JP5458479B2 - Method for producing cadaverine by continuous fermentation - Google Patents
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Description
本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の培養液より、目詰まりが生じにくい分離膜である多孔性膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を培養液に戻すことで発酵に関与する微生物濃度を向上させることにより、高い生産性を得ることを特徴とする連続発酵によるカダベリンの製造方法に関するものである。 The present invention efficiently filters and collects a liquid containing a product through a porous membrane that is a separation membrane that is less likely to be clogged than a culture solution of microorganisms or cultured cells while culturing, and an unfiltered solution. The present invention relates to a method for producing cadaverine by continuous fermentation, characterized in that high productivity is obtained by improving the concentration of microorganisms involved in fermentation by returning to a culture solution.
カダベリンの製造方法に関する技術背景に関して説明する。カダベリンは、石油非依存型のポリマー原料として期待されている。一方、従来、Ｌ−リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することにより、カダベリンが得られることが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら、ポリマー原料として用いるためにはＬ−リジンよりも安価に製造する必要があり、Ｌ−リジンを原料にしてカダベリンを製造することは工業化されていなかった。Ｌ−リジンよりも安価な原料からカダベリンを製造するためには、微生物によるグルコースからの発酵法が考えられる。例えば、カダベリンの組み換え大腸菌での発酵による製造方法（特許文献１参照。）およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する組換え微生物を用いた発酵法によるカダベリンの製造法（特許文献２参照。）が知られている。 The technical background regarding the method for producing cadaverine will be described. Cadaverine is expected as a petroleum-independent polymer raw material. On the other hand, it has been conventionally known that cadaverine can be obtained by boiling L-lysine in cyclohexanol containing a small amount of tetralin peroxide (see Non-Patent Document 1). However, in order to use it as a polymer raw material, it is necessary to produce it at a lower cost than L-lysine, and it has not been industrialized to produce cadaverine using L-lysine as a raw material. In order to produce cadaverine from a raw material cheaper than L-lysine, a fermentation method from glucose by microorganisms can be considered. For example, a method for producing cadaverine by fermentation in recombinant Escherichia coli (see Patent Document 1) and a method for producing cadaverine by fermentation using a recombinant microorganism belonging to the genus Corynebacterium (see Patent Document 2). Are known.
しかしながら、これらのカダベリンの発酵法生産は、バッチ式発酵に関わるもののみであり、いずれのカダベリンの生産方法も生産速度が十分ではなく、更に効率的な生産方法が望まれていた。
そこで本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法によるカダベリンの製造方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for producing cadaverine by a continuous fermentation method that maintains high productivity stably over a long period of time by a simple operation method.
本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で濾過した場合に、膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成した。 As a result of diligent research, the present inventors have found that clogging of the membrane is remarkably suppressed when the microorganisms and cells enter the separation membrane with little penetration and the microorganisms and cells are filtered under a low transmembrane pressure. As a result, it was possible to maintain the stable filtration of high-concentration microorganisms, which was a problem, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流させる連続発酵方法によるカダベリンの製造方法である。具体的に、本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法は、カダベリンを生産する能力を有する微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵によるカダベリンを製造する方法であって、その分離膜として、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にある多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲として低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させるカダベリンの製造方法である。 That is, the present invention separates a culture solution into a filtrate and an unfiltered solution with a separation membrane, collects a desired fermentation product from the filtrate, and holds or refluxs the unfiltered solution in the culture solution. It is a manufacturing method. Specifically, the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention comprises filtering a culture solution of microorganisms or cultured cells having the ability to produce cadaverine through a separation membrane, recovering the product from the filtrate and removing the unfiltered solution. A method for producing cadaverine by continuous fermentation in which a culture solution is retained or refluxed and a fermentation raw material is added to the culture solution, and as the separation membrane, the average pore diameter is in the range of 0.01 μm or more and less than 1 μm. This is a method for producing cadaverine that stably improves the production efficiency of fermentation with low cost by performing filtration with a low transmembrane differential pressure with a transmembrane differential pressure in the range of 0.1 to 20 kPa.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。 According to a preferred aspect of the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention, the porous membrane has a pure water permeability coefficient of 2 × 10 −9 m 3 / m 2 / s / pa or more and 6 × 10 −7 m. 3 / m 2 / s / pa or less.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下であり、そして、その膜表面粗さは０.１μｍ以下である。 According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention, the average pore size of the porous membrane is 0.01 μm or more and less than 0.2 μm, and the standard deviation of the average pore size is 0. 0.1 μm or less, and the film surface roughness is 0.1 μm or less.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔性樹脂層を含む多孔性膜である。 According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention, the porous membrane is a porous membrane including a porous resin layer.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いることである。 According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention, a polyvinylidene fluoride resin is used as the membrane material of the porous membrane.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の微生物は、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性を増強している微生物であることである。 According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention, the microorganism is a microorganism that enhances the enzyme activity of lysine decarboxylase and / or lysine cadaverine antiporter.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の微生物は、大腸菌であることである。According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention, the microorganism is Escherichia coli.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の微生物は、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌であり、そのコリネ型細菌が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることである。 According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine by the continuous fermentation method of the present invention, the microorganism has lysine decarboxylase activity and is homoserine auxotrophic or S- (2-aminoethyl) -L-cysteine. It is a coryneform bacterium having at least one characteristic of resistance, and the coryneform bacterium is deficient in homoserine dehydrogenase activity.
本発明の連続発酵法によるカダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、酸、好ましくはジカルボン酸により培養液のｐＨを維持することでカダベリンをカダベリン塩、好ましくはカダベリン・ジカルボン酸塩として回収することである。
According to a preferred embodiment of the Kadaberi down method for producing by continuous fermentation method of the present invention, acid, preferably cadaverine salt cadaverine by maintaining the pH of the culture solution by a dicarboxylic acid, preferably recovered as cadaverine dicarboxylate That is.
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物であるカダベリンを低コストで安定に生産することが可能となる。 According to the present invention, continuous fermentation that stably maintains a high productivity of a desired fermentation product over a long period of time can be performed under simple operation conditions. This makes it possible to produce stably.
本発明のカダベリンの製造法により得られたカダベリンもしくはカダベリン・ジカルボン酸塩は、例えば、合成繊維の原料として有用である。 The cadaverine or cadaverine dicarboxylate obtained by the method for producing cadaverine of the present invention is useful as a raw material for synthetic fibers, for example.
本発明は、微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵によるカダベリンの製造方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲として濾過処理することを特徴とする連続発酵によるカダベリンの製造方法である。 The present invention is a continuous method in which a culture solution of microorganisms or cultured cells is filtered through a separation membrane, a product is recovered from the filtrate, an unfiltered solution is retained or refluxed in the culture solution, and a fermentation raw material is added to the culture solution. A method for producing cadaverine by fermentation, characterized in that a porous membrane having an average pore diameter of 0.01 μm or more and less than 1 μm is used as a separation membrane, and a filtration treatment is performed with a transmembrane pressure difference in the range of 0.1 to 20 kPa. Is a method for producing cadaverine by continuous fermentation.
本発明で用いられる多孔性膜は、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続するものであることが望ましい。 It is desirable that the porous membrane used in the present invention is not easily clogged by microorganisms and cultured cells used for fermentation, and the filtration performance continues stably for a long period of time.
