JP5419112B2 - A method for enhancing seed dormancy of wheat by accumulation of abscisic acid metabolizing enzyme gene mutations - Google Patents

A method for enhancing seed dormancy of wheat by accumulation of abscisic acid metabolizing enzyme gene mutations Download PDF

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Description

本発明は、遺伝子変異集積に基づくコムギの種子休眠性強化方法に関する。   The present invention relates to a method for enhancing seed dormancy of wheat based on gene mutation accumulation.

通常、種子は休眠性を有しており、収穫前及び収穫直後の発芽が抑制されている。しかし、半乾燥地域を起源とするコムギ（Triticum aestivum）の種子は元来休眠性が弱いため、栽培の均一化や大規模化、機械化の過程で穂発芽（収穫前に親植物上で種子が発芽する現象）が問題とされるようになってきた。本州以南の日本では、コムギの収穫時期が梅雨入り前後に当たるため、降雨や高湿度に基づく吸水刺激による穂発芽がしばしば起きる。梅雨のない北海道でも、コムギの収穫時期には霧が多く、穂発芽が起きる。世界的には、登熟期が低温・曇天になりやすいイギリスやスウェーデン、ポーランド、ドイツなどの北ヨーロッパの地域では、穂発芽は大きな問題である。近年の異常気象の多発により、カナダやアメリカ、オーストラリアなどのこれまで穂発芽が問題とならなかった地域でも、穂発芽被害が報告されるようになっている。穂発芽は、薬剤による防除が難しいため、コムギの最も厄介な障害とされているが、既存の栽培手法では穂発芽問題の解決は難しい。穂発芽が生ずると、種子のデンプン等が消費されることになる。このため穂発芽した種子が収穫物に混入することにより、小麦粉製品の品質低下が起きる。そこで、穂発芽しない種子休眠性の強いコムギ品種を作るための技術が必要とされている。一方で、作物であるコムギでは、収穫時期には発芽しないが播種時期には一斉に発芽することが必要になる。そのため、種子休眠性を高めるだけでなく、適切な期間・適切な程度のみ発芽が抑制されたコムギ品種を作製できる技術も求められる。   Usually, seeds have dormancy and germination is suppressed before and after harvesting. However, wheat (Triticum aestivum) seeds originated from semi-arid areas are weakly dormant by nature, so that germination of seeds during the homogenization, scale-up and mechanization of the seeds (seeds on the parent plant before harvesting) The phenomenon of germination) has become a problem. In Japan south of Honshu, wheat germination occurs before and after the rainy season, so sprouting is often caused by water absorption stimulation based on rainfall and high humidity. Even in Hokkaido, where there is no rainy season, there is a lot of fog and wheat germination occurs when wheat is harvested. Globally, ear germination is a major problem in areas of northern Europe such as the UK, Sweden, Poland, and Germany, where the ripening period is prone to low temperatures and cloudy weather. Due to the frequent occurrence of abnormal weather in recent years, damage to ear sprouting has been reported even in regions such as Canada, the United States and Australia, where sprouting has not been a problem so far. Panicle germination is the most troublesome obstacle in wheat because it is difficult to control with chemicals, but it is difficult to solve the ear germination problem with existing cultivation methods. When panicle germination occurs, seed starch and the like are consumed. For this reason, the quality of the flour product is reduced by mixing the germinated seeds into the harvest. Therefore, there is a need for a technique for making a wheat variety with strong seed dormancy that does not germinate. On the other hand, wheat, which is a crop, does not germinate at harvest time but must germinate simultaneously at sowing time. Therefore, there is a need for a technique that not only enhances seed dormancy but also enables production of wheat cultivars in which germination is suppressed for an appropriate period and an appropriate level.

アブシジン酸（ABA）は、種子休眠に関与する植物ホルモンである。種子が休眠から覚め、発芽する際にABA量は減少する。このABA量の減少には、ABAの主要な不活化酵素であるABA8'位水酸化酵素（ABA8'ox）によるABAの代謝が関与している（非特許文献１）。これまでに、シロイヌナズナの突然変異体やオオムギの形質転換体を用いた解析では、種子が発芽する際に機能しているABA8'oxの遺伝子発現量を抑制すると、発芽が著しく遅延することが示されている（非特許文献１〜３)。   Abscisic acid (ABA) is a plant hormone involved in seed dormancy. As seeds wake up from dormancy and germinate, the amount of ABA decreases. This decrease in the amount of ABA involves metabolism of ABA by ABA 8′-hydroxylase (ABA 8′ox), which is the main inactivating enzyme of ABA (Non-patent Document 1). So far, analyzes using Arabidopsis mutants and barley transformants have shown that if the expression level of ABA8'ox, which functions when seeds germinate, is suppressed, germination is significantly delayed. (Non-Patent Documents 1 to 3).

コムギでも、シロイヌナズナやオオムギと同様に、種子が発芽する際に機能しているABA8'oxの活性を大幅に低下させることができれば、発芽が抑制される可能性がある。しかし、コムギ（Triticum aestivum）はA、B、Dの３種のゲノムからなる異質6倍体であり、発芽時に発現しているコムギABA8'ox遺伝子（TaABA8'ox1）として3つの同祖遺伝子（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D)がゲノムA、B、D上に1つずつ存在する。異質6倍体であるコムギでは、優性の遺伝子変異を除き、遺伝子変異を表現型の変化につなげるには、同祖遺伝子群全てに変異を導入する必要がある。例えば、顆粒結合型澱粉合成酵素（GBSSI）の遺伝子変異であるモチ性（waxy）変異を例として説明すると、2倍体であるイネやオオムギ、トウモロコシでは、放射線などの変異原処理により作られたモチ変異体の報告が多数あり、変異の確率は1/10-6と推定されている。その推定を基準とすれば、コムギでモチ性変異体が変異原処理により起きる確率は1/10-6ｘ1/10-6ｘ1/10-6=1/10-18となり、その確率は限りなく低い。このことから、コムギのTaABA8'ox1遺伝子でも、単純な変異原処理では、同様に極めて低い確率でしか全ての同祖遺伝子に変異が起きないため、表現型が改変されたTaABA8'ox1変異体を作出することは極めて難しいと考えられる。RNAi法やアンチセンスRNA法などを利用して、TaABA8'ox1の発現を抑制した組換えコムギを作出する方法もあるが、組換え作物の利用についての社会的受容状況はまだ厳しく、組換えコムギの実用化は困難な状況にある。In wheat as well as in Arabidopsis and barley, germination may be suppressed if the activity of ABA8'ox, which functions when seeds germinate, can be significantly reduced. However, wheat (Triticum aestivum) is an allogeneous hexaploid consisting of three types of genomes A, B, and D. Three homologous genes (TaABA8'ox1) are expressed as wheat ABA8'ox gene (TaABA8'ox1). TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B, and TaABA8′ox1D) exist on genomes A, B, and D one by one. In wheat, which is an allogeneic hexaploid, mutations must be introduced into all homologous gene groups in order to connect genetic mutations to phenotypic changes, except for dominant genetic mutations. For example, a waxy mutation, which is a gene mutation of the granule-bound starch synthase (GBSSI), is explained as an example. In diploid rice, barley, and corn, it was made by treatment with mutagens such as radiation. There are many reports of mochi mutants, and the probability of mutation is estimated to be 1/10 -6 . If a reference the estimated probability caused by the mutagen treatment waxy mutants wheat 1/10 -6 x1 / 10 -6 x1 / 10 -6 = 1/10 -18 , and the the probability is infinitely Low. Therefore, even in the TaABA8'ox1 gene of wheat, all the homologous genes are mutated with a very low probability by simple mutagen treatment. It is considered extremely difficult to produce. There are methods to produce recombinant wheat that suppresses TaABA8'ox1 expression using RNAi method or antisense RNA method, but the social acceptance of the use of recombinant crops is still severe, and recombinant wheat Is in a difficult situation.

TaABA8'ox1同祖遺伝子群には、終止コドン直後にそれぞれ長さの異なるギャップがある。このギャップを含む領域をPCRで増幅し、得られた増幅断片の電気泳動パターンを比較することで、TaABA8'ox1同祖遺伝子間の遺伝子型の違いを検出することができる（非特許文献４）。この多型検出法では、コムギ遺伝資源系統は、TaABA8'ox1A, B, Dのそれぞれに由来する3本のバンドが増幅される系統（ABD型）と、TaABA8'ox1Dに由来するバンドが増幅されない系統（AB型）に分けられる。このTaABA8'ox1の遺伝子型と種子休眠性との関係については、ABD型を示すコムギ品種「ゼンコウジコムギ」とAB型を示すコムギ品種「タマイズミ」の半数体倍加系統（DH）を用いて解析した場合、TaABA8'ox1の遺伝子型の相違による種子休眠性への影響は認められなかったことが報告されている（非特許文献４）。   The TaABA8'ox1 homologous genes have gaps of different lengths immediately after the stop codon. A region containing this gap is amplified by PCR, and the electrophoretic patterns of the amplified fragments thus obtained are compared to detect a genotype difference between TaABA8'ox1 homologous genes (Non-patent Document 4). . In this polymorphism detection method, the wheat genetic resource lines are a line in which three bands derived from TaABA8'ox1A, B and D are amplified (ABD type), and a band derived from TaABA8'ox1D is not amplified. Divided into lines (AB type). The relationship between TaABA8'ox1 genotype and seed dormancy was analyzed using a haploid doubling line (DH) of wheat cultivar "Zenkougi wheat" showing ABD and wheat cultivar "Tamaizumi" showing AB. In this case, it has been reported that the effect on seed dormancy due to the difference in the genotype of TaABA8'ox1 was not observed (Non-patent Document 4).

既存のコムギ遺伝資源に存在する種子休眠性をもたらす遺伝子変異を、交配により他のコムギ品種に効率よく導入できれば、遺伝子組換え法を利用せずに高品質なコムギ品種を作出できると考えられる。しかし上記の通り、種子休眠性をもたらすようなTaABA8'ox1遺伝子上の変異はまだ見出されていない。   If gene mutations that cause seed dormancy in existing wheat genetic resources can be efficiently introduced into other wheat varieties by crossing, it is considered that high-quality wheat varieties can be produced without using genetic recombination methods. However, as described above, a mutation on the TaABA8'ox1 gene that causes seed dormancy has not yet been found.

種子休眠性の高いコムギを選抜する技術として、コムギ４Ａ染色体上の休眠性遺伝子と連鎖した遺伝子マーカーの検出に基づく方法（特許文献１）もある。しかしこの方法は、高休眠性遺伝子の間接的検出に基づいており、コムギ品種における高休眠性遺伝子の存在を直接的に確実に検出することはできない。   As a technique for selecting wheat having high seed dormancy, there is a method (Patent Document 1) based on detection of a gene marker linked to a dormancy gene on the wheat 4A chromosome. However, this method is based on the indirect detection of high dormancy genes and cannot directly and reliably detect the presence of high dormancy genes in wheat varieties.

特開２００４−１１３００７号公報JP 2004-113007 A

Kushiro, T. et. al., (2004) EMBO J., 23, p.1647-1656Kushiro, T. et.al., (2004) EMBO J., 23, p.1647-1656 Okamoto, M. et al., (2006) Plant Physiol., 141, p.97-107Okamoto, M. et al., (2006) Plant Physiol., 141, p.97-107 Gubler et al., (2008) Plant Physiol., 147, p.886-896Gubler et al., (2008) Plant Physiol., 147, p.886-896 蝶野ら、(2009) 育種学研究、日本育種学会、第11巻別冊1号 p.203Chono et al. (2009) Breeding Studies, Japanese Society of Breeding, Volume 11 Supplement 1 p.203

本発明は、コムギに優れた種子休眠性を付与する休眠性遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。   An object of this invention is to provide the detection method of the dormancy gene which provides the seed dormancy excellent in wheat.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、日本国内の一部のコムギ品種・系統では、コムギの第６群染色体上に座乗するアブシジン酸8'位水酸化酵素（ABA8'ox）をコードするTaABA8'ox1同祖遺伝子群のうちのTaABA8'ox1D遺伝子が、本来の終止コドンよりも前に挿入変異を有していること、この挿入変異型TaABA8'ox1D遺伝子にコードされたタンパク質はABA8'oxの機能に必要な領域を欠失しており活性を喪失していること、このTaABA8'ox1D挿入変異が種子休眠性を付与するのに有用であることを見出した。本発明者らはさらに、TaABA8'ox1D挿入変異を特異的かつ直接的に検出する方法、及びTaABA8'ox1D挿入変異と組み合わせて種子休眠性を付与するのに有効な他のTaABA8'ox1同祖遺伝子変異の検出方法を見出して、本発明を完成させた。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that in some wheat varieties and lines in Japan, abscisic acid 8 ′ hydroxylase that sits on the chromosome 6 of wheat The TaABA8'ox1D gene in the TaABA8'ox1 homologous gene group encoding (ABA8'ox) has an insertion mutation before the original stop codon, and this insertion mutant TaABA8'ox1D gene We found that the encoded protein lacks the region necessary for the function of ABA8'ox and loses its activity, and this TaABA8'ox1D insertion mutation is useful for conferring seed dormancy. . The present inventors further provide a method for specifically and directly detecting a TaABA8'ox1D insertion mutation, and other TaABA8'ox1 homologous genes effective in conferring seed dormancy in combination with the TaABA8'ox1D insertion mutation. A method for detecting mutations was found and the present invention was completed.

すなわち、本発明は以下のものを提供する。   That is, the present invention provides the following.

[1] 被験コムギ由来のゲノムDNAについて、配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子中の挿入変異を検出することを含む、被験コムギのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異を検出する方法。 [1] By performing nucleic acid amplification on the genomic DNA derived from the test wheat using one or more oligonucleotide primers containing at least 15 consecutive base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence A method for detecting a function-deficient mutation in the abscisic acid 8′-hydroxylase gene of a test wheat, comprising detecting an insertion mutation in the abscisic acid 8′-hydroxylase gene of the wheat D genome.

この方法の好ましい一実施形態では、(i)配列番号１０で示される塩基配列の1809位から上流の少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は配列番号１０で示される塩基配列の2776位から下流の少なくとも15塩基の塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、(ii)配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを含むプライマーペアを用いて、核酸増幅を行うことができる。   In a preferred embodiment of this method, (i) an oligonucleotide primer comprising at least 15 bases upstream from the position 1809 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or the position 2776 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 An oligonucleotide primer containing a complementary sequence of a base sequence of at least 15 bases downstream from (ii) an oligonucleotide primer containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a contiguous sequence of at least 15 bases thereof Nucleic acid amplification can be performed using the primer pair that contains it.

この方法に用いる、配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーには、配列番号３６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含むことが好ましい。   The oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 is used for one or more kinds of oligonucleotide primers containing at least 15 consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence used in this method. Preferably it contains a primer.

また、上記実施形態において、配列番号１０で示される塩基配列の1809位から上流の少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとして、配列番号２７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを好適に使用することができる。   In the above embodiment, the oligonucleotide primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 is preferably used as the oligonucleotide primer comprising at least 15 bases upstream from the position 1809 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10. Can be used.

本発明に係る方法では、前記核酸増幅を、前記オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３５で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は配列番号３７及び３８で示される塩基配列をそれぞれ含む２つのオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーペアとを反応液中で共存させて用いたマルチプレックスPCRにより行うこともできる。   In the method according to the present invention, the nucleic acid amplification is performed by using the oligonucleotide primer and the oligonucleotide primer including the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, or two oligonucleotides each including the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 37 and 38. It can also be performed by multiplex PCR using a primer pair consisting of primers coexisting in the reaction solution.

[2] a) 上記[1]の方法を用いて、機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有するコムギを選択し、
b) 工程a)で得たコムギを育種親として用いて育種し、
c) 工程b)で取得される子孫コムギ由来のゲノムDNAについて、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出する
ことを含む、種子休眠性が強化されたコムギの育種方法。[2] a) Using the method of [1] above, select a wheat having a function-deficient mutant abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene,
b) Breeding using the wheat obtained in step a) as a breeding parent,
c) Enhanced seed dormancy, including detecting mutations in the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene in the wheat A, B and D genomes of the genomic DNA derived from the progeny wheat obtained in step b) How to breed wheat.

この方法では、例えば、子孫コムギ由来のゲノムDNAを、配列番号１６及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア、又は配列番号２１及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いて核酸増幅し、得られた増幅産物を制限酵素AluIで消化することにより、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出することができる。   In this method, for example, genomic DNA derived from progeny wheat is obtained from a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 32, or from each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 26 Amplification of nucleic acid using a primer pair containing the oligonucleotide primer and digesting the resulting amplification product with the restriction enzyme AluI, thereby mutating the abscisic acid 8 'hydroxylase gene in the wheat A, B and D genomes Can be detected.

この方法では、子孫コムギ由来のゲノムDNAを、配列番号１５及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いて核酸増幅することにより、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出してもよい。   In this method, genomic DNA derived from progeny wheat is amplified by nucleic acid amplification using a primer pair comprising oligonucleotide primers each consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15 and 27, thereby allowing the wheat A, B and D genomes to be amplified. Abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene mutation may be detected.

[3] 配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異検出用のオリゴヌクレオチドプライマー。 [3] An oligonucleotide primer for detecting a function-deficient mutation in the abscisic acid 8′-hydroxylase gene of the wheat D genome, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a complementary base sequence thereof. .

[4] 配列番号２７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを含む、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異検出用のプライマーペア。 [4] Function of abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene of wheat D genome, comprising an oligonucleotide primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 36 Primer pair for detection of deletion mutations.

[5] 以下の(a)〜(c)のいずれかである、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子検出用のプライマーペア。 [5] A primer pair for detecting the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene in the wheat A, B and D genomes, which is any of the following (a) to (c):

(a) 配列番号１６及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア、
(b) 配列番号２１及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア
(c) 配列番号１５及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア
[6] 上記[3]のオリゴヌクレオチドプライマー又は上記[4]のプライマーペアと、上記[5]のプライマーペアとを含む、コムギ種子休眠性強化育種用のキット。(a) a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 32,
(b) a primer pair comprising an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 26
(c) a primer pair comprising an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15 and 27
[6] A wheat seed dormancy-enhanced breeding kit comprising the oligonucleotide primer of [3] or the primer pair of [4] and the primer pair of [5].

本発明を用いれば、コムギアブシジン酸8'位水酸化酵素（ABA8'ox）遺伝子の変異集積を効率よく検出することができ、種子休眠性強化コムギの開発を促進することができる。   By using the present invention, it is possible to efficiently detect mutation accumulation of the wheat gear bucidic acid 8′-hydroxylase (ABA8′ox) gene, and to promote the development of wheat with enhanced seed dormancy.

