JP5442310B2 - Method for preparing thrombin solution - Google Patents
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Description
本発明は、トロンビン溶液の調製方法に係り、より詳細には、血液を原料とするトロンビン溶液の調製方法に関する。 The present invention relates to a method for preparing a thrombin solution, and more particularly to a method for preparing a thrombin solution using blood as a raw material.
トロンビンは血液凝固因子の一つであり、可溶性のフィブリノーゲンに作用して不溶性のフィブリンを生成する、セリンプロテアーゼである。医療現場において、トロンビンとフィブリノーゲンとを混合して使用される生体組織接着剤フィブリン糊は、組織の接着・閉鎖、及びそれに続く創傷治癒を行うための外用接着剤あるいは止血剤として、現在各種の外科手術に広く用いられている。また、トロンビンと多血小板血漿（ＰＲＰ）とを混合して使用される血小板ゲルは、創傷治癒に用いられ、単独で止血剤として用いられる。近年、各種外科手術において、手術直前又は手術中に患者の血液から自己由来のトロンビンを短時間で調製するニーズが高まっている。 Thrombin is a blood coagulation factor and is a serine protease that acts on soluble fibrinogen to produce insoluble fibrin. Biological tissue adhesive fibrin glue, which is a mixture of thrombin and fibrinogen in medical settings, is currently used in various surgical applications as an external adhesive or hemostatic agent for tissue adhesion / closure and subsequent wound healing. Widely used in surgery. Further, platelet gel used by mixing thrombin and platelet-rich plasma (PRP) is used for wound healing and is used alone as a hemostatic agent. In recent years, in various surgical operations, there is an increasing need to prepare autologous thrombin from a patient's blood immediately before or during the operation.
トロンビンの調製方法として、特許文献１には、血漿からエタノールによってトロンビンを回収する方法が開示されている。特許文献２には、血漿からプロトロンビンをアニオン交換体へ吸着させ、アニオン交換体からプロトロンビンを溶離する際に、溶離液として塩化カルシウムを用いることにより、同時にトロンビンへの活性化を行い、トロンビンとして回収する方法が開示されている。この方法によれば、比較的トロンビン活性値が高いトロンビンを精製することができる。また、特許文献３には、プロトロンビンを精製する目的で、血漿中のプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させ、アニオン交換体からプロトロンビンを溶出する際に、緩衝液中で塩化カルシウム濃度勾配を直線的に負荷することによりプロトロンビンを溶出する方法が開示されている。更に特許文献４には、活性化剤と吸収剤とを備えた反応室、又は陰イオン性分子排除イオン交換樹脂を供えた反応室に、全血、血漿又は血漿分画を導入し、トロンビン又は他の血液生成物を製剤する装置が開示されている。 As a method for preparing thrombin, Patent Document 1 discloses a method for recovering thrombin from plasma with ethanol. In Patent Document 2, prothrombin is adsorbed from plasma to an anion exchanger, and when thrombin is eluted from the anion exchanger, calcium chloride is used as an eluent to simultaneously activate thrombin and collect it as thrombin. A method is disclosed. According to this method, thrombin having a relatively high thrombin activity value can be purified. In Patent Document 3, for the purpose of purifying prothrombin, when prothrombin in plasma is adsorbed on an anion exchanger and prothrombin is eluted from the anion exchanger, a calcium chloride concentration gradient is linearly added in a buffer solution. A method for eluting prothrombin by loading is disclosed. Further, Patent Document 4 introduces whole blood, plasma, or a plasma fraction into a reaction chamber provided with an activator and an absorbent, or a reaction chamber provided with an anionic molecular exclusion ion exchange resin. An apparatus for formulating other blood products is disclosed.
しかし、特許文献１の方法で得られるトロンビンは、トロンビン活性値が低く、フィブリノーゲンを凝固させるために要する時間が長い。そのため、トロンビン投与直後に急速にフィブリノーゲンを凝固させたい場合には不向きであるという問題点がある。特許文献２及び３の方法は、いずれも血漿又は血漿分画からトロンビンを調製する方法であり、血液から直接トロンビンを調製することができない。そのため、まず血液から血漿を調製する繁雑な操作が必要であると同時に、時間を要するという問題がある。更に、特許文献３の方法は、濃度勾配をかけながら溶出液を分画してプロトロンビンのピークを得る方法であるが、そのピークを選別する必要があり、また液量が増えるので、溶液のトロンビン活性値を高く維持することが困難であるという問題がある。 However, thrombin obtained by the method of Patent Document 1 has a low thrombin activity value and takes a long time to coagulate fibrinogen. Therefore, there is a problem that it is not suitable for rapidly coagulating fibrinogen immediately after thrombin administration. The methods of Patent Documents 2 and 3 are both methods for preparing thrombin from plasma or a plasma fraction, and thrombin cannot be prepared directly from blood. For this reason, there is a problem that a complicated operation for preparing plasma from blood is required, and at the same time it takes time. Further, the method of Patent Document 3 is a method of obtaining a prothrombin peak by fractionating the eluate while applying a concentration gradient, but it is necessary to select the peak and the amount of the liquid increases, so that the thrombin of the solution increases. There is a problem that it is difficult to keep the activity value high.
特許文献４には、全血から吸収剤又は陰イオン性分子排除イオン交換樹脂により水分を除去する方法が記載されているが、水分除去量を少なく設定する場合、トロンビン濃縮率が低下し、トロンビン活性値を高めることはできないという問題がある。また、トロンビン濃縮率を上げるために水分除去量を上げると、トロンビン溶液の液体量に対する血球量の割合が増し、フィルター濾過が困難になるという問題が生じる。この場合、血球とトロンビンの分離操作が必要となるが、特許文献４にはこの分離操作に着目した検討がなされていない。また、この方法では、トロンビンの血液凝固反応を阻害する成分が残存する可能性を否定できないため、トロンビン活性の保存安定性が問題となる。 Patent Document 4 describes a method of removing water from whole blood with an absorbent or an anionic molecular exclusion ion exchange resin. However, when the water removal amount is set to be small, the thrombin concentration rate decreases, and thrombin is reduced. There is a problem that the activity value cannot be increased. Further, if the water removal amount is increased in order to increase the thrombin concentration rate, the ratio of the blood cell amount to the liquid amount of the thrombin solution increases, which causes a problem that filter filtration becomes difficult. In this case, a blood cell and thrombin separation operation is required. However, Patent Document 4 does not make a study focusing on this separation operation. Moreover, in this method, since the possibility that the component which inhibits the blood coagulation reaction of thrombin remains cannot be denied, the storage stability of thrombin activity becomes a problem.
