JP5445902B2 - Electrocatalyst, enzyme electrode, fuel cell and biosensor - Google Patents

Description

本発明は、電極触媒、該電極触媒を備える酵素電極、並びに該酵素電極を備える燃料電池及びバイオセンサに関する。   The present invention relates to an electrode catalyst, an enzyme electrode including the electrode catalyst, and a fuel cell and a biosensor including the enzyme electrode.

酵素は、生体内の化学反応（代謝）を進行させる生体触媒であり、主としてペプチド結合によってリンクされたアミノ酸の鎖からなるタンパク質を基本構造とする。酵素は、タンパク質のみからなるものもあるが、その多くは、触媒活性を発現させ又は触媒活性を高めるために、タンパク質以外の成分（補因子）を必要とする。
酵素は、（１）常温、常圧付近の温和な条件で触媒作用を示す、（２）特定の基質にのみ作用する基質特異性と、特定の化学反応に対して触媒作用を示し、副反応を起こさない反応特異性とを併せ持つ、という特徴がある。 An enzyme is a biocatalyst that promotes a chemical reaction (metabolism) in a living body, and has a basic structure of a protein composed mainly of amino acid chains linked by peptide bonds. Some enzymes consist only of proteins, but many of them require components (cofactors) other than proteins in order to express catalytic activity or enhance catalytic activity.
Enzymes are (1) catalyzing under mild conditions near room temperature and normal pressure, (2) substrate specificity that acts only on specific substrates and catalysis for specific chemical reactions, and side reactions It has the feature of having both reaction specificity that does not cause the reaction.

酵素の中でも、生体内の酸化還元を触媒する酵素を、酸化還元酵素という。また、基質を酸化させる酵素を特に酸化酵素といい、基質を還元させる酵素を特に還元酵素という。電極表面にある種の酸化還元酵素を固定すると、酵素の触媒作用によって電極上で特定の酸化還元反応のみが選択的に進行し、酸化還元反応による物質の変化を電極により電気信号に変換することができる。このような電極は酵素電極と呼ばれており、各種のバイオセンサ、燃料電池などの電極に利用されている。   Among enzymes, an enzyme that catalyzes redox in vivo is called an oxidoreductase. An enzyme that oxidizes a substrate is called an oxidase, and an enzyme that reduces a substrate is called a reductase. When a certain oxidoreductase is immobilized on the electrode surface, only a specific redox reaction proceeds selectively on the electrode due to the catalytic action of the enzyme, and the change of the substance due to the redox reaction is converted into an electrical signal by the electrode. Can do. Such an electrode is called an enzyme electrode, and is used for various biosensors, fuel cells and the like.

例えば、ラッカーゼ、ビリルビン酸化酵素（ＢＯＤ）、ＣｕｅＯ（Ｃｏｐｐｅｒ ｅｆｆｌｕｘ Ｏｘｉｄａｓｅ）、等のマルチ銅酸化酵素は、タイプＩ、II、IIIに分類される３種、計４個（タイプＩ銅１個、タイプII銅１個、タイプIII銅２個）の銅イオンからなる活性中心を有する。タイプＩ銅は基質から電子を引き抜く機能を有し（電子受容部位）、タイプII銅と一対のタイプIII銅は、タイプＩ銅から分子内を輸送された電子を用いて、酸素を水に還元（酸素４電子還元）する機能を有する。
このように、少なくともタイプＩ、II、IIIに分類される３種、計４個の銅を有するマルチ銅酸化酵素は、電子供与体との反応サイト（タイプＩ銅部位）と、電子受容体との反応サイト（タイプII−III銅クラスター）とが異なる。すなわち、電極から電子を受け取るサイトと、酸素に電子を渡すサイトが異なるため、酸素還元反応を高効率で触媒することができる。ゆえに、このようなマルチ銅酸化酵素は、生物燃料電池のカソード（酸素還元極）用の電極触媒として使用されており、中でもＣｕｅＯは最も有望な電極触媒の１つである。 For example, multi-copper oxidases such as laccase, bilirubin oxidase (BOD), CueO (Copper efflux Oxidase), etc. are classified into three types classified into type I, II and III, a total of four (one type I copper, one type 1 active copper and 2 active type III copper). Type I copper has a function of extracting electrons from the substrate (electron accepting site), and type II copper and a pair of type III copper reduce oxygen to water using electrons transported in the molecule from type I copper. It has a function of (oxygen 4 electron reduction).
As described above, the multi-copper oxidase having at least three types of copper classified into types I, II, and III, that is, a total of four coppers, has a reaction site (type I copper site) with an electron donor, an electron acceptor, The reaction site (type II-III copper cluster) is different. That is, since the site for receiving electrons from the electrode is different from the site for passing electrons to oxygen, the oxygen reduction reaction can be catalyzed with high efficiency. Therefore, such a multi-copper oxidase is used as an electrode catalyst for a cathode (oxygen reduction electrode) of a biofuel cell, and among these, CueO is one of the most promising electrode catalysts.

また、マルチ銅酸化酵素に分類される酵素として、マルチ銅含有亜硝酸還元酵素がある。マルチ銅含有亜硝酸還元酵素は、タイプＩ銅及びタイプII銅を有し、タイプＩ銅が電子供与タンパク質から電子を受け取り、タイプII銅にて亜硝酸イオンを１電子還元し、一酸化窒素を生成する。   Moreover, there exists multi copper containing nitrite reductase as an enzyme classified into multi copper oxidase. Multi-copper-containing nitrite reductase has type I copper and type II copper, type I copper receives electrons from electron donating protein, nitrite ion is reduced by one electron with type II copper, and nitric oxide is reduced. Generate.

カソード用電極触媒としてのマルチ銅酸化酵素には、電子受容部位であるタイプＩ銅の酸化還元電位が、より正側にあることが求められる。カソード電極における過電圧の低下により、生物燃料電池の発電効率向上や、バイオセンサの高感度化が実現されるからである。
しかしながら、例えば、ＣｕｅＯの電子受容部位であるタイプＩ銅の酸化還元電位は、同じくマルチ銅酸化酵素であるラッカーゼ等に比較して負側で、過電圧による発電効率の低下を招いている。そこで、マルチ銅酸化酵素の電極触媒としての性能を高めるべく、また、マルチ銅酸化酵素の触媒活性メカニズムを解明すべく、変異体の作製も行われている。本発明者らも従来、マルチ銅酸化酵素の改変に積極的に取り組んできた。 Multi-copper oxidase as a cathode electrode catalyst is required to have the redox potential of type I copper, which is an electron accepting site, on the more positive side. This is because the reduction in overvoltage at the cathode electrode can improve the power generation efficiency of the biofuel cell and increase the sensitivity of the biosensor.
However, for example, the redox potential of type I copper, which is an electron accepting site of CueO, is negative compared to laccase or the like, which is also a multi-copper oxidase, causing a decrease in power generation efficiency due to overvoltage. Therefore, in order to improve the performance of multi-copper oxidase as an electrode catalyst, and to elucidate the catalytic activity mechanism of multi-copper oxidase, mutants have been produced. The present inventors have also been actively working on modification of multi-copper oxidase.

例えば、非特許文献１では、マルチ銅酸化酵素であるビリルビン酸化酵素のタイプＩ銅において、軸位配位子である４６７番目のメチオニンを、非配位性のフェニルアラニン及びロイシンで置換し、スペクトル特性、磁気特性、酸化酵素活性を変化させている。しかしながら、非特許文献１の変異体では、軸位配位子の置換による構造変化により、銅含量、活性の低下、タイプＩ銅の還元電位の負側へのシフトが生じている。   For example, in Non-Patent Document 1, in the type I copper of bilirubin oxidase, which is a multi-copper oxidase, the 467th methionine which is an axial ligand is substituted with non-coordinating phenylalanine and leucine, and spectral characteristics are obtained. , Changing magnetic properties, oxidase activity. However, in the mutant of Non-Patent Document 1, due to the structural change due to the substitution of the axial ligand, the copper content, the activity are reduced, and the reduction potential of Type I copper is shifted to the negative side.

また、非特許文献２では、ＣｏｔＡラッカーゼのタイプＩ銅部位において、軸位配位子である５０２番目のメチオニン残基を、ロイシン残基、フェニルアラニン残基で置換することによって、野生型と比較して、還元電位をおよそ１００ｍＶ、正側にシフトさせることに成功している。しかしながら、非特許文献２の変異体では、軸位配位子の置換による構造変化によって、銅含量、活性、安定性の低下が生じている。   Further, in Non-Patent Document 2, in the CotA laccase type I copper site, the 502th methionine residue, which is an axial ligand, is substituted with a leucine residue or a phenylalanine residue to compare with the wild type. Thus, the reduction potential is successfully shifted to the positive side by about 100 mV. However, in the mutant of Non-Patent Document 2, the copper content, activity, and stability are reduced due to the structural change caused by the substitution of the axial ligand.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 416-419Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 416-419 J. Biol. Inorg. Chem. 11 (2006) 514-526J. Biol. Inorg. Chem. 11 (2006) 514-526

本発明は、上記実情を鑑みて成し遂げられたものであり、過電圧が小さく、発電効率に優れたマルチ銅酸化酵素からなる電極触媒の提供、該電極触媒を備えた酵素電極、並びに該酵素電極を備えた燃料電池及びバイオセンサの提供を目的とするものである。   The present invention has been accomplished in view of the above circumstances, and provides an electrode catalyst comprising a multi-copper oxidase with low overvoltage and excellent power generation efficiency, an enzyme electrode provided with the electrode catalyst, and the enzyme electrode. The object is to provide a fuel cell and a biosensor provided.

