JP5421666B2 - 糖鎖チップの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、糖鎖等のサッカリド型分子により機能化された固体担体(糖鎖チップ、又は炭水化物アレイもしくはオリゴ糖アレイ)を製造するためのプロセスに関する。本発明は、かかる製造プロセスにより直接的に得られる糖鎖チップ、並びに、とりわけ生物学的分析、特にサッカリド又は肝細胞増殖因子(HGF:Hepatocyte Growth Factor)のようなタンパク質のスクリーニングのための、又はサッカリド/タンパク質相互作用の研究のための、それらの利用にも関する。
DNAチップ技術の開発は、機能ゲノム学に関するプログラムの大きな進歩を可能にした。これは、DNAを堆積又は合成する技術が小型化された結果、DNA解析が、チップ上で並列に、多数のパラメータに照らして行われるようになったためである。最近になって、プロテオミクスの出現がタンパク質チップの概念を生み出した。後者は、タンパク質/リガンド型相互作用を並列に解析することを可能にした。
さらに最近になって、生物学的研究は「グライコミクス(Glycomics)」、すなわち炭水化物/タンパク質相互作用の系統的な研究、に関心をもつようになった。これは、複合糖質(すなわち、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンのようなグリカン類のドメインをもつ任意の分子、より一般的には炭水化物を備える任意の分子)が、特に広い機能レパートリを有するためである。化学的には、これらの炭水化物は、単純なモノマーブロックの組立てにより構築される分子である。これらの組立物は、天然起源であってもよく、随意的にその断片であってもよく、あるいは合成起源であってもよい。炭水化物のファミリに属する分子の様々な機能は、炭水化物構造が非常に多くの分子と相互作用する能力に基づく。炭水化物と他分子との間の認識メカニズムに関する解析は、急速に進展する研究分野である。それは、特に、新規な治療用分子の設計、及びある種の分子の毒性リスクに関するより的確な評価を可能にするものである。現在、サッカリド分子の生成を可能にする系統的な方法は、ほとんど存在しない。このため、分子と炭水化物間との相互作用に係る構造特性の測定、及び相互作用自体の特性解析は、長く退屈な研究に取り組むことを暗に意味する。
したがって、糖鎖等のサッカリド型分子とそれらのリガンド間との相互作用メカニズムの知識を進展させるためには、例えば、特定のリガンドに対するサッカリド型分子のライブラリをスクリーニングできることが必要である。
これが、今日、新規なタイプのバイオチップの出現を目にする理由である。様々なタイプの糖鎖チップ、又は炭水化物アレイもしくはオリゴ糖アレイが、上記と関連するDNA又はタンパク質チップ開発の構成要素を成し、様々な研究者により提案されてきた。
これらの糖鎖チップは、所与の基板上に天然又は合成サッカリド物質を堆積した結果(ex situ合成)、又は、例えばヘパランのような、内因性の複合糖質からなるいくつかの大ファミリの分子多様性を代表する様々なオリゴ糖配列を担体上に多数並列合成(コンビナトリアル・ケミストリ)した結果(in situ合成)のいずれかである。
In situ合成については、どのようなチップの特質(DNA、タンパク質、サッカリド)であっても、結合サイトにアドレッシングする種々の方法がすでに用いられてきた。
‐手動アドレッシング:例えば、特許文献1は、マイクロロボットを用いた手動アドレッシングを提案しており、これによれば、対応する反応物質(オリゴヌクレオチド)を圧電ポンプで注入することによりオリゴヌクレオチド配列を形成するのに先立って、基板に種々の結合サイトを規定するために、フォトレジスト物質又はマスクを用いて、担体表面上に官能化されたサイトが形成される。
‐単一基板上に多様な構造を有する複数の化合物を合成するためのプロセスを記載した特許文献2に開示されるようなリソグラフィ技術:かかるプロセスは、アレイの選択領域を段階的に作り上げるために、2層のフォトレジストを用いることを含む。このプロセスによれば、次のステップを行う:(i)基板上に配置され不安定な保護基を有する第1分子層上への保護ポリマーコート層の堆積、(ii)保護材料の層上への放射感受性レジストコート層の堆積、(iii)レジスト層を像様に露光すること、(iv)第1分子層の一部分を像様に暴露するために現像すること、(v)第1分子層の露光部分を、保護基を除去するために処理すること、及び(vi)暴露した第1分子に第2分子を結合させること。
‐フォトリソグラフィ技術:一例として、特許文献3は、ポリマー配列のアレイを調製するための方法において、各々のアレイが、既知のモノマー配列をもつ複数の様々な位置的に区別できるポリマー配列を含み、基板表面を、初めに光解離性の保護された官能基で官能化した後、マスク露光で保護基を除去して官能基を活性化し、次に化学モノマーと結合させる方法を記載している。基板上の各領域における活性化及び結合シークエンスが、そこで合成されるポリマーの配列を決定する。このプロセスは、核酸チップの作製に特に適している。
‐化学的マスキング:例えば特許文献4に記載されており、特許文献4は、従来の結合化学を用いて、基板の選択領域に、オリゴヌクレオチド及び関連するポリマー(例えばペプチド核酸)のようなポリマーのアレイを形成する方法を開示している。そして、それは、基板の選択領域にバリア材料のような材料を分配するために選択的印刷技術を使用することを含み、上記バリア材料は、ブラシ、スプレイ技術、印刷技術などを含む様々な技術により、液体又は気体として塗布される。
- 特許文献5に例えば開示される方法による機械的アドレッシング:特許文献5は、複数のマイクロキュベットを有するマイクロプレート形状の基板上に、化学的又は生物学的分子の配列のマトリクスを生成するプロセスを記載している。このプロセスは、官能化したマイクロキュベット上に局所的に保護ポリマーを堆積してすべてのマイクロキュベット上に固体のポリマーキャップを形成することと、引き続き、保護ポリマーをすべてのマイクロキュベットから取り除くのに先立って、非光解離性の保護基による、各々のマイクロキュベットを取り囲む表面をパッシベーションするステップを可能にすることと、を備える。
しかし、上述したすべての方法は、しばしば長くて複雑であり、特定の煩わしい反応物及び材料の使用が必要になる。また、上述した方法は、しばしば、固定化を望む目的分子以外の分子の非特異的吸着のレベルがあまりに高いために、目的とする生物学的分子を充分な感度で固定化できないデバイスをもたらす。官能化された個体担体の感度は、固定化量及び信号検出方法に依存するが、さらにまた特にバックグラウンドのノイズレベル(非特異的信号)にも依存する。バックグラウンドノイズの低減は、信号/ノイズ比を改善する。事実、生物種の存在を表面付近で検出するデバイスでは、バックグラウンドノイズは、固定化を望む目的の生物学的分子以外の分子の非特異的吸着に本質的に由来するため、これを制限する必要がある。
しかし、今日まで、信号/ノイズ比を低減することにより、固定された生物学的分子の信号を再現性よく高感度に検出することを可能にした、糖鎖等のサッカリド型分子で官能化された個体担体を、満足な方法で得ることはできなかった。
これらの理由から、本発明者らは、かかる担体を製造することを目的として本発明の主題を成すものを開発した。そこで、本発明の第1の主題は、固体担体の表面上に糖鎖モノマーを順次連結することにより、糖鎖等のサッカリド型分子をin situ合成するための方法である。上記表面は水酸官能基で修飾されており、当該方法は、
a)保護基Pで保護された少なくとも一つの水酸官能基を有する第1の糖鎖モノマー(第1のサッカリド部分SM1)を溶媒中に含む溶液と、表面の少なくとも一つの区域A1と、を接触させることにより、第1のサッカリド部分SM1を表面水酸官能基に結合させることと、
