JP5410708B2

JP5410708B2 - Microorganisms and microorganism preparations belonging to the genus Sharpea, and oral compositions

Info

Publication number: JP5410708B2
Application number: JP2008206897A
Authority: JP
Inventors: 英利森田
Original assignee: クロスフィールドバイオ株式会社
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2008-08-11
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2028-08-11
Also published as: JP2010041940A

Description

本発明は、ストレス軽減効果を有する新属であるシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属に属する微生物および当該微生物を含有する微生物製剤並びに当該微生物の発酵物を含有する経口組成物に関する。 The present invention relates to an oral composition containing a fermented product of the new genus is Shapea (Sharpea) microbial agent and the microorganism containing microorganisms and the microorganisms belonging to the genus having the stress reduction effect.

牛や豚、馬などの哺乳動物の飼育においては、消化器疾患がしばしば問題となり、例えば、馬の飼育における、疝痛（せんつう）や下痢症などの消化器疾患は、消化吸収に影響を及ぼし栄養障害につながるため、馬の発育を阻害する要因となる。特に仔馬はこのような消化器疾患を発症しやすく、生後６ヶ月までに約７０〜８０％の仔馬が何らかの下痢を発症することが報告されている。このような下痢や腸炎の原因となる病原微生物の報告はあるが、仔馬の場合は不顕性保菌馬も多いため、効果的な治療法がとれず下痢状態が長期間に及ぶ場合もある。したがって、腸内フローラの状態を改善し下痢症などの消化器疾患を予防・治療することが望まれていた。 Gastrointestinal diseases are often a problem in the breeding of mammals such as cattle, pigs, and horses. For example, gastrointestinal diseases such as colic and diarrhea in horse breeding affect digestion and absorption. Since it leads to nutritional disorders, it becomes a factor that inhibits horse growth. In particular, foals are likely to develop such digestive diseases, and it is reported that about 70 to 80% of foals develop some diarrhea by the sixth month after birth. There are reports of pathogenic microorganisms that cause such diarrhea and enteritis, but foals often have occult carriers, so effective treatment is not available and diarrhea may last for a long time. Therefore, it has been desired to improve the state of intestinal flora and prevent and treat digestive diseases such as diarrhea.

一方、馬は家畜として人に飼育され、競走用、使役用、ホースセラピー用などの用途に使用されており、様々なストレスに曝される。例えば競走馬であれば、調教や輸送などにおいて多大なストレスを受け、輸送熱などの症状となって顕れることもある。したがって、日常飼育の中でのストレスを軽減することも望まれていた。 On the other hand, horses are bred by humans as livestock, and are used for races, utility, hose therapy, etc., and are exposed to various stresses. For example, a racehorse may be exposed to great stress in training or transportation, and may manifest as symptoms of transportation fever. Therefore, it has also been desired to reduce stress during daily breeding.

近年、馬に対して下痢の予防や治療、増体重の促進を目的として、乳酸菌を添加した飼料が使用されている。しかしながら、従来の乳酸菌では、馬の有用な腸内フローラの形成には有効に働かず下痢症などを十分に予防、治療することができないものであった。さらに、馬に対してストレス軽減効果を有する乳酸菌に近縁の微生物はこれまで知られていなかった。 In recent years, feed supplemented with lactic acid bacteria has been used for the purpose of preventing and treating diarrhea and promoting weight gain in horses. However, conventional lactic acid bacteria cannot effectively prevent and treat diarrhea and the like because they do not work effectively for the formation of useful intestinal flora in horses. Furthermore, microorganisms closely related to lactic acid bacteria having a stress reducing effect on horses have not been known so far.

また、女性、男性共に存在するエストロゲンのもつ選択的エストロゲン受容体モヂュレーターは近年、骨粗鬆症の治療薬として、また動脈硬化に対する効果が示唆されている。植物中に含まれる植物エストロゲンの存在は以前より知られ、例えば大豆に豊富に含まれるゲニステインやダイゼインは代表的なイソフラボンであり、植物エストロゲンとして作用することが知られている。このダイゼインは摂取された後に腸内細菌叢によって代謝を受けてダイハイドロダイゼインを経てエクオールに変換される（非特許文献１）。 In addition, selective estrogen receptor modulators possessed by estrogens present in both women and men have recently been suggested as therapeutic agents for osteoporosis and for effects on arteriosclerosis. The existence of phytoestrogens contained in plants has been known for a long time. For example, genistein and daidzein abundantly contained in soybeans are typical isoflavones and are known to act as phytoestrogens. After being ingested, this daidzein is metabolized by the intestinal flora and converted to equol via die hydrodaidzein (Non-patent Document 1).

最近の研究において、これらダイゼインの代謝産物であるダイハイドロダイゼインやエクオールが、エストロゲン受容体α，βのいずれに対しても活性を有することが報告されている。しかしながら、ヒトにおいて、このダイゼインの代謝を司る腸内細菌叢を有する割合は約３０％程度にすぎないとされており、かかる腸内細菌叢を有さないヒトでは、ダイゼインを摂取してもその代謝産物による効果が得られないと考えられる（非特許文献２）。 In recent studies, it has been reported that these hydrolysates of daidzein, die hydrodaidzein and equol, have activity against both estrogen receptors α and β. However, in humans, the proportion of intestinal flora responsible for the metabolism of daidzein is said to be only about 30%. In humans who do not have such intestinal flora, even if they take daidzein, It is thought that the effect by a metabolite is not acquired (nonpatent literature 2).

したがって、ダイゼインからダイハイドロダイゼインやエクオールを産生する微生物を摂取するか、または産生されたダイハイドロダイゼインやエクオールを直接摂取することにより、これらの成分によるエストロゲン受容体活性作用を介し骨成分の増強効果などの種々の生理活性が期待できるが、このようなダイハイドロダイゼインやエクオールの産生能を有する微生物はこれまでほとんど知られていなかった。 Therefore, by ingesting microorganisms that produce Daihydrodaidzein and equol from daidzein, or by directly ingesting the produced Daihydrodaidzein and equol, these components enhance the bone component through the estrogen receptor activity. Such microorganisms having the ability to produce die hydrodaidzein and equol have been hardly known so far.

ＣｈａｎｇＨ．Ｈ．，ＲｏｂｉｎｓｏｎＡ．Ｒ．ａｎｄＣｏｍｍｏｎＲ．Ｈ．，Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｄａｉｚｅｉｎａｎｄｅｑｕｏｌａｓｍｏｎｏｓｕｌｆａｔｅｓａｎｄｄｉｓｕｌｆａｔｅｓｉｎｔｈｅｕｒｉｎｅｏｆｔｈｅｌａｙｉｎｇｈｅｎ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，２２３−２３０（１９７５）．Chang H. H. Robinson A .; R. and Common R.A. H. , Execution of radioactive daizein and equal as monosulfates and disulsates in the urine of the laying hen. Can. J. et al. Biochem. 53, 223-230 (1975). 大豆に含まれるゲニステイン、ダイゼインおよびその代謝産物エクオールの分子生物学的薬理作用の検討およびその生体内濃度の臨床的意義、大豆たん白質研究、９，１５３−１５７（２００６）．Study of molecular biological pharmacological action of genistein, daidzein and its metabolite equol contained in soybean and clinical significance of in vivo concentration, soybean protein research, 9, 153-157 (2006).