本発明の電極触媒は、少なくとも、タイプＩ銅１個、タイプII銅１個及びタイプIII銅２個を有する、マルチ銅酸化酵素からなる電極触媒であって、少なくとも１つのシステイン残基及び２つのヒスチジン残基が、前記タイプＩ銅に配位しており、前記２つのヒスチジン残基のうちリガンドループを形成していないヒスチジン残基の下流側に隣接するプロリン残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、グリシン残基、及びメチオニン残基よりなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸残基で置換され、置換アミノ酸残基のアミドプロトンとタイプＩ銅配位システイン残基の硫黄原子との間に水素結合を有することを特徴とするものである。 Electrocatalyst of the present invention comprises at least one type I copper, one type II copper and Type III copper having two, an electrode catalyst comprising a multi-copper oxidase, at least one cysteine residue and two histidine residues, wherein are coordinated to the type I copper, proline residues adjacent to the downstream side of the histidine residue not form a ligand-loop of the two histidine residues, alanine residue, valine Substituted with any amino acid residue selected from the group consisting of a residue, a leucine residue, an isoleucine residue, a glycine residue, and a methionine residue, and the amide proton of the substituted amino acid residue and the type I copper coordinated cysteine residue It has a hydrogen bond with the sulfur atom of the group.

本発明者らは、タイプＩ銅１個、タイプII銅１個及びタイプIII銅２個を有するマルチ銅酸化酵素の１つであるＣｕｅＯについて鋭意研究した結果、上記リガンドループを形成していないヒスチジン残基（以下、リガンドループ外配位ヒスチジン残基、ということがある）の下流側に隣接するプロリン残基を、プロリン以外の特定のアミノ酸の残基で置換することによって、タイプＩ銅の酸化還元電位を正側にシフトできることを見出した。このような酸化還元電位の正側へのシフトは、タイプＩ銅部位における上記変異導入によって、上記２つのヒスチジン残基と共にタイプＩ銅に配位し且つ上記リガンドループを形成するシステイン残基の硫黄原子と、置換アミノ酸残基のアミドプロトンと、の間に生じた水素結合に起因すると考えられる。
プロリン残基をアミノ酸残基に置換する上記変異導入は、リガンドループ外配位ヒスチジン残基に隣接するプロリン残基が保存されているＣｕｅＯ以外のタイプＩ銅１個、タイプII銅１個及びタイプIII銅２個を有するマルチ銅酸化酵素においても有効であり、前記システイン残基の硫黄原子と置換アミノ酸残基のアミドプロトンとの間に水素結合を生じさせることができる。 As a result of intensive research on CueO, which is one of multi-copper oxidases having one type I copper, one type II copper and two type III coppers , the present inventors have found that histidine that does not form the above ligand loops. Oxidation of type I copper by substituting a proline residue adjacent to the downstream side of the residue (hereinafter, sometimes referred to as a ligand-loop coordinated histidine residue) with a residue of a specific amino acid other than proline It was found that the reduction potential can be shifted to the positive side. Such a shift of the redox potential to the positive side is caused by the introduction of the mutation at the type I copper site, and the sulfur of the cysteine residue that coordinates with type 2 copper together with the two histidine residues and forms the ligand loop. This is thought to be due to a hydrogen bond formed between the atom and the amide proton of the substituted amino acid residue.
The above-described mutagenesis in which a proline residue is substituted with an amino acid residue includes one type I copper, one type II copper, and a type other than CueO in which the proline residue adjacent to the histidine residue coordinated outside the ligand loop is conserved. It is also effective in multi-copper oxidase having two III coppers , and can form a hydrogen bond between the sulfur atom of the cysteine residue and the amide proton of the substituted amino acid residue.

本発明において、前記アミノ酸残基が、アラニン残基、ロイシン残基、及びイソロイシン残基よりなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
また、前記マルチ銅酸化酵素として、具体的には、ＣｕｅＯ、ＭｖＢＯ、ＲｖＬｃ、ＣｐＡＯ、ＴｖＬｃ、ＣｃＬｃ、Ｆｅｔ３ｐ、ＣｕｍＡ、及びＣｏｔＡよりなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。 In the present invention, the amino acid residue is preferably at least one selected from the group consisting of an alanine residue, a leucine residue, and an isoleucine residue .
Specific examples of the multi-copper oxidase include at least one selected from the group consisting of CueO, MvBO, RvLc, CpAO, TvLc, CcLc, Fet3p, CumA, and CotA .

前記マルチ銅酸化酵素がＣｕｅＯである場合、本発明の電極触媒は、配列番号：１（オープンリーディングフレーム）に示されるアミノ酸配列において、４４４番のプロリン残基を、前記アミノ酸残基（プロリン残基以外のアミノ酸残基）で置換したＣｕｅＯ変異体からなる。   When the multi-copper oxidase is CueO, the electrocatalyst of the present invention uses the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (open reading frame) as the proline residue at position 444 as the amino acid residue (proline residue). A CueO mutant substituted with an amino acid residue other than

本発明の酵素電極は、上記本発明の電極触媒を備えることを特徴とするものである。   The enzyme electrode of the present invention comprises the above-described electrode catalyst of the present invention.

また、本発明の燃料電池は、上記本発明の酵素電極を酸化剤極として備えることを特徴とするものである。また、本発明のバイオセンサは、上記本発明の酵素電極を備えることを特徴とするものである。   The fuel cell of the present invention is characterized by comprising the enzyme electrode of the present invention as an oxidant electrode. The biosensor of the present invention is characterized by comprising the enzyme electrode of the present invention.

本発明によれば、タイプＩ銅の酸化還元電位を正側にシフトさせたマルチ銅酸化酵素からなる電極触媒を提供することができる。すなわち、本発明の電極触媒は反応過電圧が小さく、本発明の電極触媒を用いることによって発電効率に優れた燃料電池や高感度のバイオセンサの実現を可能とする。   ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the electrode catalyst which consists of multi copper oxidase which shifted the oxidation-reduction potential of type I copper to the positive side can be provided. That is, the electrode catalyst of the present invention has a small reaction overvoltage, and by using the electrode catalyst of the present invention, it is possible to realize a fuel cell excellent in power generation efficiency and a highly sensitive biosensor.

マルチ銅酸化酵素のタイプＩ銅配位子周囲のアミノ酸配列を示すものである。It shows the amino acid sequence around the type I copper ligand of multi-copper oxidase. 野生型ＣｕｅＯのタイプＩ銅部位の構造を示すものである。The structure of the type I copper site | part of wild type CueO is shown. 実施例におけるサイクリックボルタムグラムの結果を示すものである。The result of the cyclic voltammgram in an Example is shown.

本発明の電極触媒は、少なくともタイプＩ銅を含む複数の銅原子を有する、マルチ銅酸化酵素からなる電極触媒であって、
少なくとも１つのシステイン残基及び２つのヒスチジン残基が、前記タイプＩ銅に配位しており、前記システイン残基と前記２つのヒスチジン残基のうちリガンドループを形成しているヒスチジン残基との間に存在するプロリン残基、又は、前記２つのヒスチジン残基のうちリガンドループを形成していないヒスチジン残基の下流側に隣接するプロリン残基が、プロリン残基以外のアミノ酸残基で置換され、置換アミノ酸残基のアミドプロトンとタイプＩ銅配位システイン残基の硫黄原子との間に水素結合を有することを特徴とするものである。 The electrode catalyst of the present invention is an electrode catalyst composed of a multi-copper oxidase having a plurality of copper atoms including at least type I copper,
At least one cysteine residue and two histidine residues are coordinated to the type I copper, and the cysteine residue and a histidine residue that forms a ligand loop of the two histidine residues. A proline residue present in between or a proline residue adjacent to the downstream side of the histidine residue that does not form a ligand loop among the two histidine residues is substituted with an amino acid residue other than the proline residue. And a hydrogen bond between the amide proton of the substituted amino acid residue and the sulfur atom of the type I copper coordinated cysteine residue.

マルチ銅酸化酵素のタイプＩ銅には、少なくとも、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）残基１つと、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）残基２つが配位している。その他、軸配位子としてメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）残基が配位している場合もある（図１参照）。これらタイプＩ銅に配位したシステイン残基（配位システイン残基）、及び、２つのヒスチジン残基（配位ヒスチジン残基）のうちの一方は、リガンドループを形成している。メチオニン残基が配位している場合には、この配位メチオニン残基もリガンドループを形成している。   At least one cysteine (Cys, C) residue and two histidine (His, H) residues are coordinated with type I copper of the multi-copper oxidase. In addition, a methionine (Met, M) residue may be coordinated as an axial ligand (see FIG. 1). One of these cysteine residues coordinated to type I copper (coordinated cysteine residues) and two histidine residues (coordinated histidine residues) forms a ligand loop. When a methionine residue is coordinated, this coordinated methionine residue also forms a ligand loop.

