JP5427789B2 - バイオフィルムの酵素的予防及び制御 - Google Patents
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Description
この出願は2007年12月20日出願の米国仮出願第61/015,504に基づいて優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本発明は表面からバイオフィルムを除去するための酵素組成物及び方法に関連する。特に、バイオフィルム除去の方法は、表面上のバイオフィルムに他の酵素と組み合わせてペルヒドロラーゼ酵素を適用することを含む。
バイオフィルムは、浮遊性微生物を殺菌するために考えられる従来の手段による制御方法を用いてもしばしば存続する粘液性エキソポリマー(exopolymer)マトリックス中に組み込まれて固着する微生物集団からなる。抗生剤、消毒剤、及び酸化性抗菌剤に対するバイオフィルムの耐性についてはかなりの文献がある。
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
二つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びグルカナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
少なくとも二つのアミラーゼ及びグルカナーゼ、
少なくとも三つのアミラーゼ、及び
少なくとも二つのアミラーゼ、グルカナーゼ、及びプロテアーゼ
から選択されることを特徴とする方法である。いくつかの実施態様においては、バイオフィルムが緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、リステリア モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、又は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む。いくつかの実施態様においては、ペルヒドロラーゼ酵素が配列番号1に記載のアミノ酸配列又はその変異体又は相同体を含む。いくつかの実施態様においては、ペルヒドロラーゼ酵素は配列番号1のS54V変異体である。
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
二つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びグルカナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
少なくとも二つのアミラーゼ及びグルカナーゼ、
少なくとも三つのアミラーゼ、及び
少なくとも二つのアミラーゼ、グルカナーゼ、及びプロテアーゼ
から選択されることを特徴とする組成物である。
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
二つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びグルカナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
少なくとも二つのアミラーゼ及びグルカナーゼ、
少なくとも三つのアミラーゼ、及び
少なくとも二つのアミラーゼ、グルカナーゼ、及びプロテアーゼ
からなる群から選択されることを特徴とし、キットは任意に本明細書に記載のバイオフィルム除去のための方法に用いる説明書を含むことを特徴とするキットである。ある実施態様においては、ペルヒドロラーゼ酵素及び前記除去酵素混合物が別個の容器中に収容される。ある実施態様においては、ペルヒドロラーゼ酵素及び前記除去酵素混合物が同じ容器中に収容される。
本発明は制御、即ち表面上のバイオフィルムの放出又は低減、又は表面上のバイオフィルムの形成又は増殖の予防のための方法、組成物、及びキットを提供する。本発明の酵素含有組成物及び方法は例えば、クーリング・タワー、飲料水、廃水、歯科衛生、医療用インプラント、医療機器、血液透析システム、油回収、生物的環境浄化(bioremediation)井戸、紙処理パルプ処理、船殻処理、食品加工装置、及びパイプ、チューブ等水配給システムのような産業用水処理におけるバイオフィルムの制御に利用できる。
「バイオフィルム」とは、表面に付着した細胞外のポリマーマトリックスの中に埋め込まれる微生物の集団を言う。さらに、バイオフィルムは水を含み、他の取り込まれた粒子を含んでよい。バイオフィルムは一以上の微生物を含み、微生物は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌(好気性、または嫌気性の)、藻類、原生動物、及び/又は酵母、又は糸状菌が挙げられる。いくつかの実施態様においては、バイオフィルムは、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、リステリア(Listeria)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、及びエシェリケア(Escherichia)からなるバクテリア属の生きた細胞を含む。
