JP5416355B2 - Method for culturing sulfate-reducing bacteria - Google Patents
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Description
本発明は硫酸還元細菌の培養方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、硫酸還元細菌の培養の高効率化や硫酸還元細菌の集積培養に好適な培養方法と、この方法を利用した重金属含有排水の処理方法に関する。 The present invention relates to a method for culturing sulfate-reducing bacteria. More specifically, the present invention relates to a culture method suitable for increasing the efficiency of culture of sulfate-reducing bacteria and enrichment culture of sulfate-reducing bacteria, and a method for treating heavy metal-containing wastewater using this method.
現在様々な分野で利用されている微生物は自然界に存在する全微生物の１％に満たないと言われている。そこで、残り９９％の膨大な微生物資源を有効利用するため、新しい概念に基づく微生物の培養技術が多数開発されている。 It is said that less than 1% of all microorganisms present in nature are currently used in various fields. Therefore, in order to effectively use the remaining 99% of the huge microbial resources, many culturing techniques for microorganisms based on a new concept have been developed.
例えば、特許文献１には、環境汚染物質である六価クロムを無害な三価クロムに還元する能力を有するクロム還元菌を集積培養する技術が開示されている。具体的には、六価クロムを溶解させてクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって増殖し難い環境とした培養液中で、六価クロムに対して還元活性を有するShewanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacter等のクロム還元菌を選択的に集積培養し、その際に、培養液中に流した電気により、クロム還元菌によって還元されて生成された三価クロムを酸化して六価クロムに再生しながら培養を行うようにしたものである。 For example, Patent Document 1 discloses a technique for accumulating and cultivating chromium-reducing bacteria having the ability to reduce hexavalent chromium, which is an environmental pollutant, to harmless trivalent chromium. Specifically, in a culture solution in which hexavalent chromium is dissolved to make it difficult for various microorganisms other than chromium-reducing bacteria to grow, Shewanella, Pseudomonas, Sulfate reducing bacteria, which have a reducing activity against hexavalent chromium, Chromium-reducing bacteria such as Arthrobacter, Bacillus, Aerococcus, Micrococcus, Aeromonas, Thermoanaerobacter, Cellulomonas, Geobacter, Streptomyces, Escherichia, Enterobacter, etc. are selectively accumulated and cultured. The trivalent chromium produced by reduction by oxidation is oxidized and regenerated to hexavalent chromium, and then cultured.
ここで、クロム還元菌以外にも、環境汚染物質を処理する能力を有する微生物が多数知られている。例えば、硫酸還元細菌は硫酸イオンを電子受容体として、硫酸呼吸により硫化水素を産生する微生物として知られている。硫化水素は水溶性であり、且つ、重金属を不溶化させることができる。したがって、排水（廃水）中に含まれる重金属を水に溶けにくい状態あるいは水に溶けない状態、つまり、重金属の硫化物沈殿を生成したり、重金属を元素状態に還元することにより、重金属を排水と固液分離することが可能な状態とすることができる。そこで、硫化水素により重金属を不溶化して排水から固液分離するために、硫酸還元細菌を利用することができる。また、硫酸還元細菌の中には、硫酸還元と相補的にベンゼンやトルエンなどの芳香族化合物を分解処理する能力を有しているものも存在する。このように、硫酸還元細菌は、様々な環境汚染物質を処理することのできる有用な微生物である。 Here, in addition to chromium-reducing bacteria, many microorganisms having the ability to treat environmental pollutants are known. For example, sulfate-reducing bacteria are known as microorganisms that produce hydrogen sulfide by sulfate respiration using sulfate ions as electron acceptors. Hydrogen sulfide is water-soluble and can insolubilize heavy metals. Therefore, heavy metals contained in wastewater (wastewater) are not soluble in water or insoluble in water, that is, heavy metals are treated as wastewater by generating heavy metal sulfide precipitates or reducing heavy metals to elemental state. It can be in a state in which solid-liquid separation is possible. Therefore, sulfate-reducing bacteria can be used to insolubilize heavy metals with hydrogen sulfide and separate them from waste water. Some sulfate-reducing bacteria have the ability to decompose aromatic compounds such as benzene and toluene in a complementary manner to sulfate reduction. Thus, sulfate-reducing bacteria are useful microorganisms that can treat various environmental pollutants.
しかしながら、硫酸還元細菌の増殖速度は一般的な微生物と比較して低いことから、培養を効率的に行えないという問題があった。また、一般的な微生物と比較して増殖速度が低いことに起因して、雑多な微生物群が競合している環境下で優先的に増殖させることが非常に困難であり、集積培養が難しいという問題もあった。このことから、様々な有用な機能を有する硫酸還元細菌の有効活用が図れないという問題があった。 However, since the growth rate of sulfate-reducing bacteria is lower than that of general microorganisms, there is a problem that the culture cannot be performed efficiently. In addition, due to the low growth rate compared to general microorganisms, it is very difficult to preferentially grow in an environment where various microbial groups are competing, and it is difficult to enrich culture. There was also a problem. For this reason, there has been a problem that the sulfate-reducing bacteria having various useful functions cannot be effectively used.
そこで、本発明は、硫酸還元細菌の増殖を促進することのできる培養方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a culture method that can promote the growth of sulfate-reducing bacteria.
また、本発明は、雑多な微生物群が競合している環境下においても、硫酸還元細菌を優先的に増殖させることができる培養方法を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a culture method capable of preferentially proliferating sulfate-reducing bacteria even in an environment where various microbial groups compete.
さらに、本発明は、重金属含有排水を効率よく処理する方法を提供することを目的とする。 Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for efficiently treating heavy metal-containing wastewater.
かかる課題を解決するため、本願発明者等が鋭意研究を行ったところ、硫酸還元細菌を培養する際の培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御することで、硫酸還元細菌の増殖を促進できることを見出した。また、雑多な微生物群から硫酸還元細菌を優先的に増殖できることも見出した。これらの知見に基づき本発明に至った。 In order to solve this problem, the inventors of the present application have conducted extensive research. As a result, the oxidation-reduction potential X (V) of the culture solution for culturing sulfate-reducing bacteria with respect to the silver / silver chloride electrode is X ≦ −0.6. It has been found that the growth of sulfate-reducing bacteria can be promoted by controlling the concentration of sulfoxide. It was also found that sulfate-reducing bacteria can be preferentially grown from various microbial groups. Based on these findings, the present invention has been achieved.
かかる知見に基づく請求項１記載の硫酸還元細菌の培養方法は、硫酸還元細菌と硫酸イオンとを含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で硫酸還元細菌を培養するようにしている。 The method for culturing sulfate-reducing bacteria according to claim 1 based on such knowledge is obtained by immersing an electrode in a culture solution containing sulfate-reducing bacteria and sulfate ions, and applying a potential to the electrode to produce a silver / silver chloride electrode of the culture solution. The sulfate-reducing bacteria are cultured under anaerobic conditions while controlling the oxidation-reduction potential X (V) with respect to X.
このように、培養液自体の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御することで、硫酸還元細菌の増殖を促進することができる。また、硫酸還元細菌以外の微生物が培養液に含まれている場合であっても、硫酸還元細菌を優先的に増殖させることができる。 Thus, the growth of sulfate-reducing bacteria can be promoted by controlling the redox potential X (V) of the culture solution itself to the silver / silver chloride electrode to be X ≦ −0.6 . Moreover, even when microorganisms other than sulfate-reducing bacteria are contained in the culture solution, the sulfate-reducing bacteria can be preferentially grown.
