JP5460332B2

JP5460332B2 - Polypeptide films and methods

Info

Publication number: JP5460332B2
Application number: JP2009546448A
Authority: JP
Inventors: ドナルド・テンプルトン・ハイニー
Original assignee: アーティフィシャルセルテクノロジーズインコーポレイテッド
Priority date: 2007-01-22
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2028-01-22
Also published as: BRPI0806819A2; US7973129B2; AU2008209526A1; EP2124906B1; WO2008091591A1; US7759305B2; ES2640760T3; US20100189769A1; DK2124906T3; AU2008209526B2; CA2675972A1; CA2675972C; US20080176080A1; MX2009007754A; CN101641086A; CN101641086B; PT2124906T; IL200019A0; JP2010516336A; EP2124906A1

Description

本発明は、生物学的機能性を有するポリペプチドの多層フィルムの設計に関する。 The present invention relates to the design of multilayer films of polypeptides having biological functionality.

高分子電解質の多層フィルムは、反対に荷電した高分子電解質の交互の層から構成される薄いフィルム(例えば、厚さ数ナノメートルから数ミリメートル)である。このようなフィルムは、適切な基質上への積層構築によって形成され得る。静電気的積層自己集合(「ELBL」)においては、高分子電解質の集合の物理的ベースは静電気である。フィルムの表面の電荷密度の符号が連続層の沈着時に逆転するので、フィルムの集積が可能である。反対に荷電したポリイオンのELBL沈着の一般的原理を、図1に図示する。ELBLフィルムプロセスは一般的であり、比較的単純であるので、多くの異なるタイプの表面上に多くの異なるタイプの高分子電解質を沈着するのが可能になる。ポリペプチドの多層フィルムは、荷電したポリペプチドを含む少なくとも1層からなる、高分子電解質の多層フィルムのサブセットである。ポリペプチド多層フィルムの主要な利点は、環境にやさしいことである。ELBLフィルムは、カプセル化のために用いることもできる。ポリペプチドフィルムおよびマイクロカプセルの適用には、例えば、ナノリアクター、バイオセンサー、人工細胞、および薬物送達ビヒクルが含まれる。 A polyelectrolyte multilayer film is a thin film (eg, several nanometers to several millimeters thick) composed of alternating layers of oppositely charged polyelectrolytes. Such a film can be formed by layer construction on a suitable substrate. In electrostatic laminate self-assembly (“ELBL”), the physical base of assembly of polyelectrolytes is static electricity. Film accumulation is possible because the sign of the charge density on the surface of the film is reversed during deposition of the continuous layer. The general principle of ELBL deposition of oppositely charged polyions is illustrated in FIG. The ELBL film process is common and relatively simple, thus allowing many different types of polyelectrolytes to be deposited on many different types of surfaces. Polypeptide multilayer films are a subset of polyelectrolyte multilayer films consisting of at least one layer comprising a charged polypeptide. A major advantage of polypeptide multilayer films is that they are environmentally friendly. ELBL film can also be used for encapsulation. Applications of polypeptide films and microcapsules include, for example, nanoreactors, biosensors, artificial cells, and drug delivery vehicles.

多層フィルム中にポリペプチドを組み込むことに関する設計原理は、米国特許出願公開第2005/0069950号（特許文献１）において最初に明らかにされた。簡潔に述べると、ELBLへのポリペプチドの適合性は、ポリペプチド上の実効電荷およびポリペプチド長に関連する。ELBLに適するポリペプチドは、好ましくは1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフ、すなわち約5から約15アミノ酸残基長を有し、静電沈着に適する線形電荷密度を有する近接するアミノ酸配列を含んでいる。ELBL用のポリペプチドは、様々な方法で、例えば、多数のアミノ酸配列モチーフを、直接またはリンカーによってのいずれかによって、相互に連結することによって設計され得る。好適な長さおよび電荷の性質を有するポリペプチドは容易に沈着し、1つまたは複数の層のポリペプチドの多層フィルムを形成することができる。 The design principle for incorporating polypeptides in multilayer films was first revealed in US Patent Application Publication No. 2005/0069950. Briefly, the compatibility of a polypeptide to ELBL is related to the net charge on the polypeptide and the polypeptide length. A polypeptide suitable for ELBL preferably comprises one or more amino acid sequence motifs, i.e., adjacent amino acid sequences having a linear charge density suitable for electrostatic deposition, having a length of about 5 to about 15 amino acid residues. . Polypeptides for ELBL can be designed in various ways, for example by linking multiple amino acid sequence motifs to each other either directly or by means of a linker. Polypeptides with suitable length and charge properties can be readily deposited to form a multilayer film of one or more layers of the polypeptide.

米国特許出願公開第2005/0069950号明細書US Patent Application Publication No. 2005/0069950

P.ChouおよびG.Fasman、Biochemistry、13巻、211頁(1974年)P.Chou and G.Fasman, Biochemistry, 13, 211 (1974)

ポリペプチドの多層フィルムに対する基本的な設計原理は明らかにされているが、それでも望ましい機能性、特に生物学的機能性を有するポリペプチドの多層フィルムを設計することが依然として必要とされている。 Although the basic design principles for polypeptide multilayer films have been clarified, there is still a need to design multilayer films of polypeptides with desirable functionality, particularly biological functionality.

一実施形態において、多層フィルムは2つ以上の高分子電解質層を含み、隣接する層は反対に荷電している高分子電解質を含み、第1層の高分子電解質は1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフを含む第1層のポリペプチドを含み、1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフは5から15アミノ酸からなり、0.4の1残基あたりの実効電荷を有する。第1層のポリペプチドは少なくとも15アミノ酸長であり、pH7で第1層のポリペプチドの全長の約2分の1以上の電荷のバランスを有し、第1層のポリペプチドは第1層のポリペプチドに可逆的に連結している治療物質を含む。第2層は、1000を超える分子量および1分子あたり少なくとも5の電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む第2層の高分子電解質を含み、第2層はポリペプチドを含まない。 In one embodiment, the multilayer film includes two or more polyelectrolyte layers, the adjacent layers include oppositely charged polyelectrolytes, and the first layer polyelectrolyte comprises one or more first electrolytes. Wherein the one or more first amino acid sequence motifs consist of 5 to 15 amino acids and have a net charge per residue of 0.4. The first layer polypeptide is at least 15 amino acids long, has a charge balance of at least about one-half of the total length of the first layer polypeptide at pH 7, and the first layer polypeptide is the first layer polypeptide. A therapeutic agent that is reversibly linked to the polypeptide. The second layer comprises a second layer polyelectrolyte comprising a polycationic or polyanionic material having a molecular weight greater than 1000 and a charge of at least 5 per molecule, and the second layer does not comprise a polypeptide.

ポリペプチドの多層フィルムから治療物質を制御可能に放出する方法は、上記に記載したポリペプチドの多層フィルムを提供するステップと、フィルムを、可逆的連結からの治療物質の放出を刺激するのに適する刺激と接触させるステップとを含む。 A method for controllably releasing a therapeutic substance from a multilayer film of a polypeptide provides a multilayer film of the polypeptide described above, and the film is suitable for stimulating release of the therapeutic substance from a reversible linkage. Contacting with a stimulus.

別の一実施形態において、ポリペプチドの多層フィルムを構築する方法は、第2層の高分子電解質は、1000を超える分子量および1分子あたり少なくとも5の荷電を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含み、第2層はポリペプチドを含まない、第2層の高分子電解質を基質上に配置するステップと、第1層のポリペプチドは1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフを含む、第1層のポリペプチドを第2層の高分子電解質上に配置するステップとを含み、1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフは5から15アミノ酸からなり、0.4の1残基あたりの実効電荷を有する。第1層のポリペプチドは少なくとも15アミノ酸長であり、pH7で第1層のポリペプチドの全長の約2分の1以上の電荷のバランスを有し、第1層のポリペプチドは第1層のポリペプチドに可逆的に連結している治療物質を含む。 In another embodiment, the method of constructing a multilayer film of a polypeptide, wherein the second layer polyelectrolyte comprises a polycationic or polyanionic material having a molecular weight greater than 1000 and a charge of at least 5 per molecule; Placing the second layer of polyelectrolyte on the substrate, wherein the second layer does not contain the polypeptide, and the first layer of the polypeptide comprises one or more first amino acid sequence motifs Placing one of the polypeptides on the second layer of polyelectrolyte, wherein the one or more first amino acid sequence motifs consist of 5 to 15 amino acids and have a net charge per residue of 0.4 . The first layer polypeptide is at least 15 amino acids long, has a charge balance of at least about one-half of the total length of the first layer polypeptide at pH 7, and the first layer polypeptide is the first layer polypeptide. A therapeutic agent that is reversibly linked to the polypeptide.

反対に荷電したポリペプチドの構築を示す模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing the construction of an oppositely charged polypeptide. DTNBの、N1におけるCys側鎖との反応を示す図である。TNB基は、ジスルフィド結合の形成によってペプチドのチオール基に結合する。It is a figure which shows reaction with the Cys side chain in N1 of DTNB. The TNB group binds to the peptide thiol group by formation of a disulfide bond. 未反応のDTNBを除去するための広範な透析後であるが、DTTを加える前(0時間)および1.5時間後の、LN1溶液の吸収スペクトルを示す図である。1.5時間のスペクトルにおける412nmのピークはTNBジアニオンによるものであり、328nm(0時間)のピークはTNB-チオール混合ジスルフィドによるものである。300nm未満の吸光度における急激な増大はDTTによるものである。後の時間点(示さず)における275nm周辺に明らかであるショルダーは、酸化されたDTTによるものである。FIG. 3 shows absorption spectra of LN1 solution after extensive dialysis to remove unreacted DTNB but before adding DTT (0 hours) and after 1.5 hours. The 412 nm peak in the 1.5 hour spectrum is due to the TNB dianion, and the 328 nm (0 hour) peak is due to the TNB-thiol mixed disulfide. The sharp increase in absorbance below 300 nm is due to DTT. The shoulder apparent around 275 nm at a later time point (not shown) is due to oxidized DTT. 190nmにおける多層フィルム吸光度(光学的厚さ)対、層の数を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing multilayer film absorbance (optical thickness) at 190 nm versus number of layers. DTTの内向きの拡散時のペプチドLN1からのTNB解離を示す図である。It is a figure which shows TNB dissociation from peptide LN1 at the time of inward diffusion of DTT. 0.1mMDTT溶液中の浸漬0、5、30、または60分後に記録された、10P1/LN1ナノコーティングの周囲の液体媒体の吸収スペクトルを示す図である。TNBの吸光度は時間とともに増大する。FIG. 6 shows the absorption spectrum of the liquid medium around the 10P1 / LN1 nanocoating recorded after 0, 5, 30, or 60 minutes immersion in 0.1 mM DTT solution. The absorbance of TNB increases with time. 10P1/LN1フィルムに対する放出媒体の412nmの吸光度対インキュベーション時間を示す図である。「キャッピングされた」フィルムは、外側表面上に(P1/N1)₂を有していた。TNB放出の動態学は、酸化還元電位、およびキャッピング層によって表される物理学的挙動に依存する。FIG. 4 shows the absorbance of the release medium at 412 nm versus incubation time for 10P1 / LN1 film. The “capped” film had (P1 / N1) ₂ on the outer surface. The kinetics of TNB release depends on the redox potential and the physical behavior represented by the capping layer. ポリペプチドの多層ナノコーティングからのTNBの酸化還元刺激された放出を示す模式図である。単純化のためDTT分子は省略する。ΔEは、還元電位における変化であるΔt時間を示す。FIG. 2 is a schematic showing redox-stimulated release of TNB from a multilayer nano-coating of a polypeptide For simplicity, the DTT molecule is omitted. ΔE represents Δt time which is a change in reduction potential.

本発明は、第1の層のポリペプチドを含む少なくとも1つの層を含むポリペプチドの多層フィルムを対象とし、ポリペプチドは、可逆的に結合している治療物質、例えば薬物を含む。高分子電解質の多層コーティングは、例えば、ステントなどの医療用インプラントからの薬物の送達に有用であり得る。一手法では、治療物質は、コーティング調製後にコーティングに担持され、治療物質は拡散によって放出される。別の手法では、治療物質は、多層コーティング内にカプセル化され、再び、放出は拡散によって支配される。本明細書に開示する代替の一手法は、治療物質と第1層のポリペプチドの間に共有結合による連結を形成することであり、共有結合による連結はいくつかの物理学的条件下で可逆的である。例えば、5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)のチオール保有分子のモデルは、ジスルフィド結合の形成によって32merのCys含有ポリペプチド上に「担持」されてよく、「担持」されたペプチドは、ELBLによって多層フィルム中に組み込まれてよく、2-ニトロ-5-チオベンゾエートジアニオン(TNB)が周囲の液体媒体の酸化還元電位における変化によってフィルムから放出され得る。このような担持および放出は、実験的に実証されている。DTNBはエルマン試薬としても知られており、ペプチドおよびタンパク質における遊離のスルフヒドリル基およびジスルフィドを定量するのに用いられ得る。周囲の液体媒体の還元電位における増大は、生存する生物学的な細胞の、酸化的な環境の場合は外側からの、還元的な場合は内側へのコーティングされた粒子の通過のモデルとなっている。したがって、本明細書に開示する手法は、局所的な還元電位に感受性である、ジスルフィド結合によって多層フィルムに共有結合している治療物質の環境的な刺激による放出を可能にするものである。 The present invention is directed to a multilayer film of a polypeptide comprising at least one layer comprising a first layer of a polypeptide, wherein the polypeptide comprises a therapeutic agent, such as a drug, that is reversibly bound. Polyelectrolyte multilayer coatings can be useful, for example, for drug delivery from medical implants such as stents. In one approach, the therapeutic agent is loaded onto the coating after coating preparation and the therapeutic agent is released by diffusion. In another approach, the therapeutic agent is encapsulated in a multilayer coating and again, release is governed by diffusion. One alternative approach disclosed herein is to form a covalent linkage between the therapeutic agent and the first layer polypeptide, the covalent linkage being reversible under some physical conditions. Is. For example, a model of a 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) thiol-carrying molecule may be "supported" on a 32mer Cys-containing polypeptide by formation of a disulfide bond. The peptides "can be incorporated into multilayer films by ELBL and 2-nitro-5-thiobenzoate dianion (TNB) can be released from the film by a change in the redox potential of the surrounding liquid medium. Such loading and release has been experimentally demonstrated. DTNB, also known as the Elman reagent, can be used to quantify free sulfhydryl groups and disulfides in peptides and proteins. The increase in the reduction potential of the surrounding liquid medium is a model for the passage of coated biological cells from the outside in the case of an oxidative environment, and inside in the case of a reduction. Yes. Thus, the approach disclosed herein allows for the environmentally stimulated release of therapeutic agents that are sensitive to local reduction potentials and covalently attached to the multilayer film by disulfide bonds.

