JP5415814B2 - Enzymatic synthesis of theaflavin - Google Patents
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Description
本発明は、原料使用量に対して高効率で簡便に各種テアフラビンを製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for easily producing various theaflavins with high efficiency with respect to the amount of raw material used.
紅茶は茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉を発酵することで製造され、世界中で飲用される。紅茶中には緑茶の代表的なポリフェノール成分であるカテキン類が酸化重合して生成した様々な重合ポリフェノールが多量に存在する。テアフラビン類はその中で最も知られている化合物であり、紅茶中には主に、テアフラビン（ＴＦ１、一般式（IV）のＲ１およびＲ２は水素原子）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ、一般式（IV）のＲ１はガロイル基、Ｒ２は水素原子）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ、一般式（IV）のＲ１は水素原子、Ｒ２はガロイル基）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３、一般式（IV）のＲ１およびＲ２はガロイル基）の４種類が存在する。これら４種のテアフラビンの構造を一般式（IV）に示した。 Black tea is produced by fermenting tea ( Camellia sinensis ) leaves and is drunk worldwide. Black tea contains a large amount of various polymerized polyphenols produced by oxidative polymerization of catechins, which are typical polyphenol components of green tea. Theaflavins is a compound that is best known among them, mainly during black tea theaflavin (R 1 and R 2 of TF1, the general formula (IV) is a hydrogen atom), theaflavin 3-O-gallate (TF 2 a , R 1 in the general formula (IV) is a galloyl group, R 2 is a hydrogen atom), theaflavin 3′-O-gallate (TF2B, R 1 in the general formula (IV) is a hydrogen atom, R 2 is a galloyl group), theaflavin There are four types of 3,3′-di-O-gallate (TF3, R 1 and R 2 in the general formula (IV) are galloyl groups). The structures of these four theaflavins are shown in general formula (IV).
上記した４種類のテアフラビンは、緑茶中に含まれるカテキン類が、茶葉中に存在する酵素（ポリフェノールオキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼ）を触媒として酸化されることにより生成する。ＴＦ１はエピガロカテキン（ＥＧＣ、一般式（Ｖ）のＲ３は水酸基、Ｒ４は水素原子）とエピカテキン（ＥＣ、一般式（Ｖ）のＲ３、Ｒ４はともに水素原子）、ＴＦ２Ａはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ、一般式（Ｖ）のＲ３は水酸基、Ｒ４はガロイル基）とＥＣ、ＴＦ２ＢはＥＧＣとエピカテキンガレート（ＥＣｇ、一般式（Ｖ）のＲ３は水素原子、Ｒ４はガロイル基）、そしてＴＦ３は、ＥＧＣｇとＥＣｇからそれぞれ生成される。カテキン類の構造を一般式（Ｖ）に示した。 The four types of theaflavins described above are produced by oxidizing catechins contained in green tea using an enzyme (polyphenol oxidase and / or peroxidase) present in tea leaves as a catalyst. TF1 is epigallocatechin (EGC, R 3 in the general formula (V) is a hydroxyl group, R 4 is a hydrogen atom) and epicatechin (EC, R 3 and R 4 in the general formula (V) are both hydrogen atoms), and TF2A is Epigallocatechin gallate (EGCg, R 3 in formula (V) is a hydroxyl group, R 4 is a galloyl group) and EC, TF2B is EGC and epicatechin gallate (ECg, R 3 in formula (V) is a hydrogen atom, R 4 is a galloyl group), and TF3 is produced from EGCg and ECg, respectively. The structure of catechins is shown in general formula (V).
テアフラビンは紅茶中の赤色色素成分として飲用時の水色や渋味などに重要な役割を担う成分として知られてきたが、近年、その抗酸化活性や糖吸収抑制（非特許文献１、２）、抗菌活性（非特許文献３）など種々の生理活性を有することが明らかとなり、多くの研究がなされている。 Theaflavin has been known as a component that plays an important role in the light blue color and astringency at the time of drinking as a red pigment component in black tea. In recent years, its antioxidant activity and sugar absorption suppression (Non-Patent Documents 1 and 2), It has become clear that it has various physiological activities such as antibacterial activity (Non-patent Document 3), and many studies have been made.
テアフラビンを取得する方法としては、紅茶葉から抽出する方法、フェリシアン化カリウムを用いた化学的合成法（非特許文献４）、ペルオキシダーゼを用いた酵素的合成法（非特許文献５、特許文献１）、タンナーゼ処理した生茶葉のスラリーを発酵させてテアフラビンを豊富に含む茶抽出物を製造する方法（特許文献２）、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養液を利用した合成法（特許文献３）、ポリフェノールオキシダーゼを用いて酵素的に合成する方法（特許文献４）などたくさんの手法が提案されてきた。 As a method for obtaining theaflavin, a method of extracting from tea leaves, a chemical synthesis method using potassium ferricyanide (Non-Patent Document 4), an enzymatic synthesis method using peroxidase (Non-Patent Document 5, Patent Document 1), A method for producing a tea extract rich in theaflavin by fermenting a tannase-treated raw tea leaf slurry (Patent Document 2), a synthesis method using a plant cell culture solution having peroxidase activity (Patent Document 3), polyphenol oxidase Many methods have been proposed, such as a method of enzymatically synthesizing using a protein (Patent Document 4).
テアフラビンの合成について記載された先行文献を検証すると、まず、紅茶葉から抽出する方法では、茶葉中に含まれるテアフラビン総量は茶葉重量に対して多くても１％程度と、その量は極微量であることから、多量のテアフラビンを紅茶葉から抽出し精製することは容易ではない。また、化学合成法ではテアフラビン生成以外の酸化反応物も多く生成してしまうため、使用した原料に対するテアフラビンの変換効率は低かった。 When verifying the prior literature describing the synthesis of theaflavin, first, in the method of extracting from tea leaves, the total amount of theaflavins contained in tea leaves is about 1% at most with respect to the weight of tea leaves, the amount is extremely small Therefore, it is not easy to extract and purify a large amount of theaflavin from tea leaves. In addition, the chemical synthesis method generates a large amount of oxidation reaction products other than theaflavin generation, and the conversion efficiency of theaflavin with respect to the used raw material was low.
そこで、テアフラビンを簡便で原料使用量に対して高効率に合成する方法に関し、本発明者らは、まず、化学的な反応を用いた化学合成法よりも基質特異性を有する酵素を用いた方が、原料であるカテキン類をテアフラビンに高効率で変換する条件を見出せるだろうと考えた。 Therefore, regarding a method for synthesizing theaflavin simply and efficiently with respect to the amount of raw material used, the present inventors firstly used a method using an enzyme having substrate specificity rather than a chemical synthesis method using a chemical reaction. However, it was thought that the conditions for converting catechins as raw materials to theaflavins with high efficiency could be found.
酵素を用いる従来法としては、ポリフェノールオキシダーゼを用いてＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の混合物を合成する方法が特許文献４に開示されているが、テアフラビンの生成効率が低く、また、目的とするテアフラビン以外の酸化物も多く生成してしまうという欠点がある。さらに、テアフラビン混合物として生成するので、例えば、着色剤として利用しようとした場合に、色調が異なるＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３を所望の比率で混合することが難しい。また、各種テアフラビンの生理活性を比較しようとした場合や特定のテアフラビンの生理活性を調べようとした場合には、得られた混合物からテアフラビンを個別に分離精製する必要が生じ、操作が煩雑になるばかりか精製に長時間を要してしまう。
このように、テアフラビン混合物の形態ではその用途が大幅に制限を受けてしまうことから、各種テアフラビンを個別に生成する簡便な方法が求められている。
As a conventional method using an enzyme, a method of synthesizing a mixture of TF1, TF2A, TF2B and TF3 using polyphenol oxidase is disclosed in Patent Document 4, but the production efficiency of theaflavin is low, and the target theaflavin is used. There is a disadvantage that many oxides other than the above are also generated. Furthermore, since it is produced as a theaflavin mixture, it is difficult to mix TF1, TF2A, TF2B, and TF3 having different color tones in a desired ratio when, for example, an attempt is made to use them as a colorant. Also, when trying to compare the physiological activities of various theaflavins, or when trying to examine the physiological activity of a specific theaflavin, it is necessary to separate and purify theaflavins from the resulting mixture, which complicates the operation. Not only will purification take a long time.
As described above, since the use of the theaflavin mixture is greatly limited, a simple method for individually generating various theaflavins is required.
