ｇａｇ１、プロテアーゼおよびＲＴ３標的を増幅するプライマーを含有し；そして増幅反応試験管２は、Ｇａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４標的を増幅するプライマーを含有した。増幅反応混合物は、６０℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後、各々約３０００Ｕの逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを添加し（２５μｌ中、８ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１７０ｍＭＴｒｉｓ、７０ｍＭＫＣｌ、０．０１％フェノールレッド、１０％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．０８％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、２０％グリセロール、０．０４ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮ−アセチルＬ−システイン、０．０４ｍＭ酢酸亜鉛、０．０８％トレハロース）、そして混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。 Plasma was collected from 3 HIV positive patients undergoing drug combination therapy experiencing an increased viral load. Patients 1 and 2 are both treated with one drug combination (d4T, 3TC and Nelfinavir ^™ ) and have viral loads of 6,130 and 10,000 copies / ml, respectively; Of drug combinations (Abacavir ^™ , Efavirenz ^™ and Nelfinavir ^™ ) and had a viral load of 10,000 copies / ml. From each patient, 0.5 ml of plasma is distributed into two separate tubes and mixed with 0.5 ml lysis buffer (0.4 M HEPES, pH 7.6, 0.35 M LiOH, 0.22 M LLS). And incubated at 60 ° C. for 20 minutes. Hybridize with 3 capture oligonucleotides added to the mix (each 3.5 pmol / test SEQ ID 30 and 32 and 10 pmol / test SEQ ID 31) and dT ₁₄ oligonucleotide immobilized on magnetic particles The viral RNA released from the other sample components was purified by: the mixture was incubated at 55-60 ° C. for 15-20 minutes and then at 18-25 ° C. for 10-15 minutes. Magnetic fields were pelleted using a magnetic field and unbound sample components were aspirated; magnetic particles containing bound HIV-1 RNA were washed twice (1.5 ml wash buffer). The washed particles were suspended in 75 μl of amplification buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, MgCl ₂ , KCl, glycerol, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ATP, CTP, GTP, UTP and amplification oligonucleotide). The amplification oligonucleotides for each target region are: SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 17 for Gag1; SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 60 for Gag2; SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 19 for protease; SEQ ID NO: 41 and RT1 for RT1 SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 21 for RT3; and SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 22 for RT4. Amplification reaction tube 1 contained primers that amplify Gag1, protease and RT3 target; and amplification reaction tube 2 contained primers that amplify Gag2, RT1 and RT4 targets. The amplification reaction mixture was incubated at 60 ° C. for 10 minutes, and then approximately 3000 U of reverse transcriptase and T7 RNA polymerase were added each (8 mM HEPES, pH 7.5, 170 mM Tris, 70 mM KCl, 0.01 in 25 μl). % Phenol red, 10% TRITON® X-100, 0.08% TRITON® X-102, 20% glycerol, 0.04 mM EDTA, 50 mM N-acetyl L-cysteine, 0.04 mM zinc acetate 0.08% trehalose), and the mixture was incubated at 42 ° C. for 1 hour.