多数の異なる酵素をバイオフィルム除去のために本明細書に記載の酵素混合物中及び方法に用いてよい。本明細書に記載の酵素混合物は少なくとも二つの酵素であって、例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びベータ‐グルコシダーゼのようなカルボヒドロラーゼ、
アルファ‐アミラーゼのようなアミラーゼ、
例えばスブチリシンであるセリンプロテアーゼのようなプロテアーゼ、
エステラーゼ及びクチナーゼ、
粒状デンプン加水分解酵素、
ホスホリパーゼのようなリパーゼ、及び
マンナナーゼのようなヘミセルラーゼ
の組み合わせを含む。また、そのような酵素混合物は本明細書にて「除去酵素混合物」と称し、本明細書に記載の酵素の組み合わせを含む。除去酵素混合物はペルヒドロラーゼ酵素を含まないが、本明細書に記載のようにバイオフィルム低減用の方法において、同時又は連続のいずれかで、一以上のペルヒドロラーゼ酵素と組み合わせて用いることを含む。
アルファアミラーゼ及びマンナナーゼ、
アミラーゼ及びプロテアーゼ、
アミラーゼ及びアラビナーゼ、
少なくとも一つのアルファアミラーゼ及び少なくとも2つの他のアミラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、及びグルカナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ及び3つのグルカナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ及びアミラーゼ、
プロテアーゼ、アミラーゼ及びグルカナーゼ、
プロテアーゼ、マンナナーゼ及びアミラーゼ、
セルラーゼ、アラビナーゼ及びアミラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ及びホスホリパーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ及びアラビナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ及び2つのグルカナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ及び3つのグルカナーゼ、
3つのプロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ及びホスホリパーゼ、
3つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ及びエステラーゼ、
3つのプロテアーゼ、マンナナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
3つのプロテアーゼ、セルラーゼ及びマンナナーゼ、
2つのプロテアーゼ、セルラーゼ及びグルカナーゼ、
2つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ及びマンナナーゼ、
2つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
少なくとも3つのアミラーゼ及びセルラーゼ、
アミラーゼ、アラビナーゼ及びセルラーゼ、
アミラーゼ、アラビナーゼ及びプロテアーゼ、
少なくとも3つのアミラーゼ及びプロテアーゼ、
少なくとも3つのアミラーゼ、プロテアーゼ及びセルラーゼ、
グルカナーゼ及びアミラーゼ混合物、
セルラーゼ及びアミラーゼ混合物
の混合物を含む。
プロテアーゼ、グルカナーゼ及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ及びホスホリパーゼ及びマンナナーゼ、
3つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
3つのプロテアーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ及びマンナナーゼ、
3つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ、
2つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ及びエステラーゼ、
2つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ及びエステラーゼ、
2つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ及びマンナナーゼ、
3つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ及びグルカナーゼ、
3つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ及びマンナナーゼ、
3つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ及びエステラーゼ、
2つ以上のアミラーゼ及びグルカナーゼ、
少なくとも3つのアミラーゼ、
少なくとも2つのアミラーゼ、グルカナーゼ及びプロテアーゼ、
の混合物を含む。