図１は、3つのTaABA8'ox1同祖遺伝子（相同遺伝子）（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D）の塩基配列（全長cDNA配列；配列番号１、３、５）のアラインメントによる比較を示す図である。図中に枠で示した開始コドン（ATG）及び終止コドン（TGA）は、TaABA8'ox1A遺伝子ではそれぞれ配列番号１の112位〜114位及び1552位〜1554位に位置する。TaABA8'ox1B遺伝子では、開始コドン（ATG）及び終止コドン（TGA）は配列番号３の96位〜98位及び1524位〜1526位に位置する。TaABA8'ox1D遺伝子では、開始コドン（ATG）及び終止コドン（TGA）は配列番号５の101位〜103位及び1535位〜1537位に位置する。FIG. 1 shows an alignment comparison of the base sequences of the three TaABA8'ox1 homologous genes (homologous genes) (TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B, TaABA8'ox1D) (full-length cDNA sequences; SEQ ID NOs: 1, 3, 5). FIG. In the TaABA8′ox1A gene, the start codon (ATG) and stop codon (TGA) shown in the frame in the figure are located at positions 112 to 114 and 1552 to 1554 in SEQ ID NO: 1, respectively. In the TaABA8′ox1B gene, the start codon (ATG) and the stop codon (TGA) are located at positions 96 to 98 and 1524 to 1526 in SEQ ID NO: 3. In the TaABA8′ox1D gene, the start codon (ATG) and stop codon (TGA) are located at positions 101 to 103 and 1535 to 1537 in SEQ ID NO: 5. 図２は、3つのTaABA8'ox1同祖遺伝子（相同遺伝子）（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D）のゲノムDNA上の塩基配列（ゲノム配列；配列番号７〜９）のアラインメントによる比較を示す図である。図中に枠で示した開始コドン及び終止コドンは、TaABA8'ox1A遺伝子ではそれぞれ配列番号７の14位〜16位及び1960位〜1962位、TaABA8'ox1B遺伝子では配列番号８の14位〜16位及び1930位〜1932位、そしてTaABA8'ox1D遺伝子では配列番号９の14位〜16位及び1937位〜1939位に位置する。FIG. 2 is a comparison by alignment of base sequences (genomic sequences; SEQ ID NOs: 7 to 9) on genomic DNA of three TaABA8'ox1 homologous genes (homologous genes) (TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B, TaABA8'ox1D) FIG. The start and stop codons shown in the frame in the figure are positions 14 to 16 and 1960 to 1962 of SEQ ID NO: 7 for the TaABA8'ox1A gene, and positions 14 to 16 of SEQ ID NO: 8 for the TaABA8'ox1B gene. And 1930 to 1932, and in the TaABA8'ox1D gene, it is located at positions 14 to 16 and 1937 to 1939 of SEQ ID NO: 9. 図３は、TaABA8'ox1同祖遺伝子群を検出するためのプライマーセットの設計について示す図である。各DNAマーカーに対応する核酸増幅産物を示す四角枠の右側には、枠内に記載された制限酵素での処理によって増幅産物から得られるDNA断片のサイズ（bp）が記載されている。A、B、Dは、それぞれTaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、及びTaABA8'ox1Dを示す。FIG. 3 is a diagram showing the design of a primer set for detecting a TaABA8′ox1 homologous gene group. On the right side of the square frame indicating the nucleic acid amplification product corresponding to each DNA marker, the size (bp) of the DNA fragment obtained from the amplification product by treatment with the restriction enzyme described in the frame is described. A, B, and D represent TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B, and TaABA8′ox1D, respectively. 図４は、コムギNullisomic-tetrasomic系統における各DNAマーカーのバンドパターンを示す図である。ox1A、ox1B、ox1Dは、それぞれ、TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D遺伝子に対応するバンドを表す（他の図でも同様）。ＡはDNAマーカーS7A3/AluI、S1A8/AluI、及びS2A2mixの設計について示す。白抜き矢印は、タマイズミDゲノム中に見出された挿入変異のおおよその位置を示している。また、図示したS2A2mixの増幅産物を示す枠中には、終止コドン直後に存在する、同祖遺伝子間で長さの異なるギャップ部位（Gap）を示した。ＢはS7A3/AluIマーカー、ＣはS1A8/AluIマーカー、ＤはS2A2mixマーカーについての解析結果を示す。各レーンには、解析に用いたNullisomic-tetrasomic系統名を示す。例えば「N6AT6B」は、6A染色体（ゲノムAの第6染色体）が欠失し、かつ6B染色体（ゲノムBの第6染色体）を１本過剰に有している系統を意味する。他の系統名も同様の形式で記載されている。FIG. 4 is a diagram showing the band pattern of each DNA marker in the wheat nullisomic-tetrasomic line. ox1A, ox1B and ox1D represent bands corresponding to the TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B and TaABA8′ox1D genes, respectively (the same applies to other figures). A shows the design of DNA markers S7A3 / AluI, S1A8 / AluI, and S2A2mix. The open arrow indicates the approximate location of the insertion mutation found in the taize D genome. Further, in the frame showing the amplification product of S2A2mix shown in the figure, gap sites (Gap) having different lengths between homologous genes existing immediately after the stop codon are shown. B shows the analysis results for the S7A3 / AluI marker, C for the S1A8 / AluI marker, and D for the S2A2mix marker. Each lane shows the Nullisomic-tetrasomic system name used in the analysis. For example, “N6AT6B” means a strain in which the 6A chromosome (chromosome 6 of genome A) has been deleted and the 6B chromosome (chromosome 6 of genome B) has an excess. Other system names are described in the same format. 図５は、S2A2mixマーカーを用いたTaABA8'ox1同祖遺伝子群の多型解析によって示された、コムギ遺伝資源におけるTaABA8'ox1の遺伝子型を示す図である。各レーンにはコムギ遺伝資源の品種又は系統名を示す。FIG. 5 is a diagram showing the genotype of TaABA8′ox1 in wheat genetic resources, which was shown by polymorphism analysis of the TaABA8′ox1 homologous gene group using the S2A2mix marker. Each lane indicates the variety or line name of the wheat genetic resource. 図６は、TaABA8'ox1D遺伝子における挿入変異を示す図である。「D」は「農林61号」由来TaABA8'ox1D遺伝子の部分ゲノム配列、「D Insertion」は「新中長」由来TaABA8'ox1D遺伝子の部分ゲノム配列を示す。d_S1は遺伝子特異的プライマーTaABAox1d_S1、A2_AGCGは遺伝子特異的プライマーTaABAox1.A2_AGCGの位置を示す。d_insert A1は挿入配列内に設計したTaABAox1d_InsertA1プライマー、S2はTaABAox1.S2プライマーの位置を示す。「農林61号」及び「新中長」由来TaABA8'ox1D遺伝子のそれぞれの塩基配列上に終止コドン（TGA及びTAG）を枠で囲って示した。FIG. 6 is a diagram showing an insertion mutation in the TaABA8′ox1D gene. “D” indicates a partial genome sequence of TaABA8′ox1D gene derived from “Noribayashi 61”, and “D Insertion” indicates a partial genome sequence of TaABA8′ox1D gene derived from “New Medium Length”. d_S1 indicates the position of the gene-specific primer TaABAox1d_S1, and A2_AGCG indicates the position of the gene-specific primer TaABAox1.A2_AGCG. d_insert A1 indicates the position of the TaABAox1d_InsertA1 primer designed in the insert sequence, and S2 indicates the position of the TaABAox1.S2 primer. Stop codons (TGA and TAG) are shown in a box on the base sequences of TaABA8'ox1D genes derived from "Noribayashi 61" and "New Medium Length". 図７は、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異によるアミノ酸配列の変化を示す図である。Ａは「新中長」のTaABA8'ox1Dの挿入配列を含むゲノム配列（D Insertion）と、「農林61号」のTaABA8'ox1Dの対応する領域のゲノム配列（D）とのアラインメントを示す。Ｂは「新中長」由来の挿入変異を有するTaABA8'ox1Dと様々な植物種起源のABA8'oxのC末端アミノ酸配列のアラインメントを示す。TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D、及びTaABA8'ox1D insertionは、本願実施例で決定した「農林61号」由来TaABA8'ox1A,B,D遺伝子及び「新中長」由来TaABA8'ox1D遺伝子にコードされるアミノ酸配列を示している。図中の、Triticum aestivum、Hordeum vulgare、Oryza sativa、Zea mays、Sorghum bicolor、Ricinus communis、Solanum tuberosum、及びPopulus trichocarpa、Arabidopsis thaliana（CYP707A1、CYP707A2、CYP707A3、CYP707A4）のABA8'oxのC末端アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３９〜５０に示す。TaABA8'ox1D insertionの枠で囲った配列が、挿入変異により変化したアミノ酸配列である。アスタリスクはヘム結合領域のCys残基を示す。ヘム結合領域の保存配列（Phe-X-X-Gly-X-Arg/His-X-Cys-X-Gly）はこの図では439位のPheから448位のGlyまでである。FIG. 7 is a figure which shows the change of an amino acid sequence by the insertion mutation in TaABA8'ox1D gene. A shows an alignment between the genome sequence (D Insertion) containing the insert sequence of “New Medium and Long” TaABA8′ox1D and the genome sequence (D) of the corresponding region of TaABA8′ox1D of “Norin 61”. B shows an alignment of the C-terminal amino acid sequences of TaABA8'ox1D having an insertion mutation derived from "new medium length" and ABA8'ox derived from various plant species. TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B, TaABA8'ox1D, and TaABA8'ox1D insertion are the TaABA8'ox1A, B and D genes derived from `` Noribayashi No. 61 '' and the TaABA8'ox1D gene derived from `` New Medium Length '' Shows the amino acid sequence encoded by. In the figure, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Oryza sativa, Zea mays, Sorghum bicolor, Ricinus communis, Solanum tuberosum, and Populus trichocarpa, Arabidopsis thaliana (CYP707A1, CYP707A2, CYP707A3, CYP707A4, CYP707A4, CYP707A4, CYP707A4) Are shown in SEQ ID NOs: 39 to 50, respectively. The sequence surrounded by the frame of TaABA8'ox1D insertion is an amino acid sequence changed by insertion mutation. The asterisk indicates the Cys residue in the heme binding region. In this figure, the conserved sequence of the heme binding region (Phe-X-X-Gly-X-Arg / His-X-Cys-X-Gly) extends from Phe at position 439 to Gly at position 448. 図８は、TaABA8'ox1D遺伝子の挿入配列を含むゲノム領域のPCR増幅について記載した図である。Ａは、「新中長」のTaABA8'ox1D遺伝子のゲノム構造及び挿入配列を示す。Ｂは、プライマーTaABAox1d_S1（dS1）及びTaABAox1.A2_AGCG（A2_AGCG）を用いたPCRによるTaABA8'ox1Dのゲノム領域の増幅産物の電気泳動結果を示す。N:「農林61号」、S:「新中長」、T:「タマイズミ」、M:「タマイズミ」変異体（「タマイズミ」のγ線照射系統のTaABA8'ox1A/TaABA8'ox1D変異体）。上側のより大きなサイズのバンドが挿入配列を含むTaABA8'ox1Dの増幅断片、下側のより小さなサイズのバンドが挿入配列を含まないTaABA8'ox1Dの増幅断片である。FIG. 8 is a diagram describing PCR amplification of a genomic region containing the inserted sequence of TaABA8′ox1D gene. A shows the genome structure and insertion sequence of the “new medium-long” TaABA8′ox1D gene. B shows the electrophoresis result of the amplification product of the genomic region of TaABA8′ox1D by PCR using the primers TaABAox1d_S1 (dS1) and TaABAox1.A2_AGCG (A2_AGCG). N: “Agriculture 61”, S: “New Middle Length”, T: “Tamaizumi”, M: “Tamaizumi” mutant (TaABA8'ox1A / TaABA8'ox1D mutant of γ-irradiated line of “Tamaizumi”). The upper larger band is the amplified fragment of TaABA8'ox1D containing the insertion sequence, and the lower lower band is the amplified fragment of TaABA8'ox1D containing no insertion sequence. 図９は、挿入配列を含むTaABA8'ox1D遺伝子をマルチプレックスPCRにより特異的に増幅した結果を示す電気泳動写真である。Ａは、S2d_InsertA1&A2_AGCG解析の結果、ＢはS2d_InsertA1&a_S1a_A1解析の結果を示す。N、S、T、Mは図８と同様である。FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of specific amplification of TaABA8′ox1D gene containing the inserted sequence by multiplex PCR. A shows the result of S2d_InsertA1 & A2_AGCG analysis, and B shows the result of S2d_InsertA1 & a_S1a_A1 analysis. N, S, T, and M are the same as in FIG. 図１０は、S2d_InsertA1&a_S1a_A1マルチプレックスPCRを用いた、様々なコムギ登録品種におけるTaABA8'ox1D挿入変異の検出結果を示す図である。各レーンにはコムギ品種名を示す。S2d_InsertA1、aS1aA1は、それぞれ、TaABAox1a_S1とTaABAox1a_A1のプライマーペア、TaABAox1.S2とTaABAox1d_InsertA1のプライマーペアで増幅されたバンドを示す。FIG. 10 is a diagram showing detection results of TaABA8′ox1D insertion mutation in various wheat registered varieties using S2d_InsertA1 & a_S1a_A1 multiplex PCR. Each lane shows the wheat variety name. S2d_InsertA1 and aS1aA1 indicate bands amplified with a primer pair of TaABAox1a_S1 and TaABAox1a_A1, and a primer pair of TaABAox1.S2 and TaABAox1d_InsertA1, respectively. 図１１は、S2d_InsertA1&a_S1a_A1マルチプレックスPCRを用いた、様々なコムギ遺伝資源におけるTaABA8'ox1D挿入変異の検出結果を示す図である。各レーンにはコムギ遺伝資源の品種又は系統名を示す。FIG. 11 is a diagram showing the detection results of TaABA8′ox1D insertion mutation in various wheat genetic resources using S2d_InsertA1 & a_S1a_A1 multiplex PCR. Each lane indicates the variety or line name of the wheat genetic resource. 図１２は、DNAマーカーを用いたTaABA8'ox1遺伝子変異体の検出結果を示す図である。ＡはDNAマーカーS1A8/AluI、ＢはDNAマーカーS7A3/AluI、ＣはDNAマーカーS2A2mixによる解析結果である。同じコムギ個体のサンプルは、Ａ、Ｂ、及びＣで同位置のレーンにアプライされている。バンドの喪失によって表されるTaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1Dのそれぞれの遺伝子欠失変異の存在を、A変異、B変異、D変異として示す。FIG. 12 is a diagram showing the detection result of TaABA8′ox1 gene mutant using a DNA marker. A is the result of analysis with the DNA marker S1A8 / AluI, B is the result of analysis with the DNA marker S7A3 / AluI, and C is the result of analysis with the DNA marker S2A2mix. Samples of the same wheat individuals are applied to lanes A, B, and C at the same location. The presence of each gene deletion mutation of TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B and TaABA8′ox1D represented by the loss of the band is shown as A mutation, B mutation, and D mutation. 図１３は、「タマイズミ」由来のγ線照射系統におけるTaABA8'ox1遺伝子変異の検出結果を示した図である。ＡはDNAマーカーS7A3/AluI、ＢはDNAマーカーS1A8/AluI、ＣはDNAマーカーS2A2mixによる解析結果である。電気泳動像の各レーンは右から新中長、184G4、タマイズミ、農林61号である。FIG. 13 is a view showing a detection result of TaABA8′ox1 gene mutation in a γ-irradiation line derived from “Tamaizumi”. A is the result of analysis with the DNA marker S7A3 / AluI, B is the result of analysis with the DNA marker S1A8 / AluI, and C is the result of analysis with the DNA marker S2A2mix. From the right, each lane of the electrophoretic image is Shin-nakamata, 184G4, Tamizumi and Norin 61. 図１４は、184G4（TaABA8'ox1A/TaABA8'ox1D変異体）の多型パターンを示す図である。N:「農林61号」、T:「タマイズミ」、M:「タマイズミ」変異体184G4（「タマイズミ」のγ線照射系統のTaABA8'ox1A/TaABA8'ox1D変異体）、S:「新中長」。A、B、Dは、それぞれTaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、及びTaABA8'ox1D由来増幅断片を示す。DNAマーカーS7A3/AluI、S7A7/AluI、S7A8/MseI、S6A8/MseI、及びS8A8/MseIを用いた。FIG. 14 is a diagram showing a polymorphism pattern of 184G4 (TaABA8′ox1A / TaABA8′ox1D mutant). N: “Norin 61”, T: “Tamaizumi”, M: “Tamaizumi” mutant 184G4 (TaABA8'ox1A / TaABA8'ox1D mutant of “Tamaizumi” γ-irradiated strain), S: “New medium length” . A, B, and D represent amplified fragments derived from TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B, and TaABA8′ox1D, respectively. The DNA markers S7A3 / AluI, S7A7 / AluI, S7A8 / MseI, S6A8 / MseI, and S8A8 / MseI were used. 図１５は、184G4（TaABA8'ox1A/TaABA8'ox1D変異体）の多型パターンを示す図である。N、T、M、Sは図１４と同様である。DNAマーカーS1A8/AluI、S1A10/AluI+MboI、S1A11/AluI+MboI、S1A12/AluI+MboI、及びS1A1/AluI+MboIを用いた。A、B、Dは、それぞれTaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、及びTaABA8'ox1D由来増幅断片を示す。アスタリスク（＊）は、当該バンドがTaABA8'ox1A由来のバンドの推定増幅断片サイズよりも若干短いことを示す。FIG. 15 is a diagram showing a polymorphism pattern of 184G4 (TaABA8′ox1A / TaABA8′ox1D mutant). N, T, M, and S are the same as those in FIG. DNA markers S1A8 / AluI, S1A10 / AluI + MboI, S1A11 / AluI + MboI, S1A12 / AluI + MboI, and S1A1 / AluI + MboI were used. A, B, and D represent amplified fragments derived from TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B, and TaABA8′ox1D, respectively. The asterisk (*) indicates that the band is slightly shorter than the estimated amplified fragment size of the band derived from TaABA8'ox1A. 図１６は、184G4（TaABA8'ox1A/TaABA8'ox1D変異体）の多型パターンを示す図である。N、T、M、Sは図１４と同様である。ＡはDNAマーカーS2A2mixを用いた解析結果、ＢはDNAマーカーS7A9/KpnIを用いた解析結果を示す。FIG. 16 is a diagram showing a polymorphism pattern of 184G4 (TaABA8′ox1A / TaABA8′ox1D mutant). N, T, M, and S are the same as those in FIG. A shows the analysis result using the DNA marker S2A2mix, and B shows the analysis result using the DNA marker S7A9 / KpnI. 図１７は、TaABA8'ox1同祖遺伝子変異の集積による発芽抑制効果を示した図である。Ａは開花後49日目の種子、Ｂは開花後70日目の種子の累積発芽率を示した。FIG. 17 is a diagram showing the germination inhibitory effect by accumulation of TaABA8′ox1 homologous gene mutations. A shows the germination rate of seeds 49 days after flowering, and B shows the cumulative germination rate of seeds 70 days after flowering.

本発明は、本質的には、コムギDゲノムに坐乗するアブシジン酸8'位水酸化酵素（ABA8'ox）をコードするTaABA8'ox1D遺伝子のコード領域中の挿入配列に基づいて設計した検出用核酸を用いてその挿入配列の存在を検出することにより、TaABA8'ox1D遺伝子の挿入変異を検出し、それによりコムギゲノム中の機能欠損変異したTaABA8'ox1D遺伝子を検出する方法に基づくものである。   The present invention is essentially for detection designed based on the insertion sequence in the coding region of TaABA8'ox1D gene encoding abscisic acid 8 'hydroxylase (ABA8'ox) sitting on the wheat D genome. This is based on a method of detecting the insertion mutation of the TaABA8'ox1D gene by detecting the presence of the insertion sequence using a nucleic acid, thereby detecting the TaABA8'ox1D gene having a function-deficient mutation in the wheat genome.

以下、本発明をより詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

１．TaABA8'ox1D遺伝子の挿入変異の検出
本発明に係る検出方法の適用対象となるコムギは、普通コムギ（Triticum aestivum）に属する任意のコムギ植物であり得るが、栽培種の普通コムギ品種又は系統がより好ましい本発明に係る検出方法の適用対象となるコムギは、日本在来品種若しくは系統又はその子孫コムギであってよいし、例えば品種「新中長」の子孫コムギであってもよい。 1. Detection of insertion mutation of TaABA8'ox1D gene The wheat to which the detection method according to the present invention is applied can be any wheat plant belonging to normal wheat (Triticum aestivum), but more common wheat varieties or lines of cultivated varieties. Preferred wheat to which the detection method according to the present invention is applied may be Japanese native varieties or strains or their descendants, or may be, for example, progeny wheat of the cultivar “New Medium-length”.