増幅反応を各患者に関してプールし（試験管１および２各々から５０μｌ）、そして先に記載された方法を用いて、増幅された産物を標識した（ＰＣＴ第ＷＯ９９／６５９２６号および第ＰＣＴ／ＩＢ９９／０２０７３号）。簡潔には、増幅産物を標識試薬と混合し（１５０μｌの総体積中、６０ｍＭＭｎＣｌ_２、６ｍＭイミダゾール、２ｍＭブロモフルオレセインの最終濃度）、そして６０℃で３０分間インキュベーションし、そしてその後、１５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを添加した。標準的カラムクロマトグラフィー（ＱＩＡＶＡＣ^ＴＭ、Ｑｉａｇｅｎ、ＳＡ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて標識核酸を精製し、そして１００μｌ体積中で溶出し、これを４００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．０６ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．９ＭＮａＣｌ、３Ｍベタイン、５ｍＭＤＴＡＢ、５００μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡ、０．０６％消泡剤、５ｘ１０^−４ｎｍｏｌ／試験の対照オリゴヌクレオチド）と混合した。混合物を固定ＤＮＡプローブのアレイと３５℃で３０分間インキュベーションした（流体状態のＤＮＡ−Ｃｈｉｐ^ＴＭ（ＤＮＡ−Ｃｈｉｐ^ＴＭｉｎａＦｌｕｉｄｉｃＳｔａｔｉｏｎ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，ＢｉｏＦｅａｔｕｒｅ３：４４２−４４７（１９９５）；米国特許第５，７４４，３０５号）。未結合材料をアレイから２回洗い流し（ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２溶液を用いる）、そしてアレイ上のハイブリダイゼーション結果を検出して、患者試料に問題のＨＩＶ−１配列が存在するかどうかを決定した（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，ＢｉｏＦｅａｔｕｒｅ３：４４２−４４７（１９９５）；ＰＣＴ第ＷＯ９５／１１９９５号）。この系は、薬剤耐性と関連する１８０の突然変異を含む、１００５の多型ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｐｏｌ配列を検出可能である（フランス政府機関ＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅｌａＲｅｃｈｅｒｃｈｅｓｕｒｌｅＳＩＤＡに決定された薬剤耐性コドン）。検出工程には、アレイ上の各プローブ部位に関して、蛍光強度を測定し（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ共焦点レーザー読み取り装置を用いる）、そしてアルゴリズム（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェア）を用いて、最も強いシグナルに対応する塩基を決定し、これを用いて、該コドンに関して存在する可能性があるアミノ酸（類）を決定した。３人の患者試料各々に関して、この方法を用いて得た、選択した位の予測されるアミノ酸を、ＲＴコドンに関して表５に、そしてプロテアーゼコドンに関して表６に、一文字アミノ酸暗号を用いて示す（「チップ」列）。比較のため、各患者試料のＨＩＶ−１配列を独立に決定し（米国特許第５，７９５，７２２号に記載されるようなＲＴ−ＰＣＲ後の標準的配列決定法を用いて）、そしてハイブリダイゼーション解析によって決定されるものに対応するコドン各々に関して予測されるアミノ酸を表に示す（「配列」列）。報告される位各々で、第一列（「ＷＴおよび位」）に、野生型（非薬剤耐性）アミノ酸を示し；「ｎｄ」は、未測定を意味する。 Amplification reactions were pooled for each patient (50 μl from each of tubes 1 and 2) and the amplified product was labeled (PCT WO 99/65926 and PCT / IB99 /) using the methods described above. 02073). Briefly, the amplification product is mixed with labeling reagent (60 mM MnCl ₂ , 6 mM imidazole, 2 mM bromofluorescein final concentration in a total volume of 150 μl) and incubated for 30 minutes at 60 ° C. and then 15 μl of 0. 5M EDTA was added. The labeled nucleic acid was purified using standard column chromatography (QIAVAC ^™ , Qiagen, SA, Courtaboeuf, France) and eluted in a 100 μl volume, which was added to 400 μl of hybridization buffer (0.06 M HEPES, pH 7. 5, 0.9 M NaCl, 3 M betaine, 5 mM DTAB, 500 μg / ml salmon sperm DNA, 0.06% antifoam, 5 × 10 ⁻⁴ nmol / control oligonucleotide). The mixture was incubated for 30 minutes in an array and 35 ° C. of immobilized DNA probes (in a fluid state ^{^{DNA-Chip TM (DNA-Chip}} TM in a Fluidic Station), Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA; Lipshutz et al, BioFeature 3: 442-447 (1995); U.S. Pat. No. 5,744,305). Unbound material is washed away from the array twice (using HEPES, NaCl, TRITON® X-102 solution) and the hybridization results on the array are detected to ensure that the patient sample has the HIV-1 sequence in question (Lipshutz et al., BioFeature 3: 442-447 (1995); PCT No. WO95 / 11995). This system is capable of detecting 1005 polymorphic HIV-1 gag and pol sequences containing 180 mutations associated with drug resistance (drug resistance codon determined by the French government agency Nationale de la Recherche sur le Sida ). For the detection step, for each probe site on the array, the fluorescence intensity is measured (using an Affymetrix confocal laser reader) and the algorithm (Affymetrix GeneChip software) is used to determine the base corresponding to the strongest signal. This was used to determine the amino acid (s) that may be present for the codon. For each of the three patient samples, the predicted amino acid of the selected position obtained using this method is shown in Table 5 for the RT codon and in Table 6 for the protease codon using the one-letter amino acid code (“ Chip "column). For comparison, the HIV-1 sequence of each patient sample was determined independently (using standard sequencing methods after RT-PCR as described in US Pat. No. 5,795,722) and high The predicted amino acids for each codon corresponding to those determined by hybridization analysis are shown in the table ("Sequence" column). In each reported position, the first column (“WT and position”) shows wild-type (non-drug resistant) amino acids; “nd” means unmeasured.