一実施形態において、多層フィルムは2つ以上の高分子電解質層を含み、隣接する層は反対に荷電している高分子電解質を含み、第1層の高分子電解質は1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフを含む第1層のポリペプチドを含み、1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフは5から15アミノ酸からなり、0.4の1残基あたりの実効電荷を有し、第1層のポリペプチドはホモポリマーではなく、少なくとも15アミノ酸長であり、pH7で第1層のポリペプチドの全長の約2分の1以上の電荷のバランスを有する。第2層は、1000を超える分子量および1分子あたり少なくとも5の電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む第2層の高分子電解質を含み、第2層はポリペプチドを含まない。フィルムが基質を含む一実施形態において、第1層のポリペプチドは最も外側であり、または溶剤に曝露されている層であり、すなわち基質から最も遠い層である。 In one embodiment, the multilayer film includes two or more polyelectrolyte layers, the adjacent layers include oppositely charged polyelectrolytes, and the first layer polyelectrolyte comprises one or more first electrolytes. A first layer polypeptide comprising an amino acid sequence motif of, wherein the one or more first amino acid sequence motifs consist of 5 to 15 amino acids and have a net charge per residue of 0.4, the first layer These polypeptides are not homopolymers, are at least 15 amino acids long, and have a charge balance of at least about one-half of the total length of the first layer polypeptide at pH 7. The second layer comprises a second layer polyelectrolyte comprising a polycationic or polyanionic material having a molecular weight greater than 1000 and a charge of at least 5 per molecule, and the second layer does not comprise a polypeptide. In one embodiment where the film includes a substrate, the first layer of the polypeptide is the outermost or the layer that is exposed to the solvent, i.e., the layer furthest from the substrate.

本明細書には、ポリペプチドの多層フィルムから治療物質を放出する方法も開示する。 Also disclosed herein is a method of releasing a therapeutic agent from a multilayer film of a polypeptide.

本明細書で用いられる「層」は、例えば、吸着ステップの後フィルムを形成するための基質上の厚さの増大を意味する。「多層」は、複数の(すなわち、2つ以上の)厚さの増大を意味する。「高分子電解質の多層フィルム」は、高分子電解質の1つまたは複数の厚さの増大を含むフィルムである。沈着後、多層フィルムの層は別々の層として残らなくてもよい。実際、特に厚さが増大する界面において、種の著しい混ぜ合わせが存在することが可能である。 As used herein, “layer” means an increase in thickness on a substrate, for example, to form a film after an adsorption step. “Multilayer” means multiple (ie, two or more) thickness increases. A “polyelectrolyte multilayer film” is a film that includes one or more thickness increases of a polyelectrolyte. After deposition, the layers of the multilayer film need not remain as separate layers. In fact, there can be significant mixing of seeds, especially at interfaces where thickness increases.

「高分子電解質」の語は、1000を超える分子量および1分子あたり少なくとも5の電荷を有するポリカチオン材料およびポリアニオン材料を含む。適切なポリカチオン材料には、例えば、ポリアミンが含まれる。ポリアミンには、例えば、ポリペプチド、ポリビニルアミン、ポリ(アミノスチレン)、ポリ(アミノアクリレート)、ポリ(N-メチルアミノアクリレート)、ポリ(N-エチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノアクリレート)、ポリ(アミノメタクリレート)、ポリ(N-メチルアミノ-メタクリレート)、ポリ(N-エチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノメタクリレート)、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロライド)、ポリ(N,N,N-トリメチルアミノアクリレートクロライド)、ポリ(メタアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド)、キトサン、および先のポリカチオン材料の1つまたは複数を含む組合せが含まれる。適切なポリアニオン材料には、例えば、ポリペプチド、核酸、アルギン酸塩、カラギーナン、フルセララン(furcellaran)、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリ(メタ)アクリル酸、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、酸性多糖、およびクロスカルメロース、ペンダントのカルボキシル基を含む合成ポリマーおよび共重合体、ならびに先のポリアニオン材料を1つまたは複数含む組合せが含まれる。 The term “polyelectrolyte” includes polycationic and polyanionic materials having a molecular weight greater than 1000 and a charge of at least 5 per molecule. Suitable polycationic materials include, for example, polyamines. Polyamines include, for example, polypeptides, polyvinylamine, poly (aminostyrene), poly (aminoacrylate), poly (N-methylaminoacrylate), poly (N-ethylaminoacrylate), poly (N, N-dimethylamino). Acrylate), poly (N, N-diethylamino acrylate), poly (amino methacrylate), poly (N-methylamino-methacrylate), poly (N-ethylamino methacrylate), poly (N, N-dimethylamino methacrylate), poly (N, N-diethylamino methacrylate), poly (ethyleneimine), poly (diallyldimethylammonium chloride), poly (N, N, N-trimethylaminoacrylate chloride), poly (methacrylamidepropyltrimethylammonium chloride), chitosan, and Includes combinations containing one or more of the preceding polycationic materials . Suitable polyanion materials include, for example, polypeptides, nucleic acids, alginate, carrageenan, furcellaran, pectin, xanthan, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, dextran sulfate, poly (meth) acrylic. Acids, oxidized cellulose, carboxymethylcellulose, acidic polysaccharides, and croscarmellose, synthetic polymers and copolymers containing pendant carboxyl groups, and combinations containing one or more of the foregoing polyanionic materials are included.

「アミノ酸」は、ポリペプチドの構成単位を意味する。本明細書で用いる「アミノ酸」には、20種の通常の天然に存在するLアミノ酸、全ての他の天然のアミノ酸、全ての非天然のアミノ酸、および全てのアミノ酸模倣物、例えばペプトイドが含まれる。 “Amino acid” means a building block of a polypeptide. As used herein, “amino acid” includes the 20 common naturally occurring L amino acids, all other natural amino acids, all non-natural amino acids, and all amino acid mimetics such as peptoids. .

「天然に存在するアミノ酸」は、20種の通常の天然に存在するLアミノ酸、すなわち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびプロリンを意味する。 `` Naturally occurring amino acids '' refers to the 20 normal naturally occurring L amino acids: glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, Means arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and proline.

「非天然のアミノ酸」は、20種の通常の天然に存在するLアミノ酸以外のアミノ酸を意味する。非天然のアミノ酸は、L-またはD-いずれかの立体配置を有することができる。 "Non-natural amino acid" means an amino acid other than the 20 normal naturally occurring L amino acids. Unnatural amino acids can have either L- or D-configuration.

「ペプトイド」、すなわちN置換されたグリシンは、対応するアミノ酸と同じ側鎖を有するが、残基のα-炭素に対してではなく、アミノ基の窒素原子に対して付加している側鎖を有する、対応するアミノ酸モノマーの類似体を意味する。したがって、ポリペプトイドにおけるモノマー間の化学連結は、タンパク質分解性の消化を制限するのに有用であり得るペプチド結合ではない。 A “peptoid”, or N-substituted glycine, has the same side chain as the corresponding amino acid, but has a side chain attached to the nitrogen atom of the amino group rather than to the α-carbon of the residue. Means an analog of the corresponding amino acid monomer. Thus, chemical linkage between monomers in a polypeptoid is not a peptide bond that can be useful to limit proteolytic digestion.

「アミノ酸配列」および「配列」は、少なくとも2アミノ酸残基長である、近接する長さのポリペプチド鎖を意味する。 "Amino acid sequence" and "sequence" mean adjacent lengths of a polypeptide chain that is at least 2 amino acid residues long.

「残基」は、ポリマーまたはオリゴマーにおけるアミノ酸を意味し、そこからポリマーが形成されたアミノ酸モノマーの残基である。ポリペプチドの合成には、脱水、すなわちアミノ酸がポリペプチド鎖に付加するとき、水分子1個の「喪失」を伴う。 “Residue” means an amino acid in a polymer or oligomer and is the residue of an amino acid monomer from which the polymer was formed. Polypeptide synthesis involves dehydration, or “loss” of one water molecule when an amino acid is added to the polypeptide chain.

「アミノ酸配列モチーフ」は、n個の残基を含む近接するアミノ酸配列を意味し、この場合nは5から15である。一実施形態において、アミノ酸配列モチーフ1残基あたりの実効電荷の大きさは、0.4以上である。別の一実施形態において、アミノ酸配列モチーフ1残基あたりの実効電荷の大きさは、0.5以上である。本明細書で用いられる、実効電荷の大きさは実効電荷の絶対値を意味し、すなわち実効電荷は負の正でもよい。 “Amino acid sequence motif” means a contiguous amino acid sequence comprising n residues, where n is 5 to 15. In one embodiment, the net charge per amino acid sequence motif residue is 0.4 or greater. In another embodiment, the net charge per amino acid sequence motif residue is 0.5 or greater. As used herein, the magnitude of the effective charge means the absolute value of the effective charge, that is, the effective charge may be negatively positive.

「設計されたポリペプチド」は1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフを含むポリペプチドを意味し、ポリペプチドは少なくとも15アミノ酸長であり、ポリペプチドにおける残基の総数に対する、同じ極性の荷電した残基の数から反対の極性の残基の数を引いたものの比率は、pH7.0で0.4以上である。換言すると、ポリペプチド1残基あたりの実効電荷の大きさは0.4以上である。一実施形態において、ポリペプチドにおける残基の総数に対する、同じ極性の荷電した残基の数から反対の極性の残基の数を引いたものの比率は、pH7.0で0.5以上である。換言すると、ポリペプチドにおける1残基あたりの実効電荷の大きさは0.5以上である。総じて、ポリペプチド長に対して絶対的な上限は存在しないが、ELBL沈着に適する設計されたポリペプチドは、1000残基の実際的な長さの上限を有する。 “Designed polypeptide” means a polypeptide comprising one or more amino acid sequence motifs, the polypeptide is at least 15 amino acids long, and charged residues of the same polarity relative to the total number of residues in the polypeptide The ratio of the number of residues minus the number of residues of opposite polarity is 0.4 or more at pH 7.0. In other words, the net charge per polypeptide residue is 0.4 or more. In one embodiment, the ratio of the number of charged residues of the same polarity minus the number of opposite polarity residues to the total number of residues in the polypeptide is 0.5 or greater at pH 7.0. In other words, the magnitude of the net charge per residue in the polypeptide is 0.5 or more. Overall, there is no absolute upper limit on polypeptide length, but designed polypeptides suitable for ELBL deposition have a practical upper limit of 1000 residues.

「一次構造」は、ポリペプチド鎖におけるアミノ酸の近接する線状の配列を意味し、「二次構造」は通常水素結合である、非共有結合による相互作用によって安定化されるポリペプチド鎖におけるある程度規則的なタイプの構造を意味する。二次構造の例には、αヘリックス、βシート、およびβターンが含まれる。 “Primary structure” means a contiguous linear sequence of amino acids in a polypeptide chain, and “secondary structure” is a degree in a polypeptide chain that is stabilized by non-covalent interactions, usually hydrogen bonds. Means a regular type of structure. Examples of secondary structures include alpha helices, beta sheets, and beta turns.

「ポリペプチドの多層フィルム」は、上記で定義した設計されたポリペプチドなど、1つまたは複数のポリペプチドを含むフィルムを意味する。例えば、ポリペプチドの多層フィルムは、設計されたポリペプチドを含む第1層を含み、高分子電解質を含む第2層は設計されたポリペプチドに反対の極性の実効電荷を有する。例えば、第1層が正の実効電荷を有する場合は、第2層は負の実効電荷を有し、第1層が負の実効電荷を有する場合は、第2層は正の実効電荷を有する。第2層は、別の設計されたポリペプチド、または別の高分子電解質を含む。 By “polypeptide multilayer film” is meant a film comprising one or more polypeptides, such as the designed polypeptides defined above. For example, a multilayer film of a polypeptide includes a first layer that includes a designed polypeptide, and a second layer that includes a polyelectrolyte has a net charge opposite to that of the designed polypeptide. For example, if the first layer has a positive net charge, the second layer has a negative net charge, and if the first layer has a negative net charge, the second layer has a positive net charge . The second layer includes another designed polypeptide or another polyelectrolyte.

「基質」は、水溶液から高分子電解質を吸着するのに適する表面を有する固体の材料を意味する。基質の表面は、例えば、平面、球状、細長状など、本質的にあらゆる形態を有することができる。基質の表面は、規則的または不規則的である。基質は結晶であってよい。基質は、場合により生物活性分子を含む。基質のサイズは、ナノスケールからマクロスケールまでの範囲である。さらに、基質は、場合によりいくつかの小型のサブ粒子を含む。基質は、有機材料、無機材料、生物活性材料、またはこれらの組合せからできていてよい。基質の非限定的な例には、シリコンウェハ、荷電したコロイド粒子、例えば、CaCO₃またはメラミンホルムアルデヒドの微粒子、タンパク質結晶、核酸結晶、生物学的細胞(例えば、赤血球、肝細胞、細菌の細胞、または酵母菌の細胞)、有機ポリマーの格子(例えば、ポリスチレンまたはスチレン共重合体の格子)、リポソーム、細胞小器官、およびウイルスが含まれる。一実施形態において、基質は、人工ペースメーカー、人工内耳、またはステントなどの医療器具である。 “Substrate” means a solid material having a surface suitable for adsorbing a polyelectrolyte from an aqueous solution. The surface of the substrate can have essentially any shape, for example, flat, spherical, elongated, and the like. The surface of the substrate is regular or irregular. The substrate may be a crystal. The substrate optionally includes a bioactive molecule. The size of the substrate ranges from nanoscale to macroscale. In addition, the substrate optionally includes several small sub-particles. The substrate may be made of organic materials, inorganic materials, bioactive materials, or combinations thereof. Non-limiting examples of substrates include silicon wafers, charged colloidal particles such as CaCO ₃ or melamine formaldehyde microparticles, protein crystals, nucleic acid crystals, biological cells (e.g., red blood cells, hepatocytes, bacterial cells, Or yeast cells), organic polymer lattices (eg, polystyrene or styrene copolymer lattices), liposomes, organelles, and viruses. In one embodiment, the substrate is a medical device such as an artificial pacemaker, cochlear implant, or stent.