従って、本発明は、哺乳動物の消化管中に良好な付着性と定着性を有し、下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療することができ、さらにはストレス軽減効果などプロバイオティクス効果を有するとともに、ダイゼインを資化してダイヒドロダイゼインやエクオールを産生する能力を有する微生物を提供することを課題とする。 Therefore, the present invention has good adhesion and colonization in the digestive tract of mammals, can prevent and treat gastrointestinal diseases such as diarrhea and colic, and further, probiotics such as stress-reducing effects. It is an object of the present invention to provide a microorganism that has a tics effect and has the ability to assimilate daidzein to produce dahydrodaidzein and equol.

本発明者らは、馬の腸内に常在する乳酸菌の分布や構成を調べ、それらの馬の消化管由来株の分離同定を行う過程で、乳酸菌と類似の性質をもつが、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統樹では、Ｍｏｌｉｃｕｔｅｓ綱に属する４種の未同定菌株を分離した。そしてその菌株を馬に投与することにより、馬の下痢や疝痛の発生を予防・治療することができ、また馬およびラットに対してストレス軽減効果を奏することを見出した。さらにこの菌株は、ダイゼインを資化し、ダイヒドロダイゼインおよびエクオール産生能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 In the process of examining the distribution and composition of lactic acid bacteria resident in the intestines of horses, and separating and identifying the digestive tract-derived strains of these horses, the present inventors have similar properties to lactic acid bacteria, but the 16S rRNA gene In the sequence-based phylogenetic tree, four unidentified strains belonging to the class of Molicutes were isolated. It was also found that by administering the strain to horses, the occurrence of diarrhea and colic in horses can be prevented and treated, and it has a stress reducing effect on horses and rats. Furthermore, this strain has assimilated daidzein and found to have the ability to produce dahydrodaidzein and equol, and has completed the present invention.

すなわち本発明は、ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物である。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％ That is, the present invention is a Shapea (Sharpea) microorganism showing the following mycological properties having stress-reducing action.
(1) Bacterial morphology: Aspergillus (2) Motility: None (3) Sporulation: None (4) Gram staining: Positive (5) Catalase reaction: Negative (6) Attitude toward oxygen: Absolute anaerobic (7) G + C content: 36-38 mol%

また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を含有する微生物製剤である。 Further, the present invention is a microbial preparation containing the above-mentioned microorganism of the genus Sharpa .

また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有することを特徴とする経口組成物である。 The present invention is an oral composition characterized by containing a fermented product obtained by the action of the Shapea (Sharpea) microorganisms daidzein-containing substance.

また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールの製造方法である。 In addition, the present invention is a method for producing Daihydrodaidzein and / or equol, characterized in that the above-mentioned Sharpea microorganism is allowed to act on daidzein-containing material.

本発明のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物は、消化管内での定着能が高く、馬などの哺乳動物に投与することにより有効に下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療できるとともに、ストレスを低減できるものである。また、ダイゼインを資化して、ダイヒドロダイゼインやエクオールを産生する能力を有するため、産生されたダイヒドロダイゼインやエクオールを摂取することによって、あるいはこのシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を摂取することにより、骨粗鬆症や動脈硬化などのエストロゲン受容体関連疾患を予防・治療することができる。 Shapea (Sharpea) microorganisms of the present invention has a high fixing ability of the gastrointestinal tract, with gastrointestinal disorders such as effectively diarrhea and colic by administering to a mammal such as a horse can prevent and treat the stress It can be reduced. In addition, since it has the ability to assimilate daidzein and produce dihydrodaidzein and equol, osteoporosis can be obtained by ingesting the produced Daihydrodaidzein and equol, or by ingesting microorganisms belonging to the genus Sharpa. And estrogen receptor-related diseases such as arteriosclerosis can be prevented and treated.

本発明の新属に属する微生物は、競走馬の糞便より分離されたものである。すなわち、健常なサラブレッドの***後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＬ寒天培地またはＬＢＳ寒天培地（ともに栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養して形成されたコロニーからＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９の４種の未同定株を分離した。 The microorganism belonging to the new genus of the present invention is isolated from the stool of a racehorse. That is, fresh feces immediately after excretion of healthy thoroughbreds were placed in an anaerobic pack (Anerogas Pack: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical) and transported in a refrigerator at 7 ° C. or lower where feces were not frozen. The transported stool is serially diluted by anaerobic serial dilution method (Tomotsuka Mitsuoka, “World of Enterobacteriaceae”, 2nd edition, 53-65, Sobunsha, 1984), and part of this is BL agar medium or LBS Four unidentified strains ST18, HM244, HM250 and DI49 were isolated from colonies formed by smearing on an agar medium (both manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and anaerobically culturing at 37 ° C. for 48 hours by the steel wool method. .

これらのうち、ＳＴ１８株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ：０．７〜１×２〜１０μｍ
（３）運動性：無
（４）胞子：無 Among these, (a) morphological properties, (b) culture properties, (c) physiological properties, and (d) chemical taxonomic properties of the ST18 strain are shown below.
(A) Morphological properties (1) Bacterial shape: Neisseria gonorrhoeae (2) Bacterial size: 0.7-1 × 2-10 μm
(3) Motility: None (4) Spore: None

このＳＴ１８株の顕微鏡写真を図１に示す。 A micrograph of this ST18 strain is shown in FIG.