これらの結果は、ＤＮＡプローブにハイブリダイズした、増幅されたＨＩＶ−１配列が、薬剤耐性と関連するアミノ酸に影響を与える突然変異（太字で示す突然変異）に関する情報を提供し、そしてハイブリダイゼーション結果が、１３５の解析したコドンの配列決定によって決定した予測されるアミノ酸と、概して一致する（９８．５％）ことを示す。２つの場合で、プローブハイブリダイゼーションが突然変異配列を検出する一方、ＤＮＡ配列決定が野生型および突然変異配列の混合を検出した。しかし、突然変異体の検出は、診断のため、臨床的に重要である。 These results provide information on the mutations that the amplified HIV-1 sequence hybridized to the DNA probe affects the amino acids associated with drug resistance (mutations shown in bold) and the hybridization results Shows generally consistent (98.5%) with the predicted amino acid determined by sequencing of 135 analyzed codons. In two cases, probe hybridization detected mutant sequences while DNA sequencing detected a mixture of wild type and mutant sequences. However, the detection of mutants is clinically important for diagnosis.

表５：３人の患者由来の増幅されたＨＩＶ−１ＲＮＡから予測されるＲＴコドンTable 5: RT codon predicted from amplified HIV-1 RNA from 3 patients

表６：３人の患者由来の増幅されたＨＩＶ−１ＲＮＡから予測されるプロテアーゼコドンTable 6: Protease codon predicted from amplified HIV-1 RNA from 3 patients

他の実験において、以下の組み合わせの増幅オリゴマーを用い、ＨＩＶ−１標的配列の増幅を同様に行って、検出可能産物を産生した：Ｇａｇ１に関して（配列番号３３および配列番号５９）、Ｇａｇ２に関して（配列番号３６および配列番号６０）、Ｐｒｔに関して（配列番号３７または配列番号３８および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２）、ＲＴ１に関して（配列番号３９または配列番号４０および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５）、ＲＴ３に関して（配列番号４２または配列番号４３および配列番号６６）、およびＲＴ４に関して（配列番号４４または配列番号４５および配列番号６７または配列番号６８）。 In other experiments, the following combinations of amplification oligomers were used to similarly amplify the HIV-1 target sequence to produce a detectable product: for Gag1 (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 59), for Gag2 (sequence) No. 36 and SEQ ID NO: 60), for Prt (SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 61 or SEQ ID NO: 62), for RT1 (SEQ ID NO: 39 or SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 63) , SEQ ID NO: 64 or SEQ ID NO: 65), for RT3 (SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 66), and for RT4 (SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 67 or SEQ ID NO: 68).

実施例５
ＰＣＲ増幅および増幅されたＨＩＶ−１プロテアーゼおよびＲＴ１標的配列の検出
本実施例では、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＨＩＶ−１標的配列（ＰｒｔおよびＲＴ１）を増幅し、そして増幅された配列をその後、標準的ＤＮＡ配列決定と比較して、先の実施例に記載するようなＤＮＡチップ解析を用いることによって、検出した。ウイルスＲＮＡは、９２ＢＲ０２０単離体（米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダから）の組織培養上清から、標準的ＲＮＡ精製法（ＱＩＡＭＰ^ＴＭウイルスＲＮＡミニキット、Ｑｉａｇｅｎ、ＳＡ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて精製して、５ｘ１０^５コピー／ｍｌを含有する溶出液を産生した。ＲＴ−ＰＣＲは、標準法（ＡＣＣＥＳＳ^ＴＭＲＴ−ＰＣＲキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用い、別個の試験管中で行うＰｒｔおよびＲＴ１標的配列の増幅に関して、先の実施例に記載するプライマー（Ｐｒｔに関して、配列番号３７および配列番号１９；ＲＴ１に関して、配列番号４１および配列番号２０）を用いて行った。増幅後、１．５％アガロースゲルを通過させ、エチジウムブロミド染色した電気泳動を用い、標準分子サイズマーカーと比較して結果をチェックした。期待されるサイズを持つ増幅された核酸のバンドは、ＲＴ１に関して、５コピー／ｍｌの標的を含有する試験管で、そしてプロテアーゼに関して、５００コピー／ｍｌの標的を含有する試験管で見られた。 Example 5
PCR amplification and detection of amplified HIV-1 protease and RT1 target sequences In this example, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to amplify HIV-1 target sequences (Prt and RT1). , And the amplified sequence was then detected by using DNA chip analysis as described in the previous examples, compared to standard DNA sequencing. Viral RNA was obtained from a tissue culture supernatant of a 92BR020 isolate (from the National Institutes of Health, Bethesda, MD) using standard RNA purification methods (QIAAMP ^™ viral RNA mini kit, Qiagen, SA, Courtaboeuf, France). Was used to produce an eluate containing ⁵ × 10 ⁵ copies / ml. RT-PCR is performed using standard methods (ACCESS ^™ RT-PCR kit, Promega, Madison, Wis.) And using primers (Prt described in the previous examples for amplification of Prt and RT1 target sequences in separate tubes. For SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 19; for RT1, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 20). After amplification, the results were checked using electrophoresis through 1.5% agarose gel and ethidium bromide staining compared to standard molecular size markers. Amplified nucleic acid bands with the expected size were seen in tubes containing 5 copies / ml target for RT1 and in tubes containing 500 copies / ml target for protease.

