JP5456955B2 - Ａタイプのプロシアニジンを含有する組成物およびその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ａタイプのプロシアニジンを含有する組成物、およびヒトまたは家畜動物の予防または治療処置のためのその使用方法に関する。

ポリフェノールは、非常に多様な化合物群である（非特許文献１）。ポリフェノールは、様々な植物中に広く生じ、その内のいくつかが食物連鎖に関係する。ある場合には、ポリフェノールは、ヒトの食餌のための重要な化合物の部類を示す。ポリフェノールのあるものは栄養ではないと考えられるが、健康への潜在的に有益な効果のために、これらの化合物に関心が生じてきた。例えば、ケルセチン（フラボノイド）が、実験的な動物研究において抗発癌性活性を有することが示されてきた（非特許文献２および３）。（＋）−カテキンおよび（−）−エピカテキン（フラバン−３−オール）は、白血病ウイルス逆転写酵素活性を阻害することが示されてきた（非特許文献４）。ノボタニン（オリゴマー加水分解性タンニン）は、抗腫瘍活性を有することが示されてきた（非特許文献５）。抗突然変異物質として使用するためのプロシアニジンオリゴマーが、キッコーマン社により報告されている（特許文献１、１９９２年７月７日発行）。

Ｂタイプのプロシアニジンなどのある種のポリフェノールは、一酸化窒素（ＮＯ）放出への、それゆえ、ＮＯに積極的に反応する様々な健康状態の治療への有益な効果を有することが示されてきた（例えば、Romanczyk等への特許文献２参照）。

一酸化窒素（ＮＯ）は、アテローム発生のプロセスに重大に関与する、血管の平滑筋組織の増殖、並びに血小板凝集、単球付着および走化性を阻害することが知られている。ＮＯの濃度は、酸素遊離ラジカルとの反応のために、アテローム組織中で減少し得る。これらの反応によりＮＯが損失することによって、血管壁に血小板および炎症細胞が益々付着して、弛緩のＮＯ機構がさらに損なわれることになる。このようにして、ＮＯの損失は、アテロームプロセスを促進して、進行性疾患の状態に至るかもしれない。

高血圧症は、血液が血管内を循環するときの血圧が正常よりも高い状態である。長期間に亘り、最高血圧が１５０ｍｍ Ｈｇを超えると、または最低血圧が９０ｍｍ Ｈｇを超えると、体が損傷を受ける。高血圧症は、脳梗塞、心臓発作、心不全、および腎不全を含む血管系の病気の主要な原因である。例えば、過度の最低血圧は、血管のどこかを破裂させ得る。脳内で破裂が生じた場合には、脳梗塞になる。高血圧症はまた、アテローム性動脈硬化を引き起こすこともある血管の肥厚および狭窄を生じ得る。上昇した血圧は、血液が排出されたときの上昇した静止（拡張期）血圧を克服するために心筋が激しく働くので、心筋を肥大させることもある。この肥大はゆくゆくは、不整脈や心不全を生じ得る。高血圧症は、「サイレント・キラー」と称される。何故ならば、高血圧症は、何の症状も示さず、血圧を検査したときだけに検出できるからである。

血圧の調節は、ある機構が、内皮一酸化窒素シンターゼまたはｅＮＯＳとして知られる、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の構成Ｃａ²⁺／カルモジュリン従属形態の発現を含む場合は複雑な出来事である。この酵素により生成されるＮＯは、血管の平滑筋弛緩（拡張）を生じ、これにより、血圧が低下する。ＮＯの生成が阻害因子により遮断されたかまたはアテローム性動脈硬化などの病状において遮断されたために、ＮＯの循環濃度が減少した場合、血管の平滑筋は、適度に弛緩しない。その結果生じた血管収縮は、血圧を上昇させる。この血管収縮は、ある種の高血圧症の原因となるかもしれない。
特開平４−１９０７７４号公報 米国特許第６６７０３９０号明細書 Ferriera et al.,Tetrahedron,48:10,1743-1803,1992 Deshner et al.,Carcinogenesis,7:1193-1196,191 Kato et al.,Carcinogenesis,4,1301-1305 1983 Chu et al.,J.of Natural Prod.,55:2,179-183,1992 Okuda et al.,presented at the XVIth International Conference of the Groupe Polyphenols,Lisbon,Portugal,July 13-16,1992

高血圧症および関連する疾病並びに脈管系の疾患を被る多くの人々を考えると、ＮＯプールを正常な健康的レベルに維持する治療方法を見つけることに多きな関心が寄せられている。ニトログリセリンやイソソルビド・ジニトレートなどのＮＯを放出できる薬物は、依然として、血管弛緩療法の主流である。

本願の出願人等は、ここで意外なことに、ＮＯプールを維持し、血管弛緩を誘発し、および／またはＮＯ反応性疾病および疾患を治療するおよび／または予防するために、Ａタイプのプロシアニジンを利用できることを発見した。

本発明は、Ａタイプのプロシアニジンを含有する組成物、およびヒトまたは家畜動物の予防または治療処置のためにその組成物を使用する方法に関する。

ある態様において、本発明は、効果的な量のＡタイプのプロシアニジンを含む、製薬、食品、食品添加物または栄養補助食品などの組成物に関する。この組成物は、必要に応じて、追加のＮＯ調節薬および／または心血管保護薬または治療薬を含有していてもよく、もしくはそのような薬剤と組み合わせて投与してもよい。上述した組成物を含有するパッケージ製品、並びにＮＯ反応性健康状態を治療または予防する、高血圧症、心疾患、冠動脈疾患および／または血管循環障害を治療する、心臓発作、脳梗塞、鬱血性心不全および／または腎不全を予防するまたはそのリスクを低減する、もしくは血流、例えば、腎血流を改善するための使用上の注意および／またはラベルも本発明の範囲に含まれる。

別の態様において、本発明は、ＮＯ反応性健康状態を治療または予防する、高血圧症、心疾患、冠動脈疾患および／または血管循環障害を治療する、心臓発作、脳梗塞、鬱血性心不全および／または腎不全を予防するまたはそのリスクを低減する、もしくは血流、例えば、腎血流を改善するためにＡタイプのプロシアニジンを使用する方法に関する。

本出願に引用された全ての特許、特許出願および文献は、参照によりここに含まれる。矛盾がある場合には、本開示が支配する。

本発明は、効果的な量のＡタイプのプロシアニジン、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体を含む組成物に関する。

本発明のＡタイプのプロシアニジンは、以下の化学式のフラバン−３−オール単量体ユニットｎ個から構成されたオリゴマーである：

ここで、
(i) この単量体ユニットは、フラバン間の結合４→６および／または４→８により連結されている、
(ii) 単量体ユニットの少なくとも２つが、Ａタイプのフラバン間の結合（４→８；２→Ｏ→７）または（４→６；２→Ｏ→７）によりさらに連結されている、
(iii) ｎは２から１２である。

Ａタイプのフラバノイド間の結合により連結された２つのフラバノールユニットが、２位および４位の２つの結合を含まなければならないことが当業者により理解されよう。これらは両方とも、αまたはβいずれかの立体化学を有している。すなわち、結合は、２αと４αまたは２βと４βのいずれかである。これらの結合は、Ａタイプのフラバン間の結合により連結された第２のフラバノールユニットの６−Ｏ位および７−Ｏ位、または８−Ｏ位および７−Ｏ位に結合している。Ｃ−２位およびＣ−４位にＡタイプのフラバン間の結合を含まないオリゴマーの構成フラバノールユニットにおいて、Ｃ−４位での結合は、αまたはβいずれかの立体化学を有し得る。フラバノールユニットのＣ−３位でのＯＨ基は、αまたはβいずれかの立体化学を有する。フラバン−３−オール（単量体）ユニットは、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキンおよびそれぞれのエピマー（例えば、（−）−カテキンおよび（＋）−エピカテキン）であってよい。

上述したＡタイプのプロシアニジンは、１つ以上の構成フラバン−３−オールユニットの１つ以上のＯＨ基で、誘導体化、例えば、エステル化されていてもよい。それゆえ、所定のフラバン−３−オールユニットは、環の３位、５位、７位、３’位および４’位の内の１つ以上で、１つ以上のエステル基、好ましくは、没食子酸エステル基を含んでもよい。このユニットは、特に、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−またはペンタ−没食子酸エステルユニットであってよい。

