JP5419775B2 - Substrate for measurement, and biochemical bond formation and biochemical bond amount measuring method using the same - Google Patents

Description

本発明は、イムノアッセイと言われる生化学的測定方法に用いられる測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に関する。  The present invention relates to a measurement substrate used in a biochemical measurement method called an immunoassay, and a biochemical bond formation and biochemical bond amount measurement method using the same.

イムノアッセイとは、免疫反応を利用して、微量物質の検出・定量を行う免疫学的測定方法、抗原抗体反応を利用した測定方法などの生化学的測定方法である。
近年、生化学的測定方法の１つとして、蛍光色素を含む微粒子をレーザーダイオードから発振された光により励起することによって生じる一重項酸素による発光現象を利用したアセイが実用化されている。このアセイは、現在でも一般的に用いられるエンザイムイノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）と比較すると、抗原と、これを挟み込む２種の抗体とを１つのステップで混合するだけで、これらの抗原および抗体を検出できることから、測定時間と手間を大幅に軽減することができるという利点がある。さらに、このアセイは、１次抗体−抗原−２次抗体が結合して近接していないと発光しないため、エンザイムイノアッセイや従来の蛍光イムノアッセイに比べてバックグラウンドが低く抑えられるので、高感度化にも有利な手法である。また、このアセイでは、蛍光色素を励起する一重項酸素が生体中分子やスーパーオキシドと反応して濃度が減少することから、蛍光色素をシリカで保護した微粒子により、測定時の夾雑物の影響が抑えられることも報告されている（例えば、非特許文献１参照）。 The immunoassay is a biochemical measurement method such as an immunological measurement method that detects and quantifies a trace amount substance using an immune reaction, a measurement method that uses an antigen-antibody reaction, and the like.
In recent years, as one of the biochemical measurement methods, an assay using a light emission phenomenon caused by singlet oxygen generated by exciting fine particles containing a fluorescent dye with light oscillated from a laser diode has been put into practical use. Compared with the enzyme immunoassay (ELISA), which is still commonly used today, this assay can detect these antigens and antibodies only by mixing the antigen and the two antibodies sandwiching it in one step. Therefore, there is an advantage that the measurement time and labor can be greatly reduced. Furthermore, since this assay does not emit light unless the primary antibody-antigen-secondary antibody is in close proximity to each other, the background can be kept low compared to enzyme immunoassays and conventional fluorescent immunoassays, thus increasing the sensitivity. It is also an advantageous technique. In addition, in this assay, singlet oxygen that excites the fluorescent dye reacts with molecules in the living body and superoxide to reduce the concentration, so the fine particles with the fluorescent dye protected by silica have the effect of impurities during measurement. It has also been reported that it can be suppressed (see, for example, Non-Patent Document 1).

中島 憲一郎、「化学発光を利用する分析法」、分析化学、Ｖｏｌ．４９（２０００）、Ｎｏ．３、ｐｐ．１３５−１５９Kenichiro Nakajima, “Analysis Method Using Chemiluminescence”, Analytical Chemistry, Vol. 49 (2000), no. 3, pp. 135-159

上述のような利点を有する活性酸素種（一重項酸素）を用いた化学増幅は、診療や介護の現場で行う臨床検査（ＰＯＣＴ、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）やオンサイトでの生化学的測定にも適していると期待される。しかしながら、従来は、レーザーダイオードを用いているため、測定装置の小型化や低コスト化を達成することが難しい上に、測定装置の設置場所にも制限があった。そこで、レーザーダイードの代りに、これと比べると安価で小型の測定装置に組み込みが可能な発光ダイオードを用いて、一重項酸素を発生させることも可能であるが、それによって発生する一重項酸素の量は、生化学分析に十分な反応量ではなかった。  Chemical amplification using reactive oxygen species (singlet oxygen) having the above-mentioned advantages can be used for clinical tests (POCT, Point of Care Testing) and on-site biochemical measurements performed in the field of medical care and nursing care. Expected to be suitable. However, conventionally, since a laser diode is used, it is difficult to achieve downsizing and cost reduction of the measuring apparatus, and there is a limit to the installation location of the measuring apparatus. Therefore, instead of laser diode, it is possible to generate singlet oxygen by using a light emitting diode that can be incorporated into a small and inexpensive measuring device. The amount of was not sufficient for biochemical analysis.

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、表面プラズモン共鳴を適用し、発光ダイオードとＣＣＤカメラを主な要素とする簡易な測定装置により、一重項酸素を媒介とした化学増幅型蛍光イムノアセイを実現することができる測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法を提供することを目的とする。  The present invention has been made in view of the above circumstances, and is a chemical amplification type using singlet oxygen as a medium by applying a surface plasmon resonance and using a simple measuring device mainly composed of a light emitting diode and a CCD camera. It is an object of the present invention to provide a measurement substrate capable of realizing fluorescent immunoassay, and a method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount using the same.

本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による反射光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられた金薄膜と、該金薄膜上に配置され、前記金属膜の表面に誘起された表面プラズモン波により励起されることにより一重項酸素を生成する感応剤と、前記金薄膜および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする。 The measurement substrate of the present invention is a measurement method that detects biochemical bond formation and biochemical bond amount using enhancement by surface plasmon resonance in a measurement apparatus including a reflection optical system including a light source and a light detection element. A measurement substrate used, which is excited by a transparent substrate, a gold thin film provided on one surface of the transparent substrate, and a surface plasmon wave disposed on the gold thin film and induced on the surface of the metal film and sensitive that produces singlet oxygen by being, and characterized by comprising a protective film covering the gold thin film and the sensitive agent, a primary antibody immobilized on the surface of the protective film, the To do.

本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモンによる増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられたドット状の金薄膜の集合体と、該集合体上に配置され、前記金属膜の表面に誘起された表面プラズモン波により励起されることにより一重項酸素を生成する感応剤と、前記集合体および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする。
The measurement substrate of the present invention is used in a measurement apparatus configured by a transmission optical system including a light source and a light detection element for a measurement method for detecting biochemical bond formation and biochemical bond amount using enhancement by surface plasmon. A transparent substrate, an aggregate of dot-like gold thin films provided on one surface of the transparent substrate, and disposed on the aggregate and induced on the surface of the metal film A sensitive agent that generates singlet oxygen when excited by surface plasmon waves, a protective film that covers the aggregate and the sensitive agent, and a primary antibody immobilized on the surface of the protective film. It is characterized by that.

前記保護膜はシリカ薄膜であることが好ましい。  The protective film is preferably a silica thin film.

本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、本発明の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間を有する溶液保持部材を設けるステップＡ１と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ１と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ１と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を測定するステップＤ１と、を有することを特徴とする。 The method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount of the present invention is a method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount using the measurement substrate of the present invention, wherein the measurement substrate is A step A1 of providing a solution holding member having a space for holding at least the primary antibody and holding the solution α to be measured on the surface provided with the primary antibody; and flowing the solution α into the space Then, the step B1 of bringing the solution α into contact with the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided, and the solution β containing the secondary antibody bound to the fluorescent reagent into the space are introduced to the measurement substrate. a plane primary antibody is provided in the substrate, the step C1 contacting the solution beta, incident light to the gold thin film from the transparent substrate side, the fluorescence excited from the fluorescent reagent by incident light a step D1 of measurement, the It is characterized by having.

本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、本発明の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間、並びに、前記溶液αを前記空間内に流入する流入部および前記空間から前記溶液αを排出する排出部を有する溶液保持部材を設けるステップＡ２と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ２と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ２と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を測定するステップＤ２と、を有することを特徴とする。 The method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount of the present invention is a method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount using the measurement substrate of the present invention, wherein the measurement substrate is The surface on which the primary antibody is provided contains at least the primary antibody and holds the solution α to be measured, and the inflow portion into which the solution α flows into the space and the space from the space. Step A2 of providing a solution holding member having a discharge portion for discharging the solution α, and the solution α is introduced into the space, and the surface of the measurement substrate is provided with the primary antibody and the solution α is brought into contact with the surface. Step B2, Step C2 in which a solution β containing a secondary antibody combined with a fluorescent reagent is introduced into the space, and the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided is brought into contact with the solution β, The thin gold from the transparent substrate side Incident light to a step D2 which measures the fluorescence excited from the fluorescent reagent by incident light, and having a.

本発明の測定用基板によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオード（ＬＥＤ）とＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。また、感応剤が保護膜で被覆されているので、本発明の測定用基板を用いた測定中に感応剤が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。  According to the measurement substrate of the present invention, fluorescence emission immunoassay using singlet oxygen can be measured by a simple measuring device combining a light emitting diode (LED) suitable for portability and miniaturization and a CCD camera. In the future, on-site measurement and application to POCT will be possible. In addition, since the sensitive agent is coated with the protective film, it is possible to prevent a problem that the sensitive agent disappears during measurement using the measurement substrate of the present invention and the measurement sensitivity is lowered.

本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。  According to the biochemical bond formation and biochemical bond amount measuring method of the present invention, fluorescence using singlet oxygen can be obtained by a simple measuring device combining a light emitting diode suitable for portability and miniaturization and a CCD camera. Luminescence immunoassay can be measured, and it will be possible to apply to on-site measurement and POCT in the future.

本発明の測定用基板の第一の実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows 1st embodiment of the board | substrate for a measurement of this invention. 本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows the manufacturing method of 1st embodiment of the board | substrate for a measurement of this invention. 本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows the manufacturing method of 1st embodiment of the board | substrate for a measurement of this invention. 本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows the manufacturing method of 1st embodiment of the board | substrate for a measurement of this invention. 本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows the manufacturing method of 1st embodiment of the board | substrate for a measurement of this invention. 本発明の測定用基板の第二の実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows 2nd embodiment of the board | substrate for a measurement of this invention. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定用チップを示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。It is the schematic which shows the chip | tip for a measurement used for 1st embodiment of the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of the amount of biochemical bonds, (a) is a top view, (b) is (a). It is sectional drawing which follows the AA line. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows 1st embodiment of the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of a biochemical bond amount. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows 1st embodiment of the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of a biochemical bond amount. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows 1st embodiment of the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of a biochemical bond amount. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows 1st embodiment of the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of a biochemical bond amount. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定装置を示す概略構成図である。It is a schematic block diagram which shows the measuring apparatus used for 1st embodiment of the measuring method of biochemical bond formation and the amount of biochemical bonds of this invention. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows 1st embodiment of the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of a biochemical bond amount. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用チップの第二の実施形態を示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。It is the schematic which shows 2nd embodiment of the chip | tip for a measurement used for the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of a biochemical bond amount, (a) is a top view, (b) is (a). It is sectional drawing which follows the BB line. 本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第二の実施形態に用いられる測定装置を示す概略構成図である。It is a schematic block diagram which shows the measuring apparatus used for 2nd embodiment of the biochemical bond formation of this invention, and the measuring method of a biochemical bond amount.