b)固体担体の表面を以下の化学式(I)で示される少なくとも一つの化合物と接触させることにより、未反応の表面水酸官能基を不活性化することと、を含む。
ここで:
‐Y1及びY2は、同じでも異なってもよく、水素原子、ハロゲン原子、C1〜C4アルコキシラジカル、直鎖もしくは分岐C1〜C4アルキルラジカル、チオ(C1〜C4)アルキルラジカル、ニトロ基、アジド基、トリフルオロ(C1〜C4)アルキルラジカル、シアノ基、又はアリール環を表し;
‐Y1及びY2は、同じでも異なってもよく、水素原子、ハロゲン原子、C1〜C4アルコキシラジカル、直鎖もしくは分岐C1〜C4アルキルラジカル、チオ(C1〜C4)アルキルラジカル、ニトロ基、アジド基、トリフルオロ(C1〜C4)アルキルラジカル、シアノ基、又はアリール環を表し;
‐nは、1以上4以下の範囲の整数であり;
‐Xは、ハロゲン原子、トリクロロアセトイミド基、R1が直鎖もしくは分岐C1〜C4アルキルラジカルを表すキサンテート基−SC=SOR1、チオ(C1〜C4)アルキル基、チオアリール基、リン酸基、亜リン酸基、セレノ(C1〜C4)アルキル基、セレノアリール基、C1〜C5アルコキシラジカル、並びにR2が直鎖もしくは分岐C1〜C4アルキルラジカルもしくはアリール環を表すスルホキシド基‐S(O)‐R2からなる群から選択される。
但し、Y1及びY2の一方が水素を表し、Y1及びY2の他方がメトキシラジカルであるとき、メトキシラジカルは−(CH2)n−X鎖をもつ炭素原子に対してパラ位にはない。
さらに、当該方法は、c)所定のサッカリド配列の複数のサッカリド型分子が得られるまで結合ステップa)を繰り返すことにおいて、各々の結合ステップa)は、表面の少なくとも一つの選択区域A2、A3、A4・・・、Am上で行われ、上記区域A2、A3、A4・・・、Amは先行する結合ステップの区域と同一又は少なくとも部分的に異なり、保護基Pにより保護された少なくとも一つの水酸基をもつ糖鎖モノマー(サッカリド部分)SM1、SM2、SM3、SM4、・・・、SMmを用い、上記サッカリド部分は先行する結合ステップの間に結合されたサッカリド部分と同一であるか又は異なり、各々の結合ステップa)の後に、先行する結合ステップの間に結合されたサッカリド部分の少なくとも一つの水酸基から保護基Pを除去するサブステップが続くステップと、
d)保護基Pでまだ保護されているサッカリド型分子の水酸基を脱保護するステップと、を含む。
固体担体の表面の水酸官能基を不活性化するために用いる化学式(I)の化合物は、種々のサッカリド部分の結合ステップの間に用いられる条件と両立するものである。したがって、それらは、サッカリド部分の水酸官能基の保護基Pを除去するために用いる条件に反応しないため、糖合成の間に表面から除去されない。そのため、化学式(I)の化合物で不活性化された水酸官能基は、糖合成の間ずっと保護されたままであるため、反応性が非常に低い表面をもつ担体を取扱うことも可能になり、信号/ノイズ比が向上する。
よって、このプロセスにより、信号/ノイズ比が向上した糖鎖チップを再現性のある方法かつ許容できるコストで容易に得ることが可能となり、サッカリド又はタンパク質分子の高感度スクリーニング、及び/又は目的とするタンパク質との相互作用の検出が可能となる。
本発明の形態において使用されうる固体担体の性質は、重要ではない。しかし、個体担体の材料には、ガラス、シリカ、又は水酸官能基により修飾できることが当業者に知られた任意の材料を用いることが好ましい。固体担体は、少なくとも一つの平坦もしくは非平坦、並びに平滑もしくは構造をもつ表面を有し、例えば、スライド、平坦プレート、ウェル付きプレート、キャピラリー、又は多孔質もしくは無孔性ビーズの形状で提供することができる。
本発明の形態において、すでに水酸官能基をもつ表面を有する担体を用いてもよいし、水酸官能基を天然には持たず、したがって表面を水酸官能基で水酸化する予備ステップが必要な担体を用いてもよい。
この場合、本発明の形態に係る方法は、少なくとも選択領域上に水酸官能基により修飾された表面を得るために、固体担体の表面の少なくとも選択領域と、少なくとも一つの末端水酸官能基を持つスペーサを有機溶媒中に含む溶液と、を反応させることにより行われうる、表面の水酸化の予備ステップを備える。
固体担体の表面を修飾するために用いる、少なくとも一つの末端水酸官能基をもつスペーサは、好ましくはその一端に少なくとも一つの水酸官能基をもつシラン処理剤から選ぶことが有利である。かかるシラン処理剤は、より詳しくは次の化学式(II‐a)又は化学式(II‐b)で示される化合物である:
M‐(CH2)x‐O‐R6 (II‐a)
M‐(CH2)x‐R7 (II‐b)
M‐(CH2)x‐R7 (II‐b)
ここで:
‐Mは、シラン化された(silanized)基−Si(R3)3、−SiR3(R4)2又はSiR3R4R5を表す。なおR3、R4、及びR5は各々独立に、水素もしくはフッ素及び塩素のようなハロゲン原子、(C1〜C4)アルコキシラジカル、(C1〜C4)アルキルラジカル又はクロロ(C1〜C4)アルキルラジカルを表す;
‐Mは、シラン化された(silanized)基−Si(R3)3、−SiR3(R4)2又はSiR3R4R5を表す。なおR3、R4、及びR5は各々独立に、水素もしくはフッ素及び塩素のようなハロゲン原子、(C1〜C4)アルコキシラジカル、(C1〜C4)アルキルラジカル又はクロロ(C1〜C4)アルキルラジカルを表す;
‐xは、1から20までを含む範囲の整数である;
‐R6は、水酸基の保護基を表す;
‐R7は、エポキシ基のような、少なくとも一つの水酸基を含む群の前駆体を表す。
R6の水酸保護基には、例えば、メトキシメチルエーテル(MOM)及びジ(p‐メトキシフェニル)メチルエーテル(DMT)のようなエーテル基;アセチル基、並びにさらに一般的にはT.W.グリーン(Greene)ら、第2版,ワイリー・インターサイエンス(Wiley Interscience)が挙げるような、水酸基に対するすべての保護基が使用可能である。
かかるシラン処理剤のうち、特に5,6‐エポキシヘキシルトリエトキシシラン及びトリフルオロメトキシウンデカントリメトキシシランが好ましい。
シラン処理ステップの間に用いる有機溶媒は、例えばトリクロロエチレン及びトルエンから選ぶことができ、トリクロロエチレンが特に好ましい。
ステップa)及びステップc)に用いることができるサッカリド部分の性質は、糖鎖チップに望まれるサッカリド型分子の最終的な性質に依存することになる。
サッカリド部分は、以下から選ぶことができる:
i)単糖類、特にグルコサミン、アジドグルコサミン、D‐リボース、D‐キシロース、D‐アラビノース、D‐グルコース、D‐ガラクトース、D‐マンノース、2‐デオキシリボース、L‐フコース、N‐アセチル‐D‐グルコサミン、N‐アセチル‐D‐ガラクトサミン、N‐アセチルノイラミン酸、D‐グルクロン酸、L‐イズロン酸、D‐ソルビトール、D‐マンニトール、グルコシド等;
ii)スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース及びセロビオース、グルコピラノシドなどのような、グルコシド結合により結合した二つの単糖類の組み合わせから形成される二糖類;
iii)3から9までのサッカリド単位をもち、特にヘパランスルファートのフラグメント、ヘパリン、コンドロイチン、及びデルマタンスルファートのサッカリドフラグメント、ルイス抗原等から由来のオリゴ糖類。
上述のように、サッカリド部分の少なくとも一つの水酸基は、保護基Pで保護される。これらの保護基は、当業者によく知られており、T.W.グリーンらによる著作「有機化学における保護基」(Protective Groups in Organic Chemistry),第2版,ワイリー・インターサイエンス出版,1991に十分に記載されている。