本発明に係る検出方法では、まず、本検出方法に供するコムギから、ゲノムDNAを調製することが好ましい。ゲノムDNAは、コムギ個体より採取した任意の組織（例えば、葉、茎、根、カルス、種子など）から、植物分子生物学の分野で慣用されている手法に従って抽出し、必要に応じて精製することにより、調製すればよい。コムギからのゲノムDNAの抽出は、例えば、市販の植物ゲノムDNA抽出キット（例えば、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN））やPlant Genomic DNA Extraction Mini（VIOGENE）等）を用いて行うこともできる。このようにして調製されるコムギ由来のゲノムDNAについては、核酸増幅反応の鋳型として用いる前にRNase処理等によりRNAを除去することも好ましい。   In the detection method according to the present invention, it is preferable to first prepare genomic DNA from wheat to be subjected to the detection method. Genomic DNA is extracted from an arbitrary tissue collected from a wheat individual (for example, leaves, stems, roots, callus, seeds, etc.) according to a method commonly used in the field of plant molecular biology, and purified as necessary. Depending on the situation, it may be prepared. Extraction of genomic DNA from wheat can also be performed using, for example, a commercially available plant genomic DNA extraction kit (for example, DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)), Plant Genomic DNA Extraction Mini (VIOGENE), or the like). Regarding the genomic DNA derived from wheat thus prepared, it is also preferable to remove RNA by RNase treatment or the like before using it as a template for nucleic acid amplification reaction.

本検出法では、このようにして調製されるコムギ由来のゲノムDNAを鋳型として、品種「新中長」で見出されるコムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1D遺伝子）中の挿入配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅を行えばよい。このオリゴヌクレオチドプライマーは、TaABA8'ox1D遺伝子中の終止コドンの約130bp上流の部位（配列番号９で示されるTaABA8'ox1D遺伝子のゲノム配列の1809位と1810位の間）に挿入された塩基配列（配列番号１１）に基づき、常法により配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーである。本明細書において、特定の塩基配列の「相補配列」とは、その特定の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する相補鎖（アンチセンス鎖）全長の塩基配列（5'から3'方向に記載した配列）を意味する。配列番号１１で示される塩基配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、通常はフォワードプライマーとして使用される。配列番号１１で示される塩基配列の相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、通常はリバースプライマーとして使用される。このオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも15塩基長であるが、15〜50塩基長が好ましく、15〜30塩基長がさらに好ましい。このオリゴヌクレオチドプライマーは、特異性をより高める上では、好ましくは18塩基長以上、さらに好ましくは20塩基長以上であってよい。このオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の、少なくとも380位〜403位（配列番号１１の塩基番号による。配列番号３６のプライマーがアニーリングする位置に相当）の領域を含む連続した24塩基以上の塩基配列を含むものも好ましい。   In this detection method, using the wheat-derived genomic DNA prepared in this way as a template, the abscisic acid 8'-hydroxylase gene (TaABA8'ox1D gene) in the wheat D genome found in the cultivar "New Middle Length" Nucleic acid amplification may be performed using an oligonucleotide primer designed based on the inserted sequence. This oligonucleotide primer is a base sequence inserted at a site about 130 bp upstream of the stop codon in TaABA8'ox1D gene (between positions 1809 and 1810 of the genomic sequence of TaABA8'ox1D gene shown in SEQ ID NO: 9) ( Based on SEQ ID NO: 11), a sequence-specific oligonucleotide primer may be designed by a conventional method. Such an oligonucleotide primer is typically one or more oligonucleotide primers comprising a base sequence of at least 15 bases contiguous to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence. In the present specification, the “complementary sequence” of a specific base sequence is the base sequence of the full length of the complementary strand (antisense strand) to the polynucleotide comprising the specific base sequence (sequence described in the 5 ′ to 3 ′ direction). Means. An oligonucleotide primer containing a base sequence of at least 15 bases continuous with the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 is usually used as a forward primer. An oligonucleotide primer containing a base sequence of at least 15 consecutive bases complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 is usually used as a reverse primer. The oligonucleotide primer is at least 15 bases long, preferably 15-50 bases long, and more preferably 15-30 bases long. In order to further increase the specificity, the oligonucleotide primer may preferably have a length of 18 bases or more, more preferably 20 bases or more. The oligonucleotide primer is a region of at least positions 380 to 403 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence (depending on the base number of SEQ ID NO: 11, corresponding to the position where the primer of SEQ ID NO: 36 is annealed). Those containing a base sequence of 24 or more consecutive bases containing are also preferred.

核酸増幅は、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1D遺伝子）中の挿入配列に基づいて設計される上記リバースプライマーと、TaABA8'ox1D遺伝子の挿入配列の上流に設計したフォワードプライマーとを含むプライマーペアを用いて行うことができる。ここで、挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子のゲノム配列（配列番号１０）において、挿入配列は、配列番号１０で示される塩基配列の1810位から2775位までに相当する。従って、挿入配列の上流に設計するこのフォワードプライマーは、例えば、配列番号１０で示される塩基配列の1809位から上流の少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。ここで「配列番号１０で示される塩基配列の1809位から上流」とは、配列番号１０で示される塩基配列の1〜1809位の配列を指す。   Nucleic acid amplification was designed upstream of the reverse primer designed above based on the insertion sequence in the abscisic acid 8 'hydroxylase gene (TaABA8'ox1D gene) of the wheat D genome and the TaABA8'ox1D gene insertion sequence. It can be performed using a primer pair including a forward primer. Here, in the genome sequence of the TaABA8′ox1D gene having an insertion mutation (SEQ ID NO: 10), the insertion sequence corresponds to positions 1810 to 2775 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. Therefore, this forward primer designed upstream of the insertion sequence is, for example, an oligonucleotide primer containing a base sequence of at least 15 bases upstream from position 1809 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. Here, “upstream from position 1809 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10” refers to the sequence of positions 1 to 1809 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

核酸増幅はまた、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1D遺伝子）中の挿入配列に基づいて設計される上記フォワードプライマーと、TaABA8'ox1D遺伝子の挿入配列の下流に設計したリバースプライマーとを含むプライマーペアを用いて行うことができる。挿入配列の下流に設計するこのリバースプライマーは、例えば、配列番号１０で示される塩基配列の2776位から下流の少なくとも15塩基の塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。ここで「配列番号１０で示される塩基配列の2776位から下流」とは、配列番号１０で示される塩基配列の2776位〜3253位の配列を指す。   Nucleic acid amplification is also designed downstream of the above-mentioned forward primer, which is designed based on the insertion sequence in the abscisic acid 8 'hydroxylase gene (TaABA8'ox1D gene) of the wheat D genome and the TaABA8'ox1D gene insertion sequence. Can be performed using a primer pair containing the reverse primer. This reverse primer designed downstream of the insertion sequence is, for example, an oligonucleotide primer containing a complementary sequence of a base sequence of at least 15 bases downstream from position 2776 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. Here, “downstream from position 2776 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10” refers to the sequence of positions 2776 to 3253 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

核酸増幅は、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1D遺伝子）中の挿入配列に基づいて設計したフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーペアを用いて行うこともできる。   Nucleic acid amplification can also be performed using a primer pair consisting of a forward primer and a reverse primer designed based on the insertion sequence in the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene (TaABA8′ox1D gene) of the wheat D genome.

プライマーペアの設計は、既存のプライマー設計ソフトウェア等を利用して、常法により行えばよい。例えばプライマーペアは、フォワードプライマーとリバースプライマーのそれぞれの塩基配列から算出されるTM値やCG含量を考慮して設計することができる。   The primer pair may be designed by a conventional method using existing primer design software or the like. For example, the primer pair can be designed in consideration of the TM value and CG content calculated from the respective base sequences of the forward primer and the reverse primer.

核酸増幅はまた、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1D遺伝子）中の挿入配列に基づいて設計したフォワードプライマー又はリバースプライマーのいずれかのみを用いて行うこともできる。   Nucleic acid amplification can also be performed using either the forward primer or the reverse primer designed based on the insertion sequence in the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene (TaABA8′ox1D gene) of the wheat D genome.

配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの好ましい例としては、以下に限定するものではないが、配列番号３６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、例えば、配列番号３６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。   A preferred example of an oligonucleotide primer comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a complementary sequence of at least 15 bases thereof is not limited to the following, but the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 is Examples thereof include an oligonucleotide primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 36.

一方、配列番号１０で示される塩基配列の1809位から上流の少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとしては、以下に限定するものではないが、配列番号２７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、例えば、配列番号２７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。   On the other hand, the oligonucleotide primer containing a base sequence of at least 15 bases upstream from position 1809 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is not limited to the following, but is an oligo containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 A nucleotide primer, for example, an oligonucleotide primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 can be mentioned.

本発明に係る検出方法では、上記のようなオリゴヌクレオチドプライマーを用いたコムギ由来のゲノムDNAの核酸増幅を、公知の核酸増幅法に従って行えばよい。例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、SDA（Strand Displacement Amplification）法などを利用することができる。本発明に係る方法における核酸増幅は、２つ以上のプライマーペアを反応液中に共存させて行うマルチプレックスPCRによって行ってもよい。核酸増幅を行う際の反応液組成や温度サイクル条件の各温度及び反応時間等は、当業者であれば、使用する核酸増幅法、プライマーのTm値、サーマルサイクラーの仕様などに合わせて適宜定めることができる。例えば、95〜99℃で20秒〜1分間の熱変性の後、90〜99℃で8秒〜1分間及び65〜75℃で20秒〜2分間のアニーリング及び伸長反応を1サイクルとして20〜40サイクル行い、最後に65〜80℃で1〜4分間の反応を行う温度サイクル条件で核酸増幅（例えばPCR）を実施してもよい。あるいは、95〜99℃で20秒〜1分間の熱変性の後、90〜99℃で8秒〜1分間、50〜65℃で20秒〜1分間、及び65〜80℃で30秒〜2分間を1サイクルとして20〜40サイクル行い、最後に65〜80℃で1〜4分間の反応を行う温度サイクル条件で核酸増幅（例えばPCR）を実施してもよい。   In the detection method according to the present invention, nucleic acid amplification of wheat-derived genomic DNA using the oligonucleotide primers as described above may be performed according to a known nucleic acid amplification method. For example, PCR (polymerase chain reaction) method, LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method and the like can be used. Nucleic acid amplification in the method according to the present invention may be performed by multiplex PCR performed in the presence of two or more primer pairs in the reaction solution. The temperature and reaction time of the reaction solution composition and temperature cycle conditions when performing nucleic acid amplification are appropriately determined by those skilled in the art according to the nucleic acid amplification method to be used, primer Tm value, thermal cycler specifications, etc. Can do. For example, heat denaturation at 95 to 99 ° C. for 20 seconds to 1 minute, followed by annealing and extension reaction at 90 to 99 ° C. for 8 seconds to 1 minute and 65 to 75 ° C. for 20 seconds to 2 minutes for 20 to 20 minutes. Nucleic acid amplification (for example, PCR) may be performed under temperature cycle conditions in which 40 cycles are performed and a reaction is performed at 65 to 80 ° C. for 1 to 4 minutes. Alternatively, after heat denaturation at 95-99 ° C for 20 seconds to 1 minute, 90-99 ° C for 8 seconds to 1 minute, 50-65 ° C for 20 seconds to 1 minute, and 65-80 ° C for 30 seconds to 2 Nucleic acid amplification (for example, PCR) may be performed under temperature cycle conditions in which 20 to 40 cycles are performed per minute, and the reaction is performed at 65 to 80 ° C. for 1 to 4 minutes.

コムギ由来のゲノムDNAについて、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマー、具体的には、配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅反応を行った結果、被験ゲノムDNAに「新中長」で見出されたのと同様の挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子が含まれていれば、そのオリゴヌクレオチドプライマーによる特異的な核酸増幅が起こる。従って、核酸増幅後の反応液に、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅産物が確認された場合、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子中の挿入変異が検出されたことになる。   An oligonucleotide primer designed based on the insertion sequence in the TaABA8'ox1D gene for genomic DNA derived from wheat, specifically, a base sequence of at least 15 bases continuous with the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence As a result of nucleic acid amplification reaction using one or more kinds of oligonucleotide primers containing, the TaABA8'ox1D gene having the same insertion mutation as that found in "New Medium Length" is included in the test genomic DNA Then, specific nucleic acid amplification by the oligonucleotide primer occurs. Therefore, in the reaction solution after nucleic acid amplification, when an amplification product by an oligonucleotide primer designed based on the insertion sequence in the TaABA8'ox1D gene is confirmed, the abscisic acid 8 'hydroxylase gene in the wheat D genome An insertion mutation has been detected.

本発明に係る方法では、そのような核酸増幅の結果として得られる上記オリゴヌクレオチドプライマーによる増幅産物を、任意の核酸分析手段によって確認することができる。例えば、そのような増幅産物を含む核酸増幅反応終了後の反応液を、ゲル電気泳動と染色（例えば、０．５〜４％アガロースゲル、および、５〜２０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動及び臭化エチジウム染色）、蛍光又は放射同位元素等で標識したプライマーを使用した場合のゲル電気泳動と標識検出、キャピラリー電気泳動、自動シークエンサー等を用いた塩基配列決定、MALDI-TOF/MS分析等に供し、その核酸分析結果から、目的の増幅産物が得られたかどうかを確認することができる。目的の増幅断片が得られたかどうかは、例えばTaABA8'ox1D遺伝子のゲノム配列（配列番号９）や挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子のゲノム配列（配列番号１０）に基づいて予測される増幅産物の塩基配列やそのサイズ等と一致するかどうかにより判定することができる。   In the method according to the present invention, the amplification product by the oligonucleotide primer obtained as a result of such nucleic acid amplification can be confirmed by any nucleic acid analysis means. For example, the reaction solution after completion of the nucleic acid amplification reaction containing such an amplification product is subjected to gel electrophoresis and staining (for example, electrophoresis on 0.5 to 4% agarose gel and 5 to 20% polyacrylamide gel). And ethidium bromide staining), gel electrophoresis and label detection using primers labeled with fluorescent or radioisotopes, etc., base sequencing using capillary electrophoresis, automatic sequencer, MALDI-TOF / MS analysis, etc. And whether or not the target amplification product has been obtained can be confirmed from the nucleic acid analysis result. Whether the target amplified fragment has been obtained is determined based on, for example, the predicted amplification product based on the TaABA8'ox1D gene genomic sequence (SEQ ID NO: 9) and the TaABA8'ox1D gene genomic sequence (SEQ ID NO: 10) having an insertion mutation. The determination can be made based on whether the nucleotide sequence matches the size or the like.

上記オリゴヌクレオチドプライマーによる増幅産物は、適当な制限酵素で処理した後に、電気泳動して、予測される切断断片長のバンドが得られるかどうかに基づいて、確認してもよい。   The amplification product by the oligonucleotide primer may be confirmed based on whether or not a band having the expected cleaved fragment length can be obtained after electrophoresis with an appropriate restriction enzyme.

本発明に係る検出方法の一例として、配列番号２７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーをフォワードプライマー、配列番号３６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーをリバースプライマーとするプライマーペアを用いて、コムギゲノムDNAを鋳型としてPCRにより核酸増幅することにより、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入配列に対する特異的な増幅産物を得ることができる。この場合、PCRの温度サイクル条件の好ましい例は、98℃で30秒間の熱変性の後、98℃で10秒間及び70℃で45秒間のアニーリング及び伸長反応を1サイクルとして20〜40サイクル行い、最後に72℃で1〜4分間の反応を行うものである。このPCRにより、挿入配列に対する特異的な増幅産物として、典型的には492bpの増幅産物が得られる。   As an example of the detection method according to the present invention, a primer pair is used in which an oligonucleotide primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 is a forward primer, and an oligonucleotide primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 36 is a reverse primer. By amplification of nucleic acid by PCR using wheat genomic DNA as a template, a specific amplification product for the inserted sequence in the TaABA8′ox1D gene can be obtained. In this case, a preferable example of the PCR temperature cycle condition is that heat denaturation at 98 ° C. for 30 seconds, followed by annealing and extension reaction at 98 ° C. for 10 seconds and 70 ° C. for 45 seconds as 20 to 40 cycles, Finally, the reaction is performed at 72 ° C. for 1 to 4 minutes. By this PCR, a 492 bp amplification product is typically obtained as a specific amplification product for the inserted sequence.

配列番号２７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとから構成されるプライマーペアを、挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子を増幅せずに他のTaABA8'ox1遺伝子を特異的に増幅するコントロール用のオリゴヌクレオチドプライマーと反応液中で共存させて、核酸増幅を行うこともできる。核酸増幅法がPCRである場合、このPCRはいわゆるマルチプレックスPCRと呼ばれる。この方法によれば、他のTaABA8'ox1遺伝子も同時に検出できるので、挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子をより精度良く検出することができる。   A primer pair composed of an oligonucleotide primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 is amplified without amplifying the TaABA8'ox1D gene having an insertion mutation. Nucleic acid amplification can also be carried out in the reaction solution with a control oligonucleotide primer that specifically amplifies other TaABA8'ox1 genes. When the nucleic acid amplification method is PCR, this PCR is called so-called multiplex PCR. According to this method, other TaABA8′ox1 genes can be detected simultaneously, so that the TaABA8′ox1D gene having an insertion mutation can be detected with higher accuracy.

このようなマルチプレックスPCRに用いるコントロール用のプライマーの例としては、配列番号３５で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられ、これは配列番号２７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせにより、挿入変異を有しないTaABA8'ox1D遺伝子を特異的に核酸増幅できる。この場合、特に特異的な核酸増幅のためには、アニーリング及び伸長反応は、30〜50秒、例えば45秒とすることが好ましい。配列番号２７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによる特異的核酸増幅では、挿入変異を有しないTaABA8'ox1D遺伝子から、典型的には294bpの増幅産物が得られる。   An example of a control primer used for such multiplex PCR is an oligonucleotide primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 35, which comprises an oligonucleotide primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 Thus, the TaABA8′ox1D gene having no insertion mutation can be specifically amplified by nucleic acid. In this case, for specific nucleic acid amplification, the annealing and extension reaction is preferably performed for 30 to 50 seconds, for example, 45 seconds. In specific nucleic acid amplification using an oligonucleotide primer consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide primer consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 35, a TaABA8'ox1D gene having no insertion mutation is typically used. An amplification product of 294 bp is obtained.

さらに、マルチプレックスPCRに用いるコントロール用のプライマーの例として、配列番号３７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号３８で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせ（プライマーペア）が挙げられ、これはTaABA8'ox1A遺伝子を特異的に核酸増幅できる。配列番号３７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによる特異的核酸増幅では、TaABA8'ox1A遺伝子から、典型的には198bpの増幅産物が得られる。   Furthermore, as an example of a control primer used for multiplex PCR, a combination (primer pair) of an oligonucleotide primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 37 and an oligonucleotide primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 38 is given. This can specifically amplify the TaABA8'ox1A gene. In the specific nucleic acid amplification using the oligonucleotide primer consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 37 and the oligonucleotide primer consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 38, an amplification product of typically 198 bp is obtained from the TaABA8'ox1A gene. can get.