プロテアーゼ、グルカナーゼ及びクチナーゼの混合物であって、市販の酵素MULTIFECT NEUTARAL、LAMINEX BG及びクチナーゼを使用して調製されてよく、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ及びクチナーゼの混合物であって、市販の酵素、MULTIFECT NEUTARL、LAMINEX BG、マンナナーゼ、及びクチナーゼを使用して調製されてよく、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ及びホスホリパーゼの混合物であって、市販の酵素MULTIFECT NEUTARL、LAMINEX BG、マンナナーゼ及びリソマックス(LYSOMAX)を用いて調製されてよく、
3つのプロテアーゼにセルラーゼを足した混合物、マンナナーゼ及びクチナーゼの混合物であって、市販の酵素、PROPERASE L、PURAFECRT L、FNA、LAMINEX BG、マンナナーゼ及びクチナーゼを使用して調製されてよい、
混合物である。
マルチフェクト ニュートラル(MULTIFECT NEUTRAL)、
ラミネックス(LAMINEX)、
リソマックス(LYSOMAX)、
プロペラーゼ(PROPERASE)、
プラダックス(PURADAX)、
プラフェクト(PURAFECT)及び、
スペザイム(SPEZYME)
を含み、これら全ては、ジェネンコ(Genencor)社の登録商標である。
1.MULTIFECT NEUTARAL、LAMINEX BG及びクチナーゼ
2.MULTIFECT NEUTARAL、LAMINEX BG、マンナナーゼ及びクチナーゼ
3.MULTIFECT NEUTARAL、LAMINEX BG、マンナナーゼ及びLYSOMAX
4.PROPERASE L、PURAFECT L、FNA、LAMINEX BG、マンナナーゼ及びクチナーゼ
5.PROPERASE L、PURAFECT L、FNA、マンナナーゼ、クチナーゼ及びLYSOMAX
6.PROPERASE L、PURAFECT L、FNA、マンナナーゼ、LAMINEX BG
7.MULTIFECT NEUTARAL、LAMINEX BG及びマンナナーゼ
8.FNA、PURDADAX EG 7000L、LAMINEX BG及びクチナーゼ
9.PURAFECT L、FNA、LAMINEX BG及びLYSOMAX
10.PROPERASE L、FNA、LAMINEX BG及びLYSOMAX
11.PROPERASE L、PURAFECT L、FNA、LAMINEX BG、PURADAX EG 7000L及びLYSOMAX
12.PROPERASE L、PURAFECT L、FNA、LAMINEX BG、クチナーゼ及びLYSOMAX
13.MULTIFECT NEUTARAL、PURADAX EG 7000L、LAMINEX BG、LYSOMAX及びクチナーゼ
14.PROPERASE L、LAMINEX BG、LYSOMAX及びクチナーゼ
SPEZYMEは、バシルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)から得られるアルファアミラーゼを含む。CuCONCは、リゾプス ニベウス(Rhizopus niveus)の麹菌グルコアミラーゼの商品名であり、粒状デンプン加水分解活性をもつ(新日本化学株式会社、日本)。AFP GC106は、酸性菌類プロテアーゼ(acid fungal protease)(新日本化学株式会社 日本)である。M1は、Biocon India社 インド、バンガロールから入手できる。ARIS SUMIZYME(1,5-アルファ アラビナーゼ)とACH SUMIZYMEである。
15.SPEZYME FRED L、CuCON及びLAMINEX BG
16.SPEZYME FRED L、Aris SUMIZYME及びLAMINEX BG
17.SPEZYME FRED L及びCuCONC
18.SPEZYME FRED L、CuCONC及びGC106
19.SPEZYME FRED L及びGC106
20.SPEZYME FRED L及びM1
21.SPEZYME FRED L、Aris SUMIZYME及びGC106
22.SPEZYME FRED L、CuCONC、LAMINEX BG及びGC106
23.SPEZYME FRED L、ACH SUMIZYMNE及びGC106
24.SPEZYME FRED L、Aris SUMIZYME、LAMINEX BG及びGC106
25.CuCONC及びLAMINEX BG
26.SPEZYME FRED L及びAris SUMIZYME
27.M1及びLAMINEX BG
28.SPEZYME FRED L、LAMINEX BG及びGC106
29.CuCONC、LAMINEX BG及びGC106
一以上のペルヒドロラーゼ酵素を上述のように酵素混合物と組み合わせて、バイオフィルム除去のための本発明の方法に用いてよい。
L12C、Q、又はG、
T25S、G、又はP、
L53H、Q、G、又はS、
S54V、L、A、P、T、又はR、
A55G又はT、
R67T、Q、N、G、E、L、又はF、
K97R、
V125S、G、R、A、又はP、
F154Y、
F196G、
である。
L12I S54V