以上の説明から明らかなように、血液から血漿への繁雑な分離操作を必要とせず、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液を血液から直接調製する方法が、これまで確立されていない。本発明の課題は、上記従来技術の問題点に鑑み、高いトロンビン活性値を有し、ゲル化しないトロンビン溶液を血液から直接かつ簡便に調製する方法を提供することである。 As is apparent from the above description, a method for directly preparing a thrombin solution having a high thrombin activity value from blood without requiring a complicated separation operation from blood to plasma has not been established so far. An object of the present invention is to provide a method for easily and directly preparing a thrombin solution having a high thrombin activity value and having no high gelation from blood in view of the above-mentioned problems of the prior art.
上記課題を解決するため、本発明者は、アニオン交換体に吸着させたプロトロンビンをトロンビンへ活性化し、かつアニオン交換体からトロンビンを溶出する溶離液のカルシウムイオン濃度とイオン強度とに着目して、鋭意検討を重ねた。その結果、アニオン交換体を用いたトロンビンの調製方法において、特定の範囲のカルシウムイオン濃度とイオン強度とを持つ溶離液を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の態様は以下を含む。
（１）アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させた後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法。
（２）溶離液とアニオン交換体との接触時間が２分以上１０分以下である、（１）に記載のトロンビン溶液の調製方法。
（３）アニオン交換体がジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換体である、（１）又は（２）に記載のトロンビン溶液の調製方法。
（４）溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、アニオン交換体を等張液で洗浄する、（１）乃至（３）の何れかに記載のトロンビン溶液の調製方法。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors focused on the calcium ion concentration and ionic strength of the eluent that activates prothrombin adsorbed on the anion exchanger to thrombin and elutes thrombin from the anion exchanger, We studied earnestly. As a result, in the method for preparing thrombin using an anion exchanger, it has been found that the above problems can be solved by using an eluent having a calcium ion concentration and ionic strength within a specific range, and the present invention has been completed. It was. That is, the aspect of this invention contains the following.
(1) A method for preparing a thrombin solution using an anion exchanger, wherein blood is brought into contact with the anion exchanger, and after the prothrombin contained in the blood is adsorbed to the anion exchanger, 5 mmol / L to 50 mmol / L A method for preparing a thrombin solution, wherein a thrombin solution containing no calcium ion is brought into contact with an anion exchanger and an eluent having an ionic strength of 0.17 mol / L or more and 0.46 mol / L or less is obtained.
(2) The method for preparing a thrombin solution according to (1), wherein the contact time between the eluent and the anion exchanger is 2 minutes or more and 10 minutes or less.
(3) The method for preparing a thrombin solution according to (1) or (2), wherein the anion exchanger is an anion exchanger having a diethylaminoethyl group.
(4) The method for preparing a thrombin solution according to any one of (1) to (3), wherein the anion exchanger is washed with an isotonic solution before the eluent is brought into contact with the anion exchanger.
本発明によれば、血液を直接原料として、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液を簡便に調製できる。またゲル化しない液体であるトロンビン溶液を調製できる。更には、従来技術と比較し、短時間にトロンビン溶液を調製することができる。また得られたトロンビン溶液は高い保存安定性を有している。 According to the present invention, a thrombin solution having a high thrombin activity value can be easily prepared using blood as a direct raw material. Moreover, the thrombin solution which is a liquid which does not gel can be prepared. Furthermore, a thrombin solution can be prepared in a short time compared with the prior art. Moreover, the obtained thrombin solution has high storage stability.
以下、本発明の実施の形態（以下、本実施の形態という。）を更に詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。本実施の形態は、血液を直接原料とし、アニオン交換体を用いて、ゲル化しないトロンビン溶液を調製する方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させることと、その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得ることと、を含む。 Hereinafter, an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as the present embodiment) will be described in more detail. In addition, this invention is not limited to the following embodiment, It can implement by changing variously within the range of the summary. The present embodiment is a method for preparing a thrombin solution that does not gel using blood as a direct raw material and using an anion exchanger, wherein the blood is brought into contact with the anion exchanger, and prothrombin contained in the blood is anion-exchanged. Adsorbing to the body, and then bringing the eluent containing 5 to 50 mmol / L of calcium ions and having an ionic strength of 0.17 to 0.46 mol / L into contact with the anion exchanger. Obtaining a thrombin solution that does not gel.
本実施の形態に係るトロンビン溶液を調製する方法においては、まず、血液をアニオン交換体に接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させる。本実施の形態でいうアニオン交換体とは、アニオン交換基が化学的に結合された多孔材を意味する。アニオン交換基としては、水中でプラスに荷電する官能基であればよく、例えば、強塩基性のトリメチルアンモニウム基や、弱塩基性のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が使用可能である。また、ここでいう多孔材とは、液体が浸入可能な細孔を有する部材を意味し、例えば、球状のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの樹脂、球状のセルロース、また、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロースなどのゲル、ポリエステル、ポリプロピレン、セルロースなどの不織布、あるいはその他の多孔性膜や焼結体などが使用可能である。この中でも、球状のセルロースは、タンパク質など生体高分子の分画、精製に広く使用されており、好適に使用できる。あるいは、細孔のないビーズや繊維状のイオン交換体をカラムに充填し、実質的に多孔性のアニオン交換体を形成したものも使用することもできる。 In the method for preparing a thrombin solution according to the present embodiment, blood is first brought into contact with an anion exchanger, and prothrombin contained in the blood is adsorbed onto the anion exchanger. The anion exchanger referred to in the present embodiment means a porous material in which anion exchange groups are chemically bonded. The anion exchange group may be any functional group that is positively charged in water. For example, a strongly basic trimethylammonium group or a weakly basic diethylaminoethyl (DEAE) group can be used. The porous material here means a member having pores into which a liquid can enter, for example, a resin such as a spherical styrene-divinylbenzene copolymer, spherical cellulose, polyacrylamide, dextran, Gels such as agarose, non-woven fabrics such as polyester, polypropylene, and cellulose, or other porous films and sintered bodies can be used. Among these, spherical cellulose is widely used for fractionation and purification of biopolymers such as proteins, and can be suitably used. Alternatively, it is also possible to use a material in which a column is filled with beads without pores or a fibrous ion exchanger to form a substantially porous anion exchanger.