各種テアフラビンを個別に生成する方法としては、カテキン類にペルオキシダーゼを作用させる方法が特許文献１および非特許文献５に開示されているが、テアフラビンの収率が数％〜十数％と低く、テアフラビン以外の酸化物が多く生成してしまうために分離精製操作に時間と手間を要する。また、植物細胞培養物中のペルオキシダーゼを用いる方法が報告されているが（特許文献３）、テアフラビンの収率が低いといった欠点のほか、植物細胞を培養するのに手間と日数がかかるという問題がある。さらに、どちらの方法も過酸化水素を添加しなければならず、その操作にも細心の注意を払う必要があるため、簡便な酵素合成法とは言い難い。その他、タンナーゼ処理後の緑茶スラリーを酵素酸化する方法（特許文献２）では高変換効率でＴＦ１を得ることができるものの、酵素反応を２段階行う必要性があるばかりか、生成したＴＦ１を分離精製する操作が煩雑である。さらに、この方法ではＴＦ１以外のテアフラビン類への適用ができない。このように、各種テアフラビンを個別に生成する方法が種々考えられてはきたものの、変換効率や操作性、目的とするテアフラビンが制限されるといった問題点を抱えており、満足のいく方法ではなかった。 As a method for individually producing various theaflavins, a method of causing peroxidase to act on catechins is disclosed in Patent Document 1 and Non-Patent Document 5, but the yield of theaflavin is as low as several% to several tens%, and theaflavin is low. Since a large amount of oxides other than those are generated, time and labor are required for the separation and purification operation. Further, although a method using peroxidase in a plant cell culture has been reported (Patent Document 3), in addition to the disadvantage that the yield of theaflavin is low, there are problems that it takes time and labor to cultivate plant cells. is there. Furthermore, both methods require addition of hydrogen peroxide, and since it is necessary to pay close attention to the operation, it is difficult to say that it is a simple enzyme synthesis method. In addition, in the method of enzymatic oxidation of tannase-treated green tea slurry (Patent Document 2), although TF1 can be obtained with high conversion efficiency, it is not only necessary to carry out the enzyme reaction in two stages, but the produced TF1 is separated and purified. The operation to perform is complicated. Furthermore, this method cannot be applied to theaflavins other than TF1. Thus, although various methods for individually generating various theaflavins have been considered, there are problems such as conversion efficiency and operability, and the target theaflavin is limited, which is not a satisfactory method. .
そこで、本発明の目的は、各種テアフラビンを個別に酵素合成する方法において、原料であるカテキン類を効率よくテアフラビンに変換させることを特徴とする、高収率で簡便にテアフラビンを製造する方法を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for easily producing theaflavins in a high yield, characterized by efficiently converting catechins as raw materials into theaflavins in a method for enzymatic synthesis of various theaflavins individually. It is to be.
そして上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、目的のテアフラビンの原料となるピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、それら２種類のカテキンをポリフェノールオキシダーゼとｐＨ４．０〜６．０の条件下で反応させるだけで、従来よりもはるかに効率よくカテコール型カテキンを各種テアフラビンへ変換できることを見出した。 And as a result of intensive studies to achieve the above-mentioned purpose, pyrogallol-type catechin and catechol-type catechin, which are raw materials of the target theaflavin, are used at a molar ratio of 3.5: 1 to 6: 1, and these two types of catechins It has been found that catechol-type catechins can be converted to various theaflavins much more efficiently than before by simply reacting with polyphenol oxidase under the conditions of pH 4.0 to 6.0.
即ち、請求項１記載の本発明は、一般式（Ｉ）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることを特徴とする一般式（III）で表されるテアフラビンの製造方法を提供するものである。 That is, the present invention according to claim 1 uses pyrogallol type catechin represented by general formula (I) and catechol type catechin represented by general formula (II) in a molar ratio of 3.5: 1 to 6: 1. And providing a method for producing theaflavin represented by the general formula (III), wherein polyphenol oxidase is allowed to act at pH 4.0 to 6.0.
また、請求項２記載の本発明は、ポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用したときの減少速度（モル／分）と（−）ＥＧＣに作用したときの減少速度（モル／分）の比が以下に示す数値となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いる請求項１に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
＜数値比率＞
（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）≧３．５４
The present invention according to claim 2 is characterized in that the ratio of the rate of decrease (mol / min) when polyphenol oxidase acts on (-) EC and the rate of decrease (mol / min) when acted on (-) EGC. The method for producing theaflavin according to claim 1, wherein a polyphenol oxidase having a numerical value shown below is used.
<Numerical ratio>
(−) EC decrease rate (mol / min) / (−) EGC decrease rate (mol / min) ≧ 3.54
また、請求項３記載の本発明は、ポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼを用いる請求項２に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。 Moreover, this invention of Claim 3 provides the manufacturing method of theaflavin of Claim 2 using tyrosinase as polyphenol oxidase.
また、請求項４記載の本発明は、一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１０マイクロモルに対してポリフェノールオキシダーゼを２０００〜７０００Ｕ作用させる請求項３に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。 Moreover, this invention of Claim 4 provides the manufacturing method of theaflavin of Claim 3 which makes polyphenol oxidase act 2000-7000 U with respect to 10 micromol of catechol-type catechin represented by general formula (II). Is.
また、請求項５記載の本発明は、一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１ミリモルに対して反応系の総液量が１リットル以上である請求項４に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。 The present invention according to claim 5 is the method for producing theaflavin according to claim 4, wherein the total amount of the reaction system is 1 liter or more with respect to 1 mmol of the catechol-type catechin represented by the general formula (II). Is to provide.
また、請求項６記載の本発明は、酵素反応の時間が１０〜３０分間である請求項５に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。 Moreover, this invention of Claim 6 provides the manufacturing method of theaflavin of Claim 5 whose time of enzyme reaction is 10 to 30 minutes.
また、請求項７記載の本発明は、酵素反応のｐＨがｐＨ４．０〜５．５である請求項６に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。 The present invention according to claim 7 provides the method for producing theaflavin according to claim 6, wherein the pH of the enzyme reaction is pH 4.0 to 5.5.
本発明におけるピロガロール型カテキンとは、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートを代表とする一般式（Ｖ）のＲ３が水酸基である構造を有する化合物、カテコール型カテキンとは、エピカテキン、カテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレートを代表とする一般式（Ｖ）のＲ３が水素原子である構造を有する化合物を意味する。 The pyrogallol-type catechin in the present invention is a compound having a structure in which R 3 in the general formula (V) represented by epigallocatechin, gallocatechin, epigallocatechin gallate, and gallocatechin gallate is a hydroxyl group, It means a compound having a structure in which R 3 in the general formula (V) represented by epicatechin, catechin, epicatechin gallate or catechin gallate is a hydrogen atom.
本発明におけるテアフラビンとは、テアフラビン（ＴＦ１）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３）、ネオテアフラビン（（−）ＥＧＣと（＋）Ｃ）、ネオテアフラビン ３−Ｏ−ガレート（（−）ＥＧＣｇと（＋）Ｃ）、イソテアフラビン（（＋）ＧＣと（−）ＥＣ）、イソテアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（（＋）ＧＣと（−）ＥＣｇ）を代表とする一般式（III）に示す構造を有する化合物を意味する。 The theaflavin in the present invention is theaflavin (TF1), theaflavin 3-O-gallate (TF2A), theaflavin 3'-O-gallate (TF2B), theaflavin 3,3'-di-O-gallate (TF3), neotheaflavin ((−) EGC and (+) C), neotheaflavin 3-O-gallate ((−) EGCg and (+) C), isotheaflavin ((+) GC and (−) EC), isotheaflavin 3′- It means a compound having a structure represented by the general formula (III) represented by O-gallate ((+) GC and (−) ECg).
本発明におけるテアフラビンの酵素合成法は、特別な装置を必要とせず、一般的な製造設備を利用して簡便でありながら、従来法と比較してはるかに効率よくカテコール型カテキンをテアフラビンに変換することができる。すなわち、テアフラビンを高効率で製造することができる。 The enzymatic synthesis method of theaflavin according to the present invention does not require a special apparatus and is simple using a general production facility, but converts catechol-type catechin into theaflavin much more efficiently than the conventional method. be able to. That is, theaflavin can be produced with high efficiency.
以下において、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明におけるテアフラビンの製造方法は、カテコール型カテキン使用量に対する各種テアフラビンへの変換効率が従来よりも顕著に高く、例えば、ＴＦ１の従来法の変換率は３０％程度、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂ、ＴＦ３の場合は数％程度であったところ、本発明におけるテアフラビンの生成効率は、カテコール型カテキン使用量の好ましくは３５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。詳細には、ＴＦ１の場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂの場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、ＴＦ３の場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは３５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。なお、この場合のカテコール型カテキン使用量とは、反応液に添加したカテコール型カテキン量を示す。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
First, the production method of theaflavin in the present invention has remarkably higher conversion efficiency to various theaflavins with respect to the amount of catechol-type catechin used, for example, the conversion rate of the conventional method of TF1 is about 30%, TF2A, TF2B, TF3 In this case, the theaflavin production efficiency in the present invention is preferably 35% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, most preferably 90% of the amount of catechol-type catechin used. % Or more. Specifically, in the case of TF1, preferably 75% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and in the case of TF2A or TF2B, preferably 50% of the amount of catechol-type catechin used. In the case of TF3, the amount of catechol-type catechin used is preferably 35% or more, more preferably 70% or more, and still more preferably 80% or more. In this case, the amount of catechol-type catechin used indicates the amount of catechol-type catechin added to the reaction solution.
本発明におけるテアフラビンの製造法は、ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることによって、従来法よりも効率よくカテコール型カテキンをテアフラビンに変換するものである。詳しくは、一般式（Ｉ）及び一般式（II）で表されるカテキン類を主原料とし、ｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中でポリフェノールオキシダーゼを作用させることによって、一般式（III）で表される各種テアフラビンを得るものである。 The method for producing theaflavin in the present invention uses pyrogallol-type catechin and catechol-type catechin at a molar ratio of 3.5: 1 to 6: 1, and causes polyphenol oxidase to act at a pH of 4.0 to 6.0. It converts catechol-type catechin into theaflavin more efficiently. Specifically, catechins represented by general formula (I) and general formula (II) are used as main raw materials, and polyphenol oxidase is allowed to act in a buffer solution having a pH of 4.0 to 6.0, whereby general formula (III) To obtain various theaflavins represented by
本発明の基本的な態様は、一般式（I）のピロガロール型カテキンの一種と一般式（II）のカテコール型カテキンの一種を原料に用いてテアフラビンを得る方法である。 A basic aspect of the present invention is a method for obtaining theaflavin using as a raw material one kind of pyrogallol type catechin of general formula (I) and one kind of catechol type catechin of general formula (II).
