JP5419680B2 - アルコール性肝障害診断用マーカーペプチドおよびそれを利用したアルコール性肝障害診断方法 - Google Patents
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Description
網羅的発現タンパク解析の手法として一般的なのは二次元タンパク電気泳動であるが、低分子量蛋白またはペプチドの検出に難がある。近年、matrix−assisted laser desorption ionization(MALDI)やsurface enhanced laser desorption ionization (SELDI)と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーが開発され、新規腫瘍マーカーの検出など臨床応用が始まっている(非特許文献3)。従ってこれらのプロテオミクス技術などを活用して網羅的に新たなマーカーを検索することが求められている。
Anton RF et al.,Alcolism Clin.Exp.Res.,2002;26:1215−1222 Niomola O et al.,J.Clin.Invest,1991;87:1367−13741 Petricoin EF et al.,Lancet,2002;359:572−577
更に、本発明は、アルコール性肝障害が疑われる患者から得た検体中の、上記の1種またはそれ以上のアルコール性肝障害マーカーペプチドの存否を検出しあるいはその量を測定して、アルコール性肝障害発症可能性、アルコール性肝障害あるいはアルコール性肝障害の予後を診断する方法に関する。
本発明によりアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドとして利用できることが見出されたペプチドは、配列表の配列番号1から4のアミノ酸配列を有するヒトフィブリノーゲン由来分解産物であるペプチドから選ばれる。
配列表の配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチド(以下1.4kDaペプチドと記載することもある)は、理論分子量が1465.4である。1.4kDaペプチドは、15個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、ヒトフィブリノペプチドA分解産物である。サンプル中の1.4kDaペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは高くなり、そうでないときは、その濃度が低くなるかほとんど検出できない。
配列表の配列番号2のアミノ酸配列を有するペプチド(以下1.5kDaペプチドと記載することもある)は、その理論分子量は1545.6である。1.5kDaペプチドは、セリンがリン酸化されている15個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、ヒトフィブリノペプチドA分解産物である。サンプル中の1.5kDaペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは高くなりやすく、そうでないときは、その濃度が低くなるかほとんど検出できない。
配列表の配列番号3のアミノ酸配列を有するペプチド(以下1.6kDaペプチドと記載することもある)は、その理論分子量は1616.6である。1.6kDaペプチドは、セリンがリン酸化されている16個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、ヒトフィブリノペプチドA分解産物である。サンプル中の1.6kDaペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは高くなりやすく、そうでないときは、その濃度が低くなるかほとんど検出できない。
配列表の配列番号4のアミノ酸配列を有するペプチド(以下2.6kDaペプチドと記載することもある)は、その理論分子量は2659.6である。2.6kDaペプチドは、25個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、フィブリノーゲンα−E鎖(Fibrinogen α−E chain)分解産物である。サンプル中の2.6kDaペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは低くなりやすいか検出しにくく、そうでないときは、濃度が高くなりやすい。
本発明で用いることのできる検体としては、アルコール性肝障害が疑われる患者から採取した血清、血漿、血液、尿などが挙げられる。
本発明のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否の検出あるいはその量の測定は、現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、質量分析法、免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー(LC)法、ガスクロマトグラフィー(GC)法などが挙げられる。
MALDI−TOF MS法は、MALDIと飛行型質量分析計を組み合わせたプロテオーム解析法であり、例えば、Bruker Daltonics社のクリント・プロットシステムTM・マス・スペクトロメーターを使用することができる。この場合、例えば、磁気ビーズ、好ましくは陽イオン磁気ビーズにサンプルを加え、本発明のマーカーを吸着させ、次いで、それを溶出し、溶出液にマトリックス溶液を加えアンカーチップにアプライしてシステムに適用することにより、マーカー濃度の存否、高い低いを読み取ることができる。
SELDI−TOF MS法は、SELDIと飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーであり、例えば、Ciphergen 社により開発されたプロテイン・バイオロジー・システムII・マス・スペクトロメーター(Ciphergen Biosystems ,Inc)を使用することができる。その詳細はWO 01/25791 A2号公報、特開2001−281222号公報等に詳しい。この場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、SELDI−TOF MS質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。
これらの方法に用いられるプロテインチップとしては、本発明のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドを吸着できるチップであれば特に限定しない。例えば、疎水性やイオン交換などのペプチドに親和性を持つ官能基が修飾されているチップ(ケミカルチップともいう)、目的のペプチドに対する抗体を固定化したチップ(バイオケミカルチップ)等を例示できる。
免疫測定法としては、本発明のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作成し、従来知られているペプチドを測定する免疫測定法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法(EIA法)、免疫比濁測定法(TIA法)、ラテックス免疫凝集法(LATEX法)、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
これらの方法以外にも、電気泳動法、液体クロマトグラフィー(LC)法、ガスクロマトグラフィー(GC)法などが挙げられる。これらの方法も既に当業者に周知であり、それらの周知の方法をそのまま採用することができる。