本実施の形態でいう血液とは、赤血球を含む末梢血であり、採血したままのものであっても、抗凝固剤、生理食塩液などで希釈されたものであってもよい。トロンビン溶液調製中の血液凝固を防ぐために、抗凝固剤で希釈された血液を好適に使用することができる。抗凝固剤の種類は、クエン酸又はその塩からなる群の他、フサン、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などを使用することができるが、クエン酸又はその塩からなる群を好適に使用することができる。クエン酸又はその塩からなる群としては、例えば、クエン酸ナトリウム溶液、ＡＣＤ(ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ)−Ａ液、ＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）液などが使用可能である。ＡＣＤ−Ａ液とは、クエン酸ナトリウム、クエン酸、及びブドウ糖からなる溶液であり、ＣＰＤ液はクエン酸ナトリウム、クエン酸、ブドウ糖、及びリン酸二水素ナトリウム二水和物からなる溶液である。また、冷蔵保存あるいは室温保存された血液を使用する場合は、白血球除去フィルターによって白血球を除去された血液を用いてもよい。 The blood referred to in the present embodiment is peripheral blood containing red blood cells, which may be collected as it is or may be diluted with an anticoagulant, physiological saline or the like. In order to prevent blood coagulation during preparation of the thrombin solution, blood diluted with an anticoagulant can be preferably used. As the type of anticoagulant, fusan, heparin, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and the like can be used in addition to the group consisting of citric acid or a salt thereof, but the group consisting of citric acid or a salt thereof is preferably used. be able to. As a group consisting of citric acid or a salt thereof, for example, a sodium citrate solution, an ACD (acid-citrate-dextrose) -A solution, a CPD (citrate-phosphate-dextrose) solution and the like can be used. The ACD-A solution is a solution composed of sodium citrate, citric acid, and glucose, and the CPD solution is a solution composed of sodium citrate, citric acid, glucose, and sodium dihydrogen phosphate dihydrate. In addition, when blood stored in a refrigerator or at room temperature is used, the blood from which leukocytes have been removed by a leukocyte removal filter may be used.
血液とアニオン交換体との接触は、例えば、カラムに充填したアニオン交換体に血液をポンプ又は落差により通過させてなされてもよいし、血液全量とアニオン交換体とを容器に入れ、混和してなされてもよいが、全血液中のプロトロンビンを効率よくアニオン交換体と接触させる観点から、先述の接触がより好ましい。本実施の形態によれば、例えば遠心分離などにより血液から血漿を分離する操作を行うことなく、直接血液をアニオン交換体へ接触させ、以下に記載の操作によりトロンビン溶液を調製することができる。そのため、遠心分離などの繁雑な操作が不要となり、またトロンビン溶液の調製時間を短くすることが可能となる。 The contact between the blood and the anion exchanger may be performed, for example, by passing the blood through the anion exchanger packed in the column by a pump or a drop, or the whole blood and the anion exchanger are put in a container and mixed. The contact described above is more preferable from the viewpoint of efficiently bringing prothrombin in whole blood into contact with the anion exchanger. According to the present embodiment, for example, without performing an operation of separating plasma from blood by centrifugation or the like, the blood can be directly brought into contact with the anion exchanger, and a thrombin solution can be prepared by the operation described below. Therefore, complicated operations such as centrifugation are unnecessary, and the preparation time of the thrombin solution can be shortened.
次に、プロトロンビンを吸着させたアニオン交換体に溶離液を接触させる。溶離液によりアニオン交換体に吸着したプロトロンビンがトロンビンへ活性化され、溶離液中へ溶出し、トロンビン溶液を調製することができる。本実施の形態でいう溶離液とは、アニオン交換体に吸着したプロトロンビンをトロンビンに活性化し、溶離液中へ溶出させ、トロンビン溶液として回収する溶液である。本実施の形態において、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液を用いることで、ゲル化しないトロンビン溶液を直接血液から調製できる。 Next, the eluent is brought into contact with the anion exchanger having adsorbed prothrombin. Prothrombin adsorbed on the anion exchanger by the eluent is activated to thrombin and eluted into the eluent to prepare a thrombin solution. The eluent used in the present embodiment is a solution in which prothrombin adsorbed on the anion exchanger is activated to thrombin, eluted into the eluent, and recovered as a thrombin solution. In this embodiment, a thrombin solution that does not gel by using an eluent containing calcium ions of 5 mmol / L or more and 50 mmol / L or less and having an ionic strength of 0.17 mol / L or more and 0.46 mol / L or less. Can be prepared directly from blood.
ここで、「イオン強度」とは、溶液における種々のイオンの電気的（イオン−イオン）相互作用の強さを表す値である。溶液中のイオン種ｉの電荷数をｚi、そのモル濃度をｃiとすると、イオン強度は次式（１）で定義される。
アニオン交換体を用いて血液からトロンビン溶液を調製する方法において、本発明者が検討を進めたところ、溶離液のカルシウムイオン濃度とイオン強度とが、得られるトロンビン溶液のトロンビン活性値とゲル化の有無とに影響する重要因子であることをつきとめた。すなわち、カルシウムイオン濃度とイオン強度とを調整した溶離液を用いることにより、アニオン交換体を用いて血液からゲル化しない、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液の作製が可能となると同時に、短い時間でのトロンビン溶液の調製が可能となることを見出し、本発明を完成するに至ったのである。 In the method of preparing a thrombin solution from blood using an anion exchanger, the present inventors proceeded with investigations. As a result, the calcium ion concentration and ionic strength of the eluent were determined by the thrombin activity value and gelation of the resulting thrombin solution. It was found that this is an important factor affecting the presence or absence. That is, by using an eluent with adjusted calcium ion concentration and ionic strength, it becomes possible to produce a thrombin solution having a high thrombin activity value that does not gel from blood using an anion exchanger, and at the same time, in a short time. The present inventors have found that a thrombin solution can be prepared, and have completed the present invention.