加えて、サッカリド部分の一つ又はそれ以上のアミン官能基及び/又はカルボキシル基も、一つ又はそれ以上の保護基により保護してもよい。これらの保護基も、当業者によく知られており、先に引用したT.W.グリーンらの著作に十分に記載されている。
本発明の有利な形態によれば、これらの保護基は、次の群から選ばれる:アセチル;p‐メトキシベンジル;アリル、特に1から40までの炭素原子をもつアルキル鎖から選ばれるRラジカルにより置換されたアリル基;2,2,2‐トリクロロエチルオキシカルボニル(Troc);ベンジルオキシカルボニル(Z);トリクロロアセトアミダート(TCA);tert‐ブチルオキシカルボニル(BOC)及びフルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)。それらは、化学式(II−a)及び化学式(II−b)の化合物におけるR6の例として挙げた保護基から選ぶこともできる。
ステップa)及びc)の間に用いる溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ジエチルエーテル、及びトルエンから選ぶことができる。
本発明の形態において、化学式(I)の化合物におけるY1、Y2及びXに対して指定されるハロゲン原子は、塩素、ヨウ素、臭素及びフッ素原子から選ぶことができ、塩素及びフッ素原子が好ましい。
化学式(I)の化合物におけるY1及びY2に対して挙げられるC1〜C4アルコキシラジカルのうち、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、n‐ブチルオキシ及びt‐ブチルオキシ基を挙げることができ、メチルオキシ基が好ましい。
化学式(I)の化合物におけるXに対して挙げられるC1〜C5アルコキシラジカルのうち、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、n‐ブチルオキシ及びt‐ブチルオキシ、並びにn‐ペンチルオキシ基を挙げることができ、メチルオキシ基が好ましい。
化学式(I)の化合物におけるY1、Y2及びXに対して指定される直鎖及び分岐C1〜C4アルキルラジカルのうち、メチル、エチル、プロピル、n‐ブチル及びt‐ブチルラジカルを挙げることができる。
化学式(I)の化合物におけるY1、Y2及びXに対して指定されるチオ(C1〜C4)アルキルラジカルのうち、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、n‐ブチルチオ及びt‐ブチルチオラジカルを挙げることができ、メチルチオ及びエチルチオラジカルが好ましい。
化学式(I)の化合物におけるY1及びY2に対して挙げられるトリフルオロ(C1〜C4)アルキルラジカルのうち、トリフルオロメチルラジカルが特に好ましい。
化学式(I)の化合物におけるY1、Y2及びXに対して挙げられるアリル、チオアリル、及びセレノアリル基のうち、フェニル、チオフェニル及びセレノフェニル基が特に好ましい。
本発明の好ましい実施形態の化学式(I)において、
i)n=1、Y1及びY2の一方が水素原子であり、Y1及びY2の他方が水素又はハロゲン原子、C1〜C4アルコキシラジカル、チオ(C1〜C4)アルキルラジカル又はシアノ又はアジド基であり、Xがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド又はチオ(C1〜C4)アルキル基であるか、
ii)n=1、Y1及びY2が同じで、C1〜C4アルコキシラジカル又はC1〜C4アルキルラジカルを表し、Xがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド基又はチオ(C1〜C4)アルキル基を表しているか、
iii)n=2、Y1及びY2の一方が水素原子であり、Y1及びY2の他方が水素又はハロゲン原子、C1〜C4アルコキシラジカル又はシアノ又はアジド基であり、Xがトリクロロアセトイミド基であるか、
iv)n=2、Y1及びY2が同じで、C1〜C4アルコキシラジカルを表し、Xがトリクロロアセトイミド基を表している。
化学式(I)の具体的な化合物のうち、以下の化合物が特に好ましい。
‐2,2,2‐トリクロロアセトイミド酸ベンジルエステル(X=トリクロロアセトイミド酸、Y1=Y2=H、n=1);
‐ベンジルクロリド(X=Cl、Y1=Y2=H、n=1);
‐ベンジルブロミド(X=Br、Y1=Y2=H、n=1);
‐2‐(トリフルオロメチル)ベンジルブロミド(X=Br、Y1=H、Y2=CF3、n=1);
‐3,5‐ジ‐(tert‐ブチル)ベンジルブロミド(X=Br、Y1=Y2=tert‐ブチル、n=1);及び
‐4‐(メチルチオ)ベンジルクロリド(X=Cl、Y1=H、Y2=CH3S、n=1)。
化学式(I)の化合物は、市販されているか、又は、特に「有機合成における保護基」(Protective groups in organic synthesis),第3版,セオドラ(Theodora) W.グリーン(Green),ピーター(Peter) GM ウッツ(Wuts) 著作権1999,ジョン・ワイリー&サンズ社(John Wiley&Sons,Inc)に記載される方法に従って容易に調製することができる。
本発明の具体的かつ好ましい実施形態によれば、固体担体のすべての表面は、表面水酸官能基により修飾されている。この場合、ステップa)の前に、以下のサブステップを備えるマスキング/脱マスキングステップが先行することが好ましい。
1)溶媒が蒸発した後に選択領域上に固体ポリマーのキャップが形成されるように、有機溶媒中に溶解した上記ポリマーの液滴をマイクロ堆積することにより、水酸化された表面の少なくとも一つの選択領域に少なくとも一つの保護ポリマーを堆積すること、
2)固体担体の表面の固体ポリマーのキャップで被覆されていない領域の水酸基を、上述のように規定した化学式(I)で示される少なくとも一つの化合物で保護すること、及び
3)選択領域上における保護ポリマーからなる固体ポリマーのキャップを、有機溶媒中において上記固体キャップを溶解することにより除去すること。
本発明の特定の実施形態は、複数のマイクロウェルを有するプレート形状の固体担体によく適しており、これらのマイクロウェルが保護ポリマーで被覆された選択領域に対応する。
本発明のこのような特定の実施形態は、ステップa)の間に選択領域をさらに機械的にアドレッシングスする必要はなく、次のステップc)の間に固体担体のすべての表面を上記サッカリド部分の溶液に単に浸漬することにより、サッカリド部分の結合を選択領域にだけ生起させることができて有利である。
本発明のまた別の特定の実施形態によれば、固体担体の表面の選択領域は、ステップa)の前、及び/又は各ステップc)の前及び合間に行うマスキング/脱マスキングステップに従って、少なくとも一つの保護ポリマーによりマスクすることもできる。かかるマスキング/脱マスキングステップは、固体担体の表面の選択領域のマスキング/脱マスキングステップによりそれぞれ分離された担体全体を異なるサッカリド部分の溶液に順次浸漬することにより、異なるサッカリド配列を同じ表面上に合成することを可能にする。
この実施形態によれば、マスキング/脱マスキングステップは、少なくとも二つのサブステップに分割され、マスキングサブステップは、ステップa)の前、及び/又は各ステップc)の前及び合間に行い、次に脱マスキングステップは、ステップa)の後、及び/又は各ステップc)の後に行う。このマスキング/脱マスキングステップは、次のサブステップを備える。
1)溶媒が蒸発した後に選択領域上に固体ポリマーのキャップが形成されるように、上記ポリマーの液滴のマイクロ堆積により、固体担体の表面の少なくとも一つの選択領域上に少なくとも一つの保護ポリマーを堆積するマスキングサブステップ、
2)上述のステップa)に従って第1のサッカリド部分を結合すること、及び/又は上述のステップc)に従ってさらなるサッカリド部分を結合すること、及び