本発明に係る検出方法では、以上のようにして、被験コムギのゲノムにおける、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異を検出することができる。本発明に係る検出方法によれば、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異をホモ接合で有する被験コムギだけでなく当該挿入変異をヘテロ接合で有する被験コムギについても、その挿入変異を特異的に検出することができる。なお、例えば、挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子を増幅せずに挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子を特異的に増幅するコントロール用のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅を併用することにより、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異をホモ接合で有する被験コムギと、当該挿入変異をヘテロ接合で有する被験コムギとを識別することもできる。   In the detection method according to the present invention, the insertion mutation in the TaABA8′ox1D gene in the genome of the test wheat can be detected as described above. According to the detection method of the present invention, the insertion mutation is specifically detected not only in a test wheat homozygous for the insertion mutation in the TaABA8'ox1D gene but also in a test wheat heterozygous for the insertion mutation. be able to. In addition, for example, TaABA8 ′ by combining nucleic acid amplification using a control oligonucleotide primer that specifically amplifies TaABA8′ox1D gene having an insertion mutation without amplifying TaABA8′ox1D gene having an insertion mutation. A test wheat having an insertion mutation in the ox1D gene in a homozygote can be distinguished from a test wheat having the insertion mutation in a heterozygote.

このようにして検出されるTaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異は、野生型TaABA8'ox1D遺伝子によりコードされるアブシジン酸8'位水酸化酵素のC末端アミノ酸配列を変更し、さらに、そのタンパク質コード領域内で終止コドンを引き起こすことにより、アブシジン酸8'位水酸化酵素のC末端アミノ酸を欠失させる。具体的には、この方法で検出される挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子によりコードされるアブシジン酸8'位水酸化酵素は、野生型アブシジン酸8'位水酸化酵素（配列番号６）の436位以降のアミノ酸を欠失している（配列番号１２）。アブシジン酸8'位水酸化酵素はシトクロムP450スーパーファミリーに分類されるが、シトクロムP450ファミリーのヘム結合領域のCys残基よりC末端側には、6番目の基質の認識に関わる部位がある（今井嘉郎、化学と生物、Vo. 36, No.8（1998）、Gotoh, J. Biol. Chem., 267，83 (1992）)。植物のアブシジン酸8'位水酸化酵素のアミノ酸配列を比較すると、ヘム結合領域のCys残基よりC末端側に高度に保存されたアミノ酸配列（PFxxPxxGL）があるが、シロイヌナズナのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子CYP707A2の変異体cyp707a2-2では、7番目のイントロンにT-DNAが挿入されることによりPFxxPxxGL配列を含むC末端領域（WEVIGDEEGIQYGPFPVPKKGLPIRVTPI；配列番号５１）が翻訳されない（Kushiro et al., EMBO, 2004）。このcyp707a2-2変異体の種子発芽は、野生型に比較して顕著に遅延することから、アブシジン酸の代謝活性を失っていると考えられる（Kushiro et al., EMBO, 2004）。このようにC末端アミノ酸を欠失したアブシジン酸8'位水酸化酵素は活性を喪失することになる。なお、図７Ｂに、TaABA8'ox1A,B,D、TaABA8'ox1D insertionと、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）等の他植物種のアブシジン酸8'位水酸化酵素とのC末端アミノ酸配列のアラインメントを示している。上記のようにTaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異が検出された被験コムギのTaABA8'ox1D遺伝子は、活性のあるアブシジン酸8'位水酸化酵素を発現できず、機能を欠損している。従って本発明に係る検出方法では、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異を上記のようにして検出することにより、被験コムギの有するアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異を検出することができる。この本発明に係る検出方法によりアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異が検出された被験コムギは、機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の供給源として有用である。   The insertion mutation in the TaABA8'ox1D gene detected in this way changes the C-terminal amino acid sequence of the abscisic acid 8 'hydroxylase encoded by the wild-type TaABA8'ox1D gene, and further, its protein coding region The C-terminal amino acid of the abscisic acid 8 ′ hydroxylase is deleted by causing a stop codon within. Specifically, the abscisic acid 8 ′ hydroxylase encoded by the TaABA8′ox1D gene having an insertion mutation detected by this method is 436 of wild type abscisic acid 8 ′ hydroxylase (SEQ ID NO: 6). The amino acid after the position is deleted (SEQ ID NO: 12). Abscisic acid 8'-hydroxylase is classified into the cytochrome P450 superfamily, but there is a site involved in recognition of the sixth substrate on the C-terminal side of the Cys residue in the cytochrome P450 family heme binding region (Imai). Yoshiro, Chemistry and Biology, Vo. 36, No. 8 (1998), Gotoh, J. Biol. Chem., 267, 83 (1992)). Comparing the amino acid sequence of the plant abscisic acid 8 'hydroxylase, there is a highly conserved amino acid sequence (PFxxPxxGL) on the C-terminal side of the Cys residue in the heme binding region, but Arabidopsis abscisic acid 8' position In the mutant cyp707a2-2 of the hydroxylase gene CYP707A2, the C-terminal region (WEVIGDEEGIQYGPFPVPKKGLPIRVTPI; SEQ ID NO: 51) containing the PFxxPxxGL sequence is not translated by inserting T-DNA into the seventh intron (Kushiro et al., EMBO, 2004). Seed germination of this cyp707a2-2 mutant is significantly delayed compared to the wild type, and is considered to have lost the metabolic activity of abscisic acid (Kushiro et al., EMBO, 2004). Thus, the abscisic acid 8 ′ hydroxylase lacking the C-terminal amino acid loses its activity. FIG. 7B shows an alignment of the C-terminal amino acid sequence of TaABA8′ox1A, B, D, TaABA8′ox1D insertion and abscisic acid 8′-hydroxylase of other plant species such as Arabidopsis thaliana. Yes. As described above, the TaABA8′ox1D gene of the test wheat in which the insertion mutation in the TaABA8′ox1D gene is detected cannot express the active abscisic acid 8′-hydroxylase and is deficient in function. Therefore, in the detection method according to the present invention, by detecting the insertion mutation in the TaABA8′ox1D gene as described above, it is possible to detect a function-deficient mutation in the abscisic acid 8′-hydroxylase gene of the test wheat. it can. The test wheat in which a function-deficient mutation of the abscisic acid 8′-position hydroxylase gene is detected by the detection method according to the present invention is useful as a source of the function-deficient mutant abscisic acid 8′-position hydroxylase gene.

２．TaABA8'ox1同祖遺伝子群の同時検出方法
本発明は、所定のプライマーペアを用いた核酸増幅を行い、コムギのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1）の各同祖遺伝子（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D；コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子）に特異的な増幅産物を確認することにより、被験コムギのTaABA8'ox1同祖遺伝子群を互いに区別して検出する方法も提供する。 2. Method for Simultaneous Detection of TaABA8'ox1 Homologous Gene Group The present invention performs nucleic acid amplification using a predetermined primer pair, and each homologous gene (TaABA8'ox1) of wheat abscisic acid 8 'hydroxylase gene (TaABA8'ox1) By confirming amplification products specific for 'ox1A, TaABA8'ox1B, TaABA8'ox1D; abscisic acid 8' hydroxylase gene in wheat A, B and D genomes), the test wheat TaABA8'ox1 homologous gene A method for distinguishing and detecting groups from each other is also provided.

このTaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出方法は、各同祖遺伝子（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D）の多型検出が可能なDNAマーカーを用いて行うことができる。具体的には、TaABA8'ox1同祖遺伝子群の多型部位を増幅するプライマーペアを用いた核酸増幅（好ましくはPCR）と、必要に応じてその後の制限酵素処理を行い、各同祖遺伝子に特異的な増幅産物（DNA断片）を確認することにより、TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、及びTaABA8'ox1D遺伝子を区別して同時に検出することができる。本明細書において「増幅産物」とは、プライマー又はプライマーペアにより特定の領域について増幅された核酸増幅産物又はその制限酵素処理で得られたDNA断片をいう。   This method for detecting the TaABA8′ox1 homologous gene group can be performed using a DNA marker capable of detecting a polymorphism of each homologous gene (TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B, TaABA8′ox1D). Specifically, nucleic acid amplification (preferably PCR) using a primer pair that amplifies the polymorphic site of TaABA8'ox1 homologous gene group, and subsequent restriction enzyme treatment as necessary, By confirming specific amplification products (DNA fragments), the TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B, and TaABA8′ox1D genes can be distinguished and detected simultaneously. As used herein, “amplified product” refers to a nucleic acid amplification product amplified in a specific region by a primer or primer pair or a DNA fragment obtained by treatment with a restriction enzyme thereof.

より具体的には、本発明は、被験コムギ由来のゲノムDNAについて、以下の(1)〜(13)のいずれかの工程により、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子のそれぞれに特異的な増幅産物を得ることにより、コムギアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子群を検出する方法を提供する：
(1) 配列番号１６及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素AluIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS7A3/AluIに対応］、
(2) 配列番号２０及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素AluIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS7A7/AluIに対応］、
(3) 配列番号２１及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素MseIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS7A8/MseIに対応］、
(4) 配列番号２１及び３１で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素MseIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS6A8/MseIに対応］、
(5) 配列番号２１及び３３で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素MseIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS8A8/MseIに対応］、
(6) 配列番号２１及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素AluIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS1A8/AluIに対応］、
(7) 配列番号２３及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素AluIとMboIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS1A10/AluI+MboIに対応］、
(8) 配列番号２４及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素AluIとMboIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS1A11/AluI+MboIに対応］、
(9) 配列番号２５及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素AluIとMboIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS1A12/AluI+MboIに対応］、
(10) 配列番号１４及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素AluIとMboIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS1A1/AluI+MboIに対応］、
(11) 配列番号２２及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行い、得られた増幅産物を制限酵素KpnIで消化する工程［実施例中のDNAマーカーS7A9/KpnIに対応］、
(12) 配列番号１５及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行う工程［実施例中のDNAマーカーS2A2mixに対応］、
(13) 配列番号１８及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いたPCRにより核酸増幅を行う工程［実施例中のDNAマーカーS2A5mixに対応］。More specifically, the present invention relates to the genomic DNA derived from the test wheat by the steps of any of the following (1) to (13), the abscisic acid 8 ′ hydroxylase of the wheat A, B and D genomes: A method is provided for detecting a group of 8 'hydroxylase genes of wheat gear bucidic acid by obtaining amplification products specific for each of the genes:
(1) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer comprising each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 32, and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme AluI [Example Compatible with DNA marker S7A3 / AluI in the middle]
(2) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 20 and 32, and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme AluI [Example Compatible with DNA marker S7A7 / AluI in the middle]
(3) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 32, and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme MseI [Example Corresponding to DNA marker S7A8 / MseI in the middle]
(4) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 31, and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme MseI [Example Corresponding to DNA marker S6A8 / MseI in the middle]
(5) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 33, and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme MseI [Example Corresponding to DNA marker S8A8 / MseI in the middle]
(6) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 26, and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme AluI [Example Corresponding to the DNA marker S1A8 / AluI in the middle]
(7) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 23 and 26, and digesting the obtained amplification product with restriction enzymes AluI and MboI [ Corresponding to the DNA marker S1A10 / AluI + MboI in the Examples],
(8) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 24 and 26, and digesting the obtained amplification product with restriction enzymes AluI and MboI [ Corresponding to the DNA marker S1A11 / AluI + MboI in the Examples],
(9) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 25 and 26, and digesting the obtained amplification product with restriction enzymes AluI and MboI [ Corresponding to the DNA marker S1A12 / AluI + MboI in the Examples],
(10) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 and 26, and digesting the obtained amplification product with restriction enzymes AluI and MboI [ Corresponding to the DNA marker S1A1 / AluI + MboI in the Examples],
(11) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair including an oligonucleotide primer comprising each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 22 and 32, and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme KpnI [Example Corresponding to DNA marker S7A9 / KpnI in the middle]
(12) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair containing an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15 and 27 [corresponding to the DNA marker S2A2mix in the Examples]
(13) A step of performing nucleic acid amplification by PCR using a primer pair containing an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 18 and 27 [corresponding to the DNA marker S2A5mix in the Examples].

本発明に係るTaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出方法において、各工程で得られる各TaABA8'ox1同祖遺伝子に特異的な増幅産物（その制限酵素切断断片を含む）のサイズは、図３に記載されている。またPCRの温度サイクル条件等の詳細については後述の実施例を参照できる。本方法における核酸増幅法と特異的増幅産物の検出手段は、上記の１．同様にして行えばよい。   In the method for detecting a TaABA8'ox1 homologous gene group according to the present invention, the size of the amplification product (including its restriction enzyme fragment) specific to each TaABA8'ox1 homologous gene obtained in each step is shown in FIG. Have been described. The details of PCR temperature cycle conditions and the like can be referred to in the examples described later. The nucleic acid amplification method and the specific amplification product detection means in this method are as described in 1. above. The same can be done.

本発明に係るTaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出方法においては、特に、上記の(1)のDNAマーカーS7A3/AluI、(6)のDNAマーカーS1A8/AluI、及び(12)のDNAマーカーS2A2mixの少なくとも１つを利用することが好ましい。   In the method for detecting a TaABA8'ox1 homologous gene group according to the present invention, in particular, the DNA marker S7A3 / AluI of (1) above, the DNA marker S1A8 / AluI of (6), and the DNA marker S2A2mix of (12) It is preferable to use at least one.

本発明に係るTaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出方法を用いれば、それぞれのTaABA8'ox1同祖遺伝子の増幅産物の変化に基づき、それらの遺伝子の変異を容易に検出することができる。例えば、DNAマーカーS2A2mixを用いたTaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出方法では、特に、上記１．で検出される、挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子については、TaABA8'ox1D遺伝子由来の増幅産物に対応するバンドが喪失することにより、その挿入変異を容易に検出できる。   By using the method for detecting a TaABA8′ox1 homologous gene group according to the present invention, mutations in those genes can be easily detected based on changes in the amplification products of the respective TaABA8′ox1 homologous genes. For example, in the method for detecting a TaABA8′ox1 homologous gene group using the DNA marker S2A2mix, the above-mentioned 1. As for the TaABA8′ox1D gene having an insertion mutation detected in (2), the insertion mutation can be easily detected by losing the band corresponding to the amplification product derived from the TaABA8′ox1D gene.

このTaABA8'ox1同祖遺伝子群の変異の検出方法では、3つのTaABA8'ox1同祖遺伝子群の変異を同時に検出できるため、遺伝子変異を効率的に検出できる。また本方法では、複数のDNAマーカーを利用してTaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出を行ってもよい。すなわち、複数の遺伝子内領域に対して設計した複数のプライマーペアを用いてTaABA8'ox1同祖遺伝子群の核酸増幅を行うことにより、プライマーとゲノム中のアニーリング部位の塩基配列の不一致による増幅不良を防ぎつつ、各TaABA8'ox1同祖遺伝子の欠失変異をより確実に検出することができる。   In this method for detecting mutations in the TaABA8'ox1 homologous gene group, mutations in the three TaABA8'ox1 homologous gene groups can be detected simultaneously, so that the gene mutation can be detected efficiently. In this method, a TaABA8′ox1 homologous gene group may be detected using a plurality of DNA markers. In other words, by performing nucleic acid amplification of TaABA8'ox1 homologous gene group using multiple primer pairs designed for multiple intragenic regions, amplification failure due to mismatch between the primer and the nucleotide sequence of the annealing site in the genome is eliminated. While preventing, deletion mutation of each TaABA8'ox1 homologous gene can be detected more reliably.

３．種子休眠性を強化したコムギの育種方法
本発明に係るアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異の検出方法によれば、機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有する被験コムギを選択することができる。このようにして選択された機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有するコムギは、TaABA8'ox1同祖遺伝子群（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D）の全てを機能欠損させたTaABA8'ox1完全変異体を作出する上で、育種親として有利に使用できる。機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子をヘテロ接合で有するコムギも育種親として使用できるが、機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子をホモ接合で有するコムギを育種親として用いることがより好ましい。 3. Method for breeding wheat with enhanced seed dormancy According to the method for detecting a function-deficient mutation of the abscisic acid 8′-hydroxylase gene according to the present invention, a test having a function-deficient mutant abscisic acid 8′-hydroxylase gene Wheat can be selected. The wheat having the function-deficient mutant abscisic acid 8 'hydroxylase gene selected in this way is functionally deficient in all of the TaABA8'ox1 homologous gene groups (TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B, TaABA8'ox1D) In producing a complete TaABA8'ox1 mutant, it can be advantageously used as a breeding parent. Wheat with heterozygous loss-of-function mutant abscisic acid 8′-hydroxylase gene can also be used as a breeding parent, but wheat with homozygous function-deficient mutant abscisic acid 8′-hydroxylase gene as a breeding parent More preferably, it is used.

本発明では、このように選択された機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有するコムギを育種親として用いてコムギを育種することができる。コムギの育種は、常法により行うことができる。例えば、育種親である機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有するコムギを他の品種又は系統のコムギと１回以上交配することによりコムギの育種を行うことができ、その結果得られた種子を採種することにより子孫コムギを取得することができる。あるいは、育種親である機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有するコムギを変異原処理した後、自家交配することによってコムギの育種を行うこともでき、その結果得られた種子を採種することにより子孫コムギを取得することができる。変異原処理は、限定するものではないが、例えば、コムギ種子をγ線照射又はアジ化ナトリウム処理することにより実施することができる。γ線照射は、例えば、乾燥種子に対してγ線を10Gy/hで20時間照射することにより行うことができる。アジ化ナトリウム処理は、例えば、吸水種子（20℃、48時間）を4mMアジ化ナトリウム溶液に２時間浸漬することにより行うことができる。   In the present invention, wheat having the function-deficient mutant abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene thus selected can be used as a breeding parent to breed wheat. Wheat breeding can be carried out by conventional methods. For example, wheat can be bred by crossing at least one wheat with another varieties or strains of wheat having the function-deficient mutant abscisic acid 8′-hydroxylase gene as a breeding parent. Progeny wheat can be obtained by harvesting the seeds. Alternatively, after breeding the wheat having the function-deficient mutant abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene, which is the breeding parent, with mutagen treatment, it is possible to breed the wheat by self-mating, Progeny wheat can be obtained by seeding. The mutagen treatment is not limited, but can be carried out, for example, by subjecting wheat seeds to γ-ray irradiation or sodium azide treatment. The γ-ray irradiation can be performed, for example, by irradiating dried seeds with γ rays at 10 Gy / h for 20 hours. The sodium azide treatment can be performed, for example, by immersing a water-absorbing seed (20 ° C., 48 hours) in a 4 mM sodium azide solution for 2 hours.