本発明におけるピロガロール型カテキンとは、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートを代表とする一般式（Ｉ）の構造を有する化合物、カテコール型カテキンとは、エピカテキン、カテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレートを代表とする一般式（II）の構造を有する化合物を意味する。 The pyrogallol-type catechin in the present invention is epigallocatechin, gallocatechin, epigallocatechin gallate, a compound having a structure of general formula (I) typified by gallocatechin gallate, and catechol-type catechin means epicatechin, catechin, epi Catechin gallate means a compound having a structure of general formula (II) typified by catechin gallate.
また、本発明におけるテアフラビンとは、テアフラビン（ＴＦ１）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３）、ネオテアフラビン、ネオテアフラビン ３−Ｏ−ガレート、イソテアフラビン、イソテアフラビン ３’−Ｏ−ガレートを代表とする一般式（III）に示す構造を有する化合物である。 The theaflavins in the present invention are theaflavin (TF1), theaflavin 3-O-gallate (TF2A), theaflavin 3′-O-gallate (TF2B), theaflavin 3,3′-di-O-gallate (TF3), Neotheaflavin, neotheaflavin 3-O-gallate, isotheaflavin, isotheaflavin 3'-O-gallate is a compound having a structure represented by the general formula (III).
また、原料として用いるカテキン類が高純度であるほど得られるテアフラビンの量は多く、さらに反応による副生成物の量が低下するため好ましい。 Further, the higher the purity of the catechins used as a raw material, the greater the amount of theaflavin obtained, and the lower the amount of by-products produced by the reaction, which is preferable.
得られたテアフラビンは天然の赤色色素であるため食品や飲料の着色剤としてはもちろんのこと、抗酸化剤や抗菌剤として、あるいは、血糖上昇抑制剤、血圧上昇抑制剤、脂質代謝改善剤、抗ガン剤等の生理活性剤として、さらに、渋み添加剤等の風味改善剤としての応用が考えられる。 The theaflavin obtained is a natural red pigment, so it can be used not only as a food or beverage colorant, but also as an antioxidant or antibacterial agent, or as an antihyperglycemic agent, antihypertensive agent, lipid metabolism improving agent, As a bioactive agent such as a cancer agent, an application as a flavor improving agent such as an astringent additive is conceivable.
一般式（Ｉ）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させるだけでも各種テアフラビンを高効率で得ることはできるが、ポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用したときの減少速度（モル／分）と、等量のポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＧＣに作用したときの減少速度（モル／分）の比が３．５４以上となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いることでテアフラビンへの変換効率を上げることができる。この特徴を有するポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼ、特にマッシュルーム由来のチロシナーゼが挙げられるが、この特徴を示す酵素であれば何であっても良く、また２種以上のポリフェノールオキシダーゼの混合物でもよく、特に制限されない。ポリフェノールオキシダーゼの具体例としては、チロシナーゼ、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼなどが挙げられる。
酵素を作用させる方法は特に制限されないが、例えば市販の酵素粉末を直接反応系に添加する方法、あるいは酵素粉末を水で溶解後、反応系に添加する方法が挙げられる。
The pyrogallol catechin represented by the general formula (I) and the catechol type catechin represented by the general formula (II) are used at a molar ratio of 3.5: 1 to 6: 1, and the polyphenol oxidase is adjusted to pH 4.0-6. Although various theaflavins can be obtained with high efficiency simply by acting at 0, the rate of decrease (mol / min) when polyphenol oxidase is applied to (-) EC and the equivalent amount of polyphenol oxidase to (-) EGC The conversion efficiency to theaflavin can be increased by using polyphenol oxidase such that the ratio of the rate of decrease (mol / min) when acting is 3.54 or more. Examples of the polyphenol oxidase having this characteristic include tyrosinase, particularly mushroom-derived tyrosinase, and any enzyme exhibiting this characteristic may be used, and a mixture of two or more polyphenol oxidases may be used without any particular limitation. Specific examples of polyphenol oxidase include tyrosinase, laccase, bilirubin oxidase and the like.
The method for allowing the enzyme to act is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding commercially available enzyme powder directly to the reaction system, or a method of dissolving the enzyme powder in water and then adding it to the reaction system.
ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンの使用モル比は３．５：１〜６：１であるが、より高い変換効率を得るためにはその使用モル比は４：１〜５．５：１が好ましく、より好ましくは４．５：１〜５：１である。カテコール型カテキンに対するピロガロール型カテキンの使用モル比が３．５未満であるとテアフラビンへの変換効率が低くなる。また、モル比が６を超えると高価な原料であるカテキンを多量に使用しなければならず経済的に不利となる上、副生成物の量も増加して分離精製操作が煩雑になり好ましくない。 The use molar ratio of pyrogallol type catechin and catechol type catechin is 3.5: 1 to 6: 1. In order to obtain higher conversion efficiency, the use molar ratio is preferably 4: 1 to 5.5: 1. More preferably, it is 4.5: 1 to 5: 1. If the molar ratio of pyrogallol catechin to catechol type catechin is less than 3.5, the conversion efficiency to theaflavin is lowered. On the other hand, if the molar ratio exceeds 6, a large amount of expensive catechins must be used, which is economically disadvantageous, and the amount of by-products increases and the separation and purification operation becomes complicated, which is not preferable. .
また、本発明で使用するポリフェノールオキシダーゼは、（−）ＥＣに作用させたときの減少速度（モル／分）と（−）ＥＧＣに作用させたときの減少速度（モル／分）の比を３．５４以上にするとカテコール型カテキン使用量に対して少なくとも３５％以上がテアフラビンに変換されるが、より高い変換効率を得るためにはその比が望ましくは４．２以上、より望ましくは５．４以上、さらに望ましくは６．８以上、いっそう望ましくは８．６以上、最も望ましくは１１．２以上がよい。これらの数値を示すポリフェノールオキシダーゼを用いるとカテコール型カテキン使用量に対して少なくとも４０％以上、より望ましくは５０％以上、さらに望ましくは６０％以上、いっそう望ましくは７０％以上および最も望ましくは８０％以上の変換効率でテアフラビンが得られるため好適である。（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比が３．５４未満のポリフェノールオキシダーゼではテアフラビンへの変換効率が低下してしまうため好ましくない。例えば、この比が３．０のポリフェノールオキシダーゼを用いた場合テアフラビン生成量は減少し、ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の中で最も変換効率の低いＴＦ３ではその効率が３５％に満たない。 In addition, the polyphenol oxidase used in the present invention has a ratio of the rate of decrease (mol / min) when acting on (−) EC to the rate of decrease (mol / min) when acted on (−) EGC. When it is .54 or more, at least 35% or more is converted to theaflavin with respect to the amount of catechol-type catechin used, but in order to obtain higher conversion efficiency, the ratio is preferably 4.2 or more, more preferably 5.4. More preferably, it is 6.8 or more, more preferably 8.6 or more, and most preferably 11.2 or more. When polyphenol oxidase showing these values is used, it is at least 40% or more, more desirably 50% or more, more desirably 60% or more, even more desirably 70% or more and most desirably 80% or more, based on the amount of catechol-type catechin used. Theaflavin can be obtained with a conversion efficiency of 5%, which is preferable. A polyphenol oxidase having a ratio of (−) EC reduction rate (mol / min) / (−) EGC reduction rate (mol / min) of less than 3.54 is not preferable because the conversion efficiency to theaflavin is lowered. For example, when polyphenol oxidase having a ratio of 3.0 is used, the amount of theaflavin produced decreases, and the efficiency of TF3 having the lowest conversion efficiency among TF1, TF2A, TF2B and TF3 is less than 35%.
また、酵素反応のｐＨを４．０〜６．０、望ましくは４．５〜５．５、より望ましくは４．５〜５．０に調整するとカテコール型カテキン使用量に対して高い変換効率でテアフラビンが得られるため好ましい。ｐＨ４．０未満あるいはｐＨ６．０を超えるとテアフラビンへの変換効率が著しく低下してしまう。例えば、本発明で使用するポリフェノールオキシダーゼのうちチロシナーゼ（マッシュルーム由来）の至適ｐＨはｐＨ６〜７であるが、本発明法においては、チロシナーゼの至適ｐＨ６．５で酵素反応させるとテアフラビン生成量は著しく低減してしまう。 Further, when the pH of the enzyme reaction is adjusted to 4.0 to 6.0, desirably 4.5 to 5.5, more desirably 4.5 to 5.0, the conversion efficiency is high with respect to the amount of catechol type catechin used. Since theaflavin is obtained, it is preferable. If the pH is less than 4.0 or exceeds pH 6.0, the conversion efficiency to theaflavin is significantly reduced. For example, among the polyphenol oxidases used in the present invention, the optimum pH of tyrosinase (derived from mushrooms) is pH 6-7, but in the method of the present invention, when the enzyme reaction is carried out at the optimum pH of tyrosinase 6.5, It will be significantly reduced.