（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＡＢＣＭブイヨン寒天培地での培養：
３７℃、２４時間培養により、直径１〜２．５ｍｍ程度のやや不規則な円形状
で扁平状に***し、周縁は波状、表面は円滑で、露滴状の構造であって、褐色で
透明、硬度は脂状のコロニーを生じる。
（２）ＡＢＣＭブイヨン液体培地での培養：
３７℃、１５〜２４時間培養によって懸濁する。
（Ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（４）乳酸発酵：ヘテロ型
（５）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｄ型
（６）グルコースからのガス発生：あり
（７）生育の範囲
温度１５℃ なし
４５℃ あり
（８）耐塩性３％耐塩性
（９）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ５０ＣＨＳｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、＋／−酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
Ｄ−アラビノース −
リボース −
Ｄ−キシロース −
ガラクトース＋
グルコース＋
フラクトース＋
マンノース＋
ラムノース −
マンニトール −
ソルビトール −
サリシン −
セロビオース＋
ラクトース＋
メリビオース＋
トレハロース −
メレジトース −
ラフィノース −
デンプン＋
グルコン酸 − (B) Culture properties (growth state)
(1) Culture on ABCM bouillon agar medium:
By culturing at 37 ° C for 24 hours, it has a slightly irregular circular shape with a diameter of about 1 to 2.5 mm, and rises in a flat shape, the periphery is wavy, the surface is smooth, a dewdrop-like structure, brown and transparent , Hardness produces greasy colonies.
(2) Culture in ABCM bouillon liquid medium:
Suspend by incubation at 37 ° C for 15-24 hours.
(C) Physiological properties (1) Gram staining: Positive (2) Catalase reaction: Negative (3) Attitude toward oxygen: Absolute anaerobic (4) Lactic acid fermentation: Heterotype (5) Optical rotation of lactic acid produced from glucose Sex: D type (6) Gas generation from glucose: Yes (7) Growth range Temperature 15 ° C None
45 ° C. Yes (8) Salt tolerance 3% Salt tolerance (9) Presence or absence of acid generation from sugars API 50 CH System (manufactured by BioMereux) was used.
(+ Acid generated, +/- acid generated slightly, -no acid generated)
D-arabinose-
Ribose −
D-xylose-
Galactose +
Glucose +
Fructose +
Mannose +
Rhamnose −
Mannitol −
Sorbitol −
Salicin −
Cellobiose +
Lactose +
Melibiose +
Trehalose −
Merezitose −
Raffinose −
Starch +
Gluconic acid −

（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Ｍｅｓｂａｈらの方法（ＭｅｓｂａｈＭ．，ＰｒｅｍａｃｈａｎｄｒａｎＵ．ａｎｄＷｈｉｔｍａｎＷ．Ｅ．，ＰｒｅｃｉｓｅｍｅａｓｕｒｍｅｎｔｏｆｔｈｅＧ＋Ｃｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｂｙｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３９，１５９−１６７（１９８９）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：３７．４ｍｏｌ％
（２）細胞壁のアミノ酸組成
アミノ酸組成：アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メソジ
アミノピメリン酸
ペプチドグリカンタイプ：Ａ１γ、（Ｌ−Ａｌａ）−Ｄ−Ｇｌｕ−ｍ−Ｄｐｍ (D) Chemical taxonomic properties (1) G + C content method of Mesbah et al. (Mesbah M., Premachandran U. and Whitman WH, and Precise measurement of the G + C content of deoxyribond. J. Syst. Bacteriol., 39, 159-167 (1989).
G + C content: 37.4 mol%
(2) Amino acid composition of cell wall Amino acid composition: Aspartic acid, glutamic acid, glycine, alanine, mesodi aminopimelic acid Peptidoglycan type: A1γ, (L-Ala) -D-Glu-m-Dpm

（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
コロニーＰＣＲにより、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１００ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。 (3) 16S rRNA gene base sequence homology (base sequence determination of 16S rRNA gene)
The 16S rRNA gene region was amplified by colony PCR, and the entire 16S rRNA gene base sequence was determined by ABI PRISM 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystem). The following 27F, 75R, 520F, 520R, 930F, 800R, 1100F, 1100R primers were used.

＜１６ＳｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’ <PCR primer for 16S rDNA gene amplification and nucleotide sequence determination>
27F: 5′-AGAGTTTGATCCCTGCTCAG-3 ′
75R: 5′-CCCGGGATCCAAGCTTACCGGTTACCTTGTAC
GACTT-3 '
520F: 5′-CAGGAGTGCCAGCAGCCCGCGG-3 ′
520R: 5′-ACCGCCGCTGCTGGC-3 ′
930F: 5′-GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG-3 ′
800R: 5′-CAGGACTACCAGGGTATCTAAT-3 ′
1100F: 5′-CAGGAGCAACGAGCCGCAACCC-3 ′
1100R: 5'-AGGGTTGCCGCTCGTTG-3 '

決定したＳＴ１８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列１に示す。 The determined base sequence of 16S rRNA gene of ST18 strain is shown in base sequence 1 of the sequence listing.

（相同性検索）
このＳＴ１８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁のＬ．ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓＪＣＭ１１４３Ｔ（アクセッションナンバー：Ｍ２３７２９）との相同性は８９．９％であった。配列表の塩基配列１に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。 (Homology search)
The base sequence of the 16S rRNA gene of this ST18 strain was subjected to homology search with known bacterial species by BLAST search (Japan DNA Data Bank). As a result, if the homology is generally less than 97%, it is considered to be a different species . The homology with catenaformis JCM 1143T (accession number: M23729) was 89.9%. If the homology is 97% or more with respect to the base sequence 1 in the sequence listing, it is included in the microorganism of the present invention.

（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬＷにより系統樹を作成した。図２は、クロストリジウムクラスターＸＶ〜ＸＩＸに属する既知の種とＳＴ１８株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、括弧内の記号はアクセッションナンバーである。 (System analysis)
Furthermore, a phylogenetic tree was created with the analysis software CLUSTAL W. FIG. 2 is a phylogenetic tree showing the relationship between known species belonging to the Clostridial clusters XV to XIX and the ST18 strain. The numerical value shown at the branch point in the figure is the bootstrap confidence value, and the symbol in parentheses is the accession number.

（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３９，２２４−２２９（１９８９））により行った。３株の近縁菌種の基準株（Ｌ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓＪＣＭ１１２１^Ｔ、Ｌ．ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓＪＣＭ１１４３^Ｔ、Ｃ．ｍｉｔｓｕｏｋａｉＪＣＭ０６０９^Ｔ）を、ＳＴ１８株と比較するのに使用した。 (4) DNA-DNA homology with related species DNA-DNA hybridization is performed by the microplate method (Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 224-229 (1989)) by fluorescence detection of Ezaki et al. It was. Reference strains of three closely related bacterial species ( L. vitrinus JCM 1121 ^T , L. cataformis JCM 1143 ^T , C. mitsukakai JCM 0609 ^T ) were used to compare with ST18 strain.

（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
Ｃ．ｍｉｔｓｕｏｋａｉＪＣＭ０６０９^Ｔ：１５．６％
Ｌ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓＪＣＭ１１２１^Ｔ：１４．３％
Ｌ．ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓＪＣＭ１１４３^Ｔ：０．７％ (DNA-DNA homology)
C. mitsuokai JCM 0609 ^T : 15.6%
L. Vitulinus JCM 1121 ^T : 14.3%
L. catenaformis JCM 1143 ^T : 0.7%

このように、ＳＴ１８株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が２０％未満の低い相同性しか示さなかった。本発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株（Ｃ．ｍｉｔｓｕｏｋａｉＪＣＭ０６０９^Ｔ、Ｌ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓＪＣＭ１１２１^Ｔ、Ｌ．ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓＪＣＭ１１４３^Ｔ）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。 Thus, the ST18 strain showed only a low homology of less than 20% in DNA-DNA homology with the reference strain of the related strain. The microorganism of the present invention has a DNA-DNA homology of less than 60% with the reference strains of the above-mentioned closely related bacterial species ( C. mitsuikai JCM 0609 ^T , L. vitrulinus JCM 1121 ^T , L. cataformis JCM 1143 ^T ) Is included.