機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有するコムギを育種親としてコムギを育種することにより得られた子孫コムギについて、さらに、そのゲノムDNA中のTaABA8'ox1同祖遺伝子群の変異を検出してもよい。ゲノムDNA中のTaABA8'ox1同祖遺伝子群の変異の検出は、上記２．に記載したTaABA8'ox1同祖遺伝子群の同時検出方法を用いて行うことができる。すなわち、子孫コムギのゲノムDNAについて、TaABA8'ox1同祖遺伝子群の同時検出方法により各TaABA8'ox1同祖遺伝子を特異的に検出した結果、例えば特定のTaABA8'ox1同祖遺伝子からの増幅産物のみが検出されない場合には、そのTaABA8'ox1同祖遺伝子に変異が存在することが示される。複数のDNAマーカーを利用して、複数のプライマーペアで複数のTaABA8'ox1遺伝子内領域の増幅を行うことも好ましい。複数のプライマーペアでTaABA8'ox1遺伝子配列を増幅しても増幅産物が得られない場合には、当該子孫コムギはそのTaABA8'ox1同祖遺伝子を欠失していると考えられる。   Regarding the progeny wheat obtained by breeding wheat with the wheat having the functional deficient abscisic acid 8 'hydroxylase gene as a breeding parent, mutations in the TaABA8'ox1 homologous gene group in its genomic DNA It may be detected. Detection of mutations in the TaABA8'ox1 homologous gene group in genomic DNA is described in 2. above. Can be performed using the method for simultaneous detection of TaABA8′ox1 homologous gene group described in 1. above. That is, for the genomic DNA of the offspring wheat, as a result of specific detection of each TaABA8'ox1 homologous gene by the simultaneous detection method of TaABA8'ox1 homologous gene group, for example, only amplification products from a specific TaABA8'ox1 homologous gene Is not detected, it indicates that there is a mutation in the TaABA8'ox1 homologous gene. It is also preferable to amplify a plurality of TaABA8′ox1 gene internal regions with a plurality of primer pairs using a plurality of DNA markers. If an amplification product is not obtained even when the TaABA8'ox1 gene sequence is amplified with a plurality of primer pairs, it is considered that the progeny wheat has lost its TaABA8'ox1 homologous gene.

上記１．の方法によって選択された、挿入変異によって機能欠損したTaABA8'ox1D遺伝子を有するコムギを育種親として行う育種の過程で、子孫コムギのゲノムDNAについてTaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出を行うことにより、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B）の変異（好ましくは遺伝子欠失等の機能欠損変異）を検出すれば、TaABA8'ox1D遺伝子における挿入変異に加えてTaABA8'ox1A及び／又はTaABA8'ox1B遺伝子の変異（好ましくは遺伝子欠失等の機能欠損変異）をさらに生じた子孫コムギを容易にスクリーニングすることができる。また、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子（TaABA8'ox1D）における挿入変異も併せて検出することにより、子孫コムギにおけるTaABA8'ox1D遺伝子における挿入変異の保持を確認することができる。   Above 1. In the process of breeding wheat having a TaABA8'ox1D gene deficient in function due to insertion mutation selected by the method as a breeding parent, by detecting the TaABA8'ox1 homologous gene group for the genomic DNA of the offspring wheat, If a mutation in the abscisic acid 8 'hydroxylase gene (TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B) in the wheat A, B and D genomes (preferably a functional deletion mutation such as a gene deletion) is detected, the TaABA8'ox1D gene In addition to the insertion mutation, progeny wheat that further has a mutation in the TaABA8′ox1A and / or TaABA8′ox1B gene (preferably a function-deficient mutation such as gene deletion) can be easily screened. In addition, by detecting an insertion mutation in the abscisic acid 8′-hydroxylase gene (TaABA8′ox1D) in the wheat D genome, it is possible to confirm the retention of the insertion mutation in the TaABA8′ox1D gene in the offspring wheat.

TaABA8'ox1同祖遺伝子群の検出は、限定するものではないが、例えば、上記２．に示した(1)〜(13)のいずれかの工程に基づく方法により行うことがより好ましい。特に、(1)のDNAマーカーS7A3/AluI、(6)のDNAマーカーS1A8/AluI、及び(12)のDNAマーカーS2A2mixの１つ以上、好ましくはそれら３つを利用して行うことがより好適である。   Although detection of TaABA8'ox1 homologous gene group is not limited, for example, 2. More preferably, it is carried out by a method based on any one of the steps (1) to (13). In particular, it is more preferable to use one or more of (1) DNA marker S7A3 / AluI, (6) DNA marker S1A8 / AluI, and (12) DNA marker S2A2mix, preferably three of them. is there.

例えば、子孫コムギ由来のゲノムDNAを、配列番号１６及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア（DNAマーカーS7A3/AluIの場合）、又は配列番号２１及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア（DNAマーカーS1A8/AluIの場合）を用いて核酸増幅し、得られた増幅産物を制限酵素AluIで消化することにより、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出することが好ましい。例えば、核酸増幅と制限酵素処理後の反応産物を電気泳動して、TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B及びTaABA8'ox1Dに特異的な増幅産物に対応した予測されるサイズ（表２）のバンドの有無を確認し、バンドが現れない場合には当該TaABA8'ox1遺伝子の変異が検出されたと判断することができる。   For example, a genomic DNA derived from a progeny wheat is represented by a primer pair (in the case of DNA marker S7A3 / AluI) including oligonucleotide primers each consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 32, or represented by SEQ ID NOs: 21 and 26 Nucleic acid amplification using a primer pair (in the case of DNA marker S1A8 / AluI) containing oligonucleotide primers each consisting of a base sequence, and digesting the resulting amplification product with the restriction enzyme AluI, wheat A, B and D It is preferable to detect a mutation in the genomic abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene. For example, electrophoresis of the reaction product after nucleic acid amplification and restriction enzyme treatment shows the presence or absence of a band of the expected size (Table 2) corresponding to the amplification products specific to TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B and TaABA8'ox1D If no band appears, it can be determined that the mutation of the TaABA8'ox1 gene has been detected.

あるいは、子孫コムギ由来のゲノムDNAを、配列番号１５及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア（DNAマーカーS2A2mixの場合）を用いて核酸増幅することにより、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出することも好ましい。例えば、核酸増幅後の反応産物を電気泳動して、TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B及びTaABA8'ox1Dに特異的な増幅産物に対応した予測されるサイズ（表２）のバンドの有無を確認し、バンドが現れない場合には当該TaABA8'ox1遺伝子の変異が検出されたと判定することができる。なお、このプライマーペア（S2A2mix）は、上記１．の方法で検出される挿入変異を有するTaABA8'ox1D遺伝子を増幅せず、挿入変異を有しないTaABA8'ox1D遺伝子を特異的に増幅するため、この方法によれば、TaABA8'ox1D遺伝子の挿入変異を簡便に検出することができる。   Alternatively, a genomic DNA derived from progeny wheat is subjected to nucleic acid amplification using a primer pair (in the case of the DNA marker S2A2mix) containing oligonucleotide primers each consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15 and 27, so that wheat A, It is also preferable to detect mutations in the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene in the B and D genomes. For example, electrophoresis of the reaction product after nucleic acid amplification confirms the presence or absence of a band of the expected size (Table 2) corresponding to the amplification products specific to TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B and TaABA8'ox1D, When no band appears, it can be determined that the mutation of the TaABA8′ox1 gene has been detected. This primer pair (S2A2mix) In order to specifically amplify the TaABA8'ox1D gene having no insertion mutation without amplifying the TaABA8'ox1D gene having the insertion mutation detected by this method, the insertion mutation of the TaABA8'ox1D gene is performed according to this method. It can be easily detected.

DNAマーカーS7A3/AluI、S1A8/AluI、及びS2A2mixの３種を用いてTaABA8'ox1遺伝子の変異を検出し、特定のTaABA8'ox1同祖遺伝子からの特異的増幅産物が、３種のDNAマーカーのいずれによっても得られない場合には、そのTaABA8'ox1同祖遺伝子は遺伝子全体又はその大部分が欠失しており、機能欠損していると判定することができる。   DNA markers S7A3 / AluI, S1A8 / AluI, and S2A2mix were used to detect mutations in TaABA8'ox1 gene, and specific amplification products from specific TaABA8'ox1 homologous genes If it cannot be obtained by any of the methods, it can be determined that the TaABA8′ox1 homologous gene lacks the entire gene or most of the gene and is deficient in function.

このようにして得られる、TaABA8'ox1同祖遺伝子群の機能欠損変異が集積した子孫コムギでは、アブシジン酸8'位水酸化酵素の全体的な活性レベルが顕著に低下する。その結果、TaABA8'ox1同祖遺伝子群の機能欠損変異が集積した子孫コムギでは、種子休眠性が強化される。   In the offspring wheat obtained by integrating the function-deficient mutations of the TaABA8′ox1 homologous gene group thus obtained, the overall activity level of the abscisic acid 8′-position hydroxylase is significantly reduced. As a result, seed dormancy is enhanced in offspring wheat in which function-deficient mutations of the TaABA8'ox1 homologous gene cluster are accumulated.

本発明における「種子休眠性」のレベルは、種子休眠性の指標となる、吸水処理後の種子の発芽率で表すことができる。まず、発芽試験として、No.2濾紙を2枚入れた直径9cmのシャーレに蒸留水を6mL添加し、その濾紙の上に被験コムギ（育種親コムギ、子孫コムギ等が含まれる）から採種した種子を並べることにより吸水を開始させ、その後、24時間毎に発芽粒数を調べ、累積発芽粒数を吸水刺激処理の７日後まで計数する。この発芽試験は、20℃暗所にて行う。吸水処理した種子の総数に対する発芽した種子の累積数の割合を、発芽率（％）として算出する。種子休眠性を調べるコムギ種子は、限定するものではないが、例えば、開花後49日目の種子、又は開花後70日目の種子であってよい。吸水処理の７日後の発芽率（％）（累積発芽率）が、子孫コムギの育種親のコムギ品種若しくは系統と比較して有意に低減しているか又は発芽率０％であることが示される場合には、当該子孫コムギの種子休眠性は育種親よりも強化されていることが実証される。   The level of “seed dormancy” in the present invention can be expressed by the germination rate of the seed after water absorption treatment, which is an index of seed dormancy. First, as a germination test, 6 mL of distilled water was added to a petri dish with a diameter of 9 cm containing two No. 2 filter papers, and seeds collected from the test wheat (including breeding parent wheat, offspring wheat, etc.) on the filter paper Then, the number of germinated grains is examined every 24 hours, and the cumulative number of germinated grains is counted until 7 days after the water absorption stimulation treatment. This germination test is performed in the dark at 20 ° C. The ratio of the cumulative number of germinated seeds to the total number of seeds subjected to water absorption treatment is calculated as germination rate (%). The wheat seed to be examined for seed dormancy is not limited, and may be, for example, a seed on the 49th day after flowering or a seed on the 70th day after flowering. When germination rate (%) after 7 days of water absorption treatment (cumulative germination rate) is significantly reduced compared to the wheat cultivar or line of the offspring wheat breeding parent, or it is shown that germination rate is 0% It is demonstrated that the seed dormancy of the offspring wheat is stronger than the breeding parent.

従って本発明は、このような方法で実施する、種子休眠性が強化されたコムギの育種方法も提供する。この育種方法では、交配や変異原処理等の従来の方法を用いて、TaABA8'ox1同祖遺伝子群の機能欠損変異を集積させることができる。この方法を用いれば、最終的にはTaABA8'ox1完全変異体を作出することができる。   Therefore, the present invention also provides a method for breeding wheat with enhanced seed dormancy, which is carried out by such a method. In this breeding method, function-deficient mutations in the TaABA8'ox1 homologous gene group can be accumulated using conventional methods such as mating and mutagen treatment. If this method is used, TaABA8'ox1 complete mutant can be finally produced.

TaABA8'ox1同祖遺伝子群の機能欠損変異が集積した子孫コムギでは、吸水処理後も種子の発芽を抑制することができることから、本育種方法によれば、TaABA8'ox1同祖遺伝子群の機能欠損変異をコムギ個体に集積することにより、コムギ種子の発芽を抑制することができる。このようなコムギ種子発芽抑制方法も本発明の範囲に含まれる。   In progeny wheat, which has accumulated TaABA8'ox1 homologous gene group mutations, it is possible to suppress seed germination after water-absorbing treatment. By accumulating mutations in wheat individuals, germination of wheat seeds can be suppressed. Such a wheat seed germination suppression method is also included in the scope of the present invention.

４．プライマー及びキット
本発明は、本発明に係る方法に好適に用いることができるオリゴヌクレオチドプライマーも提供する。 4). Primers and Kits The present invention also provides oligonucleotide primers that can be suitably used in the method according to the present invention.

本発明に係るそのようなオリゴヌクレオチドプライマーの一実施形態は、配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異検出用のオリゴヌクレオチドプライマーである。   One embodiment of such an oligonucleotide primer according to the present invention is an abscisic acid 8′-position water of wheat D genome comprising a base sequence of at least 15 bases contiguous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a complementary sequence thereof. It is an oligonucleotide primer for detecting a function-deficient mutation of an oxidase gene.

本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーの特に好ましい一実施形態として、配列番号２７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを含む、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異検出用のプライマーペアが挙げられる。   As a particularly preferred embodiment of the oligonucleotide primer according to the present invention, a wheat D genome comprising an oligonucleotide primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 And a primer pair for detecting a function-deficient mutation of the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene.

本発明はまた、本発明に係る育種方法に好適に使用され得るプライマーペアとして、以下の(a)〜(c)：
(a) 配列番号１６及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア、
(b) 配列番号２１及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア
(c) 配列番号１５及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア
のいずれかである、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子検出用のプライマーペアも提供する。The present invention also provides the following (a) to (c) as primer pairs that can be suitably used in the breeding method according to the present invention:
(a) a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 32,
(b) a primer pair comprising an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 26
(c) For detection of the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene in the wheat A, B and D genomes, which is one of primer pairs including oligonucleotide primers each consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 15 and 27 Primer pairs are also provided.

本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも15塩基（bp）、好ましくは15〜50塩基（bp）、より好ましくは15〜30塩基（bp）、必要に応じて18〜30塩基（bp）（例えば20〜30塩基（bp））の塩基長を有する。本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、当業者に周知の任意の化学合成法により作製することができ、例えば市販の自動DNA合成装置を使用して慣用手順により合成することができる。本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドにさらに任意の修飾が施されたものでもよい。例えば本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、その5'末端又は3'末端に当該プライマーの検出や増幅を容易にするための標識物質（例えば、蛍光分子、色素分子、放射性同位元素、ジゴキシゲニンやビオチン等の有機化合物など）及び／又は付加配列（LAMP法で用いるループプライマー部分等）を含んでいてもよい。本発明に係るプライマーは、5'末端でリン酸化又はアミン化されていてもよい。本発明に係るプライマーはまた、天然塩基のみを含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。修飾塩基としては、デオキシイノシン、デオキシウラシル、S化塩基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に係るプライマーは、ホスホロチオエート結合やホスホロアミデート結合などを含む任意の誘導体オリゴヌクレオチドを含むものであってもよいし、ペプチド核酸結合を含むペプチド-核酸（PNA）を含んでいてもよい。本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、RNAである場合には、その塩基配列はDNA配列における「T（チミン）」を「U（ウラシル）」に読み替えるものとする。   The oligonucleotide primer according to the present invention has at least 15 bases (bp), preferably 15-50 bases (bp), more preferably 15-30 bases (bp), and optionally 18-30 bases (bp) (for example, 20 to 30 bases (bp)). The oligonucleotide primer according to the present invention can be prepared by any chemical synthesis method well known to those skilled in the art. For example, it can be synthesized by a conventional procedure using a commercially available automatic DNA synthesizer. The oligonucleotide primer according to the present invention may be one obtained by further modifying the oligonucleotide. For example, the oligonucleotide primer according to the present invention has a labeling substance (for example, fluorescent molecule, dye molecule, radioisotope, digoxigenin, biotin, etc.) for facilitating detection and amplification of the primer at the 5 ′ end or 3 ′ end. And / or an additional sequence (such as a loop primer portion used in the LAMP method). The primer according to the present invention may be phosphorylated or aminated at the 5 ′ end. The primer according to the present invention may also contain only a natural base or a modified base. Examples of the modified base include, but are not limited to, deoxyinosine, deoxyuracil, S-modified base and the like. The primer according to the present invention may contain any derivative oligonucleotide containing a phosphorothioate bond, phosphoramidate bond, or the like, or may contain a peptide-nucleic acid (PNA) containing a peptide nucleic acid bond. . The oligonucleotide primer according to the present invention may be DNA or RNA, and in the case of RNA, the base sequence thereof reads “T (thymine)” in the DNA sequence as “U (uracil)”. Shall.

本発明はまた、本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットも提供する。好適な実施形態では、該キットは、上記のコムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異検出用のオリゴヌクレオチドプライマー又はプライマーペアと、上記のコムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子検出用のプライマーペアとを含む、コムギ種子休眠性強化育種用のキットである。このキットは、さらに制限酵素AluIを含んでいてもよい。このコムギ種子休眠性強化育種用のキットは、種子休眠性が強化されたコムギの作製において非常に便利に使用できる。   The present invention also provides a kit comprising the oligonucleotide primer according to the present invention. In a preferred embodiment, the kit comprises an oligonucleotide primer or primer pair for detecting a function-deficient mutation of the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene of the wheat D genome, and the wheat A, B and D genomes. A wheat seed dormancy-enhanced breeding kit comprising a primer pair for detecting abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene. This kit may further contain a restriction enzyme AluI. This wheat seed dormancy-enhanced breeding kit can be used very conveniently in the production of wheat with enhanced seed dormancy.

以下、本発明を実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples.

以下の実施例で使用したコムギ品種又は系統は、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 作物研究所（日本）で保存されているもの又は農業生物資源ジーンバンクから分与されたものを用いた。   The wheat varieties or lines used in the following examples are those stored at the Crop Research Institute (Japan), Agricultural and Food Industry Research Organization, or those distributed from the Genebank of Agricultural Biological Resources. It was.

［実施例１］TaABA8'ox1同祖遺伝子の単離及び解析
（１）コムギの発芽時に発現するABA8'ox遺伝子の単離
濾紙2枚を入れた直径9cmのシャーレに蒸留水6mlを加え、コムギ品種「Chinese Spring（チャイニーズ・スプリング）」の種子を30粒播種し、発芽及び発根させた。得られた幼植物体からCTAB法（Chang et al. Plant Mol. Biol. Rep. 11, 113-116 (1993)）を用いて全RNAを抽出し、Dynabeads Olygo (dT)25 resin (Dynal)を用いてmRNAを精製した。このmRNAを鋳型として、Marathon cDNA Amplification Kit（Clontech）の使用説明書に従って逆転写反応を行い、5'及び3'末端にアダプターを付加したcDNAを調製し、RACEのための鋳型とした。RACE反応は、Advantage2 PCRキット（Clontech）を用いてその説明書に従って行った。5'-RACE及び3'-RACEには、オオムギのABA8'ox遺伝子と高い相同性を示すコムギのESTの塩基配列（GenBankアクセッション番号CJ702265）を基に設計した遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.S1：5'-AGGCCGTGGAGGACGTGGAGTACC-3'；配列番号２６、TaABAox1.A3：5'-CCGAAGATGGACAGCAATGCCACAT-3'；配列番号１６）とアダプタープライマーAP1（5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'；配列番号１３（Marathon cDNA Amplification Kit, Clontech））を用いた。続いて、このようにしてRACEにより得られた増幅断片の塩基配列を決定し、コムギのABA8'ox1をコードすると推定される3つの遺伝子に対応するcDNAの部分塩基配列が明らかになった。[Example 1] Isolation and analysis of TaABA8'ox1 homologous gene (1) Isolation of ABA8'ox gene expressed during germination of wheat 6 ml of distilled water was added to a petri dish with a diameter of 9 cm containing two filter papers. 30 seeds of the variety “Chinese Spring” were sown, germinated and rooted. Total RNA was extracted from the obtained seedlings using the CTAB method (Chang et al. Plant Mol. Biol. Rep. 11, 113-116 (1993)), and Dynabeads Olygo (dT) 25 resin (Dynal) was extracted. MRNA was purified. Using this mRNA as a template, a reverse transcription reaction was carried out according to the instruction manual of Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) to prepare cDNA with adapters at the 5 ′ and 3 ′ ends, and used as a template for RACE. The RACE reaction was performed using the Advantage2 PCR kit (Clontech) according to the instructions. For 5'-RACE and 3'-RACE, a gene-specific primer (TaABAox1.S1) designed based on the wheat EST base sequence (GenBank accession number CJ702265) showing high homology with the barley ABA8'ox gene. : 5'-AGGCCGTGGAGGACGTGGAGTACC-3 '; SEQ ID NO: 26, TaABAox1.A3: 5'-CCGAAGATGGACAGCAATGCCACAT-3'; SEQ ID NO: 16) and adapter primer AP1 (5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 '; SEQ ID NO: 13 (Marathon cDNA Amplification Kit , Clontech)). Subsequently, the base sequence of the amplified fragment thus obtained by RACE was determined, and the partial base sequences of cDNA corresponding to three genes presumed to encode wheat ABA8'ox1 were revealed.