製品にとって、また本発明の方法において有用な化合物の例としては、整数ｎが３から１２、４から１２、５から１２、４から１０、または５から１０である化合物が挙げられる。ある実施の形態において、ｎは２から４、または２から５、例えば、ｎは２または３である。

ある実施の形態において、Ａタイプのプロシアニジンは、エピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−カテキン（すなわち、Ａ１ダイマー）、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体であり、以下の化学式を有する：

別の実施の形態において、Ａタイプのプロシアニジンは、エピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−エピカテキン（すなわち、Ａ２ダイマー）であり、以下の化学式を有する：

さらに別の実施の形態において、Ａタイプのプロシアニジンは、Ａタイプのトリマーであり、以下の化学式を有する：

Ａタイプのプロシアニジンは、天然起源のものであっても、合成により調製されてもよい。例えば、Ａタイプのプロシアニジンは、実施例１に記載されたように、もしくはLou et al., Phytochemistry,51:297-308(1999)、またはKarchesy and Hemingway,J.Agric.Food Chem.,34:966-970(1986)に記載されたように、ピーナッツの皮から単離されてもよい。これらの文献の各関連部分をここに引用する。熟成したレッドピーナッツの皮は、約１７質量％のプロシアニジンを含有し、二量体プロシアニジンの中でも、エピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−カテキンが優位を占め、エピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−エピカテキンが少量存在する。しかしながら、（４→８；２→Ｏ→７）二重結合を持つプロシアニジンに加え、（４→６；２→Ｏ→７）二重結合を持つプロシアニジンもピーナッツの皮の中に見られる。

上述した化合物の他の供給源には、例えば、Foo et al., J.Nat.Prod.,63:1225-1228、およびPrior et al.,J.Agricultural Food Chem.,49(3):1270-76(2001)に記載されたようにクランベリーがある。これらの文献の各関連部分をここに引用する。他の供給源としては、ゴムカズラ(Ecdysanthera utilis)（Lie-Chwen et al.,J.Nat.Prod.,65:505-8(2002)）およびセイヨウトチノキ(Aesculus hippocastanum)（米国特許第４８６３９５６号明細書）が挙げられる。これらの文献の各関連部分をここに引用する。

Ａタイプの化合物は、Kondo et al.,Tetrahedron Lett.,41:485(2000)に記載されたような中性条件下で１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルを用いた酸化によって、Ｂタイプのプロシアニジンから得てもよい。この文献の関連部分をここに引用する。天然と合成のＢタイプのプロシアニジンを得る方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、全てRomanczyk等の米国特許第６６７０３９０号、同第６２０７８４２号、同第６４２０５７２号、および同第６１５６９１２号の各明細書に記載されている。

Ａタイプのプロシアニジンは、ここに記載した組成物中に用いられても、主成分としてＡタイプのプロシアニジンを含む抽出物（例えば、ピーナッツの皮の抽出物）の形態で投与されてもよい。

Ａタイプのプロシアニジンは、単離され、精製されてもよく、すなわち、それらは、天然に共に生じる化合物（Ａタイプのプロシアニジンが天然起源のものである場合）から単離され、またはそれらの合成により調製され、いずれの場合でも、汚染化合物（不純物）のレベルは、Ａタイプのプロシアニジンの有効性に著しく寄与しない、またはその有効性を減少させないようなものである。例えば、単離され精製されたＡ１ダイマーは、自然に共に生じるであろうＡ２ダイマーから、工業的に利用できる実行可能な精製および分離技法により達成できる程度まで分離される。化合物は実質的に純粋であってよく、すなわち、それらの化合物は、利用できる精製、分離および／または合成技術により達成できる最高の程度の均質性を有する。ここに用いられているように、「実質的に純粋なＡ１ダイマー」は、技術的かつ工業的に可能な程度までＡ２ダイマーから分離されており、「実質的に純粋なＡタイプのトリマー」は、他のオリゴマーから（技術的かつ工業的に可能な程度まで）分離されているが、いくつかのＡタイプのトリマーの混合物を含有していてもよい。言い換えれば、「単離され精製されたトリマー」という語句は、主に、一種類のトリマーを称し、一方で、「実質的に純粋なトリマー」は、トリマーの混合物を包含してもよい。

ある実施の形態において、Ａタイプのプロシアニジンは、少なくとも８０％純粋、好ましくは少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である。そのような化合物は、製薬用途に特に適している。

使用方法
本願に記載されたどの化合物を、ここに記載した方法を実施するために用いてもよい。実施例３に示したように、Ａタイプのプロシアニジンは、ＮＯプールの維持を補助する内皮細胞における一酸化窒素（ＮＯ）経路に影響を与える。理論により拘束することを意図するものではなく、ＮＯプールは、ＮＯ合成を誘発しおよび／またはＮＯ分解を減少させることによって維持される。前記化合物は、収縮した血管を弛緩させる。それらの化合物は、実施例４に示したように、抗血小板療法に用いてもよい。

それゆえ、本発明は、ＮＯ反応性疾病または疾患を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のフラバン−３−オール単量体ユニットｎ個から構成されたＡタイプのプロシアニジンオリゴマー、
または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、
を効果的な量で投与することによって、治療または予防する方法であって、
ここで、
(i) この単量体ユニットは、フラバン間の結合４→６および／または４→８により連結されており、
(ii) 単量体ユニットの少なくとも２つが、Ａタイプのフラバン間の結合（４→８；２→Ｏ→７）または（４→６；２→Ｏ→７）によりさらに連結されており、
(iii) ｎは２から１２であり、
検体がヒトまたは家畜動物である方法に関する。

このＡタイプのプロシアニジンは、単離され精製されている、または実質的に純粋であってよい。ある実施の形態において、上記化合物は、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。上述した方法に使用するための化合物の例としては、整数ｎが３から１２、４から１２、５から１２、４から１０、または５から１０である化合物が挙げられる。ある実施の形態において、ｎは２から４、または２から５、例えば、ｎは２または３である。

ここに用いているように、「ＮＯ反応性疾病または疾患」は、ＮＯによる治療に反応する健康状態を称する。そのような状態の例としては、以下に限られないが、疾病／疾患の病状がＮＯ経路の異常機能により生じる、ＮＯ媒介またはＮＯ依存性疾病および疾患が挙げられる。その状態が、高血圧症、心疾患、冠動脈疾患、および／または血管循環疾患、心臓発作、脳梗塞、鬱血性心不全、腎不全、および腎臓病を含むことが好ましい。Ａタイプのプロシアニジンは、単独で投与しても、別の心血管治療薬との組合せで投与してもよい。

高血圧は、心臓発作、脳梗塞、鬱血性心不全、および腎不全のリスクを増加させるので、これらの状態を予防するために、血管弛緩を生じるＡタイプのプロシアニジンを、単独で、または他の心血管保護薬との組合せで使用できる。特に適した検体としては、糖尿病、肥満症、高コレステロールレベルおよび／または喫煙と組み合わされた高血圧の検体が挙げられ、そのような患者においては、心臓発作および脳梗塞のリスクが数倍増加する。

ここに用いているように、「治療」は、例えば、疾患の進行を遅くする、延命する、死ぬリスクを減少させる、および／または疾患のパラメータの測定可能な改善を与えることによって、心疾患などの既存の医療状態の改善を意味する。

「予防(preventing)」という用語は、疾病の兆候の減少を含む、疾病の発症に関連するリスクを減少させることを意味する。

ここに用いているように、「心血管保護薬または治療薬」という用語は、心臓血管系を治療または保護するのに効果的な、Ａタイプのプロシアニジン以外の薬剤を称する。そのような薬剤の例は、抗血小板治療薬（例えば、アスピリンなどのＣＯＸ阻害剤、Ｂタイプのプロシアニジン）、ＮＯ調節薬、コレステロール低下薬（例えば、ステロール、スタノール）である。

ある実施の形態において、本発明は以下の方法に関する：
ＮＯ反応性疾病または疾患を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のエピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−カテキン（すなわち、Ａ１ダイマー）、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、を効果的な量で投与することによって、治療または予防する方法であって、ここで、検体はヒトまたは家畜動物である方法。Ａ１ダイマーは単離され精製されていてもよい。ある実施の形態において、上述した化合物は、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。