本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の分離膜である。後述するように、多孔性膜としては、多孔質基材の少なくとも一表面に多孔質樹脂層を有する構造のものが好ましく用いられる。多孔質樹脂層が多孔性膜の両面に存在する場合、少なくとも一方の多孔質樹脂層が、上記の平均細孔径の条件を満たしていればよい。平均細孔径がこの範囲内にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。平均細孔径が、この範囲内にあれば、動物細胞、酵母、糸状菌などを用いた場合、目詰まりが少なく、また、細胞の濾液への漏れもなく安定に連続発酵が実施可能である。また、動物細胞、酵母および糸状菌より小さな細菌類を用いた場合は、０.４μｍ以下の平均細孔であればよりよく、０.２μｍ未満の平均細孔であればなお好適に実施可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、通常は０．０１μｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは、０．０４μｍ以上である。 The porous membrane used in the present invention is a separation membrane having an average pore diameter of 0.01 μm or more and less than 1 μm. As will be described later, a porous membrane having a porous resin layer on at least one surface of a porous substrate is preferably used. When the porous resin layer is present on both surfaces of the porous membrane, it is sufficient that at least one of the porous resin layers satisfies the above average pore diameter condition. If the average pore size is within this range, it is possible to achieve both a high exclusion rate without leaking bacterial cells and sludge and high water permeability, and it is difficult to clog and keep water permeability for a long time. However, it can be implemented with higher accuracy and reproducibility. If the average pore diameter is within this range, when animal cells, yeast, filamentous fungi, or the like are used, clogging is small, and continuous fermentation can be performed stably without leakage of the cells into the filtrate. When bacteria smaller than animal cells, yeast, and filamentous fungi are used, the average pore size is preferably 0.4 μm or less, and the average pore size is less than 0.2 μm, and can be suitably implemented. is there. If the average pore diameter is too small, the water permeability may decrease. Therefore, it is usually preferably 0.01 μm or more, more preferably 0.02 μm or more, and further preferably 0.04 μm or more. .
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋ、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）から算出した。 Here, the average pore diameter can be obtained by measuring and averaging the diameters of all pores that can be observed within a range of 9.2 μm × 10.4 μm in a scanning electron microscope observation at a magnification of 10,000 times. it can. The standard deviation σ of the average pore diameter is preferably 0.1 μm or less. The standard deviation σ of the average pore diameter is Nk, which is the number of pores that can be observed within the above-mentioned range of 9.2 μm × 10.4 μm, and the measured diameter is Xk, and the average pore diameter is X (ave). It was calculated from the following (Formula 1).
本発明で用いられる多孔性膜において、培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。多孔性膜の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、２×１０−９以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。 In the porous membrane used in the present invention, the permeability of the culture solution is one of the important points, and the pure water permeability coefficient of the porous membrane before use can be used as the permeability index. When the pure water permeability coefficient of the porous membrane was calculated by measuring the water permeability at a head height of 1 m using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane, 2 × 10 −9 m 3 / m 2 / s. / Pa or more is preferable, and if it is 2 × 10 −9 or more and 6 × 10 −7 m 3 / m 2 / s / pa or less, a practically sufficient amount of permeated water can be obtained.
本発明で用いられる多孔性膜の表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子であり、好ましくは、その表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗を低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。また、表面粗さが低いことで、微生物や培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物または培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。 The surface roughness of the porous membrane used in the present invention is a factor that affects the clogging of the separation membrane. Preferably, when the surface roughness is 0.1 μm or less, the separation coefficient or membrane resistance of the separation membrane. The continuous fermentation can be carried out with a lower transmembrane pressure difference. In addition, the low surface roughness can be expected to reduce the shearing force generated on the membrane surface during filtration of microorganisms and cultured cells, the destruction of microorganisms or cultured cells is suppressed, and the porous membrane is clogged. It is considered that stable filtration is possible for a long time by being suppressed.
ここで、表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定することができる。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件 探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲 １０μｍ，２５μm 四方（気中測定）
５μｍ，１０μm 四方（水中測定）
走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに１５分浸漬後ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
Here, the surface roughness can be measured under the following conditions using the following atomic force microscope (AFM).
・ Atomic force microscope (Nanoscope IIIa manufactured by Digital Instruments)
・ Condition probe SiN cantilever (manufactured by Digital Instruments)
Scan mode Contact mode (in-air measurement)
Underwater tapping mode (underwater measurement)
Scanning range 10μm, 25μm square (measurement in air)
5μm, 10μm square (underwater measurement)
Scanning resolution 512 × 512
Sample preparation For measurement, the membrane sample was immersed in ethanol at room temperature for 15 minutes, immersed in RO water for 24 hours, washed, and then air-dried. The RO water refers to water that has been filtered using a reverse osmosis membrane (RO membrane), which is a type of filtration membrane, to exclude impurities such as ions and salts. The pore size of the RO membrane is approximately 2 nm or less.
膜の表面粗さｄｒｏｕｇｈは、ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから下記の（式２）から算出した。 The surface roughness d rough of the film was calculated from the following (Equation 2) from the height of each point in the Z-axis direction by AFM.
本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能、透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。好ましい多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。 The porous membrane in the present invention has separation performance and water permeability according to the quality of water to be treated and applications, and in terms of separation performance such as blocking performance, water permeability and dirt resistance, the porous resin layer It is preferable that the film contains a porous film. A preferred porous membrane has a porous resin layer that acts as a separation functional layer on the surface of the porous substrate. The porous substrate supports the porous resin layer and gives strength to the separation membrane.
本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。 When the porous membrane used in the present invention has a porous resin layer on the surface of the porous substrate, the porous substrate is porous even if the porous resin layer penetrates the porous substrate. It does not matter if the porous resin layer does not penetrate, and it is selected according to the application.
多孔質基材の材質としては、有機材料および無機材料等で特に限定されないが、有機繊維が望ましい。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、なかでも、密度の制御が比較的容易であり、製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。 The material of the porous substrate is not particularly limited, and is preferably an organic fiber, such as an organic material and an inorganic material. A preferred porous substrate is a woven fabric or a nonwoven fabric using organic fibers such as cellulose fiber, cellulose triacetate fiber, polyester fiber, polypropylene fiber and polyethylene fiber, and among them, the density control is relatively easy, Nonwoven fabrics that are easy to manufacture and inexpensive are preferably used. The average thickness of the porous substrate is preferably 50 μm or more and 3000 μm or less.
多孔質樹脂層は、上述のように分離機能層として作用するもので、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜は、基本的に有機ポリマー材料から構成される分離膜のことであり、例えば、有機繊維の不織布やマクロポア構造多孔質有機基材と当該多孔質有機基材の孔径より小さな孔径を有する多孔質樹脂層が複合化された構造を持つ場合が多い。 As described above, the porous resin layer functions as a separation functional layer, and an organic polymer membrane can be preferably used. The organic polymer membrane is a separation membrane basically composed of an organic polymer material. For example, a pore size smaller than the pore size of the organic fiber nonwoven fabric or macropore structure porous organic substrate and the porous organic substrate. In many cases, the porous resin layer has a composite structure.
多孔質樹脂層の材質としては、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられ、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。中でも、溶液による製膜が容易で、物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく用いられる。特に、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とするものが最も好ましく用いられる。 The material of the porous resin layer includes polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polyacrylonitrile resin, cellulose resin, and cellulose triacetate. And a mixture of resins mainly composed of these resins may be used. Among them, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin and polyacrylonitrile resin, which are easy to form a film by solution and have excellent physical durability and chemical resistance, Preferably used. In particular, a polyvinylidene fluoride resin or a resin containing the same as the main component is most preferably used.
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、フッ化ビニリデンの単独重合体の他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。このようなビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。 Here, as the polyvinylidene fluoride-based resin, a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used. In addition to a homopolymer of vinylidene fluoride, a copolymer of a vinyl monomer copolymerizable with vinylidene fluoride is used. A polymer is also preferably used. Examples of such vinyl monomers include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and trichlorofluoroethylene.
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。多孔性膜が平膜の場合、その厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下の範囲であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。上述のように、多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されていても良い。 The porous membrane used in the present invention may be a flat membrane or a hollow fiber membrane. When the porous membrane is a flat membrane, its thickness is selected according to the application, but is preferably in the range of 20 μm to 5000 μm, more preferably in the range of 50 μm to 2000 μm. As described above, the porous film may be formed of a porous substrate and a porous resin layer.
多孔性膜が中空糸膜の場合、内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編み物を含んでいても良い。 When the porous membrane is a hollow fiber membrane, the inner diameter is preferably selected in the range of 200 μm to 5000 μm, and the film thickness is preferably selected in the range of 20 μm to 2000 μm. Moreover, the woven fabric and knitting which made the organic fiber or the inorganic fiber the cylinder shape may be included.