ここで、リガンドループとは、タイプＩ銅に配位した配位システイン残基と配位メチオニン残基の間のペプチドがなす構造をいう。軸配位子としてタイプＩ銅にメチオニン残基が配位していない場合には、タイプＩ銅に配位したシステイン残基と、該配位システイン残基の下流の前記配位メチオニン残基に対応する位置に存在するアミノ酸残基と、の間のペプチドがなす構造をいう。軸配位子としてメチオニン残基が配位していない場合において、配位メチオニン残基に対応する位置に存在するアミノ酸残基としては、例えば、フェニルアラニン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基等が挙げられる。
図１にマルチ銅酸化酵素ファミリーの銅配位子周辺のアミノ酸配列の比較を示す。図１において、１、２、３の数字は、それぞれ、タイプＩ、II、III銅に配位したアミノ酸残基を表す。また、マルチ銅含有亜硝酸還元酵素（ＮＩＲ）のリガンドループ中の＋は、ＡＰＥＧＭ（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ）又はＡＰＰＧＭ（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ）のペンタペプチド配列の挿入を表している。
また、図１において各マルチ銅酸化酵素は、下記略名で示している。 Here, the ligand loop refers to a structure formed by a peptide between a coordinating cysteine residue coordinated with type I copper and a coordinating methionine residue. When the methionine residue is not coordinated to type I copper as an axial ligand, the cysteine residue coordinated to type I copper and the coordinated methionine residue downstream of the coordinated cysteine residue A structure formed by a peptide between an amino acid residue at a corresponding position. In the case where the methionine residue is not coordinated as an axial ligand, the amino acid residue present at the position corresponding to the coordinated methionine residue includes, for example, a phenylalanine residue, an isoleucine residue, a leucine residue, etc. Can be mentioned.
FIG. 1 shows a comparison of amino acid sequences around the copper ligands of the multi-copper oxidase family. In FIG. 1, numerals 1, 2, and 3 represent amino acid residues coordinated to type I, II, and III copper, respectively. Moreover, + in the ligand loop of multi-copper-containing nitrite reductase (NIR) is a pentapeptide sequence of APEGM (Ala-Pro-Glu-Gly-Met) or APPGM (Ala-Pro-Pro-Gly-Met). Represents an insertion.
Moreover, in FIG. 1, each multi copper oxidase is shown by the following abbreviation.

ＭｖＢＯ；Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase
ＲｖＬｃ；Rhus vernicifera laccase
ＣｐＡＯ；Cucurbita pepo ascorbate oxidase
ＴｖＬｃ；Trametes versicolor laccase
ＣｃＬｃ；Coprinus cinerius laccase
Ｆｅｔ３ｐ；Saccharomyces cerevisiae ferroxidase
ＣｕｍＡ；Pseudomonas putida Mn2⁺ oxidase
ＣｏｔＡ；Bacillus subtilis endospore coat laccase
ＳＬＡＣ；small laccase from Streptomyces coelicolor
ｈＣｐ；human ceruloplasmin
ＡｘＮＩＲ；Alcaligenes xylosoxidans nitrite reductase
ＡｃＮＩＲ；Achromobacter cycloclastes nitrite reductase
ＡｆＮＩＲ；Alcaligenes faecalis nitrite reductase MvBO; Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase
RvLc; Rhus vernicifera laccase
CpAO; Cucurbita pepo ascorbate oxidase
TvLc; Trametes versicolor laccase
CcLc; Coprinus cinerius laccase
Fet3p ； Saccharomyces cerevisiae ferroxidase
CumA; Pseudomonas putida Mn2 ⁺ oxidase
CotA; Bacillus subtilis endospore coat laccase
SLAC; small laccase from Streptomyces coelicolor
hCp; human ceruloplasmin
AxNIR; Alcaligenes xylosoxidans nitrite reductase
AcNIR; Achromobacter cycloclastes nitrite reductase
AfNIR; Alcaligenes faecalis nitrite reductase

例えば、ＣｕｅＯの場合、図２に示すように、Ｃｙｓ５００とＭｅｔ５１０の間のペプチドがなす構造をリガンドループという。図２は、野生型ＣｕｅＯのタイプＩ銅部位の構造を示すものである。
本発明者らは、マルチ銅酸化酵素のタイプＩ銅周辺の水素結合ネットワークに着目した。そして、マルチ銅酸化酵素の１つであるＣｕｅＯのタイプＩ銅部位において、リガンドループを形成している配位システイン残基（Ｃｙｓ５００）の硫黄原子が、同じくリガンドループを形成するロイシン残基（Ｌｅｕ５０２）との間にのみ水素結合を有し、他のアミノ酸残基との間には水素結合を有していないことを確認した（図２参照）。 For example, in the case of CueO, as shown in FIG. 2, a structure formed by a peptide between Cys500 and Met510 is called a ligand loop. FIG. 2 shows the structure of the type I copper site of wild-type CueO.
The present inventors paid attention to the hydrogen bond network around type I copper of multi-copper oxidase. Then, in the type I copper site of CueO, which is one of the multi-copper oxidases, the sulfur atom of the coordinating cysteine residue (Cys500) that forms the ligand loop is replaced with the leucine residue (Leu502) that also forms the ligand loop. ) And hydrogen bonds only with other amino acid residues (see FIG. 2).

そこで、本発明者らは、ＣｕｅＯのタイプＩ銅部位において、アミド結合を有していないためにＣｙｓ５００の硫黄原子と水素結合を形成することができない、４４４番目のプロリン残基（Ｐｒｏ４４４）（図１、図２参照）を、主鎖アミド水素原子（アミドプロトン）を有するアミノ酸残基に置換することで、Ｃｙｓ５００の硫黄原子に４４４番目の置換アミノ酸残基のアミドプロトンからの水素結合を導入できることを見出した。
配列表の配列番号１に、野生型（組換え型）の大腸菌由来ＣｕｅＯのアミノ酸配列を示す。また、配列表の配列番号２〜４に、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型（組換え型）の大腸菌由来ＣｕｅＯにおいて、４４４番目のプロリン残基をアラニン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基にそれぞれ置換した変異型ＣｕｅＯのアミノ酸配列を示す。
尚、配列番号１〜４のアミノ酸配列は、オープンリーディングフレームである。また、配列番号１〜４のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１番目のメチオニン（Ｍｅｔ１）〜２８番目のアラニン（Ａｌａ２８）は、ＴＡＴ分泌シグナル配列である。 Therefore, the present inventors cannot form a hydrogen bond with the sulfur atom of Cys500 because it does not have an amide bond at the type I copper site of CueO, and the 444th proline residue (Pro444) (FIG. 1, refer to FIG. 2), a hydrogen bond from the amide proton of the 444th substituted amino acid residue can be introduced into the sulfur atom of Cys500 by substituting the amino acid residue having a main chain amide hydrogen atom (amide proton). I found.
The amino acid sequence of wild-type (recombinant) Escherichia coli-derived CueO is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In addition, in the sequence listing, SEQ ID NOs: 2 to 4, in the wild type (recombinant) E. coli-derived CueO having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 444th proline residue is alanine residue, isoleucine residue, leucine residue 1 shows the amino acid sequence of mutant CueO each substituted with a group.
The amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 are open reading frames. In the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4, the first methionine (Met1) to the 28th alanine (Ala28) from the N-terminal side are TAT secretion signal sequences.

そして、このような変異導入を行うことで、ＣｕｅＯのタイプＩ銅の酸化還元電位を、正側に５０〜１００ｍＶシフトさせることに成功した。さらに、上記変異導入を行ったＣｕｅＯは、野生型ＣｕｅＯと比較して、酵素活性が約１０倍に増大することも確認された。   And by carrying out such mutation introduction, it succeeded in shifting the oxidation-reduction potential of CueO type I copper by 50 to 100 mV to the positive side. Furthermore, it was also confirmed that CueO in which the mutation was introduced had an enzyme activity increased about 10 times compared to wild-type CueO.

ＣｕｅＯにおいて、変異を導入したプロリン残基（Ｐｒｏ４４４）は、タイプＩ銅に配位した配位ヒスチジン残基（Ｈｉｓ４４３、Ｈｉｓ５０５）のうち、リガンドループを形成していない配位ヒスチジン残基（Ｈｉｓ４４３、リガンドループ外配位ヒスチジン残基）の下流側に隣接している。
図１に示すように、ＣｕｅＯにおいて変異を導入したプロリン残基（リガンドループ外配位ヒスチジン残基に隣接するプロリン残基）は、ほとんどのマルチ銅酸化酵素（図１においては、ＳＬＡＣ、ｈＣｐ、ＡｘＮＩＲ、ＡｃＮＩＲ及びＡｆＮＩＲ以外）において保存されている。
ゆえに、リガンドループ外配位ヒスチジン残基に隣接するプロリン残基が保存されているマルチ銅酸化酵素であれば、該プロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基で置換する、上記変異導入を行うことによって、配位システイン残基の硫黄原子と置換アミノ残基のアミドプロトンとの間に水素結合を生じさせ、タイプＩ銅の酸化還元電位を正側にシフトさせることが可能であると考えられる。すなわち、本発明によれば、カソード用電極触媒としてのマルチ銅酸化酵素の性能を、容易に向上させることが可能である。 In CueO, a proline residue (Pro444) into which a mutation has been introduced is a coordinated histidine residue (His443, His443, which forms a ligand loop among the coordinated histidine residues (His443, His505) coordinated to type I copper. Adjacent to the downstream side of the ligand loop outside coordination histidine residue).
As shown in FIG. 1, proline residues (proline residues adjacent to ligand-ligand ligated histidine residues) introduced with mutations in CueO are mostly multi-copper oxidases (in FIG. 1, SLAC, hCp, (Except AxNIR, AcNIR and AfNIR).
Therefore, in the case of a multi-copper oxidase in which the proline residue adjacent to the histidine residue coordinated outside the ligand loop is conserved, the mutation introduction described above is performed by substituting the proline residue with an amino acid residue other than the proline residue. By doing so, it is considered possible to generate a hydrogen bond between the sulfur atom of the coordinating cysteine residue and the amide proton of the substituted amino residue and shift the redox potential of type I copper to the positive side. It is done. That is, according to the present invention, the performance of multi-copper oxidase as a cathode electrode catalyst can be easily improved.