L12M S54T
L12T S54V
L12Q T25S S54V
L53H S54V
S54P V125R
S54V V125G
S54V F196G
S54V K97R V125G又は
A55G R67T K97R V125G
バイオフィルム除去はクリスタルバイオレット試験を用いて測定してよい。サンプルを10分間クリスタルバイオレット(0.31%w/v)の溶液中に浸し、その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中3回濯ぎ、固定していない染料を除く。バイオフィルムにより保持される固定染料を95%エタノールを用いて抽出し、540nmにてクリスタルバイオレット/エタノール溶液の吸光度を測定する。バイオフィルムの除去パーセントを[(1−バイオフィルム残留フラクション)x100]として計算する。バイオフィルム残留フラクション割合は、酵素処理バイオフィルムから抽出される液の吸光度から、培地+酵素溶液の吸光度を引き、これを未処理のコントロールバイオフィルムの吸光度から培養培地のみの吸光度を差し引いた吸光度の差で割ることにより計算される。
本発明は表面からバイオフィルムを除去する方法を提供する。バイオフィルムの除去とは表面からバイオフィルムを減少し又は除去することをいう。本発明の方法は、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99パーセントのバイオフィルムを低減するために十分な時間及び十分な酵素用量のレベルにて表面上のバイオフィルムへ一以上のペルヒドロラーゼ酵素及び上述の除去酵素混合物を適用することを含む。バイオフィルムの低減するパーセントは、処理する前のバイオフィルムにおける生存細胞及び/又は全体の細胞の数に比較してバイオフィルムにおける生存細胞の数での減少をいう。いくつかの実施態様においては、処理するバイオフィルムは緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、リステリア モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、又は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む、からなる、又は実質的にからなる。また、本発明の方法は表面上のバイオフィルムの形成又は増殖の予防的な阻止を含む。
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
二つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びグルカナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二以上のアミラーゼ及びグルカナーゼ、
少なくとも三つのアミラーゼ、及び
少なくとも二つのアミラーゼ及びグルカナーゼ、及びプロテアーゼ
から選択される。いくつかの実施態様においては、プロペラーゼ(PROPERASE)、プラフェクト(PURAFECT)、マルチフェクト ニュートラル(MULTIFECT NEUTRAL)、エフエヌエー(FNA)、及びジーシー106(GC 106)から選択される商業的に入手可能なプロテアーゼの一以上を除去酵素混合物中に含む。いくつかの実施態様においては、商業的に入手可能なセルラーゼであるプラダックス(PURADAX)を除去酵素混合物中に含む。いくつかの実施態様においては、商業的に入手可能なエステラーゼであるクチナーゼ(CUTINASE)を除去酵素混合物中に含む。いくつかの実施態様においては、ジーシー265(GC265)及びヘミセル(HEMICELL)から選択される商業的に入手可能なマンナナーゼを除去酵素混合物中に含む。いくつかの実施態様においては、商業的に入手可能なセルラーゼであるラミネックス ビージー(LAMINEX BG)を除去酵素混合物中に含む。いくつかの実施態様においては、さらに、エンド‐アラビナーゼを除去酵素混合物中に含む。
また、本発明はキットを提供する。キットは本明細書に記載のようにバイオフィルム処理のための方法において用いるために十分な量のペルヒドロラーゼ酵素及び除去酵素混合物を含む。ある実施態様においては、ペルヒドロラーゼ酵素及び除去酵素混合物は別個の容器中に収容される。別の実施態様においては、ペルヒドロラーゼ酵素及び除去酵素混合物は同じ容器中に収容される。除去酵素混合物は上述の任意の酵素組み合わせを含んでよい。上記に記載のように、ペルヒドロラーゼ酵素は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、又はその変異体又は相同体を含む、からなる、又は実質的になってよい。キット中に存在する酵素を固体又は液体の形状で供給してよい。さらに、キットは緩衝液、基質又は酵素活性及び/又は安定性に有用な他の成分を含んでよい。例えば、キットはペルヒドロラーゼ活性に対する基質、例えば、プロピレングリコール二酢酸(PDG)及び過炭酸塩(percarbonate)を含んでよい。キットは本明細書に記載のようにバイオフィルム処理のための方法において用いる説明書を含んでよい。