本発明の診断方法は、上記した質量分析により行う場合には、質量分析計によって得られるスペクトルのパターン分析によって診断することもできる。本発明の診断方法は、例えば、習慣飲酒者や問題飲酒者がアルコール性肝障害を発症する可能性を診断することもでき、飲酒が要因のアルコール性肝障害、例えば、肝炎、肝硬変などを診断することもでき、また通常のアルコール性肝障害を診断することもできる。更には、アルコール性肝障害の治療経過などを診断することもできる。本発明の診断方法は、特にアルコール性肝障害の診断に適している。
インフォームド・コンセントを行った3名の患者血清を使用して、WCX ClinProt Magnetic Beads(Bruker Daltonics,Inc)を用いて血清中の新規肝障害マーカーを探索した。 WCX Magnetic Beads とは Weak Cation Exchange Magnetic Beads のことであり、検体中の正電荷物質を結合させるという特徴を持っている。検体としてアルコール性肝障害患者3名の入院直後及び禁酒3ヶ月後のそれぞれの血清を用いた。
以下にWCX ClinProt Magnetic Beads実験操作法を簡単に述べる。チューブに10μlのBinding solution(Bruker Daltonics,Inc)、10μlのビーズ溶液(Bruker Daltonics,Inc)と5μlの血清を加え、5分間インキュベーションした。チューブをMagnetic Beads Separator(Bruker Daltonics,Inc)に置き、1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてMagnetic Beads Separatorからチューブを外し、100μlの洗浄液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、Magnetic Beads Separatorにチューブを立て、前後に10回チューブを移動させた。1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を3回繰り返した。10μlの溶出液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをMagnetic Beads Separatorに立て、2分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。10μlのStabilization Solution(Bruker Daltonics,Inc)を溶出液に加えた。Matrix Solutionは0.3g/Lα−シアノ−4−ヒドロキシシンナミノ酸(Bruker Daltonics,Inc)をエタノール(Wako)/アセトン(Wako)(2:1)で溶かした溶液を用いた。10μlの溶出液に20μlのMatrix Solutionを加え、1μlをAnchor chip(Bruker Daltonics,Inc)にアプライした。作製したAnchor chipはAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)によって読み取った。
図1に代表的なアルコール性肝障害患者3名の血清の入院直後及び禁酒3ヶ月後のそれぞれのデータを示す。Anchor chip から脱離したサンプルの蛋白質の分子量を横軸に、その分子量で検出器に到達した分析物の量を反映するピークを縦軸で表すことができる。よって図1から明らかなように、アルコール性肝障害患者の入院時のデータでは、分子量1.4kDa蛋白質、1.5kDa蛋白質及び1.6kDa蛋白質のピークが観察されたが、入院後はほとんど観察されないことが判明した。一方、アルコール性肝障害患者の禁酒3ヶ月後のデータでは、分子量2.6kDa蛋白質のピークが観察されたが、入院直後はほとんど観察されないことが判明した。従って、この1.4kDaペプチド、1.5kDaペプチド、1.6kDaペプチド及び2.6kDaペプチドを指標として、アルコール性肝障害を診断できることが判った。
WCX ClinProt Magnetic Beads実験によって見出された1.4kDaペプチドについて、チューブに10μlのBinding solution(Bruker Daltonics,Inc)、10μlのビーズ溶液(Bruker Daltonics,Inc)と5μlの血清を加え、5分間インキュベーションした。チューブをMagnetic Beads Separator(Bruker Daltonics,Inc)に置き、1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてMagnetic Beads Separatorからチューブを外し、100μlの洗浄液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、Magnetic Beads Separatorにチューブを立て、前後に10回チューブを移動させた。1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を3回繰り返した。10μlの溶出液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをMagnetic Beads Separatorに立て、2分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。10μlのStabilization Solution(Bruker Daltonics,Inc)を溶出液に加えた。Matrix Solutionは0.3g/Lα−シアノ−4−ヒドロキシシンナミノ酸(Bruker Daltonics,Inc)をethanol(Wako)/acetone(Wako)(2:1)で溶かした溶液を用いた。10μlの溶出液に20μlのMatrix Solutionを加え、1μlをAnchor chip(Bruker Daltonics,Inc)にアプライした。作製したAnchor chipはAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)によって読み取った。そのデータを取得後、MascotTM(Matrix Science,Inc)検索を行った結果、ヒトフィブリノペプチドAの分解産物であることがわかった。1.4kDaぺプチドのAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図2に示す。また、1.4kDaぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示した。
WCX ClinProt Magnetic Beads実験によって見出された1.5kDaペプチドについて、チューブに10μlのBinding solution(Bruker Daltonics,Inc)、10μlのビーズ溶液(Bruker Daltonics,Inc)と5μlの血清を加え、5分間インキュベーションした。チューブをMagnetic Beads Separator(Bruker Daltonics,Inc)に置き、1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてMagnetic Beads Separatorからチューブを外し、100μlの洗浄液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、Magnetic Beads Separatorにチューブを立て、前後に10回チューブを移動させた。1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を3回繰り返した。10μlの溶出液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをMagnetic Beads Separatorに立て、2分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。