溶離液のカルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ない場合、又はイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低い場合は、アニオン交換体へ吸着したプロトロンビン由来のトロンビンの収率が低くなり、プロトロンビンを有効に活用できなくなり、トロンビン溶液のトロンビン活性値が低下する。カルシウムイオンは、プロトロンビンをトロンビンへ活性化する活性化剤として作用し、またイオン強度は、カルシウムイオンと相互作用してプロトロンビンからトロンビンへの活性化及び／又はトロンビンの溶離液への溶出を促進するが、カルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ないと、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上としても、得られるトロンビン溶液のトロンビン活性値が有効に上がらない。また、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低いと、カルシウムイオンを５ｍｍｏｌ／Ｌ以上含んでいても、プロトロンビンからトロンビンへの活性化に時間を要し、アニオン交換体と溶離液との接触時間を１時間以上としても、十分なトロンビン活性値が得られない。 When the calcium ion in the eluent is less than 5 mmol / L, or when the ionic strength is lower than 0.17 mol / L, the yield of thrombin derived from prothrombin adsorbed on the anion exchanger is lowered, and prothrombin can be effectively utilized. The thrombin activity value of the thrombin solution decreases. Calcium ions act as activators that activate prothrombin to thrombin, and ionic strength interacts with calcium ions to promote activation of prothrombin to thrombin and / or elution of thrombin into the eluent. However, if the calcium ion is less than 5 mmol / L, the thrombin activity value of the thrombin solution obtained does not increase effectively even if the ionic strength is 0.17 mol / L or more. Moreover, when the ionic strength is lower than 0.17 mol / L, it takes time to activate prothrombin to thrombin even if calcium ions are contained in an amount of 5 mmol / L or more, and the contact time between the anion exchanger and the eluent is reduced. Even if it is 1 hour or more, a sufficient thrombin activity value cannot be obtained.
また、カルシウムイオンが５０ｍｍｏｌ／Ｌより多い、又はイオン強度が０．４６ｍｏｌ／Ｌより高い場合は、得られるトロンビン溶液がゲル化し、液体として使用することができない。ゲル化する理由は定かではないが、５０ｍｍｏｌ／Ｌより多いカルシウムイオンや０．４６ｍｏｌ／Ｌより大きいイオン強度の環境は、プロトロンビンやトロンビンどうし、又はトロンビンを含む溶出される混在タンパク質どうしが影響し合い、トロンビン溶液を凝集又は変性させると考えられる。 Moreover, when there are more calcium ions than 50 mmol / L or ionic strength is higher than 0.46 mol / L, the obtained thrombin solution gels and cannot be used as a liquid. The reason for gelation is not clear, but the environment of calcium ions greater than 50 mmol / L and ionic strength greater than 0.46 mol / L is influenced by prothrombin, thrombin, or mixed proteins that contain thrombin. The thrombin solution is considered to aggregate or denature.
なお、トロンビン活性値は、フィブリノーゲンを凝固させる時間を測定する凝固時間法や、発色性合成基質を分解し、遊離する発色物質の吸光度を測定する合成基質法によって測定可能である。また、トロンビン溶液のゲル化とは、トロンビン溶液の全体又は一部がゼリー状に固化することである。トロンビン溶液全体がゲル化すると、トロンビン溶液は実質使用できなくなる。トロンビン溶液のゲル化が一部であっても、回収できる液量が減少し、回収できた溶液も不安定であって、時間とともにゲル化する可能性があるので好ましくない。 The thrombin activity value can be measured by a coagulation time method for measuring the time for coagulation of fibrinogen or a synthetic substrate method for measuring the absorbance of the chromogenic substance that decomposes and releases the chromogenic synthetic substrate. The gelation of the thrombin solution means that the whole or part of the thrombin solution is solidified in a jelly form. If the entire thrombin solution gels, the thrombin solution becomes virtually unusable. Even if the thrombin solution is partially gelled, the amount of liquid that can be collected is reduced, and the solution that can be collected is unstable and may gel with time, which is not preferable.
以上の理由から、本実施の形態に係るアニオン交換体を用いて血液からトロンビン溶液を調製する方法において、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液が用いられる。カルシウムイオン濃度とイオン強度の範囲は、より好ましくはカルシウムイオン濃度が１０乃至４０ｍｍｏｌ／Ｌ、且つイオン強度が０．２１乃至０．３２ｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくはカルシウムイオン濃度が２０乃至３０ｍｍｏｌ／Ｌ、且つイオン強度が０．２４乃至０．２９ｍｏｌ／Ｌである。 For the above reasons, in the method for preparing a thrombin solution from blood using the anion exchanger according to the present embodiment, it contains 5 mmol / L or more and 50 mmol / L or less calcium ions and has an ionic strength of 0.17 mol / L. An eluent having a concentration of 0.46 mol / L or less is used. The range of the calcium ion concentration and the ionic strength is more preferably a calcium ion concentration of 10 to 40 mmol / L and an ionic strength of 0.21 to 0.32 mol / L, and still more preferably a calcium ion concentration of 20 to 30 mmol / L. L and the ionic strength is 0.24 to 0.29 mol / L.
カルシウム塩としては、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、及び酢酸カルシウムなどを使用することができるが、塩化カルシウムを好適に使用することができる。また、カルシウム塩以外の溶離液の成分としては、プロトロンビンの活性化及びトロンビン活性を阻害するもの以外ならば何でもよい。塩化ナトリウムは生理食塩液に使用される成分であり、一般的にタンパク質の溶解度が高いことが知られており、好適に使用することができる。 As the calcium salt, calcium chloride, calcium hydroxide, calcium acetate, and the like can be used, and calcium chloride can be preferably used. The eluent components other than the calcium salt may be anything other than those that inhibit the activation of thrombin and the activity of prothrombin. Sodium chloride is a component used in physiological saline, and is generally known to have high protein solubility, and can be suitably used.
トロンビン溶液のトロンビン活性値は、用いる血液の液量と溶離液の液量とで調整できる。血液の液量が多いほどアニオン交換体に吸着するプロトロンビン量が増え、得られるトロンビンの量が増える。溶離液の液量は、アニオン交換体全体に行き渡る液量以上であることが好ましく、溶離液の液量を増やしても、トロンビン溶液全体を回収すれば、トロンビンの収量は変化しない。ただし、溶離液の液量が少ない程トロンビンの濃度が増し、トロンビン活性値が高くなる。トロンビン溶液を希釈しトロンビン活性値を低くしたい場合は、溶離液の液量を増してもよいし、回収後に希釈して液量を増してもよい。 The thrombin activity value of the thrombin solution can be adjusted by the amount of blood used and the amount of eluent. As the amount of blood increases, the amount of prothrombin adsorbed on the anion exchanger increases and the amount of thrombin obtained increases. The amount of the eluent is preferably equal to or greater than the amount that can be distributed throughout the anion exchanger. Even if the amount of the eluent is increased, the yield of thrombin does not change if the entire thrombin solution is recovered. However, as the amount of the eluent decreases, the concentration of thrombin increases and the thrombin activity value increases. When it is desired to dilute the thrombin solution and reduce the thrombin activity value, the amount of the eluent may be increased, or the amount may be increased by dilution after the recovery.