一方、ＡｘＮＩＲ、ＡｃＮＩＲ及びＡｆＮＩＲ等のマルチ銅酸化酵素は、タイプＩ銅部位において、リガンドループ外配位ヒスチジン残基の下流側に隣接するプロリン残基を有していない（図１参照）。しかし、これらのマルチ銅酸化酵素では、タイプＩ銅部位において、配位システイン残基とリガンドループを形成する配位ヒスチジン残基との間にプロリン残基、すなわち、リガンドループ上において、配位システイン残基と配位ヒスチジン残基との間にプロリン残基（以下、リガンドループ内プロリン残基ということがある。）が存在することが確認されている（J. Biochem, 1998,Vol. 124, No.5 876-879、Biochemistry 2001, 40, 9132-9141）。
このようなタイプＩ銅部位の構造（例えば、リガンドループ内プロリン残基と配位システイン残基との距離等）から、該リガンドループ内プロリン残基を、プロリン残基以外のアミノ酸残基で置換することによって、配位システイン残基の硫黄原子と置換アミノ酸残基のアミドプロトンとの間に水素結合を導入可能であることが推測される。 On the other hand, multi-copper oxidases such as AxNIR, AcNIR, and AfNIR do not have a proline residue adjacent to the downstream side of the ligand-loop coordinated histidine residue at the type I copper site (see FIG. 1). However, in these multi-copper oxidases, at the type I copper site, between the coordinating cysteine residue and the coordinating histidine residue forming the ligand loop, the proline residue, ie, the coordinating cysteine on the ligand loop. It has been confirmed that a proline residue (hereinafter sometimes referred to as a proline residue in a ligand loop) exists between a residue and a coordinated histidine residue (J. Biochem, 1998, Vol. 124, No. 5 876-879, Biochemistry 2001, 40, 9132-9141).
Based on the structure of the type I copper site (for example, the distance between the proline residue in the ligand loop and the coordinating cysteine residue, etc.), the proline residue in the ligand loop is replaced with an amino acid residue other than the proline residue. By doing so, it is presumed that a hydrogen bond can be introduced between the sulfur atom of the coordinating cysteine residue and the amide proton of the substituted amino acid residue.

すなわち、配位システイン残基とリガンドループを形成する配位ヒスチジン残基との間に存在するプロリン残基を有するマルチ銅酸化酵素は、リガンドループ内プロリン残基を、プロリン残基以外のアミノ酸残基で置換することによって、配位システイン残基の硫黄原子と置換アミノ酸残基のアミドプロトンとの間に水素結合を形成させることができる。その結果、上記同様、タイプＩ銅の酸化還元電位を正側にシフトさせることが可能である。   That is, a multi-copper oxidase having a proline residue existing between a coordinating cysteine residue and a coordinating histidine residue that forms a ligand loop causes a proline residue in the ligand loop to remain as an amino acid residue other than the proline residue. By substituting with a group, a hydrogen bond can be formed between the sulfur atom of the coordinating cysteine residue and the amide proton of the substituted amino acid residue. As a result, the redox potential of type I copper can be shifted to the positive side as described above.

具体的には、図１に示すように、ＡｘＮＩＲ、ＡｃＮＩＲ及びＡｆＮＩＲのタイプＩ銅部位には、リガンドループ外配位ヒスチジン残基（Ｈｉｓ９５）の下流側に隣接するプロリン残基はない。しかし、リガンドループを形成している配位システイン残基（Ｃｙｓ１３６）と、同じくリガンドループを形成している配位ヒスチジン残基（Ｈｉｓ１４５）との間に、プロリン残基（Ｐｒｏ１４３）が存在する。このリガンドループ上に存在するＰｒｏ１４３は、アミドプロトンを有していないため、Ｃｙｓ１３６の硫黄原子との間に水素結合を形成することができない。
そこで、Ｐｒｏ１４３を、アミドプロトンを有するアミノ酸残基に置換することで、Ｃｙｓ１３６の硫黄原子に、１４３番目の置換アミノ酸残基のアミドプロトンからの水素結合を導入でき、タイプＩ銅の酸化還元電位を、正側にシフトさせることができる。
これらＡｘＮＩＲ、ＡｃＮＩＲ及びＡｆＮＩＲは、マルチ銅含有亜硝酸還元酵素であり、タイプＩ銅及びタイプII銅を有するマルチ銅酸化酵素に分類される。 Specifically, as shown in FIG. 1, the type I copper site of AxNIR, AcNIR and AfNIR does not have a proline residue adjacent to the downstream side of the ligand-loop coordinated histidine residue (His95). However, there is a proline residue (Pro143) between the coordinating cysteine residue (Cys136) forming the ligand loop and the coordinating histidine residue (His145) also forming the ligand loop. Since Pro143 present on the ligand loop does not have an amide proton, it cannot form a hydrogen bond with the sulfur atom of Cys136.
Therefore, by replacing Pro143 with an amino acid residue having an amide proton, a hydrogen bond from the amide proton of the 143th substituted amino acid residue can be introduced into the sulfur atom of Cys136, and the redox potential of type I copper is increased. Can be shifted to the positive side.
These AxNIR, AcNIR and AfNIR are multi-copper-containing nitrite reductases, and are classified into multi-copper oxidases having type I copper and type II copper.

尚、本明細書において、アミノ酸配列又は塩基配列の下流とは、対象とするアミノ酸配列のＣ末端又は塩基配列の３’側に続く領域を示し、上流とは、対象とするアミノ酸配列のＮ末端又は塩基配列の５’側に続く領域を示す。   In the present specification, the downstream of the amino acid sequence or base sequence refers to the C-terminal of the target amino acid sequence or the region continuing to the 3 ′ side of the base sequence, and the upstream refers to the N-terminal of the target amino acid sequence. Or the area | region which continues on the 5 'side of a base sequence is shown.

また、タイプＩ銅に配位した配位システイン残基の硫黄原子と、置換アミノ酸残基のアミドプロトンとの間に水素結合があるかどうかは、Ｘ線結晶構造解析等、一般的な手法により確認することができる。   In addition, whether there is a hydrogen bond between the sulfur atom of the coordinating cysteine residue coordinated with type I copper and the amide proton of the substituted amino acid residue is determined by a general method such as X-ray crystal structure analysis. Can be confirmed.

以下、本発明の電極触媒、酵素電極、燃料電池及びバイオセンサについて詳しく説明していく。   Hereinafter, the electrode catalyst, enzyme electrode, fuel cell, and biosensor of the present invention will be described in detail.

［電極触媒］
本発明において、変異導入を行うマルチ銅酸化酵素は、少なくともタイプＩ銅を含む複数の銅原子を有し、少なくとも１つのシステイン残基及び２つのヒスチジン残基がタイプＩ銅に配位しており、該配位システイン残基と２つの配位ヒスチジン残基のうちリガンドループを形成しているヒスチジン残基との間に存在するプロリン残基（リガンドループ内プロリン残基）、又は、２つの配位ヒスチジン残基のうちリガンドループを形成していないヒスチジン残基（リガンドループ外配位ヒスチジン残基）に隣接するプロリン残基を有するものであれば特に限定されない。
例えば、少なくともタイプＩ銅１個、タイプII銅１個及びタイプIII銅２個を有するマルチ銅酸化酵素の他、タイプＩ銅及びタイプII銅を有するマルチ銅酸化酵素も含まれる。
本発明において好適に用いられるマルチ銅酸化酵素として、具体的には、少なくともタイプＩ銅１個、タイプII銅１個及びタイプIII銅２個を有するマルチ銅酸化酵素としては、例えば、ＣｕｅＯ、ラッカーゼ（ビリルビン酸化酵素を除く）、ビリルビン酸化酵素（ＢＯＤ）、アスコルビン酸酸化酵素、マルチ銅含有金属酸化酵素（ＣｕｅＯを除く）等が挙げられ、タイプＩ銅及びタイプII銅を有するマルチ銅酸化酵素としては、例えば、マルチ銅含有亜硝酸還元酵素が挙げられる。 [Electrode catalyst]
In the present invention, the multi-copper oxidase for mutagenesis has a plurality of copper atoms including at least type I copper, and at least one cysteine residue and two histidine residues are coordinated to type I copper. A proline residue (proline residue in the ligand loop) existing between the coordinating cysteine residue and a histidine residue forming a ligand loop among the two coordinating histidine residues, There is no particular limitation as long as it has a proline residue adjacent to a histidine residue that does not form a ligand loop among the position histidine residues (coordination histidine residue outside the ligand loop).
For example, in addition to multi-copper oxidase having at least one type I copper, one type II copper and two type III coppers, multi-copper oxidase having type I copper and type II copper is also included.
As the multi-copper oxidase suitably used in the present invention, specifically, as the multi-copper oxidase having at least one type I copper, one type II copper and two type III coppers, for example, CueO, laccase (Excluding bilirubin oxidase), bilirubin oxidase (BOD), ascorbate oxidase, multi-copper-containing metal oxidase (excluding CueO), etc. As multi-copper oxidase having type I copper and type II copper Examples include multi-copper-containing nitrite reductase.