10μlのStabilization Solution(Bruker Daltonics,Inc)を溶出液に加えた。Matrix Solutionは0.3g/Lα−シアノ−4−ヒドロキシシンナミノ酸(Bruker Daltonics,Inc)をエタノール(Wako)/アセトン(Wako)(2:1)で溶かした溶液を用いた。10μlの溶出液に20μlのMatrix Solutionを加え、1μlをAnchor chip(Bruker Daltonics,Inc)にアプライした。作製したAnchor chipはAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)によって読み取った。そのデータを取得後、MascotTM(Matrix Science,Inc)検索を行った結果、ヒトフィブリノペプチドAの分解産物であることがわかった。1.5kDaペプチドのAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図3に示す。また、1.5kDaぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号2に示した。
WCX ClinProt Magnetic Beads実験によって見出された1.6kDaペプチドについて、チューブに10μlのBinding solution(Bruker Daltonics,Inc)、10μlのビーズ溶液(Bruker Daltonics,Inc)と5μlの血清を加え、5分間インキュベーションした。チューブをMagnetic Beads Separator(Bruker Daltonics,Inc)に置き、1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてMagnetic Beads Separatorからチューブを外し、100μlの洗浄液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、Magnetic Beads Separatorにチューブを立て、前後に10回チューブを移動させた。1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を3回繰り返した。10μlの溶出液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをMagnetic Beads Separatorに立て、2分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。10μlのStabilization Solution(Bruker Daltonics,Inc)を溶出液に加えた。Matrix Solutionは0.3g/Lα−シアノ−4−ヒドロキシシンナミノ酸(Bruker Daltonics,Inc)をエタノール(Wako)/アセトン(Wako)(2:1)で溶かした溶液を用いた。10μlの溶出液に20μlのMatrix Solutionを加え、1μlをAnchor chip(Bruker Daltonics,Inc)にアプライした。作製したAnchor chipはAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)によって読み取った。そのデータを取得後、MascotTM(Matrix Science,Inc)検索を行った結果、ヒトフィブリノペプチドAの分解産物であることがわかった。1.6kDaペプチドのAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図4に示す。また、1.6kDaぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号3に示した。
WCX ClinProt Magnetic Beads実験によって見出された2.6kDaペプチドについて、チューブに10μlのBinding solution(Bruker Daltonics,Inc)、10μlのビーズ溶液(Bruker Daltonics,Inc)と5μlの血清を加え、5分間インキュベーションした。チューブをMagnetic Beads Separator(Bruker Daltonics,Inc)に置き、1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてMagnetic Beads Separatorからチューブを外し、100μlの洗浄液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、Magnetic Beads Separatorにチューブを立て、前後に10回チューブを移動させた。1分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を3回繰り返した。10μlの溶出液(Bruker Daltonics,Inc)を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをMagnetic Beads Separatorに立て、2分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。10μlのStabilization Solution(Bruker Daltonics,Inc)を溶出液に加えた。Matrix Solutionは0.3g/Lα−シアノ−4−ヒドロキシシンナミノ酸(Bruker Daltonics,Inc)をエタノール(Wako)/アセトン(Wako)(2:1)で溶かした溶液を用いた。10μlの溶出液に20μlのMatrix Solutionを加え、1μlをAnchor chip(Bruker Daltonics,Inc)にアプライした。作製したAnchor chipはAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)によって読み取った。そのデータを取得後、MascotTM(Matrix Science,Inc)検索を行った結果、ヒトフィブリノーゲンα−E鎖の分解産物であることがわかった。2.6kDaペプチドのAutoFlex II(Bruker Daltonics,Inc)で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図5に示す。また、2.6kDaぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号4に示した。
Claims (6)
- 配列表の配列番号1または3のアミノ酸配列を有するヒトフィブリノーゲン由来分解産物であるペプチドから選ばれるアルコール性肝障害診断用マーカーペプチド。
- アルコール性肝障害が疑われる患者から得た検体中の、請求項1記載の1種またはそれ以上のアルコール性肝障害マーカーペプチドの存否を検出しあるいはその量を測定して、アルコール性肝障害発症可能性、アルコール性肝障害あるいはアルコール性肝障害の予後の診断に用いるためのデータを得る方法。
- 検体中のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否の検出あるいはその量の測定を質量分析法により行なう請求項2の方法。
- 質量分析計で得られるスペクトルのパターン分析により、診断に用いるためのデータを得る請求項3の方法。
- 質量分析をレーザーイオン化飛行時間型質量分析計(LDI−TOF MS)により行う請求項4の方法。
- 検体中のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否の検出あるいはその量の測定を、該ペプチドに対する抗体を用いた免疫測定法により行う請求項2の方法。
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