3)有機溶媒中で上記固体キャップを溶解することにより、選択領域上の保護ポリマーの固体キャップを除去する脱マスキングサブステップ。
保護ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリビニルカルバゾール、ポリイミド、及びその誘導体のポリマーにより形成される群から選択することができる。保護ポリマーは、ステップa)の前の担体の表面の水酸化の間に反応に用いる溶媒にも、ステップa)及びc)のサッカリド部分の結合の間に用いる溶媒にも溶解しない。
これらのポリマーのうち、ポリスチレン、ポリビニルカルバゾール、ポリイミド、及びポリエチレンオキサイドと比較してジクロロメタンに溶解しないポリビニルアルコール及びポリヒドロキシスチレン類が、保護ポリマーとして特に好ましい。なお、ポリヒドロキシスチレン類とは、ポリヒドリキシスチレン、及びポリヒドロキシスチレンを骨格として、官能基を付加したものをいう。
マスキングサブステップの終りに、溶媒の蒸発を加速する一方で、保護ポリマーキャップの付着性を向上させるために、50から80℃の温度で担体のアニールを一般的に行う。
保護ポリマーのキャップを溶解するために、脱マスキングサブステップの間に用いる有機溶媒は、担体表面上にすでにグラフトされたサッカリド部分に不活性でなければならない。この溶媒は、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、アセトン及びジメチルスルホキシド(DMSO)からなる群から選ばれる。
本発明のまた別の特定の実施形態によれば、固体担体の表面にすでにグラフトされたサッカリド部分上に存在し、その後の結合ステップの間にさらなるサッカリド部分と反応しなかった未反応の水酸基を不活性化するステップは、サッカリド部分の結合ステップc)の各々の繰り返しの間に、化学式(I)で示される少なくとも一つの化合物を用いて行う。これらの繰り返し不活性化ステップは、糖鎖チップの製造の間に切詰められたサッカリド配列が成長するのを防止するのに役立つ。
本発明の形態に係るプロセスは、好ましくは、合成の終りにサッカリド型分子を活性化するさらなるステップを備え、この活性化ステップは、グリコサミノグリカンに対して、さらに担体上に存在するサッカリド型分子とタンパク質間の認識を可能にするのに特に有用である。
この活性化ステップは、サッカリド部分の水酸/アミン/カルボキシル官能基上に存在する異なる保護基を除去することからなる。保護基の除去は、当業者に知られるように、言うまでもなく、それらの性質に適応させられる。したがって、活性化は、保護基の特質に依存して脱アセチル化、脱ベンジル化などにより行うことができる。一例として、保護基がp‐メトキシベンジル基のとき、活性化ステップは、好ましくは担体を室温で約15分の間テトラヒドロフランに浸漬することにより行うことができる。
本発明のまた別の主題は、一つ又はそれ以上のサッカリド型分子により機能化された少なくとも一つの表面を備える固体担体であり、上記担体は本発明の製造プロセスに従って得られることを特徴とする。
かかる担体は、例えば、サッカリド分子、及び、特に、例えば国際公開第03/008927号に記載される方法を用いて、有益な特定タンパク質を認識するオリゴ糖配列を、スクリーニングにより、特定するために用いることができる糖鎖チップの構成要素を成す。
本発明の形態に係る固体担体は、例えば有益なサッカリドを認識するタンパク質リガンドを、スクリーニングにより特定するためにも用いることができる。
したがって、本発明の付加的な主題は、サッカリド部もしくはタンパク質分子をスクリーニングにより特定するために、又はサッカリド/タンパク質相互作用を研究するために、上述のように規定した少なくとも一つの固体担体を利用することである。
その結果、本発明の最終的な主題は、サッカリド分子と、特にオリゴ糖配列もしくはそれぞれタンパク質リガンドをスクリーニングするためのプロセスであって、少なくとも一つのサッカリド型分子により官能化された少なくとも一つの表面を備えており、上述のように規定された本発明の形態に係る製造プロセスに従って作製された固体担体を、一つもしくはそれ以上の潜在的なサッカリド分子、特にオリゴ糖分子、又はそれぞれ一つもしくはそれ以上の潜在的なタンパク質を含む溶液と接触させる、少なくとも一つの段階を備えることを特徴とする。
これらの具体的な応用において、本発明の形態に係る官能化された個体担体は、担体の表面への固定化が望まれる目的分子以外の分子の非特異的吸着を回避又は制限することにより、スクリーニングプロセスを最適化すること、及びそれにより、治療又はバイオテクノロジ目的で、分子をより効果的、かつより迅速に入手することを可能にする。
本発明によれば、目的タンパク質を再現性及び感度のいい方法で固定化すること、及び信号/ノイズ比を制限することにより信号検出することを可能にするサッカリド型分子で官能化された個体担体を満足な方法で得ることが可能となる。
本発明の実施の形態は、上述の提供物に加えて、いずれも本発明の実施の形態に係るプロセスに従い、以下の添付図によるマンノースチップの作製例、グリコサミノグリカンチップの作製例に言及する以下の記載から明らかになる他の提供物も備える。しかし、当然のことながらこれらの例は、本発明の主題の説明のためだけに示したものであり、いかなる状況においてもこれに限定を加えるものではない。
(実施例1)
本発明の実施例1に係る製造プロセスによる糖鎖チップの作製‐本発明の比較例1に係るプロセスにより作製した糖鎖チップとの比較
以下、説明するように、本発明の実施例1に係る作製方法により、サッカリド部分としてのマンノース誘導体、及び化学式(I)の不活性化化合物としてベンジル‐2,2,2‐トリクロロアセトイミド酸(Bn‐OTCA)を用いて、実施例1に係るマンノースチップMC1を作製した。また、比較を目的として、サッカリド部分として同じマンノース誘導体を用いるが、Bn‐OTCAを化学式(I)の化合物とは異なる不活性化化合物、すなわち、2,3,4,6‐テトラ‐O‐ベンジル‐α‐D‐グルコピラノシルトリクロロアセトイミド酸(Bn‐グルコース‐OTCA)に替えた、本発明の比較例1に係るマンノースチップMC2も作製した。
本発明の実施例1に係る製造プロセスによる糖鎖チップの作製‐本発明の比較例1に係るプロセスにより作製した糖鎖チップとの比較
以下、説明するように、本発明の実施例1に係る作製方法により、サッカリド部分としてのマンノース誘導体、及び化学式(I)の不活性化化合物としてベンジル‐2,2,2‐トリクロロアセトイミド酸(Bn‐OTCA)を用いて、実施例1に係るマンノースチップMC1を作製した。また、比較を目的として、サッカリド部分として同じマンノース誘導体を用いるが、Bn‐OTCAを化学式(I)の化合物とは異なる不活性化化合物、すなわち、2,3,4,6‐テトラ‐O‐ベンジル‐α‐D‐グルコピラノシルトリクロロアセトイミド酸(Bn‐グルコース‐OTCA)に替えた、本発明の比較例1に係るマンノースチップMC2も作製した。
1)材料、方法及び試薬
a)糖溶液:
次の化学式をもつ10mgのマンノース誘導体を1mLのジクロロメタンに溶かした溶液を調製した。
a)糖溶液:
次の化学式をもつ10mgのマンノース誘導体を1mLのジクロロメタンに溶かした溶液を調製した。
このマンノース誘導体は、次の反応スキームAに従ってD‐マンノースの原料から調製することができる。
Acはアセチルを表し、D‐マンノースは、初めにピリジン(Py)の存在下で無水酢酸(Ac2O)によりアセチル化されてアセチル化D‐マンノース(収率90%)になる。第2ステップでジメチルホルムアミド(DMF)中においてヒドラジン(H2NNH2)及び酢酸(CH3COOH)の存在下でアノマー位が脱アセチル化されて1‐OH‐アセチル化D‐マンノース(収率77%)になる。次に反応のための触媒としてジアザビシクロ‐ウンデセン(DBU)を用い、ジクロロメタン(DCM)中においてトリクロロアセトニトリル(CCl3CN)の存在下でマンノース誘導体に変換される(収率65%)。