中でも、生物燃料電池のカソード用電極触媒として優れた性能を有する少なくともタイプＩ銅１個、タイプII銅１個及びタイプIII銅２個を有するマルチ銅酸化酵素が好ましく、例えば、ビリルビン酸化酵素（例えば、ＭｖＢＯなど）、ＣｏｔＡ、ＲｖＬｃ、ＴｖＬｃ、ＣｃＬｃ等のラッカーゼ；ＣｐＡＯ等のアスコルビン酸酸化酵素；ＣｕｅＯ、Ｆｅｔ３Ｐ、ＣｕｍＡ等のマルチ銅含有金属酸化酵素等が挙げられ、これらのうち、特にＣｕｅＯが好ましい。
また、マルチ銅含有亜硝酸還元酵素としては、例えば、ＡｘＮＩＲ、ＡｃＮＩＲ、ＡｆＮＩＲ等が挙げられる。 Among them, a multi-copper oxidase having at least one type I copper, one type II copper and two type III coppers having excellent performance as an electrode catalyst for a cathode of a biofuel cell is preferable. For example, bilirubin oxidase (for example, , MvBO, etc.), CotA, RvLc, TvLc, CcLc and other laccases; CpAO and other ascorbic acid oxidases; .
Examples of the multi-copper-containing nitrite reductase include AxNIR, AcNIR, AfNIR, and the like.

尚、本発明において、変異を導入するマルチ銅酸化酵素は、菌株から直接採取された野生型マルチ銅酸化酵素でもよく、或いは、本発明において変異導入を行うアミノ酸残基以外において、電極触媒としての触媒活性を消失させない範囲において、野生型マルチ銅酸化酵素の一部を変更、削除等した（例えば、１個乃至数十個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された）改変型マルチ銅酸化酵素であってもよい。また、野生型マルチ銅酸化酵素とは、天然型のマルチ銅酸化酵素、及びその組換え型を含む。   In the present invention, the multi-copper oxidase for introducing a mutation may be a wild-type multi-copper oxidase directly collected from a strain, or as an electrode catalyst other than the amino acid residue to be mutated in the present invention. Modified type in which a part of wild type multi-copper oxidase is changed, deleted, etc. (for example, 1 to several tens of amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added) as long as the catalytic activity is not lost. Multi-copper oxidase may be used. The wild-type multi-copper oxidase includes a natural multi-copper oxidase and a recombinant form thereof.

上記したように、リガンドループ外配位ヒスチジン残基の下流側に隣接するプロリン残基を、プロリン以外のアミノ酸の残基に置換することによって、該置換アミノ酸残基のアミドプロトンから、配位システイン残基の硫黄原子に水素結合を導入することができる。
リガンドループ外配位ヒスチジン残基の下流側に隣接するプロリン残基と置換するアミノ酸残基は、プロリン残基以外のアミノ酸残基であれば、アミドプロトンを有するため、特に限定されない。好ましい置換アミノ酸残基としては、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等が挙げられる。 As described above, by substituting the proline residue adjacent to the downstream side of the ligand-loop coordinated histidine residue with a residue of an amino acid other than proline, the amide proton of the substituted amino acid residue can be used to coordinate cysteine. Hydrogen bonds can be introduced into the sulfur atom of the residue.
The amino acid residue to be substituted with the proline residue adjacent to the downstream side of the histidine residue coordinated outside the ligand loop is not particularly limited because it has an amide proton as long as it is an amino acid residue other than the proline residue. Examples of preferable substituted amino acid residues include alanine, valine, leucine, and isoleucine.

本発明において、上記プロリン残基を他のアミノ酸残基に置換する方法は、特に限定されず、一般的な手法を採用することができる。具体的な方法については、実施例において説明し、ここでは、一般的な手法の一例について、その概略を説明する。   In the present invention, the method for substituting the proline residue with another amino acid residue is not particularly limited, and a general method can be adopted. A specific method will be described in Examples, and an outline of an example of a general method will be described here.

まず、マルチ銅酸化酵素の発現ベクターを鋳型として、変異導入オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、変異導入するプロリン残基を、その他のアミノ酸残基に置換した変異型マルチ銅酸化酵素の発現プラスミドを作製する。このとき、目的の変異型遺伝子領域を単離、調製する方法としては、例えば、ＰＣＲ法による遺伝子の増幅が挙げられる。
次に、この発現プラスミドを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養することで、変異型マルチ銅酸化酵素を誘導発現させる。このとき、形質転換の方法としては、ヒートショック法、エレクトロポーション法のどちらでもよい。また、形質転換体は、培養し、生育したコロニーからプラスミドを単離し、電気泳動等によって目的の変異型遺伝子が発現しているかどうかを確認する。誘導発現の方法としては、例えば、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトサイド）を誘導物質として用いる方法が挙げられる。
続いて、培養した形質転換体を集菌、破砕し、変異型マルチ銅酸化酵素を精製する。変異型マルチ銅酸化酵素を精製する方法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。 First, using a multi-copper oxidase expression vector as a template, a mutant multi-copper oxidase expression plasmid is prepared by replacing the proline residue to be mutated with other amino acid residues using a mutagenesis oligonucleotide primer. . At this time, examples of the method for isolating and preparing the target mutant gene region include gene amplification by PCR.
Next, the expression plasmid is introduced into a host cell, the host cell is transformed, and the transformant is cultured to induce and express mutant multi-copper oxidase. At this time, either a heat shock method or an electroporation method may be used as a transformation method. In addition, the transformant is cultured, a plasmid is isolated from the grown colonies, and it is confirmed whether the target mutant gene is expressed by electrophoresis or the like. Examples of the inductive expression method include a method using IPTG (isopropylthiogalactoside) as an inducer.
Subsequently, the cultured transformant is collected and crushed, and the mutant multi-copper oxidase is purified. Examples of the method for purifying the mutant multi-copper oxidase include ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography and the like.

尚、本発明において、変異型マルチ銅酸化酵素の調製方法は、上記方法に限定されるものではなく、マルチ銅酸化酵素、宿主細胞、等に応じて、その他の方法を適宜選択することができる。   In the present invention, the method for preparing the mutant multi-copper oxidase is not limited to the above-described method, and other methods can be appropriately selected depending on the multi-copper oxidase, host cells, and the like. .

［酵素電極］
本発明の酵素電極は、上記したような変異型マルチ銅酸化酵素からなる電極触媒を備えるものである。酵素電極の具体的な構造としては、電極触媒が、導電性担体の表面に担持されたものが挙げられる。 [Enzyme electrode]
The enzyme electrode of the present invention comprises an electrode catalyst composed of the above-described mutant multi-copper oxidase. As a specific structure of the enzyme electrode, a structure in which an electrode catalyst is supported on the surface of a conductive carrier can be mentioned.

導電性担体としては、酵素電極の導電性担体として一般的に使用されているものを用いることができ、例えば、グラファイト、カーボンブラック、活性炭、カーボンゲル等のカーボン多孔体、白金、金等の金属、等が挙げられる。カーボンゲルは、例えば、特開２００８−６４５１４号公報に記載の方法に準じて製造することができる。   As the conductive carrier, those generally used as the conductive carrier of the enzyme electrode can be used. For example, carbon porous bodies such as graphite, carbon black, activated carbon and carbon gel, metals such as platinum and gold , Etc. Carbon gel can be manufactured according to the method of Unexamined-Japanese-Patent No. 2008-64514, for example.

導電性担体に電極触媒を担持させる方法は特に限定されず、好ましい方法として、例えば、含浸法が挙げられる。含浸法は、まず、電極触媒である酸化酵素を、沈殿が生じない濃度（好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｍＬ）となるように水又は緩衝液に溶解させた溶液を調製する。そして、その溶液が凍結することなく、また酵素が変性することのない温度（好ましくは０〜５０℃）で、該溶液中に粉末状の担体を懸濁又はシート状の担体を浸漬し、酵素と担体を接触させる。接触時間は、５分以上が好ましく、３０分以上がさらに好ましい。
また、ポリマー等の固定剤や、含硫黄化合物等のプロモーターを用いて、電極触媒を担体表面に固定化させてもよい。 The method for supporting the electrode catalyst on the conductive carrier is not particularly limited, and a preferable method includes, for example, an impregnation method. In the impregnation method, first, a solution is prepared by dissolving oxidase, which is an electrode catalyst, in water or a buffer solution so as to have a concentration at which precipitation does not occur (preferably 0.1 to 1000 mg / mL). Then, at a temperature at which the solution does not freeze and at which the enzyme is not denatured (preferably 0 to 50 ° C.), a powdery carrier is suspended in the solution or a sheet-like carrier is immersed in the enzyme. And carrier. The contact time is preferably 5 minutes or longer, more preferably 30 minutes or longer.
Further, the electrode catalyst may be immobilized on the surface of the support using a fixing agent such as a polymer or a promoter such as a sulfur-containing compound.

尚、導電性担体がシート状である場合には、そのまま電極として用いることができる。導電性担体が粉末状である場合には、電極触媒を担持した導電性担体をさらに、シート状導電性基材に固定して使用することもできる。
また、酵素電極は、導電性担体及び電極触媒のみから構成されてもよいが、さらに、導電性担体−電極触媒間の電子の受け渡しを促進するメディエータを備えていてもよい。メディエータは、電極触媒であるマルチ銅酸化酵素に合わせて適宜選択すればよい。メディエータは、導電性担体の表面に固定化されることが好ましく、その固定方法は特に限定されるものではない。 In addition, when a conductive support is a sheet form, it can be used as an electrode as it is. When the conductive carrier is in a powder form, the conductive carrier carrying the electrode catalyst can be further used by being fixed to the sheet-like conductive substrate.
In addition, the enzyme electrode may be composed of only a conductive carrier and an electrode catalyst, but may further include a mediator that promotes the transfer of electrons between the conductive carrier and the electrode catalyst. What is necessary is just to select a mediator suitably according to the multi copper oxidase which is an electrode catalyst. The mediator is preferably immobilized on the surface of the conductive carrier, and the immobilization method is not particularly limited.