ＮＯ反応性疾病または疾患を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のエピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−エピカテキン（すなわち、Ａ２ダイマー）、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、を効果的な量で投与することによって、治療または予防する方法であって、ここで、検体はヒトまたは家畜動物である方法。Ａ２ダイマーは単離され精製されていてもよい。ある実施の形態において、上述した化合物は、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。

ＮＯ反応性疾病または疾患を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のＡタイプのトリマー、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、を効果的な量で投与することによって、治療または予防する方法であって、ここで、検体はヒトまたは家畜動物である方法。Ａタイプのトリマーは、単離され精製されていても、または実質的に純粋であってもよい。ある実施の形態において、上述した化合物は、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。

ある実施の形態において、本発明は以下の例示の方法を提供する：
高血圧症を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のフラバン−３−オール単量体ユニットｎ個から構成されたＡタイプのプロシアニジンオリゴマー、
または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、を効果的な量で投与することによって、治療する方法であって、
ここで、
(i) この単量体ユニットは、フラバン間の結合４→６および／または４→８により連結されており、
(ii) 単量体ユニットの少なくとも２つが、Ａタイプのフラバン間の結合（４→８；２→Ｏ→７）または（４→６；２→Ｏ→７）によりさらに連結されており、
(iii) ｎは２から１２であり、
検体がヒトまたは家畜動物である方法。

このＡタイプのプロシアニジンは、単離され精製されている、または実質的に純粋であってよい。ある実施の形態において、上記化合物は、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。

上述した方法に使用するための化合物の例としては、整数ｎが３から１２、４から１２、５から１２、４から１０、または５から１０である化合物が挙げられる。ある実施の形態において、ｎは２から４、または２から５、例えば、ｎは２または３である。

ある実施の形態において、本発明は以下の例示の方法を含む：
高血圧症を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のエピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−カテキン（すなわち、Ａ１ダイマー）、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、を効果的な量で投与することによって、治療する方法であって、ここで、検体はヒトまたは家畜動物である方法。Ａ１ダイマーは単離され精製されていてもよい。ある実施の形態において、上述した化合物は、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。

高血圧症を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のエピカテキン−（４β→８；２β→Ｏ→７）−エピカテキン（すなわち、Ａ２ダイマー）、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、を効果的な量で投与することによって、治療する方法であって、ここで、検体はヒトまたは家畜動物である方法。Ａ２ダイマーは単離され精製されていてもよい。ある実施の形態において、上述した化合物は、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。

高血圧症を、その必要のある検体に、以下の化学式：

のＡタイプのトリマー、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体、を効果的な量で投与することによって、治療する方法であって、ここで、検体はヒトまたは家畜動物である方法。Ａタイプのトリマーは、単離され精製されていても、または実質的に純粋であってもよい。ある実施の形態において、上述した化合物は、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であってよい。

上述した化合物のいずれを用いて、必要のあるヒトの***障害を改善／治療する方法も本発明の範囲に含まれる。

上述した方法に使用するための効果的な量は、ここに与えられる指図および当該技術分野における一般的な知識を用いて当業者が決めてもよい。例えば、前記効果的な量は、ほ乳類の体（例えば、血液）内における生理学的に適切な濃度を達成するようなものであってよい。そのような生理学的に適切な濃度は、少なくとも約１０ナノモル（ｎＭ）、好ましくは少なくとも約２０ｎＭ、または少なくとも約１００ｎＭ、より好ましくは少なくとも約５００ｎＭであってよい。ある実施の形態において、ヒトなどのほ乳類の血液中に少なくとも約１マイクロモルが達成される。ここに定義したような化学式Ａ_nの化合物は、約５０ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日、好ましくは約１００〜１５０ｍｇ／日から約９００ｍｇ／日、最も好ましくは約３００ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日で投与してよい。しかしながら、上述した量よりも多い量を用いてもよい。

前記化合物を急に投与しても、または治療／予防投与を、投与計画として、すなわち、有効期間に亘り、例えば、毎日、毎月、隔月、半年、毎年続けても、または他の投与計画において、そのような期間に亘り医者が決めたように必要に応じて行ってもよい。投与は、少なくとも、治療／予防効果を示すのに要する期間に亘り続けられるであろう。前記組成物は、ほ乳類の体内の効果的な化合物のレベルを維持するために、好ましくは毎日、最も好ましくは一日二、三回、例えば、朝と晩に投与される。最も有益な結果を得るために、この組成物は、少なくとも約３０日間、または少なくとも約６０日間に亘り投与されるであろう。これらの投与計画は、周期的に繰り返してもよい。

組成物および配合物
本発明の化合物は、製薬、食品、食品添加物または栄養補助食品として投与してもよい。

ここに用いたように、「食品」は、成長、修復および生体プロセスを維持し、エネルギーを供給するために、生物の体内に用いられる、タンパク質、炭水化物および／または脂質から実質的になる材料である。食品は、ミネラル、ビタミン類および調味料などの補助物質も含有してよい。Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10th Edition,1993を参照のこと。「食品」という用語は、ヒトまたは動物の消費のために適用された飲料を含む。ここに用いたように、「食品添加物」は、連邦規制基準第２１編第１７０．３（ｅ）（１）項において米国食品医薬品局により定義されたようなものであり、直接的および間接的な添加物を含む。ここに用いたように、「製薬」は医薬品である。Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10th Edition,1993を参照のこと。製薬は薬剤と称してもよい。ここに用いたように、「栄養補助食品」は、以下の栄養成分：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、毎日の摂取総量を増加させることによって食事を補助するためのヒト用の栄養物質、もしくは濃縮物、代謝物、構成要素、抽出物またはこれらの成分の組合せの内の一種類以上を担持または含有する、食事を補助することを意図した製品（タバコ以外）である。

必要に応じて、別の心血管保護薬または治療薬と組み合わせて、本発明の化合物を含有する製薬は、経口、舌下、口内、鼻、直腸、静脈内、非経口および局所などの様々な様式で用途してもよい。当業者は、必要に応じて、別の心血管保護薬または治療薬と組み合わせて、Ａタイプのプロシアニジンの送達を最大にするために適切な投与様式を決定することができるであろう。それゆえ、各タイプの投与のために適用された投与形態は、本発明の範囲に含まれ、錠剤、カプセル、ゼラチンカプセル（ジェルキャップ）、塊または投与単位粉末または顆粒、乳濁液、懸濁液、ペースト、クリーム、ゲル、発泡体、ゼリーまたは注射投与形態などの、固体、液体および半固体投与形態を含む。徐放性投与形態も本発明の範囲に含まれ、米国特許第５０２４８４３号、同第５０９１１９０号、同第５０８２６６８号、同第４６１２００８号、および同第４３２７７２５号の各明細書に記載されたように調製してもよい。これらの文献の関連部分をここに引用する。適切な薬剤的に許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤は、当該技術分野において一般に知られており、当業者により容易に決定できる。例えば、錠剤は、効果的な量のＡタイプのプロシアニジンを含有する組成物と、ソルビトール、ラクトース、セルロース、またはリン酸二カルシウムなどの必要に応じてのキャリアとを含んでもよい。

Ａタイプのプロシアニジン、および必要に応じて別の心血管保護薬または治療薬を含有する栄養補助食品は、当該技術分野に知られた方法を用いて調製してよく、例えば、リン酸二カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、硝酸カルシウム、ビタミン類、およびミネラルなどの栄養素を含んでもよい。

さらに、本発明の組成物を含むパッケージ製品（例えば、食品、栄養補助食品、または製薬）および本発明の化合物の存在、または増加した含有量を示す、もしくは上述した組成物の使用を指示するラベルを含むパッケージ製品などの製造製品が本発明の範囲に含まれる。

少なくとも１つの容器および少なくとも一種類のＡタイプのプロシアニジン、または薬剤的に許容されるその塩または誘導体を含む組合せ治療に使用するように適用された製造製品（パッケージ製品またはキットなどの）も本発明の範囲に含まれる。この製造製品は、少なくとも一種類の追加の薬剤、心血管保護薬または治療薬（すなわち、Ａタイプのプロシアニジン、もしくは薬剤的に許容されるその塩または誘導体以外の）をさらに含み、その薬剤は、別の組成物として、別の容器内、または本発明の化合物との混合物で提供されていてよい。