次に、10mgのマンノース誘導体を1mLのジクロロメタン(DCM)に溶解させることにより糖溶液を調製した。
b)不活性化溶液
次の不活性化溶液を用いた:
‐2mLのジクロロメタン(DCM)に100μLのBn‐OTCAを溶かした実施例に係る不活性化溶液PS1。
‐2mLのジクロロメタン(DCM)に10mgのBn‐グルコース‐OTCAを溶かした比較例に係る不活性化溶液PS2。
次の不活性化溶液を用いた:
‐2mLのジクロロメタン(DCM)に100μLのBn‐OTCAを溶かした実施例に係る不活性化溶液PS1。
‐2mLのジクロロメタン(DCM)に10mgのBn‐グルコース‐OTCAを溶かした比較例に係る不活性化溶液PS2。
c)マスキングポリマー溶液
ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解した5重量%のポリヒドロキシスチレン(PHS)を含むマスキングポリマー溶液も調製した。
ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解した5重量%のポリヒドロキシスチレン(PHS)を含むマスキングポリマー溶液も調製した。
d)マンノースチップの作製
実施例1に係るマンノースチップMC1と比較例1に係るマンノースチップMC2は、次のプロセスに従って作製した:
実施例1に係るマンノースチップMC1と比較例1に係るマンノースチップMC2は、次のプロセスに従って作製した:
i)チップ表面の水酸化
厚さ500nm、寸法1×1cmで、24個のマイクロウェル(直径650μm、深さ15μm及びマイクロウェル間ステップ1500)をもつ構造化された熱酸化シリコン(Si/SiOt)からなる二つの基板を、まず水酸化ナトリウム溶液(NaOH 12g/水50mL/エタノール50mL)に浸漬することにより水和し、2時間攪拌し、水に続いてエタノールですすぎ、80℃で15分間乾燥させた。
厚さ500nm、寸法1×1cmで、24個のマイクロウェル(直径650μm、深さ15μm及びマイクロウェル間ステップ1500)をもつ構造化された熱酸化シリコン(Si/SiOt)からなる二つの基板を、まず水酸化ナトリウム溶液(NaOH 12g/水50mL/エタノール50mL)に浸漬することにより水和し、2時間攪拌し、水に続いてエタノールですすぎ、80℃で15分間乾燥させた。
基板は、次にシラン溶液(トルエン30mL及びトリエチルアミン430μL中に5,6‐エポキシヘキシルトリエトキシシラン137μL)に80℃で一晩の間浸すことによりシラン処理した。基板は、次に、110℃で3時間ベーキングする前にエタノール、ジクロロメタン(DCM)、さらに超音波下において5分間クロロホルムですすいだ。
シラン処理ステップの終りに、シランのエポキシド部分を対応するジオールに変換するために、5%硫酸を含む水溶液に浸し、室温で2時間攪拌し、水、エタノール、さらに超音波下において5分間水ですすいだ。
ii)マスキングステップ
各基板のウェルを、ウェル毎に30滴のマスキングポリマー溶液を注入することによりマスキングした。マスキングポリマー溶液のポリヒドロキシスチレン(PHS)を固化するために、80℃で2分間基板をベーキングした。次に、各ウェルに再度20滴、その後80℃で2分間ベーキングする前に10滴のマスキングポリマー溶液を埋め合わせた。このようにして、各ウェルを被覆した固体ポリヒドロキシスチレン(PHS)キャップを備える基板が得られた。
各基板のウェルを、ウェル毎に30滴のマスキングポリマー溶液を注入することによりマスキングした。マスキングポリマー溶液のポリヒドロキシスチレン(PHS)を固化するために、80℃で2分間基板をベーキングした。次に、各ウェルに再度20滴、その後80℃で2分間ベーキングする前に10滴のマスキングポリマー溶液を埋め合わせた。このようにして、各ウェルを被覆した固体ポリヒドロキシスチレン(PHS)キャップを備える基板が得られた。
iii)チップ表面の水酸基の不活性化ステップ
マスキングした二つの基板の一方は2mLの実施例に係る不活性化溶液PS1に浸漬し、他方は2mLの比較例に係る不活性化溶液PS2に浸漬した。次にジクロロメタン(DCM)100μLに5μLのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(TMSOTf)を加えた溶液40μLを各々の不活性化溶液に加えた。基板を不活性化溶液に浸漬したまま室温で攪拌しながら1時間放置した。次に、基板を乾燥する前にジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、エタノール及び最後に超音波下において5分間クロロホルムですすいだ。
マスキングした二つの基板の一方は2mLの実施例に係る不活性化溶液PS1に浸漬し、他方は2mLの比較例に係る不活性化溶液PS2に浸漬した。次にジクロロメタン(DCM)100μLに5μLのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(TMSOTf)を加えた溶液40μLを各々の不活性化溶液に加えた。基板を不活性化溶液に浸漬したまま室温で攪拌しながら1時間放置した。次に、基板を乾燥する前にジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、エタノール及び最後に超音波下において5分間クロロホルムですすいだ。
iv)ポリヒドロキシスチレン(PHS)キャップの除去
基板をテトラヒドロフランに浸漬することにより固化したポリヒドロキシスチレン(PHS)キャップを除去した。3分間の超音波ステップの後、基板をエタノールですすぎ、乾燥させた。
基板をテトラヒドロフランに浸漬することにより固化したポリヒドロキシスチレン(PHS)キャップを除去した。3分間の超音波ステップの後、基板をエタノールですすぎ、乾燥させた。
v)糖結合ステップ
基板を糖溶液に浸漬し、100μLのジクロロメタン(DCM)に2μLのトリメチルシリルトリフラート(TMS‐OTf)を加えた溶液10μLを各々の浸漬した基板に加えた。反応媒質を室温で30分間攪拌した。次に、基板をジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、エタノール、及び最後に超音波下において5分間クロロホルムですすいだ。メタノール中に1mol/Lでナトリウムメタノラートを含む溶液40μLに基板を浸漬し、室温で30分間攪拌した。最後に、基板をメタノールで及びエタノールで超音波下において5分間すすいだ。
基板を糖溶液に浸漬し、100μLのジクロロメタン(DCM)に2μLのトリメチルシリルトリフラート(TMS‐OTf)を加えた溶液10μLを各々の浸漬した基板に加えた。反応媒質を室温で30分間攪拌した。次に、基板をジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、エタノール、及び最後に超音波下において5分間クロロホルムですすいだ。メタノール中に1mol/Lでナトリウムメタノラートを含む溶液40μLに基板を浸漬し、室温で30分間攪拌した。最後に、基板をメタノールで及びエタノールで超音波下において5分間すすいだ。
vi)マンノースによるレクチン認識
基板を5mLの緩衝液A(緩衝液A=リン酸緩衝生理食塩水(PBS)0.01mol/L、0.05%のTween(登録商標)20を含みpH7.4)に30mgのウシ血清アルブミン(BSA)を溶かした溶液に浸漬し、室温で1時間攪拌した。
基板を5mLの緩衝液A(緩衝液A=リン酸緩衝生理食塩水(PBS)0.01mol/L、0.05%のTween(登録商標)20を含みpH7.4)に30mgのウシ血清アルブミン(BSA)を溶かした溶液に浸漬し、室温で1時間攪拌した。