ハイスループット方法を酵素の計画された試験マトリックスに基づき、多くの酵素混合物をスクリーニングするために用いた。PBS及び酢酸緩衝液を溶液(Tris緩衝液:pH7.0又は8.5及び酢酸緩衝液:pH5.0)を調製するために用いた。多様な酵素混合物組み合わせをpH及び温度に従って酵素の特定化を行った。96穴法を各組み合わせについて4回の再現試験を用いて酵素の375の異なる組み合わせをスクリーニングするために用いた。この分析は、96穴マイクロタイタープレートのウェルにおいてバイオフィルムを形成させ、これを96までの異なる試験サンプルを提供するために用いることができる。
酸性条件(pH5)下で加水分解反応に触媒的に効果的であるプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及び他のカルボヒドラーゼのような特異的酵素が、バイオフィルムを除去する有効性についてスクリーニングされた。例えば、GC106酸性プロテアーゼをこの試験のために、酸性条件下で触媒的に効果的であるリパーゼ、セルラーゼ及び他のカルボヒドラーゼと組み合わせて用いた。この試験からスクリーニングされた17の酵素の組合せが69‐88%のバイオフィルム除去を達成した。
中性条件(pH7)下で加水分解反応に触媒的に効果的であるプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及び他のカルボヒドラーゼのような特異的酵素がバイオフィルムを除去する有効性についてスクリーニングされた。例えば、中性プロテアーゼをこの試験のために、中性条件下で触媒的に効果的であるリパーゼ、セルラーゼ及び他のカルボヒドラーゼと組み合わせて用いた。この試験からスクリーニングされた5つの酵素の組合せが71‐84%のバイオフィルム除去を達成した。
アルカリ性条件(pH8.4)で加水分解反応に触媒的に効果的であるアルカリプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及び他のカルボヒドラーゼのような特異的酵素がバイオフィルムを除去する有効性についてスクリーニングされた。例えば、エフエヌエー(FNA)、プラフェクト(PURAFECT)、及びプロペラーゼ(PROPERASE)のようなセリンプロテアーゼをこの試験のために、塩基性条件で触媒的に効果的であるリパーゼ、セルラーゼ及び他のカルボヒドラーゼと組み合わせて用いた。この試験からスクリーニングされた11の酵素の組合せが70‐80%のバイオフィルム除去を達成した。
データを統計的有意性ついて分析した。差異についての分析より下記表1に示す酵素混合物が、コントロールと統計的に異なることがわかった。ファミリーワイズ(family‐wise)の誤差を0.05と設定した。つまり1組の143の試験結果のうち偽陽性結果がないことが95%の信頼度で測定された。統計的分析のこの方法の詳細は以下のウェブサイトで見られる。
http://core.ecu.edu/psyc/wuenschk/docs30/multcomp.doc
及び概念は下記ウェブサイトにて十分に説明される。http://www.brettscaife.net/statistics/introstat/08multiple/lecture.html
実験方法
表1の酵素混合物を実験用モデルシステム、CDCバイオフィルムリアクター(モデル CBR 90、Biosurface Technologies Corporation、Bozeman、MT)を用いてバイオフィルム除去について評価した。このシステムは疾病管理センター(Centers for Disease Control)により開発され、多様な細菌種により形成されたバイオフィルムを研究するために使用されてきた。このCDCバイオフィルムリアクターは蓋からぶら下げられた8個のポリプロピレンの小片ホルダーを備えた1リットルの容器からなる。各小片ホルダーは3つの0.5インチ直径のサンプル片を収納することができる。本明細書にて報告された試験については、サンプル片はポリスチレンから製作され、ポリスチレンマイクロタイタープレートを用いて実施したハイスループットスクリーニング試験と一致した。2台のCDCバイオフィルムリアクターを1試験当たり合計48枚のサンプル小片が試験できるよう並行して操作した。液体培養培地を容器の上から加え、サイドアームの排出ポートを通って排出した。混合羽根を持つマグネチックスターラーバーにより、流体の混合、液面のせん断を行った。
10%ストレングストリプティックソイブロス(10%‐strength tryptic soy broth)培地を含む約400mlの作業体積を有するCDCバイオフィルムリアクター容器に緑膿菌(P. aeruginosa)を播種し、37℃にて6時間バッチ式(培地を流入しない)で実施した。バッチ培養を確立した後、600ml/時間の速度にて培地の流入をさらに42時間行い、ポリスチレンサンプル片上に緑膿菌(P. aeruginosa)バイオフィルムを構築した。バイオフィルム増殖時間の終わりに、6つのコントロール片を各二つの反応容器から除き、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で濯ぎ、非接着細菌を除去した。それから、各反応容器から3つの小片を下記に記載するクリスタルバイオレット染色方法を用いてバイオフィルムの分析を行った。各反応容器からの残りの3つのコントロール小片をPBS中超音波処理し、次に希釈し、トリプティックソイ培地上へ移し、バイオフィルム内の培養可能な細菌の数を数えた。