本発明の測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の実施の形態について説明する。
なお、この形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。 Embodiments of a measurement substrate of the present invention and a method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount using the same will be described.
This embodiment is specifically described for better understanding of the gist of the invention, and does not limit the present invention unless otherwise specified.

「測定用基板」
本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による反射または透過光学系で構成される測定装置において、一重項酸素による蛍光発光現象である表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用基板である。
なお、ここでいう生化学的結合形成および生化学的結合量とは、１次抗体に結合させた抗原と２次抗体との結合の形成、および、その結合量のことである。 "Measurement board"
The measurement substrate of the present invention is a biochemical bond formation utilizing enhancement by surface plasmon resonance, which is a fluorescence emission phenomenon due to singlet oxygen, in a measurement apparatus constituted by a reflection or transmission optical system by a light source and a light detection element. This is a measurement substrate used in a method for measuring the amount of biochemical bond.
The biochemical bond formation and the amount of biochemical bond here are the formation of the bond between the antigen bound to the primary antibody and the secondary antibody, and the amount of the bond.

（１）第一の実施形態
図１は、本発明の測定用基板の第一の実施形態を示す概略断面図である。
この実施形態の測定用基板１０は、透明基板１１と、透明基板１１の一方の面１１ａに設けられた金薄膜１２と、金薄膜１２上（金薄膜１２の透明基板１１と接している面とは反対側の面（以下、「一方の面」と言う。）１２ａ）に配置された感応剤１３と、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面（感応剤１３の金薄膜１２と接している面以外の面）１３ａを被覆する保護膜１４と、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５とから概略構成されている。 (1) First Embodiment FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing a first embodiment of the measurement substrate of the present invention.
The measurement substrate 10 of this embodiment includes a transparent substrate 11, a gold thin film 12 provided on one surface 11a of the transparent substrate 11, and a surface on the gold thin film 12 (the surface of the gold thin film 12 in contact with the transparent substrate 11). Is the sensitive agent 13 disposed on the opposite surface (hereinafter referred to as "one surface") 12a), one surface 12a of the gold thin film 12, and the surface of the sensitive agent 13 (the gold thin film 12 of the sensitive agent 13). The surface is composed of a protective film 14 covering the surface 13a and a primary antibody 15 immobilized on the surface 14a of the protective film 14.

透明基板１１は、特に限定されないが、発光ダイオード（ＬＥＤ）から入射された光の透過率に優れ、熱膨張係数が小さく、低膨張の材質からなるものが好ましく、例えば、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）などの光学ガラスなどが用いられる。
また、透明基板１１の厚さは、特に限定されないが、金薄膜１２の表面にエバネッセント波を生じさせるのに十分な光が、発光ダイオードから金薄膜１２に入射される程度、かつ、取り扱いがし易く、割れ難い厚さであることが好ましく、０．５ｍｍ〜２ｍｍであることがより好ましい。 The transparent substrate 11 is not particularly limited, but is preferably made of a material having excellent transmittance for light incident from a light emitting diode (LED), a low thermal expansion coefficient, and a low expansion, such as BK7 (borosilicate glass). Optical glass such as is used.
In addition, the thickness of the transparent substrate 11 is not particularly limited, but the light is sufficient to cause evanescent waves to be generated on the surface of the gold thin film 12 from the light-emitting diode and is handled. It is preferable that the thickness is easy and hard to break, and more preferably 0.5 mm to 2 mm.

金薄膜１２は、スパッタリング装置や蒸着装置などによって形成された連続した薄膜である。
金薄膜１２は、透明基板１１の一方の面１１ａに、感応剤１３を配置するために必要な大きさ（面積）に設けられるが、所定量の感応剤１３が設けられる大きさであれば、その大きさは特に限定されない。すなわち、金薄膜１２は、透明基板１１の一方の面１１ａの一部に設けられていても、全面に設けられていてもよい。 The gold thin film 12 is a continuous thin film formed by a sputtering apparatus or a vapor deposition apparatus.
The gold thin film 12 is provided on one surface 11a of the transparent substrate 11 in a size (area) necessary for disposing the sensitive agent 13, but if the size is such that a predetermined amount of the sensitive agent 13 is provided, The size is not particularly limited. That is, the gold thin film 12 may be provided on a part of one surface 11 a of the transparent substrate 11 or may be provided on the entire surface.

また、金薄膜１２の膜厚は、特に限定されないが、透明基板１１を介して、発光ダイオードから入射された光により、金薄膜１２の表面に表面プラズモン波が誘起される大きさであることが好ましく、２０ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましい。  The film thickness of the gold thin film 12 is not particularly limited, but may be such a size that a surface plasmon wave is induced on the surface of the gold thin film 12 by light incident from the light emitting diode through the transparent substrate 11. Preferably, it is 20 nm-50 nm.

感応剤１３としては、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ Ｂｅｎｇａｌ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ）などの一重項酸素を発生させる色素が用いられる。
透明基板１１の一方の面１１ａに配置される感応剤１３の量は、表面プラズモン共鳴によって、生化学的結合形成および生化学的結合量を検出するために十分な励起光が得られる量であり、金薄膜１２の一方の面１２ａにおいて、１００ｍｍ^２あたり０．６μｇ〜３０μｇであることが好ましい。 As the sensitizer 13, a dye that generates singlet oxygen such as Rose Bengal or Methylene Blue is used.
The amount of the sensitive agent 13 disposed on the one surface 11a of the transparent substrate 11 is an amount by which sufficient excitation light can be obtained to detect biochemical bond formation and biochemical bond amount by surface plasmon resonance. In the one surface 12a of the gold thin film 12, the thickness is preferably 0.6 μg to 30 μg per 100 mm ² .

保護膜１４は、特に限定されないが、感応剤１３において発生した励起光の透過率に優れるとともに、表面プラズモン共鳴を実施するバッファ溶液中に測定用基板１０を浸漬しても、そのバッファ溶液中に感応剤１３が溶出することを防止することができるものが好ましく、シリカ薄膜であることがより好ましい。  Although the protective film 14 is not particularly limited, the protective film 14 is excellent in the transmittance of the excitation light generated in the sensitive agent 13, and even if the measurement substrate 10 is immersed in the buffer solution that performs surface plasmon resonance, What can prevent the sensitive agent 13 from eluting is preferable, and a silica thin film is more preferable.

また、保護膜１４の膜厚は、特に限定されないが、感応剤１３において発生した励起光を減衰することがないとともに、表面プラズモン共鳴を実施するバッファ溶液中に測定用基板１０を浸漬しても、そのバッファ溶液中に感応剤１３が溶出することを防止することができる大きさであり、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。  Further, the film thickness of the protective film 14 is not particularly limited, but the excitation light generated in the sensitive agent 13 is not attenuated, and the measurement substrate 10 is immersed in a buffer solution that performs surface plasmon resonance. The size is such that the sensitive agent 13 can be prevented from eluting into the buffer solution, and is preferably 10 nm to 100 nm.

１次抗体１５としては、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法により検出される抗原を認識することができる抗体が用いられる。すなわち、測定対象の抗原に応じて、１次抗体１５は適宜選択される。
また、１次抗体１５は、物理吸着あるいはシランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａにおいて、感応剤１３上に固定化されている。すなわち、保護膜１４を介して、感応剤１３の表面１３ａ上に、１次抗体１５が固定化されている。 As the primary antibody 15, an antibody capable of recognizing an antigen detected by a biochemical bond formation utilizing enhancement by surface plasmon resonance and a method of measuring the amount of biochemical bond is used. That is, the primary antibody 15 is appropriately selected according to the antigen to be measured.
The primary antibody 15 is immobilized on the sensitive agent 13 on the surface 14a of the protective film 14 by physical adsorption or chemical bonding via a silane coupling agent. That is, the primary antibody 15 is immobilized on the surface 13 a of the sensitive agent 13 via the protective film 14.

保護膜１４の表面１４ａに固定化される１次抗体１５の量は、測定対象の抗原を結合させるために十分な量であり、例えば、保護膜１４の表面１４ａにおいて、１００ｍｍ^２あたり１ｎｇ〜１００ｎｇであることが好ましい。 The amount of the primary antibody 15 immobilized on the surface 14a of the protective film 14 is an amount sufficient to bind the antigen to be measured. For example, on the surface 14a of the protective film 14, 1 ng to 100 ng per 100 mm ² It is preferable that

次に、図２〜５を参照して、この測定用基板１０の製造方法を説明する。
まず、図２に示すように、スパッタリング装置や蒸着装置などにより、透明基板１１の一方の面１１ａに、所定の大きさ、所定の膜厚の金薄膜１２を形成する。
次いで、スポッター装置などを用いて、金薄膜１２の一方の面１２ａに、ローズベンガル、メチレンブルーなどの色素を含む溶液を微量の液滴として滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、図３に示すように、金薄膜１２の一方の面１２ａに、所定量の感応剤１３を配置する。 Next, a method for manufacturing the measurement substrate 10 will be described with reference to FIGS.
First, as shown in FIG. 2, a gold thin film 12 having a predetermined size and a predetermined film thickness is formed on one surface 11a of the transparent substrate 11 by a sputtering apparatus, a vapor deposition apparatus, or the like.
Next, using a spotter device or the like, a solution containing a pigment such as rose bengal or methylene blue is dropped as a small amount of droplets onto one surface 12a of the gold thin film 12, and then the solvent of the droplets is dried. As shown in FIG. 3, a predetermined amount of the sensitive agent 13 is disposed on one surface 12 a of the gold thin film 12.