増幅後、標準的ＤＮＡ配列決定法を用いて、各試験管由来のアリコットを配列決定した。チップ上のＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーションのため、標準法でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写（ＡＭＢＩＯＮＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ^ＴＭＴ７キット、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランス・モンルージュ）に、増幅された材料１０μｌをテンプレートとして用いた。転写後、実質的に先の実施例に記載するように、８μｌのＲＮＡ産物をブロモフルオレセインで標識した。先の実施例に記載するように示した、ＰｒｔおよびＲＴ１増幅配列の多様な位に関して予測されるアミノ酸結果を表７に示す。 After amplification, aliquots from each tube were sequenced using standard DNA sequencing methods. For hybridization to DNA probe array on a chip, using transcription with T7 RNA polymerase by standard methods (AMBION MEGASCRIPT ^TM T7 Kit, Clinisciences, France Montrouge) in the amplified material 10μl as a template. After transcription, 8 μl of the RNA product was labeled with bromofluorescein substantially as described in the previous examples. Table 7 shows the predicted amino acid results for the various positions of the Prt and RT1 amplified sequences shown as described in the previous examples.

これらの結果は、別の増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることによって、増幅オリゴマーが単位複製配列を産生可能であり、そして産物、または増幅産物から産生される転写物が、プローブアレイへのハイブリダイゼーションによって、そして配列決定によって、突然変異に該当する配列情報を提供することを示す。結果は、解析した４５のコドンに関して、概して一致した（９１．１％）。 These results show that by using another amplification method (RT-PCR), the amplification oligomers can produce amplicons, and the products, or transcripts produced from the amplification products, can be Shows providing sequence information corresponding to mutations by hybridization and by sequencing. Results were generally consistent (45. 1%) for the 45 codons analyzed.

表７：プロテアーゼおよびＲＴ１の増幅された配列から予測されるアミノ酸Table 7: Amino acids predicted from the amplified sequences of proteases and RT1

Claims

生物学的試料において、薬剤耐性に関連する突然変異を含むかもしれないＨＩＶ−１標的配列を増幅する方法であって：
（ａ）ｇａｇ遺伝子内に含有されるＧａｇ１と呼ばれるＨＩＶ−１標的配列を特異的に増幅する、増幅オリゴマーと、試料とを混合し、
ここで増幅オリゴマーは、配列番号１７の増幅オリゴマーおよび配列番号５の増幅オリゴマーを含む；そして
（ｂ）Ｇａｇ１標的配列を増幅して、Ｇａｇ１標的配列の増幅産物を産生する
工程を含んでなる、方法。 A method for amplifying an HIV-1 target sequence in a biological sample that may contain mutations associated with drug resistance:
(A) specifically amplifying the H IV-1 target sequence, called a Gag1 contained in gag the gene, were mixed and amplification oligomers, and a sample,
Here amplification oligomers, the including amplification oligomers of amplifier oligomers and SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 17; and (b) to amplify the Gag 1 target sequence, the step of producing an amplification product of Gag1 target sequence comprising the, mETHODS.