次にまず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要の一例を例示して説明する。 Next, an example of the outline of a method for producing a flat film among the porous films will be described as an example.
多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。 A film of a stock solution containing a resin and a solvent is formed on the surface of the porous base material, and the porous base material is impregnated with the stock solution. Thereafter, only the coating-side surface of the porous substrate having a coating is brought into contact with a coagulation bath containing a non-solvent to solidify the resin, and a porous resin layer is formed on the surface of the porous substrate.
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ −メチル− ２− ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ −ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。原液は、先述の樹脂を好ましくは５重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の溶媒に溶解させることにより調製することができる。 The stock solution is prepared by dissolving the resin in a solvent. The temperature of the stock solution is usually preferably selected within the range of 5 to 120 ° C. from the viewpoint of film forming properties. The solvent dissolves the resin and acts on the resin to encourage them to form a porous resin layer. Examples of the solvent include N-methylpyrrolidinone (NMP), N, N-dimethylacetamide (DMAc), N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), N-methyl-2-pyrrolidone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, Tetramethylurea, trimethyl phosphate, cyclohexanone, isophorone, γ-butyrolactone, methyl isoamyl ketone, dimethyl phthalate, propylene glycol methyl ether, propylene carbonate, diacetone alcohol, glycerol triacetate, acetone, and methyl ethyl ketone can be used. Of these, N-methylpyrrolidinone (NMP), N, N-dimethylacetamide (DMAc), N, N-dimethylformamide (DMF) and dimethylsulfoxide (DMSO), which have high resin solubility, are preferably used. These solvents may be used alone or in combination of two or more. The stock solution can be prepared by dissolving the above-mentioned resin in the above-mentioned solvent at a concentration of preferably 5 wt% or more and 60 wt% or less.
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。 Further, for example, components other than the solvent such as polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone and glycerin may be added to the solvent. Non-solvents can also be added to the solvent. The non-solvent is a liquid that does not dissolve the resin. The non-solvent acts to control the pore size by controlling the rate of solidification of the resin. As the non-solvent, water and alcohols such as methanol and ethanol can be used. Of these, water or methanol is preferably used as the non-solvent from the viewpoint of cost. Components other than the solvent and the non-solvent may be a mixture.
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。 A pore opening agent may be added to the stock solution. The pore-opening agent is extracted when immersed in the coagulation bath, and has a function of making the resin layer porous. By adding a pore opening agent, the average pore size can be controlled. The pore-opening agent is preferably one having high solubility in the coagulation bath. As the pore opening agent, for example, an inorganic salt such as calcium chloride or calcium carbonate can be used. As the pore opening agent, polyoxyalkylenes such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, water-soluble polymer compounds such as polyvinyl alcohol, polyvinyl butyral and polyacrylic acid, and glycerin can be used.
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要の一例を例示して説明する。 Next, an example of the outline of a method for producing a hollow fiber membrane among the porous membranes will be described as an example.
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。 The hollow fiber membrane discharges a stock solution composed of a resin and a solvent from the outer tube of the double-tube base, and discharges a hollow portion forming fluid from the inner tube of the double-tube base in a cooling bath. It can be produced by cooling and solidifying.
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を好ましくは２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水性・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。 The stock solution can be prepared by dissolving the resin described in the above-described method for producing a flat film, preferably in a concentration of 20% by weight or more and 60% by weight or less, in the solvent described in the above-described method for forming a flat film. . Moreover, a gas or a liquid can be normally used for the hollow portion forming fluid. In addition, a new porous resin layer can be coated (laminated) on the outer surface of the obtained hollow fiber membrane. Lamination can be performed in order to change the properties of the hollow fiber membrane, for example, hydrophilicity / hydrophobicity or pore diameter, to desired properties. A new porous resin layer to be laminated can be produced by bringing a stock solution obtained by dissolving a resin in a solvent into contact with a coagulation bath containing a non-solvent to coagulate the resin. As the material of the resin, for example, the same material as that of the organic polymer film is preferably used. As a lamination method, the hollow fiber membrane may be immersed in the stock solution, or the stock solution may be applied to the surface of the hollow fiber membrane. After the lamination, a part of the attached stock solution is scraped off or an air knife is used. It is also possible to adjust the stacking amount by blowing it away.
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって膜分離エレメントとして使用することができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に本発明で用いられる多孔性膜を配した多孔性膜エレメントは、本発明で用いられる膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態では、膜面積を大きくすることが困難なので、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。 The porous membrane used in the present invention can be used as a membrane separation element by combining with a support. A porous membrane element in which a support plate is used as a support and the porous membrane used in the present invention is disposed on at least one surface of the support plate is one of the preferred forms of the membrane element used in the present invention. In this embodiment, since it is difficult to increase the membrane area, it is also a preferable aspect to dispose a porous membrane on both surfaces of the support plate in order to increase the water permeability.
本発明において、微生物や細胞を濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲とすることが重要である。濾過の駆動力としては、培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能であり、また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることで制御することができる、またポンプを使用する場合には吸引圧力により制御することができ、更に培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によって制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。 In the present invention, the transmembrane pressure difference during filtration of microorganisms and cells may be any condition as long as the microorganisms, cells and medium components are not easily clogged, but the transmembrane pressure difference is 0.1 kPa or more and 20 kPa or less. It is important to have a range. As a driving force for filtration, it is possible to generate a transmembrane differential pressure in the porous membrane by siphon using the liquid level difference (water head difference) of the culture solution and the porous membrane treated water. As a force, a suction pump may be installed on the porous membrane treated water side, or a pressure pump may be installed on the culture solution side of the porous membrane. The transmembrane pressure can be controlled by changing the liquid level difference between the culture solution and the porous membrane treated water. In addition, when using a pump, it can be controlled by the suction pressure. Can be controlled by the pressure of the gas or liquid introduced. When performing these pressure controls, the pressure difference between the culture fluid side pressure and the porous membrane treated water side can be used as the transmembrane pressure difference and used to control the transmembrane pressure difference.
また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができるものであることが好ましい。また、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、さらに２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the porous membrane used in the present invention can be filtered in the range of 0.1 kPa or more and 20 kPa or less as the transmembrane pressure difference to be filtered. In addition, when the pure water permeability coefficient before use was calculated by measuring the water permeability at a head height of 1 m using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane, 2 × 10 −9 m 3 / m 2 / It is preferably in the range of s / pa or more, and more preferably in the range of 2 × 10 −9 m 3 / m 2 / s / pa to 6 × 10 −7 m 3 / m 2 / s / pa. .
本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物であるカダベリンを良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。 The fermentation raw material used in the present invention may be any material that promotes the growth of the microorganisms to be cultured and can successfully produce cadaverine, which is the target fermentation product, carbon source, nitrogen source, inorganic salts, Ordinary liquid media containing organic micronutrients such as amino acids and vitamins as needed are preferably used.
上記の炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースやラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類およびリセリンなども使用される。ここで糖分とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。 Examples of the carbon source include glucose, sucrose, fructose, saccharides such as galactose and lactose, starch saccharified solution containing these saccharides, sweet potato molasses, sugar beet molasses, high test molasses, and organic acids such as acetic acid, ethanol, etc. Alcohols and lysine are also used. Here, sugar is the first oxidation product of polyhydric alcohol, which is a carbohydrate that has one aldehyde group or ketone group, categorized as aldose, saccharide with aldehyde group, and ketose as sugar with ketone group. Point to.
また上記の窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類および各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。 As the nitrogen source, ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other auxiliary organic nitrogen sources such as oil cakes, soybean hydrolysate, casein decomposition products, other amino acids, Vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and hydrolysates thereof are used.
また上記の無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。本発明で使用される微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。 Moreover, as said inorganic salt, phosphate, magnesium salt, calcium salt, iron salt, manganese salt, etc. can be added suitably. When the microorganism used in the present invention requires a specific nutrient for growth, the nutrient is added as a preparation or a natural product containing it. Moreover, an antifoamer can also be used as needed.