また、本発明で作用させる酵素量は、他の条件（原料となるカテキン組成比、酵素反応のｐＨ、反応液中のカテキン濃度、反応温度、反応時間など）に合わせテアフラビンへの変換効率が高くなるよう適宜決定すればよいが、通常は、使用するカテコール型カテキン１０マイクロモルに対して２０００〜７０００Ｕが好ましく、５０００〜７０００Ｕがより好ましい。好ましい範囲内では、例えば市販のＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを使用した場合、原料使用総重量／酵素使用重量の比が１／０．００１以上１／０．１未満となる。使用するカテコール型カテキン１０マイクロモルに対して２０００〜７０００Ｕの酵素を作用させるとテアフラビンへの変換効率は、カテコール型カテキン使用量の５０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上となる。なお、酵素単位１ＵはｐＨ６．５、２５℃の条件下で、３ｍＬの０．５ｍＭチロシン溶液の２８０ｎｍの吸光度を１分間に０．００１上昇させる酵素量を表す。 In addition, the amount of the enzyme to be acted on in the present invention is high in the conversion efficiency to theaflavin according to other conditions (the catechin composition ratio as a raw material, the pH of the enzyme reaction, the catechin concentration in the reaction solution, the reaction temperature, the reaction time, etc.). However, it is usually preferably 2000 to 7000 U, more preferably 5000 to 7000 U with respect to 10 μmol of catechol-type catechin used. Within a preferable range, for example, when a commercially available SIGMA tyrosinase is used, the ratio of the total raw material use weight / enzyme use weight is 1 / 0.001 or more and less than 1 / 0.1. When the enzyme of 2000 to 7000 U is allowed to act on 10 micromoles of catechol type catechin used, the conversion efficiency to theaflavin is 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more of the amount of catechol type catechin used. Become. Enzyme unit 1U represents the amount of enzyme that increases the absorbance at 280 nm of 3 mL of 0.5 mM tyrosine solution by 0.001 per minute under the conditions of pH 6.5 and 25 ° C.
さらに、カテコール型カテキン１ミリモルに対して反応液総量を１リットル以上に調整するとカテコール型カテキンからテアフラビンに効率よく変換することができるため好ましい。 Furthermore, it is preferable to adjust the total amount of the reaction solution to 1 liter or more with respect to 1 mmol of catechol-type catechin because catechol-type catechin can be efficiently converted into theaflavin.
酵素反応時間は１０〜１８０分が好ましい。より好ましくは１０〜３０分、さらに好ましくは、４０℃の条件下で、２０〜３０分の反応を行うとカテコール型カテキン使用量に対して５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは８５％以上の変換効率でテアフラビンが得られ、反応にかかる時間が短縮されることから、操作が迅速となり好ましい。 The enzyme reaction time is preferably 10 to 180 minutes. More preferably 10 to 30 minutes, and even more preferably, when the reaction is performed at 40 ° C. for 20 to 30 minutes, the amount of catechol-type catechin used is 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80 %, More preferably 85% or more, theaflavin can be obtained with a conversion efficiency, and the reaction time is shortened.
上記のように、ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用することによって得られたテアフラビンを、吸着樹脂などのカラムクロマトグラフィーを用いた分離法により精製すれば、より純度の高いテアフラビンの精製品を得ることができる。 As described above, pyrogallol-type catechin and catechol-type catechin are used at a molar ratio of 3.5: 1 to 6: 1, and theaflavins obtained by acting polyphenol oxidase at pH 4.0 to 6.0 are adsorbed. A purified product of theaflavin with higher purity can be obtained by purification by a separation method using column chromatography such as resin.
吸着樹脂としては、吸着能力の高い合成吸着樹脂が好適である。具体的には、合成吸着樹脂を充填したカラムに、酵素反応後の溶液を通液し、テアフラビンを樹脂に吸着させ、有機溶媒を用いて目的のテアフラビンを樹脂より溶出し、精製テアフラビンを得る。この操作は通常、合成吸着樹脂を充填したカラムを用いて行うが、カラムを用いずにバッチ式で行うこともできる。 As the adsorption resin, a synthetic adsorption resin having a high adsorption capability is suitable. Specifically, the solution after the enzyme reaction is passed through a column packed with a synthetic adsorption resin, the theaflavin is adsorbed to the resin, and the desired theaflavin is eluted from the resin using an organic solvent to obtain purified theaflavin. This operation is usually performed using a column packed with a synthetic adsorption resin, but can also be performed in a batch manner without using a column.
この際使用可能な合成吸着樹脂としては、スチレンジビニルベンゼン系、メタクリル系、スチレン系、修飾スチレン系、アクリル系、アミド系、デキストラン系、セルロース系、ポリビニル系等の樹脂が使用可能であり、市販品では、例えばスチレンジビニルベンゼン系のダイアイオンＨＰ−２０、ダイアイオンＨＰ−２１、ＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＣＨＰ５５Ａ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ５５Ｙ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２０Ａ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２０Ｙ（以上、三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−４（以上、米国ローム・アンド・ハース社製）、メタクリル系のダイアイオンＨＰ−２ＭＧ（三菱化学（株）製）、スチレン系としてアンバーライトＸＡＤ−１６（米国ローム・アンド・ハース社製）、修飾スチレン系としてセパビーズｓｐ２０７（三菱化学（株）製）、アクリル系のダイアイオンＷＫ−２０（三菱化学（株）製）、アミド系のＸＡＤ−１１（米国ローム・アンド・ハース社製）、デキストラン系のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、セルロース系のＩＮＤＩＯＮ ＤＳ−３（フェニックスケミカルズ社製）、ポリビニル系のトヨパールＨＷ−４０（東ソー（株）製）等を挙げることができるがこれに限定されない。 Synthetic adsorption resins that can be used at this time include styrene divinylbenzene, methacrylic, styrene, modified styrene, acrylic, amide, dextran, cellulose, and polyvinyl resins that are commercially available. Examples of the product include styrene divinylbenzene-based Diaion HP-20, Diaion HP-21, MCI (registered trademark) GEL CHP55A, MCIGEL CHP55Y, MCIGEL CHP20A, MCIGEL CHP20Y (above, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-4 (above, manufactured by Rohm and Haas, USA), Methacrylic Diaion HP-2MG (manufactured by Mitsubishi Chemical), Amberlite XAD-16 (Rohm, USA) as styrene・ And Haas Sepa beads sp207 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), acrylic Diaion WK-20 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), amide XAD-11 (Rohm and Haas, USA), Examples thereof include dextran-based Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia), cellulose-based INDION DS-3 (manufactured by Phoenix Chemicals), and polyvinyl-based Toyopearl HW-40 (manufactured by Tosoh Corporation). It is not limited.
また、他の吸着剤としてはシリカゲル系が使用可能であり、例えば市販品ではシリカゲル４０、シリカゲル６０（球状）（以上、関東化学（株）製）、シリカゲル中圧分取用（山善株式会社）等が挙げられ、ＯＤＳなどアルキル基が化学結合したタイプとしてクロマトレックス（富士シリシア化学（株）製）、オクタデシル中圧分取用（山善株式会社）等を挙げることが出来るが、これに限定されない。 As other adsorbents, silica gel can be used. For example, commercially available silica gel 40, silica gel 60 (spherical) (above, manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), silica gel medium pressure fractionation (Yamazen Co., Ltd.) Examples of the type in which an alkyl group such as ODS is chemically bonded include Chromatrex (manufactured by Fuji Silysia Chemical Co., Ltd.), octadecyl medium pressure fractionation (Yamazen Co., Ltd.), etc., but are not limited thereto. .
溶出に用いる溶媒としては、水の他に例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、アセトニトリルなど、水と任意に混和する有機溶媒を用いることができる。 As a solvent used for elution, an organic solvent arbitrarily mixed with water such as methanol, ethanol, propanol, acetone, acetonitrile, etc. can be used in addition to water.
樹脂と溶出溶媒の組み合わせとしては、上記のものを任意に組み合わせて使用することができるが、飲料などの用途に供する場合は食品衛生法の観点から、特に親水性ビニルポリマー樹脂に吸着させた後、エタノール（含水しても良い）で溶出するのが好ましい。この溶出液を通常の方法で乾固、あるいは結晶化し、目的のテアフラビンを得ることができる。 As a combination of the resin and the elution solvent, any of the above can be used in combination, but when used for beverages and the like, from the viewpoint of the food hygiene law, especially after adsorbing to the hydrophilic vinyl polymer resin It is preferable to elute with ethanol (which may contain water). This eluate can be dried or crystallized by a conventional method to obtain the desired theaflavin.
テアフラビンのうち、ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の４成分は以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ）を用いて定量分析することができる。定量分析には常法に従って調製した標準品を用いればよいが、市販されている各テアフラビン試薬（長良サイエンス株式会社製、和光純薬工業株式会社製など）を標準品として利用することもできる。 Among the theaflavins, the four components TF1, TF2A, TF2B, and TF3 can be quantitatively analyzed using high performance liquid chromatography (hereinafter, HPLC) under the following conditions. For the quantitative analysis, a standard product prepared according to a conventional method may be used, but commercially available theaflavin reagents (manufactured by Nagara Science Co., Ltd., Wako Pure Chemical Industries, etc.) can also be used as standard products.