以上の化学分類学的性質により、ＳＴ１８株は、クロストリジウムクラスターＸＶＩＩに含まれるいずれの属にも属さない新属の微生物であると判断され、シャーペア属（Ｓｈａｒｐｅａ）に属するシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）と命名された。このシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号ＮＩＴＥＰ−３００として寄託した。 By chemical taxonomic nature of the above, ST18 strain was determined to be a new microorganism of the genus that does not belong to any genus that is included in the Clostridium cluster XVII, Shapea-Azabuenshisu belonging to the Shapea genus (Sharpea) (Sharpea azabuensis ). This Charpea Azabu Ensis ST18 strain was deposited on January 19, 2007, at the National Institute of Technology and Evaluation of Microorganisms as a microorganism deposit number NITE P-300.

ＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９についても同様にして分類学的性質を調べた。Ｃ．ｍｉｔｓｕｏｋａｉＪＣＭ０６０９^Ｔ、Ｌ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓＪＣＭ１１２１^Ｔ、Ｌ．ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓＪＣＭ１１４３^Ｔの結果も併せて表１に示す。 The taxonomic properties of HM244, HM250, and DI49 were similarly examined. C. mitsuokai JCM 0609 ^T, L. Vitulinus JCM 1121 ^T , L. The results of catenaformis JCM 1143 ^T are also shown in Table 1.

＊Ｌ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓＪＣＭ１１２１^ＴおよびＣ．ｍｉｔｓｕｏｋａｉＪＣＭ０６０９^Ｔについては、ＳｈａｒｐｅａＭ．Ｅ．，ＬａｔｈａｍＭ．Ｊ．，ＧａｒｖｉｅＥ．Ｉ．ＺｉｒｎｇｉｂｌＪ．ａｎｄＫａｎｄｌｅｒＯ．，ＴｗｏｎｅｗｓｐｅｃｉｅｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｂｏｖｉｎｅｒｕｍｅｎ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｕｍｉｎｉｓｓｐ．ｎｏｖ．ａｎｄＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｉｔｕｌｉｎｕｓｓｐ．ｎｏｖ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７，３７−４９（１９７３）とＫａｇｅｙａｍａＡ．ａｎｄＢｅｎｎｏＹ．，Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｉｔｓｕｏｋａｉｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅａｎａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｆａｅｃｅｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０，１５９５−１５９９（２０００）のデータをそれぞれ用いた。
＋：陽性、−：陰性、ｗ：弱陽性、ＮＴ：試験せず * L. Vitulinus JCM 1121 ^T and C.I. For Mitsukakai JCM 0609 ^T , Sharpa M. et al. E. Latham M .; J. et al. , Garvie E .; I. Zirngibl J. et al. and Kandler O. , Two new specialties of Lactobacillus isolated from the bovine rumen, Lactobacillus ruminis sp. nov. and Lactobacillus viturinus sp. nov. , J. et al. Gen. Microbiol. , 77, 37-49 (1973) and Kageyama A. et al. and Benno Y. et al. , Catenibacterium mitsuokai gen. nov. , Sp. nov. , A gram-positive analytical battery isolated from human faces, Int. J. et al. Syst. Evol. Microbiol. , 50, 1595-1599 (2000).
+: Positive,-: negative, w: weak positive, NT: not tested

ＳＴ１８株とこれら３種の菌株は下記の共通する性質を有する。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％ The ST18 strain and these three strains have the following common properties.
(1) Bacterial morphology: Aspergillus (2) Motility: None (3) Sporulation: None (4) Gram staining: Positive (5) Catalase reaction: Negative (6) Attitude toward oxygen: Absolute anaerobic (7) G + C content: 36-38 mol%

また、ＳＴ１８のＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９に対するＤＮＡ−ＤＮＡ相同性は、それぞれ、８１．８、９３．１、８９．２％であった。一般にＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が７０％以上であると同種であるとされる（ＳｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔＥ．Ｇ．ａｎｄＧｏｅｂｅｌＢ．Ｍ．，Ｔａｘｏｎｏｍｉｃｎｏｔｅ：ａｐｌａｃｅｆｏｒＤＮＡ−ＤＮＡｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｉｎｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４４：８４６−８４９（１９９４））。 Moreover, the DNA-DNA homology with respect to HM244, HM250, and DI49 of ST18 was 81.8, 93.1, and 89.2%, respectively. It is generally said that DNA-DNA homology is 70% or more (Stackebeg EG and Goebel BM, Taxonomic note: a place for DNA-DNA resis- tance and 16S rRNA sequence. specifications definition in bacteria, 44: 846-849 (1994)).

さらにこれら４種の１６ＳｒＲＮＡ相同性を調べたところ、９９％以上の相同性を示した。 Furthermore, when the homology of these four 16S rRNAs was examined, it showed 99% or more homology.

以上より、ＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０およびＤＩ４９は、同種に属する微生物であると判断された。ＳＴ１８は、シャーペア・アザブエンシスの基準株である。 From the above, it was determined that ST18, HM244, HM250 and DI49 are microorganisms belonging to the same species. ST18 is a reference stock for Charpea Azabuensis.

上記本発明のシャーペア属（Ｓｈａｒｐｅａ）微生物を得るには、通常の培養方法に準じて培養を行えばよい。例えば、ＡＢＣＭブイヨン培地に接種し、３７℃で２４時間培養して得ることができる。 In order to obtain the above-mentioned Sharpea microorganism of the present invention, culturing may be performed according to a normal culturing method. For example, it can be obtained by inoculating ABCM broth medium and culturing at 37 ° C. for 24 hours.

本発明の微生物製剤は、上記のように培養した本発明の微生物の培養液をそのまま用いることもできるが、遠心分離等の手段を用いて集菌した菌体をスキムミルク等に分散して懸濁液として用いてもよい。さらに、培養液や懸濁液を凍結乾燥等により乾燥させた乾燥菌体として用いることもできる。 The microorganism preparation of the present invention can use the culture solution of the microorganism of the present invention cultured as described above as it is, but the cells collected by means of centrifugation or the like are dispersed and suspended in skim milk or the like. It may be used as a liquid. Furthermore, it can also be used as a dried microbial cell obtained by drying a culture solution or suspension by freeze-drying or the like.

本発明の微生物製剤の剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができ、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等の賦形剤やその他フラクトオリゴ糖など各種のプロバイオティクス成分等の任意成分を配合することもできる。 The dosage form of the microorganism preparation of the present invention is not particularly limited, and can be any dosage form such as tablets, powders, granules, capsules, pellets, liquids, and the like. Glucose, sucrose, lactose, sucrose, skim milk An optional ingredient such as various probiotic ingredients such as excipients and other fructooligosaccharides can also be blended.