［燃料電池及びバイオセンサ］
本発明の酵素電極は、燃料電池用電極や、バイオセンサ等の電気化学ディバイスに利用することができる。
例えば、酸素の４電子還元反応に対して触媒活性を有するマルチ銅酸化酵素を備える酵素電極は、基質（電子供与体）若しくはアノード極から受け取った電子を利用して、酸素（電子受容体）を水に還元する、酸素還元電極として機能する。本発明の電極触媒は、上記したように、野生型のマルチ銅酸化酵素と比較して、タイプＩ銅の酸化還元電位を正側にシフトしているため、過電圧が小さく、発電効率に優れている。従って、本発明の電極触媒を備える酵素電極を、酸素還元電極（カソード）として用いることで、発電性能に優れた燃料電池を得ることができる。 [Fuel cells and biosensors]
The enzyme electrode of the present invention can be used for an electrochemical device such as a fuel cell electrode or a biosensor.
For example, an enzyme electrode including a multi-copper oxidase having catalytic activity for a four-electron reduction reaction of oxygen uses oxygen received from a substrate (electron donor) or an anode electrode, to convert oxygen (electron acceptor). Functions as an oxygen reduction electrode that reduces to water. As described above, the electrode catalyst of the present invention shifts the oxidation-reduction potential of type I copper to the positive side as compared with the wild-type multi-copper oxidase, so the overvoltage is small and the power generation efficiency is excellent. Yes. Therefore, a fuel cell excellent in power generation performance can be obtained by using an enzyme electrode provided with the electrode catalyst of the present invention as an oxygen reduction electrode (cathode).

このような本発明の酵素電極（酸素還元電極）と対をなす燃料極（アノード）としては、特に限定されず、例えば、酸化還元酵素がグルコース等の基質を燃料とし、酸化する酵素電極であってもよいし、或いは、白金や白金合金等の金属触媒が水素やメタノール等の燃料を酸化する電極であってもよい。燃料極において、電極触媒として酵素を用いる場合、金属触媒を用いる場合の具体的な電極構成は、特に限定されず、一般的な構成を採用することができる。   The fuel electrode (anode) paired with the enzyme electrode (oxygen reduction electrode) of the present invention is not particularly limited. For example, the enzyme electrode is an enzyme electrode in which an oxidoreductase oxidizes using a substrate such as glucose as a fuel. Alternatively, a metal catalyst such as platinum or a platinum alloy may be an electrode that oxidizes a fuel such as hydrogen or methanol. In the fuel electrode, when an enzyme is used as the electrode catalyst, a specific electrode configuration when a metal catalyst is used is not particularly limited, and a general configuration can be adopted.

また、本発明の酵素電極をバイオセンサに用いる場合、本発明の酵素電極及び対をなす電極間の電流又は電圧を検知することで、アノード電極における電子供与体の存在の有無又は濃度、或いは、カソード電極における電子受容体の存在の有無又は濃度を測定することができる。本発明の酵素電極は、上記したように、野生型のマルチ銅酸化酵素と比較してタイプＩ銅の酸化還元電位が正側にシフトした変異型マルチ銅酸化酵素を電極触媒として備えているため、測定感度に優れたバイオセンサを提供することができる。バイオセンサの具体的な構成は、特に限定されず、測定対象、測定目的に応じて、適宜決定すればよい。   When the enzyme electrode of the present invention is used for a biosensor, the presence or concentration of an electron donor in the anode electrode is detected by detecting the current or voltage between the enzyme electrode of the present invention and a pair of electrodes, or The presence or concentration of the electron acceptor in the cathode electrode can be measured. As described above, the enzyme electrode of the present invention includes, as an electrode catalyst, a mutant multi-copper oxidase in which the redox potential of type I copper is shifted to the positive side as compared with the wild-type multi-copper oxidase. A biosensor with excellent measurement sensitivity can be provided. The specific configuration of the biosensor is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the measurement target and the measurement purpose.

（１）変異型ＣｕｅＯ遺伝子の作製
CueO遺伝子の塩基配列の開始コドンの前に制限酵素EcoRI切断部位、3'末端にヒスチジンタグをコードする塩基配列と制限酵素BamHI切断部位を付加し、さらに、CueO遺伝子内部にアミノ酸置換のないサイレントな変異により制限酵素NcoI切断部位を導入した遺伝子を、クローニングベクターpUC18のEcoRI‐BamHI切断部位に挿入した組換え型CueO発現プラスミドpUCCueO'を鋳型に、PCRを用いるクイックチェンジ法により、444位のPro残基をAla、Ile、Leu残基に置換した変異型CueO発現プラスミドを増幅した。
それぞれ、P444A変異型遺伝子の増幅にはCueO_P444A(+)、CueO_P444A(-)、P444I変異型遺伝子の増幅にはCueO_P444I(+)、CueO_P444I(-)、P444L変異型遺伝子の増幅にはCueO_P444L(+)、CueO_P444L(-)のプライマーセットを使用し、以下に示すPCR反応液を用い、以下の反応サイクルで変異導入を行った。また、増幅には、ＤＮＡポリメラーゼとして、Pwo Super Yield DNA Polymerase (ロッシュ・ダイアグノスティクス社製)を使用した。
pUCCueO'中の組換え型ＣｕｅＯ遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号５に示す。尚、配列番号５の塩基配列において、５’末端側から、１〜６番目の塩基（gaattc）はＥｃｏＲＩ切断部位、７〜９番目の塩基（atg）は開始コドン、１１３０〜１１３５番目の塩基（ccatgg）はＮｃｏＩ切断部位、１５５８〜１５７５番目の塩基（catcatcatcatcatcat）はＨｉｓタグコード配列、１５７６〜１５７８番目の塩基（taa）は終止コドン、１５７９〜１５８４番目の塩基（ggatcc）はＢａｍＨＩ切断部位である。 (1) Production of mutant CueO gene
A restriction enzyme EcoRI cleavage site is added in front of the start codon of the nucleotide sequence of the CueO gene, a nucleotide sequence encoding a histidine tag and a restriction enzyme BamHI cleavage site are added to the 3 'end, and the CueO gene is silent without any amino acid substitution. Using the quick change method using PCR with the recombinant CueO expression plasmid pUCCueO 'inserted into the EcoRI-BamHI cleavage site of the cloning vector pUC18 as a template, the gene with the restriction enzyme NcoI cleavage site introduced by mutation is left in the Pro position at position 444. A mutant CueO expression plasmid in which the group was substituted with Ala, Ile and Leu residues was amplified.
CueO_P444A (+), CueO_P444A (-) for amplification of the P444A mutant gene, CueO_P444I (+), CueO_P444I (-) for amplification of the P444I mutant gene, and CueO_P444L (+) for amplification of the P444L mutant gene, respectively. Using the CueO_P444L (-) primer set, the PCR reaction solution shown below was used to introduce mutations in the following reaction cycle. For amplification, Pwo Super Yield DNA Polymerase (manufactured by Roche Diagnostics) was used as a DNA polymerase.
The base sequence of the recombinant CueO gene in pUCCueO ′ is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. In the base sequence of SEQ ID NO: 5, from the 5 ′ end, the 1st to 6th bases (gaattc) are EcoRI cleavage sites, the 7th to 9th bases (atg) are start codons, and the 1100th to 1135th bases ( ccatgg) is the NcoI cleavage site, the 1558th to 1575th bases (catcatcatcatcatcat) is the His tag coding sequence, the 1576th to 1578th bases (taa) are stop codons, and the 1579th to 1584th bases (ggatcc) are BamHI cleavage sites. .

＜合成オリゴヌクレオチドプライマー＞
CueO_P444A(+) ： 5'-cat gat gct gca tgc gtt cca tat cca cg-3'
CueO_P444A(-) ： 5'-cgt gga tat gga acg cat gca gca tca tg-3'
CueO_P444I(+) ： 5'-cat gat gct gca tat ctt cca tat cca cg-3'
CueO_P444I(-) ： 5'-cgt gga tat gga aga tat gca gca tca tg-3'
CueO_P444L(+) ： 5'-cat gat gct gca tct gtt cca tat cca cg-3'
CueO_P444L(-) ： 5'-cgt gga tat gga aca gat gca gca tca tg-3' <Synthetic oligonucleotide primer>
CueO_P444A (+): 5'-cat gat gct gca tgc gtt cca tat cca cg-3 '
CueO_P444A (-): 5'-cgt gga tat gga acg cat gca gca tca tg-3 '
CueO_P444I (+): 5'-cat gat gct gca tat ctt cca tat cca cg-3 '
CueO_P444I (-): 5'-cgt gga tat gga aga tat gca gca tca tg-3 '
CueO_P444L (+): 5'-cat gat gct gca tct gtt cca tat cca cg-3 '
CueO_P444L (-): 5'-cgt gga tat gga aca gat gca gca tca tg-3 '

＜ＰＣＲ反応液＞
Pwo Super Yield PCR buffer (×10) with MgCl₂ 5.0μl
pUCCueO'(10 ng/μl) 1.0μl
(+)、(-)プライマー(10pmol/μl) 各1.0μl
GC-RICH solution (ストラタジーン社製) 10.0μl
dNTPmix (2 mM，東洋紡社製) 5.0μl
滅菌水 26.5μl
Pwo Super Yield DNA Polymerase 0.5μl
合計 50.0μl <PCR reaction solution>
Pwo Super Yield PCR buffer (× 10) with MgCl ₂ 5.0μl
pUCCueO '(10 ng / μl) 1.0 μl
(+), (-) Primer (10 pmol/μl) 1.0μl each
GC-RICH solution (Stratagene) 10.0μl
dNTPmix (2 mM, manufactured by Toyobo) 5.0 μl
Sterile water 26.5μl
Pwo Super Yield DNA Polymerase 0.5μl
Total 50.0μl