アニオン交換体と溶離液との接触は、アニオン交換体に溶離液を添加することによりなされるが、添加後、アニオン交換体と溶離液とをより均一に混合するために、転倒混和や振動を与えてもよい。あるいは、溶離液の添加時に、溶離液とアニオン交換体とが混和するように勢いよく溶離液を添加してもよい。溶離液を添加後、静置することで十分なプロトロンビンの活性化が進むが、途中転倒混和や振動を与えて混和してもよい。また、アニオン交換体に溶離液を接触させる前に、アニオン交換体から血液を排出させると、接触させる溶離液の液量と得られるトロンビン溶液の液量とがほぼ同量となり、液量を調整できるので好ましい。 The contact between the anion exchanger and the eluent is made by adding the eluent to the anion exchanger. After the addition, in order to mix the anion exchanger and the eluent more uniformly, inversion mixing and vibration are performed. May be given. Alternatively, the eluent may be vigorously added so that the eluent and the anion exchanger are mixed when the eluent is added. When the eluent is added and left standing, sufficient activation of prothrombin proceeds. However, the mixture may be mixed by inversion or vibration. In addition, if blood is drained from the anion exchanger before contacting the eluent with the anion exchanger, the volume of the eluent to be brought into contact with the thrombin solution is almost the same, and the volume is adjusted. It is preferable because it is possible.
トロンビン溶液の回収は、アニオン交換体からフィルターを介して吸引や遠心分離により回収してもよいし、静置又は遠心分離によりアニオン交換体と溶離液とを２層に分け、上層のトロンビン溶液のみを回収してもよい。得られたトロンビン溶液を全て回収する観点から、フィルターを介した回収がより好ましい。フィルターは、アニオン交換体を通過させない孔径のフィルターであれば公知のものを使用することができる。 The thrombin solution may be collected from the anion exchanger by suction or centrifugation through a filter, or the anion exchanger and the eluent are separated into two layers by standing or centrifuging, and only the upper thrombin solution is collected. May be recovered. From the viewpoint of recovering all of the obtained thrombin solution, recovery through a filter is more preferable. A well-known filter can be used as long as the filter has a pore size that does not allow the anion exchanger to pass through.
本実施の形態において、溶離液とアニオン交換体との接触時間は、２分以上１０分以下が望ましい。なお、本実施の形態における接触時間とは、アニオン交換体に溶離液を添加してからトロンビン溶液の回収操作を始めるまでの時間である。本実施の形態によれば、プロトロンビンを吸着させたアニオン交換体に溶離液を接触させると、２分以上でほとんどの吸着プロトロンビンがトロンビンへ活性化され、トロンビンを回収することができる。アニオン交換体と溶離液との接触に偏りがある場合でも、アニオン交換体と溶離液とを接触させた後１０分以内には、溶離液はアニオン交換体全体に行き渡り、プロトロンビンのほとんどが活性化される。したがって、本実施の形態により、溶離液の接触時間を２分以上１０分以下とすることができる。また、上述した通り、血液を直接アニオン交換体へ接触させることができるので、トロンビンの作製時間がより短縮される。 In the present embodiment, the contact time between the eluent and the anion exchanger is preferably 2 minutes or more and 10 minutes or less. The contact time in the present embodiment is the time from when the eluent is added to the anion exchanger until the thrombin solution is recovered. According to the present embodiment, when the eluent is brought into contact with the anion exchanger having adsorbed prothrombin, most of the adsorbed prothrombin is activated to thrombin in 2 minutes or more, and thrombin can be recovered. Even if there is a bias in the contact between the anion exchanger and the eluent, the eluent reaches the entire anion exchanger within 10 minutes after contacting the anion exchanger and the eluent, and most of the prothrombin is activated. Is done. Therefore, according to this embodiment, the contact time of the eluent can be set to 2 minutes or more and 10 minutes or less. Moreover, as described above, blood can be directly brought into contact with the anion exchanger, so that the production time of thrombin is further shortened.
本実施の形態において、アニオン交換基としてＤＥＡＥ基を有するアニオン交換体を用いることがより好ましい。また、本実施の形態において、血液をアニオン交換体と接触させた後、溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、アニオン交換体を等張液で洗浄することが好ましい。洗浄することにより、アニオン交換体上に付着した、例えばフィブリノーゲンなどのトロンビン活性値を下げる性質を有する成分を排除可能であり、得られるトロンビン溶液の活性値がより安定する。また、アニオン交換体の空隙部分に赤血球が残存した場合、得られるトロンビン溶液に赤血球が混在するが、洗浄により赤血球の混在量を減らすこともできる。ここで、洗浄に使用する洗浄液として等張液を用いることにより、残存した赤血球が溶血することなく洗浄することができるので好ましい。 In the present embodiment, it is more preferable to use an anion exchanger having a DEAE group as an anion exchange group. In the present embodiment, it is preferable to wash the anion exchanger with an isotonic solution after contacting the blood with the anion exchanger and before bringing the eluent into contact with the anion exchanger. By washing, a component adhering to the anion exchanger having a property of lowering the thrombin activity value such as fibrinogen can be eliminated, and the activity value of the obtained thrombin solution becomes more stable. Further, when red blood cells remain in the void portion of the anion exchanger, red blood cells are mixed in the obtained thrombin solution, but the amount of mixed red blood cells can be reduced by washing. Here, it is preferable to use an isotonic solution as a washing solution used for washing, since the remaining red blood cells can be washed without hemolysis.
本実施の形態でいう等張液とは、血液と等張である溶液である。洗浄液の浸透圧が１６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下で赤血球は溶血するため、１６０ｍＯｓｍ／ｋｇより高いことが好ましく、血液（血漿・血清）の浸透圧２７５〜２９０ｍＯｓｍ／ｋｇと等張であることがより好ましい。組成としては、プロトロンビンの活性化及びトロンビン活性を阻害するもの以外ならば何でもよいが、生理食塩液が好適に使用できる。また、洗浄に用いる等張液の液量は、アニオン交換体と混和し洗浄できる液量を用いることができ、使用するアニオン交換体の容積の２〜２０倍がより好ましい。本実施の形態により得られるトロンビン溶液は、使用するまで室温や冷蔵で保存してもよいし、冷凍して保存し、使用前に解凍して用いてもよい。 The isotonic solution in the present embodiment is a solution that is isotonic with blood. Since erythrocytes are hemolyzed when the osmotic pressure of the washing solution is 160 mOsm / kg or less, it is preferably higher than 160 mOsm / kg, and more preferably isotonic with osmotic pressure of blood (plasma / serum) 275-290 mOsm / kg. The composition may be anything other than prothrombin activation and thrombin activity inhibition, but physiological saline can be preferably used. Further, the amount of the isotonic solution used for washing can be an amount that can be mixed and washed with the anion exchanger, and is more preferably 2 to 20 times the volume of the anion exchanger to be used. The thrombin solution obtained by the present embodiment may be stored at room temperature or refrigerated until use, or may be stored frozen and thawed before use.