かくして得られた本発明の新規微生物を馬などの哺乳動物に投与することにより、微生物が消化管に付着・定着し、下痢や疝痛等の消化器疾患を予防・治療することができ、またストレスを軽減させることができる。さらに、摂取したダイゼインを代謝して、ダイハイドロダイゼインやエクオールを産生することができるため、これらのエストロゲン受容体活性化作用により骨増強効果等を得ることができる。投与量は１頭当たり１日に１×１０^６〜１×１０^１１ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、特に１×１０^７〜１×１０^１０ｃｆｕ程度が好ましい。なお、本発明においてストレスの軽減とは、本発明製剤の投与前後で血清アルブミンのフリーのＳＨ基保有率が例えば、対照群３頭の平均から、試験群の平均が１．５倍以上増加することをいう。 By administering the novel microorganism of the present invention thus obtained to a mammal such as a horse, the microorganism adheres to and settles in the digestive tract, and can prevent or treat digestive diseases such as diarrhea and colic, and stress. Can be reduced. Furthermore, since ingested daidzein can be metabolized to produce die hydrodaidzein and equol, a bone enhancing effect and the like can be obtained by activating these estrogen receptors. The dosage per day is preferably about 1 × 10 ⁶ to 1 × 10 ¹¹ cfu (colony forming unit), particularly about 1 × 10 ⁷ to 1 × 10 ¹⁰ cfu per day. In the present invention, stress reduction means that the serum albumin free SH group retention rate before and after the administration of the preparation of the present invention is, for example, an increase of 1.5 times or more in the test group from the average of 3 control groups. That means.

本発明の微生物製剤は、哺乳動物に直接経口投与してもよく、飼料や餌等に混ぜて投与してもよい。なお、本発明の微生物製剤の投与対象である哺乳動物としては、ヒト、馬、牛、豚、ヒツジ、山羊等が例示できる。 The microbial preparation of the present invention may be directly orally administered to mammals, or may be administered by mixing with feed or feed. Examples of mammals to which the microorganism preparation of the present invention is administered include humans, horses, cows, pigs, sheep, goats and the like.

本発明の経口組成物は、上記微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有するものである。このダイゼイン含有物としては、精製されたダイゼインだけでなく、ダイゼインを含有する大豆、その大豆を原料とした食品である豆乳、豆腐、納豆、そして、クズ、葛根、グワーオクルア、ザクロなども含まれる。 The oral composition of this invention contains the fermented material obtained by making the said microorganisms act on a daidzein containing material. This daidzein-containing product includes not only refined daidzein but also soy milk containing daidzein, soy milk, tofu, natto, foods made from the soy, and kudzu, kudzu, guwaokarua, pomegranate and the like.

発酵にあたっては、上記ダイゼイン含有物を基質として通常の発酵方法に従って上記シャーペア属微生物を培養することにより行うことができる。すなわち、ＡＢＣＭブイヨン培地、ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ）、ＧＡＭ液体培地（日水製薬）等の栄養培地または牛乳、豆乳などの食品素材に、滅菌したダイゼイン含有物およびシャーペア属微生物を添加し、３７℃程度で３〜５日間程度発酵させることにより行うことができる。基質となるダイゼイン含有物は、ダイゼインの含有量を２００ｍＭ以上添加することが好ましい。また、微生物の接種量は、０．２〜１．０％程度が好ましい。 Fermentation can be performed by culturing the above Charpea microorganisms according to a normal fermentation method using the daidzein-containing material as a substrate. That is, a sterilized daidzein-containing material and a Charpea pair microorganism are added to a nutrient medium such as ABCM broth medium, MRS liquid medium (Oxoid), GAM liquid medium (Nissui Pharmaceutical) or food materials such as milk and soy milk, and 37 ° C. It can be carried out by fermentation for about 3 to 5 days. The daidzein-containing material serving as a substrate is preferably added with a daidzein content of 200 mM or more. Further, the inoculation amount of the microorganism is preferably about 0.2 to 1.0%.

本発明の経口組成物は上記発酵物をそのまま食品や医薬品の形態として用いることができるが、常法にしたがって、ダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールを分離・精製してもよい。分離・精製方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いる方法が例示できる。 In the oral composition of the present invention, the fermented product can be used as it is as a form of food or medicine, but dihydrodaidzein and / or equol may be separated and purified according to a conventional method. Examples of the separation / purification method include a method using high performance liquid chromatography (HPLC).

上記発酵物または分離精製したダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールを、適当な飲食品原料または医薬用担体を用いて本発明の経口組成物を調製することができる、飲食品形態としては、例えば、乳酸菌飲料、ヨーグルト等の発酵乳、野菜の発酵物（漬物）等が例示できる。 The above-mentioned fermented product or separated and purified dihydrodaidzein and / or equol can be used to prepare the oral composition of the present invention using an appropriate food or beverage material or pharmaceutical carrier. Examples include beverages, fermented milk such as yogurt, fermented vegetables (pickles), and the like.

医薬品形態とするための医薬用担体としては、例えばブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等が挙げられ、また剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができる。 Examples of the pharmaceutical carrier for obtaining a pharmaceutical form include glucose, sucrose, lactose, sucrose, skim milk and the like, and the dosage form is not particularly limited, and tablets, powders, granules, capsules, pellets, It can be set as arbitrary dosage forms, such as a liquid agent.

医薬用経口組成物の投与量は、疾患の程度、被投与者の年齢等によって異なるが、一般には、大人１日当たりダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールとして１００ｎＭ〜１，０００ｎＭ程度となる量を投与すれば良い。本発明の医薬用経口組成物は、有効成分であるダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールのエストロゲン受容体活性作用により、動脈硬化や骨粗鬆症の予防・治療効果を奏する。 The dose of the oral pharmaceutical composition varies depending on the degree of the disease, the age of the recipient, etc., but in general, the amount of dihydrodaidzein and / or equol is about 100 nM to 1,000 nM per day for an adult. It ’s fine. The oral pharmaceutical composition of the present invention has an effect of preventing and treating arteriosclerosis and osteoporosis due to the estrogen receptor activity of dihydrodaidzein and / or equol, which are active ingredients.

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example is given and the present invention is explained still in detail, the present invention is not limited to these.