緩衝液Aによるすすぎステップの後、基板を2mLのレクチン溶液(緩衝液B(緩衝液B=PBS 0.01mol/L、Ca2+ 0.01mmol/L及びMn2+ 0.1mmol/Lを含む)中の、参照C2272の下、凍結乾燥粉末としてシグマアルドリッチ社が販売するカナバリア・エンシフォルミス(Canavalia ensiformis)(タチナタマメ)からのコンカナバリンAとビオチンの複合体、タイプIV:5μL)に浸漬した。基板を37℃で1時間放置した。
緩衝液Aによる新たなすすぎステップの後、基板をストレプトアビジン‐Cy3の溶液(緩衝液R(緩衝液R=PBS 0.01mol/L、NaCl 0.5mol/L及び0.05%のTween(登録商標)20を含む)5μL中にCy3‐ストレプトアビジン2μg)に浸漬した。基板を室温で暗所に20分間放置し、次に緩衝液Aですすぎ、乾燥させた。
vii)蛍光信号の測定
レーザを用いた高スループットのバイオチップイメージャー及び分析器である、GeneTAC(登録商標)LS IV バイオチップ・アナライザ(Biochip Analyzer)(Genomic Solutions(登録商標))を用いて基板をスキャンした。
FITCレクチャー(λexcitation=498nm;λemission=518nm)
レーザパワーPW=42%
レーザを用いた高スループットのバイオチップイメージャー及び分析器である、GeneTAC(登録商標)LS IV バイオチップ・アナライザ(Biochip Analyzer)(Genomic Solutions(登録商標))を用いて基板をスキャンした。
FITCレクチャー(λexcitation=498nm;λemission=518nm)
レーザパワーPW=42%
2)結果
このようにして得られた結果に対応する写真を図1に示す。
このようにして得られた結果に対応する写真を図1に示す。
これらの結果は、基板の水酸基の不活性化を化学式(I)の化合物で行う本発明の実施例1に係るプロセスは、化学式(I)の化合物とは異なる化合物を含む比較例に係る不活性化溶液を用いて作製したマンノースチップ(MC‐2)をスキャンした時に得られる像と比較して、改良された信号/ノイズ比を示すマンノースチップ(MC‐1)をもたらすことを示した。具体的には、図1の右側に示す実施例1に係るマンノースチップ(MC−1)のバックグラウンドは、図1の左側に示す比較例1に係るマンノースチップ(MC−2)のバックグラウンドより顕著に暗かった。
(実施例2、3)
本発明の実施例2に係る製造プロセスによるグリコサミノグリカンチップの作製‐本発明の比較例2に係るプロセスにより作製したグリコサミノグリカンチップとの比較
上述した実施例に係る不活性化溶液PS1及び以下に規定する特定構造の糖ユニットを用いる本発明の実施例2に係る作製プロセスにより、グリコサミノグリカンチップ(GAG‐C1)を作製した。
本発明の実施例2に係る製造プロセスによるグリコサミノグリカンチップの作製‐本発明の比較例2に係るプロセスにより作製したグリコサミノグリカンチップとの比較
上述した実施例に係る不活性化溶液PS1及び以下に規定する特定構造の糖ユニットを用いる本発明の実施例2に係る作製プロセスにより、グリコサミノグリカンチップ(GAG‐C1)を作製した。
比較を目的として、上述した比較例に係る不活性化溶液PS2を用いる本発明の比較例2に係るグリコサミノグリカンチップ(GAG‐C2)も作製した。
1)材料及び方法
a)糖溶液:
対応するグリコサミノグリカンを固体担体上に合成するために、糖ユニットとしてトリクロロアセトイミド酸メチル 2―O―アセチル‐3‐O‐ベンジル‐4‐O‐(4‐メトキシベンジル)‐α‐L‐イドピラノシルウロナート)‐(1→4)‐O‐6‐O‐アセチル‐2‐アジド‐3‐O‐ベンジル‐2‐デオキシ‐D‐グルコピラノシドを用いた。この糖ユニット(GAG)は、以下の化学構造を有する。
a)糖溶液:
対応するグリコサミノグリカンを固体担体上に合成するために、糖ユニットとしてトリクロロアセトイミド酸メチル 2―O―アセチル‐3‐O‐ベンジル‐4‐O‐(4‐メトキシベンジル)‐α‐L‐イドピラノシルウロナート)‐(1→4)‐O‐6‐O‐アセチル‐2‐アジド‐3‐O‐ベンジル‐2‐デオキシ‐D‐グルコピラノシドを用いた。この糖ユニット(GAG)は、以下の化学構造を有する。
この糖ユニットの合成は、すでにボナフェ(Bonnaffe)ら,ユーロピアン ジャーナル オブ オーガニック ケミストリ(European Journal of Organic Chemistry),2003,3603‐3620及びA.ルビノー(Lubineau)ら,ケミカル ユーロピアン ジャーナル(Chemical European Journal),2004,10,4265‐4282による論文に報告されている。
この糖溶液を、8mgの糖ユニット(GAG)を500mLのジクロロメタン(DCM)に溶解させて調製した。
b)不活性化溶液
実施例に係る不活性化溶液PS1及び比較例に係る不活性化溶液PS2を用いた。
実施例に係る不活性化溶液PS1及び比較例に係る不活性化溶液PS2を用いた。
c)マスキングポリマー溶液
上述の実施例1のように、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解させた重量5%のポリヒドロキシスチレン(PHS)を含むマスキングポリマー溶液を用いた。
上述の実施例1のように、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解させた重量5%のポリヒドロキシスチレン(PHS)を含むマスキングポリマー溶液を用いた。
d)グリコサミノグリカンチップの作製
実施例2に係るグリコサミノグリカンチップGAG‐C1及び比較例2に係るグリコサミノグリカンチップGAG‐C2は、次のプロセスにより作製した:グリコサミノグリカンチップを作製するための反応スキーム(スキームB)を添付図2に示す。
実施例2に係るグリコサミノグリカンチップGAG‐C1及び比較例2に係るグリコサミノグリカンチップGAG‐C2は、次のプロセスにより作製した:グリコサミノグリカンチップを作製するための反応スキーム(スキームB)を添付図2に示す。
この実施例では、実施例1と同じ構造化された酸化シリコン基板を用いた。
i)チップの表面水酸化
チップのすべての表面は、上述の実施例1に開示したプロセスに従って初めに水酸化した。
チップのすべての表面は、上述の実施例1に開示したプロセスに従って初めに水酸化した。
ii)マスキングステップ
各チップのウェルを、上述の実施例1に記載したようにポリヒドロキシスチレン(PHS)溶液でマスキングした。
各チップのウェルを、上述の実施例1に記載したようにポリヒドロキシスチレン(PHS)溶液でマスキングした。
このようにして、各ウェルを覆う固体ポリヒドロキシスチレン(PHS)のキャップを備えるチップが得られた。
iii)チップ表面の水酸基の不活性化ステップ
一方のチップ上で実施例に係る不活性化溶液PS1を用い、他方のチップ上で比較例に係る不活性化溶液PS2を用いる不活性化ステップを上述の実施例1に記載したように行った。
一方のチップ上で実施例に係る不活性化溶液PS1を用い、他方のチップ上で比較例に係る不活性化溶液PS2を用いる不活性化ステップを上述の実施例1に記載したように行った。
iv)ポリヒドロキシスチレン(PHS)キャップの除去
固化したポリヒドロキシスチレン(PHS)のキャップを上述の実施例1に記載したプロセスに従って各ウェルから除去した。
固化したポリヒドロキシスチレン(PHS)のキャップを上述の実施例1に記載したプロセスに従って各ウェルから除去した。
v)グリコサミノグリカンの合成
GAGオリゴマーのチップ上への成長は、次のステップサイクルに従って行った。