以下実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。まず、実施例及び比較例における使用されたトロンビン活性値の２種の測定方法を説明する。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. First, two methods for measuring the thrombin activity value used in Examples and Comparative Examples will be described.
［トロンビン活性値測定；凝固時間法］
日本薬局方によるトロンビンの定量法に準じてトロンビン活性値を測定した。フィブリノーゲン溶液（ボルヒール（登録商標）、（財）化学及血清療法研究所）を生理食塩液（大塚生食注、大塚製薬）で希釈し、フィブリノーゲン濃度３ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を調製した。日本薬局方標準品のトロンビン標準品（（財）日本公定書協会）を生理食塩液に溶かし、４種の標準溶液を調製した。標準溶液の濃度は、下記方法による凝固時間が１４〜６０秒の範囲内となるように濃度を振り調製した。測定サンプルも凝固時間が１４〜６０秒の範囲内となるように生理食塩液で希釈した。測定は血液凝固自動測定装置（ＫＣ４デルタ、ｔｒｉｎｉｔｙ ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。
[Thrombin activity measurement; clotting time method]
The thrombin activity value was measured according to the method of quantification of thrombin by the Japanese Pharmacopoeia. A fibrinogen solution (Bolheel (registered trademark), Chemical and Serum Therapy Laboratory) was diluted with a physiological saline solution (Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to prepare a fibrinogen solution having a fibrinogen concentration of 3 mg / mL. The Japanese Pharmacopoeia standard thrombin standard (Japan Standards Association) was dissolved in physiological saline to prepare four standard solutions. The concentration of the standard solution was adjusted and adjusted so that the coagulation time by the following method was in the range of 14 to 60 seconds. The measurement sample was also diluted with physiological saline so that the coagulation time was in the range of 14 to 60 seconds. The measurement was performed using an automatic blood coagulation measuring device (KC4 delta, trinity biotech).
あらかじめ血液凝固自動測定装置を３７℃に加温した。サンプルカップにフィブリノーゲン溶液を１５０μＬ入れ、３７℃で３分間温めた。これにトロンビン標準溶液５０μＬをピペットで吹き込み、同時にタイマーを作動させ、凝固するまでの凝固時間を測定した。５回ずつ測定を行いその平均値を求め、検量線とした。同様に、測定サンプルの凝固時間を測定し、検量線及び希釈倍率からトロンビン活性値を算出した。 The blood coagulation automatic measuring device was heated to 37 ° C. in advance. 150 μL of fibrinogen solution was placed in a sample cup and warmed at 37 ° C. for 3 minutes. Thrombin standard solution 50 μL was blown into this with a pipette, and at the same time, a timer was activated to measure the coagulation time until coagulation. Measurement was performed 5 times, and the average value was obtained as a calibration curve. Similarly, the coagulation time of the measurement sample was measured, and the thrombin activity value was calculated from the calibration curve and dilution factor.
［トロンビン活性値測定；発色基質法］
ＮａＣｌ １．７５３ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．７４４ｇ、ＢＳＡ ０．２００ｇ、１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ４ｍｌを注射用水（大塚蒸留水、大塚製薬）１９６ｍＬに溶解して、アッセイバッファーを調製した。発色性合成基質はＳ−２２３８（テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８、積水メディカル）を注射用水で溶解し、濃度２μｍｏｌ／ｍＬの合成基質溶液を調製した。標準溶液として日本薬局方標準品のトロンビン標準品を生理食塩液に溶解し２００Ｕ／ｍＬにしたものを更にアッセイバッファーで希釈し、４種の標準溶液を調製した。
[Thrombin activity measurement; Chromogenic substrate method]
Prepare an assay buffer by dissolving 4 ml of NaCl 1.753 g, EDTA · 2Na 0.744 g, BSA 0.200 g, 1 mol / L Tris-HCl (pH 8.0) in water for injection (Otsuka distilled water, Otsuka Pharmaceutical). did. As a chromogenic synthetic substrate, S-2238 (Test Team (registered trademark) chromogenic substrate S-2238, Sekisui Medical) was dissolved in water for injection to prepare a synthetic substrate solution having a concentration of 2 μmol / mL. As a standard solution, a Japanese Pharmacopoeia standard thrombin standard dissolved in physiological saline to 200 U / mL was further diluted with an assay buffer to prepare four types of standard solutions.
測定サンプルは、まず、吸光度測定結果に誤差を生じないようにトロンビン溶液に微量に混在する赤血球を遠心分離により除去し使用した。なお、赤血球除去操作前後の凝固時間法によるトロンビン活性値に差はみられないことを下記実施例で確認済みである。次に下記測定法における検量線の範囲の吸光度を得られるように、アッセイバッファーで希釈した。測定はマイクロプレート分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ３８４、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用した。 First, red blood cells mixed in a very small amount in the thrombin solution were removed by centrifugation so as not to cause an error in the absorbance measurement result. In addition, it has been confirmed in the following Examples that there is no difference in the thrombin activity value by the coagulation time method before and after the erythrocyte removal operation. Next, it was diluted with an assay buffer so as to obtain an absorbance within the range of the calibration curve in the following measurement method. The measurement used the microplate spectrophotometer (SPECTRAmax340PC384, Molecular Devices).
あらかじめマイクロプレート分光光度計を３７℃に加温した。９６穴マイクロプレートに、アッセイバッファーによって一定の希釈操作を行なった標準溶液又は測定サンプルを各々３ウェルに入れ、合成基質溶液を一定量添加後、４０５ｎｍの吸光度を１０秒間隔で５分カイネティック測定を行った。３ウェルの結果の平均値を測定値とし、４種の標準溶液の測定値から検量線を求め、測定サンプルの測定値から検量線と希釈倍率を元にトロンビン活性値を算出した。 A microplate spectrophotometer was heated to 37 ° C. in advance. In a 96-well microplate, a standard solution or measurement sample that has been diluted with an assay buffer is placed in 3 wells. After adding a fixed amount of a synthetic substrate solution, absorbance at 405 nm is measured at 10 second intervals for 5 minutes. Went. An average value of the results of the three wells was taken as a measurement value, a calibration curve was obtained from the measurement values of the four standard solutions, and a thrombin activity value was calculated from the measurement values of the measurement samples based on the calibration curve and the dilution factor.