（テアフラビンの測定条件）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＵＧ１２０ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ（粒子径３μｍ、ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸＝１００／０．０５（Ｂ）アセトニトリル／酢酸エチル＝９８．５／１．５、（Ａ）８１％（Ｂ）１９％で０〜１３．３分まで保持、１３．３〜２６．６分で（Ｂ）１９％→２３％まで直線的にグラジエント溶出、その後、（Ａ）５０％（Ｂ）５０％で３分間カラム洗浄、初期条件で５分間平衡化。流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出波長：２８０ｎｍ、注入量：２０μＬ。
(Theaflavin measurement conditions)
Column: CAPCELL PAK UG120 4.6 mmI. D. × 100 mm (particle diameter 3 μm, SHISEIDO), mobile phase: (A) ultrapure water / phosphoric acid = 100 / 0.05 (B) acetonitrile / ethyl acetate = 98.5 / 1.5, (A) 81% ( B) 19% hold from 0 to 13.3 minutes, 13.3 to 26.6 minutes (B) linear elution from 19% to 23%, then (A) 50% (B) 50% Wash column for 3 minutes, equilibrate for 5 minutes at initial conditions. Flow rate: 1.5 mL / min, column temperature: 25 ° C., detection wavelength: 280 nm, injection volume: 20 μL.
カテキン類のうち、エピカテキン、カテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレート、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートの８成分は以下の条件によりＨＰＬＣで定量分析することができる。定量分析には常法に従って調製した標準品を用いればよいが、市販されている各カテキン試薬（ＳＩＧＭＡ製、ナカライテスク株式会社製など）を標準品として利用することもできる。 Among the catechins, eight components of epicatechin, catechin, epigallocatechin, gallocatechin, epicatechin gallate, catechin gallate, epigallocatechin gallate and gallocatechin gallate can be quantitatively analyzed by HPLC under the following conditions. For quantitative analysis, a standard product prepared according to a conventional method may be used, but commercially available catechin reagents (manufactured by SIGMA, Nacalai Tesque, etc.) can also be used as standard products.
（カテキン類の測定条件）
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ（粒子径５μｍ、関東化学）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸／アセトニトリル＝１００／０．０５／２．５（Ｂ）超純水／リン酸／アセトニトリル／メタノール＝１００／０．０５／２．５／５０、（Ａ）１００％で０〜３分まで保持、３〜２５分で（Ｂ）０％→１００％まで直線的にグラジエント溶出、２５〜２６分で（Ａ）１００％に戻し、２６〜３０分まで（Ａ）１００％で平衡化、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２３０ｎｍ、注入量：１０μＬ。
(Measurement conditions for catechins)
Column: Mightysil RP-18GP 4.6 mmI. D. × 150 mm (particle diameter 5 μm, Kanto Chemical), mobile phase: (A) ultrapure water / phosphoric acid / acetonitrile = 100 / 0.05 / 2.5 (B) ultrapure water / phosphoric acid / acetonitrile / methanol = 100 /0.05/2.5/50, (A) 100% hold for 0-3 min, 3-25 min for (B) 0% → 100% linear gradient elution, 25-26 min ( A) Return to 100%, equilibrate at 26% for (A) 100%, flow rate: 1 mL / min, column temperature: 40 ° C., detection wavelength: 230 nm, injection volume: 10 μL.
本発明のポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用させたときおよび（−）ＥＧＣに作用させたときの減少速度（モル／分）を算出する方法は以下のとおりである。まず、ポリフェノールオキシダーゼの使用量は（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣの双方に対し、反応時間に伴って基質を直線的に消費しうる量とし、その量はポリフェノールオキシダーゼにより異なる。決定した一定量のポリフェノールオキシダーゼを０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で（−）ＥＣに作用させ、反応時間に対する（−）ＥＣの消費量（モル）をプロットする。このとき、（−）ＥＣ濃度を上昇させてもそれ以上傾きが増加しない最高基質濃度でのデータを用いる。次に（−）ＥＣに作用させたのと等量のポリフェノールオキシダーゼを０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で（−）ＥＧＣに作用させ、同じように反応時間に対する（−）ＥＧＣの消費量（モル）をプロットする。（−）ＥＣでの試験と同様に（−）ＥＧＣ濃度を上昇させてもそれ以上傾きが増加しない最高基質濃度でのデータを用いる。（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣそれぞれのプロットから傾き（モル／分）を算出する。 The method for calculating the rate of decrease (mol / min) when the polyphenol oxidase of the present invention is allowed to act on (−) EC and (−) EGC is as follows. First, the amount of polyphenol oxidase used is such that the substrate can be consumed linearly with the reaction time for both (−) EC and (−) EGC, and the amount varies depending on the polyphenol oxidase. The determined amount of polyphenol oxidase was allowed to act on (−) EC in 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0), and the consumption amount (mol) of (−) EC relative to the reaction time was determined. Plot. At this time, the data at the highest substrate concentration at which the slope does not increase further when the (−) EC concentration is increased is used. Next, the same amount of polyphenol oxidase as that reacted with (−) EC was reacted with (−) EGC in 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0) and reacted in the same manner. Plot the consumption (mole) of (-) EGC against time. Similar to the (−) EC test, the data at the highest substrate concentration at which the slope does not increase further when the (−) EGC concentration is increased is used. The slope (mol / min) is calculated from each plot of (−) EC and (−) EGC.
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention. However, the present invention is not limited to these.
（酵素量の検討）
ＥＧＣｇ ４５マイクロモル（約２０．６ｍｇ）とＥＣｇ １０マイクロモル（約４．４ｍｇ）を５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。この溶液にＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１０００、２０００、５０００、７０００、或いは１００００Ｕ添加し、４０℃で反応を行った。１０〜３０分まで適宜サンプリングを行い、全ての試料をＨＰＬＣ分析に供し、カテキン類とテアフラビンの測定を行った。カテキン類およびテアフラビンの分析法は以下に示したとおりであり、定量には三井農林（株）製のカテキン類標準品とテアフラビン標準品を用いた。酵素量に対するＴＦ３の生成量を図１および表１に示し、ＴＦ３生成量とＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１に示した。なお、図表には、各酵素使用量でのＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Examination of enzyme amount)
45 micromoles of EGCg (about 20.6 mg) and 10 micromoles of ECg (about 4.4 mg) were placed in a 50 ml Erlenmeyer flask and mixed with 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). Made milliliters. 1000, 2000, 5000, 7000, or 10000 U of tyrosinase made by SIGMA was added to this solution and reacted at 40 ° C. Sampling was appropriately performed for 10 to 30 minutes, all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured. Analyzing methods for catechins and theaflavins are as shown below, and catechin standard products and theaflavin standard products manufactured by Mitsui Norin Co., Ltd. were used for quantification. The amount of TF3 produced with respect to the amount of enzyme is shown in FIG. 1 and Table 1, and the conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of TF3 produced and the amount of ECg used is shown in Table 1. The chart shows the conversion efficiency with respect to ECg at that time, using the value of the reaction time when the amount of TF3 produced at each enzyme use amount is maximum. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
（カテキン類の測定方法）
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ（粒子径５μｍ、関東化学）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸／アセトニトリル＝１００／０．０５／２．５（Ｂ）超純水／リン酸／アセトニトリル／メタノール＝１００／０．０５／２．５／５０、（Ａ）１００％で０〜３分まで保持、３〜２５分で（Ｂ）０％→１００％まで直線的にグラジエント溶出、２５〜２６分で（Ａ）１００％に戻し、２６〜３０分まで（Ａ）１００％で平衡化、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２３０ｎｍ、注入量：１０μＬ。
(Measurement method of catechins)
Column: Mightysil RP-18GP 4.6 mmI. D. × 150 mm (particle diameter 5 μm, Kanto Chemical), mobile phase: (A) ultrapure water / phosphoric acid / acetonitrile = 100 / 0.05 / 2.5 (B) ultrapure water / phosphoric acid / acetonitrile / methanol = 100 /0.05/2.5/50, (A) 100% hold for 0-3 min, 3-25 min for (B) 0% → 100% linear gradient elution, 25-26 min ( A) Return to 100%, equilibrate at 26% for (A) 100%, flow rate: 1 mL / min, column temperature: 40 ° C., detection wavelength: 230 nm, injection volume: 10 μL.
（テアフラビンの測定方法）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＵＧ１２０ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ（粒子径３μｍ、ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸＝１００／０．０５（Ｂ）アセトニトリル／酢酸エチル＝９８．５／１．５、（Ａ）８１％（Ｂ）１９％で０〜１３．３分まで保持、１３．３〜２６．６分で（Ｂ）１９％→２３％まで直線的にグラジエント溶出、その後、（Ａ）５０％（Ｂ）５０％で３分間カラム洗浄、初期条件で５分間平衡化。流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出波長：２８０ｎｍ、注入量：２０μＬ。
(Theaflavin measurement method)
Column: CAPCELL PAK UG120 4.6 mmI. D. × 100 mm (particle diameter 3 μm, SHISEIDO), mobile phase: (A) ultrapure water / phosphoric acid = 100 / 0.05 (B) acetonitrile / ethyl acetate = 98.5 / 1.5, (A) 81% ( B) 19% hold from 0 to 13.3 minutes, 13.3 to 26.6 minutes (B) linear elution from 19% to 23%, then (A) 50% (B) 50% Wash column for 3 minutes, equilibrate for 5 minutes at initial conditions. Flow rate: 1.5 mL / min, column temperature: 25 ° C., detection wavelength: 280 nm, injection volume: 20 μL.