上述したように、心血管保護薬または治療薬は、心臓血管系を治療するまたは保護するのに効果的である。そのような薬剤の例は、抗血小板治療薬（例えば、アスピリンなどのＣＯＸ阻害剤）、ＮＯ調節薬、コレステロール低下剤（例えば、ステロール、スタノール）である。

ある実施の形態において、必要に応じてＡタイプのプロシアニジンと共に投与される心血管保護薬または治療薬は、Ｂタイプのプロシアニジン、例えば、以下に記載するようなココアフラバノールおよび／またはプロシアニジンであってよい。

本発明に使用するためのＢタイプのプロシアニジンは、天然起源のもの、例えば、カカオ豆またはポリフェノールの別の天然源から由来しても、もしくは合成により調製されてもよい。例えば、Ｂタイプのプロシアニジンおよびその誘導体は、Romanczyk等の米国特許第６６７０３９０号明細書に記載されたものであり、その関連部分をここに引用する。当業者は、有効性または費用に基づいて天然または合成のポリフェノールを選択してよい。ポリフェノールは、カカオポリフェノールを含有するカカオ成分、例えば、チョコレートに含まれるチョコレートリカーの形態で組成物に含まれてもよく、またはカカオ成分とは独立して、例えば、抽出物、抽出分画、単離され精製された個別の化合物、プールされた抽出分画または合成された化合物として加えられてもよい。

「カカオ成分」という用語は、チョコレートリカーなどの殻を取ったカカオニブおよびある程度または完全に脱脂されたカカオ固形物（例えば、ケーキまたは粉末）由来のカカオ固形物含有材料を称する。

Ｂタイプのプロシアニジンオリゴマーは、２から約１８、好ましくは２から約１２、最も好ましくは２から約１０の単量体ユニットを有していてよい。あるいは、このオリゴマーは、３〜１８、好ましくは３〜１２、より好ましくは３〜１０の単量体ユニットを、または５〜１８，好ましくは５〜１２、より好ましくは５〜１０の単量体ユニットを有していてよい。例えば、オリゴマーは、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマーおよびデカマーであってよい。オリゴマーにおいて、モノマーは、（４→６）および／または（４→８）のフラバン間の結合により連結されている。単独に（４→８）結合を持つオリゴマーは線状であり、一方で、少なくとも１つの（４→６）の存在により、枝分れオリゴマーとなる。少なくとも１つの非天然結合（６→６）、（６→８）、および（８→８）を含むオリゴマーも本発明の範囲に含まれる。そのような天然に生じないオリゴマーの合成が、国際公開第００／６１５４７号パンフレットとして２０００年１０月１９日に発行された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／０８２３４号に記載されている。その関連部分をここに引用する。

Ｂタイプのプロシアニジンは、カカオ豆、カカオニブ、またはチョコレートリカー、ある程度脱脂されたカカオ固形物、および／または完全に脱脂されたカカオ固形物などのカカオ成分からの抽出により調製してもよい。抽出物は、完全にまたはある程度脱脂されたカカオ粉末から調製されたものであることが好ましい。テオブローマ(Theobroma)、ヘラニア(Herrania)またはその種間および種内の交雑の任意の種からの豆を用いてもよい。抽出物は、発酵した、不十分に発酵した、または未発酵の豆から調製してもよく、発酵した豆は、カカオフェノールの量が最も少なく、未発酵の豆が最も多い。豆の選択は、豆の発酵係数に基づいて行ってもよく、例えば、抽出物は、約２７５以下の発酵係数(fermentation factor)を持つ豆から製造してもよい。発酵の度合いを操作することによって、カカオ成分およびその抽出物中のポリフェノールのレベルを最適化することを、国際公開第９８／０９５３３号パンフレットとして発酵された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１５８９３号に記載されたように行ってもよい。その関連部分をここに引用する。

カカオポリフェノールは、カカオ加工の従来の方法（例えば、Industrial Chocolate Manufacture and Use,ed.Backett,S.T.,Blackie Acad. & Professional,New York,1997のChapters 1,5 および6に記載されている）を用いて、または従来の方法とは対照的にカカオ成分中のポリフェノールを保存した（それらの破壊を防ぐことによって）、Kealey等の米国特許第６０１５９１３号明細書に記載された改良加工方法を用いて、加工されたカカオ成分から抽出してもよい。改良されたカカオ加工方法は、従来のロースト工程を省いている。それゆえ、(a)カカオニブをローストせずにカカオの殻をゆるくするのに十分な温度と時間に亘りカカオ豆を加熱し、(b)カカオの殻からカカオニブを篩にかけ、(c)カカオニブをネジプレスし、(d)保存されたレベルのカカオポリフェノールを含有するある程度脱脂されたカカオ固形物およびカカオバターを回収することによって得られるカカオ成分を用いてよい。この改良方法は、従来の加工方法よりもずっと高いレベルの高級プロシアニジンオリゴマーを保持する。この方法により製造されたカカオ固形物は、脱脂固形物１ｇ当たり総フラバノールおよび／またはプロシアニジンを２０，０００μｇより多く、好ましくは２５，０００μｇ／ｇより多く、より好ましくは２８，０００μｇ／ｇより多く、最も好ましくは３０，０００μｇ／ｇより多く含有するであう。本発明の目的のために、フラバノールおよび／またはプロシアニジンの総量は、実施例２に記載したように決定される。

Ｂタイプのプロシアニジンは、ポリフェノールがその中に溶解する溶媒を用いて、上述した供給源、または任意の他のポリフェノールまたはフラバノールもしくはプロシアニジン含有供給源から抽出してもよい。適切な溶媒としては、水またはメタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコールおよび酢酸エチルなどの有機溶媒が挙げられる。溶媒の混合物を用いてもよい。水を溶媒として使用する場合、水は、例えば、酢酸によりわずかに酸性化されていてよい。溶媒の例としては、水と有機溶媒、例えば、水性のメタノール、エタノールまたはアセトンとの混合物が挙げられる。水性有機溶媒は、例えば、約５０％から約９５％の有機溶媒を含んでよい。それゆえ、水中に約５０％、約６０％、約７０％、約８０％および約９０％の有機溶媒を用いてよい。溶媒は、酢酸などの酸を少量、例えば、約０．５％から約１．０％の量で含んでもよい。抽出物の組成、すなわち、プロシアニジンオリゴマーの表示（すなわち、オリゴマー分布）および量は、溶媒の選択に依存する。例えば、水抽出物は主にモノマーを含有し、酢酸エチル抽出物はモノマーと低級オリゴマー、主にダイマーとトリマーを含有する、水性のメタノール、エタノールまたはアセトン抽出物はモノマーとある範囲の高級オリゴマーを含有する。モノマーおよび高級プロシアニジンオリゴマーを抽出するための溶媒の内の１つは、約７０％のアセトンである。しかしながら、本発明において、どのようなポリフェノール含有抽出物も有用である。カカオポリフェノールの抽出方法は、当該技術分野において知られており、例えば、Romanczyk等の米国特許第５５５４６４５号明細書および国際公開第９７／３６４９７号パンフレットとして発行された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号に記載されている。それゆえ、ある実施の形態において、カカオ抽出物は、カカオ豆をカカオ粉末に粉砕し、粉末を脱脂し、カカオポリフェノールを抽出し、抽出物を精製することによって調製される。カカオ粉末は、カカオ豆と果肉を凍結乾燥させ、凍結乾燥したカカオ豆から果肉を除去し、皮を取り、皮のない豆を粉砕することにより調製できる。

Ｂタイプのカカオポリフェノール抽出物は、例えば、カフェインおよび／またはテオブロミンの除去により精製し、ゲル透過クロマトグラフィーおよび／または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製してもよい。この抽出物に高級プロシアニジンオリゴマーを豊富にさせるために、ゲル透過クロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０で）を用いてもよい。例えば、選択したオリゴマーがカラムから溶出し始めるまで、モノマーおよび低級オリゴマーを含有する溶出液を収集しなくてもよい。そのような抽出の例が、当該技術分野において知られており、ここにその関連部分を引用する国際公開第９７／３６４９７号パンフレットとして発行された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号の実施例５に記載されている。分取ＨＰＬＣ、例えば、順相クロマトグラフィーを使用することによって、抽出物は、例えば、モノマーまたは特定のオリゴマーを少なくとも５０質量％含有するモノマー分画とオリゴマー分画に分画してもよい。特定の分画がモノマーまたは任意の低級オリゴマー（例えば、ダイマー、トリマーまたはテトラマー分画）を含有する場合、その分画は、特定のオリゴマー分画を約９０から９５質量％含有する。所望の分画は、例えば、オリゴマー３〜１０または５〜１０を含有するように選択したオリゴマーの組合せを得るために、分離後にプールしてもよい。当業者は、クロマトグラフィー条件を操作して、本明細書における手引き、当該技術分野における一般的な知識、および例えば、Romanczyk等の米国特許第５５５４６４５号明細書および国際公開第９７／３６４９７号パンフレットとして発行された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号の教示に鑑みて、所望のプロシアニジンプロファイルを達成することができる。