実施例１
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の培養：
ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研化学社製）５Ｌをフラスコに入れ、ｐＨを７．２に調整しオートクレーブで、１１５℃、１５分間の滅菌を行った。このＡＢＣＭブイヨン培地に、予め、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）で４８時間培養したコロニーを釣菌し、ＡＢＣＭブイヨン培地で２４時間のプレ培養したシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株培養液を０．２容量％接種し、３７℃、２４時間静置培養した。この培養液を３０００×ｇで遠心分離し集菌して湿重量約４ｇ／５Ｌの菌体ペレットを得た。 Example 1
Culture of Charpea azabuensis ST18 strain:
5 L of ABCM broth medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) was placed in the flask, the pH was adjusted to 7.2, and sterilization was performed at 115 ° C. for 15 minutes with an autoclave. In this ABCM bouillon medium, colonies previously cultured for 48 hours on BL agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) were fished, and a culture solution of Charpea azabuensis ST18 strain precultured for 24 hours in ABCM bouillon medium was added to the culture medium. 2% by volume was inoculated and incubated at 37 ° C. for 24 hours. This culture solution was centrifuged at 3000 × g and collected to obtain a cell pellet having a wet weight of about 4 g / 5 L.

実施例２
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株含有微生物製剤の調製：
実施例１により得られた菌体ペレットを生理食塩水で洗浄した。その菌体ペレット
４ｇ（湿重量）を滅菌１０％スキムミルク４６ｍｌに懸濁し、凍結乾燥処理をして凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に５質量倍のスキムミルク粉末を加えて均一に混合して本発明の微生物製剤を得た。この微生物製剤は、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を４.５×１０^１０ｃｆｕ／ｇ含有するものであった。 Example 2
Preparation of microbial preparation containing Charpea Azabuensis ST18 strain:
The cell pellet obtained in Example 1 was washed with physiological saline. 4 g (wet weight) of the bacterial cell pellets were suspended in 46 ml of sterilized 10% skim milk and lyophilized to obtain a lyophilized powder. The lyophilized powder was added with 5 mass times skim milk powder and mixed uniformly to obtain the microbial preparation of the present invention. The microorganism preparation contained 4.5 × 10 ¹⁰ cfu / g of Charpea azabuensis ST18 strain.

試験例１
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の消化管付着性試験１：
実施例１で得られた菌体ペレット４ｇ（湿重量）を、あらかじめ滅菌しておいた１０％スキムミルク溶液４６ｍｌに懸濁し−８５℃で急冷した。融解試験を行ったところ、１×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの生菌数が認められた。この懸濁液１ｍｌを１０ｍｌの滅菌１０％スキムミルク溶液に再懸濁して試料とした。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１１ｍｌを５日間連日、シリンジで経口投与した（試験区）。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、１１ｍｌの滅菌１０％スキムミルクを５日間連続で経口投与した。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表２に示す。 Test example 1
Gastrointestinal adherence test of Charpea azabuensis ST18 strain 1:
4 g (wet weight) of the bacterial cell pellet obtained in Example 1 was suspended in 46 ml of a 10% skim milk solution that had been sterilized in advance, and rapidly cooled at -85 ° C. When a thawing test was performed, a viable cell count of 1 × 10 ¹⁰ cfu / ml was observed. 1 ml of this suspension was resuspended in 10 ml of a sterile 10% skim milk solution to prepare a sample. 11 ml of this sample was orally administered to two 1-year-old mares and 1 1-year-old stallion daily by syringe for 5 days (test area). In the control group, 11 ml of sterile 10% skim milk was orally administered to two 1-year-old mares and one 1-year-old stallion for 5 consecutive days. Bacterial count of Charpea azabuensis ST18 strain was measured in the feces of each horse before administration and 10 days after the last administration day. The number of bacteria was the average value of each test section. The results are shown in Table 2.

対照区では、ほとんど菌数の変化は見られなかったが、試験区では菌数が1オーダー増加していることから、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が定着後に増殖しているものと考えられた。 In the control group, there was almost no change in the number of bacteria, but in the test group, the number of bacteria increased by one order. Therefore, it was considered that the Charpea azabuensis ST18 strain grew after colonization.

試験例２
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の下痢症・疝痛予防効果：
試験例１において、それぞれの馬について試料投与開始から３０日間糞便の状態を観察し、各試験区について軟便が確認された延べ日数を調べた。対照区では、延べ８日間の軟便が確認されたのに対し、試験区では、軟便は認められなかった。また、対照区では、延べ５日間の疝痛の徴候が確認されたのに対し、試験区では疝痛の徴候はみられなかった。したがって、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が有する馬への下痢症・疝痛予防効果が認められた。 Test example 2
Anti-diarrhea and colic prevention effect of Charpea Azabuensis ST18 strain:
In Test Example 1, the state of stool was observed for 30 days from the start of sample administration for each horse, and the total number of days in which soft stool was confirmed was examined for each test section. In the control plot, loose stool was confirmed for a total of 8 days, whereas no loose stool was observed in the test plot. In the control group, signs of colic were observed for a total of 5 days, whereas no signs of colic were observed in the test group. Therefore, the effect of preventing diarrhea and colic on horses possessed by Charpea Azabuensis ST18 strain was observed.

試験例３
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の消化管付着性試験２：
実施例２により得られた微生物製剤を試料として用いた。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１．５ｇを飼葉０．５ｋｇの上に置いて投与する方法により５日間連続投与した（試験区）。完食を確認後、飼葉を自由摂取させた。試験例６とは別の個体を用いた。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、５日間、飼葉を自由摂取させた。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表３に示す。 Test example 3
Gastrointestinal adherence test of Charpea azabuensis ST18 strain 2:
The microbial preparation obtained in Example 2 was used as a sample. Two 1.5-year-old mares and one 1-year-old stallion were administered continuously for 5 days by a method in which 1.5 g of this sample was placed on 0.5 kg of fodder (test group). After confirming the complete meal, the fodder was ingested freely. An individual different from Test Example 6 was used. In the control group, two 1-year-old mares and 1 1-year-old stallion were allowed free access to fodder for 5 days. Bacterial count of Charpea azabuensis ST18 strain was measured in the feces of each horse before administration and 10 days after the last administration day. The number of bacteria was the average value of each test section. The results are shown in Table 3.

この結果から、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株は、乾燥粉末投与によっても、定着後増殖しているものと考えられた。 From these results, it was considered that the Charpea azabuensis ST18 strain was proliferated after colonization even by administration of dry powder.

試験例４
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の馬のストレス軽減効果：
哺乳動物のストレス度合いは、血清中のアルブミンにおけるフリーＳＨ基保有率を指標とした。馬のストレスが高くなるとアルブミン中のフリーＳＨ基が酸化されこの割合が低下すると考えられる。測定方法は、Ｆａｂｓｉａｋらの方法に準じた（ＦａｂｓｉａｋＪ．Ｐ．，ＳｅｄｅｌｏｖＡ．ａｎｄＫａｇｏｎＶ．Ｅ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｘｄａｔｉｖｅ／ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＹＳ３４ｉｎｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｍｉｎｕｓｉｎｇａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄＳＤＳ−ＰＡＧＥａｓｓａｙ，ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓａｎｄＲｅｄｏｘＳｉｇｎａｌ，５，８５５−８６５（２００２））。 Test example 4
Sharpe Azabu Ensis ST18 Strain Reduces Horse Stress:
The degree of stress in mammals was determined using the free SH group possession rate in serum albumin as an index. It is considered that when the horse's stress increases, free SH groups in albumin are oxidized and this ratio decreases. The measurement method was in accordance with the method of Fabsik et al. (Fabsik JP, Sedlov A. and Kagon VE, Quantification of ox and blu ed s num in s um s in s um ins um s in s Antioxidants and Redox Signal, 5, 855-865 (2002)).