ここで、銀・塩化銀電極は標準水素電極に対して＋０．２２Ｖの値を示す。そして、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位に０．２２Ｖを加えることにより、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位を標準水素電極に対する酸化還元電位に換算することができる。したがって、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位から、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位を換算することができる。例えば、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位をＸ（Ｖ）、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位をＡ（Ｖ）とし、銀・塩化銀電極以外の電極の標準水素電極に対する電位をＢ（Ｖ）とすると、以下の式により、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位Ａを換算することができる
[数式１] Ａ＝Ｘ＋０．２２−Ｂ
Here, the silver / silver chloride electrode shows a value of +0.22 V with respect to the standard hydrogen electrode. Then, by adding 0.22 V to the redox potential for the silver / silver chloride electrode, the redox potential for the silver / silver chloride electrode can be converted into the redox potential for the standard hydrogen electrode. Therefore, the redox potential for electrodes other than the silver / silver chloride electrode can be converted from the redox potential for the silver / silver chloride electrode. For example, the redox potential for a silver / silver chloride electrode is X (V), the redox potential for an electrode other than the silver / silver chloride electrode is A (V), and the potential of the electrode other than the silver / silver chloride electrode with respect to the standard hydrogen electrode Is B (V), the oxidation-reduction potential A for an electrode other than the silver / silver chloride electrode can be converted by the following formula.
[Formula 1] A = X + 0.22-B
つまり、数式１により得られるＡは、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位と同義であり、このようにして換算することに得られる酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。 That is, A obtained by Equation 1 is synonymous with the redox potential with respect to the silver / silver chloride electrode, and the range of the redox potential obtained by conversion in this way is also included in the present invention.
例えば、銀・塩化銀電極以外の電極として飽和カロメル電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．２４Ｖであり、酸化還元電位Ａ（Ｖ）の範囲はＡ≦−０．６２と換算することができる。 For example, when a saturated calomel electrode is used as an electrode other than the silver / silver chloride electrode, the potential B of the electrode with respect to the standard hydrogen electrode is +0.24 V, and the range of the oxidation-reduction potential A (V) is A ≦ −. it can be converted to 0.6 2.
また、銀・塩化銀電極以外の電極として 水銀・硫酸水銀（Ｉ）電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．６６Ｖであり、酸化還元電位Ａ（Ｖ）の範囲はＡ≦−１．０４と換算することができる。 The case where a mercury / mercury sulfate (I) electrode is used as an electrode other than the silver / silver chloride electrode will be described. The potential B of the electrode with respect to the standard hydrogen electrode is +0.66 V , and the oxidation-reduction potential A (V) range can be converted with a ≦ -1.0 4.
請求項２記載の硫酸還元細菌の培養方法は、請求項１記載の硫酸還元細菌の培養方法において、培養液の酸化還元電位の制御を、電極に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質を培養液に含ませて、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行うようにしている。 The method for culturing sulfate-reducing bacteria according to claim 2 is the method for culturing sulfate-reducing bacteria according to claim 1, wherein the oxidation-reduction potential of the culture solution is controlled by an oxidation-reduction reaction caused by the potential applied to the electrode. The substance is contained in the culture solution, and the concentration ratio of the oxidized form and reduced form of the redox substance is controlled by the potential applied to the electrode.
このように、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することで、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができる。 As described above, the oxidation-reduction potential of the culture solution itself can be controlled to a constant value by controlling the concentration ratio between the oxidized form and reduced form of the redox substance by the potential applied to the electrode.
請求項３記載の排水処理方法は、硫酸還元細菌と硫酸イオンとを含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で硫酸還元細菌を培養する際に発生する硫化水素を、重金属含有排水と接触させるようにしている。 In the waste water treatment method according to claim 3, an electrode is immersed in a culture solution containing sulfate-reducing bacteria and sulfate ions, and a potential is applied to the electrode to cause a redox potential X (V ) Is controlled to X ≦ −0.6, and hydrogen sulfide generated when culturing sulfate-reducing bacteria under anaerobic conditions is brought into contact with wastewater containing heavy metal.
硫化水素は水溶性であり、且つ、重金属を不溶化させることができる。したがって、硫酸還元細菌を培養する際に発生する硫化水素を重金属含有排水と接触させることで、重金属を排水と固液分離することが可能な状態とすることができる。 Hydrogen sulfide is water-soluble and can insolubilize heavy metals. Therefore, the hydrogen sulfide generated when the sulfate-reducing bacteria are cultured is brought into contact with the heavy metal-containing wastewater, whereby the heavy metal can be separated from the wastewater by solid-liquid separation.
請求項１記載の発明によれば、硫酸還元細菌の増殖を促進することができるので、硫酸還元細菌の培養期間を短縮することができる。また、硫酸還元細菌以外の微生物が培養液に含まれている場合であっても、硫酸還元細菌を優先的に増殖させることができるので、雑多な微生物群の中から硫酸還元細菌のみを選択的に培養することが可能となる。 According to the invention described in claim 1, since the growth of sulfate-reducing bacteria can be promoted, the culture period of the sulfate-reducing bacteria can be shortened. Even when microorganisms other than sulfate-reducing bacteria are contained in the culture solution, sulfate-reducing bacteria can be preferentially grown, so only sulfate-reducing bacteria are selectively selected from a diverse group of microorganisms. Can be cultured.
請求項２記載の発明によれば、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができ、硫酸還元細菌の培養に好ましい酸化還元電位を長期に亘って制御し続けることが可能となる。 According to the invention described in claim 2, the oxidation-reduction potential of the culture solution itself can be controlled to a constant value, and the oxidation-reduction potential preferable for culturing sulfate-reducing bacteria can be controlled over a long period of time. .
請求項３記載の発明によれば、硫酸還元細菌の増殖の促進または雑多な微生物群からの硫酸還元細菌の優先的な増殖により、硫化水素の発生量を増加させることができるので、硫酸還元細菌が生成する硫化水素を利用した重金属含有排水の処理効率を高めることが可能となる。 According to the invention described in claim 3, since the amount of hydrogen sulfide generated can be increased by promoting the growth of sulfate-reducing bacteria or by preferential growth of sulfate-reducing bacteria from various microorganisms, the sulfate-reducing bacteria It is possible to increase the treatment efficiency of wastewater containing heavy metals using hydrogen sulfide produced by the
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。 The best mode for carrying out the present invention will be described below in detail with reference to the drawings.
図１に、本発明の硫酸還元細菌の培養方法の実施形態の一例として、電気培養装置１を用いた場合について説明する。本発明の硫酸還元細菌の培養方法は、硫酸還元細菌２と硫酸イオン１３とを含む培養液４に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液４の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で硫酸還元細菌２を培養するものである。 FIG. 1 illustrates a case where an electric culture apparatus 1 is used as an example of an embodiment of the method for culturing sulfate-reducing bacteria of the present invention. In the method for culturing sulfate-reducing bacteria of the present invention, an electrode is immersed in a culture solution 4 containing sulfate-reducing bacteria 2 and sulfate ions 13, and a potential is applied to this electrode to oxidize the culture solution 4 with respect to a silver / silver chloride electrode. The sulfate-reducing bacteria 2 are cultured under anaerobic conditions while controlling the reduction potential X (V) to X ≦ −0.6 .
電解槽５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８に仕切られている。培養槽７と対極槽８には培養液４が充填され、培養槽７には作用極９及び参照電極１１が、対極槽８には対極１０が浸漬される。作用極９、対極１０及び参照電極１１は３電極式の電位制御装置（ポテンシオスタット）１２に結線され、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能としている。 The electrolytic cell 5 is divided into a culture cell 7 and a counter electrode cell 8 by an ion exchange membrane 6. The culture tank 7 and the counter electrode tank 8 are filled with the culture solution 4, the working electrode 9 and the reference electrode 11 are immersed in the culture tank 7, and the counter electrode 10 is immersed in the counter electrode tank 8. The working electrode 9, the counter electrode 10 and the reference electrode 11 are connected to a three-electrode type potential control device (potentiostat) 12 so that the potential of the working electrode 9 in the culture tank 7 can be set strictly.
培養槽７には、酸化還元物質３がさらに添加される。 A redox substance 3 is further added to the culture tank 7.