次いで、図４に示すように、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａを覆うように、所定の膜厚の保護膜１４を形成する。
保護膜１４を形成する方法としては、例えば、（１）スパッタリングにより金薄膜１２を形成する方法、（２）スポッター装置により、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａに、テトラエトキシシランのエタノール溶液を液滴として滴下し、その後、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａに塩酸を含むエタノール溶液を３０分以上接触させ、さらに、温度８０℃以上で４〜２０時間加熱して、保護膜１４を形成する方法などが用いられる。 Next, as shown in FIG. 4, a protective film 14 having a predetermined thickness is formed so as to cover one surface 12 a of the gold thin film 12 and the surface 13 a of the sensitive agent 13.
As a method of forming the protective film 14, for example, (1) a method of forming the gold thin film 12 by sputtering, and (2) a surface of the gold thin film 12 and the surface 13 a of the sensitive agent 13 by a spotter device. An ethanol solution of tetraethoxysilane is dropped as a droplet, and then an ethanol solution containing hydrochloric acid is brought into contact with one surface 12a of the gold thin film 12 and the surface 13a of the sensitive agent 13 for 30 minutes or more, and further at a temperature of 80 ° C. or more. A method of forming the protective film 14 by heating for 4 to 20 hours is used.

次いで、図５に示すように、物理吸着あるいはシランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、１次抗体１５を固定化し、測定用基板１０を得る。
シランカップリング剤としては、例えば、３アミノプロピルエトキシシランなどが用いられる。 Next, as shown in FIG. 5, the primary antibody 15 is immobilized on the surface 14 a of the protective film 14 by physical adsorption or chemical bonding via a silane coupling agent to obtain the measurement substrate 10.
As the silane coupling agent, for example, 3 aminopropylethoxysilane or the like is used.

この測定用基板１０によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
また、感応剤１３が保護膜１４で被覆されているので、この測定用基板１０を用いた測定中に感応剤１３が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。 According to this measurement substrate 10, it becomes possible to measure fluorescence emission immunoassay using singlet oxygen by a simple measurement device combining a light emitting diode suitable for portability and miniaturization and a CCD camera, and in the future. Application to on-site measurement and POCT becomes possible.
Further, since the sensitive agent 13 is covered with the protective film 14, it is possible to prevent a problem that the sensitive agent 13 disappears during measurement using the measurement substrate 10 and the measurement sensitivity is lowered.

（２）第二の実施形態
図６は、本発明の測定用基板の第二の実施形態を示す概略断面図である。
図６において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
この実施形態の測定用基板２０が、上述の第一の実施形態の測定用基板１０と異なる点は、透明基板１１の一方の面１１ａに、ドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２が設けられ、それぞれのドット状の金薄膜２２Ａの上（ドット状の金薄膜２２Ａの透明基板１１と接している面とは反対側の面（以下、「一方の面」と言う。）２２ａ）に、感応剤２３が配置されている点である。すなわち、感応剤２３も、ドット状に配置されている。 (2) Second Embodiment FIG. 6 is a schematic cross-sectional view showing a second embodiment of the measurement substrate of the present invention.
In FIG. 6, the same components as those of the measurement substrate 10 shown in FIG.
The measurement substrate 20 of this embodiment is different from the measurement substrate 10 of the first embodiment described above in that an aggregate 22 of dot-shaped gold thin films 22A is provided on one surface 11a of the transparent substrate 11. On each dot-shaped gold thin film 22A (the surface opposite to the surface in contact with the transparent substrate 11 of the dot-shaped gold thin film 22A (hereinafter referred to as "one surface") 22a) is sensitive. The agent 23 is arranged. That is, the sensitive agent 23 is also arranged in a dot shape.

ドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２は、電子線リソグラフィー、ナノインプリント法などによって、一定の間隔を置いて、不連続かつ規則的に形成された多数のドット状（点状）の金薄膜２２Ａの集合体からなる薄膜である。
集合体２２は、透明基板１１の一方の面１１ａに、感応剤２３を配置するために必要な大きさ（面積）に設けられるが、所定量の感応剤２３が設けられる大きさであれば、その大きさは特に限定されない。すなわち、集合体２２は、透明基板１１の一方の面１１ａの一部に設けられていても、全面に設けられていてもよい。 The aggregate 22 of the dot-shaped gold thin film 22A is formed of a large number of dot-shaped (dot-shaped) gold thin films 22A that are discontinuously and regularly formed at regular intervals by electron beam lithography, nanoimprint method, or the like. It is a thin film made of an aggregate.
The aggregate 22 is provided on the one surface 11a of the transparent substrate 11 in a size (area) necessary for disposing the sensitive agent 23. If the size is such that a predetermined amount of the sensitive agent 23 is provided, The size is not particularly limited. That is, the aggregate 22 may be provided on a part of the one surface 11a of the transparent substrate 11 or may be provided on the entire surface.

また、集合体２２の膜厚、すなわち、ドット状の金薄膜２２Ａの膜厚は、特に限定されないが、透明基板１１を介して、発光ダイオードから入射された光により、集合体２２（ドット状の金薄膜２２Ａ）の表面２２ａに表面プラズモン波が誘起される程度であることが好ましく、５ｎｍ〜４０ｎｍであることがより好ましい。
さらに、ドット状の金薄膜２２Ａ同士の間隔は、特に限定されないが、発光ダイオードから入射された光により、集合体２２の表面に局在する局在プラズモンが誘起されて電場強度を増大させることができる大きさが好ましく、５ｎｍ〜４０ｎｍであることがより好ましい。 Further, the film thickness of the aggregate 22, that is, the film thickness of the dot-shaped gold thin film 22A is not particularly limited, but the aggregate 22 (dot-shaped gold film) is incident on the transparent substrate 11 by light incident from the light emitting diode. It is preferable that the surface plasmon wave is induced on the surface 22a of the gold thin film 22A), more preferably 5 nm to 40 nm.
Further, the interval between the dot-shaped gold thin films 22A is not particularly limited, but the local plasmon localized on the surface of the aggregate 22 is induced by the light incident from the light emitting diode, and the electric field strength may be increased. The size which can be performed is preferable and it is more preferable that it is 5 nm-40 nm.

感応剤２３としては、上述の感応剤１３と同様のものが用いられる。  As the sensitive agent 23, the same one as the above-described sensitive agent 13 is used.

次に、この測定用基板２０の製造方法を説明する。
電子線リソグラフィー、ナノインプリント法などにより、透明基板１１の一方の面１１ａに、所定の大きさ、所定の膜厚のドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２を形成し、さらに、集合体２２（ドット状の金薄膜２２Ａ）の表面２２ａに、感応剤２３を配置する以外は、上述の第一の実施形態と同様にして、測定用基板２０を製造する。 Next, a method for manufacturing the measurement substrate 20 will be described.
An assembly 22 of dot-shaped gold thin films 22A having a predetermined size and a predetermined film thickness is formed on one surface 11a of the transparent substrate 11 by electron beam lithography, nanoimprinting, or the like. The measurement substrate 20 is manufactured in the same manner as in the first embodiment except that the sensitive agent 23 is disposed on the surface 22a of the gold thin film 22A).

この測定用基板２０によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
また、感応剤２３が保護膜１４で被覆されているので、この測定用基板１０を用いた測定中に感応剤２３が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。
さらに、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２を設けたことにより、発光ダイオードにより透明基板１１側から集合体２２に光を入射することによって、集合体２２の表面に局在する局在プラズモンが誘起して電場強度を増大させることができるので、透過光学系による測定方法が可能となる。 According to this measurement substrate 20, it is possible to measure fluorescence emission immunoassay using singlet oxygen by a simple measuring device combining a light emitting diode suitable for portability and miniaturization and a CCD camera, and in the future. Application to on-site measurement and POCT becomes possible.
Further, since the sensitive agent 23 is covered with the protective film 14, it is possible to prevent the problem that the sensitive agent 23 disappears during measurement using the measurement substrate 10 and the measurement sensitivity is lowered.
Furthermore, by providing the aggregate 22 composed of the dot-shaped gold thin film 22A, the light is incident on the aggregate 22 from the transparent substrate 11 side by the light emitting diode, so that the localized plasmon localized on the surface of the aggregate 22 is obtained. Can be induced to increase the electric field strength, so that a measurement method using a transmission optical system becomes possible.

「生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法」
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法では、まず、上述の測定用基板を用いて、測定用チップを形成する。 "Method for measuring biochemical bond formation and amount of biochemical bond"
In the biochemical bond formation and biochemical bond amount measurement method of the present invention, first, a measurement chip is formed using the above-described measurement substrate.

（１）第一の実施形態
図７〜１３を参照して、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を説明する。
図７は、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定用チップを示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
図７において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。また、図７において、説明を簡略化するために、図１に示した測定用基板１０の構成要素の一部の図示を省略する。また、図８〜１３において、説明を簡略化するために、図７に示した測定用チップ３０の構成要素の一部の図示を省略する。 (1) First Embodiment With reference to FIGS. 7 to 13, a first embodiment of the biochemical bond formation and biochemical bond amount measurement method of the present invention will be described.
FIG. 7 is a schematic view showing a measuring chip used in the first embodiment of the biochemical bond formation and biochemical bond amount measuring method of the present invention, wherein (a) is a plan view and (b). These are sectional drawings which follow the AA line of (a).
In FIG. 7, the same components as those of the measurement substrate 10 shown in FIG. Further, in FIG. 7, in order to simplify the description, some of the components of the measurement substrate 10 shown in FIG. 1 are not shown. 8 to 13, some components of the measurement chip 30 shown in FIG. 7 are not shown in order to simplify the description.

この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、まず、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面（透明基板１１の一方の面１１ａ）上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間３１ａを有する溶液保持部材３１を設け、測定用チップ３０を作製する（ステップＡ１）。  In this embodiment, the biochemical bond formation and the method for measuring the amount of biochemical bond are first performed on at least the surface of the measurement substrate 10 on which the primary antibody 15 is provided (one surface 11a of the transparent substrate 11). A solution holding member 31 having a space 31a for holding the primary antibody 15 and holding the solution α to be measured is provided to produce the measurement chip 30 (step A1).

測定用チップ３０は、測定用基板１０と、その透明基板１１の一方の面１１ａ上に設けられた溶液保持部材３１とから概略構成されている。
また、溶液保持部材３１には、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられている部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の空間３１ａが設けられている。 The measurement chip 30 is schematically configured from a measurement substrate 10 and a solution holding member 31 provided on one surface 11 a of the transparent substrate 11.
In addition, the solution holding member 31 is provided with a space 31a having a circular cross section penetrating in the thickness direction at a position facing at least a portion of the measurement substrate 10 where the primary antibody 15 is provided.