モノマー分画は一般に、モノマーのエピカテキンとカテキンの混合物を含有し、オリゴマー分画は一般に、ダイマー（ダイマー分画において）、トリマー（トリマー分画において）、テトラマー（テトラマー分画において）などの混合物を含有する。カカオはモノマー、ダイマーなどの各々について複数のタイプを含有するので、モノマーとオリゴマーの混合物は、単離された分画中に生じる。プロシアニジンの基礎的要素である二種類のモノマー、エピカテキンとカテキン、並びにオリゴマー中の化学結合により連結したモノマーの結果として、オリゴマーの変動性が生じる。それゆえ、カカオダイマーは主にＢ２およびＢ５であり、これらの各々は、エピカテキンの二種類のモノマーを含有している。個々のモノマーおよびオリゴマーは、逆相ＨＰＬＣを用いて、例えば、Ｃ１８カラムを用いて得てもよい。

Ｂタイプのカカオポリフェノールを本発明の組成物中に、カカオ抽出物として、例えば、溶媒により生成した抽出物、カカオ分画、単離化合物として、または効果的な量のフラバノールおよび／またはプロシアニジンを含有するカカオ成分またはチョコレートの形態で、用いてもよい。カカオ成分は、従来のカカオ加工工程を用いて調製してもよいが、Kealey等の米国特許第６０１５９１３号に記載された方法を用いて調製することが好ましい。あるいは、カカオポリフェノールのレベルを上昇させるために、約２７５以下の発酵係数を持つカカオ豆から調製されたカカオ固形物およびチョコレートリカーを用いてもよい。これらの成分は、従来のカカオ加工方法（例えば、ローストによる）および完全に発酵した豆を用いて得られるよりも高いカカオポリフェノール含有量を有する。チョコレートは、上述した成分から従来の技法を用いて、またはその関連部分をここに引用する国際公開第９９／４５７８８号として発行された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５４１４号に記載されたチョコレート製造中にカカオポリフェノールを保存するための改良プロセスを用いて調製してもよい。以下の従来のものではないプロセスの内の少なくとも１つにより調製されたチョコレートは、ここでは「保存された量のカカオポリフェノールを有するチョコレート」と称される：(i)不十分に発酵したまたは未発酵のカカオ豆からカカオ成分を調製する、(ii)カカオ成分製造プロセス中にカカオポリフェノールを保存する、(iii)チョコレート製造プロセス中にカカオポリフェノールを保存する。

合成のＢタイプのプロシアニジンを用いてもよく、このプロシアニジンは、当該技術分野において公知であり、その関連部分をここに引用する国際公開第９９／１９３１９号として発行された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１３９２号に記載されたような方法により調製される。

フラバノールおよび／またはプロシアニジン誘導体も有用であろう。これらの例としては、没食子酸エステル（例えば、没食子酸エピカテキンおよび没食子酸カテキン）などのモノマーとオリゴマーのエステル；モノ−またはジ−糖類部分（例えば、β−Ｄ−グルコース）などの糖類部分により誘導体化された化合物、グリコシル化されたモノマーとオリゴマー、およびそれらの混合物；結腸内フローラ代謝により生成されるプロシアニジンの酵素開裂生成物を除いて、硫酸化、グルクロニド化、およびメチル化形態などのプロシアニジンモノマーとオリゴマーの代謝産物が挙げられる。これらの誘導体は、天然供給源からのものであっても、合成により調製されたものであってもよい。

Ａタイプおよび／またはＢタイプのプロシアニジンおよび随意的な別の心血管保護薬／治療薬を含む食品は、ヒトまたは家畜用途に適用してもよく、ペットフードを含む。食品は、菓子類以外のものであってよい。しかしながら、好ましいコレステロール低下食品は、ブラックチョコレート、低脂肪チョコレートおよびチョコレート被覆キャンディーであってよいキャンディーを含む、ミルクチョコレート、甘みを加えたチョコレートおよび甘みをわずかに加えたチョコレートなどの、米国の食品に関する商品規格（ＳＯＩ）および非ＳＯＩのチョコレートを含む菓子類である。他の例としては、焼いた製品（例えば、ブラウニー、焼いたスナック、クッキー、ビスケット）、香辛料、グラノラバー、トッフィーチュー、食事代替バー、スプレッド、シロップ、粉末の飲料ミックス、ココアまたはチョコレート風味の飲料、プリン、餅、風味の良いソースなどが挙げられる。所望であれば、食品はチョコレートまたはココア風味であってよい。食品は、チョコレートおよびナッツ、例えば、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、およびヘーゼルナッツを含有するグラノラバーなどのキャンディーバーであってよい。ここに記載した食品に皮付きナッツを加えると、例えば、ピーナッツの皮は約１７％のフラバノールおよびプロシアニジンを含有し、アーモンドの皮は約３０％のフラバノールおよびプロシアニジンを含有するので、ポリフェノール総含有量も増すであろうことに留意されたい。挽いたピーナッツの皮を本発明の組成物に加えてもよい。ある実施の形態において、ナッツの皮、例えば、ピーナッツの皮が、チョコレートキャンディーのヌガーに加えられる。

ある実施の形態において、チョコレート以外の食品は、少なくとも約５μｇ／ｇから約１０ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも５μｇ／ｇ、好ましくは少なくとも１０μｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも１００μｇ／ｇのフラバノールおよび／またはＢタイプのプロシアニジンおよび／またはＡタイプのプロシアニジンを含有する。所望であれば、チョコレート以外の食品は、以下に記載するチョコレート食品に見られるよりもずっと高いレベルのカカオプロシアニジンを含有しても差し支えない。

チョコレート菓子類はミルクチョコレートまたはブラックチョコレートであってもよい。ある実施の形態において、チョコレートは、製品中の非脂肪カカオ固形物の総量に基づいて、チョコレート１グラム当たり、少なくとも３，６００μｇ、好ましくは少なくとも４，０００μｇ、好ましくは少なくとも４，５００μｇ、より好ましくは少なくとも５，０００μｇ、最も好ましくは少なくとも５，５００μｇのフラバノールおよび／またはＢタイプのプロシアニジンおよび／またはＡタイプのプロシアニジンを含む。別の実施の形態において、チョコレートは、製品中の非脂肪カカオ固形物に基づいて、１グラム当たり、少なくとも６，０００μｇ、好ましくは少なくとも６，５００μｇ、より好ましくは少なくとも７，０００μｇ、最も好ましくは少なくとも８，０００μｇのフラバノールおよび／またはＢタイプのプロシアニジンおよび／またはＡタイプのプロシアニジンを、さらにより好ましくは１０，０００μｇ／ｇで含有する。

ミルクチョコレート菓子は、ミルクチョコレート製品中の非脂肪カカオ固形物の総量に基づいて、ミルクチョコレート１グラム当たり、少なくとも１，０００μｇ、好ましくは少なくとも１，２５０μｇ、より好ましくは少なくとも１，５００μｇ、最も好ましくは少なくとも２，０００μｇのフラバノールおよび／またはＢタイプのプロシアニジンおよび／またはＡタイプのプロシアニジンを有していてよい。好ましい実施の形態において、ミルクチョコレート菓子は、ミルクチョコレート製品中の非脂肪カカオ固形物の総量に基づいて、ミルクチョコレート１グラム当たり、少なくとも２，５００μｇ、好ましくは少なくとも３，０００μｇ、より好ましくは少なくとも４，０００μｇ、最も好ましくは少なくとも５，０００μｇのフラバノールおよび／またはＢタイプのプロシアニジンおよび／またはＡタイプのプロシアニジンを含有する。