酸化還元物質３としては、培養液４に浸されている作用極９と可逆的に酸化還元反応を生じ得る物質であり、且つ、硫酸還元細菌２に対して毒性を示さない物質であればよい。例えば、土壌成分として一般的な鉄イオンが挙げられる。鉄イオンは以下に示す化学反応式１により酸化体と還元体に可逆的に変化する。
[化学反応式１] Ｆｅ(III) ＋ ｅ− ＝ Ｆｅ(II)
The redox substance 3 may be any substance that can reversibly cause a redox reaction with the working electrode 9 immersed in the culture solution 4 and that does not exhibit toxicity to the sulfate-reducing bacteria 2. . For example, a general iron ion is mentioned as a soil component. The iron ion reversibly changes into an oxidized form and a reduced form according to the chemical reaction formula 1 shown below.
[Chemical Reaction Formula 1] Fe (III) + e − = Fe (II)
ここで、鉄イオンを培養液４中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させて培養液中に添加することが好ましい。キレート剤としては、鉄イオンを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、好ましくはＥＤＴＡである。 Here, in order to allow iron ions to stably exist in the culture solution 4, it is preferable that iron ions be coordinated with the chelating agent and added to the culture solution. As the chelating agent, any chelating agent capable of coordinating iron ions can be used. For example, diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetraethylenetriamine (TET), ethylenediamine (EDA), diethylenetriamine (DETA), citric acid, oxalic acid, crown ether, nitrilotetraacetic acid, disodium edetate, sodium edetate, trisodium edetate, penicillamine, trisodium pentetate calcium, pentetate, succil and edet An acid trientine can be mentioned, and EDTA is preferred.
尚、鉄イオンをキレート剤に配位させて用いることにより、硫酸還元細菌２が産生する硫化水素により鉄イオンが硫化物となって沈殿するのを防ぐ効果もある。 In addition, by coordinating and using the iron ion to the chelating agent, there is an effect of preventing the iron ion from being precipitated as a sulfide by the hydrogen sulfide produced by the sulfate-reducing bacteria 2.
鉄イオン以外にも、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲンを用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により、酸化体と還元体に可逆的に変化する。特に、キノン化合物は土壌成分の一つとして知られている物質であり、好ましい。つまり、土壌そのものを培養液４に添加することで、土壌に含まれている酸化還元物質３により培養液の酸化還元電位が制御できる場合がある。尚、酸化還元物質３は上記した物質に限定されるものではない。 In addition to iron ions, quinone compounds such as potassium ferrocyanide and sodium anthraquinone disulfonate, and methyl viologen can be used. These substances also reversibly change into an oxidized form and a reduced form by an oxidation-reduction reaction. In particular, a quinone compound is a substance known as one of the soil components and is preferable. That is, by adding the soil itself to the culture solution 4, the oxidation-reduction potential of the culture solution can be controlled by the oxidation-reduction substance 3 contained in the soil. The redox material 3 is not limited to the materials described above.
尚、酸化還元物質３の培養槽７への添加量は、培養液４の酸化還元電位を制御できる量であれば特に限定されないが、培養液４の濃度を０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることが好適である。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満とすると酸化還元電位の制御を十分に行うことができない可能性が生じやすくなる。また、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると培養液に完全に溶解しない、もしくは微生物の生育を阻害する可能性が生じやすくなる。 The amount of the redox substance 3 added to the culture tank 7 is not particularly limited as long as the redox potential of the culture solution 4 can be controlled, but the concentration of the culture solution 4 is 0.1 to 100 mmol / L. Is preferred. If it is less than 0.1 mmol / L, the possibility of insufficient control of the redox potential tends to occur. On the other hand, if it exceeds 100 mmol / L, it may not be completely dissolved in the culture solution or may possibly inhibit the growth of microorganisms.
また、培養液４に含有させる硫酸イオン１３は、硫酸還元細菌に呼吸を行わせてエネルギーを獲得させるために必須の成分である。硫酸イオン源としては、例えば、硫酸マグネシウムや硫酸カルシウム等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、硫酸イオン１３の添加量については、硫酸還元細菌に呼吸を十分に行わせることのできる量であれば特に限定されるものではないが、例えば、硫酸還元細菌の菌体密度１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに対して、培養液４の硫酸イオン濃度を１０００〜１５００ｐｐｍとすることが好適である。 Moreover, the sulfate ion 13 contained in the culture solution 4 is an essential component for causing the sulfate-reducing bacteria to breathe and acquiring energy. As the sulfate ion source, for example, magnesium sulfate, calcium sulfate, or the like can be used, but is not limited thereto. The amount of sulfate ion 13 added is not particularly limited as long as it allows the sulfate-reducing bacteria to sufficiently breathe. For example, the cell density of sulfate-reducing bacteria is 10 7 to 10. It is preferable that the sulfate ion concentration of the culture solution 4 is 1000 to 1500 ppm with respect to 8 cells / mL.
ここで、本発明の硫酸還元細菌の培養方法において、硫酸還元細菌２の培養環境は嫌気条件下としている。硫酸還元細菌２は嫌気性微生物であることから、培養環境を嫌気環境とすることが必要である。嫌気環境は、例えば電気培養装置１の電解槽５をボックス（不図示）内に入れ、当該ボックス内に水素ガス、二酸化炭素、不活性ガス（窒素、希ガス）、またはそれらの混合ガスを充填することにより形成することができるが、このような方法に限定されるものではない。 Here, in the method for culturing sulfate-reducing bacteria of the present invention, the culture environment of the sulfate-reducing bacteria 2 is anaerobic. Since sulfate-reducing bacteria 2 are anaerobic microorganisms, it is necessary to make the culture environment anaerobic. In an anaerobic environment, for example, the electrolytic cell 5 of the electroculture device 1 is placed in a box (not shown), and the box is filled with hydrogen gas, carbon dioxide, inert gas (nitrogen, rare gas), or a mixed gas thereof. However, it is not limited to such a method.
次に、培養液４の酸化還元電位について説明する。培養液４の酸化還元電位は、数式１に示すネルンストの式により表される。 Next, the oxidation-reduction potential of the culture solution 4 will be described. The oxidation-reduction potential of the culture solution 4 is expressed by the Nernst equation shown in Equation 1.
[数式２] Ｅ＝Ｅ０＋ＲＴ／ｎＦ×ｌｎ（Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ） [Formula 2] E = E 0 + RT / nF × ln (C ox / C red )
数式２において、Ｅは溶液の酸化還元電位、Ｅ０は酸化還元物質の標準酸化還元電位、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｎは反応電子数、Ｆはファラデー定数、Ｃｏｘは酸化体の濃度、Ｃｒｅｄは還元体の濃度である。つまり、培養液中に含まれる酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位を制御することができる。要するに、酸化還元物質３が培養液４の酸化還元電位を決定する要素であり、培養液４の組成は酸化還元電位にほとんど影響を与えることがない。 In Equation 2, E is the redox potential of the solution, E 0 is the standard redox potential of the redox material, R is the gas constant, T is the absolute temperature, n is the number of reaction electrons, F is the Faraday constant, and C ox is the oxidant. , C red is the concentration of the reductant. That is, the oxidation-reduction potential of the culture solution 4 itself can be controlled by controlling the ratio of the oxidant concentration of the redox substance 3 and the concentration of the reductant contained in the culture solution to be constant. In short, the redox substance 3 is an element that determines the redox potential of the culture solution 4, and the composition of the culture solution 4 hardly affects the redox potential.