本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、目的とするカダベリンの生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。 In the present invention, the culture solution refers to a solution obtained as a result of growth of microorganisms or cultured cells on the fermentation raw material, and the composition of the fermentation raw material to be added is cultured so that the target cadaverine productivity is increased. You may change suitably from the fermentation raw material composition at the time of a start.
本発明では、培養液中の糖類濃度は５ｇ／Ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節される。微生物または培養細胞の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、培養を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要があれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。 In the present invention, the saccharide concentration in the culture solution is preferably maintained at 5 g / L or less. The reason is to minimize the loss of saccharide due to withdrawal of the culture solution. The culture of microorganisms is usually carried out at a pH of 4 to 8 and a temperature of 20 to 40 ° C. The pH of the culture solution is adjusted to a predetermined value within the above range by an inorganic acid or an organic acid, an alkaline substance, urea, calcium carbonate, ammonia gas, or the like. If it is necessary to increase the oxygen supply rate in culturing microorganisms or cultured cells, add oxygen to the air to maintain the oxygen concentration at 21% or higher, pressurize the culture, increase the agitation rate, increase the aeration rate, etc. The following means can be used. Conversely, if it is necessary to reduce the oxygen supply rate, it is also possible to supply a gas containing no oxygen such as carbon dioxide, nitrogen and argon mixed with air.
本発明においては、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。 In the present invention, batch culture or fed-batch culture may be performed at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration, and then continuous culture (pullout) may be started. Culture may be performed. It is possible to supply the raw material culture solution and extract the culture from an appropriate time. The starting times of the supply of the raw material culture solution and the withdrawal of the culture are not necessarily the same. Further, the supply of the raw material culture solution and the withdrawal of the culture may be continuous or intermittent. Nutrients necessary for cell growth as described above may be added to the raw material culture solution so that the cell growth is continuously performed.
培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、一例として、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。また、連続発酵装置の運転上の不具合、生産効率の低下を招かなければ、微生物または培養細胞の濃度の上限値は限定されない。 The concentration of microorganisms or cultured cells in the culture solution should be maintained at a high level so that the environment of the culture solution is not suitable for the growth of microorganisms or cultured cells and the rate of death does not increase. As an example, good production efficiency can be obtained by maintaining the dry weight at 5 g / L or more. Moreover, the upper limit of the density | concentration of microorganisms or a cultured cell will not be limited unless the malfunction in operation of a continuous fermentation apparatus and the fall of production efficiency are caused.
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、培養管理上、通常、単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。 The continuous culture operation performed while growing fresh cells having fermentation production ability is usually preferably performed in a single fermentation reaction tank in terms of culture management. However, the number of fermentation reaction tanks is not limited as long as it is a continuous culture method for producing a product while growing cells. A plurality of fermentation reaction tanks may be used because the capacity of the fermentation reaction tank is small. In this case, high productivity of the fermentation product can be obtained even if continuous fermentation is performed by connecting a plurality of fermentation reaction tanks in parallel or in series by piping.
本発明で使用される微生物や培養細胞は、カダベリンを生産することが可能な微生物や培養細胞であり、例えば、微生物がリジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性を増強している微生物が好ましい。更に好ましくは、微生物がリジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、組換え微生物がリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が、１または２種類以上組み込まれている微生物が挙げられる。 The microorganism or cultured cell used in the present invention is a microorganism or cultured cell capable of producing cadaverine. For example, the microorganism enhances the enzyme activity of lysine decarboxylase and / or lysine cadaverine antiporter. Microorganisms are preferred. More preferred is a recombinant microorganism into which a microorganism has incorporated a gene encoding lysine decarboxylase and / or lysine cadaverine antiporter. More preferably, a microorganism in which one or two or more genes encoding a lysine decarboxylase is incorporated in the recombinant microorganism is used.
本発明では、組換え微生物としては大腸菌およびコリネ型細菌が好ましく、更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌が用いられる。更には、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく、遺伝子挿入変異生成によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが更に好ましい態様である。 In the present invention, the recombinant microorganism is preferably Escherichia coli or coryneform bacterium, more preferably lysine decarboxylase activity and homoserine auxotrophy or S- (2-aminoethyl) -L-cysteine resistance. Coryneform bacteria having at least one of the characteristics are used. Furthermore, it is preferable that the homoserine dehydrogenase activity is deficient, and it is further preferable that the homoserine dehydrogenase activity is deficient due to gene insertion mutagenesis.
本発明では、コリネ型細菌の属が、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群から選ばれた少なくとも１つの属であることが好ましく、特にコリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましく用いられる。 In the present invention, the genus of coryneform bacteria is preferably at least one genus selected from the group consisting of the genus Corynebacterium and Brevibacterium, and in particular, Corynebacterium glutamicum is preferably used. .
本発明の連続発酵によるカダベリンの製造方法により製造された濾過・分離発酵液に含まれるカダベリンの分離・精製は、濃縮、蒸留および晶析などの従来知られている方法を組み合わせて行うことができる。例えば、特開２００４−２２２５６９号公報に示される晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。
Separation and purification of cadaverine contained in the filtration and separation fermentation liquor produced by the production method of mosquito Daberin by continuous fermentation of the present invention, concentration, be performed by combining the methods known in the art such as distillation and crystallization it can. For example, a purification method using crystallization disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-222569 can be suitably used.
本発明では、連続培養のｐＨ維持の際に用いられる酸によって様々なポリマー原料とすることができ、高純度が求められるポリマー原料用途では晶析による精製方法が好ましく用いられる。例えば、塩酸により培養液のｐＨを維持すると、その濾過液から晶析工程によりカダベリン二塩酸塩を回収することができる。更に好ましくは、連続培養の際にジカルボン酸により培養液のｐＨを維持し、その濾液から晶析工程によりカダベリン・ジカルボン酸塩を回収することができる。更に好ましくは、そのジカルボン酸は、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸である。更に好ましくは、そのジカルボン酸として、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかを挙げることができる。
In the present invention, various polymer raw materials can be used depending on the acid used for maintaining the pH in continuous culture, and a purification method by crystallization is preferably used for polymer raw materials that require high purity. For example, when the pH of the culture solution is maintained with hydrochloric acid, cadaverine dihydrochloride can be recovered from the filtrate by a crystallization step. More preferably, cadaverine dicarboxylate can be recovered from the filtrate by a crystallization step while maintaining the pH of the culture solution with dicarboxylic acid during continuous culture. More preferably, the dicarboxylic acid is an aliphatic and / or aromatic dicarboxylic acid having only two carboxyl groups as functional groups. More preferably, examples of the dicarboxylic acid include adipic acid, sebacic acid, 1,12-dodecanedicarboxylic acid, succinic acid, isophthalic acid, and terephthalic acid.
本発明の連続発酵によるカダベリンの製造方法で用いられる連続発酵装置１つの例は、主に、微生物もしくは培養細胞を保持しカダベリンを製造するための発酵反応槽、および微生物もしくは培養細胞と培養液を濾過分離するための多孔性膜を含む膜分離エレメントから構成される。膜分離エレメントは、発酵反応槽の内部または外部のいずれに設置されてもよい。
Continuous fermentation apparatus One example to be used in the production method of mosquito Daberin by continuous fermentation of the present invention is primarily, fermentation reaction tank for the production of cadaverine holds microorganisms or culture cells, and microorganisms or culture cells and culture It is comprised from the membrane separation element containing the porous membrane for carrying out filtration separation. The membrane separation element may be installed either inside or outside the fermentation reaction tank.
本発明の連続発酵によるカダベリンの製造方法は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と発酵反応槽間で培養液を循環させる動力手段が不要となり、膜分離エレメントを発酵反応槽内部に設置して発酵装置をコンパクト化することが可能である。
Method for manufacturing a mosquito Daberin by continuous fermentation of the present invention has an average pore diameter using a porous membrane of less than 1μm than 0.01 [mu] m, filtration in the range of 20kPa from the transmembrane pressure difference is filtration pressure of 0.1 It is characterized by doing. Therefore, there is no need to keep the inside of the fermentation reactor in a pressurized state, so there is no need for a power means to circulate the culture solution between the filtration separator and the fermentation reactor, and a membrane separation element is installed inside the fermentation reactor. Thus, the fermentation apparatus can be made compact.