（実施例１〜２６）
注射用水で置換したＤＥＡＥ基を有するアニオン交換体（セルロファインＫＡＮＴＯ ＤＥＡＥ−５００、関東化学）０．５ｍＬを容器容量２．５ｍＬのポリエチレン製のカラム（ラボラトリー・ポリエチレンカラムＳ１０１２、モビテック社）に充填した。溶離液は、注射用水に塩化カルシウム二水和物を５乃至５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、更に塩化ナトリウムでイオン強度が０．１７乃至０．４６ｍｏｌ／Ｌとなるように調製した。また、健常人ボランティアより血液を採取し、血液１００ｍＬに対して抗凝固剤としてＣＰＤ液を１４ｍＬ添加し、ヒト新鮮血液とした。ＣＰＤ液はクエン酸三ナトリウム二水和物３０．０ｇ、ブドウ糖２３．２ｇ、クエン酸一水和物３．５８ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．５１ｇを注射用水１Ｌに溶解して調製した。
(Examples 1 to 26)
0.5 mL of an anion exchanger having a DEAE group substituted with water for injection (Cellulofine KANTO DEAE-500, Kanto Chemical) was packed in a polyethylene column (Laboratory Polyethylene Column S1012, Movitech) having a container volume of 2.5 mL. . The eluent was prepared by dissolving calcium chloride dihydrate in water for injection to 5 to 50 mmol / L and further adjusting the ionic strength with sodium chloride to 0.17 to 0.46 mol / L. In addition, blood was collected from healthy volunteers, and 14 mL of CPD solution was added as an anticoagulant to 100 mL of blood to obtain fresh human blood. CPD solution was obtained by dissolving 30.0 g of trisodium citrate dihydrate, 23.2 g of glucose, 3.58 g of citric acid monohydrate, and 2.51 g of sodium dihydrogen phosphate dihydrate in 1 L of water for injection. Prepared.
アニオン交換体カラムに生理食塩液５ｍＬを流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液、平衡化し、ゲルヘッドを出した後、ヒト新鮮血液８ｍＬを流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで濾過した。続いて生理食塩液１０ｍＬを流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで濾過し、アニオン交換体カラムを洗浄し、生理食塩液をアニオン交換体カラムから排出した。次に、出口を閉じたアニオン交換体カラムに、表１に記載の組成の溶離液０．５ｍＬを添加し、ピペッティング２〜３回によりアニオン交換体と溶離液をなじませた後、接触時間として１０分間静置した。アニオン交換体カラムの出口に１ｍＬシリンジをセットし、シリンジで吸引してトロンビン溶液を回収した。このようにして作製したトロンビン溶液のゲル化の有無を目視で確認した。また、ゲル化のないトロンビン溶液は、回収後１〜３時間以内にトロンビン活性値を凝固時間法及び合成基質法で測定した。実施例１乃至２６の結果を、表１、図１、及び図２に示す。 After 5 mL of physiological saline was passed through the anion exchanger column at a flow rate of 1 mL / min and equilibrated, and the gel head was discharged, 8 mL of fresh human blood was filtered at a flow rate of 0.8 mL / min. Subsequently, 10 mL of physiological saline was filtered at a flow rate of 1.0 mL / min, the anion exchanger column was washed, and the physiological saline was discharged from the anion exchanger column. Next, 0.5 mL of the eluent having the composition shown in Table 1 was added to the anion exchanger column with the outlet closed, and the anion exchanger and the eluent were mixed by pipetting 2 to 3 times, and then the contact time. And allowed to stand for 10 minutes. A 1 mL syringe was set at the outlet of the anion exchanger column, and the thrombin solution was collected by suction with the syringe. The presence or absence of gelation of the thrombin solution thus prepared was confirmed visually. Moreover, the thrombin solution without gelation was measured for the thrombin activity value by the coagulation time method and the synthetic substrate method within 1 to 3 hours after recovery. The results of Examples 1 to 26 are shown in Table 1, FIG. 1 and FIG.
（比較例１〜１５）
溶離液の塩化カルシウム二水和物の濃度を５ｍｍｏｌ／Ｌ未満又は５０ｍｍｏｌ／Ｌより高くなるように調製したか、又は溶離液のイオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ未満又は０．４６ｍｏｌ／Ｌより高くなるように調製した以外は、実施例１〜２６と同様に実験した。比較例１乃至１５の結果を表２、図１、及び図２に示す。実施例１乃至２６、及び比較例１乃至１５の結果より、溶離液のカルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ない場合、又はイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低い場合は、トロンビン溶液のトロンビン活性値が低下することが示された。また、カルシウムイオンが５０ｍｍｏｌ／Ｌより多い、又はイオン強度が０．４６ｍｏｌ／Ｌより高い場合は、得られるトロンビン溶液がゲル化することが示された。
(Comparative Examples 1-15)
The concentration of calcium chloride dihydrate in the eluent was prepared to be less than 5 mmol / L or higher than 50 mmol / L, or the ionic strength of the eluent was lower than 0.17 mol / L or higher than 0.46 mol / L Experiments were carried out in the same manner as in Examples 1 to 26 except that the sample was prepared as described above. The results of Comparative Examples 1 to 15 are shown in Table 2, FIG. 1 and FIG. From the results of Examples 1 to 26 and Comparative Examples 1 to 15, when the calcium ion in the eluent is less than 5 mmol / L, or the ionic strength is lower than 0.17 mol / L, the thrombin activity value of the thrombin solution is It was shown to decline. Moreover, when there were more calcium ions than 50 mmol / L, or when ionic strength was higher than 0.46 mol / L, it was shown that the obtained thrombin solution gelatinizes.
（実施例２７）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を２分に変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液のゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５０４Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５３Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液との接触時間を２分に短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表３に示す。
(Example 27)
A thrombin solution was prepared in the same manner as in Example 13 except that the contact time between the anion exchanger and the eluent was changed to 2 minutes, and the presence or absence of gelation of the thrombin solution was confirmed in the same manner as in Example 13. The thrombin activity value was measured. As a result, gelation of the thrombin solution was not observed. The thrombin activity value was 504 U / mL by the coagulation time method and 353 U / mL by the synthetic substrate method. Compared to Example 13, a thrombin solution having a similar thrombin activity value could be prepared even when the contact time with the eluent was shortened to 2 minutes. The results are shown in Table 3.