Ｌ−アルギニンを、様々な量で食品に加えてもよい。一般に、カカオは、ある程度脱脂されたカカオ固形物の１００グラム当たり１から１．１グラムのＬ−アルギニンを含有する。その量は、カカオの１００グラム当たり０．８から１．５グラムに及んで差し支えない。ある実施の形態において、本発明のチョコレート食品は、Ｌ−アルギニンを、カカオ成分中に自然に生じる量よりも多い量で含有する。食品中に用いられるカカオ成分とＬ−アルギニンの量を知ることによって、当業者は、最終製品中のＬ−アルギニンの総量を容易に決定できる。食品は、一般に、食品１ｇ当たり、少なくとも５μｇ／ｇ、好ましくは少なくとも３０μｇ／ｇ、または少なくとも６０μｇ／ｇ、さらに好ましくは少なくとも２００μｇ／ｇのＬ−アルギニンを含有する。

一日の有効量のフラバノールおよび／またはＡタイプおよび／またはＢタイプのプロシアニジンは、一回分で提供してもよい。それゆえ、菓子類（例えば、チョコレート）は、少なくとも約１００ｍｇ／１回分（例えば、１５０〜２００、２００〜４００ｍｇ／１回分）を含有してよい。

本発明を以下の非限定的実施例においてさらに説明する。

実施例１−Ａタイプのプロシアニジンの抽出および単離
抽出
微細に粉砕したピーナッツの皮（４９８ｇ）をヘキサンで脱脂した（２０００ｍｌで２回）。周囲温度で５分間、３５００ｒｐｍの遠心分離によりヘキサンを除去して、捨てた。残留したヘキサンを、一晩で蒸発させた。翌日、脱脂したピーナッツの皮を２時間に亘り周囲温度でアセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５ｖ／ｖ／ｖ）により抽出した（２０００ｍｌで２回）。抽出物を遠心分離により回収した（周囲温度で５分間、３５００ｒｐｍ）。分圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去した（４０℃）。抽出溶媒の水性部分を凍結乾燥により除去して、褐色−赤色の殻の固い固体を得た（５１．３６ｇ）。

粗製ピーナッツ皮抽出物のゲル透過
上述したように得た粗製ピーナッツ皮抽出物（２４ｇ）を７０％のメタノール（１５０ｍｌ）中に溶解させ、１時間に亘り冷蔵し、３秒間に亘り渦流にかけ、次いで、室温で５分間に亘り３５００ｒｐｍで遠心分離した。メタノール中で予め膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（４００ｇ）を収容する大きなカラムの頂上に上清を装填した。カラムを１０ｍＬ／分の流量で１００％メタノールにより定組成で溶離した。それぞれ２５０ｍＬの２９の分画を収集し、全部で８つの分画（i〜viii）を得るために、ＮＰ−ＨＰＬＣ（Adamson et al., J.Ag.Food Chem.,47:4184-4188,1999）により決定された組成にしたがって組み合わせた。分画ｉはモノマーのエピカテキンとカテキンを含有し、分画ii〜viiはダイマー、トリマーまたはそれらの混合物を含有した。分画ｖ（１．８ｇ）およびvii（２．７ｇ）は、それぞれ、ダイマーとトリマーを優位に含有し、これらをさらなる精製のために選択した。

Ａタイプのダイマーとトリマーの精製
分画ｖ（１．８ｇ）を２０％メタノール中０．１％の酢酸中に溶解させた（４０ｍｇ／ｍｌ）。勾配条件下Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ（２５０×２３ｍｍ）で分離を行った。移動相は、水中０．１％の酢酸（移動相Ａ）およびメタノール中０．１％の酢酸（移動相Ｂ）からなった。勾配条件は、０〜１０分で２０％のＢの定組成、１０〜６０分で２０〜４０％のＢの線形勾配、６０〜６５分で４０〜１００％のＢの線形勾配であった。分離は、２８０ｎｍでモニタした。いくつかの分取分離から等しい保持時間による分画を組み合わせ、不完全真空下において４０℃で回転蒸発させ、凍結乾燥した。５つの分画（ａ〜ｅ）を得た。分画ｄおよびｅは、それぞれ、ダイマーＡ１およびＡ２として、ＬＣＭＳにより特徴付けられた。Ａ１およびＡ２ダイマー以外に、４つの異なるダイマーがピーナッツの皮から以前に単離された（Lou et al.,Phytochemistry 51,297-308,1999）。

分画viiを上述したように精製して、先に示した化学式を有するＡ結合を持つ単独のトリマーを得た。

精製した化合物の構造を質量分析により確認し、化合物の純度を、ＵＶ２８０ｎｍでＨＰＬＣを用いて決定した。Ａ１ダイマーは９５％の純度であり、Ａ２ダイマーは９１％の純度であり、Ａトリマーは８４％の純度であった。

実施例２：フラバノール／プロシアニジンの決定
プロシアニジンを以下のように定量した：市販の（−）−エピカテキン、およびHammerstone,J.F.et al.,J.Ag.Food Chem.;1999;47(10)490-496; Lazarus,S.A. et al.,J.Ag.food Chem.;1999;47(9);3693-3701;およびAdamson,G.E.et al.,J.Ag.Food Chem.;1999;47(10)4184-4188に記載された方法により精製された状態で得たダイマーからデカマーを用いて、複合体標準物を製造した。これらの化合物を用いた標準原液を、先に引用したAdamsonの文献に記載された順相ＨＰＬＣ法を用いて分析し、それぞれ、２７６ｎｍおよび３１６ｎｍの励起波長および発光波長で蛍光を検出した。ピークをグループ化し、それらの面積を、オリゴマーの任意の一群内の全ての異性体からの寄与を含むように合計し、二次適合(fit)を用いて校正曲線を作成した。モノマーと小さなオリゴマーはほとんど線形のプロットを有した。これは、モノマー基準の校正曲線およびダイマー基準の校正曲線を作成するための線形回帰の先の使用と一致する。

次いで、これらの校正曲線を用いて、以下のように調製した試料中のプロシアニジンレベルを計算した：最初に、３つのヘキサン抽出物（それぞれ４５ｍｌ）を用いて、カカオまたはチョコレート試料（約８グラム）を脱脂した。次に、１グラムの脱脂材料を５ｍｌのアセトン／水／酢酸の混合物（７０：２９．５：０．５ｖ／ｖ／ｖ）により抽出した。次いで、脱脂材料中のプロシアニジンの量を、試料からのＨＰＬＣデータを、上述したように得た校正曲線（精製オリゴマーを用いた）と比較することによって決定した。試料に関する脂肪の百分率（チョコレートについては１グラムの試料サイズを、リカーについては０．５グラムの試料サイズを用いた）を、the Association of Officail Analytical Chemists（AOAC Official Method 920.177）による標準化方法を用いて決定した。次いで、オリゴマー試料（脂肪を含む）中の総プロシアニジンレベルの量を計算した。カラム毎の変動を防ぐために、各試料の実行前に、校正を行った。

実施例３−ＮＯ生成および血管弛緩へのＡタイプのプロシアニジンの効果
実施例１に記載したように得た化合物を、それぞれ、インビトロの無血清ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養系および半ビボのウサギ大動脈環モデルを用いて、一酸化窒素（ＮＯ）生成および血管弛緩へのそれらの効果について調査した。内皮細胞によるＮＯ生成および予め収縮させた大動脈環の弛緩は、試験化合物の心血管効果を評価するための２つの主要なマーカーである。

インビトロ実験
単独のドナーから得られたＨＵＶＥＣを、必須成長因子、栄養素およびミネラルが補給された無血清の低タンパク質（０．５ｇ／ｌ）無抗生物質細胞培養培地内で培養した。培養した細胞は、内皮マーカーを発現し（フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３１抗原、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの摂取）、群集に増殖したときに、典型的な「栗石モルホロジー」を示した。細胞培養培地を、アポ−トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、およびカタラーゼと交換して、それらの自己酸化媒介過酸化水素成形を含む試験化合物の二次効果を排除した。

試験化合物を、ＮＯ生成を急に（２時間）および慢性に（２４時間で５回の投与が行われた）調節する潜在能力について評価した。正の対照（アセチルコリンおよび／またはヒスタミン）および負の対照Ｌ−ＮＮＭＡ（ＮＯシンターゼ阻害因子）を全ての実験に含めた。細胞の数および総タンパク質を用いて、アッセイ内の変動を評価した。試験化合物の潜在的な毒性効果もモニタした（ＭＴＴの低下を測定した）。