本発明の連続発酵によるカダベリンの製造方法で用いる連続発酵装置のうち、膜分離エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。
Among the continuous fermentation apparatus used in the method for manufacturing a mosquito Daberin by continuous fermentation of the present invention, showing a representative example of the membrane separation element is installed inside the fermentation reaction tank schematic diagram of FIG.
図１は、本発明の連続発酵によるカダベリンの製造方法で用いられる連続発酵装置の一つの実施の形態を示す概略側面図である。図１において、連続発酵装置は、内部に膜分離エレメント２を備えた発酵反応槽１と水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内の膜分離エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている膜および膜エレメントを使用することができる。膜分離エレメントについては、追って詳述する。
Figure 1 is a schematic side view showing one embodiment of a continuous fermentation apparatus used in the manufacturing method of mosquito Daberin by continuous fermentation of the present invention. In FIG. 1, the continuous fermentation apparatus basically includes a fermentation reaction tank 1 having a
次に、図１の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地は投入前に必要に応じて加熱殺菌、あるいは加熱滅菌、あるいはフィルターを用いた滅菌を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて攪拌機５で発酵反応槽１内の培養液を攪拌し、また必要に応じて気体供給装置４によって必要とする気体を供給し、また必要に応じてｐＨセンサ・制御装置９、およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整し、また必要に応じて温度調節器１０によって培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて溶存酸素やＯＲＰの制御、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により培養液中のカダベリンの濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、上記計装装置による培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
Next, the form of continuous fermentation by the continuous fermentation apparatus of FIG. 1 will be described. In FIG. 1, the medium is continuously or intermittently charged into the fermentation reaction tank 1 by the medium supply pump 7. The medium can be subjected to heat sterilization, heat sterilization, or sterilization using a filter as necessary before addition. During fermentation production, the culture solution in the fermentation reaction tank 1 is agitated by the
培養液は、発酵反応槽１内に設置された膜分離エレメント２によって微生物もしくは培養細胞と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物もしくは培養細胞は装置系内にとどまることにより装置系内の微生物もしくは培養細胞濃度を高く維持でき、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、膜分離エレメント２による濾過・分離には発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力は必要ない。また、必要に応じてレベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、膜分離エレメント２の濾過・分離速度および発酵反応槽内の培養液量を適当に調節することができる。上記の膜分離エレメントによる濾過・分離には水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じてポンプ等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。
The culture solution is filtered and separated into microorganisms or cultured cells and a fermentation product by the
図２は、本発明のカダベリンの製造方法で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。図２は、膜分離エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された連続発酵装置の代表的な例である。 FIG. 2 is a schematic side view for explaining an example of another continuous fermentation apparatus used in the method for producing cadaverine of the present invention. FIG. 2 is a typical example of a continuous fermentation apparatus in which the membrane separation element is installed outside the fermentation reaction tank.
図２において、連続発酵装置は、発酵反応槽１と、膜分離エレメント２を備えた膜分離槽１２と、水頭差制御装置３とで基本的に構成されている。ここで、膜分離エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜を備えた膜分離エレメントとしては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および膜分離エレメントを使用することが好適である。また、膜分離槽１２は、培養液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されている。
In FIG. 2, the continuous fermentation apparatus basically includes a fermentation reaction tank 1, a
図２において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の培養液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整し、また必要に応じて、温度調節器１０によって培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の培養液は、培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む培養液は、膜分離エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。
In FIG. 2, the medium is introduced into the fermentation reaction tank 1 by the medium supply pump 7, the culture solution in the fermentation reaction tank 1 is stirred by the
ここで、膜分離エレメント２による濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力を必要としない。必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、膜分離エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の培養液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で膜分離槽１２内に供給することができる。
Here, the filtration / separation by the
膜分離エレメント２による濾過・分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、得られた培養液を必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常にフレッシュでカダベリンの生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
The filtration / separation by the
次に、本発明のカダベリンの製造方法で用いられる連続発酵装置で、好ましく用いられる膜分離エレメントについて説明する。 Next, the membrane separation element preferably used in the continuous fermentation apparatus used in the method for producing cadaverine of the present invention will be described.
図３に示す膜分離エレメントについて説明する。図３は、本発明で用いられる膜分離エレメントを例示説明するための概略斜視図である。本発明のカダベリンの製造方法で用いられる連続発酵装置では、好ましくは、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および膜分離エレメントを用いることができる。膜分離エレメントは、図３に示されるように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５（多孔性膜）をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された濾液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた濾液は、支持板１３の凹部１６を通り、集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
The membrane separation element shown in FIG. 3 will be described. FIG. 3 is a schematic perspective view for illustrating the membrane separation element used in the present invention. In the continuous fermentation apparatus used in the method for producing cadaverine of the present invention, preferably, a separation membrane and a membrane separation element disclosed in International Publication No. 2002/064240 can be used. As shown in FIG. 3, the membrane separation element is configured by arranging a
図４に示す膜分離エレメントについて説明する。図４は、本発明で用いられる別の膜分離エレメントを例示説明するための概略斜視図である。膜分離エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成される。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この膜分離エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
The membrane separation element shown in FIG. 4 will be described. FIG. 4 is a schematic perspective view for illustrating another membrane separation element used in the present invention. As shown in FIG. 4, the membrane separation element is mainly constituted by a
本発明のカダベリンの製造方法で用いられる連続発酵装置の膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。膜分離エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定することができる。 The member constituting the membrane separation element of the continuous fermentation apparatus used in the method for producing cadaverine of the present invention is preferably a member resistant to high-pressure steam sterilization operation. If the inside of the continuous fermentation apparatus can be sterilized, it is possible to avoid the risk of contamination by undesirable microorganisms during continuous fermentation, and more stable continuous fermentation is possible. The members constituting the membrane separation element are preferably resistant to 15 minutes at 121 ° C., which is the condition of the high-pressure steam sterilization operation. Membrane separation element members include, for example, metals such as stainless steel and aluminum, polyamide resins, fluorine resins, polycarbonate resins, polyacetal resins, polybutylene terephthalate resins, PVDF, modified polyphenylene ether resins, and polysulfone resins. The resin can be preferably selected.
本発明のカダベリンの製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。膜分離エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に膜分離エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を培養液を循環させながら、膜分離エレメントにより培養液を連続的に濾過することができる。 In the continuous fermentation apparatus used in the method for producing cadaverine of the present invention, the membrane separation element may be installed in the fermentation reaction tank as shown in FIG. 1 or installed outside the fermentation reaction tank as shown in FIG. Also good. When the membrane separation element is installed outside the fermentation reaction tank, a separate membrane separation tank can be provided and the membrane separation element can be installed in the inside, and the culture fluid is circulated between the fermentation reaction tank and the membrane separation tank. The culture solution can be continuously filtered through the membrane separation element.
本発明のカダベリンの製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。 In the continuous fermentation apparatus used in the method for producing cadaverine of the present invention, it is desirable that the membrane separation tank be capable of high-pressure steam sterilization. If the membrane separation tank can be autoclaved, it is easy to avoid contamination with germs.
本発明の連続発酵によるカダベリンの製造方法に従って、連続発酵を行った場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の（式３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式３）
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
According to the manufacturing method of mosquito Daberin by continuous fermentation of the present invention, when performing the continuous fermentation, as compared with conventional batch fermentation, provides high volume production rates, it is possible to extremely efficient fermentation. Here, the production rate in continuous culture is calculated by the following (Equation 3).
Fermentation production rate (g / L / hr) = product concentration in the drawn solution (g / L) × culture solution drawing rate (L / hr) ÷ operating solution volume (L) of the apparatus (Formula 3)
In addition, the fermentation production rate in batch culture is calculated by dividing the amount of product (g) at the time when all of the raw carbon source is consumed by the time (h) required for consumption of the carbon source and the amount of culture solution (L) at that time. Is required.