３極式の電位制御装置１２では、作用極９と参照電極１１間の電位差を測定し、測定した電位差が設定電位Ｖに達するように作用極９と対極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。このようにして作用極９の電位を一定の電位Ｖに制御し、酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位が一定に制御される。ここで、培養液４の酸化還元電位は、作用極９の酸化還元電位に相当する。したがって、設定電位Ｖ、つまり、参照電極１１に対する作用極９の電位が培養液４の酸化還元電位に相当する。 The tripolar potential control device 12 measures the potential difference between the working electrode 9 and the reference electrode 11, passes a current between the working electrode 9 and the counter electrode 10 so that the measured potential difference reaches the set potential V, and sets the reference Thus, no current flows through the reference electrode 11. In this way, the potential of the working electrode 9 is controlled to a constant potential V, and the ratio of the oxidant concentration to the reductant concentration of the redox substance 3 is controlled to be constant, whereby the redox potential of the culture solution 4 itself. Is controlled to be constant. Here, the redox potential of the culture solution 4 corresponds to the redox potential of the working electrode 9. Therefore, the set potential V, that is, the potential of the working electrode 9 with respect to the reference electrode 11 corresponds to the redox potential of the culture solution 4.
例として、酸化還元電位が＋０．５Ｖの培養液の酸化還元電位を−０．５Ｖに制御する場合について図２に基づいて説明する。初期状態、つまり作用極９に電位を印加していない場合は、作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１との間の電位差である＋０．５Ｖとなる（図２の（１））。次に、設定電位を−０．５Ｖとして電位制御を開始すると、作用極９の電位は瞬時に設定電位となり、培養液４中の酸化還元物質３が酸化還元反応を生じて、酸化還元物質３の酸化体と還元体の濃度比が制御され、培養液４の電位が徐々に設定電位に近づき（図２の（２））、定常状態となって、培養液４の酸化還元電位が−０．５Ｖとなる（図２の（３））。このときの作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１の電位差である−０．５Ｖとなる。 As an example, a case where the oxidation-reduction potential of a culture solution having a oxidation-reduction potential of +0.5 V is controlled to -0.5 V will be described with reference to FIG. In the initial state, that is, when no potential is applied to the working electrode 9, the measured oxidation-reduction potential of the working electrode 9 is +0.5 V, which is the potential difference between the working electrode 9 and the reference electrode 11 (FIG. 2). (1)). Next, when potential control is started with the set potential set at −0.5 V, the potential of the working electrode 9 instantaneously becomes the set potential, and the redox substance 3 in the culture solution 4 undergoes a redox reaction, and the redox substance 3 The concentration ratio of the oxidant and reductant is controlled, the potential of the culture solution 4 gradually approaches the set potential ((2) in FIG. 2), and becomes a steady state, and the oxidation-reduction potential of the culture solution 4 becomes −0. .5V ((3) in FIG. 2). At this time, the measured redox potential of the working electrode 9 is −0.5 V, which is the potential difference between the working electrode 9 and the reference electrode 11.
ここで、酸化還元電位は、参照電極１１に対する作用極９の電位に相当するので、参照電極１１の種類により酸化還元電位の値は変化する。本明細書における酸化還元電位は、標準水素電極に対して＋０．２２Ｖを示す銀・塩化銀電極に対する値としているが、参照電極１１は銀・塩化銀電極に限られるものではない。銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合の酸化還元電位は上述した方法により容易に換算でき、銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合に換算した酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。 Here, since the oxidation-reduction potential corresponds to the potential of the working electrode 9 with respect to the reference electrode 11, the value of the oxidation-reduction potential varies depending on the type of the reference electrode 11. The oxidation-reduction potential in this specification is a value for a silver / silver chloride electrode showing +0.22 V with respect to a standard hydrogen electrode, but the reference electrode 11 is not limited to a silver / silver chloride electrode. The oxidation-reduction potential when an electrode other than a silver / silver chloride electrode is used can be easily converted by the method described above, and the range of the oxidation-reduction potential converted when an electrode other than a silver / silver chloride electrode is used is also included in the present invention. included.
尚、培養槽７に投入された微生物が酸化還元物質を酸化あるいは還元することにより、Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ（酸化体と還元体の濃度比）が変化した場合でも、可逆性の酸化還元物質を用いることで、所定のＣｏｘ／Ｃｒｅｄに制御して、酸化還元電位を一定値に保つことができる。 In addition, even when C ox / C red (concentration ratio of oxidant and reductant) is changed by oxidizing or reducing the redox substance by the microorganisms introduced into the culture tank 7, the reversible redox substance is removed. By using it, the redox potential can be maintained at a constant value by controlling to a predetermined C ox / C red .
ここで、電解槽５を二槽に区画しているイオン交換膜６は、一価の陽イオンのみを透過する膜である。したがって、二価の鉄イオンや三価の鉄イオンは透過しないので、酸化還元物質３が対極槽８に移動することはない。また、したがって、酸化還元物質３は培養槽７で繰り返し利用できる。対極槽８に設置された対極１０では、作用極９の逆反応として水素の還元・酸化反応が生じる。また、膜間のイオン電流の伝達は、培養液４に含まれる水素イオン、ナトリウムイオン(Ｎａ＋)、カリウムイオン（Ｋ＋）などの一価の陽イオンにより行われる。このような電気化学反応が電解槽５で進行し、培養液４の酸化還元電位が一定に制御される。 Here, the ion exchange membrane 6 that divides the electrolytic cell 5 into two cells is a membrane that transmits only monovalent cations. Therefore, since bivalent iron ions and trivalent iron ions do not permeate, the redox material 3 does not move to the counter electrode tank 8. Therefore, the redox material 3 can be repeatedly used in the culture tank 7. In the counter electrode 10 installed in the counter electrode tank 8, hydrogen reduction / oxidation reaction occurs as a reverse reaction of the working electrode 9. In addition, transmission of ionic current between the membranes is performed by monovalent cations such as hydrogen ions, sodium ions (Na + ), and potassium ions (K + ) contained in the culture solution 4. Such an electrochemical reaction proceeds in the electrolytic cell 5, and the oxidation-reduction potential of the culture solution 4 is controlled to be constant.
本発明において、培養液４の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）はＸ≦−０．６としている。酸化還元電位をＸ＞−０．６とすると、硫酸還元細菌２の増殖が促進されなくなる。尚、酸化還元電位の下限値については、−０．８Ｖの場合には硫酸還元細菌２の増殖が促進されることが確認された。しかも、酸化還元電位を−０．６Ｖとした場合よりも−０．８Ｖとした場合の方が、より増殖が促進されやすいことが確認されたことから、Ｘ≦−０．８の場合であっても硫酸還元細菌２の増殖が促進されるものと考えられる。しかしながら、酸化還元電位をＸ＜−０．８とすると、対極１０からの水素発生量が増加しすぎて酸化還元電位の制御が正確に行えなくなる。したがって、酸化還元電位は−０．８Ｖ〜−０．６Ｖとすることが好適である。 In the present invention, the oxidation-reduction potential X (V) of the culture solution 4 with respect to the silver / silver chloride electrode is X ≦ −0.6 . The redox potential is X> −0. If it is 6, the growth of sulfate-reducing bacteria 2 will not be promoted. As for the lower limit value of the oxidation-reduction potential, it was confirmed that the growth of the sulfate-reducing bacteria 2 was promoted in the case of -0.8V. Moreover, since it was confirmed that the growth was more easily promoted when the oxidation-reduction potential was −0.8 V than when −0.6 V, X ≦ −0. Even in the case of 8, it is considered that the growth of the sulfate-reducing bacteria 2 is promoted. However, the redox potential is X < −0. If it is 8, the amount of hydrogen generated from the counter electrode 10 will increase too much, and the oxidation-reduction potential cannot be accurately controlled. Therefore, the oxidation-reduction potential is preferably −0.8V to −0.6V.