＜反応サイクル＞
（１）95℃、60sec予熱
（２）95℃、50sec変性
（３）56℃、50secアニーリング
（４）68℃、90sec伸長
→（２）に戻る（18サイクル）
（５）68℃、7min伸長 <Reaction cycle>
(1) 95 ° C, 60 sec preheating (2) 95 ° C, 50 sec denaturation (3) 56 ° C, 50 sec annealing (4) 68 ° C, 90 sec extension → Return to (2) (18 cycles)
(5) 68 ° C, 7 min extension

上記反応終了後、下記エタノール沈殿で増幅産物を濃縮した。
（２）エタノール沈殿
50μlのサンプルに3M酢酸ナトリウム5μlとエタノール100μlを加えて混合し、−80℃で10分間静置した。その後、遠心分離を行い、上清を捨てた。ペレットに70％エタノールを500μl加え、洗浄後、再度遠心分離を行い、上清を捨てた。5分ほど減圧乾燥を行い、ペレットを20μlのTE緩衝液に溶かした。 After completion of the reaction, the amplification product was concentrated by the following ethanol precipitation.
(2) Ethanol precipitation
To 50 μl of the sample, 5 μl of 3M sodium acetate and 100 μl of ethanol were added and mixed, and allowed to stand at −80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, centrifugation was performed and the supernatant was discarded. To the pellet, 500 μl of 70% ethanol was added, washed, centrifuged again, and the supernatant was discarded. After drying under reduced pressure for about 5 minutes, the pellet was dissolved in 20 μl of TE buffer.

（３）制限酵素消化
以下の反応系で増幅断片中の鋳型DNAの制限酵素DpnI消化処理を行った。 (3) Restriction enzyme digestion A restriction enzyme DpnI digestion treatment of the template DNA in the amplified fragment was performed in the following reaction system.

＜反応液＞
PCR増幅断片 20.0μl
Tango緩衝液（x10，フェルメンタス社製） 5.0μl
DpnI(10 U/μl、フェルメンタス社製) 1.0μl
滅菌水 24.0μl
合計 50.0μl
反応液調整後、37℃で１晩消化し、エタノール沈殿および減圧乾燥を行った。 <Reaction solution>
PCR amplified fragment 20.0μl
Tango buffer (x10, manufactured by Fermentas) 5.0 μl
DpnI (10 U / μl, manufactured by Fermentas) 1.0 μl
Sterile water 24.0μl
Total 50.0μl
After preparing the reaction solution, digestion was performed overnight at 37 ° C., followed by ethanol precipitation and drying under reduced pressure.

（４）変異型CueO発現プラスミドの製造
＜形質転換＞
上記制限消化後、エタノール沈殿で得たペレットを10μlの滅菌水に溶解し、E. coli XL10-Goldコンピテントセル50μlに加え、全量をキュベット（1 mm電極ギャップ）に入れた。バイオラッド社製Micro Pulserを用いて、プログラムEC-1でエレクトロポレーションを行い、大腸菌を1 mlのLB培地に懸濁し回収した。37℃で1時間震盪した後、アンピシリンを含むLB寒天培地プレートに塗布した。プレートは37℃で1晩静置した。なお、コンピテントセルの調整はバイラッド社のインストラクションに従って行った。 (4) Production of mutant CueO expression plasmid <Transformation>
After the restriction digestion, the pellet obtained by ethanol precipitation was dissolved in 10 μl of sterilized water, added to 50 μl of E. coli XL10-Gold competent cell, and the whole amount was put in a cuvette (1 mm electrode gap). Electroporation was performed with the program EC-1 using a Micro Pulser manufactured by Bio-Rad, and Escherichia coli was suspended and collected in 1 ml of LB medium. After shaking at 37 ° C. for 1 hour, it was applied to an LB agar plate containing ampicillin. The plate was left overnight at 37 ° C. In addition, the adjustment of the competent cell was performed according to the instruction of Byrad.

＜変異型CueO発現プラスミドの確認＞
生育したコロニーから、アルカリSDS法によってプラスミドを単離し、得られたプラスミドの中に変異型遺伝子の配列を確認した。得られた3種の変異型CueO発現プラスミドをそれぞれ、pUCCueO-P444A、pUCCueO-P444I、pUCCueO-P444Lとする。
配列表の配列番号２〜４に、pUCCueO-P444Aのコードする変異型ＣｕｅＯ（配列番号２）、pUCCueO-P444Iのコードする変異型ＣｕｅＯ（配列番号３）、pUCCueO-P444Lのコードする変異型ＣｕｅＯ（配列番号４）のアミノ酸配列を示す。 <Confirmation of mutant CueO expression plasmid>
A plasmid was isolated from the grown colonies by the alkaline SDS method, and the sequence of the mutant gene was confirmed in the obtained plasmid. The resulting three mutant CueO expression plasmids are designated as pUCCueO-P444A, pUCCueO-P444I, and pUCCueO-P444L, respectively.
Mutant CueO encoded by pUCCueO-P444A (SEQ ID NO: 2), mutant CueO encoded by pUCCueO-P444I (SEQ ID NO: 3), and mutant CueO encoded by pUCCueO-P444L (SEQ ID NO: 2 to 4 in the Sequence Listing) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) is shown.

（５）変異型CueOの製造及び精製
（形質転換体の培養）
形質転換体E. coli XL10-Gold / pUCCueO-P444A (pUCCueO-P444I，pUCCueO-P444L)を以下の二段階で培養し、変異型タンパク質を発現させた。
前培養（試験管） ： 0.1mg/mlアンピシリンを含むLB培地4ml中、37℃で、一晩好気培養を行った。
本培養（2Lバッフル付三角フラスコ） ： 1mM CuCl₂、0.5mM IPTGを添加した400mlの上記培地中、32℃で、12時間好気培養を行った。
その後、遠心分離により集菌し、0.85％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、直ちに以下のオスモティックショックを行った。 (5) Production and purification of mutant CueO (culture of transformants)
Transformant E. coli XL10-Gold / pUCCueO-P444A (pUCCueO-P444I, pUCCueO-P444L) was cultured in the following two stages to express the mutant protein.
Pre-culture (test tube): Aerobic culture was performed overnight at 37 ° C. in 4 ml of LB medium containing 0.1 mg / ml ampicillin.
Main culture (conical flask with ₂ L baffle): Aerobic culture was carried out at 32 ° C. for 12 hours in 400 ml of the above medium supplemented with 1 mM CuCl ₂ and 0.5 mM IPTG.
Thereafter, the cells were collected by centrifugation, washed with 0.85% sodium chloride aqueous solution, and immediately subjected to the following osmotic shock.

（変異型タンパク質の採取及び精製）
＜オスモティックショック＞
菌体を氷冷した20％ショ糖、100mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）、10mM EDTA溶液に懸濁し、氷水中で10分間静置後、遠心分離により菌体を回収した。次に、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷蒸留水に懸濁し、氷水中で10分間静置後、遠心分離により上清を回収した。得られた上清を、さらに90,000×ｇ、30分間超遠心分離に供し、その上清を粗酵素液とした。 (Collecting and purifying mutant proteins)
<Osmotic shock>
The cells were suspended in ice-cooled 20% sucrose, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 10 mM EDTA solution, allowed to stand in ice water for 10 minutes, and then collected by centrifugation. Next, the suspension was suspended in ice-cold distilled water containing a protease inhibitor, allowed to stand in ice water for 10 minutes, and the supernatant was collected by centrifugation. The obtained supernatant was further subjected to ultracentrifugation at 90,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was used as a crude enzyme solution.

＜IMAC（金属アフィニティークロマトグラフィー）＞
300 mM NaClを含む50 mM Tris-H₂SO₄ 緩衝液 (pH 8.0)で平衡化したNi-NTA agarose カラム(20 ml)に粗酵素液を重層し、20 mMイミダゾールを含む50 mM Tris-H₂SO₄ 緩衝液 (pH 8.0) 300 mlでカラムを洗浄した。その後、200 mMイミダゾールを含む50 mM Tris-H₂SO₄緩衝液 (pH 8.0)で吸着したタンパク質を溶出させた。溶出画分を回収・濃縮し、100 mM リン酸緩衝液 (pH 6.0)で透析して精製標品とした。 <IMAC (Metal Affinity Chromatography)>
The crude enzyme solution was layered on a Ni-NTA agarose column (20 ml) equilibrated with 50 mM Tris-H ₂ SO ₄ buffer (pH 8.0) containing 300 mM NaCl, and 50 mM Tris-H containing 20 mM imidazole. _The column was washed with 300 ml of ₂ SO ₄ buffer (pH 8.0). Thereafter, the adsorbed protein was eluted with 50 mM Tris-H ₂ SO ₄ buffer (pH 8.0) containing 200 mM imidazole. The eluted fraction was collected and concentrated, and dialyzed against 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) to obtain a purified sample.