フィルム形成の間もしくは後に、基質が分解され、またはそうでなければ除去される場合、基質は(フィルム形成用の)「テンプレート」と呼ばれる。テンプレート粒子は、好適な溶媒に溶解されてもよく、または熱処理によって除去されてもよい。例えば、部分的に架橋されているメラミンホルムアルデヒドテンプレート粒子が用いられる場合、テンプレートは穏やかな化学的方法(例えば、DMSO中)によって、またはpH値における変化によって分解され得る。テンプレート粒子が溶解した後は、交互の高分子電解質層から構成される中空の多層シェルが残る。 If the substrate is degraded or otherwise removed during or after film formation, the substrate is referred to as a “template” (for film formation). The template particles may be dissolved in a suitable solvent or removed by heat treatment. For example, if partially cross-linked melamine formaldehyde template particles are used, the template can be degraded by mild chemical methods (eg, in DMSO) or by changes in pH value. After the template particles are dissolved, a hollow multilayer shell composed of alternating polyelectrolyte layers remains.

「マイクロカプセル」は、中空のシェル、またはコアを取り囲むコーティングの形態の高分子電解質フィルムである。コアは、例えば、液体または結晶の形態の、タンパク質、薬物、またはこれらの組合せなどの多様な異なる封入剤を含む。 A “microcapsule” is a polyelectrolyte film in the form of a hollow shell or coating that surrounds a core. The core includes a variety of different encapsulants such as, for example, proteins, drugs, or combinations thereof, in liquid or crystalline form.

「生物活性分子」は、生物学的作用を有する分子、巨大分子、または巨大分子集合体を意味する。特定の生物学的作用は、適切なアッセイにおいて測定することができ、生物活性分子の1単位重量あたりまたは1分子あたりで平均化する。生物活性分子は、カプセル化され、裏側に保持され、または高分子電解質フィルム内にカプセル化され得る。生物活性分子の非限定的な例は、薬物、薬物の結晶、タンパク質、タンパク質の機能的なフラグメント、タンパク質の複合体、リポタンパク質、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、リボソーム、活性な治療物質、リン脂質、多糖、リポ多糖である。本明細書で用いられる「生物活性分子」は、例えば、機能的な膜フラグメント、膜構造、ウイルス、病原体、細胞、細胞の凝集体、および細胞小器官などの生物学的に活性な構造をさらに包含する。カプセル化され、またはポリペプチドフィルムの裏側に保持され得るタンパク質の例は、ヘモグロビン;グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、リゾチームなどの酵素;フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、およびコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ならびに抗体である。カプセル化され、または高分子電解質フィルムの裏側に保持され得る細胞の例は、移植された島細胞、真核細胞、細菌細胞、植物細胞、および酵母菌細胞である。 “Bioactive molecule” means a molecule, a macromolecule, or a macromolecular assembly having a biological effect. Specific biological effects can be measured in a suitable assay and averaged per unit weight or per molecule of bioactive molecule. The bioactive molecule can be encapsulated, retained on the backside, or encapsulated within a polyelectrolyte film. Non-limiting examples of bioactive molecules include drugs, drug crystals, proteins, functional fragments of proteins, protein complexes, lipoproteins, oligopeptides, oligonucleotides, nucleic acids, ribosomes, active therapeutic substances, phosphorous Lipids, polysaccharides, lipopolysaccharides. As used herein, a “biologically active molecule” further refers to biologically active structures such as, for example, functional membrane fragments, membrane structures, viruses, pathogens, cells, cell aggregates, and organelles. Includes. Examples of proteins that can be encapsulated or retained on the back side of polypeptide films are hemoglobin; enzymes such as glucose oxidase, urease, lysozyme; extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, vitronectin, and collagen, and antibodies . Examples of cells that can be encapsulated or retained on the back side of a polyelectrolyte film are transplanted islet cells, eukaryotic cells, bacterial cells, plant cells, and yeast cells.

治療物質は、生物活性分子のサブセットである。「治療物質」は、患者に単独で、または別の化合物、要素、もしくは混合物と組み合わせて投与した場合に、直接または間接的に患者に対して生理学的作用を付与する化合物、要素、または混合物を意味する。間接的な生理学的作用は、代謝産物または他の間接的な機序によって起こることがある。活性物質が化合物である場合は、塩、遊離の化合物または塩の溶媒和化合物(水和物を含む)、結晶形態、非結晶形態および化合物のあらゆる多形が、本明細書に企図される。 The therapeutic agent is a subset of the bioactive molecule. “Therapeutic agent” refers to a compound, element, or mixture that imparts a physiological effect on a patient, either directly or indirectly, when administered to a patient alone or in combination with another compound, element, or mixture. means. Indirect physiological effects can occur through metabolites or other indirect mechanisms. Where the active substance is a compound, salts, free compounds or solvates of salts (including hydrates), crystalline forms, amorphous forms and all polymorphs of the compounds are contemplated herein.

適切な治療物質は、抗炎症物質、冠血管拡張薬、脳血管拡張薬、末梢血管拡張薬、抗感染薬、向精神薬、抗躁病薬、刺激薬、抗ヒスタミン薬、胃腸管鎮静薬、止瀉薬調製物、抗狭心症薬、血管拡張薬、抗不整脈薬、降圧薬、血管収縮薬、偏頭痛を処置するのに有用な薬物、抗凝血薬および抗血栓薬、鎮痛薬、解熱薬、催眠薬、鎮静薬、鎮吐薬、制吐薬、抗痙攣薬、神経筋薬、高血糖および低血糖薬剤、甲状腺および抗甲状腺調製物、利尿薬、鎮痙薬、子宮弛緩薬、ミネラルおよび栄養の添加物、抗肥満薬、タンパク同化薬、赤血球生成薬、抗喘息薬、去痰薬、鎮咳薬、粘液溶解薬、抗尿酸血症薬、他の薬物、ならびに先の治療物質を1つまたは複数含む組合せである。 Suitable therapeutic substances include anti-inflammatory substances, coronary vasodilators, cerebral vasodilators, peripheral vasodilators, anti-infectives, psychotropic drugs, antidepressants, stimulants, antihistamines, gastrointestinal sedatives, antistasis Glaze preparations, antianginal drugs, vasodilators, antiarrhythmic drugs, antihypertensive drugs, vasoconstrictors, drugs useful to treat migraine, anticoagulants and antithrombotics, analgesics, antipyretics , Hypnotics, sedatives, antiemetics, antiemetics, anticonvulsants, neuromuscular drugs, hyperglycemic and hypoglycemic drugs, thyroid and antithyroid preparations, diuretics, antispasmodic drugs, uterine relaxant, mineral and nutritional additions Products, anti-obesity drugs, anabolic drugs, erythropoietic drugs, anti-asthma drugs, expectorants, antitussives, mucolytic drugs, anti-uricemia drugs, other drugs, and combinations containing one or more of the above therapeutic substances It is.

「生体適合性」は、経口摂取、局所適用、経皮適用、皮下注射、筋肉内注射、吸入、埋め込み、または静脈内注射時に、実質的な健康への有害作用を引き起こさないことを意味する。例えば、生体適合性のフィルムは、例えばヒトの免疫系と接触させた場合に、実質的な免疫反応を引き起こさないものを含む。 “Biocompatible” means that it does not cause substantial health effects upon oral ingestion, topical application, transdermal application, subcutaneous injection, intramuscular injection, inhalation, implantation, or intravenous injection. For example, biocompatible films include those that do not cause a substantial immune response, for example when contacted with the human immune system.

「免疫反応」は、身体のあらゆるところでの物質の存在に対する、細胞性免疫系または体液性免疫系の反応を意味する。免疫反応は、数々の方法で、例えば、ある抗原を認識する抗体の数の血中における増大によって特徴付けることができる。抗体は、B細胞によって分泌されるタンパク質であり、抗原は免疫反応を誘発する実体である。ヒトの身体は、感染と戦い、血流およびあらゆる場所において抗体の数を増大することによって再感染を阻害する。反応の一般的なパターンは普通であるが、特異的な免疫反応は個体にいくらか依存する。 “Immune response” means the response of the cellular or humoral immune system to the presence of substances everywhere in the body. The immune response can be characterized in a number of ways, for example by increasing the number of antibodies that recognize an antigen in the blood. Antibodies are proteins secreted by B cells, and antigens are entities that elicit an immune response. The human body combats infection and inhibits reinfection by increasing the number of antibodies in the bloodstream and everywhere. The general pattern of response is normal, but the specific immune response is somewhat dependent on the individual.

「エピトープ」は、抗体によって認識されるタンパク質の構造または配列を意味する。通常、エピトープはタンパク質の表面上にある。「連続的なエピトープ」は、いくつかの近接するアミノ酸残基を伴うものであり、折りたたまれたタンパク質における制限されたスペースの領域とたまたま接触し、またはそこにあるアミノ酸残基を伴わないものである。 “Epitope” means the structure or sequence of a protein recognized by an antibody. Usually, the epitope is on the surface of the protein. A “contiguous epitope” is one that involves several contiguous amino acid residues, that happens to be in contact with a region of restricted space in the folded protein, or without any amino acid residues there. is there.

本発明は、第1層のポリペプチドを含むポリペプチドの多層フィルムに対するものであり、第1層のポリペプチドは、可逆的に結合している生物活性分子を含む。他の層は、設計されているポリペプチドまたは他のポリカチオンもしくはポリアニオンを含む。 The present invention is directed to a multilayer film of polypeptides comprising a first layer polypeptide, wherein the first layer polypeptide comprises a bioactive molecule that is reversibly bound. The other layer contains the designed polypeptide or other polycation or polyanion.

静電気的積層沈着に適するポリペプチドに対する設計原理は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0069950号明細書（特許文献１）において明らかにされている。簡潔に述べると、主な設計の問題はポリペプチド長および電荷である。静電気学はELBLのベースであるので、最も重要な設計の問題である。適切な荷電の性質がなければ、ポリペプチドはpH4から10の水溶液に実質的に可溶性ではなく、ELBLによる多層フィルムの製作に簡単に用いることができない。他の設計の問題には、ポリペプチドの物理的構造、ポリペプチドから形成されたフィルムの物理的安定性、ならびにフィルムおよび構成成分であるポリペプチドの生体適合性および生物活性が含まれる。 The design principles for polypeptides suitable for electrostatic laminate deposition are revealed in US Patent Application Publication No. 2005/0069950, which is hereby incorporated by reference. Briefly, the main design issues are polypeptide length and charge. Since electrostatics is the basis of ELBL, it is the most important design issue. Without the proper charge properties, the polypeptide is not substantially soluble in aqueous solutions from pH 4 to 10 and cannot be easily used to make multilayer films by ELBL. Other design issues include the physical structure of the polypeptide, the physical stability of the film formed from the polypeptide, and the biocompatibility and biological activity of the polypeptide as a film and components.

上記で定義したように、設計されたポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフを含むポリペプチドを意味し、ポリペプチドは、少なくとも15アミノ酸残基長であり、ポリペプチド1残基あたりの実効電荷の大きさはpH7.0で0.4以上である。「アミノ酸配列モチーフ」は、n個のアミノ酸残基を含む近接するアミノ酸配列を意味し、この場合nは5から15である。pH7.0で正に荷電している(塩基性の)天然に存在するアミノ酸は、Arg、His、およびLysである。pH7.0で負に荷電している(酸性の)天然に存在するアミノ酸残基は、GluおよびAspである。反対の電荷のアミノ酸残基の混合物を含むアミノ酸モチーフは、電荷の全体の比率が特定の基準を満たす限り用いることができる。一実施形態において、設計されたポリペプチドはホモポリマーではない。 As defined above, a designed polypeptide refers to a polypeptide comprising one or more amino acid sequence motifs, the polypeptide is at least 15 amino acid residues long, and per polypeptide residue The magnitude of the effective charge is 0.4 or more at pH 7.0. “Amino acid sequence motif” means a contiguous amino acid sequence comprising n amino acid residues, where n is 5 to 15. The naturally occurring amino acids that are positively charged (basic) at pH 7.0 are Arg, His, and Lys. The naturally occurring amino acid residues that are negatively charged (acidic) at pH 7.0 are Glu and Asp. Amino acid motifs containing a mixture of oppositely charged amino acid residues can be used as long as the overall proportion of charges meets certain criteria. In one embodiment, the designed polypeptide is not a homopolymer.

一つの例示の実施形態において、アミノ酸配列モチーフは7アミノ酸残基を含む。荷電したアミノ酸が4個であるのがモチーフサイズ7に適する最低である、というのは荷電が4未満であるとペプチドの可溶性の低下、およびELBLにわたる制御の低減をもたらすからである。さらに、生体適合性に関して、ゲノムのデータにおいて同定された各アミノ酸配列モチーフは、連続のエピトープを構成するには7アミノ酸残基では十分長いが、実質的にタンパク質の表面上およびその内部両方における残基に対応するにはそれほど長くない。したがって、アミノ酸配列モチーフの荷電および長さは、ゲノムのデータにおいて同定されたアミノ酸配列モチーフが、それに配列モチーフが由来するフォールディングされたタンパク質の表面上に生じる可能性があるということを確かめるのを助ける。これとは対照的に、非常に短いモチーフは、身体にとってランダムな配列または特に「自己」ではなく思われ得るものであり、したがって免疫反応を誘発し得る。 In one exemplary embodiment, the amino acid sequence motif comprises 7 amino acid residues. Four charged amino acids are the minimum suitable for motif size 7, since a charge of less than 4 results in reduced peptide solubility and reduced control over ELBL. Furthermore, for biocompatibility, each amino acid sequence motif identified in the genomic data is long enough for 7 amino acid residues to constitute a contiguous epitope, but substantially remains both on the surface of the protein and within it. It is not so long to respond to the group. Thus, the charge and length of the amino acid sequence motif helps to ensure that the amino acid sequence motif identified in the genomic data can occur on the surface of the folded protein from which the sequence motif is derived. . In contrast, very short motifs can appear to the body rather than a random sequence or especially “self” and thus can elicit an immune response.