さらにこれら3つの遺伝子のcDNA全長の塩基配列を明らかにするために、遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.S3：5'-CAAGAACCCCAACGTCTTCTTCG-3'；配列番号２８）及び遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.A4：5'-TGGCCGGGAAGGTAGGCTTGAAGAG-3'；配列番号１７）を合成し、これらプライマーを用いて「Chinese Spring」のcDNAを鋳型とする高忠実性（high fidelity）PCRを行った。PCR反応にはPyrobest DNAポリメラーゼ（TaKaRa）を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りで行った。PCR反応の温度サイクルは、98℃で10秒での変性、68℃で3分でのアニーリング及び伸長を30サイクルで行った。このようにして増幅されたDNA断片をpCR4 Blunt-TOPOベクター（Invitrogen）中にクローニングし、16クローンについて塩基配列決定を行ったところ、増幅DNA断片について3つの塩基配列が確認された。これら3つの塩基配列と5'-RACE及び3'-RACEで得られた塩基配列に基づき、3つの全長cDNAの塩基配列を決定した（図１）。さらに、これら3つの遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を、オオムギのABA8'oxのアミノ酸配列と比較したところ、それらは互いに高度の相同性を示した。なお、PCR断片の塩基配列決定は、自動シークエンシングシステム（ABI373A及びABI3100Avant, Applied Biosystems）を用いたジデオキシヌクレオチド・チェーン・ターミネーション法により行った。また、配列の解析は、DNASYS（Hitachi Software Engineering Co.、日本）を用いて実施した。   Furthermore, in order to clarify the nucleotide sequences of the full-length cDNAs of these three genes, a gene-specific primer (TaABAox1.S3: 5′-CAAGAACCCCAACGTCTTCTTCG-3 ′; SEQ ID NO: 28) and a gene-specific primer (TaABAox1.A4: 5 '-TGGCCGGGAAGGTAGGCTTGAAGAG-3'; SEQ ID NO: 17) was synthesized, and high fidelity PCR using "Chinese Spring" cDNA as a template was performed using these primers. Pyrobest DNA polymerase (TaKaRa) was used for the PCR reaction, and the reaction solution composition was performed according to the instructions attached to the enzyme. The temperature cycle of the PCR reaction was denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, annealing at 68 ° C. for 3 minutes and extension in 30 cycles. The DNA fragment thus amplified was cloned into the pCR4 Blunt-TOPO vector (Invitrogen), and the base sequence was determined for 16 clones. As a result, three base sequences were confirmed for the amplified DNA fragment. Based on these three base sequences and base sequences obtained by 5′-RACE and 3′-RACE, base sequences of three full-length cDNAs were determined (FIG. 1). Furthermore, when the deduced amino acid sequences encoded by these three genes were compared with the amino acid sequence of barley ABA8'ox, they showed a high degree of homology with each other. The base sequence of the PCR fragment was determined by the dideoxynucleotide chain termination method using an automatic sequencing system (ABI373A and ABI3100Avant, Applied Biosystems). Sequence analysis was performed using DNASYS (Hitachi Software Engineering Co., Japan).

解析の結果、上記のようにして配列決定されたコムギ品種「Chinese Spring」由来の3つの遺伝子は、ABA8'ox相同遺伝子群であることが示された。すなわち単離された３つのコムギABA8'ox相同遺伝子は、TaABA8'ox1同祖遺伝子群を構成する3つのTaABA8'ox1同祖遺伝子（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、及びTaABA8'ox1D）であった。得られたTaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1D遺伝子の全長cDNA配列をそれぞれ配列番号１、３、５に示す。またこれら遺伝子にコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２（TaABA8'ox1A）、配列番号４（TaABA8'ox1B）、配列番号６（TaABA8'ox1D）に示す。   As a result of the analysis, it was shown that the three genes derived from the wheat variety “Chinese Spring” sequenced as described above were ABA8′ox homologous gene group. That is, the three wheat ABA8'ox homologous genes isolated were the three TaABA8'ox1 homologous genes (TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B, and TaABA8'ox1D) constituting the TaABA8'ox1 homologous gene group. . The full-length cDNA sequences of the obtained TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B, and TaABA8′ox1D genes are shown in SEQ ID NOs: 1, 3, and 5, respectively. The amino acid sequences encoded by these genes are shown in SEQ ID NO: 2 (TaABA8′ox1A), SEQ ID NO: 4 (TaABA8′ox1B), and SEQ ID NO: 6 (TaABA8′ox1D), respectively.

（２）TaABA8'ox1同祖遺伝子群のゲノム配列の決定
上記（１）で単離したTaABA8'ox1同祖遺伝子群のゲノム配列を明らかにするため、まず、コムギ品種「農林61号（Nourin 61）」の葉よりDNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）でゲノムDNAを抽出・精製した。得られたゲノムDNAを鋳型として、遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.S5：5'-GCCTTTCGTTGRCATGGCWGCTT-3'；配列番号３０）と遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.A2mix：5'-CGTYGCCWCTATCGYGCYGTTGAT-3'；配列番号１５）との組合せ、及び、遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.S3：5'-CAAGAACCCCAACGTCTTCTTCG-3'；配列番号２８）と遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.A9：5'-ACTTCTTTGTGGCGCCGGATCTC-3'；配列番号２２）との組合せを用いてPyrobest DNAポリメラーゼ（TaKaRa）による高忠実性（high fidelity）PCRを行った。このようにして増幅されたDNA断片をpCR4 Blunt-TOPOベクター（Invitrogen）中にクローニングし、上記（１）と同様の方法で塩基配列を決定した。これら2種類の遺伝子特異的プライマーペアで得られた塩基配列を組合せてゲノムDNA上の塩基配列を決定した。このようにして同祖遺伝子TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1Dのゲノム配列を決定し（図２）、それぞれ配列番号７、８、及び９に示した。(2) Determination of genome sequence of TaABA8'ox1 homologous gene group In order to clarify the genome sequence of TaABA8'ox1 homologous gene group isolated in (1) above, first, wheat variety “Nourin 61” ) "Leaves were extracted and purified with DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Gene-specific primer (TaABAox1.S5: 5'-GCCTTTCGTTGRCATGGCWGCTT-3 '; SEQ ID NO: 30) and gene-specific primer (TaABAox1.A2mix: 5'-CGTYGCCWCTATCGYGCYGTTGAT-3'; SEQ ID NO: using the obtained genomic DNA as a template 15) and a gene-specific primer (TaABAox1.S3: 5′-CAAGAACCCCAACGTCTTCTTCG-3 ′; SEQ ID NO: 28) and a gene-specific primer (TaABAox1.A9: 5′-ACTTCTTTGTGGCGCCGGATCTC-3 ′; SEQ ID NO: 22) ) Was used to perform high fidelity PCR with Pyrobest DNA polymerase (TaKaRa). The DNA fragment thus amplified was cloned into the pCR4 Blunt-TOPO vector (Invitrogen), and the base sequence was determined by the same method as in (1) above. The nucleotide sequences obtained from these two gene-specific primer pairs were combined to determine the nucleotide sequence on the genomic DNA. In this way, genomic sequences of homoeologous genes TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B and TaABA8′ox1D were determined (FIG. 2) and are shown in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively.

（３）TaABA8'ox1の各同祖遺伝子特異的検出のためのDNAマーカーの開発
TaABA8'ox1同祖遺伝子群の塩基配列の違いを利用して、各同祖遺伝子の多型を同時に検出できるDNAマーカーの開発を試みた。TaABA8'ox1同祖遺伝子群の塩基配列は非常に類似していたが、部分的に保存されていない領域も存在していた。そこで、それらの塩基配列の違いを検出可能な領域を増幅するプライマー（表１）を設計した（図３）。

Figure 0005419112
(3) Development of DNA markers for specific detection of TaABA8'ox1 homologous genes
Using the difference in the nucleotide sequence of TaABA8'ox1 homologous genes, we attempted to develop a DNA marker that can simultaneously detect polymorphisms of each homologous gene. Although the base sequences of TaABA8'ox1 homologous genes were very similar, there was a region that was not partially conserved. Therefore, a primer (Table 1) was designed to amplify a region capable of detecting the difference in the base sequences (FIG. 3).
Figure 0005419112

次いで、コムギ品種「農林61号」、「新中長」及び「タマイズミ」から常法により抽出し調製したゲノムDNAを鋳型とし、設計した遺伝子特異的プライマーペア（S7A3［S7：フォワードプライマー、A3：リバースプライマー。以下同様］、S7A7、S7A8、S6A8、S8A8、S1A8、S1A10、S1A11、S1A12、S1A1、S2A5mix、S2A2mix、S7A9）を用いてPCRを行った。PCRは、Ex Taq Hot Start Version（TaKaRa）及びGeneAmp（登録商標） PCR System 9700（Applied Biosystems）を用いて、酵素に添付の説明書に従って行った。PCR反応後、S2A5mix及びS2A2mix以外のプライマーペアによる増幅産物については、同祖遺伝子間の塩基配列の違いに基づいて異なる切断パターンを示す制限酵素でさらに処理した。用いた制限酵素は、S7A3についてはAluI、S7A7についてはAluI、S7A8についてはMseI、S6A8についてはMseI、S8A8についてはMseI、S1A8についてはAluI、S1A10についてはAluIとMboI、S1A11についてはAluIとMboI、S1A12についてはAluIとMboI、S1A1についてはAluIとMboI、S7A9についてはKpnIである。得られたDNA断片をアクリルアミドゲル又はアガロースゲルで電気泳動した。   Next, a gene-specific primer pair (S7A3 [S7: forward primer, A3: Reverse primer, the same applies hereinafter), PCR was performed using S7A7, S7A8, S6A8, S8A8, S1A8, S1A10, S1A11, S1A12, S1A1, S2A5mix, S2A2mix, S7A9). PCR was performed using Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa) and GeneAmp (registered trademark) PCR System 9700 (Applied Biosystems) according to the instructions attached to the enzyme. After the PCR reaction, amplification products using primer pairs other than S2A5mix and S2A2mix were further treated with restriction enzymes that showed different cleavage patterns based on the difference in nucleotide sequence between homologous genes. The restriction enzymes used were AluI for S7A3, AluI for S7A7, MseI for S7A8, MseI for S6A8, MseI for S8A8, AluI for S1A8, AluI and MboI for S1A10, AluI and MboI for S1A11, AluI and MboI for S1A12, AluI and MboI for S1A1, and KpnI for S7A9. The obtained DNA fragment was electrophoresed on acrylamide gel or agarose gel.

電気泳動の結果、これらDNAマーカーのうち、TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、TaABA8'ox1Dをより明確に区別できたものはS7A3/AluI、S1A8/AluI、S2A5mix、及びS2A2mixであった。   As a result of electrophoresis, among these DNA markers, TaABA8′ox1A, TaABA8′ox1B and TaABA8′ox1D were more clearly distinguished from S7A3 / AluI, S1A8 / AluI, S2A5mix, and S2A2mix.

これらのDNAマーカーを用いて各同祖遺伝子について得られる増幅DNA断片又はその制限酵素処理後の切断DNA断片のサイズを表２に示す。

Figure 0005419112
Table 2 shows the size of the amplified DNA fragment obtained for each homologous gene using these DNA markers or the digested DNA fragment after the restriction enzyme treatment.
Figure 0005419112

（４）コムギNullisomic-tetrasomic（零染色体-テトラソミー）系統を用いた座乗染色体の決定
3つのTaABA8'ox1同祖遺伝子群が座乗する染色体を明らかにするため、上記（３）で開発したDNAマーカーのうちの３つ（S7A3/AluI、S1A8/AluI、及びS2A2mix）を用いて、コムギ品種「Chinese Spring」のNullisomic-tetrasomic系統（特定染色体が1対無く、それを補償する同祖染色体が1対余分にある系統）から調製したゲノムDNAを鋳型として上記（３）と同様にして解析を行った。S1A8/AluI及びS7A3/AluIマーカーについては、S1A8又はS7A3プライマーペアを用いて、98℃で30秒での変性に続き、98℃で10秒、68℃で1分を35サイクル行い、さらに72℃で2分の後、4℃で維持する温度条件でPCRを行った後、AluIで切断した。S2A2mixマーカーについては、S2A2mixプライマーペアを用い、98℃で30秒での変性に続き、98℃で10秒、60℃で30秒、72℃で30秒を35サイクル行い、さらに72℃で2分の後、4℃で維持する温度条件でPCRを行った。得られたDNA断片を電気泳動した（図４）。(4) Determination of locus chromosomes using wheat nullisomic-tetrasomic strain
Three of the DNA markers developed in (3) above (S7A3 / AluI, S1A8 / AluI, and S2A2mix) were used to clarify the chromosome on which the three TaABA8'ox1 homologous genes are located. As in (3) above, using as a template genomic DNA prepared from the wheat variety “Chinese Spring” Nullisomic-tetrasomic strain (a strain that has one pair of specific chromosomes and one extra pair of homologous chromosomes that compensates for it) Analysis was performed. For S1A8 / AluI and S7A3 / AluI markers, use S1A8 or S7A3 primer pairs for 30 cycles of denaturation at 98 ° C for 30 seconds, 98 ° C for 10 seconds, 68 ° C for 1 minute, and 72 ° C After 2 minutes, PCR was performed under the temperature condition maintained at 4 ° C., followed by cleavage with AluI. For S2A2mix markers, use S2A2mix primer pairs and perform denaturation at 98 ° C for 30 seconds, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes. Thereafter, PCR was performed under the temperature condition maintained at 4 ° C. The obtained DNA fragment was electrophoresed (FIG. 4).

この解析の結果、6A、6B、6D染色体がそれぞれ欠失した系統において増幅産物の消失が確認されたことから、3つのTaABA8'ox1遺伝子（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、及びTaABA8'ox1D）が、それぞれ6A、6B、6D染色体に座乗することが示された。   As a result of this analysis, the disappearance of the amplification products was confirmed in the lines in which the 6A, 6B, and 6D chromosomes were deleted, respectively, so that three TaABA8'ox1 genes (TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B, and TaABA8'ox1D) It was shown to sit on the 6A, 6B, and 6D chromosomes, respectively.

［実施例２］コムギのTaABA8'ox1同祖遺伝子の解析
（１）コムギ遺伝資源におけるTaABA8'ox1の多型解析
470品種又は系統のコムギ遺伝資源から調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例１で開発したDNAマーカーS2A2mixを用いて、実施例１と同様にしてTaABA8'ox1遺伝子群の多型解析を行った。S2A2mixを用いて増幅したPCR産物の電気泳動の結果を図５に示す。[Example 2] Analysis of TaABA8'ox1 homologous gene in wheat (1) Polymorphism analysis of TaABA8'ox1 in wheat germplasm
Using the genomic DNA prepared from 470 varieties or lines of wheat genetic resources as a template, the polymorphism analysis of the TaABA8'ox1 gene group was performed in the same manner as in Example 1 using the DNA marker S2A2mix developed in Example 1. The result of electrophoresis of the PCR product amplified using S2A2mix is shown in FIG.

多型解析の結果、検索した420品種又は系統の中に、S2A2mixによりTaABA8'ox1DのゲノムDNAが増幅されない品種又は系統が多数含まれること、及びそれらは2品種を除き全て国内品種又は系統であることが示された。これらの品種又は系統はTaABA8'ox1D遺伝子に変異を有していると考えられ、この変異が日本のコムギ遺伝資源に由来する可能性があると考えられた。さらに、S2A2mixによるTaABA8'ox1Dの増幅が示されなかったコムギ品種又は系統の大多数が、コムギ品種「新中長（Shin chuunaga）」を系譜上に有していた。このことから、TaABA8'ox1Dに起きた遺伝子変異は日本古来の品種である「新中長」に由来すると推定した。   As a result of polymorphism analysis, the searched 420 varieties or strains include many varieties or strains for which the genomic DNA of TaABA8'ox1D is not amplified by S2A2mix, and these are all domestic varieties or strains except for two varieties. It was shown that. These varieties or strains were considered to have mutations in the TaABA8'ox1D gene, and it was considered that this mutation may be derived from Japanese wheat genetic resources. Furthermore, the majority of wheat varieties or lines that did not show amplification of TaABA8'ox1D by S2A2mix had the wheat cultivar “Shin chuunaga” on the lineage. From this, it was presumed that the gene mutation that occurred in TaABA8'ox1D was derived from the “New Medium Length”, an ancient Japanese variety.

（２）TaABA8'ox1Dにおける遺伝子変異部位の決定
実施例２−（１）により多数のコムギ遺伝資源で見出されたTaABA8'ox1D中の遺伝子変異部位を明らかにするため、「新中長」より調製したゲノムDNAを鋳型として、TaABA8'ox1D遺伝子を特異的に増幅できる遺伝子特異的プライマー（TaABAox1d_S1：5'-GACGCGCTCCTAACCGAACGAAC-3'；配列番号３４）と遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.A2_AGCG：5'-CGTCGCCTCTATCGCGCTGTTGAT-3'；配列番号３５）とのプライマーペアを用いてPCRを行った。PCRには、PCR増幅の際の正確性を上げるため、より正確性の高いDNAポリメラーゼであるPrime STAR HS DNAポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて、酵素に添付される説明書に記載の反応条件でPCRを行った。その結果、Ex Taq Hot Start Version（TaKaRa）を用いた場合には増幅されなかった約1.5 kbpのバンドが増幅された。次いで、得られた約1.5 kbpのDNA断片をクローニングし、その塩基配列を決定した。塩基配列の決定は実施例１−（１）と同様の方法で行った。次いで「新中長」由来TaABA8'ox1Dの塩基配列を、実施例１−（２）で得られた「農林61号」由来TaABA8'ox1Dの塩基配列と比較した。その結果、「新中長」のTaABA8'ox1Dには、本来の終止コドンよりも前の位置に966 bpの挿入配列が存在し（図６）、同一の読み枠内に新たに終止コドンが生じていることが判明した（図６、図７Ａ）。なお、挿入配列を含む「新中長」由来のTaABA8'ox1D遺伝子のゲノム配列（配列番号７〜９の配列と同じゲノム領域に相当）を、配列番号１０に示す。「新中長」のTaABA8'ox1D中の挿入配列（966 bp）は配列番号１１に示す。(2) Determination of gene mutation site in TaABA8'ox1D To clarify the gene mutation site in TaABA8'ox1D found in many wheat genetic resources in Example 2- (1) Gene-specific primer (TaABAox1d_S1: 5'-GACGCGCTCCTAACCGAACGAAC-3 '; SEQ ID NO: 34) and gene-specific primer (TaABAox1.A2_AGCG: 5'-) that can specifically amplify TaABA8'ox1D gene using the prepared genomic DNA as a template PCR was performed using a primer pair with CGTCGCCTCTATCGCGCTGTTGAT-3 ′; SEQ ID NO: 35). To increase the accuracy of PCR amplification, PCR is performed using Prime STAR HS DNA polymerase (TaKaRa), a more accurate DNA polymerase, under the reaction conditions described in the instructions attached to the enzyme. Went. As a result, a band of about 1.5 kbp that was not amplified when Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa) was used was amplified. Subsequently, the obtained DNA fragment of about 1.5 kbp was cloned and its base sequence was determined. The base sequence was determined by the same method as in Example 1- (1). Next, the base sequence of TaABA8′ox1D derived from “New Medium Length” was compared with the base sequence of TaABA8′ox1D derived from “Norin 61” obtained in Example 1- (2). As a result, the “new medium-long” TaABA8'ox1D has an insertion sequence of 966 bp in the position before the original stop codon (FIG. 6), and a new stop codon is generated in the same reading frame. (FIGS. 6 and 7A). In addition, the genome sequence (corresponding to the same genomic region as the sequences of SEQ ID NOs: 7 to 9) of the TaABA8′ox1D gene derived from “new medium length” including the insertion sequence is shown in SEQ ID NO: 10. The insertion sequence (966 bp) in the “new middle length” TaABA8′ox1D is shown in SEQ ID NO: 11.