GAGオリゴマーのチップ上への成長は、次のステップサイクルに従って行った。
‐ポリヒドロキシスチレン(PHS)マスキングステップ:チップの所定の選択領域のウェルを上述の実施例1に記載したプロセスに従って被覆した。
‐GAG結合ステップ:
500μLのジクロロメタン(DCM)に8mgのGAGを溶かした溶液を反応チャンバに注入した。合成室は−10℃に維持した。次にトリメチルシリルトリフラート(TMS−OTf)溶液を注入し(500μL中に1μL)、−10℃で1時間放置した。基板を次にジクロロメタン(DCM)ですすいだ。
500μLのジクロロメタン(DCM)に8mgのGAGを溶かした溶液を反応チャンバに注入した。合成室は−10℃に維持した。次にトリメチルシリルトリフラート(TMS−OTf)溶液を注入し(500μL中に1μL)、−10℃で1時間放置した。基板を次にジクロロメタン(DCM)ですすいだ。
不活性化ステップ:
最初のGAGをチップ上に固定したのち、一方のチップ上で実施例に係る不活性化溶液PS1、他方のチップ上で比較例に係る不活性化溶液PS2を用いる不活性化ステップを上述の実施例1に記載したように行い、チップ表面の未反応の水酸基を不活性化した。
最初のGAGをチップ上に固定したのち、一方のチップ上で実施例に係る不活性化溶液PS1、他方のチップ上で比較例に係る不活性化溶液PS2を用いる不活性化ステップを上述の実施例1に記載したように行い、チップ表面の未反応の水酸基を不活性化した。
四量体を得る場合には、その後、GAG結合ステップを1回行った。また、六量体を得る場合には、最初のGAG結合ステップ及び不活性化ステップの後、GAG結合ステップを2回繰り返した。
vi)グリコサミノグリカンの活性化
メチルエーテル置換/脱アセチル化
次にチップを2mLのベンジルアルコール(BnOH)中に40μLのナトリウムベンジラート(BnONa)を含む溶液に浸漬した。反応媒質を室温で一晩の間攪拌した。次にチップをメタノール及びエタノールで5分間超音波下においてすすいだ。
メチルエーテル置換/脱アセチル化
次にチップを2mLのベンジルアルコール(BnOH)中に40μLのナトリウムベンジラート(BnONa)を含む溶液に浸漬した。反応媒質を室温で一晩の間攪拌した。次にチップをメタノール及びエタノールで5分間超音波下においてすすいだ。
アジド還元
チップを次に1.2mLプロパンジチオール/1.5mLトリエチルアミン(Et3N)/6mLメタノールの溶液に浸漬した。反応媒質を室温で2日間攪拌した。チップを次にメタノール及びエタノールで5分間超音波下においてすすいだ。
チップを次に1.2mLプロパンジチオール/1.5mLトリエチルアミン(Et3N)/6mLメタノールの溶液に浸漬した。反応媒質を室温で2日間攪拌した。チップを次にメタノール及びエタノールで5分間超音波下においてすすいだ。
硫酸化
10mLのピリジンに200mgの三酸化硫黄を加えた溶液にチップを浸漬した。反応媒質を室温で1日間攪拌し、次に55℃の温度で1日間放置した。チップを次にエタノール、水、最後に超音波下において5分間エタノールですすいだ。
10mLのピリジンに200mgの三酸化硫黄を加えた溶液にチップを浸漬した。反応媒質を室温で1日間攪拌し、次に55℃の温度で1日間放置した。チップを次にエタノール、水、最後に超音波下において5分間エタノールですすいだ。
脱ベンジル化
チップをフラスコに入れ、15mLのプロパノール及び15mLの水の混合液中に10mgのPd‐ポリビニルピロリドン(Pd‐PVP)ナノ粒子を含む溶液に浸漬した。フラスコを閉じた後、大気圧の水素ガスを15分間加えた。フラスコを閉じたまま45℃の温度で1晩の間保持した。大気圧の水素ガスを再度15分間加え、フラスコを再度閉じたまま45℃の温度で一晩の間保持した。チップを次にエタノール、水、最後に超音波下において5分間エタノールですすいだ。
チップをフラスコに入れ、15mLのプロパノール及び15mLの水の混合液中に10mgのPd‐ポリビニルピロリドン(Pd‐PVP)ナノ粒子を含む溶液に浸漬した。フラスコを閉じた後、大気圧の水素ガスを15分間加えた。フラスコを閉じたまま45℃の温度で1晩の間保持した。大気圧の水素ガスを再度15分間加え、フラスコを再度閉じたまま45℃の温度で一晩の間保持した。チップを次にエタノール、水、最後に超音波下において5分間エタノールですすいだ。
vii)GAGによるHGFタンパク質認識
実施例1で上述したような5mLの緩衝液Aに30mgのBSAを加えたBSA溶液にチップを浸漬した。反応媒質を室温で1時間攪拌した。チップを緩衝液Aですすいだ後、PBS中の濃度が70nmol/LのHGF溶液(肝細胞増殖因子、ヒトH9661‐5μg)を数滴チップに適用した。チップをプラスチック小片で覆い、室温で2時間放置した。PBSで洗浄後、PBS中に0.1%のBSAを含む緩衝液で50倍に希釈した抗HGF(単クローン性抗HGF抗体、シグマ、H1896、1mLの緩衝液B中に5mg)溶液にチップを浸漬し、その溶液中に38℃の温度で1時間放置した。インキュベーションの終りに、チップを緩衝液Aで洗浄し、次にフルオレセインイソチオシアナート(FITC)でラベル付けした抗‐抗HGF溶液(抗マウスIgG FITC,シグマ,F5687‐5mL(PBS中に0.1%のBSAを含む緩衝液により溶液をさらに100倍希釈)に浸漬した。チップを再び38℃で1時間インキュベートした。インキュベーション時間の終りに、チップを緩衝液Aで洗浄し、PBSで湿らせ、上述の実施例1で用いたGeneTAC(登録商標)LS IV バイオチップ・アナライザによりスキャンした。
実施例1で上述したような5mLの緩衝液Aに30mgのBSAを加えたBSA溶液にチップを浸漬した。反応媒質を室温で1時間攪拌した。チップを緩衝液Aですすいだ後、PBS中の濃度が70nmol/LのHGF溶液(肝細胞増殖因子、ヒトH9661‐5μg)を数滴チップに適用した。チップをプラスチック小片で覆い、室温で2時間放置した。PBSで洗浄後、PBS中に0.1%のBSAを含む緩衝液で50倍に希釈した抗HGF(単クローン性抗HGF抗体、シグマ、H1896、1mLの緩衝液B中に5mg)溶液にチップを浸漬し、その溶液中に38℃の温度で1時間放置した。インキュベーションの終りに、チップを緩衝液Aで洗浄し、次にフルオレセインイソチオシアナート(FITC)でラベル付けした抗‐抗HGF溶液(抗マウスIgG FITC,シグマ,F5687‐5mL(PBS中に0.1%のBSAを含む緩衝液により溶液をさらに100倍希釈)に浸漬した。チップを再び38℃で1時間インキュベートした。インキュベーション時間の終りに、チップを緩衝液Aで洗浄し、PBSで湿らせ、上述の実施例1で用いたGeneTAC(登録商標)LS IV バイオチップ・アナライザによりスキャンした。
同じ条件であるが、PBS中のHGFの濃度が200nmol/LのHGF溶液を用いて同一の実験を行い、実施例3に係るグリコサミノグリカンチップGAG‐C’1及び比較例3に係るグリコサミノグリカンチップGAG−C’2を得た。
FITCレクチャー(λexcitation=498nm、λemission=518nm)
レーザパワーPW=42%
FITCレクチャー(λexcitation=498nm、λemission=518nm)
レーザパワーPW=42%
2)結果
結果を添付図3に報告する。
結果を添付図3に報告する。
結果は、本発明の実施例2に係る、すなわち、化学式(I)の不活性化化合物としてBn‐OTCAを用いるプロセスにより得られたグリコサミノグリカンチップ(GAG‐C1及びGAG‐C’1)は、化学式(I)の化合物とは異なる化合物を含む不活性化溶液を用いて作製した比較例2に係るグリコサミノグリカンチップ(GAG‐C2及びGAG‐C’2)をスキャンしたときに得られる像と比較したとき、信号/ノイズ比が改良されることを示した。具体的には、図3の右上に示す実施例2に係るグリコサミノグリカンチップ(GAG‐C1)のバックグラウンドは、図3の左上に示す比較例2に係るグリコサミノグリカンチップ(GAG‐C2)のバックグラウンドより顕著に暗かった。また、図3の右下に示す実施例3に係るグリコサミノグリカンチップ(GAG‐C1’)のバックグラウンドは、図3の左下に示す比較例3に係るグリコサミノグリカンチップ(GAG‐C2’)のバックグラウンドより顕著に暗かった。