下記記載の酵素混合物を3つの他の主要な市販の関連バイオフィルムに対して有効性を評価するために試験をした。試験は、緑膿菌(Pseudomonas)に関するCDCバイオフィルムリアクターデータ、及び4種のモデルのデンタルバイオフィルムに関する分離HTP試験に基づいて行われた。洗浄可能な時間及び経済的な用量に関する実施上の配慮により、バイオフィルム小片と洗浄酵素混合物の接触時間を40分に減少し、酵素混合物中すべての酵素成分の最終混ぜ合わせ酵素濃度を全体の1%に制限した。例えば、PEP5+CAR2+CEL3酵素混合物は、試験用最終酵素混合物用量が1%になるよう各酵素を0.33+0.33+0.34%含んだ。
10%ストレングスブレインハートインフュージョン(BHI)培地を含む約400mlの作業体積を有しステンレス製小片を有するCDCバイオフィルムリアクター容器に37℃にて10%BHI中リステリア モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)(ATCC19112)の終夜培養物の4mlを播種した。反応容器を24時間バッチ式で操作し、次の24時間7ml/分にてBMH培地を流入しながら連続供給を行なった。48時間(24時間バッチ+24時間連続)後、反応容器を停止し、分解した。
10%トリプティックソイブロス(TSB)培地を含む約400mlの作業体積を有しポリウレタン小片を有するCDCバイオフィルムリアクター容器に37℃にて10%TSB培地中黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(SRWC−10943)の終夜培養物の4mlを播種した。CDCリアクターを24時間バッチ式で操作し、次の24時間7ml/分にてTSB培地を流入しながら連続供給を行った。48時間(24時間バッチ+24時間連続)後、反応容器を停止し、分解した。
19LのBAC/GAC飲料水(低CFU混合飲料水コンソーシアム)と1Lの炭素補正
溶液を以下の成分を用いて調製し、添加炭素濃度になるようにした。
L-グルタミン酸 0.0047g/L
L-アスパラギン酸 0.0053g/L
L-セリン 0.0055g/L
L-アラニン 0.0047g/L
D+グルコース 0.0048g/L
D+ガラクトース 0.0048g/L
D+アラビノース 0.0048g/L
CDCバイオフィルムリアー(http://www.imt.net/~mitbst/CDCreactor.html)を適切な培地プラス4.0mlの下記の接種材料の一つで無菌的に満たした。
・10%トリプティックソイブロス(TSB)中緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の終夜培養物。この系のための小片はポリスチレンであった。
・10%ブレインハートインフュージョン(BHI)中リステリア モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)(ATCC19112)の終夜培養物。この系のための小片はステンレス製であった。
・炭素補完を伴う水中飲料水コンソーシアム。この系のための小片は塩化ポリビニル(PVC)であった。
小片を酵素処理のために滅菌12穴プレートに置いた。下記処理を行った。
・ペルヒドロラーゼ酵素、続いてPEP1、PEP2、PEP4、CEL2、CAR1、及びPAL1の混合物(「除去酵素混合物」)
・除去酵素混合物、続いてペルヒドロラーゼ酵素
・ペルヒドロラーゼ酵素単独
それぞれ処理をした小片を10分間12穴プレートの75%クリスタルバイオレット溶液に置いた。染色後、小片をPBSで3回濯ぎ、それから5.0mlの95%エタノールに添加し、5分間室温にてシェーカーに置き、クリスタルバイオレットを溶出した。それから溶出溶液をピペットでキュベットに添加し、吸光度を540nmとしスペクトロフォトメーターで測定した。
それぞれ処理をした小片を10mlの滅菌PBSを含む滅菌コニカル瓶に置いた。モンタナ州立大学バイオフィルムエンジニアリングセンターのメディカルバイオフィルムラボラトリー(Medical Biofilm Laboratory、Center for Biofilm Engineering at Montana State University、Bozeman、Montana (MBL))にて確立した標準手順に従って、瓶を1分間ボルテックスし、2分間超音波処理し、30秒ボルテックスした。細菌浮遊物を滅菌的に希釈し、寒天培地に移し、処置の結果として生存細胞数及び対数減少値を測定した。生存数については、緑膿菌(P. aeruginosa)を100%トリプティックソイ寒天培地(TSA)上に移し、リステリア モノサイトゲネス(L. monocytogenes)を100%BHI寒天培地に移し、飲料水コンソーシアムを100%R2A寒天培地上に移して計算した。
結果