本発明の培養方法よれば、硫酸還元細菌２を単独で培養する場合に、硫酸還元細菌２の増殖を促進することができる。尚、培養対象となる硫酸還元細菌２としては、公知ないしは新規の硫酸還元細菌全般を用いることができる。公知の硫酸還元細菌としては、例えば、Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfobacula, Desulfobacterが挙げられるがこれらに限定されるものではない。 According to the culture method of the present invention, when the sulfate-reducing bacteria 2 is cultured alone, the growth of the sulfate-reducing bacteria 2 can be promoted. In addition, as sulfate-reducing bacteria 2 to be cultured, known or novel sulfate-reducing bacteria in general can be used. Examples of known sulfate-reducing bacteria include, but are not limited to, Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfobacula, and Desulfobacter.
また、本発明の培養方法によれば、培養液４中に硫酸還元細菌２以外にも微生物が存在する場合であっても、硫酸還元細菌２の増殖を促進させることによって硫酸還元細菌２を優先的に増殖させることができる。つまり、硫酸還元細菌２の増殖を促進させることによって、培養液４中に存在する炭素源（乳酸、酵母エキスなど）が硫酸還元細菌２に消費されやすくなる。その結果として、競合している他の微生物が炭素源を摂取できなくなり、硫酸還元細菌２の増殖に伴って、競合している他の微生物が減少し、最終的には硫酸還元細菌２が優先的に増殖することになる。したがって、本発明の培養方法によれば、雑多な微生物群の中から、硫酸還元細菌２を集積培養することも可能である。 Further, according to the culture method of the present invention, even when microorganisms other than the sulfate-reducing bacteria 2 are present in the culture solution 4, the sulfate-reducing bacteria 2 is prioritized by promoting the growth of the sulfate-reducing bacteria 2. Can be propagated. That is, by promoting the growth of the sulfate-reducing bacteria 2, the carbon source (lactic acid, yeast extract, etc.) present in the culture solution 4 is easily consumed by the sulfate-reducing bacteria 2. As a result, other competing microorganisms cannot take in the carbon source, and as the sulfate-reducing bacteria 2 grow, the other competing microorganisms decrease, and finally the sulfate-reducing bacteria 2 takes precedence. Will proliferate. Therefore, according to the culture method of the present invention, the sulfate-reducing bacteria 2 can be accumulated and cultured from among various microbial groups.
ここで、硫酸還元細菌は、硫酸イオンを還元して硫化水素を産生することができる。したがって、この硫化水素を利用して排水に含まれる重金属を不溶化することにより、重金属を排水から固液分離して除去することができる。また、硫酸還元細菌の中には、硫酸還元と相補的にベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物を分解する機能を有するものも存在する。本発明の培養方法によれば、このように様々な環境汚染物質を処理する機能を有する有用な微生物である硫酸還元細菌の増殖を促進することにより、硫酸還元細菌の培養期間の短縮を図ることや、雑多な微生物群から硫酸還元細菌を優先的に増殖させて集積培養することが可能となる。 Here, sulfate-reducing bacteria can reduce sulfate ions to produce hydrogen sulfide. Therefore, heavy metals can be removed from the waste water by solid-liquid separation by insolubilizing the heavy metals contained in the waste water using this hydrogen sulfide. In addition, some sulfate-reducing bacteria have a function of decomposing aromatic compounds such as benzene and toluene in a complementary manner to sulfate reduction. According to the culture method of the present invention, the culture period of sulfate-reducing bacteria can be shortened by promoting the growth of sulfate-reducing bacteria, which are useful microorganisms having a function of treating various environmental pollutants. In addition, it is possible to preferentially proliferate sulfate-reducing bacteria from a diverse group of microorganisms and accumulate and culture them.
また、本発明の硫酸還元細菌の培養方法の実施と同時に、重金属含有排水の処理を行うようにしてもよい。例えば、図３に示すように、電気培養装置１の培養槽７を硫酸還元細菌２を通過させることなく、硫酸還元細菌２により生成される硫化水素（硫化物イオン）を通過させるメンブレンフィルタ１６で仕切って処理槽１７を形成し、処理槽１７に重金属２１を含む排水１８を収容し、処理槽１７と培養槽７との間の濃度勾配によりメンブレンフィルタ１６を通過した硫化水素（硫化物イオン）と排水１８に含まれる重金属２１とを接触させて重金属２１を不溶化することにより、重金属２１を排水１８から固液分離して除去することができる。培養槽７の硫酸還元細菌２は培養液４の酸化還元電位が制御されて増殖が促進されているので、重金属を効率よく不溶化できるバイオリアクターとなる。尚、この形態において、培養液４内で十分にイオン電流が流れない場合には、排水１８に酸化還元物質３を添加するようにしても良い。 Moreover, you may make it process heavy metal containing waste_water | drain simultaneously with implementation of the culture | cultivation method of the sulfate reduction bacteria of this invention. For example, as shown in FIG. 3, a membrane filter 16 that allows hydrogen sulfide (sulfide ions) generated by the sulfate-reducing bacteria 2 to pass through the culture tank 7 of the electric culture apparatus 1 without passing the sulfate-reducing bacteria 2. A processing tank 17 is formed by partitioning, waste water 18 containing heavy metal 21 is accommodated in the processing tank 17, and hydrogen sulfide (sulfide ion) that has passed through the membrane filter 16 due to a concentration gradient between the processing tank 17 and the culture tank 7. And the heavy metal 21 contained in the drainage 18 are brought into contact with each other to insolubilize the heavy metal 21, so that the heavy metal 21 can be removed from the drainage 18 by solid-liquid separation. The sulfate-reducing bacteria 2 in the culture tank 7 is a bioreactor capable of efficiently insolubilizing heavy metals since the growth is promoted by controlling the redox potential of the culture solution 4. In this embodiment, when the ion current does not sufficiently flow in the culture solution 4, the redox material 3 may be added to the waste water 18.
尚、本発明の重金属含有液の処理方法において不溶化され得る重金属２１は、排水中で亜セレン酸イオン（ＳｅＯ３ ２−）の形態で存在しているセレン（Ｓｅ）並びに排水中で陽イオンの形態で存在している鉄（Ｆｅ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉛（Ｐｂ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、砒素（Ａｓ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、マンガン（Ｍｎ）及びスズ（Ｓｎ）のうちの一種以上である。 The heavy metal 21 that can be insolubilized in the method for treating a heavy metal-containing liquid according to the present invention includes selenium (Se) that exists in the form of selenite ion (SeO 3 2− ) in the waste water and cation in the waste water. Iron (Fe), copper (Cu), silver (Ag), zinc (Zn), lead (Pb), cobalt (Co), nickel (Ni), molybdenum (Mo), arsenic (As) present in the form , Cadmium (Cd), mercury (Hg), manganese (Mn), and tin (Sn).
排水中で亜セレン酸イオン（ＳｅＯ３ ２−）の形態で存在しているセレン（Ｓｅ）は、供給された硫化水素により硫化物沈殿が生成されるか、あるいは供給された硫化水素が還元剤として作用することにより元素状セレンとなって不溶化される。排水中で陽イオンの形態で存在している銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、スズ（Ｓｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、マンガン（Ｍｎ）及びアルミニウム（Ａｌ）は、供給された硫化水素と反応して硫化物沈殿が生成され、不溶化される。尚、アルミニウム（Ａｌ）は、硫化物沈殿ではなく、水酸化物沈殿であるＡｌ(ＯＨ)３となって不溶化される。したがって、重金属２１は排水１８と固液分離することが可能な状態となるので、排水を、例えば濾過処理等により固液分離することにより、重金属含有液から重金属を回収して無害化することができる。 Selenium (Se) present in the form of selenite ion (SeO 3 2− ) in the wastewater generates sulfide precipitates by the supplied hydrogen sulfide, or the supplied hydrogen sulfide is used as a reducing agent. Acts as elemental selenium and is insolubilized. Copper (Cu), silver (Ag), lead (Pb), cadmium (Cd), mercury (Hg), tin (Sn), nickel (Ni), cobalt (Co ), Iron (Fe), zinc (Zn), manganese (Mn), and aluminum (Al) react with the supplied hydrogen sulfide to form a sulfide precipitate, which is insolubilized. Aluminum (Al) is insolubilized as Al (OH) 3 which is not a sulfide precipitate but a hydroxide precipitate. Accordingly, since the heavy metal 21 can be separated from the waste water 18 by solid-liquid separation, the heavy metal can be recovered from the heavy metal-containing liquid to be rendered harmless by solid-liquid separation of the waste water by, for example, filtration. it can.