（実施例２８）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を５分に変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で４７３Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３４０Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液との接触時間を５分へ短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表３に示す。
(Example 28)
A thrombin solution was prepared in the same manner as in Example 13 except that the contact time between the anion exchanger and the eluent was changed to 5 minutes, and the presence or absence of gelation of the thrombin solution was confirmed in the same manner as in Example 13. The thrombin activity value was measured. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity value was 473 U / mL by the coagulation time method and 340 U / mL by the synthetic substrate method. Compared with Example 13, a thrombin solution having a similar thrombin activity value could be prepared even when the contact time with the eluent was shortened to 5 minutes. The results are shown in Table 3.
（比較例１６）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を３０分に変更した以外は、比較例１２と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、比較例１２と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で１８８Ｕ／ｍＬ、合成基質法で１２８Ｕ／ｍＬであった。比較例１２と比較し、溶離液との接触時間を３０分へ延長してもプロトロンビンからトロンビンへの活性化、溶出が不十分であり、トロンビン活性値は低かった。結果を表３に示す。
(Comparative Example 16)
A thrombin solution was prepared in the same manner as in Comparative Example 12 except that the contact time between the anion exchanger and the eluent was changed to 30 minutes, and the presence or absence of gelation of the thrombin solution was confirmed as in Comparative Example 12, The thrombin activity value was measured. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity value was 188 U / mL by the coagulation time method and 128 U / mL by the synthetic substrate method. Compared with Comparative Example 12, even when the contact time with the eluent was extended to 30 minutes, the activation and elution from prothrombin to thrombin was insufficient, and the thrombin activity value was low. The results are shown in Table 3.
（実施例２９）
アニオン交換体カラムに添加する溶離液の液量を１．０ｍＬへ変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で２８５Ｕ／ｍＬ、合成基質法で１９６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液の液量を２倍へ増やすとトロンビン活性値は１／２となり、溶離液の液量を増してもトロンビンをほぼ同等に回収できた。
(Example 29)
A thrombin solution was prepared in the same manner as in Example 13 except that the amount of the eluent added to the anion exchanger column was changed to 1.0 mL. The thrombin activity value was measured after confirmation. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity value was 285 U / mL by the coagulation time method and 196 U / mL by the synthetic substrate method. Compared with Example 13, when the amount of the eluent was increased by a factor of 2, the thrombin activity value was halved, and thrombin could be recovered almost equally even when the amount of the eluent was increased.
（実施例３０）
アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を１６ｍＬに変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で１０３０Ｕ／ｍＬ、合成基質法で７２９Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を２倍に増やすとトロンビン活性値も２倍となり、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を増やした分、トロンビン活性値は上がった。
(Example 30)
A thrombin solution was prepared in the same manner as in Example 13 except that the fresh human blood applied to the anion exchanger column was changed to 16 mL. As in Example 13, the presence or absence of gelation of the thrombin solution was confirmed, and the thrombin activity The value was measured. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity value was 1030 U / mL by the coagulation time method and 729 U / mL by the synthetic substrate method. Compared with Example 13, when the human fresh blood applied to the anion exchanger column was doubled, the thrombin activity value was also doubled, and the amount of human fresh blood applied to the anion exchanger column was increased, so that the thrombin activity value was increased. .
（実施例３１）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を室温で２４時間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５１２Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を室温で２４時間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
(Example 31)
The thrombin solution prepared in Example 13 was stored at room temperature for 24 hours, the presence or absence of gelation was confirmed, and the thrombin activity value was measured. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity values were 512 U / mL by the coagulation time method and 356 U / mL by the synthetic substrate method. Compared with Example 13, gelation did not occur even when the thrombin solution was stored at room temperature for 24 hours, and the thrombin activity value was stable. The results are shown in Table 4.
（実施例３２）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、冷蔵４℃で２週間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５０５Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３３８Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷蔵４℃で２週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
(Example 32)
The thrombin solution prepared in Example 13 was centrifuged to remove a small amount of red blood cells, and then stored at 4 ° C. for 2 weeks to confirm the presence or absence of gelation, and the thrombin activity value was measured. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity value was 505 U / mL by the coagulation time method and 338 U / mL by the synthetic substrate method. Compared with Example 13, gelation did not occur even when the thrombin solution was stored at 4 ° C. for 2 weeks, and the thrombin activity value was stable. The results are shown in Table 4.
（実施例３３）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−２０℃で３週間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５１９Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷凍−２０℃で３週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
(Example 33)
The thrombin solution prepared in Example 13 was centrifuged to remove erythrocytes mixed in a trace amount, and stored frozen at −20 ° C. for 3 weeks. After thawing the frozen thrombin solution at room temperature, the presence or absence of gelation was confirmed, and the thrombin activity value was measured. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity value was 519 U / mL by the coagulation time method and 356 U / mL by the synthetic substrate method. Compared to Example 13, gelation did not occur even when the thrombin solution was stored at -20 ° C. for 3 weeks at freezing, and the thrombin activity value was stable. The results are shown in Table 4.
（実施例３４）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−２０℃で６ヶ月間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５３４Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５０Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷凍−２０℃で６ヶ月間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
(Example 34)
The thrombin solution prepared in Example 13 was centrifuged, erythrocytes mixed in a trace amount were removed, and stored frozen at −20 ° C. for 6 months. After thawing the frozen thrombin solution at room temperature, the presence or absence of gelation was confirmed, and the thrombin activity value was measured. As a result, no gelation was observed in the thrombin solution. The thrombin activity value was 534 U / mL by the coagulation time method and 350 U / mL by the synthetic substrate method. Compared with Example 13, gelation did not occur even when the thrombin solution was stored at -20 ° C for 6 months at freezing, and the thrombin activity value was stable. The results are shown in Table 4.
（実施例３５）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、トロンビン溶液に微量に混在する赤血球を除去し、トロンビン活性値を凝固時間法で測定した。その結果、凝固法によるトロンビン活性値は５１７Ｕ／ｍＬであり、遠心分離操作によるトロンビン活性値の変化はみられなかった。
The thrombin solution prepared in Example 13 was centrifuged, erythrocytes mixed in a very small amount in the thrombin solution were removed, and the thrombin activity value was measured by the coagulation time method. As a result, the thrombin activity value by the coagulation method was 517 U / mL, and no change in the thrombin activity value by the centrifugation operation was observed.
本発明は、血液を直接原料としたトロンビン溶液の調製方法として有用であり、得られたトロンビン溶液は、フィブリン糊や血小板ゲルの１成分として使用したり、止血剤として使用したりするなど、医療用途として有用である。 The present invention is useful as a method for preparing a thrombin solution using blood directly as a raw material. The obtained thrombin solution can be used as a component of fibrin glue or platelet gel, or as a hemostatic agent. Useful as an application.
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