工程（ｂ）が、実質的に等温条件下で行う転写仲介増幅法を用いる、請求項１の方法。 The method of claim 1, wherein step (b) uses a transcription-mediated amplification method performed under substantially isothermal conditions.

増幅されたＧａｇ１標的配列の部分に特異的にハイブリダイズする核酸プローブへの、Ｇａｇ１標的配列の増幅産物のハイブリダイゼーションを検出することをさらに含む、請求項１または２の方法。 To amplified Gag 1 target sequence moiety that specifically hybridizes to a nucleic acid probe of, further comprising a method according to claim 1 or 2 and detecting the hybridization of the amplification products Gag 1 target sequence.

配列番号２３のプローブを用いてＧａｇ１標的配列の増幅産物を検出することをさらに含む、請求項１または２の方法。 The method of claim 1 or 2 , further comprising detecting the amplification product of the Gag1 target sequence using the probe of SEQ ID NO: 23.

配列番号２４のプローブを用いてＨＩＶ−１サブタイプＡのテンプレートからＧａｇ１標的配列の増幅産物を検出することをさらに含む、請求項１または２の方法。 3. The method of claim 1 or 2 , further comprising detecting an amplification product of the Gag1 target sequence from the HIV-1 subtype A template using the probe of SEQ ID NO: 24.

プローブが標識を含む、請求項４または５の方法。 6. The method of claim 4 or 5 , wherein the probe comprises a label.

標識が、均質検出系で検出可能な発光シグナルを生じる化合物である、請求項６の方法。 7. The method of claim 6 , wherein the label is a compound that produces a luminescent signal detectable with a homogeneous detection system.

請求項４〜７のいずれか一項の方法であって、プローブの核酸主鎖が１以上の２'−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、方法。 8. The method according to any one of claims 4 to 7 , wherein the nucleic acid backbone of the probe comprises one or more 2'-methoxy linkages, peptide nucleic acid linkages, phosphorothioate linkages, methylphosphonate linkages or any combination thereof. ,Method.

請求項１〜８のいずれか一項の方法であって、標的配列を含むＨＩＶ−１核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドと試料とを接触させ、こうしてＨＩＶ−１核酸が含まれるハイブリダイゼーション複合体を形成し、そして他の試料構成要素から該ハイブリダイゼーション複合体を分離する工程をさらに含んでなる、方法。 9. The method of any one of claims 1-8 , wherein the sample is contacted with at least one capture oligonucleotide that specifically hybridizes to the HIV-1 nucleic acid comprising the target sequence, such that the HIV-1 nucleic acid is The method further comprising the step of forming the included hybridization complex and separating the hybridization complex from other sample components.

生物学的試料において、薬剤耐性に関連する突然変異を含むかもしれないＨＩＶ−１標的配列を増幅することに使用するための、オリゴマーのセットであって、ここでセットは、配列番号１７の増幅オリゴマーと配列番号５の増幅オリゴマーとの増幅オリゴマーの組み合わせを含む、セット。 A set of oligomers for use in amplifying an HIV-1 target sequence that may contain a mutation associated with drug resistance in a biological sample, wherein the set is an amplification of SEQ ID NO: 17 A set comprising a combination of an amplification oligomer of an oligomer and an amplification oligomer of SEQ ID NO: 5.

配列番号２３のプローブオリゴマーをさらに含む、請求項１０のセット。 The set of claim 10 further comprising a probe oligomer of SEQ ID NO: 23.

配列番号２４のプローブオリゴマーをさらに含む、請求項１０のセット。 The set of claim 10 further comprising a probe oligomer of SEQ ID NO: 24.

プローブオリゴマーが標識を含む、請求項１１または１２のセット。 13. A set according to claim 11 or 12, wherein the probe oligomer comprises a label.

標識が、均質検出系で検出可能な発光シグナルを生じる化合物である、請求項１３のセット。 14. The set of claim 13, wherein the label is a compound that produces a luminescent signal detectable with a homogeneous detection system.

請求項１１〜１４のいずれか一項のセットであって、プローブオリゴマーの核酸主鎖が１以上の２'−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、セット。 15. A set according to any one of claims 11 to 14, wherein the nucleic acid backbone of the probe oligomer comprises one or more 2'-methoxy linkages, peptide nucleic acid linkages, phosphorothioate linkages, methylphosphonate linkages or any combination thereof. Including set.