すなわち、試験例１および３のシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を含有する試料を投与したうちの３馬について、馬用微生物製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後の血液を採取しその血清を得た（ＳＴ１８株投与群）。それから得られた馬血清を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.４）により１００倍に希釈したものをサンプルとした。次に、このサンプルの２５０μｌに２４０μＭのＴｈｉｏ−Ｇｌｏ１（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ製）を２５μｌ（終濃度２０μＭ）と、３６０ｍＭのＳＤＳ（終濃度３０ｍＭ）またはＰＢＳの２５μｌを加え、分注器で混合した。これとは別にスタンダードとしてＤＴＴで還元したＢＳＡの５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌを同様に用意した後、６０℃で４５分間反応させる。続いて室温にて１５分間インキュベートし、これを３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの蛍光波長で蛍光強度を測定した。また、サンプルの６０μｌに（−）ＢＰＢの４×サンプルバッファー２０μｌを添加しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。
このサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動後のゲルのバンドをトランスイルミネーター（フナコシ社製）で写真を撮り、強度を数値化した。続いてＣＢＢＲにて染色し写真撮影後、アルブミンとしてのタンパク量もＮＩＨ−Ｉｍａｇｅで求めた。この蛍光強度を、ｓｔａｎｄａｒｄＢＳＡの蛍光強度に換算した血清量／通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白定量から、血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を求めた。通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白量は、ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で求めた。対照として、試験例１および３において、ＳＴ１８株を投与しなかった馬のうち３頭について同様に試験した（ＳＴ１８株無投与群）。結果を図３に示す。 That is, for 3 horses that were administered a sample containing the Charpea Azabuensis ST18 strain of Test Examples 1 and 3, on the 5th day of the 5 days of administration of the microbial preparation for horses, the first day of the end of the 5 days of administration, After 9 days from the end of administration, 15 days after the end of administration, 22 days after the end of administration and 30 days after the end of administration, blood was collected to obtain the serum (ST18 strain administration group). A sample obtained by diluting horse serum obtained from it 100-fold with 10 mM PBS (pH 7.4) was used as a sample. Next, 25 μl (final concentration 20 μM) of 240 μM Thio-Glo1 (Carbiochem) and 250 μl of 360 mM SDS (final concentration 30 mM) or PBS were added to 250 μl of this sample and mixed with a dispenser. Separately, 500 μg / ml, 1000 μg / ml and 2000 μg / ml of BSA reduced with DTT as a standard are prepared in the same manner, and then reacted at 60 ° C. for 45 minutes. Subsequently, the mixture was incubated at room temperature for 15 minutes, and the fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm. Further, a sample for SDS-PAGE was prepared by adding 20 μl of 4 × sample buffer of (−) BPB to 60 μl of the sample.
This sample was subjected to SDS-PAGE electrophoresis. The gel band after electrophoresis was photographed with a transilluminator (Funakoshi Co., Ltd.), and the intensity was digitized. Subsequently, after staining with CBBR and taking a photograph, the amount of protein as albumin was also determined by NIH-Image. The amount of free SH groups in serum albumin was determined from the amount of serum converted to the fluorescence intensity of standard BSA / quantity of normal (Bradford) protein. The protein amount of normal (Bradford) was calculated | required by Protein Assay Kit (made by Bio-Rad). As a control, in Test Examples 1 and 3, three horses that did not receive the ST18 strain were similarly tested (ST18 strain non-administered group). The results are shown in FIG.

シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群は、無投与群に比べて血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率が有意に高く、ストレスが軽減されている結果が得られた。また、そのストレス軽減効果は、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与を止めた４週間後でも持続していることが認められた。 The sharper azabuensis ST18 strain administration group had a significantly higher free SH group retention rate in serum albumin than the non-administration group, and the result that stress was reduced was obtained. In addition, it was confirmed that the stress-reducing effect was maintained even 4 weeks after the administration of the Charpea Azabuensis ST18 strain was stopped.

試験例５
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のラットに対する拘束ストレス軽減効果：
ラットに拘束ストレスを負荷し、血中コルチコステロンの濃度を測定することによりストレス軽減効果を評価した。金属製の拘束装置を用い、ラットを８時間（午前０時〜午前８時）拘束した。拘束の前後で尾静脈からの採血を行いコルチコステロンの血中濃度を測定した。コルチコステロン量の測定は、ＡＣＴＩＶＥＲａｔＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅＥＩＡｋｉｔ（ＤＳＬ社、１０−８１１００）を用いてイムノアッセイ法で測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。微生物を与えない群をコントロールとした。５日目に拘束ストレスをかけ、前日の血中コルチコステロン濃度と拘束ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図４に示す。 Test example 5
Restraint stress reduction effect on rats of Charpea Azabuensis ST18 strain:
The restraint stress was applied to the rats, and the stress reduction effect was evaluated by measuring the blood corticosterone concentration. Rats were restrained for 8 hours (0:00 am to 8:00 am) using a metal restraining device. Blood was collected from the tail vein before and after restraint and the blood concentration of corticosterone was measured. The amount of corticosterone was measured by immunoassay using ACTIVE Rat Corticosterone EIA kit (DSL, 10-81100). The test group was orally administered for 5 consecutive days (n = 6) with an amount of 10 to the 8th power level of the Sharpe Azabuensis strain ST18 obtained in Examples 1 and 3. A group not given the microorganism was used as a control. On the fifth day, restraint stress was applied, and blood corticosterone concentration in the previous day and blood corticosterone concentration after restraint stress were determined. The results are shown in FIG.

コントロール群および微生物投与群ともにストレス負荷をかける前は、１００ｎｇ／ｍｌ未満の範囲であった。コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群はコントロール群に比べて、ストレス付加後の血中コルチコステロン濃度は低くなり、ストレス軽減効果が認められた。 Before applying stress load in both the control group and the microorganism administration group, the range was less than 100 ng / ml. In the control group, the amount of corticosterone in the blood was significantly increased after stress loading, and it was confirmed that effective stress stimulation was loaded. Compared with the control group, the sharpia azabuensis ST18 strain administration group had a lower blood corticosterone concentration after stress application, and a stress-reducing effect was observed.