本発明の連続発酵によるカダベリンの製造方法によって得られたカダベリンは、ポリアミド樹脂の原料に好適に用いられ、得られるポリアミド樹脂は、射出成形、押出成形、ブロー成形、真空成形、溶融紡糸およびフィルム成形などの任意の成形方法により、所望の形状に成形することができ、機械部品などの樹脂成形品、衣料・産業資材などの繊維、および包装・磁気記録などのフィルムとして使用することができる。 Ca Daberin obtained by the production method of mosquito Daberin by continuous fermentation of the present invention is suitably used for a polyamide resin material, the resulting polyamide resin, injection molding, extrusion molding, blow molding, vacuum molding, melt spinning and It can be formed into a desired shape by any molding method such as film molding, and can be used as a resin molded article such as a machine part, a fiber such as clothing or industrial material, and a film such as packaging or magnetic recording. .
以下、本発明のカダベリンの製造方法をさらに具体的に説明するために、図１および図２の概要図に示す連続発酵装置を用いることによる連続的なカダベリンの発酵生産について、実施例を挙げて説明する。 Hereinafter, in order to more specifically describe the cadaverine production method of the present invention, continuous fermentation of cadaverine using the continuous fermentation apparatus shown in the schematic diagrams of FIGS. 1 and 2 will be described with examples. explain.
（参考例１）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
［原液］
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに下記組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
［凝固浴］
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
(Reference Example 1) Production of porous membrane (part 1)
Polyvinylidene fluoride (PVDF) resin was used as the resin and N, N-dimethylacetamide (DMAc) was used as the solvent, and these were sufficiently stirred at a temperature of 90 ° C. to obtain a stock solution having the following composition.
[Undiluted solution]
・ PVDF: 13.0% by weight
DMAc: 87.0% by weight
Next, after cooling the above stock solution to a temperature of 25 ° C., a polyester fiber non-woven fabric (porous substrate) having a density of 0.48 g / cm 3 and a thickness of 220 μm, which was previously pasted on a glass plate. And immediately immersed in a coagulation bath at 25 ° C. having the following composition for 5 minutes to obtain a porous film having a porous resin layer formed on a porous substrate.
[Coagulation bath]
-Water: 30.0% by weight
DMAc: 70.0% by weight
After peeling this porous membrane from the glass plate, it was immersed in hot water at a temperature of 80 ° C. three times to wash out DMAc to obtain a separation membrane. When the surface of the porous resin layer was observed with a scanning electron microscope at a magnification of 10,000 within the range of 9.2 μm × 10.4 μm, the average diameter of all observable pores was 0.1 μm. . Next, when the pure water permeability coefficient was evaluated about the said separation membrane, it was 50 * 10 < -9 > m < 3 > / m < 2 > / s / Pa. The pure water permeation amount was measured using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane at a head height of 1 m. The standard deviation of the average pore diameter was 0.035 μm, and the membrane surface roughness was 0.06 μm.
（参考例２）多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
(Reference Example 2) Production of porous membrane (part 2)
A vinylidene fluoride homopolymer having a weight average molecular weight of 41,000 and γ-butyrolactone were dissolved at a temperature of 170 ° C. at a rate of 38% by weight and 62% by weight, respectively, to prepare a stock solution. This stock solution was discharged from the die while stirring γ-butyrolactone as a hollow portion forming liquid, and solidified in a cooling bath composed of an 80% by weight aqueous solution of γ-butyrolactone at a temperature of 20 ° C. to produce a hollow fiber membrane.
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。得られた中空糸膜（分離膜）の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
Next, 14% by weight of vinylidene fluoride homopolymer having a weight average molecular weight of 284,000, 1% by weight of cellulose acetate propionate (Eastman Chemical Co., CAP482-0.5), and N-methyl-2-pyrrolidone 77% by weight, polyoxyethylene coconut oil fatty acid sorbitan (manufactured by Sanyo Chemical Co., Ltd., trade name “IONET T-20C” (registered trademark)) 5% by weight, and
[カダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
・使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
・検出：ＵＶ３６０ｎｍ
・サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。上記の反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
[Method for HPLC analysis of cadaverine concentration]
-Column used: CAPCELL PAK C18 (Shiseido)
Mobile phase: 0.1% (w / w) phosphoric acid aqueous solution: acetonitrile = 4.5: 5.5
・ Detection: UV360nm
Sample pretreatment: 25 μl of analytical sample, 25 μl of 1,4-diaminobutane (0.03 M), 150 μl of sodium bicarbonate (0.075 M) and 2,4-dinitrofluorobenzene (0.2 M) as internal standards The ethanol solution is added and mixed, and kept at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. After dissolving 50 μl of the above reaction solution in 1 ml acetonitrile, 10 μl of the supernatant after centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes was analyzed by HPLC.
下記に示すカダベリンの製造に関する実施例においては、カダベリンを生産させる微生物として、特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株および特開２００２−２２３７７０号公報に記載の大腸菌ＣＡＤ１株を用いた。 In the examples relating to the production of cadaverine shown below, as microorganisms for producing cadaverine, Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 strain described in JP-A No. 2004-222569 and Escherichia coli described in JP-A No. 2002-223770 are disclosed. CAD1 strain was used.
（実施例１）連続発酵によるカダベリンの製造（その１）
図１の連続発酵装置を稼働させることにより、カダベリン連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成のカダベリン生産培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例１で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。多孔性膜の平均細孔径は上記のとおり０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御した。膜間差圧２０ｋＰａ以下は、水頭差制御では２ｍ以内に相当する）。
(Example 1) Production of cadaverine by continuous fermentation (part 1)
In order to investigate whether or not a cadaverine continuous fermentation system can be obtained by operating the continuous fermentation apparatus of FIG. 1, a continuous fermentation test of this apparatus was performed using a cadaverine production medium having the composition shown in Table 1. The medium was used after autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes. As the membrane separation element member, a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used. As the separation membrane, a porous membrane mainly composed of polyvinylidene fluoride (PVDF) prepared in Reference Example 1 was used. The average pore diameter of the porous membrane is 0.1 μm as described above, and the pure water permeability coefficient is 50 × 10 −9 m 3 / m 2 / s / pa. The operating conditions in Example 1 are as follows unless otherwise specified.
・ Fermentation reactor capacity: 1.5 (L)
-Separation membrane used: PVDF filtration membrane-Membrane separation element Effective filtration area: 120 square cm
・ Temperature adjustment: 30 (℃)
-Fermentation reactor aeration rate: 1.5 (L / min) air-Fermentation reactor agitation speed: 800 (rpm)
・ PH adjustment: pH 7.0 adjusted with 3M HCl and 3M ammonia water ・ Sterilization: Culture tank containing membrane separation element and culture medium used are all autoclaved at 121 ° C. for 20 min. Flow rate control by differential pressure (controlled at 0.1 kPa or more and 20 kPa or less.
微生物としてコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を用い、培地として表１に示す組成のカダベリン生産培地を用い、生産物であるカダベリンの濃度の評価はＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。 Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 strain was used as the microorganism, cadaverine production medium having the composition shown in Table 1 was used as the medium, and the evaluation of the concentration of cadaverine as a product was measured by the HPLC method. For measurement of glucose concentration, “Glucose Test Wako C” (registered trademark) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍｌのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地添加で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前々培養）。 First, Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 strain was cultured with shaking overnight in a test tube with addition of cadaverine production medium supplemented with 5 ml of kanamycin (25 μg / ml) (pre-culture). The obtained culture broth was inoculated into 50 ml of cadaverine production medium supplemented with fresh kanamycin (25 μg / ml), and placed in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours at a temperature of 30 ° C. with an amplitude of 30 cm and 180 rpm. Culture was performed (pre-culture).