溶液保持部材３１は、ポリジメチルシロキサンシートからなり、その厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の抗原を含む溶液の必要量を収容（保持）できる大きさであることが好ましく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることがより好ましい。
また、溶液保持部材３１の空間３１ａの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の抗原を含む溶液の必要量を収容（保持）できる大きさであり、かつ、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５を収容できる大きさであることが好ましく、０．０５ｍｍ〜０．０７ｍｍであることがより好ましい。 The solution holding member 31 is made of a polydimethylsiloxane sheet, and the thickness thereof is not particularly limited. In the biochemical bond formation and biochemical bond amount measuring method of the present invention, the solution holding member 31 is a solution containing an antigen to be measured. The size is preferably large enough to accommodate (hold) the required amount, and more preferably 1 mm to 10 mm.
Further, the size (diameter) of the space 31a of the solution holding member 31 is not particularly limited, but in the method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount according to the present invention, a solution containing the antigen to be measured is necessary. It is preferably a size that can accommodate (hold) the amount and that can accommodate the primary antibody 15 immobilized on the surface 14a of the protective film 14, and is 0.05 mm to 0.07 mm. Is more preferable.

なお、この実施形態では、溶液保持部材３１の空間３１ａの断面形状を円形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、ポリジメチルシロキサンシートに設けられる貫通孔の断面形状は、正方形、長方形、楕円形などであってもよい。  In this embodiment, the cross-sectional shape of the space 31a of the solution holding member 31 is circular, but the present invention is not limited to this. In the present invention, the cross-sectional shape of the through hole provided in the polydimethylsiloxane sheet may be a square, a rectangle, an ellipse, or the like.

次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、測定対象の溶液α（抗原を含む場合も含まない場合もある）を流入して（図８参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液αを接触させる（ステップＢ１）。
これにより、測定用チップ３０の１次抗体１５と、溶液αに抗原が含まれる場合、その抗原４１とを反応させて、図９に示すように、１次抗体１５に抗原４１を結合させる。
１次抗体１５と抗原４１との反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、溶液αを除去する。 Next, the solution α to be measured (which may or may not contain an antigen) flows into the space 31a of the solution holding member 31 (see FIG. 8), and the primary antibody 15 of the measurement substrate 10 is provided. The solution α is brought into contact with the formed surface (step B1).
Thereby, when the primary antibody 15 of the measuring chip 30 contains an antigen in the solution α, the antigen 41 is reacted to bind the antigen 41 to the primary antibody 15 as shown in FIG.
After the reaction between the primary antibody 15 and the antigen 41 is completed, the solution α is removed from the space 31 a of the solution holding member 31.

次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、予め調製しておいた、蛍光試薬４２と結合した２次抗体４３を含む溶液βを流入して（図１０参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液βを接触させる（ステップＣ１）。
これにより、１次抗体１５に結合した抗原４１と、２次抗体４３とを反応させて、図１１に示すように、１次抗体１５に結合した抗原４１に２次抗体４３を結合させ、２次抗体４３における１次抗体１５に結合している側とは反対側の端に蛍光試薬４２を配置させる。
１次抗体１５に結合した抗原４１と２次抗体４３との反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、２次抗体４３を含む溶液βを除去し、さらに、空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄する。
バッファ溶液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）水溶液などが用いられる。 Next, the solution β containing the secondary antibody 43 combined with the fluorescent reagent 42, which has been prepared in advance, flows into the space 31 a of the solution holding member 31 (see FIG. 10), and the primary of the measurement substrate 10. The solution β is brought into contact with the surface on which the antibody 15 is provided (step C1).
As a result, the antigen 41 bound to the primary antibody 15 is reacted with the secondary antibody 43, and the secondary antibody 43 is bound to the antigen 41 bound to the primary antibody 15 as shown in FIG. The fluorescent reagent 42 is arranged at the end of the secondary antibody 43 opposite to the side bound to the primary antibody 15.
After the reaction between the antigen 41 bound to the primary antibody 15 and the secondary antibody 43 is completed, the solution β containing the secondary antibody 43 is removed from the space 31a of the solution holding member 31, and the space 31a Wash with buffer solution.
As the buffer solution, a phosphate buffer, Tris buffer, Block Ace (DS Pharma Biomedical) aqueous solution, or the like is used.

蛍光試薬４２としては、特に限定されないが、表面プラズモン共鳴によって発生した一重項酸素により蛍光を発するものが用いられ、例えば、ユーロピウム錯体（Ｓｏｄｉｕｍ［４’−（４’−Ａｍｉｎｏ−４−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−２，２’：−６，２“−ｔｅｒｐｙｄｉｎｅ−６，６”−ｄｉｙｌｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｏ）］ｅｕｒｏｐａｔｅ（ＩＩＩ）］）、Ｅｕ ｔｒｉｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｃｒｙｐｔａｔｅ、テルビウム錯体などのランタノイド錯体が挙げられる。  The fluorescent reagent 42 is not particularly limited, but a fluorescent reagent that emits fluorescence by singlet oxygen generated by surface plasmon resonance is used. For example, a europium complex (Sodium [4 ′-(4′-Amino-4-biphenyl)- 2,2 ':-6,2 "-terpydine-6,6" -diylbis (methyliminodiacetato)] europate (III)]), Eu tripyridine Cryptate, terbium complexes, and the like.

２次抗体４３としては、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法により検出される抗原４１を認識することができる抗体が用いられる。すなわち、測定対象の抗原４１に応じて、２次抗体４３は適宜選択される。
なお、本発明では、蛍光試薬４２と２次抗体４３の結合体の代りに、市販の抗体固定化用の蛍光ビーズを用いることもできる。 As the secondary antibody 43, an antibody capable of recognizing the antigen 41 detected by the biochemical bond formation utilizing the enhancement by surface plasmon resonance and the method of measuring the amount of biochemical bond is used. That is, the secondary antibody 43 is appropriately selected according to the antigen 41 to be measured.
In the present invention, instead of the conjugate of the fluorescent reagent 42 and the secondary antibody 43, commercially available fluorescent beads for immobilizing antibodies can also be used.

次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、図１２に示すように、測定用チップ３０を測定装置５０に設置して、１次抗体１５に結合させた抗原４１と２次抗体４３との結合の形成、および、その結合量を検出する。
すなわち、透明基板１１側から金薄膜１２に光を入射して、その入射光によって蛍光試薬４２から励起された蛍光を、透明基板１１側に反射させて、その蛍光を測定する（ステップＤ１）。 Next, with the buffer solution placed in the space 31a of the solution holding member 31, as shown in FIG. 12, the measuring chip 30 is installed in the measuring device 50, and the antigen 41 bound to the primary antibody 15 and Formation of the binding with the secondary antibody 43 and the amount of the binding are detected.
That is, light is incident on the gold thin film 12 from the transparent substrate 11 side, the fluorescence excited from the fluorescent reagent 42 by the incident light is reflected to the transparent substrate 11 side, and the fluorescence is measured (step D1).

この測定装置５０は、測定用チップ３０を載置する面（載置面）５１ａを有するコニカルプリズム５１と、測定用チップ３０に光を入射する発光ダイオード５２と、蛍光試薬４２が発光した蛍光を観察、測定するための２次元ＣＣＤカメラ５３と、２次元ＣＣＤカメラ５３によって測定する光の波長を選択するためのフィルタ（波長選択フィルタ）５４とから概略構成されている。  The measuring device 50 includes a conical prism 51 having a surface (mounting surface) 51 a on which the measurement chip 30 is placed, a light emitting diode 52 that makes light incident on the measurement chip 30, and fluorescence emitted by the fluorescent reagent 42. A two-dimensional CCD camera 53 for observation and measurement and a filter (wavelength selection filter) 54 for selecting the wavelength of light to be measured by the two-dimensional CCD camera 53 are roughly configured.

コニカルプリズム５１としては、特に限定されないが、発光ダイオードから入射された光の透過率に優れ、熱膨張係数が小さく、低膨張の材質からなるものが好ましく、例えば、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）などの光学ガラスなどが用いられる。
発光ダイオード５２としては、特に限定されないが、水の吸収が少ない波長６４０ｎｍ〜７６０ｎｍの光を発光するものが好ましい。 The conical prism 51 is not particularly limited, but is preferably made of a material having excellent transmittance for light incident from a light emitting diode, a low thermal expansion coefficient, and a low expansion material, such as BK7 (borosilicate glass). Optical glass or the like is used.
Although it does not specifically limit as the light emitting diode 52, The thing which light-emits light with a wavelength of 640 nm-760 nm with little water absorption is preferable.

２次元ＣＣＤカメラ５３としては、画素数６４０×４８０以上で、フレームレートが２００ｆｐｓ以上の性能を有し、データの転送に必要なＧｉｇａ Ｅｔｈｅｒｎｅｔインターフェースを備えたもので、例えば、Ｐｒｏｓｉｌｉｃａ社製のＧＥ６８０（商品名）などが用いられる。
フィルタ５４としては、蛍光試薬４２から発光される蛍光を選択的に透過するものが用いられ、波長５００〜６００ｎｍの範囲でのバンドパスフィルターであればよく、例えば、５９５ｎｍ中心の２５ｎｍ幅バンドパスフィルターであればよい。 The two-dimensional CCD camera 53 has a pixel number of 640 × 480 or more, a frame rate of 200 fps or more, and a Giga Ethernet interface necessary for data transfer. For example, GE680 (manufactured by Prosilica) Product name) is used.
As the filter 54, a filter that selectively transmits the fluorescence emitted from the fluorescent reagent 42 is used, and any band-pass filter having a wavelength in the range of 500 to 600 nm may be used. If it is.

この測定装置５０を用いた測定方法では、図１２に示すように、コニカルプリズム５１の載置面５１ａに、測定用チップ３０を設置し、コニカルプリズム５１介して、発光ダイオード５２から発光した光を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射する。
発光ダイオード５２から金薄膜１２に入射する光は、１ＭＨｚ〜５ＭＨｚの周期で間欠的（パルス状）な光である。 In the measuring method using this measuring device 50, as shown in FIG. 12, the measuring chip 30 is placed on the mounting surface 51 a of the conical prism 51, and the light emitted from the light emitting diode 52 is transmitted via the conical prism 51. The light enters the gold thin film 12 from the transparent substrate 11 side.
Light incident on the gold thin film 12 from the light emitting diode 52 is intermittent (pulsed) light with a period of 1 MHz to 5 MHz.

すると、金薄膜１２の表面にエバネッセント波が生じるとともに、金薄膜１２の表面に表面プラズモン波が誘起され、感応剤１３が励起して、その励起光と、溶液保持部材３１の空間３１ａ内のバッファ溶液中に含まれている酸素分子とが反応して、一重項酸素が生成する。  Then, an evanescent wave is generated on the surface of the gold thin film 12, and a surface plasmon wave is induced on the surface of the gold thin film 12 to excite the sensitive agent 13, and the excitation light and the buffer in the space 31 a of the solution holding member 31 are generated. The oxygen molecules contained in the solution react to generate singlet oxygen.