さらに、「新中長」由来TaABA8'ox1D遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号１２）を他の同祖遺伝子（TaABA8'ox1A, B, D）及びコムギ以外の植物種由来ABA8'位水酸化酵素（ABA8'ox）遺伝子のアミノ酸配列（Triticum aestivum（GenBankアクセッション番号（NCBI Proteinデータベース）ACB78189）、Hordeum vulgare（同アクセッション番号ABB71585）、Oryza sativa（同アクセッション番号Q05JG2）、Zea mays（同アクセッション番号ACN34951）、Sorghum bicolor（同アクセッション番号XP_002452685）、Ricinus communis（同アクセッション番号XP_002518804）、Solanum tuberosum（同アクセッション番号ABA55732）、Populus trichocarpa（同アクセッション番号XP_002328843））、Arabidopsis thaliana（同アクセッション番号NP_567581（CYP707A1）、NP_180473（CYP707A2）、NP_851136（CYP707A3）、NP_566628（CYP707A4））と比較した。その結果、「新中長」由来TaABA8'ox1Dでは、種間でよく保存されているABA8'oxのC末端の約40アミノ酸が翻訳されず、機能発現に必要な領域を欠失していることが示された（図７Ｂ）。このことから、「新中長」のTaABA8'ox1D遺伝子によってコードされるABA8'-水酸化酵素は、その活性を失っていると考えられた。   In addition, the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) of the “new middle length” TaABA8′ox1D gene is converted to other homologous genes (TaABA8′ox1A, B, D) and ABA8 ′ hydroxylase derived from plant species other than wheat ABA8'ox) amino acid sequence (Triticum aestivum (GenBank accession number (NCBI Protein database) ACB78189), Hordeum vulgare (accession number ABB71585), Oryza sativa (accession number Q05JG2), Zea mays (same accession) Number ACN34951), Sorghum bicolor (same accession number XP_002452685), Ricinus communis (same accession number XP_002518804), Solanum tuberosum (same accession number ABA55732), Populus trichocarpa (same accession number XP_002328843)), Arabidopsis thaliana (same accession) Session numbers NP_567581 (CYP707A1), NP_180473 (CYP707A2), NP_851136 (CYP707A3), NP_566628 (CYP707A4))). As a result, in TaABA8'ox1D derived from "New Medium and Long", approximately 40 amino acids at the C-terminus of ABA8'ox, which are well conserved among species, are not translated and a region necessary for functional expression is deleted. Was shown (FIG. 7B). From this, it was considered that the ABA8′-hydroxylase encoded by the “new medium-long” TaABA8′ox1D gene has lost its activity.

さらに、「新中長」以外のコムギ品種でも「新中長」と同様のTaABA8'ox1D挿入変異を有するかを調べるため、コムギ品種「タマイズミ」、「タマイズミ」変異体（γ線照射系統）、「新中長」及び「農林61号」より調製したゲノムDNAを鋳型として同様にPCRを行った。上記と同じプライマーTaABAox1d_S1及びTaABAox1.A2_AGCGをプライマーペアとして用いた。98℃で30秒での変性に続き、98℃で10秒、68℃で1分を35サイクルを行い、さらに72℃で2分の後、4℃で維持する温度条件でPCRを行った。得られたDNA断片を電気泳動した。その結果、「新中長」を系譜上にもつ「タマイズミ」及び「タマイズミ」変異体は、「新中長」と同じサイズのバンドを示し、「農林61号」と同じサイズのバンドは示さなかった（図８）。従ってこれらの品種及び系統もTaABA8'ox1D遺伝子中に挿入配列を有することが示された。   Furthermore, in order to investigate whether wheat varieties other than "New Medium-length" have the same TaABA8'ox1D insertion mutation as "New Medium-length", the wheat varieties "Tamaizumi" and "Tamaizumi" mutants (γ-irradiated lines), PCR was carried out in the same manner using genomic DNA prepared from “New Middle Length” and “Noribayashi No. 61” as a template. The same primers TaABAox1d_S1 and TaABAox1.A2_AGCG as described above were used as a primer pair. Following denaturation at 98 ° C. for 30 seconds, 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 1 minute were performed, and PCR was performed under a temperature condition of maintaining at 4 ° C. after 2 minutes at 72 ° C. The obtained DNA fragment was electrophoresed. As a result, the “Tamaizumi” and “Tamaizumi” mutants with “New Middle Length” in the genealogy show the same size band as “New Middle Length”, but do not show the same size band as “Noribayashi 61”. (FIG. 8). Therefore, it was shown that these varieties and lines also have an insertion sequence in the TaABA8'ox1D gene.

［実施例３］TaABA8'ox1D挿入変異の特異的検出
（１）TaABA8'ox1D挿入変異を特異的に検出するDNAマーカーの開発
「新中長」と同様のTaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異が他のコムギ品種にも存在するかどうかを確認するために、「新中長」のTaABA8'ox1D遺伝子中の挿入配列に特異的なプライマー（TaABAox1d_InsertA1：5'-CTACTGCCGGATGCCACACAACAC-3'；配列番号３６）を設計した。合成した遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.S2：5'-AAGCCCAACACGTTCATGCCGTTC-3'；配列番号２７）及び挿入配列特異的プライマーTaABAox1d_InsertA1：5'-CTACTGCCGGATGCCACACAACAC-3'；配列番号３６）をプライマーペアとして（図６〜８；DNAマーカー：S2d_InsertA1）、「タマイズミ」、「タマイズミ」変異体、「新中長」及び「農林61号」より調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRに用いた。このPCRは、TaABAox1.S2との組合せで挿入変異を有しないTaABA8'ox1D遺伝子を特異的に増幅可能な遺伝子特異的プライマー（TaABAox1.A2_AGCG：5'-CGTCGCCTCTATCGCGCTGTTGAT-3'；配列番号３５）を、TaABAox1.S2及びTaABAox1d_InsertA1と共にPCR反応液に共存させて、マルチプレックスPCRとして行った（S2d_InsertA1&A2_AGCGマルチプレックスPCR）。用いたPCRの温度条件は、98℃で30秒での変性に続き、98℃で10秒、70℃で45秒を35サイクル行い、さらに72℃で2分の後、4℃にて維持するものである。PCRにはPrime STAR HS DNAポリメラーゼ（TaKaRa）を使用した。[Example 3] Specific detection of TaABA8'ox1D insertion mutation (1) Development of a DNA marker that specifically detects TaABA8'ox1D insertion mutation Other insertion mutations in the TaABA8'ox1D gene are the same as "New Medium Length" In order to confirm whether it exists also in other wheat cultivars, a primer (TaABAox1d_InsertA1: 5'-CTACTGCCGGATGCCACACAACAC-3 '; SEQ ID NO: 36) specific to the insertion sequence in the TaABA8'ox1D gene of "new medium length" Designed. The synthesized gene-specific primer (TaABAox1.S2: 5′-AAGCCCAACACGTTCATGCCGTTC-3 ′; SEQ ID NO: 27) and the insertion sequence-specific primer TaABAox1d_InsertA1: 5′-CTACTGCCGGATGCCACACAACAC-3 ′; SEQ ID NO: 36) as a primer pair (FIG. 6) ˜8; DNA marker: S2d_InsertA1), “Tamaizumi”, “Tamaizumi” mutant, “New middle length” and “Noribayashi No. 61” genomic DNA prepared from PCR was used as a template. In this PCR, a gene-specific primer (TaABAox1.A2_AGCG: 5′-CGTCGCCTCTATCGCGCTGTTGAT-3 ′; SEQ ID NO: 35) capable of specifically amplifying TaABA8′ox1D gene having no insertion mutation in combination with TaABAox1.S2; The multiplex PCR was performed together with TaABAox1.S2 and TaABAox1d_InsertA1 in the PCR reaction solution (S2d_InsertA1 & A2_AGCG multiplex PCR). The temperature condition of PCR used was denaturation at 98 ° C for 30 seconds, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds and 70 ° C for 45 seconds, and further maintained at 72 ° C for 2 minutes and then at 4 ° C. Is. Prime STAR HS DNA polymerase (TaKaRa) was used for PCR.

また、TaABA8'ox1A遺伝子を特異的に増幅する遺伝子特異的プライマー（TaABAox1a_S1：5'-GACGCGCTCCTAACTCAAGGGAAAC-3'；配列番号３７）と遺伝子特異的プライマー（TaABAox1a_A1：5'-CAGAGGGCTGTGAATGATGATGCTG-3'；配列番号３８）のプライマーペアを、TaABAox1.S2及びTaABAox1d_InsertA1と共にPCR反応液に共存させて、別のマルチプレックスPCRも行った（S2d_InsertA1&a_S1a_A1マルチプレックスPCR）。このPCRは、98℃で30秒での変性に続き、98℃で10秒、70℃で45秒を35サイクル行い、さらに72℃で2分の後、4℃で維持する温度条件で行った。Ex Taq Hot Start Version（TaKaRa）をこのPCRに使用した。   Further, a gene-specific primer (TaABAox1a_S1: 5'-GACGCGCTCCTAACTCAAGGGAAAC-3 '; SEQ ID NO: 37) and a gene-specific primer (TaABAox1a_A1: 5'-CAGAGGGCTGTGAATGATGATGCTG-3'; SEQ ID NO: 38) that specifically amplifies the TaABA8'ox1A gene ) Was coexisted in the PCR reaction solution together with TaABAox1.S2 and TaABAox1d_InsertA1, and another multiplex PCR was also performed (S2d_InsertA1 & a_S1a_A1 multiplex PCR). This PCR was performed at 98 ° C for 30 seconds followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds and 70 ° C for 45 seconds, followed by 2 minutes at 72 ° C and then maintained at 4 ° C. . Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa) was used for this PCR.

得られたDNA断片を電気泳動した。その結果、S2d_InsertA1&A2_AGCGの解析では、「新中長」（図９中、S）、「タマイズミ」（T）及び「タマイズミ」変異体（M）では挿入変異を有するTaABA8'ox1Dに対応するバンドが検出されたが、「農林61号」（N）では挿入変異を有しないTaABA8'ox1Dに対応する短いバンドが検出された（図９Ａ）。一方、S2d_InsertA1&a_S1a_A1の解析では、「タマイズミ」変異体以外でTaABA8'ox1Aに対応するバンドが検出された（図９Ｂ）。さらに「新中長」、「タマイズミ」、及び「タマイズミ」変異体では挿入変異を有するTaABA8'ox1Dに対応するバンドが検出されたが、「農林61号」（N）では当該バンドは検出されなかった（図９Ｂ）。このことから、「タマイズミ」及び「タマイズミ」変異体は、「新中長」と同様の挿入変異をTaABA8'ox1D遺伝子中に有していることが示された。   The obtained DNA fragment was electrophoresed. As a result, in the analysis of S2d_InsertA1 & A2_AGCG, a band corresponding to TaABA8'ox1D having an insertion mutation was detected in the “new medium length” (S in FIG. 9), the “Tamaizumi” (T), and the “Tamaizumi” mutant (M). However, “Noryo 61” (N) detected a short band corresponding to TaABA8′ox1D having no insertion mutation (FIG. 9A). On the other hand, in the analysis of S2d_InsertA1 & a_S1a_A1, a band corresponding to TaABA8′ox1A was detected except for the “Taizemi” mutant (FIG. 9B). In addition, a band corresponding to TaABA8'ox1D having an insertion mutation was detected in the “New Medium-length”, “Tamaizumi”, and “Tamaizumi” mutants, but no such band was detected in “Noribayashi No. 61” (N) (FIG. 9B). From this, it was shown that the “Tamaizumi” and “Tamaizumi” mutants have the same insertion mutation in the TaABA8′ox1D gene as “New Medium Length”.

（２）TaABA8'ox1D挿入変異保有コムギ品種又は系統の検出
国内のコムギ品種及び系統には、系譜上に「新中長」を有する品種・系統が多数存在するため、上記と同様のTaABA8'ox1D挿入変異を有している可能性がある。そこで、実施例３−（１）で開発した、TaABA8'ox1D挿入変異を特異的に検出するためのS2d_InsertA1のDNAマーカーを用いて、様々なコムギ品種及び系統におけるTaABA8'ox1D挿入変異を検出した。(2) Detection of TaABA8'ox1D insertion mutation-bearing wheat varieties or lines Domestic wheat varieties and lines have many varieties and lines that have "new medium length" on their lineage, so TaABA8'ox1D is the same as above. It may have an insertion mutation. Thus, TaABA8′ox1D insertion mutations in various wheat cultivars and strains were detected using the S2d_InsertA1 DNA marker specifically developed for detecting TaABA8′ox1D insertion mutations developed in Example 3- (1).

実施例３−（１）と同様にして、S2d_InsertA1&a_S1a_A1のマルチプレックスPCRを行い、得られたPCR産物をアクリルアミドゲルで電気泳動した。   In the same manner as in Example 3- (1), multiplex PCR of S2d_InsertA1 & a_S1a_A1 was performed, and the obtained PCR product was electrophoresed on an acrylamide gel.

その結果、S2d_InsertA1のDNAマーカーを用いて、TaABA8'ox1D遺伝子中に上記の挿入配列を有する品種及び系統を明確に判別することができた（図１０及び１１）。日本で品種登録済みのコムギ品種では農林11号、農林26号、農林30号、農林43号、農林49号、農林50号、農林53号、農林60号、農林68号、農林69号、ユウヤケコムギ、イヨコムギ、ダンチコムギ、シラサギコムギ、ジュンレイコムギ、フジミコムギ、セトコムギ、アサカゼコムギ、アブクマワセ、しゅんよう、ニシノカオリ、キヌヒメ、及びタマイズミにおいて、TaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異が検出された（図１０）。また、コムギ遺伝資源品種及び系統では、超極早生、極早生4-15、早小麦、新中長、Olgrumil、Victria INTA、中国53号、中国81号、中国91号、中国114号、北海195号、関系w361、関系w364、関東66号、関東87号、関東95号、西海77号、西海95号、さぬきの夢2000、秋播き型アブクマワセにおいてTaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異が検出された（図１１）。   As a result, using the S2d_InsertA1 DNA marker, it was possible to clearly discriminate varieties and lines having the above insertion sequence in the TaABA8′ox1D gene (FIGS. 10 and 11). The wheat varieties registered in Japan are No. 11, No. 26, No. 30, No. 43, No. 49, No. 49, No. 50, No. 53, No. 60, No. 68, No. 68, No. 69, Yuyake Wheat Insertion mutations in the TaABA8'ox1D gene were detected in potato, yellow wheat, dung wheat, white eagles, june lei wheat, Fujimi wheat, seto wheat, Asakaze wheat, Abukumawase, tumor, Nishino Kaori, Kinuhime and Tamamizu (Fig. 10). In wheat genetic resource varieties and lines, ultra-early early, very early 4-15, early wheat, new medium length, Olgrumil, Victria INTA, China 53, China 81, China 91, China 114, North Sea 195 , Kansai w361, Kansai w364, Kanto 66, Kanto 87, Kanto 95, Saikai 77, Saikai 95, Sanuki no Yume 2000, autumn sowing type Abkumawase detected the insertion mutation in the TaABA8'ox1D gene (FIG. 11).

なお、S2A2mixのDNAマーカーでTaABA8'ox1Dの増幅が示された品種又は系統（図５参照）の中にも、TaABA8'ox1D挿入変異を有する系統が存在した。これらのうち、「中国81号」、「北海195号」及び「関東95号」は育成系統であることから、交配後の遺伝的固定がまだ十分でなく、TaABA8'ox1D挿入変異をヘテロに有していると考えられる。   In addition, among the cultivars or lines (see FIG. 5) in which TaABA8′ox1D amplification was shown by the S2A2mix DNA marker, there was a line having the TaABA8′ox1D insertion mutation. Of these, China 81, North Sea 195, and Kanto 95 are breeding lines, so genetic fixation after mating is still insufficient and TaABA8'ox1D insertion mutation is heterogeneous. it seems to do.

以上の結果は、上記で開発されたDNAマーカーS2d_InsertA1は、TaABA8'ox1D挿入変異をホモに有する品種及び系統だけでなくヘテロに有する個体の検出にも有効であることを示していた。   The above results showed that the DNA marker S2d_InsertA1 developed above is effective not only for detecting varieties and lines having the TaABA8′ox1D insertion mutation homozygously but also heterozygous individuals.

［実施例４］TaABA8'ox1欠失変異体の作製
（１）変異原処理系統におけるTaABA8'ox1遺伝子変異体の検出
実施例１−（３）で開発したDNAマーカーを用いて、TaABA8'ox1同祖遺伝子（TaABA8'ox1A、TaABA8'ox1B、及びTaABA8'ox1D）のいずれかに変異が生じた変異コムギ個体（部分変異個体）の検出を行った。[Example 4] Preparation of TaABA8'ox1 deletion mutant (1) Detection of TaABA8'ox1 gene mutant in a mutagen-treated line Using the DNA marker developed in Example 1- (3), TaABA8'ox1 Mutant wheat individuals (partial mutant individuals) in which any of the ancestral genes (TaABA8'ox1A, TaABA8'ox1B, and TaABA8'ox1D) was mutated were detected.

まず、コムギ品種「バンドウワセ」由来の重イオンビーム処理系統（989系統）のM2世代から、25個体のTaABA8'ox1ヘテロ変異体候補を見出だした。そこで、M3世代での変異型TaABA8'ox1の遺伝的分離を期待して、ヘテロ変異体候補25個体（M2個体）から自家受粉種子（M3個体）を採種した。この25個体のうちの15個体について、各M2個体あたり1穂〜3穂の種子を播種（1穂あたり12粒）し、苗立ちの確認された幼植物体からゲノムDNAを抽出し調製した後、DNAマーカーを用いて各M3個体の遺伝子型を調べた。DNAマーカーとしては実施例１−（３）に示したS1A8/AluI、S7A3/AluI、及びS2A2mixを用い、実施例１−（４）と同様の方法でPCRを行った。   First, 25 TaABA8'ox1 heterozygous mutant candidates were found from the M2 generation of heavy ion beam processing lines (989 lines) derived from wheat variety "Bandowase". Therefore, in anticipation of genetic isolation of the mutant TaABA8'ox1 in the M3 generation, self-pollinated seeds (M3 individuals) were seeded from 25 heterozygous mutant candidates (M2 individuals). About 15 of these 25 individuals, after seeding 1 to 3 seeds per 12 M2 individuals (12 seeds per ear), and extracting and preparing genomic DNA from seedlings that were confirmed to be seedlings The genotype of each M3 individual was examined using a DNA marker. PCR was performed in the same manner as in Example 1- (4) using S1A8 / AluI, S7A3 / AluI, and S2A2mix shown in Example 1- (3) as DNA markers.