いくつかの場合において、アミノ酸配列モチーフおよび設計されたポリペプチドに関する設計の問題は、2次構造、とりわけαヘリックスまたはβシートを形成するこれらの性向である。いくつかの実施形態において、薄いフィルム層の形成にわたって制御を最大にするために、水性媒体中の設計されたポリペプチドによって、2次構造の形成を制御、例えば最小にすることができるのが望ましい。第1に、長いモチーフは溶液中で安定な3次構造をとりがちになるので、配列モチーフが比較的短い、すなわち約5から約15アミノ酸残基であるのが好ましい。第2に、設計されたポリペプチドにおける連続したアミノ酸配列モチーフ間で共有結合により連結している、グリシンまたはプロリン残基などのリンカーは、ポリペプチドが溶液中で2次構造をとる性向を低減する。例えば、グリシンはαヘリックスの性向が非常に低く、βシートの性向が非常に低く、このためグリシンおよびその近隣のアミノ酸が水溶液中で規則的な2次構造を形成するのはエネルギー的に非常に不都合になっている。第3に、設計されたポリペプチド自体のαヘリックスおよびβシートの性向は、それに対する合計されたαヘリックスの性向が7.5未満であり、合計されたβシートの性向が8未満であるアミノ酸配列モチーフを選択することによって最小にすることができる。「合計された」性向は、モチーフにおけるアミノ酸全てのαヘリックスまたはβシートの性向の和を意味する。合計されたαヘリックスの性向および/または合計されたβシートの性向がいく分より高いアミノ酸配列モチーフは、特にGlyまたはProなどのリンカーによって連結された場合、ELBLに適する。ある適用において、ポリペプチドが2次構造を形成する性向は、薄いフィルムの製作の特定の設計の特徴として比較的高いことがある。天然に存在する20種のアミノ酸全てに対する2次構造の性向は、ChouおよびFasmanの方法を用いて計算することができる(その全文が参照によって本明細書に組み込まれるP.ChouおよびG.Fasman、Biochemistry、13巻、211頁(1974年)（非特許文献１）を参照されたい。) In some cases, the design problem with amino acid sequence motifs and designed polypeptides is their propensity to form secondary structures, especially alpha helices or beta sheets. In some embodiments, it is desirable to be able to control, eg, minimize, the formation of secondary structure by a designed polypeptide in an aqueous medium to maximize control over the formation of a thin film layer. . First, it is preferred that the sequence motif is relatively short, ie, about 5 to about 15 amino acid residues, since long motifs tend to have a stable tertiary structure in solution. Second, linkers such as glycine or proline residues that are covalently linked between consecutive amino acid sequence motifs in the designed polypeptide reduce the propensity of the polypeptide to assume secondary structure in solution. . For example, glycine has a very low propensity for α-helices and a very low propensity for β-sheets, which makes it very energetically that glycine and nearby amino acids form regular secondary structures in aqueous solution. It is inconvenient. Third, the α-helix and β-sheet propensity of the designed polypeptide itself is an amino acid sequence motif in which the total α-helix propensity is less than 7.5 and the total β-sheet propensity is less than 8 Can be minimized by selecting. The “summed” propensity means the sum of the propensity of the α helix or β sheet of all amino acids in the motif. Amino acid sequence motifs with somewhat higher total helix propensity and / or total β-sheet propensity are suitable for ELBL, especially when linked by linkers such as Gly or Pro. In certain applications, the propensity for polypeptides to form secondary structures may be relatively high as a particular design feature of thin film fabrication. Secondary structure propensity for all 20 naturally occurring amino acids can be calculated using the Chou and Fasman method (P. Chou and G. Fasman, the entire text of which is incorporated herein by reference, (See Biochemistry, Vol. 13, p. 211 (1974) (Non-Patent Document 1).)

別の設計の問題は、ポリペプチドのELBLフィルムの安定性の制御である。イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および疎水性の相互作用は、多層フィルムの安定性に寄与する。さらに、同じ層内または隣接する層におけるポリペプチドにおけるスルフヒドリル含有アミノ酸間に形成される共有結合によるジスルフィド結合が、構造上の強度を増大することができる。スルフヒドリル含有アミノ酸には、システインおよびホモシステインが含まれる。さらに、スルフヒドリルは、D,L-β-アミノ-β-シクロヘキシルプロピオン酸、D,L-3-アミノブタン酸、または5-(メチルチオ)-3-アミノペンタン酸などのβアミノ酸に加えることができる。スルフヒドリル含有アミノ酸は、酸化電位における変化によって多層ポリペプチドフィルムの層を「ロック」(一緒に結合する)し、「アンロック」するのに用いることができる。また、スルフヒドリル含有アミノ酸を、設計されたポリペプチドの配列モチーフを組み込むことにより、分子間ジスルフィド結合の形成によって、薄いフィルムの製作において比較的短いペプチドが使用できるようになる。スルフヒドリル含有アミノ酸を含むアミノ酸配列モチーフは、以下に記載する方法を用いて同定されるモチーフのライブラリーから選択してもよく、または新規に設計してもよい。 Another design problem is the control of the stability of the polypeptide ELBL film. Ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals interactions, and hydrophobic interactions contribute to the stability of the multilayer film. Furthermore, covalent disulfide bonds formed between sulfhydryl-containing amino acids in polypeptides within the same layer or in adjacent layers can increase structural strength. Sulfhydryl-containing amino acids include cysteine and homocysteine. In addition, sulfhydryls can be added to beta amino acids such as D, L-beta-amino-beta-cyclohexylpropionic acid, D, L-3-aminobutanoic acid, or 5- (methylthio) -3-aminopentanoic acid. Sulfhydryl-containing amino acids can be used to “lock” (bond together) and “unlock” layers of a multilayer polypeptide film by changes in oxidation potential. Also, incorporating sulfhydryl-containing amino acids into the sequence motif of the designed polypeptide allows the use of relatively short peptides in the production of thin films by the formation of intermolecular disulfide bonds. Amino acid sequence motifs containing sulfhydryl-containing amino acids may be selected from a library of motifs identified using the methods described below, or may be newly designed.

一実施形態において、化学的に合成されても、または宿主の生物体において生成されても、設計されたスルフヒドリル含有ポリペプチドは、未熟なジスルフィド結合の形成を防ぐための還元剤の存在下、ELBLによって構築される。フィルム構築後、還元剤を除去し、酸化剤を加える。酸化剤の存在下では、ジスルフィド結合がスルフヒドリル基間に形成し、その結果チオール基が存在する層内および層間のポリペプチドを一緒に「ロック」する。適切な還元剤には、ジチオスレイトール(「DTT」)、2-メルカプトエタノール(2-ME)、還元されたグルタチオン、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸(TCEP)、およびこれらの1つを超えた化学物質の組合せが含まれる。適切な酸化剤には、酸化されたグルタチオン、tert-ブチルヒドロペルオキシド(t-BHP)、チメロサール、ジアミド、5,5'-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、4,4'-ジチオジピリジン、臭素酸ナトリウム、過酸化水素、テトラチオン酸ナトリウム、ポルフィリンジン(porphyrindin)、オルトヨードソベンゾエート(orthoiodosobenzoate)ナトリウム、およびこれらの1つを超えた化学物質の組合せが含まれる。 In one embodiment, whether designed chemically or produced in a host organism, the designed sulfhydryl-containing polypeptide is ELBL in the presence of a reducing agent to prevent premature disulfide bond formation. Built by. After film construction, the reducing agent is removed and an oxidizing agent is added. In the presence of an oxidizing agent, disulfide bonds form between the sulfhydryl groups, resulting in “locking” together the polypeptides in and between the layers in which thiol groups are present. Suitable reducing agents include dithiothreitol (`` DTT ''), 2-mercaptoethanol (2-ME), reduced glutathione, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP), and one of these. Includes combinations of chemicals beyond. Suitable oxidizing agents include oxidized glutathione, tert-butyl hydroperoxide (t-BHP), thimerosal, diamide, 5,5'-dithio-bis- (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), 4,4 Included are '-dithiodipyridine, sodium bromate, hydrogen peroxide, sodium tetrathionate, porphyrindin, sodium orthoiodosobenzoate, and combinations of more than one of these chemicals.

生体適合性は生物医学的な適用における設計の問題である。このような適用において、理想的には「免疫不活性」なポリペプチドを産生するためのポリマー設計に対するベースとして、ゲノムまたはプロテオミクスの情報が用いられる。この取り組みは、製作またはコーティングされた物体を循環する血液と接触させる場合、特に有用である。アミノ酸配列モチーフは高度に多孔性であるので、これらは、これらが由来するタンパク質の天然のフォールディングされた形態の表面上に典型的に生じる。「表面」は、単に水の粒状の性質のために、溶剤と接触し、または溶剤に接近することができない、フォールディングされたタンパク質の部分である。血液タンパク質において同定されたアミノ酸配列モチーフは、タンパク質が血液中にある間は、効果的に常に細胞および免疫系の分子と接触している。したがって、フォールディングされた血液タンパク質の表面に由来するポリペプチドは、無作為に選択された配列よりも免疫原性が低い可能性がある。設計されたポリペプチドは一般的に生体適合性であるが、免疫反応またはあらゆる他のタイプの生物学的反応の程度は、配列モチーフの特定の詳細にかなり依存し得る。 Biocompatibility is a design issue in biomedical applications. In such applications, genomic or proteomic information is used as a basis for polymer design, ideally to produce “immunoinactive” polypeptides. This approach is particularly useful when contacting fabricated or coated objects with circulating blood. Since amino acid sequence motifs are highly porous, they typically occur on the surface of the natural folded form of the protein from which they are derived. A “surface” is a portion of a folded protein that is inaccessible or inaccessible to a solvent simply because of the granular nature of water. Amino acid sequence motifs identified in blood proteins are effectively always in contact with cells and molecules of the immune system while the protein is in the blood. Thus, a polypeptide derived from the surface of a folded blood protein may be less immunogenic than a randomly selected sequence. Although the designed polypeptides are generally biocompatible, the extent of the immune response or any other type of biological response can be highly dependent on the specific details of the sequence motif.

生物活性は、数々の方法によって、フィルム、コーティング、またはマイクロカプセル中に組み込むことができる。例えば、フィルムを含む設計されたポリペプチドは機能的なドメインを含むことができる。あるいは、生物活性は、ポリペプチドの薄いフィルムによってカプセル化またはコーティングされた別の生物活性分子に付随していてよい。一実施形態において、テンプレートは、タンパク質結晶などの生物活性分子を含む。 Biological activity can be incorporated into films, coatings, or microcapsules by a number of methods. For example, a designed polypeptide comprising a film can comprise a functional domain. Alternatively, the bioactivity may be associated with another bioactive molecule encapsulated or coated with a thin film of polypeptide. In one embodiment, the template comprises a bioactive molecule such as a protein crystal.

この文脈における機能的なドメインは、特異的な生体機能性を有するタンパク質の独立に熱安定性の領域(例えば、結合性ホスホチロシン)である。多ドメインタンパク質では、例えば、ホスホチロシン結合性ドメインおよびタンパク質チロシンホスファターゼドメインを包含するタンパク質であるテンシンにおいて、複数の機能的なドメインが存在することができる。多層フィルム中に組み込まれた設計されたポリペプチドにおいて機能的なドメインを包含することで、例えば、特異的なリガンド結合、in vivoにおけるターゲティング、バイオセンシング、および生体触媒を含む、望ましい機能性を有するフィルムを提供することができる。 A functional domain in this context is an independently thermostable region (eg, binding phosphotyrosine) of a protein with specific biofunctionality. In a multidomain protein, there can be multiple functional domains, for example, in tensin, a protein that includes a phosphotyrosine binding domain and a protein tyrosine phosphatase domain. Inclusion of functional domains in engineered polypeptides incorporated in multilayer films has desirable functionality, including, for example, specific ligand binding, in vivo targeting, biosensing, and biocatalysis A film can be provided.

生物活性分子は、タンパク質、タンパク質の機能的なフラグメント、設計されたポリペプチドの部分ではないタンパク質の機能的なフラグメント、タンパク質の複合体、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、リボソーム、活性の治療物質、リン脂質、多糖、リポ多糖、機能的な膜フラグメント、膜構造、ウイルス、病原体、細胞、細胞の凝集体、細胞小器官、脂質、炭水化物、薬剤、または抗微生物剤であってよい。生物活性分子は、秩序だった、または無構造の結晶の形態であってよい。タンパク質は、酵素であってもよく、または抗体であってもよい。基質は生物活性分子を含むことができる。一実施形態において、基質は、反対に荷電したポリペプチドの層の沈着の前にその表面上に沈着した生物活性分子を有する。別の一実施形態において、基質は生物活性分子を含む結晶である。 Bioactive molecules include proteins, functional fragments of proteins, functional fragments of proteins that are not part of the designed polypeptide, protein complexes, oligopeptides, oligonucleotides, nucleic acids, ribosomes, active therapeutic agents, It can be a phospholipid, polysaccharide, lipopolysaccharide, functional membrane fragment, membrane structure, virus, pathogen, cell, cell aggregate, organelle, lipid, carbohydrate, drug, or antimicrobial agent. The bioactive molecule may be in the form of ordered or unstructured crystals. The protein may be an enzyme or an antibody. The substrate can include a bioactive molecule. In one embodiment, the substrate has a bioactive molecule deposited on its surface prior to deposition of the oppositely charged layer of polypeptide. In another embodiment, the substrate is a crystal comprising a bioactive molecule.

一実施形態において、アミノ酸配列モチーフは新規に設計される。他の実施形態において、アミノ酸配列モチーフは、ヒトゲノムなどの特定の生物体のゲノムまたはプロテオミクスの情報から選択される。例えば、補体C3(gi/68766)またはラクトトランスフェリン(gi/4505043)の1次構造を用いて、ヒト血液タンパク質におけるアミノ酸配列モチーフを検索することができる。 In one embodiment, the amino acid sequence motif is newly designed. In other embodiments, the amino acid sequence motif is selected from genomic or proteomic information of a particular organism, such as the human genome. For example, the primary structure of complement C3 (gi / 68766) or lactotransferrin (gi / 4505043) can be used to search for amino acid sequence motifs in human blood proteins.

ポリペプチドにおける第1のアミノ酸配列モチーフを同定する方法は、ポリペプチドにおけるスターターのアミノ酸残基を選択するステップ;正および負の荷電の出現に対する、ポリペプチドにおけるスターターのアミノ酸残基およびそれに続くn-1個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を試験するステップ(この場合、nは5から15である);pH7の5〜15アミノ酸残基の側鎖の実効電荷が0.4*n以上である場合は、アミノ酸配列モチーフとして5〜15アミノ酸残基を決定するステップ;またはpH7の5-15のアミノ酸残基の側鎖の実効電荷が0.4*n未満の場合は、配列を捨てるステップを含む。 A method of identifying a first amino acid sequence motif in a polypeptide comprises selecting a starter amino acid residue in the polypeptide; a starter amino acid residue in the polypeptide and the subsequent n − against the appearance of positive and negative charges. Testing an amino acid sequence containing one amino acid residue (in this case, n is 5 to 15); if the net side charge of 5-15 amino acid residues at pH 7 is greater than or equal to 0.4 * n Determining 5-15 amino acid residues as amino acid sequence motifs; or discarding the sequence if the side chain net charge of 5-15 amino acid residues at pH 7 is less than 0.4 * n.