そして、生成した一重項酸素が、蛍光試薬４２と反応する（図１３参照）。ここで、２次元ＣＣＤカメラ５３によって、蛍光試薬４２から発光された蛍光が観測された場合、測定対象の溶液αには、抗原４１が含まれていたことになる。すなわち、この蛍光が発光する現象は、測定用チップ３０の１次抗体１５に結合している抗原４１に、蛍光試薬４２と結合している２次抗体４３が結合することによって生じる現象であるから、蛍光が観測されれば、溶液αには、抗原４１が含まれていたことを確認することができる。
また、溶液αにおける抗原４１の濃度が高ければ、２次抗体４３に結合した蛍光試薬４２の数、すなわち、２次抗体４３と蛍光試薬４２との結合数も多くなるため、蛍光量と抗原濃度との間には相関（比例関係）がある。 Then, the generated singlet oxygen reacts with the fluorescent reagent 42 (see FIG. 13). Here, when the fluorescence emitted from the fluorescent reagent 42 is observed by the two-dimensional CCD camera 53, the solution 41 to be measured contains the antigen 41. That is, the phenomenon in which the fluorescence is emitted is a phenomenon caused by the binding of the secondary antibody 43 bound to the fluorescent reagent 42 to the antigen 41 bound to the primary antibody 15 of the measurement chip 30. If fluorescence is observed, it can be confirmed that the antigen 41 is contained in the solution α.
Further, if the concentration of the antigen 41 in the solution α is high, the number of fluorescent reagents 42 bound to the secondary antibody 43, that is, the number of bindings between the secondary antibody 43 and the fluorescent reagent 42 increases. There is a correlation (proportional relationship) between.

なお、発光ダイオード５２から金薄膜１２にパルス状の光を入射した際、初期に観測される蛍光の光信号は、目的とする蛍光試薬以外の夾雑物から発せられた短時間の蛍光信号も含まれている可能性が高い。そこで、２次元ＣＣＤカメラ５３によって撮影された画像のデータ処理により、蛍光が観測された初期のデータについては採用せず、発光ダイオード５２から発光された光による蛍光試薬４２の励起後、一定時間経過してから開始する擬似的プラトー部分での蛍光量を求め、抗原濃度に換算する。
なお、「擬似的プラトー部分」とは、最初に現れるプラトー部分であり、この部分の時間が長くなると、発散する。 When pulsed light is incident on the gold thin film 12 from the light-emitting diode 52, the fluorescent light signal observed at an early stage includes a short-time fluorescent signal emitted from impurities other than the target fluorescent reagent. It is highly possible that Accordingly, the initial data in which fluorescence is observed by the data processing of the image photographed by the two-dimensional CCD camera 53 is not adopted, and a certain time has elapsed after excitation of the fluorescent reagent 42 by the light emitted from the light emitting diode 52. Then, the amount of fluorescence in the pseudo plateau portion starting after that is obtained and converted to the antigen concentration.
The “pseudo plateau portion” is a plateau portion that appears first, and diverges when the time of this portion becomes long.

この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。  According to the biochemical bond formation and biochemical bond amount measuring method of this embodiment, singlet oxygen is used by a simple measuring device combining a light emitting diode suitable for portability and miniaturization and a CCD camera. Fluorescence emission immunoassay can be measured, and it will be possible to apply to on-site measurement and POCT in the future.

（２）第二の実施形態
図１４は、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用チップの第二の実施形態を示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
図１４において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。また、図１４において、説明を簡略化するために、図６に示した測定用基板２０の構成要素の一部の図示を省略する。また、図１４において、説明を簡略化するために、図１に示した測定用基板１０の構成要素の一部の図示を省略する。 (2) Second Embodiment FIG. 14 is a schematic view showing a second embodiment of a measuring chip used in the method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount according to the present invention. ) Is a plan view, and (b) is a cross-sectional view taken along line BB in (a).
In FIG. 14, the same components as those of the measurement substrate 10 shown in FIG. Further, in FIG. 14, in order to simplify the description, some of the components of the measurement substrate 20 shown in FIG. 6 are not shown. Further, in FIG. 14, in order to simplify the description, illustration of some of the components of the measurement substrate 10 shown in FIG. 1 is omitted.

この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、まず、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面（透明基板１１の一方の面１１ａ）上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間６１ａを有するシート状の第一部材６１と、溶液αを空間６１ａ内に流入する流入部６２ａおよび空間６１ａから溶液αを排出する排出部６２ｂを有するシート状の第二部材６２とから構成される溶液保持部材６３を設け、測定用チップ６０を形成する（ステップＡ２）。  In this embodiment, the biochemical bond formation and the method for measuring the amount of biochemical bond are first performed on at least the surface of the measurement substrate 10 on which the primary antibody 15 is provided (one surface 11a of the transparent substrate 11). The sheet α is discharged from the sheet-like first member 61 that contains the primary antibody 15 and has the space 61a for holding the solution α to be measured, the inflow portion 62a that flows the solution α into the space 61a, and the space 61a. A solution holding member 63 composed of the sheet-like second member 62 having the discharging portion 62b to be provided is provided to form the measurement chip 60 (step A2).

測定用チップ６０は、測定用基板１０と、その透明基板１１の一方の面１１ａ上に順に設けられたシート状の第一部材６１およびシート状の第二部材６２とから概略構成されている。
また、第一部材６１は両面テープなどからなり、第一部材６１には、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられた部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面長方形の空間６１ａが設けられている。
さらに、第二部材６２はポリジメチルシロキサンシートなどからなり、第二部材６２には、第一部材６１の空間６１ａの一端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の流入部６２ａが設けられ、かつ、第一部材６１の空間６１ａの他端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の排出部６２ｂが設けられている。 The measurement chip 60 is schematically configured from a measurement substrate 10 and a sheet-like first member 61 and a sheet-like second member 62 provided in order on one surface 11 a of the transparent substrate 11.
The first member 61 is made of a double-sided tape or the like, and the first member 61 has a rectangular cross section penetrating in the thickness direction at a position facing at least a portion where the primary antibody 15 is provided on the measurement substrate 10. Space 61a is provided.
Further, the second member 62 is made of a polydimethylsiloxane sheet or the like, and the second member 62 has a circular cross-section inflow portion 62a penetrating in the thickness direction at a position facing one end of the space 61a of the first member 61. And a discharge section 62b having a circular cross section penetrating in the thickness direction is provided at a position facing the other end of the space 61a of the first member 61.

第一部材６１の厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の溶液αの必要量を収容（保持）できる大きさであることが好ましく、０．５ｍｍ〜３ｍｍであることがより好ましい。
また、第一部材６１の空間６１ａの大きさ（面積）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の溶液αの必要量を収容（保持）できる大きさであり、かつ、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５を収容できる大きさであることが好ましく、５ｍｍ^２〜１０ｍｍ^２であることがより好ましい。 The thickness of the first member 61 is not particularly limited, but in the biochemical bond formation and biochemical bond amount measurement method of the present invention, the thickness of the first member 61 is large enough to accommodate (hold) the required amount of the solution α to be measured. It is preferable that it is 0.5 mm to 3 mm.
In addition, the size (area) of the space 61a of the first member 61 is not particularly limited, but in the method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount according to the present invention, the required amount of the solution α to be measured is determined. receiving (holding) can be sized and preferably on the surface 14a is immobilized primary antibody 15 sized to accommodate the of the protective film ^14, and more preferably 5 mm 2 to 10 mm ^2.

第二部材６２の厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液αを流入させることができる程度であればよく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。
また、第二部材６２の流入部６２ａの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第二部材６２の流入部６２ａには、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液αを流入させるためのポンプが接続（図示略）されるため、その接続に適した大きさであることが好ましく、０．８ｍｍ〜１．５ｍｍであることがより好ましい。
さらに、第二部材６２の排出部６２ｂの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第二部材６２の排出部６２ｂには、第一部材６１の空間６１ａ内から排出された廃液を回収する回収容器（図示略）が接続されるため、その接続に適した大きさであることが好ましく、０．８ｍｍ〜１．５ｍｍであることがより好ましい。 The thickness of the second member 62 is not particularly limited, but in the method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount according to the present invention, the solution α to be measured flows into the space 61a of the first member 61. As long as it can be adjusted, it is preferably 1 mm to 10 mm.
The size (diameter) of the inflow portion 62a of the second member 62 is not particularly limited, but in the biochemical bond formation and biochemical bond amount measurement method of the present invention, the inflow portion 62a of the second member 62 is used. Is connected to a pump (not shown) for allowing the solution α to be measured to flow into the space 61a of the first member 61, and preferably has a size suitable for the connection, 0.8 mm More preferably, it is -1.5 mm.
Further, the size (diameter) of the discharge portion 62b of the second member 62 is not particularly limited, but in the method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount according to the present invention, the discharge portion 62b of the second member 62. Is connected to a recovery container (not shown) for recovering the waste liquid discharged from the space 61a of the first member 61, and is preferably of a size suitable for the connection. More preferably, it is 5 mm.

また、第二部材６２の流入部６２ａにポンプを接続し、第二部材６２の排出部６２ｂに回収容器を接続することにより、第一部材６１の空間６１ａ内では、図中の矢印（破線）方向に、測定対象の溶液αが流入する。  Further, by connecting a pump to the inflow portion 62a of the second member 62 and connecting a recovery container to the discharge portion 62b of the second member 62, an arrow (broken line) in the figure is formed in the space 61a of the first member 61. The solution α to be measured flows in the direction.

なお、この実施形態では、第一部材６１の空間６１ａの断面形状を長方形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、第一部材に設けられる空間の断面形状は、正方形、円形、楕円形などであってもよい。
また、この実施形態では、第二部材６２の流入部６２ａ、第二部材６２の排出部６２ｂの断面形状を円形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、第二部材に設けられる流入部または排出部の断面形状は、正方形、長方形、楕円形などであってもよい。 In this embodiment, the cross-sectional shape of the space 61a of the first member 61 is rectangular, but the present invention is not limited to this. In the present invention, the cross-sectional shape of the space provided in the first member may be a square, a circle, an ellipse, or the like.
Moreover, in this embodiment, although the cross-sectional shape of the inflow part 62a of the 2nd member 62 and the discharge part 62b of the 2nd member 62 was made circular, this invention is not limited to this. In the present invention, the cross-sectional shape of the inflow part or the discharge part provided in the second member may be a square, a rectangle, an ellipse or the like.