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、硫酸還元細菌２の培養中に培養槽７の培養液４にベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物を直接添加し、硫酸還元細菌２にこれらを分解させながら培養を行い、ベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物の分解処理と硫酸還元細菌２の培養を同時に行うようにしてもよい。 The above-described embodiment is an example of a preferred embodiment of the present invention, but is not limited thereto, and various modifications can be made without departing from the gist of the present invention. For example, during the culture of sulfate-reducing bacteria 2, aromatic compounds such as benzene and toluene are directly added to the culture solution 4 of the culture tank 7, and the sulfate-reducing bacteria 2 are cultured while decomposing them, so that benzene, toluene, etc. You may make it perform the decomposition | disassembly process of an aromatic compound, and culture | cultivation of the sulfate reduction bacteria 2 simultaneously.
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、乳酸ナトリウム；４．０ｍＬ、ＮＨ４Ｃｌ；１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物；５．０ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、培養液４ａに酵母エキス；１．０ｇ、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．２に調整した。
(1) Adjustment of culture solution Culture solution 4a was adjusted as follows. That is, sodium lactate; 4.0 mL, NH 4 Cl; 1.0 g, K 2 HPO 4 ; 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O; 2.0 g, trisodium citrate dihydrate; 5.0 g, CaSO 4 · 2H 2 O; 1.0 g was dissolved in 1 L of distilled water to prepare. The adjusted culture solution 4a was sterilized by autoclave. Further, to the culture solution 4b filled in the culture tank 7, yeast extract; 1.0 g, Fe (III) -EDTA; 0.42 g was further added to the culture solution 4a, and filters (0.22 μm, Millex-GS, MILLIPORE) were added. , Irland) and used after sterilization by filtration. Each culture solution was adjusted to pH 7.2 with dilute sodium hydroxide solution.
（２）培養装置
硫酸還元細菌の生育には図４に示す電気培養装置１を使用した。電解槽５は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）６で仕切った二槽式とし、一方を培養槽７、他方を対極槽８とした。培養槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の作用極９と、銀・塩化銀参照電極１１（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。対極槽８には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の対極１０を設置した。これら３本の電極９,１０,１１は電位制御装置（扶桑製作所、ＰＯＴＥＮＴＩＯ／ＧＡＬＶＡＮＯＳＴＡＴ ｍｏｄｅｌ １１０）１２に結線して、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能とした。
(2) Culture apparatus The electroculture apparatus 1 shown in FIG. 4 was used for the growth of sulfate-reducing bacteria. The electrolytic cell 5 is a two-tank type in which the inside of a glass petri dish with an outer diameter of 75 mm and a height of 90 mm is partitioned by a monovalent cation-permeable exchange membrane (Asahi Kasei, K-192) 6 and one is cultured. The tank 7 was used as the counter electrode tank 8. The culture tank 7 was provided with a working electrode 9 of a carbon plate (40 mm × 70 mm, 4 mm thickness) and a silver / silver chloride reference electrode 11 (HS-205C, Toa DKK). A counter electrode 10 of a carbon plate (40 mm × 70 mm, 4 mm thickness) was installed in the counter electrode tank 8. These three electrodes 9, 10, and 11 were connected to a potential control device (Fuso Seisakusho, POTENTO / GALVANOSTAT model 110) 12 so that the potential of the working electrode 9 in the culture tank 7 could be set precisely.
培養槽７には培養液４ｂを充填し、対極槽８には培養液４ａを充填した。 The culture tank 7 was filled with the culture solution 4b, and the counter electrode tank 8 was filled with the culture solution 4a.
培養に際しては、電解槽５をアクリル製の嫌気ボックス１４内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０℃に設定した恒温槽（不図示）内に設置した。嫌気ボックス１４には、常時窒素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。 In culturing, the electrolytic cell 5 was enclosed in an anaerobic box 14 made of acrylic, and the entire anaerobic box was installed in a thermostat (not shown) set at 30 ° C. Nitrogen gas was always injected into the anaerobic box 14 (0.2 L / min) to maintain an anaerobic atmosphere.
（３）微生物群集からの硫酸還元細菌の集積の検討
以下の（ａ）〜（ｄ）に示す条件で、微生物群集を含む０．５〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を、培養液１００ｍＬに対して２ｍＬ添加し、上記電気培養装置１で１週間培養して、ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法により微生物群集の遺伝子解析を行った。尚、以下に説明する酸化還元電位は、銀・酸化銀参照電極１１に対する値である。また、微生物群集は、本願発明者等が財団法人電力中央研究所の我孫子研究所近辺の水田及び手賀沼から採取した泥を低温保存していたものに含まれていたものであり、実験の際には、この泥をそのまま使用した。
（ａ）酸化還元電位：制御せず
（ｂ）酸化還元電位：＋０．４Ｖ
（ｃ）酸化還元電位：−０．１Ｖ
（ｄ）酸化還元電位：−０．６Ｖ
(3) Examination of accumulation of sulfate-reducing bacteria from microbial communities Under the conditions shown in (a) to (d) below, a suspension of 0.5 to 1.0 × 10 9 cells / mL containing microbial communities Then, 2 mL was added to 100 mL of the culture solution, cultured for 1 week in the above-described electroculture apparatus 1, and genetic analysis of the microbial community was performed by DGGE (denaturing agent concentration gradient gel electrophoresis) method. The redox potential described below is a value with respect to the silver / silver oxide reference electrode 11. In addition, the microbial community was included in what the inventors of the present application had stored at low temperature mud collected from paddy fields and Teganuma near the Abiko Research Institute of the Central Research Institute of Electric Power. This mud was used as it was.
(A) Redox potential: not controlled (b) Redox potential: + 0.4V
(C) Redox potential: -0.1V
(D) Redox potential: -0.6V
ＤＧＧＥ法は、以下の手順により行った。培養終了後の培養液４ｂをそれぞれ２ｍＬ採取し、これをＴＥバッファーに懸濁・撹拌して３０分間静置し、上清を採取して１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿に細胞壁分解酵素とproteinase Kを含むＤＮＡ抽出用バッファー（５００Ｕ／ｍＬ アクロモペプチダーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 塩化ナトリウム）を添加し、培養液４ｂに含まれる微生物群集由来のＤＮＡを抽出した。 The DGGE method was performed according to the following procedure. 2 mL of each culture solution 4b after completion of the culture was collected, suspended and stirred in TE buffer and allowed to stand for 30 minutes, and the supernatant was collected and centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes to collect the precipitate. To this precipitate, a DNA extraction buffer (500 U / mL achromopeptidase, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 10 mM sodium chloride) containing cell wall degrading enzyme and proteinase K is added and contained in the culture solution 4b. DNA from the microbial community was extracted.
抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により１６Ｓ ｒＤＮＡの約２００ｂｐを増幅した。プライマーには、環境微生物の検索に用いられる一般的なユニバーサルプライマー（E.coil No.341-534)を使用した。使用したプライマーの塩基配列を図５に示す。ＤＮＡポリメラーゼにはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Applied Biosystem, CA, USA）を用い、サーマルサイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Applied Biosystem, CA, USA）を用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃（３０秒）→５５℃（３０秒）→７２℃（３０秒）を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返した。 About 200 bp of 16S rDNA was amplified by PCR using the extracted DNA as a template. As a primer, a general universal primer (E. coil No. 341-534) used for searching for environmental microorganisms was used. The base sequence of the used primer is shown in FIG. AmpliTaq Gold (Applied Biosystem, CA, USA) was used as the DNA polymerase, and GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystem, CA, USA) was used as the thermal cycler. The PCR conditions were 94 ° C. (30 seconds) → 55 ° C. (30 seconds) → 72 ° C. (30 seconds), and this was repeated 30 cycles.