一実施形態において、中性または負に荷電しているアミノ酸だけを含む、長さnの負に荷電したアミノ酸配列モチーフを求めてタンパク質配列データを検索するプロセスは以下に記載するとおりである。第1に、第1のアミノ酸残基を、タンパク質配列において選択する。第2に、このアミノ酸残基およびそれに続くn-1個のアミノ酸残基を、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、またはリジン(Lys)(中性のpHで正に荷電していることがある天然に存在する3つのアミノ酸)の出現に対して試験する(nは5から15である)。第3に、1つまたは複数のArg、His、またはLys残基がこれらn個のアミノ酸残基に見られる場合、第2のアミノ酸残基で改めてプロセスを開始する。しかし、これらn個の残基においてArg、His、またはLysが見られない場合は、n個の残基を試験して、グルタミン酸(Glu)および/またはアスパラギン酸(Asp)(中性のpHで負に荷電している2つのアミノ酸)の出現の数を決定する。第4に、n個の残基において少なくとも0.4*nのGluおよび/またはAspの出現が存在する場合、負に荷電したアミノ酸配列モチーフとして配列を登録する。しかし、0.4*n未満の負に荷電したアミノ酸残基の出現が見られる場合、第1のアミノ酸残基で始まる配列を捨て、例えば、第1のアミノ酸残基にすぐに隣接する第2のアミノ酸残基でプロセスを新たに開始する。モチーフを登録した後、第2のアミノ酸残基で改めてプロセスを開始することができる。 In one embodiment, the process of searching protein sequence data for a negatively charged amino acid sequence motif of length n that includes only neutral or negatively charged amino acids is as described below. First, the first amino acid residue is selected in the protein sequence. Second, this amino acid residue and the subsequent n-1 amino acid residues are arginine (Arg), histidine (His), or lysine (Lys) (which must be positively charged at neutral pH. Test for the appearance of (3 naturally occurring amino acids) (n is 5 to 15). Third, if one or more Arg, His, or Lys residues are found in these n amino acid residues, the process begins again at the second amino acid residue. However, if Arg, His, or Lys is not found in these n residues, then the n residues are examined and glutamic acid (Glu) and / or aspartic acid (Asp) (at neutral pH) Determine the number of occurrences of two negatively charged amino acids). Fourth, if there are at least 0.4 * n occurrences of Glu and / or Asp in n residues, the sequence is registered as a negatively charged amino acid sequence motif. However, if the appearance of a negatively charged amino acid residue of less than 0.4 * n is seen, discard the sequence starting with the first amino acid residue, e.g. the second amino acid immediately adjacent to the first amino acid residue Start a new process at the residue. After registering the motif, the process can be started again with the second amino acid residue.

正に荷電した配列モチーフを同定するためのプロセスは、中性または正に荷電しているアミノ酸残基だけを含むn個の残基長のアミノ酸配列を求めてタンパク質配列データを検索するのと類似しており、中性のpHでそれに対するアミノ酸残基の側鎖の実効電荷は、0.4*n以上である。 The process for identifying positively charged sequence motifs is similar to searching protein sequence data for an amino acid sequence that is n residues long and contains only neutral or positively charged amino acid residues. The effective charge of the side chain of the amino acid residue relative to that at a neutral pH is 0.4 * n or more.

モチーフにおいて正および負に荷電した両方のアミノ酸残基を許す、長さn個の負に荷電したアミノ酸配列モチーフまたは正に荷電したアミノ酸配列モチーフを同定するためのプロセスも類似している。例えば、長さn個の正に荷電したアミノ酸配列モチーフを同定するための手順は、ポリペプチドにおける第1のアミノ酸残基を選択することである。次に、このアミノ酸残基およびそれに続くn-1個のアミノ酸残基を、pH7で正または負に荷電している残基の出現に対して試験する。n個のアミノ酸残基の側鎖の実効荷電を決定する。実効荷電の絶対値が0.4*n未満である場合は、配列を捨て、別のアミノ酸で新たな検索を開始し、実効荷電の絶対値が0.4*n以上である場合、配列はアミノ酸配列モチーフである。実効荷電がゼロを超える場合モチーフは正であり、実効荷電がゼロ未満である場合は負である。 The process for identifying n negatively charged amino acid sequence motifs or positively charged amino acid sequence motifs that allow both positively and negatively charged amino acid residues in the motif is similar. For example, a procedure for identifying n positively charged amino acid sequence motifs in length is to select the first amino acid residue in the polypeptide. This amino acid residue and the subsequent n-1 amino acid residues are then tested for the occurrence of positively or negatively charged residues at pH 7. Determine the net charge on the side chain of n amino acid residues. If the absolute value of the effective charge is less than 0.4 * n, the sequence is discarded and a new search is started with another amino acid, and if the absolute value of the effective charge is 0.4 * n or more, the sequence is an amino acid sequence motif. is there. The motif is positive if the effective charge exceeds zero, and negative if the effective charge is less than zero.

本明細書で定義するアミノ酸配列モチーフの新規な設計は、配列が天然で見出されるものに限定されない以外は、本質的に同様の法則に従う。モチーフ長n、ならびに望ましい符号および実効電荷の大きさを選択する。次いで、n個のアミノ酸の実効電荷の絶対値が0.4*n以上となるように、望ましい符号および電荷の大きさをもたらすアミノ酸配列モチーフに対してn個のアミノ酸を選択する。アミノ酸配列モチーフの新規の設計の潜在的な利点は、特定の知られているタンパク質配列において見られるアミノ酸に限定されないで、望ましい実効電荷を達成するために、全てのアミノ酸(天然に存在する20種のアミノ酸および全ての非天然のアミノ酸)の中から専門家が選択することができることである。アミノ酸のプールが大きいほど、ゲノム配列におけるアミノ酸配列モチーフの同定に比べて、モチーフの配列を設計するのに選択することができる、物理的、化学的、および/または生物学的性質の潜在的な範囲が広くなる。 The novel design of the amino acid sequence motif as defined herein follows essentially the same rules, except that the sequence is not limited to that found in nature. Choose the motif length n and the desired sign and net charge magnitude. The n amino acids are then selected for the amino acid sequence motif that yields the desired sign and charge magnitude so that the absolute value of the net charge of the n amino acids is 0.4 * n or greater. The potential benefits of the novel design of amino acid sequence motifs are not limited to the amino acids found in certain known protein sequences, but all amino acids (20 naturally occurring species) are used to achieve the desired net charge. Of amino acids and all non-natural amino acids). The larger the pool of amino acids, the greater the potential for physical, chemical, and / or biological properties that can be selected to design the motif sequence compared to the identification of amino acid sequence motifs in the genomic sequence. The range becomes wider.

本明細書で定義する設計されたポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフを含む。ELBL用にポリペプチドを設計するのに、同じモチーフが繰り返されてよく、または異なるモチーフが連結されてもよい。一実施形態において、アミノ酸配列モチーフは介在配列なしに共有結合により連結されている。別の一実施形態において、設計されたポリペプチドは、リンカーによって共有結合により連結されている2つ以上のアミノ酸配列モチーフを含む。リンカーはアミノ酸ベース、例えば、グリシンもしくはプロリンなどの1つまたは複数のアミノ酸残基であってもよく、あるいは2つのアミノ酸配列モチーフを共有結合により連結するのに適するあらゆる他の化合物であってもよい。一実施形態において、リンカーは1〜4アミノ酸残基、例えば、1〜4個のグリシン残基および/またはプロリン残基を含んでいる。リンカーは、設計されたポリペプチドが、0.4以上の1残基あたりの実効電荷の大きさを維持するように、適切な長さまたは組成を含む。 A designed polypeptide as defined herein comprises one or more amino acid sequence motifs. In designing a polypeptide for ELBL, the same motif may be repeated or different motifs may be linked. In one embodiment, the amino acid sequence motifs are covalently linked without intervening sequences. In another embodiment, the designed polypeptide comprises two or more amino acid sequence motifs that are covalently linked by a linker. The linker may be amino acid based, for example one or more amino acid residues such as glycine or proline, or any other compound suitable for covalently linking two amino acid sequence motifs. . In one embodiment, the linker comprises 1 to 4 amino acid residues, such as 1 to 4 glycine residues and / or proline residues. The linker comprises a suitable length or composition so that the designed polypeptide maintains a magnitude of net charge per residue of 0.4 or greater.

一実施形態において、設計されたポリペプチドは、15アミノ酸残基長以上である。他の実施形態において、設計されたポリペプチドは、18、20、25、30、32または35アミノ酸長を超える。1000残基が、ポリペプチド長の実際の上限である。 In one embodiment, the designed polypeptide is at least 15 amino acid residues long. In other embodiments, the designed polypeptide is greater than 18, 20, 25, 30, 32, or 35 amino acids in length. 1000 residues is the practical upper limit for polypeptide length.

アミノ酸配列モチーフが選択され、または新規に設計されたら、アミノ酸ベースのリンカーを有する設計されたポリペプチドを、固相合成およびF-mocの化学、または遺伝子クローニングおよび形質転換後の細菌における異種性の発現などの、当技術分野ではよく知られている方法を用いて合成する。設計されたポリペプチドは、Global Peptide(Ft Collins、Colorado)などのペプチド合成会社によって合成してもよく、ペプチド合成機を用いて実験室で生成してもよく、または組換えDNA法によって生成してもよい。ペプチド合成のあらゆる新奇な方法の開発はペプチドの生成を亢進するが、本明細書に記載するようなペプチドの設計を根本的に変更するものではない。 Once an amino acid sequence motif has been selected or newly designed, the designed polypeptide with an amino acid-based linker can be transformed into heterologous in bacteria after solid phase synthesis and F-moc chemistry, or gene cloning and transformation. Synthesize using methods well known in the art, such as expression. The designed polypeptide may be synthesized by peptide synthesis companies such as Global Peptide (Ft Collins, Colorado), may be generated in the laboratory using a peptide synthesizer, or may be generated by recombinant DNA methods. May be. The development of any novel method of peptide synthesis enhances peptide production, but does not fundamentally change the design of peptides as described herein.

合成後、第1層のポリペプチドを治療物質に可逆的に連結する。可逆的連結には、適切な刺激に曝されたときに治療物質が第1層のポリペプチドから放出される限り、共有結合および非共有結合の両方が含まれる。治療物質は、天然に見られるように、または結合および放出を促進するように化学的に修飾されるように、ポリペプチドのN末端、C末端、または側鎖に連結していてよい。共有結合による可逆的連結は、例えば、第1層のポリペプチド上の薬物と遊離のスルフヒドリル基、遊離アミノ基、および遊離カルボキシル基の間に形成され得る。非共有結合による可逆的連結には、例えば、イオン結合および疎水性の相互作用が含まれる。 After synthesis, the first layer polypeptide is reversibly linked to the therapeutic agent. Reversible linkage includes both covalent and non-covalent bonds so long as the therapeutic agent is released from the first layer polypeptide when exposed to the appropriate stimulus. The therapeutic agent may be linked to the N-terminus, C-terminus, or side chain of the polypeptide, as found in nature or chemically modified to facilitate binding and release. A covalent reversible linkage can be formed, for example, between a drug on the first layer polypeptide and a free sulfhydryl group, free amino group, and free carboxyl group. Non-covalent reversible linkages include, for example, ionic bonds and hydrophobic interactions.

一実施形態において、治療物質のアルコール基、アミン基またはカルボン酸基は、ペプチドのN末端、C末端、または側鎖に共有結合により結合している。結合の位置は、官能基の選択に依存する。例えば、治療物質がカルボン酸(例えば、アスピリン)である場合、ペプチドのN末端が結合の適切な点である。治療物質がアミン(例えば、アンピシリン)である場合、安定なペプチド連結した活性物質を達成するために、C末端が結合の適切な点である。C末端およびN末端両方の例において、本質的に新しいペプチド結合を形成する1つの単量体単位が、ペプチドの終端に分子を加える。 In one embodiment, the alcohol, amine or carboxylic acid group of the therapeutic agent is covalently attached to the N-terminus, C-terminus, or side chain of the peptide. The position of the bond depends on the choice of functional group. For example, if the therapeutic agent is a carboxylic acid (eg, aspirin), the N-terminus of the peptide is a suitable point for attachment. When the therapeutic agent is an amine (eg, ampicillin), the C-terminus is a suitable point of attachment to achieve a stable peptide-linked active agent. In both the C-terminal and N-terminal examples, one monomeric unit that essentially forms a new peptide bond adds a molecule to the end of the peptide.

治療物質がアミンである場合、アミンをペプチドのC末端に結合させる交互の方法は、アミンに結合を開始させることである。治療物質がアルコールである場合、安定な組成物を達成するために、C末端またはN末端のいずれかが適切な結合の点である。例えば、治療物質がアルコールである場合、アルコールを、ホスゲンまたはトリホスゲンでアルキルクロロホルメートに変換することができる。次いで、この中間体をペプチドのN末端と反応させて、カルバメートによって連結しているペプチド組成物の治療物質を生成する。次いで、カルバメートの治療物質が、腸のペプチダーゼ、アミダーゼ、またはエステラーゼによってペプチドから放出され得る。 When the therapeutic agent is an amine, an alternate way of attaching the amine to the C-terminus of the peptide is to initiate the attachment of the amine. When the therapeutic agent is an alcohol, either the C-terminus or the N-terminus is a suitable point of attachment to achieve a stable composition. For example, if the therapeutic agent is an alcohol, the alcohol can be converted to an alkyl chloroformate with phosgene or triphosgene. This intermediate is then reacted with the N-terminus of the peptide to produce a therapeutic agent for the peptide composition linked by carbamate. The carbamate therapeutic can then be released from the peptide by intestinal peptidase, amidase, or esterase.

あるいは、アルコールの治療物質は、グルタミン酸のガンマカルボキシレートに選択的に結合することができ、次いでこのコンジュゲートはペプチドのC末端に共有結合により結合する。グルタミン酸-治療物質コンジュゲートは二量体とみなすことができるので、この生成物は、グルタミン酸部分がペプチドと治療物質の間のスペーサーとして働くペプチドのC末端に2つの単量体単位を加える。主要なペプチド結合を腸の酵素が加水分解することによって、ペプチドの担体からグルタミン酸-薬物部分が放出される。グルタミン酸残基の新しく形成された遊離アミンは、次いで、分子内伝達反応を受け、その結果、プリオグルタミン酸を同時に形成して治療物質を放出する。 Alternatively, an alcohol therapeutic can be selectively attached to the gamma carboxylate of glutamic acid, which is then covalently attached to the C-terminus of the peptide. Since the glutamate-therapeutic agent conjugate can be considered a dimer, this product adds two monomer units to the C-terminus of the peptide where the glutamate moiety acts as a spacer between the peptide and the therapeutic agent. The glutamic acid-drug moiety is released from the peptide carrier by hydrolysis of the major peptide bonds by intestinal enzymes. The newly formed free amine of the glutamic acid residue then undergoes an intramolecular transfer reaction, resulting in the simultaneous formation of prioglutamic acid to release the therapeutic substance.