ＮＯ生成は、細胞培養培地中に存在した全ての主要な一酸化窒素最終生成物（硝酸塩、亜硝酸塩、ニトロソチオールを含むＮＯｘ）の総量を測定することによって評価した。この目的のために、ＮＯｘは、９５℃で塩化バナジウム(III)／ＨＣｌにより直接還元して、ＮＯを生成した。その後、培養培地から放出されたＮＯの量を、ＮＯ分析器（コロラド州、ボールダー所在のシーバース・インストルメンツ社(Sievers Instruments, Inc.)）を用いてオゾンとＮＯとの間の化学量論的反応中に放出された化学発光を測定することによって評価した。

ここに提示したデータは、３つの実験から得たものであり、細胞培養培地中に存在する（ＮＯｘとして）ＮＯ濃度（μモル／ｌ）±標準偏差（ＳＤ）として表されている。データは、十分に補給された細胞培養培地中に本質的に存在するＮＯｘについて補正され、その試料をそこから取り出した培地の容積に関して標準化した。データは、９５％の信頼度でスチューデントｔ検定を用いて分析した。０．００５以下のＰ値は、統計的に有意であると定義された。

急な効果の試験に関して、ＨＵＶＥＣを、３７℃および５％のＣＯ₂で、１００ｎＭ、１μＭ、および１０μＭの濃度で２時間と２４時間に亘りＡ２ダイマーとＡタイプのトリマー一回の投与と共に培養した。２時間後、ＮＯ生成についての効果は全く観察されなかった。一回の投与から２４時間後、１μＭの濃度では効果は全く観察されなかった。両方の試験化合物は、１０μＭの濃度で対照レベルよりもＮＯ生成を増大させた（２つの内、Ａ２の方が良好に機能した）が、いずれも、統計的に有意なレベルまでは増大させなかった。ＭＴＴアッセイに基づいて、試験化合物は、毒性効果は持たなかった。

慢性の効果の試験に関して、それぞれ、２４時間に亘り、試験化合物を５回、順次投与して培養した。各２４時間の処理後、培養培地を取り替えた。Ａ２ダイマーとＡタイプのトリマーを試験した。Ａタイプのトリマーは、ＮＯ生成において統計的に有意な増大を示した（ｐ＝０．０４１）。

半ビボ実験
Ａタイプのプロシアニジンの内皮細胞依存性弛緩への効果を、Karim et al.,J.Nutrl Supple.,130(8S):2105S-2108S(2000)により先に記載されたように行った半ビボ実験で試験した。その関連部分をここに引用する。この方法を使用することの利点は、この方法が機能的心血管終点を評価することである。この方法は、急な出来事のみを評価できるものであり、薬物誘発タンパク質発現／活性の同定はできない。

手短に言えば、雄のニュージーランドホワイトウサギからウサギ大動脈環を得た。単離後、環を、酸素化したクレープス緩衝液内に取り付け、ＮＥ（１０^-6Ｍ）で予め収縮させた。張力が定常状態に到達したときに、試験化合物の累積濃度を適用した（１０^-9から１０^-4Ｍ）。

この実験に、正の対照のアセチルコリン（１０^-6Ｍ）および負の対照のＬ−ＮＡＭＥを含めた。ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）阻害因子であるＬ−ＮＡＭＥを使用することにより、内皮細胞依存性弛緩イベントと内皮細胞独立性弛緩イベントとの間で識別できる。大動脈環の露出が同様の対照を表す。各試験化合物の添加前に、４００Ｕ／ｍｌのカタラーゼを大動脈浴中に加えて、観察された効果が、培養培地中の過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の生成により生じないことを確実にした。弛緩応答は、長い間に大動脈環により及ぼされた張力の減少の関数（ｇ）として測定した。得られたデータは、ノルエピネフリン（ＮＥ）収縮環のパーセントの弛緩として表した。上述したものと同じ統計的手法を用いた。用量応答曲線を、使用した濃度に対して平均の弛緩パーセント（±ＳＥ）をプロットすることによって得た。

半ビボスクリーニングの結果は、Ａ１とＡ２ダイマーの両方およびＡタイプのトリマーが、１０^-4Ｍの濃度で血管弛緩を誘発し、その濃度で、Ａ１ダイマーは、９３．２０±３．４６％の血管弛緩を誘発し、Ａ２ダイマーは、８５．００±２．９１％の血管弛緩を誘発し、Ａタイプのトリマーは、５６．５±１６．５６％の血管弛緩を誘発したことを示している。さらに、Ａ１とＡ２ダイマーの両方は、正の対照（アセチルコリン）よりも強力な弛緩剤であり、その差は、Ａ１ダイマーに関して、ｐ＝０．００５で統計的に有意であった。

弛緩応答は、血管がＬ−ＮＡＭＥにより予め処理されたか露出されたかのいずれかの場合に弱まった。アセチルコリンは、一般に、１０^-7Ｍの濃度で弛緩応答を生じ、１０^-6Ｍの濃度で最大の弛緩に到達した。血管がビヒクルのみにより処理されたときには、応答は観察されなかった。

試験化合物により媒介された用量依存性弛緩が図１Ａ〜Ｃに表されている。

実施例４：全血中の血小板へのＡ１ダイマーの効果
Ａ１ダイマー［Ａ１Ｄ］の血小板凝集は、血小板計数技法、およびフローサイトメトリーによる血小板／単球複合体（Ｐ／Ｍ）および血小板／好中球複合体（Ｐ／Ｎ）の形成を用いて測定した。後の実験において、白血球に関連する血小板の活性化状態（ＣＤ６２Ｐ）と、白血球自体の活性化状態（ＣＤ１１ｂ）も測定した。

材料および方法
Ａ１ダイマー［Ａ１Ｄ］をエタノール中に溶解させた。一旦溶液になったら、生理食塩水によるさらなる希釈も可能であった。ヒルジン（Ｒｅｖａｓｃ（商標））をノバルティス(Novartis)社（スイス国、バーゼル）から得て、−２０℃でガラスの水薬瓶内で生理食塩水中５ｍｇ／ｍｌの溶液として貯蔵した。コラーゲン（Ｎｙｃｏｍｅｄ）はアクシス・シールド・ダイアグノスティクス(Axis Shield Diagnostics)（英国、ダンディー）からのものであった。濃縮物は、製造業者により供給された等張性グルコース緩衝液を用いて原液（１ｍｇ／ｍｌ）から調製した。アスピリン（アセチルサリチル酸−ＡＳＡ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、アラキドン酸（ＡＡ）およびエピネフリンはシグマ(Sigma)社からのものであった。固定液は、０．１６％ｗ／ｖのホルムアルデヒドを含有する１４０ｍＭのＮａＣｌ、４．６ｍＭのＮａ₂ＥＤＴＡ、４．５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、および１．６ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４からなるものであった。

血液試料は、メディカル・エンジニアリング・ユニット(Medical Engineering Unit)（ノッティンガム大学）により製造されたマルチサンプル・アジテータ（ＭＳＡ）を用いて研究した。ＭＳＡを用いて、血液試料を３７℃に維持し、必要に応じて１，０００ｒｐｍの撹拌速度で血液の少量の試料を撹拌した。

１５ｍＷのパワーおよび４８８ｎｍの波長で動作する５Ｗレーザを備えたＦＡＣＳｃａｎ（英国、ベクトン・ディキンソン）または６３３ｎｍで動作する追加の赤色三角レーザを備えたＬＳＲＩＩフローサイトメータ（英国、ベクトン・ディキンソン）で市販の蛍光標識付け抗体を用いてフローサイトメトリーを行った。

血液の採取
血液は、過去１０日間にアスピリンやＮＳＡＩＤＳを摂取していない健康な志願者から得た。この血液を、ヒルジン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）および少量の調査中のフラバノールまたは対照としてのエタノールを含有した目盛り付きポリスチレン管中に分配した。血液中のエタノールの最終濃度は常に０．３％であった。ある実験において、アスピリン（ＡＳＡ）または対照としての生理食塩水も管中に含んでいた。次いで、管に蓋をし、三回逆さまにして、確実に適切な混合を行い、次いで、実験を行う前に３０分間に亘り３７℃でＭＳＡ内に配置した。その間、血液は静置されていた。さらに別の血液試料を、抗凝血剤としてＫ₂ＥＤＴＡを含有した市販の真空採血管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標））中に採取した。