ＰＣＲにより得られた産物をＤＧＧＥ解析の試料とした。ＤＧＧＥはＤｃｏｄｅ ＤＧＧＥコンプリートシステム（BIO RAD, CA, USA）を用いて行った。変性剤濃度勾配は電気泳動方向に２０％→７０％とした。ポリアクリルアミドゲル濃度は１０％とした。ゲル変性剤には尿素（BIO RAD, CA, USA）とホルムアミド（BIO RAD, CA, USA）を使用した。電気泳動条件は、電圧を１００Ｖとし、泳動時間を５時間とした。 The product obtained by PCR was used as a sample for DGGE analysis. DGGE was performed using the Dcode DGGE complete system (BIO RAD, CA, USA). The concentration gradient of the denaturant was 20% → 70% in the electrophoresis direction. The polyacrylamide gel concentration was 10%. Urea (BIO RAD, CA, USA) and formamide (BIO RAD, CA, USA) were used as gel denaturing agents. The electrophoresis conditions were a voltage of 100 V and a migration time of 5 hours.
電気泳動終了後、変性剤濃度勾配ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、染色されたＤＮＡがＵＶ（３１０ｎｍ）照射下で発光する励起光をＣＣＤカメラで撮影した。 After the electrophoresis, the denaturant gradient gel was stained with ethidium bromide, and the excitation light emitted from the stained DNA under UV (310 nm) irradiation was photographed with a CCD camera.
ＤＧＧＥ解析結果を図６に示す。図６においてレーン１はサイズマーカーを示し、レーン２は上記（ａ）の条件で培養した結果を示し、レーン３は上記（ｂ）の条件で培養した結果を示し、レーン４は上記（ｃ）の条件で培養した結果を示し、レーン５は上記（ｄ）の条件で培養した結果を示している。この結果から、酸化還元電位を制御せずに培養した場合には少なくとも４種類の微生物が存在することが確認された（レーン２）。これに対し、酸化還元電位を−０．６Ｖに制御した場合には、レーン２で示された４種のバンドのうち、一番下のバンドのみが存在していることが確認され、しかもこのバンドの色が濃かったことから、一番下のバンドに由来する微生物のみが優先的に増殖していることが明らかとなった（レーン５）。 The DGGE analysis result is shown in FIG. In FIG. 6, lane 1 shows the size marker, lane 2 shows the result of culturing under the condition (a), lane 3 shows the result of culturing under the condition (b), and lane 4 shows the result (c). The results of culturing under the above conditions are shown, and lane 5 shows the results of culturing under the above conditions (d). From this result, it was confirmed that at least four types of microorganisms were present when culturing without controlling the redox potential (lane 2). On the other hand, when the oxidation-reduction potential was controlled to -0.6 V, it was confirmed that only the bottom band of the four types of bands shown in lane 2 was present. Since the color of the band was dark, it was revealed that only the microorganisms derived from the bottom band proliferated preferentially (lane 5).
次に、得られたDGGE解析結果をもとにレーン２において一番下に存在するＤＮＡバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した後、その一部を鋳型としてＧＣクランプのないユニバーサルプライマー（E.coil No.341-534）を用いて再度PCRを行い、増幅したDNA断片を定法に基づきクローニング後、ABI PRISM BigDye termination v3.0 cycle sequencing kit とABI PRISM 3100 genetic analyzer (Applied Biosystems Japan, Tokyo) を用い、dideoxy nucleotide chain termination法により塩基配列の同定を行った。そして、同定した塩基配列をもとに国際塩基配列データベース(Genebank, EMBL, DDBJ)を使用して一致する16S rRNA 遺伝子を検索したところ、この遺伝子が、硫酸還元細菌の16Sr RNA遺伝子と一致した。したがって、レーン２において一番下に存在しているＤＮＡバンドは、硫酸還元細菌由来のバンドであり、酸化還元電位を−０．６Ｖに制御することにより、複数の微生物群から、硫酸還元細菌のみを優先的に増殖させることが可能であることが明らかとなった。 Next, based on the obtained DGGE analysis result, a DNA band existing at the bottom in lane 2 was cut out, DNA was extracted, and a universal primer (E. coil No .341-534), PCR was performed again, and the amplified DNA fragment was cloned according to a conventional method, then using ABI PRISM BigDye termination v3.0 cycle sequencing kit and ABI PRISM 3100 genetic analyzer (Applied Biosystems Japan, Tokyo) The nucleotide sequence was identified by dideoxy nucleotide chain termination method. Then, based on the identified nucleotide sequence, a search was made for a matching 16S rRNA gene using an international nucleotide sequence database (Genebank, EMBL, DDBJ). As a result, this gene matched the 16S rRNA gene of sulfate-reducing bacteria. Therefore, the DNA band present at the bottom in lane 2 is a band derived from sulfate-reducing bacteria. By controlling the oxidation-reduction potential to −0.6 V, only sulfate-reducing bacteria can be obtained from a plurality of microorganism groups. It became clear that it was possible to proliferate preferentially.
（４）硫酸還元細菌単独での生育の促進効果の検討
次に、硫酸還元細菌として、Desulfovibrio desulfuricans(ATCC7757）を使用し、培養液の酸化還元電位を制御した場合の硫酸還元細菌単独での増殖の促進効果について検討した。
(4) Examination of the growth promoting effect of sulfate-reducing bacteria alone Next, the growth of sulfate-reducing bacteria alone when Desulfovibrio desulfuricans (ATCC7757) is used as the sulfate-reducing bacteria and the oxidation-reduction potential of the culture is controlled. The promotion effect of was examined.
硫酸還元細菌２の培養には、上記電気培養装置１と同様の培養装置を用いた。但し、酸化還元物質３として、キノン化合物であるアントラキノン−２，６−ジスルホン酸（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸二ナトリウム０．４２ｇを培養液４ｂに添加）を使用した。また、硫酸還元細菌Desulfovibrio desulfuricans(ATCC7757)は、乳酸を炭素源として培養可能であるが、生育に必要な微量元素を補填する目的で酵母エキスの添加も上記の培養液の場合と同様に行った。 For culturing the sulfate-reducing bacteria 2, a culture apparatus similar to the above-described electroculture apparatus 1 was used. However, as redox substance 3, anthraquinone-2,6-disulfonic acid (0.42 g of anthraquinone-2,6-disulfonic acid disodium was added to culture solution 4b), which is a quinone compound, was used. The sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio desulfuricans (ATCC7757) can be cultured using lactic acid as a carbon source, but yeast extract was also added in the same manner as in the above culture solution for the purpose of supplementing trace elements necessary for growth. .
硫酸還元細菌の初期添加量は、培養液１００ｍＬに対して０．５〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を２ｍＬとした。そして、以下の（ｅ）〜（ｈ）に示す条件で７０時間培養を行った。
（ｅ）酸化還元電位：＋０．４Ｖ
（ｆ）酸化還元電位：−０．４５Ｖ
（ｇ）酸化還元電位：−０．７Ｖ
（ｈ）酸化還元電位：制御せず
The initial addition amount of sulfate-reducing bacteria was 2 mL of a suspension of 0.5 to 1.0 × 10 9 cells / mL with respect to 100 mL of the culture solution. And it culture | cultivated for 70 hours on the conditions shown in the following (e)-(h).