前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌのカダベリン生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、カダベリン生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置６により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることで行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該カダベリンおよび投入グルコースから算出されたカダベリン生産速度を表２に示した。１４４時間の発酵試験を行った結果、図１に示す連続発酵装置を用いることにより、安定したカダベリンの連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
The culture solution is inoculated in a 1.5 L cadaverine production medium of the continuous fermentation apparatus shown in FIG. 1, the fermentation reaction tank 1 is stirred at 800 rpm by the attached
（実施例２）連続発酵によるカダベリンの製造（その２）
微生物としてＴＲ−ＣＡＤ１株を用い、発酵培地として表１に示す組成のカダベリン生産培地を用い、図２に示す連続発酵装置用いて連続発酵試験を行った。また、上記カダベリン生産培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例２で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例２における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
・培養液循環速度：１００ｍｌ／ｍｉｎ
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
(Example 2) Production of cadaverine by continuous fermentation (part 2)
Using a TR-CAD1 strain as a microorganism, a cadaverine production medium having the composition shown in Table 1 as a fermentation medium, a continuous fermentation test was performed using a continuous fermentation apparatus shown in FIG. The cadaverine production medium was used after being autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. As the membrane separation element member, a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used. As the separation membrane, a porous membrane mainly composed of polyvinylidene fluoride (PVDF) prepared in Reference Example 2 was used. The operating conditions in Example 2 are as follows unless otherwise specified.
[Operating conditions]
・ Fermentation reactor capacity: 1.5 (L)
・ Membrane separation tank capacity: 0.5 (L)
-Separation membrane used: PVDF filtration membrane-Membrane separation element Effective filtration area: 4000 square cm
・ Temperature adjustment: 30 (℃)
-Fermentation reactor aeration rate: 1.5 (L / min) air-Fermentation reactor agitation speed: 800 (rpm)
-PH adjustment: adjusted to pH 7.0 with 3M HCl and 3M aqueous ammonia-Culture medium circulation rate: 100 ml / min
Sterilization: All the culture tank and membrane used including the membrane separation element were autoclaved by autoclaving at a temperature of 121 ° C. for 20 minutes.
-Membrane permeated water amount control: Flow rate control by transmembrane pressure difference (controlled at 0.1 kPa or more and 20 kPa or less).
カダベリンおよびグルコース濃度は、実施例１と同様の方法を用いて評価した。 The cadaverine and glucose concentrations were evaluated using the same method as in Example 1.
まず、ＴＲ−ＣＡＤ１株を試験管で５ｍｌのカダベリン生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の２．０Ｌのカダベリン生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整および培養液循環速度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、カダベリン生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を２．０Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該カダベリンおよび投入グルコースから算出されたカダベリン発酵生産性を表２に示した。
First, TR-CAD1 strain was cultured in a test tube with shaking overnight in 5 ml of cadaverine production medium (pre-culture). The obtained culture solution was inoculated into 50 ml of fresh cadaverine production medium, and cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. for 24 hours in a 500 ml Sakaguchi flask (pre-culture). The culture solution is inoculated in the 2.0 L cadaverine production medium of the continuous fermentation apparatus shown in FIG. 2, the fermentation reaction tank 1 is stirred at 800 rpm by the attached
（実施例３）連続発酵によるカダベリン・アジピン酸塩の製造
（１）連続発酵
ｐＨの調整方法が、２Ｍアジピン酸スラリーおよび３Ｍアンモニア水でｐＨ７．０に維持したこと以外は、実施例１と同様の条件で連続発酵試験を行った。濾液中のカダベリン・アジピン酸塩および投入グルコースから算出されたカダベリン・アジピン酸塩生産速度を表２に示した。１５０時間の発酵試験を行った結果、連続発酵装置を用いることにより、安定したカダベリン・アジピン酸塩の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
(Example 3) Production of cadaverine adipate by continuous fermentation (1) Continuous fermentation As in Example 1, except that the pH adjustment method was maintained at pH 7.0 with 2M adipic acid slurry and 3M aqueous ammonia. The continuous fermentation test was conducted under the conditions described above. The cadaverine adipate production rate calculated from cadaverine adipate in the filtrate and input glucose is shown in Table 2. As a result of performing the fermentation test for 150 hours, it was confirmed that stable cadaverine and adipate can be produced by continuous fermentation by using a continuous fermentation apparatus.
（２）濾液からのカダベリン・アジピン酸塩結晶の取得
前記濾液に活性炭を対カダベリン重量で３０％添加し、２６℃の温度で２時間撹拌しながら脱色した。濾紙で活性炭を除去し、得られた溶液をエバポレーター（東京理化社製）で４−５倍濃縮した。次に濃縮液を６０℃の温度から徐々に冷却し、結晶を析出させた。この結晶を、デシケーター内で数日間乾燥させた。得られた結晶のＸ線結晶構造解析を行ったところ、カダベリン・アジピン酸塩・ニ水和物であり、純度９９％以上であった。このカダベリン・アジピン酸塩を重合することにより、ポリアミドを得ることができる。
(2) Acquisition of cadaverine and adipate crystals from filtrate The activated carbon was added to the filtrate in an amount of 30% by weight with respect to cadaverine, and decolorized while stirring at a temperature of 26 ° C. for 2 hours. Activated carbon was removed with a filter paper, and the obtained solution was concentrated 4-5 times with an evaporator (manufactured by Tokyo Rika Co., Ltd.). Next, the concentrate was gradually cooled from a temperature of 60 ° C. to precipitate crystals. The crystals were dried for several days in a desiccator. When the X-ray crystal structure analysis of the obtained crystal was conducted, it was cadaverine, adipate, dihydrate, and the purity was 99% or more. Polyamide can be obtained by polymerizing the cadaverine adipate.
（比較例１）カダベリンのバッチ発酵（その１）
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのカダベリン生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例１では、微生物としてコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を用い、生産物であるカダベリンの濃度の評価はＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例１の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．０（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍｌのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地添加で一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前培養）。前培養液を、ジャーファーメンターの１．０Ｌのカダベリン生産培地（グルコース濃度は１００ｇ／Ｌ）に植菌した。カダベリン生産培地を用い、バッチ発酵を行った。その結果を、実施例１、実施例２および実施例３の連続発酵試験で得られたカダベリン発酵生産性と比較して表２に示す。
Comparative Example 1 Cadaverine Batch Fermentation (Part 1)
The most typical batch fermentation as a fermentation form using microorganisms was performed using a 2 L jar fermenter, and its cadaverine productivity was evaluated. The medium was used after autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes. In Comparative Example 1, Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 strain was used as the microorganism, the evaluation of the concentration of the product cadaverine was performed using HPLC, and the glucose concentration was measured by “Glucose Test Wako C” ( Registered trademark) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. The operating conditions of Comparative Example 1 are as follows.
・ Fermentation reactor capacity: 1.0 (L)
・ Temperature adjustment: 30 (℃)
-Fermentation reactor aeration rate: 1.5 (L / min) air-Fermentation reactor agitation speed: 800 (rpm)
-PH adjustment: adjusted to pH 7.0 with 3M HCl and 3M aqueous ammonia First, the Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 strain was added overnight by adding cadaverine production medium supplemented with 5 ml kanamycin (25 μg / ml) in a test tube. Shake culture (pre-culture). The obtained culture broth was inoculated into 50 ml of cadaverine production medium supplemented with fresh kanamycin (25 μg / ml), and placed in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours at a temperature of 30 ° C. with an amplitude of 30 cm and 180 rpm. Culture was performed (pre-culture). The preculture was inoculated into 1.0 L of cadaverine production medium (glucose concentration of 100 g / L) of a jar fermenter. Batch fermentation was performed using cadaverine production medium. The results are shown in Table 2 in comparison with the cadaverine fermentation productivity obtained in the continuous fermentation test of Example 1, Example 2 and Example 3.
これらを比較した結果、図１および図２に示す連続発酵装置を用いることにより、カダベリンの生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、培養液を多孔性膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるカダベリンの製造が可能であることが明らかとなった。 As a result of comparing them, it was clarified that the production rate of cadaverine was significantly improved by using the continuous fermentation apparatus shown in FIGS. By using the continuous fermentation apparatus incorporating the porous membrane disclosed by the present invention and controlling the transmembrane pressure difference, the culture solution is separated into filtrate and unfiltered solution by the porous membrane, and desired fermentation production from the filtrate It was revealed that a continuous fermentation method in which an unfiltered solution is returned to a culture solution while collecting a product is possible, and cadaverine can be produced by continuous fermentation while maintaining a high amount of microorganisms.