表１および図１より、用いた酵素量が多くなるにつれて、ＴＦ３生成量は増大し、ＥＣｇに対するＴＦ３への変換効率は高くなった。そして、使用酵素量が７０００Ｕ以上でＴＦ３の生成量および変換効率は最も高くなった。 From Table 1 and FIG. 1, as the amount of the enzyme used increased, the amount of TF3 produced increased, and the conversion efficiency to TF3 with respect to ECg increased. When the amount of enzyme used was 7000 U or more, the amount of TF3 produced and the conversion efficiency were the highest.
（使用するＥＧＣｇ：ＥＣｇ比の検討）
ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比が１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、１．５：１（１５マイクロモル：１０マイクロモル）、２：１（２０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４：１（４０マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）および９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）となるように５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。ＴＦ３生成量が最大となる反応時間を見出すために５分から６０分まで適宜サンプリングを行い、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に対するＴＦ３の生成量を図２および表２に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表２に示した。なお、図表には、各原料比におけるＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Examination of EGCg: ECg ratio to be used)
EGCg: ECg ratios of 1: 1 (10 micromolar: 10 micromolar), 1.5: 1 (15 micromolar: 10 micromolar), 2: 1 (20 micromolar: 10 micromolar), 3: 1 ( 30 micromol: 10 micromol), 3.5: 1 (35 micromol: 10 micromol), 4: 1 (40 micromol: 10 micromol), 4.5: 1 (45 micromol: 10 micromol) ), 6: 1 (60 micromolar: 10 micromolar) and 9: 1 (90 micromolar: 10 micromolar) in 50 mL Erlenmeyer flasks, 0.05 M citric acid-0.1 M phosphoric acid The volume was adjusted to 10 ml with a buffer solution (pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. In order to find the reaction time that maximizes the amount of TF3 produced, sampling was performed appropriately from 5 minutes to 60 minutes, all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The production amount of TF3 with respect to the EGCg: ECg ratio is shown in FIG. 2 and Table 2, and the conversion efficiency to TF3 with respect to the ECg use amount is shown in Table 2. The chart shows the conversion efficiency with respect to ECg at that time using the value of the reaction time when the amount of TF3 produced at each raw material ratio is the maximum. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
ＥＧＣｇをＥＣｇの３．５倍量以上使用した時、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３変換効率は８０％以上となり、ＥＧＣｇ：ＥＣｇが４．５：１の時にＴＦ３生成量、変換効率共に最大を示した。ＥＧＣｇ：ＥＣｇが９：１の時には、原料使用量が多くＴＦ３の変換効率も低下する傾向を示した。 When EGCg was used 3.5 times the amount of ECg or more, the TF3 conversion efficiency with respect to the ECg use amount was 80% or more, and when EGCg: ECg was 4.5: 1, both the TF3 generation amount and the conversion efficiency showed the maximum. When EGCg: ECg was 9: 1, the amount of raw material used was large and the conversion efficiency of TF3 tended to decrease.
（反応ｐＨの検討）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ３生成量を表３および図３に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表３に示した。なお、図表には、各ｐＨにおけるＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Examination of reaction pH)
0.05M citrate-0.1M phosphate buffer under 8 conditions (pH 3.0, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5 and pH 7.0) Prepared. EGCg and ECg were placed in a 50 ml Erlenmeyer flask at a ratio of 4.5: 1 (45 μmole: 10 μmole) and made up to 10 ml with each buffer. The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was performed after 10, 20, 30, 45, and 60 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF3 produced is shown in Table 3 and FIG. 3, and the conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of ECg used is shown in Table 3. In the chart, the value of the reaction time when the amount of TF3 produced at each pH is maximized is used, and the conversion efficiency with respect to ECg at that time is shown. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表３および図３に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣｇの３５％以上が、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの７０％以上がＴＦ３に変換されることがわかった。一方、ｐＨ３．０およびｐＨ６．５以上ではＴＦ３生成量および変換効率は著しく低下した。 As shown in Table 3 and FIG. 3, if the pH is in the range of 4.0 to 6.0, 35% or more of the ECg used is 70 to the ECg used in the range of 4.5 to 5.5. % Or more was found to be converted to TF3. On the other hand, at pH 3.0 and pH 6.5 or higher, the amount of TF3 produced and the conversion efficiency were significantly reduced.
（酵素反応時間の検討）
ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比が３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）および４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）となるように５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。反応時間に伴うＴＦ３生成量を図４および表４に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表４に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Examination of enzyme reaction time)
Place in a 50 ml Erlenmeyer flask with an EGCg: ECg ratio of 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar) and 4.5: 1 (45 micromolar: 10 micromolar). Acid-0.1M phosphate buffer (pH 5.0) was adjusted to 10 ml. The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was performed after 10, 20, 30, 45, and 60 minutes, all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF3 produced with the reaction time is shown in FIG. 4 and Table 4, and the conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of ECg used is shown in Table 4. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表４および図４に示したとおり、ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に関わらず、反応開始２０〜３０分後にはＥＣｇ使用量に対するＴＦ３の変換効率が最大となった。 As shown in Table 4 and FIG. 4, regardless of the EGCg: ECg ratio, the conversion efficiency of TF3 relative to the amount of ECg used was maximized 20 to 30 minutes after the start of the reaction.
（酵素反応系の濃度の検討）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。次に、その２倍量（６０マイクロモル：２０マイクロモル）および５倍量（１５０マイクロモル：５０マイクロモル）のＥＧＣｇとＥＣｇを５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。それぞれＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを７０００、１４０００、３５０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０、および３０分後にサンプリングを行い、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。反応時間に伴うＴＦ３生成量を図５および表５に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表５に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Examination of enzyme reaction system concentration)
EGCg and ECg were placed in a 50 ml Erlenmeyer flask at a ratio of 3: 1 (30 μmol: 10 μmol) and made up to 10 ml with 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). . Next, 2 times (60 μmol: 20 μmol) and 5 times (150 μmol: 50 μmol) of EGCg and ECg were placed in a 50 ml Erlenmeyer flask and 0.05 M citric acid-0. The volume was adjusted to 10 ml with 1 M phosphate buffer (pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7,000, 14000, and 35000 U of tyrosinase made by SIGMA, respectively. Sampling was performed after 5, 10, 20, and 30 minutes, all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF3 produced with the reaction time is shown in FIG. 5 and Table 5, and the conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of ECg used is shown in Table 5. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表５および図５より、ＴＦ３生成量およびＴＦ３への変換効率が最も高かったのは、通常濃度の反応系（１０ｍＬに対してＥＧＣｇとＥＣｇを合わせて４０マイクロモル使用したもの、つまり、ＥＣｇ１ミリモルに対し反応系の総量が１Ｌであるもの）だった。
なお、上記試験におけるＥＧＣｇ：ＥＣｇのモル比を３．５：１、４：１、４．５：１及び６：１に変更し、上記と同様の方法で酵素反応溶液の濃度について検討した結果、ＴＦ３への変換効率は上記結果と同様通常濃度の反応系で最も高かった。
From Table 5 and FIG. 5, the TF3 production amount and the conversion efficiency to TF3 were the highest when the reaction system of the normal concentration (40 mL of EGCg and ECg combined for 10 mL was used, that is, ECg of 1 mmol). The total amount of the reaction system is 1 L).
In addition, the molar ratio of EGCg: ECg in the above test was changed to 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, and 6: 1, and the results of examining the concentration of the enzyme reaction solution by the same method as described above The conversion efficiency to TF3 was the highest in the reaction system of the normal concentration as in the above results.
（反応温度の検討）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で４本の５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、それぞれ８℃、２５℃、４０℃および５０℃で酵素反応を行った。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３生成量を図６および表６に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表６に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Examination of reaction temperature)
EGCg and ECg were placed in four 50 ml Erlenmeyer flasks at a ratio of 4.5: 1 (45 micromolar: 10 micromolar) and each was 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). ) To 10 ml. The enzyme reaction was performed at 8 ° C, 25 ° C, 40 ° C and 50 ° C using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was performed as appropriate, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF3 produced with the reaction time at each reaction temperature is shown in FIG. 6 and Table 6, and the conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of ECg used is shown in Table 6. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表６および図６に示したとおり、４０℃と２５℃で反応を行った時にＴＦ３の生成量が最大を示したが、４０℃では反応２０分以後で生成量が最大となったのに対し、２５℃では反応６０分以後で最大となった。５０℃では、２０分で生成量が最大に達したがその生成量は２５および４０℃に及ばなかった。８℃では生成量が最大になるまでの反応時間が長く、その生成量も他の温度と比較して低いものであった。 As shown in Table 6 and FIG. 6, the amount of TF3 produced was maximum when the reaction was carried out at 40 ° C. and 25 ° C., whereas the amount produced was maximum after 20 minutes at 40 ° C. At 25 ° C., the reaction reached a maximum after 60 minutes. At 50 ° C., the production amount reached the maximum in 20 minutes, but the production amount did not reach 25 and 40 ° C. At 8 ° C., the reaction time until the production amount reached the maximum was long, and the production amount was also low compared to other temperatures.