次いで、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液α（抗原を含む場合も含まない場合もある）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液αを接触させる（ステップＢ２）。
これにより、測定用チップ６０の１次抗体１５と、溶液αに含まれる抗原４１とを反応させて、１次抗体１５に抗原４１を結合させる（図９参照）。
１次抗体１５と抗原４１との反応が完了した後、第二部材６２の排出部６２ｂを介して、第一部材６１の空間６１ａ内から、溶液αを排出する。 Next, the measurement target solution α (which may or may not contain an antigen) flows into the space 61a of the first member 61 through the inflow portion 62a of the second member 62, and the measurement substrate 10 is obtained. The solution α is brought into contact with the surface provided with the primary antibody 15 (step B2).
As a result, the primary antibody 15 of the measurement chip 60 is reacted with the antigen 41 contained in the solution α to bind the antigen 41 to the primary antibody 15 (see FIG. 9).
After the reaction between the primary antibody 15 and the antigen 41 is completed, the solution α is discharged from the space 61 a of the first member 61 through the discharge portion 62 b of the second member 62.

次いで、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内に、予め調製しておいた、蛍光試薬４２と結合した２次抗体４３を含む溶液βを流入して（図１０参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液βを接触させる（ステップＣ２）。
これにより、１次抗体１５に結合した抗原４１と、２次抗体４３とを反応させて、図１１に示すように、１次抗体１５に結合した抗原４１に２次抗体４３を結合させて、２次抗体４３における１次抗体１５に結合している側とは反対側の端に蛍光試薬４２を配置させる。
１次抗体１５に結合した抗原４１と２次抗体４３との反応が完了した後、第二部材６２の排出部６２ｂを介して、第一部材６１の空間６１ａ内から、２次抗体４３を含む溶液βを排出し、さらに、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を流入し、第一部材６１の空間６１ａ内をバッファ溶液で洗浄する。 Subsequently, the solution β containing the secondary antibody 43 combined with the fluorescent reagent 42 prepared in advance flows into the space 61a of the first member 61 through the inflow portion 62a of the second member 62 ( 10), the solution β is brought into contact with the surface of the measurement substrate 10 on which the primary antibody 15 is provided (step C2).
Thereby, the antigen 41 bound to the primary antibody 15 and the secondary antibody 43 are reacted, and as shown in FIG. 11, the secondary antibody 43 is bound to the antigen 41 bound to the primary antibody 15, A fluorescent reagent 42 is disposed at the end of the secondary antibody 43 opposite to the side that is bonded to the primary antibody 15.
After the reaction between the antigen 41 bound to the primary antibody 15 and the secondary antibody 43 is completed, the secondary antibody 43 is contained from the space 61a of the first member 61 through the discharge portion 62b of the second member 62. The solution β is discharged, and the buffer solution is introduced into the space 61a of the first member 61 through the inflow portion 62a of the second member 62, and the space 61a of the first member 61 is washed with the buffer solution.

次いで、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、図１５に示すように、測定用チップ６０を測定装置７０に設置して、１次抗体１５に結合させた抗原４１と２次抗体４３との結合の形成、および、その結合量を検出する。
すなわち、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に光を入射して、その入射光によって蛍光試薬４２から励起された蛍光を、保護膜１４側に透過させて、その蛍光を測定する（ステップＤ２）。 Next, with the buffer solution placed in the space 61a of the first member 61, as shown in FIG. 15, the measurement chip 60 is installed in the measurement device 70, and the antigen 41 bound to the primary antibody 15 and Formation of the binding with the secondary antibody 43 and the amount of the binding are detected.
That is, light is incident on the aggregate 22 composed of the dot-shaped gold thin film 22A from the transparent substrate 11 side, and the fluorescence excited from the fluorescent reagent 42 by the incident light is transmitted to the protective film 14 side, and the fluorescence Is measured (step D2).

この測定装置７０は、測定用チップ６０を支持する支持部（図示略）と、測定用チップ６０に光を入射する発光ダイオード７２と、蛍光試薬４２が発光した蛍光を観察、測定するための２次元ＣＣＤカメラ７３と、２次元ＣＣＤカメラ７３によって測定する光の波長を選択するためのフィルタ（波長選択フィルタ）７４とから概略構成されている。  The measuring device 70 includes a support (not shown) that supports the measuring chip 60, a light emitting diode 72 that makes light incident on the measuring chip 60, and 2 for observing and measuring the fluorescence emitted by the fluorescent reagent 42. The two-dimensional CCD camera 73 and a filter (wavelength selection filter) 74 for selecting the wavelength of light to be measured by the two-dimensional CCD camera 73 are schematically configured.

発光ダイオード７２としては、特に限定されないが、波長６４０ｎｍ〜７６０ｎｍの光を発光するものが用いられる。  Although it does not specifically limit as the light emitting diode 72, The thing which light-emits the light of wavelength 640nm -760nm is used.

２次元ＣＣＤカメラ７３としては、画素数６４０×４８０以上で、フレームレートが２００ｆｐｓ以上の性能を有し、データの転送に必要なＧｉｇａ Ｅｔｈｅｒｎｅｔインターフェースを備えたもので、例えば、Ｐｒｏｓｉｌｉｃａ社製のＧＥ６８０（商品名）などが用いられる。
フィルタ７４としては、蛍光試薬４２から発光される蛍光を選択的に透過するものが用いられ、波長５００〜６００ｎｍの範囲でのバンドパスフィルターであればよく、例えば、５９５ｎｍ中心の２５ｎｍ幅バンドパスフィルターであればよい。 The two-dimensional CCD camera 73 has a pixel number of 640 × 480 or more, a frame rate of 200 fps or more, and a Giga Ethernet interface necessary for data transfer. For example, GE680 (manufactured by Prosilica) Product name) is used.
As the filter 74, a filter that selectively transmits fluorescence emitted from the fluorescent reagent 42 is used, and any band-pass filter having a wavelength in the range of 500 to 600 nm may be used. For example, a 25-nm band-pass filter centered at 595 nm. If it is.

この測定装置７０を用いた測定方法では、図１５に示すように、支持部により測定用チップ６０を支持し、発光ダイオード７２から発光した光を、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に入射する。  In the measuring method using this measuring apparatus 70, as shown in FIG. 15, the measuring chip 60 is supported by the support portion, and the light emitted from the light emitting diode 72 is transmitted from the dot-shaped gold thin film 22A from the transparent substrate 11 side. Is incident on the aggregate 22.

すると、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２の表面にエバネッセント波が生じるとともに、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２の表面に表面プラズモン波が誘起され、感応剤２３が励起して、その励起光と、第一部材６１の空間６１ａ内のバッファ溶液中に含まれている酸素分子とが反応して、一重項酸素が生成する。  Then, an evanescent wave is generated on the surface of the aggregate 22 composed of the dot-shaped gold thin film 22A, and a surface plasmon wave is induced on the surface of the aggregate 22 composed of the dot-shaped gold thin film 22A, and the sensitive agent 23 is excited. The excitation light reacts with oxygen molecules contained in the buffer solution in the space 61a of the first member 61 to generate singlet oxygen.

そして、生成した一重項酸素が、蛍光試薬４２と反応する（図１３参照）。ここで、２次元ＣＣＤカメラ７３によって、蛍光試薬４２から発光された蛍光が観測された場合、測定対象の溶液αには、抗原４１が含まれていたことになる。すなわち、この蛍光が発光する現象は、測定用チップ６０の１次抗体１５に結合している抗原４１に、蛍光試薬４２と結合している２次抗体４３が結合することによって生じる現象であるから、蛍光が観測されれば、溶液αには、抗原４１が含まれていたことを確認することができる。
また、溶液αにおける抗原４１の濃度が高ければ、２次抗体４３に結合した蛍光試薬４２の数、すなわち、２次抗体４３と蛍光試薬４２との結合数も多くなるため、蛍光量と抗原濃度との間には相関（比例関係）がある。 Then, the generated singlet oxygen reacts with the fluorescent reagent 42 (see FIG. 13). Here, when the fluorescence emitted from the fluorescent reagent 42 is observed by the two-dimensional CCD camera 73, the solution 41 to be measured contained the antigen 41. That is, the phenomenon in which the fluorescence is emitted is a phenomenon caused by the binding of the secondary antibody 43 bound to the fluorescent reagent 42 to the antigen 41 bound to the primary antibody 15 of the measurement chip 60. If fluorescence is observed, it can be confirmed that the antigen 41 is contained in the solution α.
Further, if the concentration of the antigen 41 in the solution α is high, the number of fluorescent reagents 42 bound to the secondary antibody 43, that is, the number of bindings between the secondary antibody 43 and the fluorescent reagent 42 increases. There is a correlation (proportional relationship) between.

なお、発光ダイオード７２から金薄膜１２にパルス状の光を入射した際、初期に観測される蛍光の光信号は、目的とする蛍光試薬以外の夾雑物から発せられた短時間の蛍光信号も含まれている可能性が高い。そこで、２次元ＣＣＤカメラ７３によって撮影された画像のデータ処理により、蛍光が観測された初期のデータについては採用せず、発光ダイオード７２から発光された光による蛍光試薬４２の励起後、一定時間経過してから開始する擬似的プラトー部分での蛍光量を求め、抗原濃度に換算する。  When pulsed light is incident on the gold thin film 12 from the light emitting diode 72, the fluorescence optical signal observed in the initial stage includes a short-time fluorescence signal emitted from impurities other than the target fluorescent reagent. It is highly possible that Therefore, the initial data in which fluorescence is observed by the data processing of the image photographed by the two-dimensional CCD camera 73 is not adopted, and a certain time has elapsed after excitation of the fluorescent reagent 42 by the light emitted from the light emitting diode 72. Then, the amount of fluorescence in the pseudo plateau portion starting after that is obtained and converted to the antigen concentration.

この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。  According to the biochemical bond formation and biochemical bond amount measuring method of this embodiment, singlet oxygen is used by a simple measuring device combining a light emitting diode suitable for portability and miniaturization and a CCD camera. Fluorescence emission immunoassay can be measured, and it will be possible to apply to on-site measurement and POCT in the future.

以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。  EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example demonstrate this invention further more concretely, this invention is not limited to a following example.