（６）発色基質ABTS（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)に対する変異型CueOの活性評価
キュベット中で100 mM酢酸緩衝液 (pH 5.5) 0.89 mlと、60 mM ABTS水溶液0.1 mlとを混合し、変異型CueO水溶液10μlを加えて倒立混合し、分光光度計（JASCO U-560，日本分光）を用いて、０〜３０秒後までの420 nmにおける吸光度の変化を測定した。ABTSの420 nmにおけるモル吸光係数ε₄₂₀ = 36,000を用いて，活性値を算出した。活性の単位（U）は、1分間に1μmolのABTSを酸化する酵素量とした。
＜結果＞
各変異型CueOのABTS酸化反応の比活性（タンパク質1 mg当たりの活性値）は、それぞれ、P444Aが5.1 U/mg、P444Iが5.3 U/mg、P444Lが5.2 U/mgであり、野生型CueOの0.45 U/mgと比較し、約10倍の活性化が確認された。 (6) Activity evaluation of mutant CueO against chromogenic substrate ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), 100 mM acetate buffer (pH 5.5) 0.89 ml and 60 mM in cuvette Mix with 0.1 ml of ABTS aqueous solution, add 10 μl of mutant CueO aqueous solution, invert and mix, and change absorbance at 420 nm from 0 to 30 seconds using spectrophotometer (JASCO U-560, JASCO) The activity value was calculated using the molar extinction coefficient ε ₄₂₀ = 36,000 of ABTS at 420 nm, and the unit of activity (U) was the amount of enzyme that oxidizes 1 μmol of ABTS per minute.
<Result>
The specific activity (activity value per 1 mg of protein) of ABTS oxidation reaction of each mutant CueO is 5.1 U / mg for P444A, 5.3 U / mg for P444I, and 5.2 U / mg for P444L, respectively. Compared with 0.45 U / mg, activation of about 10 times was confirmed.

（７）変異型CueOの電気化学的特性評価
＜カーボンゲルの作製＞
レゾルシノール5.5g及び炭酸ナトリウム26.5mgを蒸留水16.9gに溶解させ、その後37％ホルムアルデヒド溶液8.1gを加えて撹拌混合した。なお、各成分のモル比は、レゾルシノール：炭酸ナトリウム：ホルムアルデヒド＝200：1：400である。
次に、得られた原液に水を加えて、体積比で2倍に希釈した。希釈した溶液をバイアル瓶に入れて密栓し、室温で24時間、さらに90℃で72時間静置し、水和された有機ゲルを得た。
次に、有機ゲル中の水分を除去するために、交換溶媒であるアセトン中に有機ゲルを浸漬した。水分の拡散が飽和したところで、アセトンを交換する操作を数回繰り返し、ゲル中の水分を完全にアセトンに置換した。次いで、浸漬溶媒をn−ペンタンに変更し、有機ゲル中のアセトンがn−ペンタンに完全に入れ替わるまで、溶媒交換−浸漬を繰り返した。さらに、n−ペンタンに溶媒置換された有機ゲルを風乾させ、乾燥有機ゲルを得た。
得られた乾燥有機ゲルを窒素気流下（流量300ml/min）、1000℃で6時間加熱し、有機ゲルを炭化させた。 (7) Electrochemical characterization of mutant CueO <Preparation of carbon gel>
Resorcinol 5.5 g and sodium carbonate 26.5 mg were dissolved in distilled water 16.9 g, and then 37% formaldehyde solution 8.1 g was added and stirred. In addition, the molar ratio of each component is resorcinol: sodium carbonate: formaldehyde = 200: 1: 400.
Next, water was added to the obtained stock solution to dilute it twice by volume. The diluted solution was put in a vial and sealed, and allowed to stand at room temperature for 24 hours and further at 90 ° C. for 72 hours to obtain a hydrated organic gel.
Next, in order to remove moisture in the organic gel, the organic gel was immersed in acetone as an exchange solvent. When the diffusion of moisture was saturated, the operation of exchanging acetone was repeated several times to completely replace the moisture in the gel with acetone. Next, the immersion solvent was changed to n-pentane, and the solvent exchange-immersion was repeated until the acetone in the organic gel was completely replaced with n-pentane. Furthermore, the organic gel solvent-substituted with n-pentane was air-dried to obtain a dried organic gel.
The obtained dried organic gel was heated at 1000 ° C. for 6 hours under a nitrogen stream (flow rate: 300 ml / min) to carbonize the organic gel.

＜酵素電極の作製＞
約0.35％PVDF(Polyvinylidine Difuluoride)を含有するNMP(N-Methyl-pyrrolidone)溶液160μlに、5mgのカーボンゲルを懸濁したスラリーを調整し、直径6mmのグラッシーカーボン電極（BAS社製、型番:002021）表面に上記スラリーを1.5μl添加してカーボン担体を電極表面にコートした。得られたカーボン修飾電極をCueO変異体水溶液(20μg/ml)に浸漬することにより、酵素をカーボン修飾電極に固定化した。 <Production of enzyme electrode>
A slurry in which 5 mg of carbon gel is suspended in 160 μl of NMP (N-Methyl-pyrrolidone) solution containing about 0.35% PVDF (Polyvinylidine Difuluoride) is prepared, and a glassy carbon electrode with a diameter of 6 mm (made by BAS, model number: 002021) ) 1.5 μl of the slurry was added to the surface, and the carbon support was coated on the electrode surface. The obtained carbon-modified electrode was immersed in a CueO mutant aqueous solution (20 μg / ml) to immobilize the enzyme on the carbon-modified electrode.

＜試験方法＞
得られた酵素電極を作用電極として、サイクリックボルタムグラム法（電位：0〜700mVの間で電流掃引、電流掃引速度:20mVsec^-1もしくは5mVsec^-1、回転電極:3000rpm）により電極の電気特性を評価した。対極には、白金を用い、参照極には、銀／塩化銀電極を用いた。電解質には、硫酸カリウムでイオン強度を0.3に調整し、酸素を飽和させた、0.1M McIlvaine緩衝液(pH5.0)を用いた。 <Test method>
The resulting enzyme electrode as a working electrode, cyclic voltammogram method (potential: the current sweep between 0～700MV, current sweep rate: 20MVsec ^-1 or 5 mVsec ^-1, rotating electrode: 3000 rpm) by the electrical properties of the electrode Evaluated. Platinum was used for the counter electrode, and a silver / silver chloride electrode was used for the reference electrode. As the electrolyte, 0.1 M McIlvaine buffer (pH 5.0) in which ionic strength was adjusted to 0.3 with potassium sulfate and oxygen was saturated was used.

＜結果＞
図３にサイクリックボルタムグラムを示す。図３より、P444A、P444I、P444Lいずれの変異体を用いた酵素電極も、野生型CueOを用いた場合に比べ、-0.1mAcm^-2における酸素還元電流の立上がり電位が約50〜100mV正側にシフトすることを確認した。 <Result>
FIG. 3 shows a cyclic voltagram. From FIG. 3, the enzyme electrode using any of the mutants P444A, P444I, and P444L has a rising potential of the oxygen reduction current at −0.1 mAcm ^{−2 on} the positive side of about 50 to 100 mV compared to the case of using wild type CueO. Confirmed to shift.

Claims (7)

少なくとも、タイプＩ銅１個、タイプII銅１個及びタイプIII銅２個を有する、マルチ銅酸化酵素からなる電極触媒であって、
少なくとも１つのシステイン残基及び２つのヒスチジン残基が、前記タイプＩ銅に配位しており、
前記２つのヒスチジン残基のうちリガンドループを形成していないヒスチジン残基の下流側に隣接するプロリン残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、グリシン残基、及びメチオニン残基よりなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸残基で置換され、置換アミノ酸残基のアミドプロトンとタイプＩ銅配位システイン残基の硫黄原子との間に水素結合を有することを特徴とする電極触媒。 At least one type I copper, type II copper having one and type III copper two, an electrode catalyst comprising a multi-copper oxidase,
At least one cysteine residue and two histidine residues are coordinated to the type I copper ;
Among the two histidine residues, a proline residue adjacent to the downstream side of the histidine residue that does not form a ligand loop is an alanine residue, a valine residue, a leucine residue, an isoleucine residue, a glycine residue, and It is substituted with any amino acid residue selected from the group consisting of methionine residues, and has a hydrogen bond between the amide proton of the substituted amino acid residue and the sulfur atom of the type I copper coordinated cysteine residue Electrode catalyst. 前記アミノ酸残基が、アラニン残基、ロイシン残基、及びイソロイシン残基よりなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の電極触媒。 The electrocatalyst according to claim 1, wherein the amino acid residue is at least one selected from the group consisting of an alanine residue, a leucine residue, and an isoleucine residue . 前記マルチ銅酸化酵素が、ＣｕｅＯ、ＭｖＢＯ、ＲｖＬｃ、ＣｐＡＯ、ＴｖＬｃ、ＣｃＬｃ、Ｆｅｔ３ｐ、ＣｕｍＡ、及びＣｏｔＡよりなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の電極触媒。 The electrode catalyst according to claim 1 or 2, wherein the multi-copper oxidase is at least one selected from the group consisting of CueO, MvBO, RvLc, CpAO, TvLc, CcLc, Fet3p, CumA, and CotA . 前記マルチ銅酸化酵素がＣｕｅＯであって、配列番号：１（オープンリーディングフレーム）に示されるアミノ酸配列において、４４４番のプロリン残基が、前記アミノ酸残基で置換された、請求項３に記載の電極触媒。   The multi-copper oxidase is CueO, and in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (open reading frame), a proline residue at position 444 is substituted with the amino acid residue. Electrocatalyst. 請求項１乃至４のいずれかに記載の前記電極触媒を備えることを特徴とする、酵素電極。   An enzyme electrode comprising the electrode catalyst according to any one of claims 1 to 4. 請求項５に記載の酵素電極を酸化剤極として備える、燃料電池。   A fuel cell comprising the enzyme electrode according to claim 5 as an oxidant electrode. 請求項５に記載の酵素電極を備える、バイオセンサ。   A biosensor comprising the enzyme electrode according to claim 5.