治療物質がケトンまたはアルデヒドである場合、ペプチドのN末端、C末端、または側鎖に結合するのに適するペンダント基を有するリンカーを有するケタールが形成される。例えば、グルコースがメチルナルトレキソンと反応する例で示すように、メチルトリボフラノシド(methyltribofuranoside)またはグルコースのメチルナルトレキソンとの反応によってケタールが形成され得る。次いで、糖部分からの残りの遊離のヒドロキシルを、ペプチドのC末端または適切な側鎖に結合させるためにアルコールとして処理してもよい。 When the therapeutic agent is a ketone or aldehyde, a ketal is formed having a linker with a pendant group suitable for attachment to the N-terminus, C-terminus, or side chain of the peptide. For example, as shown in the example where glucose reacts with methylnaltrexone, a ketal can be formed by reaction of methyltribofuranoside or glucose with methylnaltrexone. The remaining free hydroxyl from the sugar moiety may then be treated as an alcohol to attach to the C-terminus of the peptide or the appropriate side chain.

一実施形態において、治療物質はペプチドのN末端に結合している。結合に適するアミノ酸には、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、およびリジンが含まれる。N末端の結合に適する薬物は、典型的には、例えば、イブプロフェン、フロセミド、ゲムフィブロジル、およびナプロキセンなど、コンジュゲートのためにカルボン酸または無機の官能基を提供する。 In one embodiment, the therapeutic agent is attached to the N-terminus of the peptide. Suitable amino acids for coupling include, for example, glutamic acid, aspartic acid, serine, and lysine. Drugs suitable for N-terminal attachment typically provide carboxylic acid or inorganic functional groups for conjugation, such as, for example, ibuprofen, furosemide, gemfibrozil, and naproxen.

一実施形態において、治療物質はペプチドのC末端に結合している。ペプチドへの治療物質のC末端の結合は、複数の活性物質の官能基によって形成され得る。官能基には、アミンおよびこれらの同等物、ならびにアルコールおよびこれらの同等物が含まれる。あらゆるアミノ酸を用いて活性物質をC末端に連結してもよいが、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、およびリジンが特に適切なアミノ酸である。C末端の結合に適する活性物質は、例えば、アテノロール、メトロプロロール、プロパノロール、メチルフェニデート、およびセルトラリンなどのアルコールおよびアミノ官能基を有する活性物質である。 In one embodiment, the therapeutic agent is attached to the C-terminus of the peptide. The C-terminal linkage of the therapeutic agent to the peptide can be formed by multiple active agent functional groups. Functional groups include amines and their equivalents, and alcohols and their equivalents. Any amino acid may be used to link the active substance to the C-terminus, but glutamic acid, aspartic acid, serine, and lysine are particularly suitable amino acids. Suitable active substances for C-terminal attachment are active substances having alcohol and amino functional groups such as, for example, atenolol, metroprolol, propanolol, methylphenidate, and sertraline.

一実施形態において、治療物質はポリペプチドの側鎖に共有結合により結合している。カルボン酸含有の活性物質は、ペプチド側鎖のアミンまたはアルコール基に結合して、それぞれアミドまたはエステルを形成することができる。アミン含有の活性物質は、側鎖のカルボキシレート、カルバミド、またはグアニン基に結合して、アミドまたは新しいグアニン基を形成することができる。さらに、リンカーはペプチドの実質的にあらゆる側鎖が結合することができるように、化合物の全ての化学物質のクラスの群から選択され得る。 In one embodiment, the therapeutic agent is covalently attached to the side chain of the polypeptide. Carboxylic acid-containing actives can be linked to amine or alcohol groups on the peptide side chain to form amides or esters, respectively. Amine-containing actives can be linked to side chain carboxylate, carbamide, or guanine groups to form amides or new guanine groups. Furthermore, the linker may be selected from the group of all chemical classes of the compound so that virtually any side chain of the peptide can be attached.

別の一実施形態において、治療物質のペプチドへの結合は、活性物質とペプチドの間にリンカーを組み込むことによってなされる。リンカーは、ペプチドに共有結合により結合するために、カルボキシレート、アルコール、チオール、オキシム、ヒドラゾン、ヒドラジド、またはアミン基などのペンダント官能基を有さなければならない。一実施形態において、治療物質はアルコールであり、アルコール基はペプチドのN末端にリンカーによって共有結合により結合している。別の一実施形態において、治療物質はケトンまたはアルデヒドであり、それぞれケタールまたはアセタールの形成によってリンカーに結合しており、リンカーはペプチドに結合しているペンダント基を有する。さらに別の一実施形態において、治療物質は、アミド、イミド、イミダゾール、または尿素であり、窒素はリンカーに結合しており、リンカーのペンダント基はペプチドに結合している。 In another embodiment, the therapeutic agent is attached to the peptide by incorporating a linker between the active agent and the peptide. The linker must have a pendant functional group such as a carboxylate, alcohol, thiol, oxime, hydrazone, hydrazide, or amine group in order to covalently attach to the peptide. In one embodiment, the therapeutic agent is an alcohol and the alcohol group is covalently attached to the N-terminus of the peptide by a linker. In another embodiment, the therapeutic agent is a ketone or aldehyde, which is attached to the linker by formation of a ketal or acetal, respectively, and the linker has a pendant group attached to the peptide. In yet another embodiment, the therapeutic agent is an amide, imide, imidazole, or urea, the nitrogen is attached to the linker, and the pendant group of the linker is attached to the peptide.

一実施形態において、第1層のポリペプチドおよび治療物質は、各々遊離のスルフヒドリル基を含んでいる。遊離のスルフヒドリル基を天然に含んでいる適切な治療物質には、例えば、システアミン、ジメルカプロール、2-メルカプトエタンスルホネートナトリウム、アセチルシステイン、オマパトリラート、カプトプリルなどが含まれる。さらに、遊離のスルフヒドリル基が存在しない既知の治療物質を、遊離のスルフヒドリル基を含むように化学的方法によって修飾することができる。 In one embodiment, the first layer polypeptide and the therapeutic agent each contain a free sulfhydryl group. Suitable therapeutic agents that naturally contain a free sulfhydryl group include, for example, cysteamine, dimercaprol, sodium 2-mercaptoethanesulfonate, acetylcysteine, omapatrilate, captopril, and the like. Furthermore, known therapeutic agents that are free of free sulfhydryl groups can be modified by chemical methods to include free sulfhydryl groups.

高分子電解質の多層フィルムを作成する方法は、複数の層の反対に荷電した高分子電解質を基質上に沈着させることを含む。連続的に沈着した高分子電解質は、反対の実効電荷を有する。本明細書の場合では、可逆的に連結している治療物質を含んでいる少なくとも第1層の高分子電解質が沈着する。図1はELBL沈着を模式的に図示したものである。一実施形態において、設計されたポリペプチドなどの高分子電解質の沈着は、ELBLに適する実効電荷を有するpHで、設計されたポリペプチド(または他の高分子電解質)を含む水溶液に基質を曝すことを含む。他の実施形態において、設計されたポリペプチドまたは他の高分子電解質の基質上への沈着は、反対に荷電した高分子電解質の溶液を逐次的に噴霧することによって実現される。さらに他の実施形態において、基質上への沈着は、反対に荷電した高分子電解質の溶液を同時に噴霧することによる。 A method of making a polyelectrolyte multilayer film includes depositing multiple layers of oppositely charged polyelectrolytes on a substrate. Continuously deposited polyelectrolytes have the opposite net charge. In the present case, at least a first layer of polyelectrolyte containing a reversibly linked therapeutic substance is deposited. FIG. 1 schematically illustrates ELBL deposition. In one embodiment, the deposition of a polyelectrolyte, such as a designed polypeptide, exposes the substrate to an aqueous solution containing the designed polypeptide (or other polyelectrolyte) at a pH with a net charge suitable for ELBL. including. In other embodiments, deposition of the designed polypeptide or other polyelectrolyte onto the substrate is accomplished by sequentially spraying a solution of the oppositely charged polyelectrolyte. In still other embodiments, deposition on the substrate is by simultaneously spraying a solution of oppositely charged polyelectrolytes.

多層フィルムを形成するELBLの方法において、隣接する層の反対の荷電が構築に対する推進力を提供する。対立する層における高分子電解質が同じ線形実効電荷密度を有することは決定的ではなく、対立する層が反対の電荷を有することだけが決定的である。沈着のための1つの標準のフィルム構築手順には、高分子電解質がイオン化されるpH(すなわち、pH4〜10)の高分子電解質の水溶液を形成するステップと、表面に電荷を帯びる基質を提供するステップと、荷電した高分子電解質溶液への基質の浸漬を交互に行うステップとが含まれる。基質は、交互に行う層の沈着の間に、任意選択で洗浄される。 In the ELBL method of forming a multilayer film, the opposite charge of adjacent layers provides the driving force for construction. It is not critical that the polyelectrolytes in the opposing layers have the same linear net charge density, only that the opposing layers have the opposite charge. One standard film construction procedure for deposition provides a step of forming an aqueous solution of polyelectrolyte at the pH at which the polyelectrolyte is ionized (i.e., pH 4-10) and a surface-charged substrate. And alternately immersing the substrate in the charged polyelectrolyte solution. The substrate is optionally washed during alternating layer deposition.

高分子電解質の沈着に適する高分子電解質の濃度は、当業者であれば容易に決定することができる。例示の濃度は0.1mg/mLから10mg/mLである。典型的には、生成される層の厚さは、指定される範囲における沈着の間、ポリイオンの溶液の濃度とは実質的に無関係である。ポリ(アクリル酸)およびポリ(アリルアミン塩酸塩)などの典型的な非ポリペプチドの高分子電解質では、層の厚さは溶液のイオン強度に応じて約3Åから約5Åである。短い高分子電解質は、長い高分子電解質よりも薄い層を形成することが多い。フィルムの厚さに関して、高分子電解質のフィルムの厚さは、湿度ならびに層の数およびフィルムの組成に依存する。例えば、厚さ50nmのPLL/PLGAフィルムは、窒素で乾燥すると1.6nmに収縮する。一般的に、フィルムの水和状態、および構築に用いられる高分子電解質の分子量に応じて、1nmから100nm以上の厚さのフィルムが形成され得る。 A person skilled in the art can easily determine the concentration of the polymer electrolyte suitable for deposition of the polymer electrolyte. Exemplary concentrations are from 0.1 mg / mL to 10 mg / mL. Typically, the thickness of the resulting layer is substantially independent of the concentration of the polyion solution during deposition in the specified range. For typical non-polypeptide polyelectrolytes such as poly (acrylic acid) and poly (allylamine hydrochloride), the layer thickness is about 3 to about 5 cm, depending on the ionic strength of the solution. Short polyelectrolytes often form thinner layers than long polyelectrolytes. With respect to film thickness, the thickness of the polyelectrolyte film depends on humidity and the number of layers and the composition of the film. For example, a 50 nm thick PLL / PLGA film shrinks to 1.6 nm when dried with nitrogen. In general, films with a thickness of 1 nm to 100 nm or more can be formed depending on the hydration state of the film and the molecular weight of the polyelectrolyte used in the construction.

さらに、安定な高分子電解質の多層フィルムを形成するのに必要とされる層の数は、フィルムにおける高分子電解質に依存する。低分子量のポリペプチド層だけを含むフィルムでは、フィルムは典型的には、反対に荷電したポリペプチドの2重層を4つ以上有する。ポリ(アクリル酸)およびポリ(アリルアミン塩酸塩)などの高分子量の高分子電解質を含むフィルムでは、反対に荷電した高分子電解質の2重層を1つ含むフィルムが安定であり得る。 Furthermore, the number of layers required to form a stable polyelectrolyte multilayer film depends on the polyelectrolyte in the film. For films containing only low molecular weight polypeptide layers, the film typically has four or more bilayers of oppositely charged polypeptides. For films comprising high molecular weight polyelectrolytes such as poly (acrylic acid) and poly (allylamine hydrochloride), a film comprising one bilayer of oppositely charged polyelectrolytes can be stable.

別の一実施形態において、ポリペプチドの多層フィルムから治療物質を放出する方法は、可逆的にそれに連結している治療物質を有する第1層のポリペプチドを含む本明細書に記載するポリペプチドの多層フィルムを提供するステップと、可逆的連結から、したがってフィルムから治療物質の放出を刺激するのに適する刺激とフィルムを接触させるステップとを含む。 In another embodiment, a method of releasing a therapeutic agent from a multilayer film of a polypeptide includes a first layer of a polypeptide having a therapeutic agent reversibly linked thereto. Providing a multilayer film and contacting the film with a stimulus suitable for stimulating release of the therapeutic agent from the reversible linkage and thus from the film.

一実施形態において、治療物質の送達は、一般的な全身性の循環中を標的とする。血流および/または消化管のpH環境は、治療物質を放出するのに適する刺激を提供することができる。別の一実施形態において、ペプチドから治療物質を放出するための刺激は、血流におけるペプチド-治療物質のコンジュゲートに対する酵素作用、または消化管におけるペプチド-治療物質のコンジュゲートに対する酵素作用、その後の通常の侵入経路による腸または胃による吸収によって生じる。 In one embodiment, therapeutic agent delivery is targeted to the general systemic circulation. The pH environment of the bloodstream and / or gastrointestinal tract can provide a suitable stimulus for releasing the therapeutic substance. In another embodiment, the stimulus to release the therapeutic agent from the peptide is an enzymatic action on the peptide-therapeutic substance conjugate in the bloodstream, or an enzymatic action on the peptide-therapeutic substance conjugate in the gastrointestinal tract, followed by Caused by absorption by the intestine or stomach through the normal route of entry.

一実施形態において、治療物質は、ペプチドにおけるグルタミン酸残基によって結合している。複合体が、ペプチドの加水分解時にペプチドから放出され、次いで同時の分子内アミノ基転移によってグルタミン酸から治療物質が放出される。別の一実施形態において、グルタミン酸は、アスパラギン酸、アルギニン、アスパラギン、システイン、リジン、スレオニン、およびセリンによって置き換えられ、治療物質はアミノ酸の側鎖に結合して、アミド、チオエステル、エステル、エーテル、チオエーテル、カーボネート、無水物、オルトエステル、ヒドロキサム酸、ヒドラゾン、スルホンアミド、スルホン酸エステル、硫黄のその他の誘導体、またはカルバメートを形成する。さらに別の一実施形態において、グルタミン酸は、例えば、アミン、アルコール、スルフヒドリル、アミド、尿素、または酸の官能性を含むペンダント基を有する合成のアミノ酸によって置換される。 In one embodiment, the therapeutic agent is bound by a glutamic acid residue in the peptide. The complex is released from the peptide upon hydrolysis of the peptide, and then the therapeutic agent is released from glutamic acid by simultaneous intramolecular transamination. In another embodiment, glutamic acid is replaced by aspartic acid, arginine, asparagine, cysteine, lysine, threonine, and serine, and the therapeutic agent is attached to the side chain of the amino acid to form an amide, thioester, ester, ether, thioether. , Carbonates, anhydrides, orthoesters, hydroxamic acids, hydrazones, sulfonamides, sulfonate esters, other derivatives of sulfur, or carbamates. In yet another embodiment, glutamic acid is substituted by a synthetic amino acid having a pendant group containing, for example, an amine, alcohol, sulfhydryl, amide, urea, or acid functionality.