（実施例４）連続発酵によるカダベリンの製造（その３）
微生物として大腸菌ＣＡＤ１株を用い、発酵培地として表３に示す組成のカダベリン発酵培地を用い、図１に示す連続発酵装置用いて連続発酵試験を行った。また、上記カダベリン発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例１で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例４における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
(Example 4) Production of cadaverine by continuous fermentation (part 3)
E. coli CAD1 strain was used as the microorganism, cadaverine fermentation medium having the composition shown in Table 3 was used as the fermentation medium, and a continuous fermentation test was performed using the continuous fermentation apparatus shown in FIG. The cadaverine fermentation medium was used after autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes. As the membrane separation element member, a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used. As the separation membrane, a porous membrane mainly composed of polyvinylidene fluoride (PVDF) prepared in Reference Example 1 was used. The operating conditions in Example 4 are as follows unless otherwise specified.
[Operating conditions]
・ Fermentation reactor capacity: 1.5 (L)
-Separation membrane used: PVDF filtration membrane-Membrane separation element Effective filtration area: 120 square cm
・ Temperature adjustment: 37 (℃)
-Fermentation reactor aeration rate: 1.5 (L / min) air-Fermentation reactor agitation speed: 800 (rpm)
・ PH adjustment: pH 7.0 adjusted with 3M HCl and 3M ammonia water ・ Sterilization: Culture tank containing membrane separation element and culture medium used are all autoclaved at 121 ° C. for 20 min. Flow control by differential pressure (controlled at 0.1 kPa or more and 20 kPa or less).
カダベリンおよびグルコース濃度は、実施例１と同様の方法を用いて評価した。 The cadaverine and glucose concentrations were evaluated using the same method as in Example 1.
まず、大腸菌ＣＡＤ１株を試験管で５ｍｌのカダベリン発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカダベリン発酵培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した膜一体型連続発酵装置の１．５Ｌのカダベリン発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該カダベリンおよび投入グルコースから算出されたカダベリン発酵生産性を表４に示した。
First, E. coli CAD1 strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of cadaverine fermentation medium (pre-culture). The obtained culture solution was inoculated into 50 ml of fresh cadaverine fermentation medium, and cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. for 24 hours in a 500 ml Sakaguchi flask (pre-culture). The culture solution is inoculated in a 1.5 L cadaverine fermentation medium of the membrane integrated continuous fermentation apparatus shown in FIG. 1 and the fermentation reaction tank 1 is stirred at 800 rpm by the attached
（実施例５） 連続発酵によるカダベリンの製造（その４）
微生物として大腸菌ＣＡＤ１株を用い、発酵培地として表３に示す組成のカダベリン発酵培地を用い、図２に示す連続発酵装置用いて連続発酵試験を行った。また、上記カダベリン発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例２で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例５における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
・培養液循環速度：１００ｍｌ／ｍｉｎ
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
(Example 5) Production of cadaverine by continuous fermentation (part 4)
E. coli CAD1 strain was used as the microorganism, cadaverine fermentation medium having the composition shown in Table 3 was used as the fermentation medium, and a continuous fermentation test was performed using the continuous fermentation apparatus shown in FIG. The cadaverine fermentation medium was used after autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes. As the membrane separation element member, a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used. As the separation membrane, a porous membrane mainly composed of polyvinylidene fluoride (PVDF) prepared in Reference Example 2 was used. The operating conditions in Example 5 are as follows unless otherwise specified.
[Operating conditions]
・ Fermentation reactor capacity: 1.5 (L)
・ Membrane separation tank capacity: 0.5 (L)
-Separation membrane used: PVDF filtration membrane-Membrane separation element Effective filtration area: 4000 square cm
・ Temperature adjustment: 37 (℃)
-Fermentation reactor aeration rate: 1.5 (L / min) air-Fermentation reactor agitation speed: 800 (rpm)
-PH adjustment: adjusted to pH 7.0 with 3M HCl and 3M aqueous ammonia-Culture medium circulation rate: 100 ml / min
Sterilization: All the culture tank and membrane used including the membrane separation element were autoclaved by autoclaving at a temperature of 121 ° C. for 20 minutes.
-Membrane permeated water amount control: Flow rate control by transmembrane pressure difference (controlled at 0.1 kPa or more and 20 kPa or less).
カダベリンおよびグルコース濃度は、実施例１と同様の方法を用いて評価した。 The cadaverine and glucose concentrations were evaluated using the same method as in Example 1.
まず、大腸菌ＣＡＤ１株を試験管で５ｍｌのカダベリン発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカダベリン発酵培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の２．０Ｌのカダベリン発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整および培養液循環速度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を２．０Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該カダベリンおよび投入グルコースから算出されたカダベリン発酵生産性を表４に示した。
First, E. coli CAD1 strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of cadaverine fermentation medium (pre-culture). The obtained culture solution was inoculated into 50 ml of fresh cadaverine fermentation medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours in a 500 ml Sakaguchi flask (pre-culture). The culture solution was inoculated in the 2.0 L cadaverine fermentation medium of the continuous fermentation apparatus shown in FIG. 2, and the fermentation reaction tank 1 was stirred at 800 rpm with the attached
（比較例２）カダベリンのバッチ発酵（その２）
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのカダベリン生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例２では、微生物として大腸菌ＣＡＤ１株を用い、生産物であるカダベリンの濃度の評価はＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例２の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．０（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１．０（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
まず、大腸菌ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍｌのカダベリン発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を、新鮮なカダベリン発酵培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３７℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前培養）。前培養液を、ジャーファーメンターの１．０Ｌのカダベリン発酵培地に植菌した。カダベリン発酵培地を用い、バッチ発酵を行った。その結果を、実施例４および実施例５の連続発酵試験で得られたカダベリン発酵生産性と比較して表４に示す。
Comparative Example 2 Cadaverine Batch Fermentation (Part 2)
The most typical batch fermentation as a fermentation form using microorganisms was performed using a 2 L jar fermenter, and its cadaverine productivity was evaluated. The medium was autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes and used. In Comparative Example 2, Escherichia coli CAD1 strain was used as a microorganism, the evaluation of the concentration of cadaverine as a product was evaluated by HPLC, and the glucose concentration was measured by “Glucose Test Wako C” (registered trademark) Yakuhin). The operating conditions of Comparative Example 2 are as follows.
・ Fermentation reactor capacity: 1.0 (L)
・ Temperature adjustment: 37 (℃)
Fermentation reactor aeration rate: 1.0 (L / min) AirFermentation reactor agitation speed: 800 (rpm)
-PH adjustment: pH 7.0 adjusted with 3M HCl and 3M aqueous ammonia First, E. coli CAD1 strain was cultured with shaking in 5 ml of cadaverine fermentation medium overnight (pre-culture). The obtained culture broth was inoculated into 50 ml of fresh cadaverine fermentation medium, and cultured in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours at a temperature of 37 ° C. under an amplitude of 30 cm and 180 rpm (pre-culture). The preculture was inoculated into 1.0 L cadaverine fermentation medium of jar fermenter. Batch fermentation was performed using cadaverine fermentation medium. The results are shown in Table 4 in comparison with the cadaverine fermentation productivity obtained in the continuous fermentation test of Example 4 and Example 5.
これらを比較した結果、図１および図２に示す連続発酵装置を用いることにより、カダベリンの生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、培養液を多孔性膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるカダベリンの製造が可能であることが明らかとなった。 As a result of comparing them, it was clarified that the production rate of cadaverine was significantly improved by using the continuous fermentation apparatus shown in FIGS. By using the continuous fermentation apparatus incorporating the porous membrane disclosed by the present invention and controlling the transmembrane pressure difference, the culture solution is separated into filtrate and unfiltered solution by the porous membrane, and desired fermentation production from the filtrate It was revealed that a continuous fermentation method in which an unfiltered solution is returned to a culture solution while collecting a product is possible, and cadaverine can be produced by continuous fermentation while maintaining a high amount of microorganisms.
１ 発酵反応槽
２ 膜分離エレメント
３ 水頭差圧制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ
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