「実施例１」
（１）測定用基板の作製
図１に示す測定用基板１０を作製した。
まず、スパッタリングにより、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなり、縦１６ｍｍ×横１６ｍｍ×厚さ１ｍｍの透明基板１１の一方の面１１ａに、膜厚約５０ｍｍの金薄膜１２を形成した。
次いで、スポッター装置を用いて、金薄膜１２の一方の面１２ａに、感応剤のローズベンガルを含む溶液を１点あたり４ｎＬの液滴として多数滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、金薄膜１２の一方の面１２ａに、薄膜状に感応剤（ローズベンガル）１３を配置した。
次いで、スパッタリングにより、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａを覆うように、膜厚約１００ｎｍのシリカ薄膜からなる保護膜１４を形成した。
次いで、シランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、唾液中に存在するストレスマーカーとして知られるコルチゾールを抗原とし、そのコルチゾールの１次抗体１５を固定化し、測定用基板１０を得た。 "Example 1"
(1) Production of Measurement Substrate A measurement substrate 10 shown in FIG. 1 was produced.
First, a thin gold film 12 having a film thickness of about 50 mm was formed on one surface 11a of the transparent substrate 11 made of BK7 (borosilicate glass) and measuring 16 mm long × 16 mm wide × 1 mm thick by sputtering.
Next, using a spotter device, a large number of 4 nL droplets of a solution containing the sensitive agent Rose Bengal are dropped on one surface 12a of the gold thin film 12, and then the solvent of the droplets is dried. Then, a sensitive agent (rose bengal) 13 was disposed on one surface 12a of the gold thin film 12 in a thin film shape.
Next, a protective film 14 made of a silica thin film having a thickness of about 100 nm was formed by sputtering so as to cover one surface 12a of the gold thin film 12 and the surface 13a of the sensitive agent 13.
Next, the cortisol known as a stress marker present in saliva is immobilized on the surface 14a of the protective film 14 by chemical bonding via a silane coupling agent, and the primary antibody 15 of the cortisol is immobilized, and the measurement substrate 10 was obtained.

（２）測定用チップの作製
図７に示す測定用チップ３０を作製した。
測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに溶液を保持する空間３１ａを有する溶液保持部材３１を設け、測定用チップ３０を作製した。
溶液保持部材３１としては、ポリジメチルシロキサンからなるシートを型抜きして、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられている部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の空間３１ａを設けた反応ウェルを用いた。 (2) Production of measurement chip A measurement chip 30 shown in FIG. 7 was produced.
On the surface of the measurement substrate 10 on which the primary antibody 15 was provided, the solution holding member 31 having at least the primary antibody 15 and holding the solution 31a was provided, and the measurement chip 30 was produced.
As the solution holding member 31, a sheet made of polydimethylsiloxane is die-cut, and a circular cross section that penetrates in the thickness direction at a position facing at least a portion of the measurement substrate 10 where the primary antibody 15 is provided. The reaction well provided with the space 31a was used.

（３）反応測定
測定用チップ３０の溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、１μｇ／ｍＬのコルチゾールを含むバッファ溶液（ポジティブ・サンプル溶液）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、ポジティブ・サンプル溶液を接触させ、室温にて１０分間、反応させた。バッファ溶液としては、トリス緩衝液を用いた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ポジティブ・サンプル溶液を除去した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、予め調製しておいた蛍光試薬のユーロピウム錯体（Ｓｏｄｉｕｍ［４’−（４’−Ａｍｉｎｏ−４−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−２，２’：−６，２“−ｔｅｒｐｙｄｉｎｅ−６，６”−ｄｉｙｌｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｏ）］ｅｕｒｏｐａｔｅ（ＩＩＩ）］）と結合したコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、このバッファ溶液を接触させ、室温にて２０分間、反応させた。この間、測定用チップ３０をしんとう機に搭載して回転数３０ｒｐｍで揺らした。 (3) Reaction Measurement A buffer solution (positive sample solution) containing 1 μg / mL cortisol flows into the space 31a of the solution holding member 31 of the measurement chip 30, and the primary antibody 15 of the measurement substrate 10 is A positive sample solution was brought into contact with the provided surface and allowed to react at room temperature for 10 minutes. As a buffer solution, Tris buffer was used.
After the reaction was completed, the positive sample solution was removed from the space 31a of the solution holding member 31.
Next, the europium complex (Sodium [4 ′-(4′-Amino-4-biphenyl) -2,2 ′: − 6,2 ”) prepared in advance in the space 31 a of the solution holding member 31. -Terpydine-6,6 "-diylbis (methyliminodiacetato)] europate (III)]) and a buffer solution containing a secondary antibody of cortisol, and a surface on which the primary antibody 15 of the measurement substrate 10 is provided The buffer solution was contacted with each other and reacted at room temperature for 20 minutes. During this time, the measuring chip 30 was mounted on a machine and shaken at a rotation speed of 30 rpm.

反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、溶液保持部材３１の空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ３０を、図１２に示す測定装置５０に設置した。
そして、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなるコニカルプリズム５１の載置面５１ａに、測定用チップ３０を設置し、コニカルプリズム５１介して、発光ダイオード５２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射した。
すると、測定用チップ３０から緑色の蛍光が発光する様子を目視にて確認することができた。
また、２次元ＣＣＤカメラ５３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。 After the reaction was completed, the buffer solution containing the europium complex and the secondary antibody of cortisol was removed from the space 31a of the solution holding member 31, and the space 31a of the solution holding member 31 was washed with the buffer solution.
Next, the measurement chip 30 was placed in the measurement device 50 shown in FIG. 12 in a state where the buffer solution was put in the space 31 a of the solution holding member 31.
Then, the measurement chip 30 is placed on the mounting surface 51a of the conical prism 51 made of BK7 (borosilicate glass), and the light (wavelength 680 nm) emitted from the light emitting diode 52 is transmitted through the conical prism 51 to the transparent substrate 11. It entered the gold thin film 12 from the side.
Then, it was possible to visually confirm how green fluorescence was emitted from the measuring chip 30.
Further, a fluorescence image was recorded by the two-dimensional CCD camera 53, and the image data was processed to obtain a fluorescence amount for 300 μs after 500 μs from the start of fluorescence emission.

「実施例２」
（１）測定用基板の作製
図６に示す測定用基板２０を作製した。
まず、電子線リソグラフィーにより、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなり、縦１６ｍｍ×横１６ｍｍ×厚さ１ｍｍの透明基板１１の一方の面１１ａに、幅２０ｎｍ×２０ｎｍ、膜厚約２０ｍｍのドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２を形成した。
次いで、スポッター装置を用いて、それぞれのドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａに、感応剤のローズベンガルを含む溶液を１点あたり４ｎＬの液滴として滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、ドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａに、ドット状に感応剤（ローズベンガル）２３を配置した。
次いで、スパッタリングにより、ドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａおよび感応剤２３の表面２３ａを覆うように、膜厚約１００ｎｍのシリカ薄膜からなる保護膜１４を形成した。
次いで、シランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、唾液中に存在するストレスマーカーとして知られるコルチゾールを抗原とし、そのコルチゾールの１次抗体１５を固定化し、測定用基板２０を得た。 "Example 2"
(1) Production of measurement substrate A measurement substrate 20 shown in FIG. 6 was produced.
First, by electron beam lithography, dot-shaped gold having a width of 20 nm × 20 nm and a film thickness of about 20 mm is formed on one surface 11a of a transparent substrate 11 made of BK7 (borosilicate glass), which is 16 mm long × 16 mm wide × 1 mm thick. An aggregate 22 of thin films 22A was formed.
Next, using a spotter device, a solution containing a rose bengal as a sensitive agent is dropped on one surface 22a of each dot-like thin gold film 22A as 4 nL droplets per point, and then the solvent of the droplets Was removed by drying or the like, and a sensitive agent (rose bengal) 23 was disposed in a dot shape on one surface 22a of the dot-shaped gold thin film 22A.
Next, a protective film 14 made of a silica thin film having a thickness of about 100 nm was formed by sputtering so as to cover one surface 22a of the dot-shaped gold thin film 22A and the surface 23a of the sensitive agent 23.
Next, the cortisol known as a stress marker present in saliva is immobilized on the surface 14a of the protective film 14 by chemical bonding via a silane coupling agent, and the primary antibody 15 of the cortisol is immobilized, and the measurement substrate 20 was obtained.

（２）測定用チップの作製
図１４に示す測定用チップ６０を作製した。
測定用基板２０の１次抗体１５が設けられた面上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに溶液を保持する空間６１ａを有するシート状の第一部材６１と、溶液を空間６１ａ内に流入する流入部６２ａおよび空間６１ａから溶液を排出する排出部６２ｂを有するシート状の第二部材６２とから構成される溶液保持部材６３を設け、測定用チップ６０を作製した。
溶液保持部材６３としては、第一部材６１と第二部材６２を積層した、フローセルを用いた。
第一部材６１としては、両面テープを型抜きして、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられた部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面長方形の空間６１ａが設けられたものを用いた。
第二部材６２としては、ポリジメチルシロキサンシートを型抜きして、第一部材６１の空間６１ａの一端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の流入部６２ａが設けられ、かつ、第一部材６１の空間６１ａの他端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の排出部６２ｂが設けられたものを用いた。 (2) Production of measurement chip A measurement chip 60 shown in FIG. 14 was produced.
On the surface of the measurement substrate 20 on which the primary antibody 15 is provided, a sheet-like first member 61 having a space 61a that contains at least the primary antibody 15 and holds the solution, and the solution flows into the space 61a. The solution holding member 63 comprised of the sheet-like second member 62 having the inflow portion 62a and the discharge portion 62b for discharging the solution from the space 61a was provided, and the measurement chip 60 was produced.
As the solution holding member 63, a flow cell in which the first member 61 and the second member 62 are laminated is used.
As the first member 61, a double-sided tape is punched out, and a space 61a having a rectangular cross section penetrating in the thickness direction is provided at a position facing at least a portion of the measurement substrate 10 where the primary antibody 15 is provided. What was used was used.
As the second member 62, a polydimethylsiloxane sheet is punched out, and an inflow portion 62a having a circular cross section penetrating in the thickness direction is provided at a position facing one end of the space 61a of the first member 61, and The first member 61 is provided with a discharge section 62b having a circular cross section penetrating in the thickness direction at a position facing the other end of the space 61a.