可逆的連結がイオン結合を含む場合、適切な刺激は濃厚な塩の溶液、例えば、1MNaClである。可逆的連結が疎水性の相互作用を含む場合、適切な刺激は界面活性剤溶液、例えば、2%SDSである。可逆的連結がジスルフィド結合を含む場合、治療物質の放出のための刺激として作用する適切な還元剤には、ジチオスレイトール(「DTT」)、2-メルカプトエタノール(2-ME)、還元されたグルタチオン、tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、およびこれらの化学物質の1つを超える組合せが含まれる。 If the reversible linkage involves an ionic bond, a suitable stimulus is a concentrated salt solution, eg, 1M NaCl. If the reversible linkage involves hydrophobic interactions, a suitable stimulus is a surfactant solution, such as 2% SDS. When the reversible linkage includes a disulfide bond, suitable reducing agents that act as stimuli for the release of the therapeutic agent include dithiothreitol (“DTT”), 2-mercaptoethanol (2-ME), reduced Glutathione, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP), and combinations of more than one of these chemicals are included.

本発明を、以下の非限定的な実施例によって、さらに説明する。 The invention is further illustrated by the following non-limiting examples.

(実施例)
［材料と方法］
材料:ペプチド(KVKGKCKV)₃KVKGKCKY(「P1」)および(EVEGECEV)₃EVEGECEY (「N1」)(Genscript, Inc.、USA)は、リジン(K)のプロトン化およびグルタミン酸(E)の脱プロトン化によって、中性のpHでは反対に荷電している。他のアミノ酸残基は、バリン(V)、グリシン(G)、およびCys(C)である。4〜15kDaポリ(L-リジン)(「PLL」)、13kDaポリ(L-グルタミン酸)(「PLGA」)およびDTNBはSigma (USA)からであった。還元剤であるDL-ジチオスレイトール(DTT)はGold Biotechnology, Inc (USA)からであった。他の試薬は全てSigmaからであった。P1、N1、PLL、およびPLGAを、TAバッファー(10mM tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン、10mM酢酸ナトリウム、20mMNaCl、0.1%NaN₃、pH7.4)中、1mg/mLの濃度に溶解した。 (Example)
[Materials and methods]
Materials: Peptides (KVKGKCKV) ₃ KVKGKCKY (`` P1 '') and (EVEGECEV) ₃ EVEGECEY (`` N1 '') (Genscript, Inc., USA) Are oppositely charged at neutral pH. Other amino acid residues are valine (V), glycine (G), and Cys (C). 4-15 kDa poly (L-lysine) (“PLL”), 13 kDa poly (L-glutamic acid) (“PLGA”) and DTNB were from Sigma (USA). The reducing agent DL-dithiothreitol (DTT) was from Gold Biotechnology, Inc (USA). All other reagents were from Sigma. P1, N1, PLL, and PLGA were dissolved at a concentration of 1 mg / mL in TA buffer (10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, 10 mM sodium acetate, 20 mM NaCl, 0.1% NaN ₃ , pH 7.4).

DTNBでのN1の標識化:ペプチドP1およびN1はCys残基を含んでいる。ペプチド上の遊離チオール基は、酸化条件下でDTNB分子と反応する(図2)。このプロセスにおいてTNB分子は、Cys側鎖と混合のジスルフィドを形成し、TNB分子が周囲に放出される。遊離TNBの水溶液は黄色であり、少々塩基性のpHでは412nmに吸収ピークがある。TNBの消衰係数は、条件に応じて11400M^-1cm^-1から14150M^-1cm^-1までの範囲である。 Labeling N1 with DTNB: Peptides P1 and N1 contain Cys residues. Free thiol groups on the peptide react with DTNB molecules under oxidizing conditions (FIG. 2). In this process, the TNB molecule forms a mixed disulfide with the Cys side chain, and the TNB molecule is released into the environment. The aqueous solution of free TNB is yellow and has an absorption peak at 412 nm at a slightly basic pH. Extinction coefficient of the TNB ranges from 11400M ^{^-1} cm ^-1 in accordance with conditions to 14150M ^{^-1} cm ^-1.

「還元性のTAバッファー」(TAバッファー、10mMDTT、pH8.1)にペプチドを溶解し、周囲温度で24時間インキュベートすることによって、担持用に凍結乾燥したN1を調製した。N1溶液2mLを、1000MWCO透析管tubing(SpectroPor(登録商標)7、Spectrum Laboratories,Inc.、USA)中に導入し、撹拌を継続しながら「DTNB溶液」(TAバッファー、10mMDTNB、pH8.1)200mLに対して透析した。1、2、4、および17時間後にDTNB溶液を交換した。標識したN1(LN1)を含む透析バッグを、次いでpH7.4のTAバッファーに浸漬して過剰のDTNBを除去し、pHを8.1から7.4に移動させた。1、2、4、および17時間後にTAバッファーを交換した。pH7.4のTAバッファーでLN1の最終濃度を1mg/mLに調節した。DTTで処理する前および後のLN1のUV吸収スペクトルを図6に示す。 Lyophilized N1 was prepared for loading by dissolving the peptide in “reducing TA buffer” (TA buffer, 10 mM DTT, pH 8.1) and incubating for 24 hours at ambient temperature. Introduce 2 mL of N1 solution into 1000 MWCO dialysis tube tubing (SpectroPor® 7, Spectrum Laboratories, Inc., USA), and continue stirring `` DTNB solution '' (TA buffer, 10 mM TTNB, pH 8.1) 200 mL Was dialyzed against. The DTNB solution was changed after 1, 2, 4, and 17 hours. The dialysis bag containing labeled N1 (LN1) was then immersed in pH 7.4 TA buffer to remove excess DTNB and the pH was moved from 8.1 to 7.4. The TA buffer was changed after 1, 2, 4, and 17 hours. The final concentration of LN1 was adjusted to 1 mg / mL with TA buffer pH 7.4. The UV absorption spectrum of LN1 before and after treatment with DTT is shown in FIG.

ポリペプチドの多層ナノコーティングの構築:ポリペプチドの多層コーティングを、基質を清浄にした後、石英の顕微鏡スライド (Electron Microscopy Sciences、USA)上に構築した。基質を、正に荷電したポリペプチド溶液(P1またはPLL)中および負に荷電したポリペプチド溶液(N1、LN1、またはPLGA)中に、ペプチド吸着ステップ1回あたり15分間、繰返し浸漬した。各ペプチド沈着ステップの後、2分間、1分間、および1分間、別々の脱イオン水浴において、コーティングしたスライドをすすいだ。30層のポリペプチドをこの方法で構築した。以下に示すようにいくつかの場合において、(P1/N1)₂で表されるP1およびN1の2つの「キャッピング」した2重層を、30層のP1/LN1コーティングの上部に構築した。 Construction of multi-layer nano-coating of polypeptides: Multi-layer coatings of polypeptides were constructed on quartz microscope slides (Electron Microscopy Sciences, USA) after cleaning the substrate. The substrate was repeatedly immersed in a positively charged polypeptide solution (P1 or PLL) and in a negatively charged polypeptide solution (N1, LN1, or PLGA) for 15 minutes per peptide adsorption step. The coated slides were rinsed in separate deionized water baths for 2 minutes, 1 minute, and 1 minute after each peptide deposition step. A 30-layer polypeptide was constructed in this way. In some cases, as shown below, two “capped” bilayers of P1 and N1, denoted (P1 / N1) ₂ , were built on top of 30 P1 / LN1 coatings.

ポリペプチド多層ナノコーティングからのTNBの放出:pH7.4のLN1溶液を、脱イオン水で4倍希釈し、DTTを加えて最終濃度2mMとした(図3)。TNB放出プロセスの間中、ロッキングプラットホーム上で混合物を穏やかに振盪した。Shimadzu UV mini 1240UV-Vis分光光度計(日本)で、溶液の吸収スペクトルを記録した。各々の場合において、コーティングは基質の約2cm²を覆っていた。放出媒体3mL(脱イオン水で4倍に希釈したpH7.4のTAバッファー、0、0.1、または1mMDTT)中、P1/LN1コーティングを10枚の別々の石英プレート上に浸漬することによって、TNBの吸収ピークを検出範囲中に入れた。放出媒体の吸光度を、規定された時間点に分光光度計をスキャンすることによって記録した。各コーティングを、第1の吸光度測定用に5分間、およびその後の測定用に15分間浸漬した。フィルム試料および放出媒体を含むビーカーを、放出プロセスの間中穏やかに揺すった。 Release of TNB from polypeptide multilayer nanocoating: LN1 solution at pH 7.4 was diluted 4-fold with deionized water and DTT was added to a final concentration of 2 mM (FIG. 3). The mixture was gently shaken on the rocking platform throughout the TNB release process. The absorption spectrum of the solution was recorded with a Shimadzu UV mini 1240UV-Vis spectrophotometer (Japan). In each case, the coating covered approximately 2 cm ² of the substrate. By immersing the P1 / LN1 coating on 10 separate quartz plates in 3 mL of release medium (pH 7.4 TA buffer diluted 4-fold with deionized water, 0, 0.1, or 1 mM DTT) An absorption peak was included in the detection range. The absorbance of the release medium was recorded by scanning the spectrophotometer at defined time points. Each coating was immersed for 5 minutes for the first absorbance measurement and 15 minutes for subsequent measurements. The beaker containing the film sample and release medium was gently shaken throughout the release process.

(実施例1)
［N1上へのTNBの担持］
DTTは、還元状態においてモノチオールを完全に維持し、ジスルフィドを定量的に還元することができる。ポリペプチドN1をDTTで処理して可能な分子間および分子内ジスルフィド結合を切断し、Cys残基側鎖の遊離チオール基を保護した。得られたN1分子は、各々遊離チオール基をいくつか有しており、少々塩基性の溶液におけるTNBの担持に用いられた(図2)。図2における328nmの吸収ピークはTNBおよびチオールの混合したジスルフィドによるものであり、N1分子へのTNBの担持に成功したことを示している。275nmのチロシン吸収は、近くのUVにおけるTNBの吸収よりも10倍を超えて小さかった。 (Example 1)
[Supporting TNB on N1]
DTT can maintain monothiols completely in the reduced state and quantitatively reduce disulfides. Polypeptide N1 was treated with DTT to break possible intermolecular and intramolecular disulfide bonds to protect the free thiol group on the Cys residue side chain. The resulting N1 molecules each had some free thiol groups and were used to support TNB in a slightly basic solution (FIG. 2). The absorption peak at 328 nm in FIG. 2 is due to the mixed disulfide of TNB and thiol, indicating that TNB was successfully loaded onto the N1 molecule. The tyrosine absorption at 275 nm was more than 10 times smaller than the absorption of TNB in the nearby UV.

(実施例2)
［ポリペプチドの多層の構築］
30層のP1/N1、P1/LN1、P1/PLGA、PLL/N1、およびPLL/PLGAコーティングを、LBLによって石英スライド上に構築した。図3は、数々の吸収ステップでのフィルム厚さにおける蓄積を示している。P1/N1は、最大量の材料の沈着を示した。P1/N1とPLL/PLGAの間の光学的質量における違いは、多層フィルムの蓄積における線形電荷密度の重要性、アミノ酸配列、および重合度を示唆しており、以前の研究と一致している。強力なクーロン力が、反対に荷電した種を両方とも引きつけ、同様に荷電した種をはね返し、フィルムの厚さの増大を制限している。P1/LN1の構築は、PLL/N1およびP1/PLGAの構築に類似する。各々の「担持」されたTNB分子は、ペプチドの疎水性を増大し、これらの実験において単一の負の荷電を加えた。静電気的な相互作用および疎水性の相互作用の両方が、ペプチド構築の挙動およびフィルムの安定性に影響を及ぼす。P1/LN1とP1/N1の間の構築の挙動における違いが、N1上にTNBを担持する間接的な証明であり、図3におけるデータと一致する。 (Example 2)
[Multilayer construction of polypeptides]
Thirty layers of P1 / N1, P1 / LN1, P1 / PLGA, PLL / N1, and PLL / PLGA coatings were constructed on quartz slides by LBL. FIG. 3 shows the accumulation in film thickness at a number of absorption steps. P1 / N1 showed the greatest amount of material deposition. The difference in optical mass between P1 / N1 and PLL / PLGA suggests the importance of linear charge density, amino acid sequence, and degree of polymerization in multilayer film accumulation and is consistent with previous studies. Powerful Coulomb forces attract both oppositely charged species, repel the similarly charged species and limit the increase in film thickness. The construction of P1 / LN1 is similar to the construction of PLL / N1 and P1 / PLGA. Each “supported” TNB molecule increased the hydrophobicity of the peptide and added a single negative charge in these experiments. Both electrostatic interactions and hydrophobic interactions affect peptide building behavior and film stability. The difference in construction behavior between P1 / LN1 and P1 / N1 is an indirect proof of carrying TNB on N1, consistent with the data in FIG.

ポリペプチドの設計は、本明細書に記載する薬物の担持および放出のプロセスにおいて重要な役割を果たしている。TNB分子は、P1上に、およびニワトリ卵白リゾチーム(HEWL)上に担持することができ、このTNBは、DTT添加時に溶液中の標識された分子から放出され得る(データは示さず)。しかし、標識されたP1も標識されたHEWLも、LBLによる多層フィルムの構築に有用ではなかったことが証明された(データは示さず)。pH7.4ではP1およびHEWLは正に荷電しており、TNB基は負に荷電している。単一の分子における荷電の異なる符号の組合せは、線形電荷密度の平均および静電気的なLBLに対する適合性を低減する。HEWLにおける電荷の分配は複雑であり、多数の疎水性基のいくつかは、インタクトな天然の酵素において「疎水性のコア」の形態を呈する。LN1は、それとは対照的に、静電気的なLBLによって多層フィルムを製作するのに有用である。 Polypeptide design plays an important role in the drug loading and release processes described herein. TNB molecules can be carried on P1 and on chicken egg white lysozyme (HEWL), which can be released from labeled molecules in solution upon addition of DTT (data not shown). However, neither labeled P1 nor labeled HEWL proved useful for the construction of multilayer films with LBL (data not shown). At pH 7.4, P1 and HEWL are positively charged and the TNB group is negatively charged. The combination of different signs of charge in a single molecule reduces the average linear charge density and suitability for electrostatic LBL. The distribution of charge in HEWL is complex and some of the many hydrophobic groups take the form of a “hydrophobic core” in intact natural enzymes. In contrast, LN1 is useful for making multilayer films by electrostatic LBL.