（ＴＦ１での検証、原料比）
ＥＧＣおよびＥＣを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣ：ＥＣ比でのＴＦ１生成量を図７および表７に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ１への変換効率を表７に示した。なお、図表には、ＴＦ１生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
(Verification at TF1, raw material ratio)
EGC and EC 1: 1 (10 micromolar: 10 micromolar), 3: 1 (30 micromolar: 10 micromolar), 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar), 4.5: 1 (45 micromolar: 10 micromolar), 6: 1 (60 micromolar: 10 micromolar), 9: 1 (90 micromolar: 10 micromolar) in 50 ml Erlenmeyer flasks, each 0.05M The volume was adjusted to 10 ml with citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was appropriately performed for 10 to 60 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF1 produced at each EGC: EC ratio is shown in FIG. 7 and Table 7, and the conversion efficiency to TF1 with respect to the amount of EC used is shown in Table 7. The chart uses the value of the reaction time when the amount of TF1 production is maximum, and shows the conversion efficiency for EC at that time. The amount of EC used indicates the amount (mol) of EC added to the reaction solution.
表７および図７に示したとおり、ＥＧＣをＥＣの３倍量以上使用した時、ＴＦ１の生成量が最大になり、ＥＣに対するＴＦ１への変換効率が９０％を超えた。 As shown in Table 7 and FIG. 7, when EGC was used more than 3 times the amount of EC, the amount of TF1 produced was maximized, and the conversion efficiency of EC to TF1 exceeded 90%.
（ＴＦ１での検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣおよびＥＣを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ１の生成量を表８および図８に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ１への変換効率を表８に示した。なお、図表には、ＴＦ１生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
(Verification with TF1, reaction pH)
0.05M citrate-0.1M phosphate buffer under 8 conditions (pH 3.0, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5 and pH 7.0) Prepared. EGC and EC were placed in a 50 ml Erlenmeyer flask at a ratio of 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar) and made up to 10 milliliters with each buffer. The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was performed after 10, 20, 30, 45, and 60 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF1 produced is shown in Table 8 and FIG. 8, and the conversion efficiency to TF1 with respect to the amount of EC used is shown in Table 8. The chart uses the value of the reaction time when the amount of TF1 production is maximum, and shows the conversion efficiency for EC at that time. The amount of EC used indicates the amount (mol) of EC added to the reaction solution.
表８および図８に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣの８０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣの８９％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の範囲であれば、使用したＥＣの９２％以上がＴＦ１に変換されることがわかった。一方、ｐＨ３．０、６．５、および７．０では生成量および変換効率が著しく低下した。 As shown in Table 8 and FIG. 8, if the pH is in the range of 4.0 to 6.0, 80% or more of the used EC is 89 to 89 in the range of pH 4.0 to pH 5.5. It was found that 92% or more of the used EC was converted to TF1 when the% was in the range of pH 4.0 to pH 5.0. On the other hand, at pH 3.0, 6.5, and 7.0, the production amount and conversion efficiency were significantly reduced.
（ＴＦ２Ａでの検証、原料比）
ＥＧＣｇおよびＥＣを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣｇ：ＥＣ比でのＴＦ２Ａの生成量を図９および表９に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ２Ａへの変換効率を表９に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ａ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
(Verification with TF2A, raw material ratio)
EGCg and EC 1: 1 (10 micromolar: 10 micromolar), 3: 1 (30 micromolar: 10 micromolar), 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar), 4.5: 1 (45 micromolar: 10 micromolar), 6: 1 (60 micromolar: 10 micromolar), 9: 1 (90 micromolar: 10 micromolar) in 50 ml Erlenmeyer flasks, each 0.05M The volume was adjusted to 10 ml with citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was appropriately performed for 10 to 60 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF2A produced at each EGCg: EC ratio is shown in FIG. 9 and Table 9, and the conversion efficiency to TF2A relative to the amount of EC used is shown in Table 9. The chart uses the value of the reaction time when the amount of TF2A production is maximum, and shows the conversion efficiency for EC at that time. The amount of EC used indicates the amount (mol) of EC added to the reaction solution.
表９および図９に示したとおり、ＥＧＣｇをＥＣの３倍量以上使用した時、ＴＦ２Ａの生成量が最大になり、ＥＣに対するＴＦ２Ａへの変換効率が９０％以上となった。 As shown in Table 9 and FIG. 9, when EGCg was used more than 3 times the amount of EC, the amount of TF2A produced was maximized, and the conversion efficiency of EC to TF2A was 90% or more.
（ＴＦ２Ａでの検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣｇおよびＥＣを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ２Ａの生成量を表１０および図１０に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ２Ａへの変換効率を表１０に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ａ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
(Verification with TF2A, reaction pH)
0.05M citrate-0.1M phosphate buffer under 8 conditions (pH 3.0, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5 and pH 7.0) Prepared. EGCg and EC were placed in a 50 ml Erlenmeyer flask at a ratio of 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar) and made up to 10 milliliters with each buffer. The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was performed after 10, 20, 30, 45, and 60 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF2A produced is shown in Table 10 and FIG. 10, and the conversion efficiency to TF2A with respect to the amount of EC used is shown in Table 10. The chart uses the value of the reaction time when the amount of TF2A production is maximum, and shows the conversion efficiency for EC at that time. The amount of EC used indicates the amount (mol) of EC added to the reaction solution.
表１０および図１０に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣの５０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣの８０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の範囲では８５％以上がＴＦ２Ａに変換されることがわかった。 As shown in Table 10 and FIG. 10, if the pH is in the range of 4.0 to pH 6.0, 50% or more of the used EC is 80 to 80% of the used EC if the range is pH 4.0 to pH 5.5. It was found that 85% or more is converted to TF2A in the range of pH 4.0 to pH 5.0.
（ＴＦ２Ｂでの検証、原料比）
ＥＧＣおよびＥＣｇを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣ：ＥＣｇ比でのＴＦ２Ｂの生成量を図１１および表１１に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ２Ｂへの変換効率を表１１に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ｂ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Verification in TF2B, raw material ratio)
EGC and ECg 1: 1 (10 micromolar: 10 micromolar), 3: 1 (30 micromolar: 10 micromolar), 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar), 4.5: 1 (45 micromolar: 10 micromolar), 6: 1 (60 micromolar: 10 micromolar), 9: 1 (90 micromolar: 10 micromolar) in 50 ml Erlenmeyer flasks, each 0.05M The volume was adjusted to 10 ml with citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was appropriately performed for 10 to 60 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF2B produced at each EGC: ECg ratio is shown in FIG. 11 and Table 11, and the conversion efficiency to TF2B with respect to the amount of ECg used is shown in Table 11. In the chart, the value of reaction time when the amount of TF2B production is maximized is used, and the conversion efficiency with respect to ECg at that time is shown. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表１１および図１１に示したとおり、ＥＧＣをＥＣｇの３倍量以上使用した時、ＴＦ２Ｂの生成量が最大となり、ＥＣｇに対するＴＦ２Ｂへの変換効率が９５％を超えた。 As shown in Table 11 and FIG. 11, when EGC was used in an amount 3 times or more the ECg, the amount of TF2B produced was maximized, and the conversion efficiency to TF2B with respect to ECg exceeded 95%.
（ＴＦ２Ｂでの検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣおよびＥＣｇを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ２Ｂの生成量を表１２および図１２に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ２Ｂへの変換効率を表１２に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ｂ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Verification with TF2B, reaction pH)
0.05M citrate-0.1M phosphate buffer under 8 conditions (pH 3.0, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5 and pH 7.0) Prepared. EGC and ECg were placed in a 50 milliliter Erlenmeyer flask at a ratio of 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar) and made up to 10 milliliters with each buffer. The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 7000 U of tyrosinase made by SIGMA. Sampling was performed after 10, 20, 30, 45, and 60 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF2B produced is shown in Table 12 and FIG. 12, and the conversion efficiency to TF2B with respect to the amount of ECg used is shown in Table 12. In the chart, the value of reaction time when the amount of TF2B production is maximized is used, and the conversion efficiency with respect to ECg at that time is shown. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表１２および図１２に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣｇの５５％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの７５％以上が、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの９０％以上がＴＦ２Ｂに変換されることがわかった。 As shown in Table 12 and FIG. 12, if the pH is in the range of 4.0 to 6.0, 55% or more of the ECg used is 75 to 75 in the range of pH 4.0 to 5.5. It was found that 90% or more of the ECg used was converted to TF2B when the% was in the range of pH 4.5 to pH 5.5.
（スケールアップ）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（９００マイクロモル：２００マイクロモル，約３９８ｍｇ：約９２ｍｇ）の比で１リットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１４００００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３生成量を図１３および表１３に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１３に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Scale-up)
EGCg and ECg were placed in a 1 liter Erlenmeyer flask at a ratio of 4.5: 1 (900 micromolar: 200 micromolar, about 398 mg: about 92 mg) and 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer ( 200 ml at pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 140000 U of tyrosinase manufactured by SIGMA. Sampling was performed after 5, 10 and 20 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The amount of TF3 produced with the reaction time at each reaction temperature is shown in FIG. 13 and Table 13, and the conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of ECg used is shown in Table 13. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表１３および図１３に示したとおり、２０倍にスケールアップした場合ＴＦ３への変換効率は８９％であり、これまでの実施例での同条件での結果を上回る数値が得られた。 As shown in Table 13 and FIG. 13, when scaled up 20 times, the conversion efficiency to TF3 was 89%, and a numerical value exceeding the result under the same conditions in the previous examples was obtained.