血小板の凝集
３０分間の前保温後、血液のアリコート（４８０μｌ）を、それぞれ撹拌棒が入れられた小さなポリスチレン管中に分配し、ＭＳＡにおいて２分間に亘り撹拌した。２分後、それらの管に作用薬またはビヒクル対照の溶液（２０μｌ）を加えた。次いで、これらの１０分までＭＳＡにおいて撹拌し、その時点で、１：２の比率（ｖ／ｖ）で固定液と少量の副試料と混合することによって、血小板凝集体を固定した。固定試料中の血小板計数は、ＵｌｔｒａＦｌｏ−１００全血血小板計数器を用いて決定した。血小板凝集は、ＥＤＴＡ試料の血小板計数に関して単独の血小板の損失パーセントとして計算した。

血小板−白血球複合体の形成
血小板−白血球複合体の形成は、血小板凝集を測定するのに用いたのと同じ撹拌試料中で測定した。副試料を、作用薬を添加してから４分後または１０分後に採取し、適切な抗体または抗体の混合物中に移した。次いで、これらを２０分以上に亘り室温で暗所においてインキュベーションした。赤血球溶解および洗浄工程の後、細胞懸濁液をＦＡＣＳｃａｎまたはＬＳＲＩＩフローサイトメータのいずれかに適用した。白血球は、線形増幅により得られた前方散乱（細胞サイズ）および側方散乱（細胞の粒度）プロファイルのドットプロットから論理ゲイティングにより同定した。単球は、それらの前方散乱−側方散乱プロファイルおよびＣＤ１４（ＰＥ）陽性率により同定した。一方で、好中球は、同じように同定したが、ＣＤ１４発現については陰性であった。白血球個体群を同定するために、「パン（ｐａｎ）」白血球マーカーであるＣＤ４５（ｐｅｒＣＰ）も用いた。蛍光パラメータは、対数増幅により得た。血小板単球（Ｐ／Ｍ）および血小板好中球（Ｐ／Ｎ）複合体は、単球個体群（Ｐ／Ｍｍｆ）または好中球個体群（Ｐ／Ｎｍｆ）のメジアンＣＤ４２ａ（ＦＩＴＣ）蛍光として定量した。白血球の活性化は、ＣＤ１１ｂ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）発現（単球についてはＣＤ１１ｂ−Ｍおよび好中球についてはＣＤ１１ｂ−Ｎ）により測定した。血小板の活性化（Ｐ−セレクチン発現）は、（Ｐ／ＭにはＣＤ６２Ｐ−ＭおよびＰ／ＮにはＣＤ６２Ｐ−Ｎ）として白血球に関連する血小板のＣＤ６２Ｐ（ＰＥ）陽性率により測定した。

三色を一緒に使用する実験において、蛍光プローブを測定するためにＦＡＣＳｃａｎを用いたが、四色を研究するためには、ＬＳＲＩＩが必要であった。ＬＳＲＩＩは、感度の高い機械装置であり、ＦＡＣＳｃａｎよりも高い蛍光値（ｍｆ）を生じる。ＦＡＣＳｃａｎで得られた結果は、ＬＳＲＩＩで得られた結果と直接比較することはできない。

結果
凝集、Ｐ／ＭおよびＰ／ＮへのＡ１ダイマーの効果
血液を３人の異なる志願者から得て、血小板凝集および血小板／白血球複合体の形成は、コラーゲン（０、０．１２５、０．２５および０．５μｇ／ｍｌ）に対して測定した。これらの実験において、アスピリンは１００μＭの濃度で使用し、Ａ１ダイマーは０．３ｍＭの濃度で使用した。凝集は、作用薬の添加から４分後と１０分後に測定し、血小板／白血球複合体は、１０分後にだけ形成した。

異なる志願者からの血液のコラーゲンに対する絶対応答は様々であった。このことは、フラバノールの相対的な阻害効果は、使用した特定のコラーゲン濃度に対する志願者の感応性に依存したことを意味する。この理由のために、比較目的で、結果を分析するための適切な手段は、使用したコラーゲン濃度とは関係ないＡ１ダイマーに関する平均値を計算することであろうと決定した。これらの結果が図２に示されている（Ａタイプのプロシアニジン以外の特定の化合物もこれらの実験において試験したが、それらはここでの議論には関係ないので、特定しなかった）。３種類の血液試料の各々について、３つの濃度のコラーゲンを用いたので、結果は、９つの個々の値の平均（±ｓｅｍ）である。

Ａ１ダイマーは、コラーゲン誘起の血小板凝集を阻害した。ＡＳＡ対照も凝集、Ｐ／ＭおよびＰ／Ｎを効果的に阻害した。

この時点から先は、コラーゲンを血液に添加した後に形成された複合体における血小板および白血球両方の活性化の程度の尺度を含めることを決めた。Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）は、形成した複合体における白血球に関連する血小板について測定した。白血球の活性化は、発現されたＣＤ１１ｂの量として測定した。四色分析を用いた。

フラバノールのコラーゲン誘発凝集、Ｐ／Ｍ、Ｐ／Ｎ、ＣＤ６２Ｐ−Ｍ、ＣＤ６２Ｐ−Ｎ、ＣＤ１１ｂ−ＭおよびＣＤ１１ｂ−Ｎへの効果の比較
血液を３人の異なる志願者から得て、血小板凝集（４分）および血小板／白血球複合体の形成（１０分）は、コラーゲン（０、０．１２５、０．２５および０．５μｇ／ｍｌ）に対して測定した。これと同時に、複合体における血小板および白血球の活性化は、ＣＤ６２ＰおよびＣＤ１１ｂ抗体によるインキュベーションにより測定した。これらの実験において、アスピリンは１００μＭの濃度で使用し、Ａ１ダイマーは０．３ｍＭの濃度で使用した。これらの結果が図３に示されている（Ａタイプのプロシアニジン以外の特定の化合物もこれらの実験において試験したが、それらはここでの議論には関係ないので、特定しなかった）。以前のとおり、３つのコラーゲン濃度全てについての全ての結果を含め、平均を計算する（±ｓｅｍ、ｎ＝９）ことにより、分析を行った。

Ａ１ダイマーは、コラーゲン誘起の血小板凝集を阻害した。しかしながら、Ａ１Ｄは白血球の活性化は阻害しない（単球および白血球上のＣＤ１１ｂ）ことは注目に値した。アスピリンもＣＤ１１ｂへの効果はなかった。

予め収縮した大動脈環におけるＡタイプのプロシアニジンにより媒介された用量依存性弛緩を表すグラフ。Ａ）Ａ２ダイマー、Ｂ）Ａ１ダイマー、Ｃ）Ａタイプのトリマー。 Ａ１ダイマーに関する血小板凝集実験の結果を表すグラフ Ａ１ダイマーに関する血小板凝集実験の結果を表すグラフ

Claims (3)

1. (a)高血圧症、心疾患、冠動脈疾患、血管循環障害および／または腎臓病；
   (b) 心臓発作、脳梗塞、鬱血性心不全および／または腎不全のリスクがある患者；または
   (c) 糖尿病、肥満症、高コレステロールレベルおよび／または喫煙のうちのいずれかと組み合わせて高血圧を患っている患者；
   を治療するための薬剤であって、
   該薬剤が、
   (i)以下の化学式
   

   

   のＡ１ダイマーまたはその薬学的に許容される塩または誘導体：
   (ii)以下の化学式
   

   

   のＡ２ダイマーまたはその薬学的に許容される塩または誘導体：および
   (iii)以下の化学式
   

   

   のＡタイプのトリマーまたはその薬学的に許容される塩または誘導体：
   から選択されるＡタイプのプロシアニジンを有効成分として含み、
   前記Ａタイプのプロシアニジンの誘導体が、エステルであるか、モノ−またはジ−糖類部分とのエーテルを含むか、またはプロシアニジンのグリコシル化、硫酸化、グルクロニド化またはメチル化形態である、
   ことを特徴とする薬剤。
2. 前記薬剤が、別の心血管治療薬と組み合わせて投与される薬剤であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
3. 前記心血管治療薬が、ＣＯＸ阻害剤およびコレステロール低下薬からなる群より選択されることを特徴とする請求項２記載の薬剤。

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