(E) Redox potential: + 0.4V
(F) Redox potential: -0.45V
(G) Redox potential: -0.7V
(H) Redox potential: not controlled
培養開始直後（０時間）と、培養開始から８時間後，２２時間後，３６時間後，４０時間後，４６時間後，５８時間後，７０時間後の菌体密度を光学顕微鏡を用いて計測した。また、培養開始直後（０時間）と、培養開始から８時間後，２２時間後，３６時間後，４０時間後，４６時間後，５８時間後，７０時間後の硫酸イオン濃度をイオンクロマトアナライザ（ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製）により測定した。さらに、培養開始直後（０時間）と、培養開始から２２時間後、３６時間後、４０時間後、４６時間後、５８時間後、７０時間後の乳酸イオン濃度をイオンクロマトアナライザ(ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製)により測定した。 The cell density was measured using an optical microscope immediately after the start of culture (0 hour) and after 8 hours, 22 hours, 36 hours, 40 hours, 46 hours, 58 hours and 70 hours after the start of the culture. did. In addition, the ion chromatograph analyzer (sulfuric acid concentration immediately after the start of culture (0 hour) and after 8 hours, 22 hours, 36 hours, 40 hours, 46 hours, 58 hours, and 70 hours after the start of the culture ICS-1500, manufactured by DIONEX). Furthermore, the lactate ion concentrations immediately after the start of culture (0 hours), and after 22 hours, 36 hours, 40 hours, 46 hours, 58 hours, and 70 hours after the start of the culture were measured using an ion chromatograph analyzer (ICS-1500, Measured by DIONEX).
菌体密度の計測結果を図７に示し、硫酸イオン濃度の測定結果を図８に示し、乳酸イオン濃度の測定結果を図９に示す。図７〜９において、◆は酸化還元電位を＋０．４Ｖに制御して培養した場合の測定結果を示し（ｅ）、■は酸化還元電位を−０．４５Ｖに制御して培養した場合の測定結果を示し（ｆ）、▲は酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合の測定結果を示し（ｇ）、×は酸化還元電位を制御せずに培養した場合の測定結果を示している（ｈ）。 The measurement result of the cell density is shown in FIG. 7, the measurement result of the sulfate ion concentration is shown in FIG. 8, and the measurement result of the lactate ion concentration is shown in FIG. 7-9, ◆ indicates the measurement results when the redox potential is cultured at + 0.4V (e), and ■ indicates the measurement when the redox potential is controlled at -0.45V. The results are shown in (f), ▲ shows the measurement results when the redox potential is cultured at -0.7 V (g), and x shows the measurement results when cultured without controlling the redox potential. (H).
図７に示す結果から、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合に、培養開始から硫酸還元細菌が増殖し始めるまでの期間である誘導期が短くなることが明らかとなった。一方、酸化還元電位を−０．４５Ｖに制御した場合、＋０．４Ｖに制御した場合には、酸化還元電位を制御しなかった場合と誘導期がほぼ等しかった。対数増殖期の曲線の傾きについては、どの培養条件においてもそれほど大きな差は見られなかった。このことから、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養することで、酸化還元電位を制御せずに培養した場合よりも誘導期を短縮して増殖を促進できることが明らかとなった。 From the results shown in FIG. 7, it was clarified that the induction period, which is a period from the start of culture to the start of proliferation of sulfate-reducing bacteria, is shortened when cultivated while controlling the redox potential to −0.7V. . On the other hand, when the oxidation-reduction potential was controlled to -0.45 V, when the oxidation-reduction potential was controlled to +0.4 V, the induction period was almost equal to the case where the oxidation-reduction potential was not controlled. Regarding the slope of the logarithmic growth phase curve, no significant difference was observed in any culture condition. From this, it was clarified that by culturing with the redox potential controlled at -0.7 V, the induction period can be shortened and the growth can be promoted compared to the case of culturing without controlling the redox potential.
また、図８並びに図９に示されるように、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合には、硫酸イオン濃度と乳酸イオン濃度の減少速度が高まることが明らかとなった。つまり、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合には、酸化還元電位を制御せずに培養した場合よりも誘導期が短縮されて増殖が促進され、その結果として電子受容体である硫酸イオンと炭素源である乳酸イオンの消費速度が高まったものと考えられる。 Further, as shown in FIG. 8 and FIG. 9, it was revealed that when the culture was carried out with the redox potential controlled at −0.7 V, the rate of decrease in sulfate ion concentration and lactate ion concentration increased. That is, in the case of culturing with the redox potential controlled to −0.7 V, the induction period is shortened and the proliferation is promoted compared with the case of culturing without controlling the redox potential, and as a result, the electron acceptor It is thought that the consumption rate of the sulfate ion and the carbon source lactate ion increased.
次に、酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．８Ｖとした場合についても硫酸還元細菌の培養を行い、酸化還元電位を＋０．４Ｖ、−０．４５Ｖ、−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖとした場合の誘導期短縮時間を算出して、酸化還元電位による誘導期短縮時間の変動傾向を検討した。 Next, even when the redox potential is -0.6 V and -0.8 V, the sulfate-reducing bacteria are cultured, and the redox potential is +0.4 V, -0.45 V, -0.6 V, -0. The induction period shortening time in the case of 7V and -0.8V was calculated, and the variation tendency of the induction period shortening time due to the redox potential was examined.
誘導期短縮時間は以下の手順で算出した。まず、酸化還元電位を制御せずに培養した場合の初期菌密度と最大到達菌密度の中点（対数増殖期中点）における培養時間Ｔｃを求め、次に、酸化還元電位を各種制御して培養した場合の初期菌密度と最大到達菌密度の中点（対数増殖期中点）における培養時間Ｔｓを求め、ＴｃとＴｓとの差を求めることで算出した。 The induction period shortening time was calculated by the following procedure. First, the culture time Tc at the midpoint (midpoint of the logarithmic growth phase) of the initial bacterial density and the maximum reached bacterial density when cultivated without controlling the redox potential is obtained, and then the culture is performed with various controlled redox potentials. The culture time Ts at the midpoint (midpoint of the logarithmic growth phase) of the initial bacterial density and the maximum reached bacterial density was calculated, and the difference between Tc and Ts was calculated.
結果を図１０に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ〜−０．８Ｖとすることで誘導期短縮時間が６時間以上になることが明らかとなった。また、しかも、酸化還元電位を−０．６Ｖとした場合よりも−０．８Ｖとした場合の方が誘導期短縮時間が高まり、増殖が促進されやすいことが確認された。このことから、酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．８とした場合であっても誘導期を短縮して増殖速度を高めることができるものと考えられた。しかしながら、酸化還元電位をＸ＜−０．８とすると、対極１０からの水素発生量が増加しすぎて酸化還元電位の制御が正確に行えなくなることが判明した。したがって、酸化還元電位は−０．８Ｖ〜−０．６Ｖとすることが好適であることがわかった。 The results are shown in FIG. It was revealed that the induction period shortening time becomes 6 hours or more by setting the oxidation-reduction potential to -0.6V to -0.8V. In addition, it was confirmed that when the oxidation-reduction potential was set to -0.8 V, the induction period shortening time was increased and the growth was easily promoted. From this, it was considered that even when the oxidation-reduction potential X (V) is set to X ≦ −0.8 , the induction period can be shortened to increase the growth rate. However, the redox potential is X < −0. 8 and Then, control of the amount of hydrogen generation is increased excessively by the redox potential of the counter electrode 10 is found to be not accurately performed. Therefore, it was found that the redox potential is preferably −0.8V to −0.6V.
２ 硫酸還元細菌
３ 酸化還元物質
４,４ａ,４ｂ 培養液
９ 作用極
１０ 対極
１１ 銀・塩化銀電極（参照電極）
１３ 硫酸イオン
１８ 排水
２１ 重金属
2 Sulfate-reducing bacteria 3 Redox substances 4, 4a, 4b Culture solution 9 Working electrode 10 Counter electrode 11 Silver / silver chloride electrode (reference electrode)
13 Sulfate ion 18 Drainage 21 Heavy metal
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