24のポリスチレン小片を備えたCDCバイオフィルムリアクターに約450mlの10%TSBプラス4mlの緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の24時間培養物を満たした。リアクターを連続攪拌でバッチ式にて24時間インキュベーションした。T=24時間にて、連続流入を次の24時間7ml/分にて開始した。小片を酵素処理のためにT=48時間(24時間バッチ+24時間連続)にて滅菌12穴プレートに移した。
それぞれ6つの小片を下記のように処理した。
・基質の無いペルヒドロラーゼ酵素(配列番号1のS54V変異体、4ppm)+除去酵
素混合物(1%各酵素)
・基質の無いペルヒドロラーゼ酵素(4ppm)
・基質の有るペルヒドロラーゼ酵素(4ppm)
・PBS、7.2(コントロール)
基質の無いペルヒドロラーゼ酵素+除去酵素混合物:400mM KH2PO4緩衝液pH7.1中各酵素の全体の最終的酵素濃度が1%であるPEP1、PEP2、CEL2、CAR1、及びPAL1プラス4ppmの最終濃度ペルヒドロラーゼ酵素
各処理をした小片を12穴プレート中の75%クリスタルバイオレット溶液へ10分間置いた。染色後、小片をPBS中3回濯ぎ、5.0mlの95%エタノールへ移し、5分間室温にてシェーカーに置き、クリスタルバイオレットを溶出した。溶出溶液をそれからピペットでキュベットへ移し、吸光度を540nmとしてスペクトロフォトメーターで測定した。
各処理をした3つの小片を10mlの滅菌PBSを含んだ滅菌コニカル瓶へ移した。MBLにて確立した標準手順に従って、バイアルを1分間ボルテックスし、2分間超音波処理し、30秒間ボルテックスした。細菌浮遊物を滅菌的に希釈し、100%TSA上に移し、処理の結果として生存細胞数及び対数減少値を測定した。
結果
Claims (19)
- 表面からバイオフィルムを除去する方法であって、前記方法が少なくとも25%の前記バイオフィルムを低減するために十分な時間ペルヒドロラーゼ酵素及び除去酵素混合物を前記バイオフィルムに適用する方法において、前記酵素混合物が
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
二つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びグルカナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びグルカナーゼ、並びに
アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、及びプロテアーゼ
から選択され、
前記プロテアーゼ、前記二つのプロテアーゼ、及び前記三つのプロテアーゼがセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼからなる群から選択されるように設ける方法。 - 前記ペルヒドロラーゼ酵素及び前記除去酵素混合物が同時に前記バイオフィルムに適用されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ペルヒドロラーゼ酵素混合物及び前記除去酵素混合物が連続的に前記バイオフィルムに適用されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ペルヒドロラーゼ酵素が前記除去酵素混合物の適用前に適用されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記ペルヒドロラーゼ酵素及び前記除去酵素混合物が表面からバイオフィルムを除去するために相乗的に働くことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バイオフィルムが緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、リステリア モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、又は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記除去酵素混合物が三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼからなり、
前記三つのプロテアーゼがセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記除去酵素混合物がバシルス アルカロフィラス(Bacillus alcalophilus)プロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、バシルス スブチリス(Bacillus subtilis)プロテアーゼ、トリコデルマ(Trichoderma)β-グルカナーゼ、バシルス レンツス(Bacillus lentus)マンナナーゼ、及びストレプトミセス ビオルセオルバー(Streptomyces violceoruber)ホスホリパーゼからなることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ペルヒドロラーゼ酵素が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 表面からバイオフィルムを除去するための組成物であって、前記組成物がペルヒドロラーゼ酵素及び除去酵素混合物を含み、ここで、前記除去酵素混合物が、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
二つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びグルカナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びグルカナーゼ、並びに
アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、及びプロテアーゼ
から選択され、
前記プロテアーゼ、前記二つのプロテアーゼ、及び前記三つのプロテアーゼがセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼからなる群から選択されることを特徴とする組成物。 - 前記除去酵素混合物が三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼからなり、
前記三つのプロテアーゼがセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の組成物。 - 前記除去酵素混合物がバシルス アルカロフィラス(Bacillus alcalophilus)プロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、バシルス スブチリス(Bacillus subtilis)プロテアーゼ、トリコデルマ(Trichoderma)β-グルカナーゼ、バシルス レンツス(Bacillus lentus)マンナナーゼ、及びストレプトミセス ビオルセオルバー(Streptomyces violceoruber)ホスホリパーゼからなることを特徴とする請求項10に記載の組成物。
- 前記ペルヒドロラーゼ酵素が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項10に記載の組成物。
- 表面からバイオフィルムを除去するためのキットであって、前記キットがペルヒドロラーゼ酵素及び除去酵素混合物を含み、ここで、前記酵素混合物が、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
二つのプロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、グルカナーゼ、及びマンナナーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
二つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びグルカナーゼ、
三つのプロテアーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼ、
三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びエステラーゼ、
アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、並びに
アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、及びプロテアーゼ
からなる群から選択され、
前記プロテアーゼ、前記二つのプロテアーゼ、及び前記三つのプロテアーゼがセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼからなる群から選択されることを特徴とするキット。 - 前記ペルヒドロラーゼ酵素及び前記除去酵素混合物が別個の容器中に収容されることを特徴とする請求項14に記載のキット。
- 前記ペルヒドロラーゼ酵素及び前記除去酵素混合物が同じ容器中に収容されることを特徴とする請求項14に記載のキット。
- 前記除去酵素混合物が三つのプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼ、及びマンナナーゼからなり、
前記三つのプロテアーゼがセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項14に記載のキット。 - 前記除去酵素混合物がバシルス アルカロフィラス(Bacillus alcalophilus)プロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、バシルス スブチリス(Bacillus subtilis)プロテアーゼ、トリコデルマ(Trichoderma)β-グルカナーゼ、バシルス レンツス(Bacillus lentus)マンナナーゼ、及びストレプトミセス ビオルセオルバー(Streptomyces violceoruber)ホスホリパーゼからなることを特徴とする請求項14に記載のキット。
- 前記ペルヒドロラーゼ酵素が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項14に記載のキット。
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