(実施例3)
［制御されたTNBの放出］
溶液中のその挙動と同様に(図3)、TNBは、水性の還元環境中に浸漬すると、多層コーティングにおいてLN1から放出された(図5)。412nmの吸収ピーク(図6)は、0.1mMDTT溶液におけるコーティングのインキュベーション時間の関数としてのTNB濃度の変化を示している。図7は、(P1/N1)₂「キャッピング」層あり、およびなしのコーティングからのTNB放出の動態学を比較するものである。0.1mMDTTに対する1次の時定数は8分であった。DTT濃度が高いほど、所与の時間におけるコーティングにおける、DTTのTNBとの衝突の可能性が高くなり、コーティングからのTNBの放出が速くなる。TNBは、温和な酸化的条件下(0mMDTT)では、検出可能レベルまで放出されなかった。1時間後の0.1mMDTT溶液におけるTNBの濃度は、2.2μMであった。LN1を含んでいるコーティングにキャッピング2重層を添加すると、TNBの放出速度が低減した。キャッピングしたフィルムの時定数は19分であり、非キャップのフィルムに対して約2倍大きかった。キャッピング層はTNBを含んでおらず、内向きのDTTの拡散および外向きのTNBの拡散の阻害を阻止することができ、遊離チオール基はTNBおよびDTTに結合することができた(図8)。 (Example 3)
[Controlled TNB release]
Similar to its behavior in solution (FIG. 3), TNB was released from LN1 in the multilayer coating when immersed in an aqueous reducing environment (FIG. 5). The absorption peak at 412 nm (FIG. 6) shows the change in TNB concentration as a function of coating incubation time in 0.1 mM DTT solution. FIG. 7 compares the kinetics of TNB release from coatings with and without the (P1 / N1) ₂ “capping” layer. The first-order time constant for 0.1mMDTT was 8 minutes. The higher the DTT concentration, the more likely the DTT will collide with the TNB in the coating at a given time and the faster the TNB release from the coating. TNB was not released to detectable levels under mild oxidative conditions (0mMDTT). The concentration of TNB in the 0.1 mM DTT solution after 1 hour was 2.2 μM. Adding a capping bilayer to a coating containing LN1 reduced the TNB release rate. The time constant of the capped film was 19 minutes, about twice as large as the uncapped film. The capping layer did not contain TNB and could prevent inward DTT diffusion and inhibition of outward TNB diffusion, and free thiol groups could bind to TNB and DTT (Figure 8). .

TNBは、設計された、負に荷電した32merのCys含有ポリペプチド上に「担持」されており、標識されたポリペプチドはLBLによる多層のナノコーティングを構築するのに用いられており、酸化還元電位における変化はコーティングからのTNBの放出を刺激するのに用いられていた。手法は、コーティングを製作した後、コーティング中に小分子を担持するのと実質的に異なっている。ここに概略した手法は、拡散が制御する担持よりも、小分子を捕捉する、より効率的な手段であると思われ、特定の条件下で環境的に刺激された放出を可能にする。 TNB is “supported” on a designed, negatively charged 32mer Cys-containing polypeptide, and the labeled polypeptide is used to build a multi-layered nanocoating with LBL. Changes in potential have been used to stimulate the release of TNB from the coating. The approach is substantially different from loading small molecules in the coating after the coating is made. The approach outlined here appears to be a more efficient means of capturing small molecules than diffusion-controlled loading, and allows environmentally stimulated release under certain conditions.

「一つの(a)」、および「一つの(an)」、および「その(the)」の語、ならびに類似の指示物の使用は(特に、以下の特許請求の範囲における文脈において)、本明細書において別段の指摘がなく、または文脈によって明らかに否定されなければ、単数および複数の両方を網羅すると解釈されたい。本明細書で用いられる、第1、第2などの語は、いかなる特定の順序付けを指すことを意味するものではないが、単に便宜上、例えば層が複数であることを指すことを意味するものである。「含む(comprising)」、「有する」、「含む(including)」、および「含む(containing)」の語は、別段の言及がなければ制限のない語(すなわち、「含むがそれに限定されない」を意味する)と解釈されたい。値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指摘がなければ、範囲内にある各々の別な値を個々に意味する即時的な方法として作用することを単に企図するものであり、各々の別な値は、それが個々に本明細書に列挙されるごとく本明細書中に組み込まれる。全ての範囲のエンドポイントは範囲内に含まれ、個々に組合せ可能である。本明細書に記載する方法は全て、本明細書において別段の指摘がなければ、またはそうでなければ文脈によって明らかに否定されなければ、適切な順序で行うことができる。いかなる全ての例、または例示の言語(例えば、「など」)の使用は、本発明をより良好に説明することが単に企図され、別の方法で要求されなければ、本発明の範囲に対する限定を提示するものではない。本明細書における言語は、本明細書で用いられる本発明の実践に本質的であるとして、あらゆる非請求の要素を示すものと解釈してはならない。 The use of the words "a" and "an" and "the", and similar indicators (especially in the context of the following claims) Unless stated otherwise in the specification or clearly denied by context, it should be construed as covering both singular and plural. As used herein, the terms first, second, etc. are not meant to refer to any particular ordering, but merely for convenience, eg, to refer to a plurality of layers. is there. The terms `` comprising '', `` having '', `` including '', and `` containing '' refer to the word without limitation (i.e., `` including but not limited to '') unless stated otherwise. Should be interpreted. The recitation of a range of values is merely intended to act as an immediate way to individually mean each different value within the range, unless otherwise indicated herein. Other values are incorporated herein as they are individually listed herein. All range endpoints are included within the range and can be combined individually. All of the methods described herein can be performed in an appropriate order unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted by context. Use of any and all examples, or exemplary languages (e.g., "etc.") is merely intended to better describe the invention and, unless otherwise required, limits the scope of the invention. It is not something to present. No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element as essential to the practice of the invention used herein.

本発明を、例示の実施形態に関して記載してきたが、当業者であれば様々な変更を行うことができ、本発明の範囲から逸脱せずにその要素に対する同等物を置き換えることができることが理解されよう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱せずに、本発明の教示に特定の状況または材料を適用させるために、多くの改変を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を行うために企図される最善の様式として開示される特定の実施形態に限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある全ての実施形態を含むことが企図される。本明細書において別段の指摘がなければ、またはそうでなければ文脈によって明らかに否定されなければ、全ての可能な変形における上記に記載した要素のあらゆる組合せが本発明に包含される。 Although the invention has been described with reference to illustrative embodiments, it will be understood that various modifications can be made by those skilled in the art and equivalents thereof may be substituted without departing from the scope of the invention. Like. In addition, many modifications may be made to apply a particular situation or material to the teachings of the invention without departing from the essential scope thereof. Accordingly, the invention is not limited to the specific embodiments disclosed as the best mode contemplated for carrying out the invention, but the invention is intended to cover all embodiments within the scope of the appended claims. Are contemplated. All combinations of the above-described elements in all possible variations are encompassed by the invention unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted by context.

Claims

2つ以上の高分子電解質層を含み、隣接する層が反対に荷電している高分子電解質を含む多層フィルムであって、
第1層の高分子電解質は1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフを含む第1層のポリペプチドを含み、
1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフは5から15アミノ酸からなり、0.4以上の1残基あたりの実効電荷を有し、
第1層のポリペプチドは少なくとも15アミノ酸長であり、pH7で第1層のポリペプチドの全長の約2分の1以上の電荷のバランスを有し、
第1層のポリペプチドは第1層のポリペプチドのN末端またはC末端に可逆的に、共有結合により連結している治療物質を含み、
第2層は、1000を超える分子量および1分子あたり少なくとも5の電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む第2層の高分子電解質を含み、第2層はポリペプチドを含まない、多層フィルム。 A multilayer film comprising a polyelectrolyte comprising two or more polyelectrolyte layers, wherein adjacent layers are oppositely charged,
The first layer polyelectrolyte comprises a first layer polypeptide comprising one or more first amino acid sequence motifs;
The one or more first amino acid sequence motifs consist of 5 to 15 amino acids, have a net charge per residue of 0.4 or more,
The first layer polypeptide is at least 15 amino acids long, has a charge balance of at least about one-half of the total length of the first layer polypeptide at pH 7,
The first layer polypeptide comprises a therapeutic agent that is reversibly and covalently linked to the N-terminus or C-terminus of the first layer polypeptide;
The second layer comprises a second layer polyelectrolyte comprising a polycationic or polyanionic material having a molecular weight greater than 1000 and a charge of at least 5 per molecule, wherein the second layer does not comprise a polypeptide.

ポリペプチドおよび治療物質の両方がスルフヒドリル基を含み、可逆的連結がジスルフィド結合である、請求項1に記載の多層フィルム。 The multilayer film of claim 1, wherein both the polypeptide and the therapeutic agent comprise a sulfhydryl group and the reversible linkage is a disulfide bond.

治療物質のアルコール基、アミン基またはカルボン酸基が、ポリペプチドのN末端またはC末端に共有結合により結合している、請求項1に記載の多層フィルム。 Alcohol group of a therapeutic agent, an amine or carboxylic acid groups, are covalently linked to the N-terminus or C-terminal of the polypeptide, the multilayer film according to claim 1.

治療物質とペプチドの結合が、活性物質とペプチドの間にリンカーを組み込むことによってなされ、リンカーがペンダント官能基を含む、請求項1に記載の多層フィルム。 The multilayer film according to claim 1, wherein the binding of the therapeutic substance and the peptide is made by incorporating a linker between the active substance and the peptide, wherein the linker comprises a pendant functional group.

ペンダント官能基が、カルボキシレート基、アルコール基、チオール基、オキシム基、ヒドラゾン基、ヒドラジド基、またはアミン基を含む、請求項4に記載の多層フィルム。 5. The multilayer film of claim 4, wherein the pendant functional group comprises a carboxylate group, an alcohol group, a thiol group, an oxime group, a hydrazone group, a hydrazide group, or an amine group.

マイクロカプセルの形である、請求項1に記載の多層フィルム。 The multilayer film of claim 1 in the form of a microcapsule.

基質上に形成される、請求項1に記載の多層フィルム。 The multilayer film of claim 1 formed on a substrate.

基質が医療器具を含む、請求項7に記載の多層フィルム。 The multilayer film of claim 7, wherein the substrate comprises a medical device.

可逆的連結からの治療物質の放出を刺激するのに適する刺激と接触させることにより、前記可逆的連結から治療物質を放出する、請求項1から8のいずれか一項に記載の多層フィルム。 9. The multilayer film according to any one of claims 1 to 8, wherein the therapeutic substance is released from the reversible linkage by contact with a stimulus suitable to stimulate the release of the therapeutic substance from the reversible linkage.

可逆的連結がジスルフィド結合であり、刺激が還元剤である、請求項9に記載の多層フィルム。 10. The multilayer film according to claim 9, wherein the reversible linkage is a disulfide bond and the stimulus is a reducing agent.

可逆的連結が、アミド、チオエステル、エステル、エーテル、チオエーテル、カーボネート、無水物、オルトエステル、ヒドロキサム酸、ヒドラゾン、スルホンアミド、スルホン酸エステル、またはカルバメートであり、刺激が、血流および/または消化管のpH環境である、請求項9に記載の多層フィルム。 The reversible linkage is an amide, thioester, ester, ether, thioether, carbonate, anhydride, orthoester, hydroxamic acid, hydrazone, sulfonamide, sulfonate ester, or carbamate and the stimulus is blood flow and / or gastrointestinal tract The multilayer film according to claim 9, which has a pH environment of

刺激が、ポリペプチド-治療物質連結に対する酵素作用である、請求項9に記載の多層フィルム。 10. The multilayer film of claim 9, wherein the stimulus is an enzymatic action on the polypeptide-therapeutic substance linkage.

マイクロカプセルの形である、請求項9に記載の多層フィルム。 10. A multilayer film according to claim 9, which is in the form of a microcapsule.

基質上に形成される、請求項9に記載の多層フィルム。 The multilayer film of claim 9 formed on a substrate.

基質が医療器具を含む、請求項14に記載の多層フィルム。 15. A multilayer film according to claim 14, wherein the substrate comprises a medical device.

第2層の高分子電解質を基質に配置するステップであって、第2層の高分子電解質は、1000を超える分子量および1分子あたり少なくとも5の荷電を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含み、第2層はポリペプチドを含まない、ステップと、
第1層のポリペプチドを第2層の高分子電解質上に配置するステップであって、第1層のポリペプチドは1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフを含み、
1つまたは複数の第1のアミノ酸配列モチーフは5から15アミノ酸からなり、0.4以上の1残基あたりの実効電荷を有し、
第1層のポリペプチドは少なくとも15アミノ酸長であり、pH7で第1層のポリペプチドの全長の約2分の1以上の電荷のバランスを有し、
第1層のポリペプチドは第1層のポリペプチドのN末端またはC末端に可逆的に、共有結合により連結している治療物質を含む、ステップと
を含む、ポリペプチドの多層フィルムを構築する方法。 Placing a second layer of polyelectrolyte on a substrate, wherein the second layer of polyelectrolyte comprises a polycationic material or polyanion material having a molecular weight greater than 1000 and a charge of at least 5 per molecule; The two layers do not contain a polypeptide, and a step;
Disposing a first layer polypeptide on a second layer polyelectrolyte, wherein the first layer polypeptide comprises one or more first amino acid sequence motifs;
The one or more first amino acid sequence motifs consist of 5 to 15 amino acids, have a net charge per residue of 0.4 or more,
The first layer polypeptide is at least 15 amino acids long, has a charge balance of at least about one-half of the total length of the first layer polypeptide at pH 7,
And wherein the first layer polypeptide comprises a therapeutic agent reversibly linked to the N-terminus or C-terminus of the first layer polypeptide by a covalent bond, and a method for constructing a multilayer film of the polypeptide .

ポリペプチドおよび治療物質の両方がスルフヒドリル基を含み、可逆的連結がジスルフィド結合である、請求項16に記載の方法。 17. The method of claim 16, wherein both the polypeptide and the therapeutic agent comprise a sulfhydryl group and the reversible linkage is a disulfide bond.

基質が医療器具を含む、請求項16に記載の方法。 The method of claim 16, wherein the substrate comprises a medical device.