Claims (15)
- 固体担体の表面上に糖鎖を合成するための方法であって、
保護基で保護された少なくとも一つの水酸基を有する第1の糖鎖モノマーを含む溶液と水酸官能基で修飾されている前記表面の少なくとも一つの区域とを接触させ、前記第1の糖鎖モノマーを前記表面の水酸官能基に結合させるステップと、
前記固体担体の前記表面を以下の化学式(I)で示される少なくとも一つの化合物と接触させ、前記表面の未反応の水酸官能基を不活性化するステップと、
前記第1の糖鎖モノマーの少なくとも一つの水酸基から前記保護基を除去するステップと、
所定の配列の糖鎖が得られるまで、前記第1の糖鎖モノマーに糖鎖モノマーを順次連結するステップと、
前記糖鎖中に残っている前記保護基で保護されている前記水酸基を脱保護するステップと、
を含む方法。
‐Y1及びY2は、同じでも異なってもよく、水素原子、ハロゲン原子、C1〜C4アルコキシラジカル、直鎖もしくは分岐C1〜C4アルキルラジカル、チオ(C1〜C4)アルキルラジカル、ニトロ基、アジド基、トリフルオロ(C1〜C4)アルキルラジカル、シアノ基、又はアリール環を表し;
‐nは、1以上4以下の範囲の整数であり;
‐Xは、ハロゲン原子、トリクロロアセトイミド基、R1が直鎖もしくは分岐C1〜C4アルキルラジカルを表すキサンテート基−SC=SOR1、チオ(C1〜C4)アルキル基、チオアリール基、リン酸基、亜リン酸基、セレノ(C1〜C4)アルキル基、セレノアリール基、C1〜C5アルコキシラジカル、並びにR2が直鎖もしくは分岐C1〜C4アルキルラジカルもしくはアリール環を表すスルホキシド基‐S(O)‐R2からなる群から選択される。
但し、Y1及びY2の一方が水素を表し、Y1及びY2の他方がメトキシラジカルであるとき、前記メトキシラジカルが−(CH2)n−X鎖をもつ炭素原子に対してパラ位にはない。 - 前記第1の糖鎖モノマーを前記表面の水酸官能基に結合させるステップの前に、
前記水酸官能基で修飾される前の前記表面と、少なくとも一つの末端水酸官能基を持つスペーサを溶液と、を反応させるステップを更に含む、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも一つの末端水酸官能基をもつスペーサが、次の化学式(II‐a)又は化学式(II‐b)で示されるシラン処理剤である、請求項2に記載の方法。
M‐(CH2)x‐O‐R6 (II‐a)
M‐(CH2)x‐R7 (II‐b)
ここで、
‐Mは、シラン化された(silanized)基−Si(R3)3、−SiR3(R4)2又はSiR3R4R5を表し、R3、R4、及びR5は各々独立に、水素もしくはフッ素及び塩素原子のようなハロゲン原子、(C1〜C4)アルコキシラジカル、(C1〜C4)アルキルラジカル又はクロロ(C1〜C4)アルキルラジカルを表し;
‐xは、1以上20以下の範囲の整数であり;
‐R6は、水酸基の保護基を表し;
‐R7は、少なくとも一つの水酸基を含む基の前駆体を表す。 - 前記シラン処理剤が、5,6‐エポキシヘキシルトリエトキシシラン又はトリフルオロメトキシウンデカントリメトキシシランである、請求項3に記載の方法。
- 前記糖鎖モノマーが、単糖類、二糖類、又はオリゴ糖類である、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記糖鎖モノマーが、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ジエチルエーテル、及びトルエンから選ばれる溶媒に溶かされている、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化学式(I)において、
i)n=1、Y1及びY2の一方が水素原子であり、Y1及びY2の他方が水素もしくはハロゲン原子、C1〜C4アルコキシラジカル、チオ(C1〜C4)アルキルラジカル、又はシアノもしくはアジド基であり、Xがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド又はチオ(C1〜C4)アルキル基であるか、
ii)n=1、Y1及びY2が同じで、C1〜C4アルコキシラジカル又はC1〜C4アルキルラジカルを表し、Xがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド基又はチオ(C1〜C4)アルキル基を表しているか、
iii)n=2、Y1及びY2の一方が水素原子であり、Y1及びY2の他方が水素もしくはハロゲン原子、C1〜C4アルコキシラジカル、又はシアノもしくはアジド基であり、Xがトリクロロアセトイミド基であるか、
iv)n=2、Y1及びY2が同じで、C1〜C4アルコキシラジカルを表し、Xがトリクロロアセトイミド基を表している、
請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。 - 化学式(I)の化合物が、2,2,2‐トリクロロアセトイミド酸ベンジルエステル、ベンジルクロリド、ベンジルブロミド、2‐(トリフルオロメチル)ベンジルブロミド、3,5‐ジ‐(tert‐ブチル)ベンジルブロミド、又は4‐(メチルチオ)ベンジルクロリドである、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の糖鎖モノマーを前記表面の水酸官能基に結合させるステップの前に、
前記水酸官能基で修飾されている表面の少なくとも一部の領域を保護ポリマーでキャップするステップと、
前記表面の前記保護ポリマーでキャップされない領域の前記水酸官能基を、前記化学式(I)で示される少なくとも一つの化合物で不活性化するステップと、
前記保護ポリマーを除去するステップと、
を含む、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記所定の配列の糖鎖が得られるまで、前記第1の糖鎖モノマーに前記糖鎖モノマーを順次連結するステップが、
前記第1の糖鎖モノマーが結合された領域の一部の領域を保護ポリマーでキャップするステップと、
前記保護ポリマーでキャップされていない前記第1の糖鎖モノマーに前記糖鎖モノマーを連結するステップと、
前記保護ポリマーを除去するステップと、
を含む、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記保護ポリマーが、ポリビニルアルコール類、ポリスチレン類、ポリビニルカルバゾール類、ポリイミド類、又はその誘導体類のポリマー類にからなる、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記保護ポリマーが、ポリヒドロキシスチレンである、請求項11に記載の方法。
- 前記保護ポリマーが、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、アセトン、又はジメチルスルホキシドで溶解することにより除去される、請求項9乃至12のいずれかに記載の方法。
- 前記糖鎖を活性化するステップを更に備える、請求項1乃至13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記糖鎖を活性化するステップにおいて、
前記糖鎖モノマーの前記水酸官能基、アミン官能基、又はカルボキシル官能基上の保護基が除去される、請求項14に記載の方法。
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