その結果、複数の個体で、TaABA8'ox1A,B,Dのいずれかの同祖遺伝子に対応するバンドが検出されず、当該遺伝子の欠失変異をホモ接合で有することが示された。図１２に示す解析例では、D433系統、D476系統及びD310系統由来のM3個体から、TaABA8'ox1Aホモ変異体（D433-2、D433-3）、TaABA8'ox1Bホモ変異体（D476-1）、TaABA8'ox1Dホモ変異体（D310-1、D310-2）が見出された（図１２）。これらのホモ変異体では、S1A8/AluI、S7A3/AluI、及びS2A2mixの３種全てのDNAマーカーで同じTaABA8'ox1同祖遺伝子に対応するバンドが検出されなかったことから、当該同祖遺伝子の全体又はほぼ全体が欠失していると考えられた。   As a result, a band corresponding to any of the homologous genes of TaABA8′ox1A, B, and D was not detected in a plurality of individuals, indicating that the gene has a deletion mutation homozygous. In the analysis example shown in FIG. 12, from the M3 individuals derived from the D433, D476, and D310 strains, TaABA8'ox1A homo mutant (D433-2, D433-3), TaABA8'ox1B homo mutant (D476-1), TaABA8'ox1D homozygous mutants (D310-1, D310-2) were found (FIG. 12). In these homozygous mutants, no band corresponding to the same TaABA8'ox1 homologous gene was detected in all three DNA markers of S1A8 / AluI, S7A3 / AluI, and S2A2mix. Or almost all of them were considered deleted.

このように、実施例１で開発したDNAマーカーを用いて、TaABA8'ox1遺伝子欠失変異体を検出できることが示された。   Thus, it was shown that the TaABA8′ox1 gene deletion mutant can be detected using the DNA marker developed in Example 1.

（２）TaABA8'ox1同祖遺伝子変異の集積
本発明者らは、TaABA8'ox1同祖遺伝子群の遺伝子変異を集積し、TaABA8'ox1活性を低下又は喪失させたコムギを作出することにより、吸水後の種子内部でのABA8'ox活性を低下させて種子発芽を抑制することができるであろうと考えた。(2) Accumulation of TaABA8'ox1 homologous gene mutations The inventors of the present invention have accumulated water mutations by accumulating gene mutations of TaABA8'ox1 homologous gene group and reducing or eliminating TaABA8'ox1 activity. It was thought that seed germination could be suppressed by reducing the ABA8'ox activity inside the seed later.

そこで、TaABA8'ox1D遺伝子中に挿入変異を有することが示された品種「タマイズミ」に変異原処理を行い、TaABA8'ox1A又はTaABA8'ox1Bに欠失変異が起きた個体の検出を行った。具体的には、まず「タマイズミ」種子に、変異原処理としてγ線照射又はアジ化ナトリウム処理を行った後、圃場に播種して生育させた。γ線照射は、乾燥種子に対してγ線を10Gy/hで20時間照射することにより行った。アジ化ナトリウム処理は、吸水種子（20℃、48時間）を4mMアジ化ナトリウム溶液に２時間浸漬することにより行った。   Therefore, mutagen treatment was performed on a variety “Tamaizumi” that was shown to have an insertion mutation in the TaABA8′ox1D gene, and individuals with deletion mutations in TaABA8′ox1A or TaABA8′ox1B were detected. Specifically, first, “Tamizumi” seeds were subjected to γ-ray irradiation or sodium azide treatment as a mutagen treatment, and then seeded and grown in a field. γ-ray irradiation was performed by irradiating dried seeds with γ-rays at 10 Gy / h for 20 hours. The sodium azide treatment was performed by immersing the water-absorbing seed (20 ° C., 48 hours) in a 4 mM sodium azide solution for 2 hours.

得られた植物体から自家受粉種子を採種し、その種子（M2世代）を圃場に播種した。γ線照射系統のM2世代（2074系統）、及びアジ化ナトリウム処理系統のM2世代（545系統）のそれぞれの植物体の葉からゲノムDNAを調製し、実施例１−（３）で開発したDNAマーカー（S1A8/AluI、S7A3/AluI、及びS2A2mix）を用いてTaABA8'ox1同祖遺伝子における遺伝子欠失変異の有無を検出した。その結果、γ線照射系統から、TaABA8'ox1Aに対応するバンドが増幅されない個体（TaABA8'ox1A/TaABA8'ox1D変異体：以下、184G4とする）を1個体見いだした（図１３）。S2A2mixではTaABA8'ox1D増幅断片のバンドは検出されなかった（図１３Ｃ）が、S1A8/AluI及びS7A3/AluIによるTaABA8'ox1Dのバンドは検出された（図１３Ａ、Ｂ）ことから、184G4が「タマイズミ」が有するTaABA8'ox1D遺伝子中の挿入変異を保持していることが確認された。   Self-pollinated seeds were collected from the obtained plant bodies, and the seeds (M2 generation) were sown in the field. Genomic DNA was prepared from the leaves of plants of the M2 generation (2074 line) of the γ-irradiated line and the M2 generation (545 line) of the sodium azide-treated line, and was developed in Example 1- (3). The presence or absence of a gene deletion mutation in the TaABA8'ox1 homologous gene was detected using markers (S1A8 / AluI, S7A3 / AluI, and S2A2mix). As a result, one individual (TaABA8′ox1A / TaABA8′ox1D mutant: hereinafter referred to as 184G4) in which the band corresponding to TaABA8′ox1A was not amplified was found from the γ-irradiated line (FIG. 13). The band of TaABA8'ox1D amplified fragment was not detected in S2A2mix (FIG. 13C), but the band of TaABA8'ox1D by S1A8 / AluI and S7A3 / AluI was detected (FIGS. 13A and 13B). It was confirmed that the insertion mutation in the TaABA8'ox1D gene possessed by

さらに184G4について、TaABA8'ox1A中の遺伝子変異がどの領域で起きているかを調べるため、実施例１−（３）で開発したDNAマーカー（S7A3/AluI、S7A7/AluI、S7A8/MseI、S6A8/MseI、S8A8/MseI、S1A8/AluI、S1A10/AluI+MboI、S1A11/AluI+MboI、S1A12/AluI+MboI、S1A1/AluI+MboI、S2A2mix、S7A9/KpnI）を使用して、実施例１−（３）と同様の方法で解析した。その結果を図１４〜１６に示す。いずれのDNAマーカーによる解析でも、TaABA8'ox1Aに由来するバンドが認められなかったことから、184G4ではTaABA8'ox1Aの座乗する領域が広く欠失していると考えられた。この個体184G4から自家受粉種子（M3世代）を採種し、その遺伝子型を各M3個体について調べたところ、同様のTaABA8'ox1A/TaABA8'ox1D遺伝子変異が確認された。   Furthermore, for 184G4, the DNA markers (S7A3 / AluI, S7A7 / AluI, S7A8 / MseI, S6A8 / MseI) developed in Example 1- (3) were examined in order to investigate in which region the gene mutation in TaABA8'ox1A occurred. , S8A8 / MseI, S1A8 / AluI, S1A10 / AluI + MboI, S1A11 / AluI + MboI, S1A12 / AluI + MboI, S1A1 / AluI + MboI, S2A2mix, S7A9 / KpnI) ) And the same method. The results are shown in FIGS. In any DNA marker analysis, no band derived from TaABA8'ox1A was observed, suggesting that the region where TaABA8'ox1A sits was widely deleted in 184G4. Self-pollinated seeds (M3 generation) were collected from this individual 184G4, and the genotype was examined for each M3 individual. As a result, the same TaABA8'ox1A / TaABA8'ox1D gene mutation was confirmed.

184G4では、TaABA8'ox1Aが欠失し、またTaABA8'ox1Dが挿入変異により機能喪失していることが示された。このことから、184G4ではTaABA8'ox1同祖遺伝子のうち活性を有しているのはTaABA8'ox1Bのみであるため、発芽時のABA8'ox1活性が親品種「タマイズミ」よりも低下していると考えられた。   In 184G4, it was shown that TaABA8'ox1A was deleted and that TaABA8'ox1D lost its function due to insertion mutation. From this, in 184G4, only TaABA8'ox1B has activity among TaABA8'ox1 homologous genes, so ABA8'ox1 activity at germination is lower than the parental variety `` Tamaizumi '' it was thought.

（３）TaABA8'ox1部分遺伝子変異の集積による発芽抑制効果の判定
実施例４−（２）で得たTaABA8'ox1同祖遺伝子変異体184G4（M4世代）と親品種「タマイズミ」を温室で栽培し、1穂ずつ開花日を穂にラベルした。種子（M5世代）が十分に成熟した開花後49日目、及び開花後70日目に、種子を採種し、20℃暗所で発芽試験を行った。(3) Judgment of germination suppression effect by accumulation of TaABA8'ox1 partial gene mutations Growing TaABA8'ox1 homologous gene mutant 184G4 (M4 generation) obtained in Example 4- (2) and parent cultivar "Tamaizumi" in a greenhouse The flowering date was labeled on the ears. Seeds were seeded on the 49th day after flowering when the seeds (M5 generation) were fully matured and on the 70th day after flowering, and a germination test was conducted in the dark at 20 ° C.

発芽試験は、No.2濾紙を2枚入れた直径9cmのシャーレに蒸留水を6mL添加し、種子を15粒ずつ並べて吸水させることにより行った。また、発芽試験は3連で（in triplicate）行った。吸水開始後は、24時間毎に発芽粒数を調べ、発芽した種子は取り除いた。種子総数（15粒）に対する発芽した種子の累積数の割合を、発芽率（％）として算出した。その結果、184G4の種子発芽は、開花後49日目の種子、及び開花後70日目の種子はいずれも、親品種「タマイズミ」と比較して明らかに抑制されていた（図１７）。このことから、TaABA8'ox1の同祖遺伝子における変異を集積することにより、種子休眠性を強めることができることが示された。   The germination test was performed by adding 6 mL of distilled water to a petri dish with a diameter of 9 cm containing two No. 2 filter papers, and arranging 15 seeds to absorb water. The germination test was performed in triplicate. After the start of water absorption, the number of germinated grains was examined every 24 hours, and the germinated seeds were removed. The ratio of the cumulative number of germinated seeds to the total number of seeds (15) was calculated as the germination rate (%). As a result, seed germination of 184G4 was clearly suppressed in both the seeds on the 49th day after flowering and the seeds on the 70th day after flowering as compared with the parent cultivar “Tamaizumi” (FIG. 17). This indicates that seed dormancy can be enhanced by accumulating mutations in the homologous gene of TaABA8'ox1.

「タマイズミ」は、醤油や中華めん製造用に適した硬質で高蛋白の白粒品種である。一般に、赤粒品種に比較して、白粒品種の種子休眠性は弱いため、穂発芽が発生しやすく、穂発芽耐性の強化が望まれている。従って種子休眠性が強化された「タマイズミ」変異体は産業上非常に有用と考えられる。   “Tamaizumi” is a hard, high protein white grain variety suitable for soy sauce and Chinese noodle production. In general, since the seed dormancy of white cultivars is weaker than that of red cultivars, ear germination is likely to occur, and enhancement of ear germination resistance is desired. Therefore, the “Tamizumi” mutant with enhanced seed dormancy is considered to be very useful industrially.

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書にとり入れるものとする。   All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

本発明によれば、植物試料中のコムギの発芽時に発現しているABA8'ox遺伝子（TaABA8'ox1遺伝子）について、日本国内の品種・系統に数多く含まれているTaABA8'ox1D挿入変異を特異的かつ効率的に判別することができる。さらに、本発明に係る方法により、TaABA8'ox1の各同祖遺伝子に起きた変異の有無を特異的かつ効率的に判定し、それにより、簡便かつ確実に、TaABA8'ox1遺伝子の部分変異体（A、B、Dゲノムそれぞれの変異体、又は、そのABゲノム、ADゲノム、BDゲノムの組合せの変異体）又は完全変異体（ABDゲノム全ての変異体）を識別することにより、種子休眠性が強化されたコムギの育種を効率よく実施することができる。   According to the present invention, the ABA8'ox gene (TaABA8'ox1 gene) that is expressed at the time of germination of wheat in a plant sample is specific for the TaABA8'ox1D insertion mutation contained in many varieties and strains in Japan. And can be determined efficiently. Furthermore, by the method according to the present invention, the presence or absence of a mutation occurring in each homologous gene of TaABA8'ox1 is specifically and efficiently determined, whereby a partial mutant of TaABA8'ox1 gene ( By discriminating the mutants of A, B, and D genomes, or the combination of AB, AD, and BD genomes) or complete mutants (mutants of all ABD genomes), seed dormancy is improved. It is possible to efficiently carry out enhanced wheat breeding.

本発明に係る方法によれば、幼植物体等を含む任意のコムギ植物試料について、TaABA8'ox1遺伝子変異を含有するか否かを判定することができる。すなわち本発明に係る方法は、育種現場におけるTaABA8'ox1遺伝子変異の導入に伴う従来の労力を大幅に軽減できる点で特に有用である。   According to the method of the present invention, it is possible to determine whether or not any wheat plant sample including a young plant body contains a TaABA8′ox1 gene mutation. That is, the method according to the present invention is particularly useful in that the conventional labor associated with the introduction of TaABA8'ox1 gene mutation at the breeding site can be greatly reduced.

配列番号１：TaABA8'ox1A (cDNA)
配列番号３：TaABA8'ox1B (cDNA)
配列番号５：TaABA8'ox1D (cDNA)
配列番号７：TaABA8'ox1A (ゲノム)
配列番号８：TaABA8'ox1B (ゲノム)
配列番号９：TaABA8'ox1D (ゲノム)
配列番号１０：TaABA8'ox1D insertion (ゲノム)
配列番号１１：TaABA8'ox1D 挿入配列
配列番号１３〜３８：プライマーSequence number 1: TaABA8'ox1A (cDNA)
Sequence number 3: TaABA8'ox1B (cDNA)
Sequence number 5: TaABA8'ox1D (cDNA)
SEQ ID NO: 7: TaABA8'ox1A (genome)
Sequence number 8: TaABA8'ox1B (genome)
SEQ ID NO: 9: TaABA8'ox1D (genome)
SEQ ID NO: 10: TaABA8'ox1D insertion (genome)
Sequence number 11: Insertion sequence of TaABA8'ox1D Sequence number 13-38: Primer

Claims (12)

被験コムギ由来のゲノムDNAについて、配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子中の挿入変異を検出することを含む、被験コムギのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異を検出する方法。   By performing nucleic acid amplification on the genomic DNA derived from the test wheat using one or more oligonucleotide primers containing at least 15 bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence, wheat D A method for detecting a function-deficient mutation in the abscisic acid 8′-hydroxylase gene in a test wheat, comprising detecting an insertion mutation in the genomic abscisic acid 8′-hydroxylase gene. (i)配列番号１０で示される塩基配列の1809位から上流の少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は配列番号１０で示される塩基配列の2776位から下流の少なくとも15塩基の塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、(ii)配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを含むプライマーペアを用いて、核酸増幅を行う、請求項１に記載の方法。   (i) an oligonucleotide primer comprising a base sequence of at least 15 bases upstream from position 1809 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a base sequence of at least 15 bases downstream from position 2776 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 Nucleic acid amplification using a primer pair comprising an oligonucleotide primer comprising a complementary sequence of (ii) and (ii) an oligonucleotide primer comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence of at least 15 consecutive bases thereof The method of claim 1, wherein: 配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号３６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１又は２に記載の方法。   The one or more oligonucleotide primers comprising a base sequence of at least 15 bases contiguous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence comprise an oligonucleotide primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 The method according to 1 or 2. 配列番号１０で示される塩基配列の1809位から上流の少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号２７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項２又は３に記載の方法。   The oligonucleotide primer containing a base sequence of at least 15 bases upstream from position 1809 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 10 is an oligonucleotide primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 27 the method of. 前記核酸増幅を、前記オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３５で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は配列番号３７及び３８で示される塩基配列をそれぞれ含む２つのオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーペアとを反応液中で共存させて用いたマルチプレックスPCRにより行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。   The nucleic acid amplification is carried out by using the oligonucleotide primer and an oligonucleotide primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, or a primer pair comprising two oligonucleotide primers each comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 37 and 38. The method according to any one of claims 1 to 4, which is carried out by multiplex PCR used in the reaction solution. a) 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を用いて、機能欠損変異型アブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子を有するコムギを選択し、
b) 工程a)で得たコムギを育種親として用いて育種し、
c) 工程b)で取得される子孫コムギ由来のゲノムDNAについて、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出する
ことを含む、種子休眠性が強化されたコムギの育種方法。a) Using the method according to any one of claims 1 to 5, a wheat having a function-deficient mutant abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene is selected,
b) Breeding using the wheat obtained in step a) as a breeding parent,
c) Enhanced seed dormancy, including detecting mutations in the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene in the wheat A, B and D genomes of the genomic DNA derived from the progeny wheat obtained in step b) How to breed wheat. 子孫コムギ由来のゲノムDNAを、配列番号１６及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア、又は配列番号２１及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いて核酸増幅し、得られた増幅産物を制限酵素AluIで消化することにより、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出する、請求項６に記載の方法。   Genomic DNA derived from progeny wheat contains a primer pair comprising oligonucleotide primers consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 32, or an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 26 7. Mutation of the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene in the wheat A, B and D genomes is detected by performing nucleic acid amplification using a primer pair and digesting the obtained amplification product with the restriction enzyme AluI. The method described in 1. 子孫コムギ由来のゲノムDNAを、配列番号１５及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアを用いて核酸増幅することにより、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の変異を検出する、請求項６又は７に記載の方法。   Abscisic acid 8 ′ of the wheat A, B, and D genomes by nucleic acid amplification of progeny wheat-derived genomic DNA using a primer pair containing oligonucleotide primers each consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 15 and 27 The method according to claim 6 or 7, wherein a mutation in the coordinate hydroxylase gene is detected. 配列番号１１で示される塩基配列又はその相補配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列を含む、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異検出用のオリゴヌクレオチドプライマー。   An oligonucleotide primer for detecting a function-deficient mutation in the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene of the wheat D genome, which comprises a base sequence of at least 15 bases continuous with the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or its complementary sequence. 配列番号２７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを含む、コムギDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子の機能欠損変異検出用のプライマーペア。   Detection of a function-deficient mutation in the abscisic acid 8′-hydroxylase gene of wheat D genome comprising an oligonucleotide primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 36 Primer pair for. 以下の(a)〜(c)のいずれかである、コムギA、B及びDゲノムのアブシジン酸8'位水酸化酵素遺伝子検出用のプライマーペア。
(a) 配列番号１６及び３２で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア、
(b) 配列番号２１及び２６で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペア
(c) 配列番号１５及び２７で示される塩基配列のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーペアA primer pair for detecting the abscisic acid 8 ′ hydroxylase gene in the wheat A, B and D genomes, which is any of the following (a) to (c):
(a) a primer pair including an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 32,
(b) a primer pair comprising an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 26
(c) a primer pair comprising an oligonucleotide primer consisting of each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15 and 27 請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプライマー又は請求項１０に記載のプライマーペアと、請求項１１に記載のプライマーペアとを含む、コムギ種子休眠性強化育種用のキット。   A wheat seed dormancy-enhanced breeding kit comprising the oligonucleotide primer according to claim 9 or the primer pair according to claim 10 and the primer pair according to claim 11.
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