（ＴＦ異性体での検証１）
ＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（９００マイクロモル：２００マイクロモル，約４１３ｍｇ：約８８ｍｇ）の比で１リットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１４００００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビン異性体の測定を行った。なお、テアフラビン異性体は、仮にそれぞれのエピ体を標準品として定量を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３異性体の生成量を図１４および表１４に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３異性体への変換効率を表１４に示した。ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
(Verification in TF isomer 1)
GCg and ECg were placed in a 1 liter Erlenmeyer flask at a ratio of 4.5: 1 (900 micromolar: 200 micromolar, about 413 mg: about 88 mg) and 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer ( 200 ml at pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 140000 U of tyrosinase manufactured by SIGMA. Sampling was performed after 5, 10 and 20 minutes, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavin isomers were measured by the method described in Example 1. The theaflavin isomers were quantified using each epimer as a standard product. The amount of TF3 isomer produced with the reaction time at each reaction temperature is shown in FIG. 14 and Table 14, and the conversion efficiency to the TF3 isomer with respect to the amount of ECg used is shown in Table 14. The amount of ECg used indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表１４および図１４に示したとおり、ＧＣｇとＥＣｇからもテアフラビンが生成することが確認された。この結果から、エピ体以外のカテキンを用いても高変換効率（７２％）でＴＦ３異性体が得られることがわかった。なお、この異性体は今まで報告されていない新規なテアフラビンである。 As shown in Table 14 and FIG. 14, it was confirmed that theaflavin was also produced from GCg and ECg. From this result, it was found that the TF3 isomer could be obtained with high conversion efficiency (72%) even when catechins other than epi were used. This isomer is a novel theaflavin that has not been reported so far.
（ＴＦ異性体での検証２）
表１５の組み合わせでそれぞれピロガロール型カテキン：カテコール型カテキンの比が４．５：１（１．３５マイクロモル：０．３マイクロモル）となるように２０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で４ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各２２０Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。２０分後に反応停止し、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビン異性体の測定を行った。なお、テアフラビン異性体は、仮にそれぞれのエピ体を標準品として定量を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ異性体の生成量と、カテコール型カテキン使用量に対するＴＦ異性体への変換効率を表１５に示した。なお、カテコール型カテキン使用量とは反応液に添加したカテコール型カテキンの量（モル）を示す。
(Verification with TF isomer 2)
Each of the combinations shown in Table 15 was placed in a 20 ml Erlenmeyer flask so that the ratio of pyrogallol-type catechin: catechol-type catechin was 4.5: 1 (1.35 micromol: 0.3 micromol), and 0.05 M each. The volume was adjusted to 4 ml with citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). The enzyme reaction was performed at 40 ° C. using 220 U of tyrosinase made by SIGMA. After 20 minutes, the reaction was stopped, all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavin isomers were measured by the method described in Example 1. The theaflavin isomers were quantified using each epimer as a standard product. Table 15 shows the amount of TF isomer produced with the reaction time at each reaction temperature and the conversion efficiency to the TF isomer with respect to the amount of catechol-type catechin used. The amount of catechol-type catechin used indicates the amount (mol) of catechol-type catechin added to the reaction solution.
表１５に示したとおり、テアフラビン異性体を高い変換効率で得ることが出来た。 As shown in Table 15, theaflavin isomers could be obtained with high conversion efficiency.
（（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣの減少速度の比とＴＦ３への変換効率）
（−）ＥＣ（３５〜８０マイクロモル）および（−）ＥＧＣ（５〜８０マイクロモル）に対し、酵素Ａから酵素Ｆの６種類のポリフェノールオキシダーゼをｐＨ５．０の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液中、４０℃で作用させた。ポリフェノールオキシダーゼの使用量は酵素の種類によって異なり、各酵素において（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣが反応時間とともに直線的に消費しうる量とした。基質量も酵素によって適宜調節し、単位時間あたりの基質減少量がそれぞれの酵素で最大となる最高濃度で試験を行った。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して実施例１に記載の方法でカテキン類の測定を行い、酵素毎にそれぞれの基質に対しての反応時間に伴う消費量（モル）を求めた。各酵素における反応時間に伴う（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣ消費量（モル）をプロットし、傾き、すなわち減少速度（１分間の消費量）を求めてその比を算出した。各酵素の（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比を表１６に示した。
次に、ＥＧＣｇおよびＥＣｇを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。上記Ａ〜Ｆの６種類のポリフェノールオキシダーゼを各適量使用し、４０℃で酵素反応を行った。使用量はそれぞれの酵素でＴＦ３が最大生成量となるように設定した。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ３生成量およびＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１６に示し、（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比とＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率の相関を図１５に示した。なお、図表には、ＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
((−) EC and (−) EGC reduction rate ratio and conversion efficiency to TF3)
(−) EC (35 to 80 μmol) and (−) EGC (5 to 80 μmol) were mixed with 6 types of polyphenol oxidases from enzyme A to enzyme F at 0.05 M citric acid at pH 5.0−0.0. It was made to act at 40 degreeC in 1M phosphate buffer. The amount of polyphenol oxidase used varies depending on the type of enzyme, and (−) EC and (−) EGC can be consumed linearly with the reaction time in each enzyme. The base mass was also adjusted as appropriate with the enzyme, and the test was performed at the maximum concentration at which the amount of substrate reduction per unit time was maximum for each enzyme. Sampling was performed as appropriate, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins were measured by the method described in Example 1. The amount of consumption (mole) associated with the reaction time for each substrate was determined for each enzyme. Plotting (-) EC and (-) EGC consumption (mole) with reaction time in each enzyme, plotting the slope, that is, the rate of decrease (consumption for 1 minute), and calculating the ratio. The ratio of (−) EC decrease rate (mol / min) / (−) EGC decrease rate (mol / min) for each enzyme is shown in Table 16.
Next, EGCg and ECg were placed in a 50 ml Erlenmeyer flask at a ratio of 3.5: 1 (35 micromolar: 10 micromolar) and 0.05 M citrate-0.1 M phosphate buffer (pH 5.0). To 10 milliliters. An appropriate amount of each of the six types of polyphenol oxidases A to F was used, and an enzyme reaction was performed at 40 ° C. The amount used was set so that TF3 was the maximum production amount for each enzyme. Sampling was performed appropriately, and all samples were subjected to HPLC analysis, and catechins and theaflavins were measured by the method described in Example 1. The conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of TF3 produced and the amount of ECg used is shown in Table 16, and the ratio of (−) EC reduction rate (mol / min) / (−) EGC reduction rate (mol / min) and ECg usage The correlation of the conversion efficiency to TF3 with respect to is shown in FIG. The chart uses the value of reaction time when the amount of TF3 production is maximum, and shows the conversion efficiency with respect to ECg at that time. The ECg use amount indicates the amount (mol) of ECg added to the reaction solution.
表１６および図１５より、減少速度の比（ＥＣの減少速度（モル／分）／ＥＧＣの減少速度（モル／分））が大きくなるほどＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率は高くなり、図１５に示したように、その傾きの比が３．５４以上であればＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率が３５％を超えるという結果が得られた。実際に、上記した減少速度の比が３．５４に満たない酵素Ｃ、酵素Ｄ、酵素Ｅおよび酵素ＦではＥＣｇに対するＴＦ３への変換効率が３５％に満たないのに対し、消費直線の傾きの比が３．５４を超えている酵素ＢおよびＡではＴＦ３への変換効率がそれぞれ４６．３％および８１．４％と高値で得られた。 From Table 16 and FIG. 15, the conversion efficiency to TF3 with respect to the amount of ECg used increases as the ratio of the reduction rate (EC reduction rate (mol / min) / EGC reduction rate (mol / min)) increases. As shown in Fig. 5, when the ratio of the slope is 3.54 or more, the conversion efficiency to TF3 with respect to the ECg usage amount exceeds 35%. Actually, the conversion rate of TF3 with respect to ECg is less than 35% in enzyme C, enzyme D, enzyme E and enzyme F whose ratio of decrease rate is less than 3.54, while the slope of the consumption line is Enzymes B and A with ratios exceeding 3.54 gave high conversion efficiencies to TF3 of 46.3% and 81.4%, respectively.
以上の通り、本発明により、特別な装置を必要とせず、一般的な設備を利用して簡便にカテコール型カテキン使用量に対して高変換効率でテアフラビンを製造することが出来る。
As described above, according to the present invention, theaflavin can be easily produced with high conversion efficiency with respect to the amount of catechol-type catechin using a general facility without requiring a special apparatus.
Claims (7)
＜数値比率＞
（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）≧３．５４ Decreasing rate (mol / min) when polyphenol oxidase is allowed to act on (−) epicatechin ((−) EC) and decreasing rate (mole) when acting on (−) epigallocatechin ((−) EGC) 2. The method for producing theaflavin according to claim 1, wherein polyphenol oxidase is used such that the ratio of / min) becomes a value shown below.
<Numerical ratio>
(−) EC decrease rate (mol / min) / (−) EGC decrease rate (mol / min) ≧ 3.54
The method for producing theaflavin according to claim 6, wherein the pH of the enzyme reaction is 4.0 to 5.5.
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