（３）反応測定
実施例１と同様にして、測定用チップ６０の第一部材６１の空間６１ａ内に、１μｇ／ｍＬのコルチゾールを含むバッファ溶液（ポジティブ・サンプル溶液）を流入して、反応させた後、測定用チップ６０の第一部材６１の空間６１ａ内に、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、反応させた。
反応が完了した後、第一部材６１の空間６１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、第一部材６１の空間６１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ６０を、図１５に示す測定装置７０に設置した。
そして、発光ダイオード７２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に入射した。
すると、測定用チップ６０から緑色の蛍光が発光する様子を目視にて確認することができた。
また、２次元ＣＣＤカメラ７３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。 (3) Reaction measurement In the same manner as in Example 1, a buffer solution (positive sample solution) containing 1 μg / mL of cortisol was allowed to flow into the space 61a of the first member 61 of the measurement chip 60 and reacted. After that, a buffer solution containing a europium complex and a secondary antibody of cortisol was allowed to flow into the space 61a of the first member 61 of the measurement chip 60 and reacted.
After the reaction was completed, the buffer solution containing the europium complex and the secondary antibody of cortisol was removed from the space 61a of the first member 61, and the space 61a of the first member 61 was washed with the buffer solution.
Next, the measurement chip 60 was placed in the measurement device 70 shown in FIG. 15 in a state where the buffer solution was put in the space 61 a of the first member 61.
The light (wavelength 680 nm) emitted from the light emitting diode 72 was incident on the aggregate 22 composed of the dot-shaped gold thin film 22A from the transparent substrate 11 side.
Then, it was possible to visually confirm how green fluorescence was emitted from the measuring chip 60.
In addition, a fluorescence image was recorded with a two-dimensional CCD camera 73, and the image data was processed to obtain a fluorescence amount for 300 μs after 500 μs from the start of fluorescence emission.

「比較例」
（１） 測定用基板の作製
実施例１と同様にして、図１に示す測定用基板１０を作製した。
（２）測定用チップの作製
実施例１と同様にして、図７に示す測定用チップ３０を作製した。
（３）反応測定
測定用チップ３０の溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、バッファ溶液のみ（ネガティブ・サンプル溶液）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、ネガティブ・サンプル溶液を接触させ、室温にて１０分間、反応させた。バッファ溶液としては、トリス緩衝液を用いた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ネガティブ・サンプル溶液を除去した。
次いで、実施例１と同様にして、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、反応させた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、溶液保持部材３１の空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ３０を、図１２に示す測定装置５０に設置した。
そして、実施例１と同様にして、発光ダイオード５２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射した。
すると、測定用チップ３０から蛍光が発光する様子を目視にて確認することができなかった。
また、２次元ＣＣＤカメラ５３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。 "Comparative example"
(1) Production of Measurement Substrate In the same manner as in Example 1, the measurement substrate 10 shown in FIG.
(2) Production of Measurement Chip A measurement chip 30 shown in FIG. 7 was produced in the same manner as in Example 1.
(3) Reaction measurement Only the buffer solution (negative sample solution) flows into the space 31a of the solution holding member 31 of the measurement chip 30, and the surface of the measurement substrate 10 on which the primary antibody 15 is provided, The negative sample solution was contacted and allowed to react for 10 minutes at room temperature. As a buffer solution, Tris buffer was used.
After the reaction was completed, the negative sample solution was removed from the space 31a of the solution holding member 31.
Next, in the same manner as in Example 1, a buffer solution containing a europium complex and a secondary antibody of cortisol was allowed to flow into the space 31a of the solution holding member 31 and reacted.
After the reaction was completed, the buffer solution containing the europium complex and the secondary antibody of cortisol was removed from the space 31a of the solution holding member 31, and the space 31a of the solution holding member 31 was washed with the buffer solution.
Next, the measurement chip 30 was placed in the measurement device 50 shown in FIG. 12 in a state where the buffer solution was put in the space 31 a of the solution holding member 31.
In the same manner as in Example 1, light (wavelength 680 nm) emitted from the light emitting diode 52 was incident on the gold thin film 12 from the transparent substrate 11 side.
Then, it was not possible to visually confirm how the fluorescence was emitted from the measuring chip 30.
Further, a fluorescence image was recorded by the two-dimensional CCD camera 53, and the image data was processed to obtain a fluorescence amount for 300 μs after 500 μs from the start of fluorescence emission.

以上の結果から、実施例１および２において求められた蛍光量と、比較例において求められた蛍光量とを比較したところ、実施例１および２の蛍光量は、比較例の蛍光量の３倍以上であることが分かった。これより、実施例１および２によれば、発光ダイオードを用いた測定装置にて、プラズモン増強蛍光イムノアセイが実現できることを確認できた。  From the above results, when the fluorescence amount obtained in Examples 1 and 2 was compared with the fluorescence amount obtained in the comparative example, the fluorescence amount in Examples 1 and 2 was three times the fluorescence amount in the comparative example. It turns out that it is above. Thus, according to Examples 1 and 2, it was confirmed that plasmon-enhanced fluorescence immunoassay can be realized with a measuring device using a light emitting diode.

なお、実施例１で用いたウェル型測定用チップ３０は、一般的な９６穴ウェルと同じサイズのウェルとして設計していることから、ジグに設置することによって、上記の測定装置５０に限らず、市販の生化学用蛍光測定装置に適用することもできる。  Since the well-type measurement chip 30 used in Example 1 is designed as a well having the same size as a general 96-well, it is not limited to the measurement apparatus 50 described above by being installed in a jig. It can also be applied to a commercially available fluorescence measuring apparatus for biochemistry.

１０・・・測定用基板、１１・・・透明基板、１２・・・金薄膜、１３・・・感応剤、１４・・・保護膜、１５・・・１次抗体、２０・・・測定用基板、２２・・・集合体、２２Ａ・・・ドット状の金薄膜、２３・・・感応剤、３０・・・測定用チップ、３１・・・溶液保持部材、４１・・・抗原、４２・・・蛍光試薬、４３・・・２次抗体、５０・・・測定装置、５１・・・コニカルプリズム、５２・・・発光ダイオード、５３・・・２次元ＣＣＤカメラ、５４・・・フィルタ、６０・・・測定用チップ、６１・・・第一部材、６２・・・第二部材、６３・・・溶液保持部材、７０・・・測定装置、７２・・・発光ダイオード、７３・・・２次元ＣＣＤカメラ、７４・・・フィルタ。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Measuring substrate, 11 ... Transparent substrate, 12 ... Gold thin film, 13 ... Sensitive agent, 14 ... Protective film, 15 ... Primary antibody, 20 ... For measurement Substrate, 22 ... Aggregate, 22A ... Dot-like gold thin film, 23 ... Sensitive agent, 30 ... Measurement chip, 31 ... Solution holding member, 41 ... Antigen, 42. ..Fluorescent reagent, 43 ... secondary antibody, 50 ... measuring device, 51 ... conical prism, 52 ... light emitting diode, 53 ... two-dimensional CCD camera, 54 ... filter, 60 ... Measurement chip, 61 ... first member, 62 ... second member, 63 ... solution holding member, 70 ... measuring device, 72 ... light emitting diode, 73 ... 2 Dimensional CCD camera, 74 ... filter.

Claims (5)

光源と光検出素子による反射光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、
透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられた金薄膜と、該金薄膜上に配置され、前記金属膜の表面に誘起された表面プラズモン波により励起されることにより一重項酸素を生成する感応剤と、前記金薄膜および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする測定用基板。 A measurement substrate used in a measurement method configured to detect biochemical bond formation and biochemical bond amount using enhancement by surface plasmon resonance in a measurement apparatus including a reflection optical system including a light source and a light detection element. ,
A single substrate oxygen is generated by being excited by a surface plasmon wave placed on the gold thin film and induced on the surface of the metal film, a transparent thin film, a gold thin film provided on one surface of the transparent substrate. A measurement substrate comprising: a sensitizing agent, a protective film covering the gold thin film and the sensitizing agent, and a primary antibody immobilized on the surface of the protective film. 光源と光検出素子による透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、
透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられたドット状の金薄膜の集合体と、該集合体上に配置され、前記金属膜の表面に誘起された表面プラズモン波により励起されることにより一重項酸素を生成する感応剤と、前記集合体および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする測定用基板。 A measurement substrate used in a measurement method configured to detect biochemical bond formation and biochemical bond amount using enhancement by surface plasmon resonance in a measurement apparatus configured by a transmission optical system including a light source and a light detection element. ,
A transparent substrate, a collection of dots like gold thin film provided on one surface of the transparent substrate, that is disposed on the aggregate, it is excited by the surface plasmon waves induced on a surface of the metal film For measurement, comprising: a sensitive agent that generates singlet oxygen by: a protective film that covers the aggregate and the sensitive agent; and a primary antibody immobilized on the surface of the protective film. substrate. 前記保護膜はシリカ薄膜であることを特徴とする請求項１または２に記載の測定用基板。  The measurement substrate according to claim 1, wherein the protective film is a silica thin film. 請求項１に記載の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、
前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間を有する溶液保持部材を設けるステップＡ１と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ１と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ１と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を測定するステップＤ１と、を有することを特徴とする生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法。 A biochemical bond formation and biochemical bond amount measurement method using the measurement substrate according to claim 1,
A step A1 of providing a solution holding member having a space for containing the primary antibody and holding the solution α to be measured on the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided; and the solution in the space. Step B1 in which α is introduced to bring the solution α into contact with the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided, and a solution β containing a secondary antibody bound to a fluorescent reagent is introduced into the space. Step C1 for bringing the solution β into contact with the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided, and light is incident on the gold thin film from the transparent substrate side and excited from the fluorescent reagent by the incident light A method of measuring biochemical bond formation and the amount of biochemical bond, characterized in that it comprises a step D1 of measuring the measured fluorescence. 請求項２に記載の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、
前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間、並びに、前記溶液αを前記空間内に流入する流入部および前記空間から前記溶液αを排出する排出部を有する溶液保持部材を設けるステップＡ２と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ２と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ２と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を測定するステップＤ２と、を有することを特徴とする生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法。 A method for measuring biochemical bond formation and biochemical bond amount using the measurement substrate according to claim 2,
On the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided, a space that contains at least the primary antibody and holds the solution α to be measured, an inflow portion that flows the solution α into the space, and Step A2 of providing a solution holding member having a discharge part for discharging the solution α from the space, and the solution α flowing into the space and the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided, the solution Step B2 in which α is brought into contact, and a step in which a solution β containing a secondary antibody bound to a fluorescent reagent is introduced into the space and the solution β is brought into contact with the surface of the measurement substrate on which the primary antibody is provided. C2 and the step D2 of measuring the fluorescence excited from the fluorescent reagent by the incident light and entering the gold thin film from the transparent substrate side, and biochemical bond formation, Birth Method of measuring the specific binding.

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