試験例６
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のラットに対する強制水泳ストレス軽
減効果：
直径２０ｃｍ、高さ５０ｃｍのプラスチック製の円筒に２７℃の水を４０ｃｍまで入れ、ラットを１５分間の強制的に水泳をさせ、強制水泳前後で尾静脈から採血し血中コルチコステロン量を測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。微生物を与えない群をコントロールとした。５日目に強制水泳させ、前日の血中コルチコステロン濃度と強制水泳ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図５に示す。 Test example 6
Reduction of forced swimming stress in rats by Charpea Azabuensis ST18 strain:
A plastic cylinder with a diameter of 20 cm and a height of 50 cm is filled with water at 27 ° C up to 40 cm. The rat is forced to swim for 15 minutes, and blood is collected from the tail vein before and after forced swimming to measure the amount of corticosterone in the blood. did. The test group was orally administered for 5 consecutive days (n = 6) with an amount of 10 to the 8th power level of the Sharpe Azabuensis strain ST18 obtained in Examples 1 and 3. A group not given the microorganism was used as a control. On the fifth day, forced swimming was performed, and blood corticosterone concentration on the previous day and blood corticosterone concentration after forced swimming stress were determined. The results are shown in FIG.

コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ＳＴ１８株投与群は、コントロール群に比べ、ストレス負荷後の血中コルチコステロン量が抑制され、ラットに対するストレス軽減効果があることがわかった。 In the control group, the amount of corticosterone in the blood was significantly increased after stress loading, and it was confirmed that effective stress stimulation was loaded. In the ST18 strain administration group, it was found that the amount of corticosterone in the blood after stress load was suppressed and the effect of reducing stress on rats was found compared to the control group.

試験例７
馬腸内フローラにおけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の分布（１）
国内各地の生産牧場および厩舎における０（当歳）〜３３歳までの様々な年齢の牡７頭、牝９頭の糞便を採取し、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によりシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を保有しているか調べた。その結果、ＳＴ１８株は１６頭中１４頭から検出されたことから、生産牧場や厩舎には関係なく、健常な馬の腸内フローラに普遍的に存在している微生物であると考えられる。したがって、本発明のシャーペア属微生物は馬に投与しても安全性の高いものである。 Test example 7
Distribution of Charpea azabuensis ST18 strain in equine flora (1)
Collecting feces of 7 males and 9 females of various ages from 0 (current year) to 33 years old at production ranches and stables in various parts of Japan, and possessing Charpea Azabu Ensis ST18 strain by PCR-DGGE method I checked. As a result, ST18 strain was detected from 14 out of 16 animals, so it is considered to be a microorganism that is universally present in the intestinal flora of healthy horses regardless of the production farm or stable. Therefore, the Charpea microorganism of the present invention is highly safe even when administered to horses.

試験例８
馬腸内フローラにおけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の分布（２）
下記表５に示した健常なサラブレッド１２頭（Ａ〜Ｌ）の新鮮な糞便について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ）法により、シャーペア・アザブエンシスの分布を調べた。これらのサラブレッドは、糞便の採取１ヶ月以内に、生菌剤は使用していない。Ｗａｌｔｅｒら（ＷａｌｔｅｒＪ．，ＨｅｒｔｅｌＣ．，ＴａｎｎｏｃｋＧ．Ｗ．，ＬｉｓＣ．Ｍ．，ＭｕｎｒｏＫ．ａｎｄＨａｍｍｅｓＷ．Ｐ．，ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ，Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ，ａｎｄＷｅｉｓｓｅｌｌａｓｐｅｃｉｅｓｉｎｈｕｍａｎｆｅｃｅｓｂｙｕｓｉｎｇｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７，２５７８−２５８５（２００１））の文献に基づくＰＣＲ条件と、大腸菌の１６ＳｒＲＮＡ配列のＮｏ．３４１−５３４領域で３４０ｂｐを増幅させる下記のプライマーＬａｃ１とＬａｃ２ＧＣを用いた。 Test example 8
Distribution of Charpea azabuensis ST18 strain in equine flora (2)
About 12 healthy thoroughbred (A to L) fresh feces shown in Table 5 below, the distribution of Charpeas azabuensis was examined by denaturant concentration gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) method. These thoroughbreds do not use viable bacteria within one month of stool collection. Walter et al. (Walter J., Hertel C., Tannock GW, Lis CM, Munro K. and Hammes W. P., Detection of Lactobacillus , Pediococus , Leuconostoc , Leuconocus , Leuconescus , Leuconescus. -Specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresis, Appl. Environ. Microbiol., 67, 2578-2585 (2001)) and the 16S rRNA sequence of E. coli. The following primers Lac1 and Lac2GC that amplify 340 bp in the 341-534 region were used.

＜ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒＬａｃ１＞
５′−ＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡ−３′
＜ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒＬａｃ２ＧＣ＞
５′−ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＡＣ
ＣＧＧＧＧＧＡＴＴＹＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧ−３′ <Forward primer Lac1>
5'-AGCAGTAGGGGAATCTTCCA-3 '
<Reverse primer Lac2GC>
5'-CGCCCCGGGGCGCGCCCCGGGGGGCCCGGGGGACAC
CGGGGGATTYCACCGCTACACATG-3 '

ＤＧＧＥ泳動には、ＤＣｏｄｅシステム装置（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、各種糞便からシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の検出を試みた。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の検出は次のようにして行った。変性剤（尿素とホルムアミド）で３７．５％から５２．５％の濃度勾配をつけた８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルを用いた。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に浸して、６０Ｖで１４時間、泳動した。泳動後のゲルは、１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液２５ μｌを添加した２５０ｍｌＴＡＥ緩衝液で染色した。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のバンドの特定は、純粋培養したシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の移動度、およびそのバンドを切り出しての１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定によって、９８％以上の相同性のあるものをシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株とした。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定も上記と同様の方法により行った。結果を図６に示す。 For DGGE electrophoresis, detection of Charpea azabuensis ST18 strain was attempted from various feces using a DCode system apparatus (Bio-Rad Laboratories). The detection of Charpea azabuensis ST18 strain was performed as follows. An 8% (wt / vol) polyacrylamide gel with a denaturant (urea and formamide) and a gradient of 37.5% to 52.5% was used. It was immersed in a Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer solution and electrophoresed at 60 V for 14 hours. The gel after electrophoresis was stained with 250 ml TAE buffer supplemented with 25 μl of a 10 mg / ml ethidium bromide solution. The identification of the band of the Charpea azabuensis ST18 strain was determined by determining the mobility of the purely cultured Charpea azabuensis ST18 strain, and sequencing the 16S rDNA gene by excising the band, and determining those having a homology of 98% or more. It was named Azabu Ensis ST18 strain. The 16S rDNA gene sequencing was also performed by the same method as described above. The results are shown in FIG.

図６に示すとおり、１２頭中１０頭（Ａ〜Ｈ、Ｋ、Ｌ）のサラブレットからシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が検出された。この結果から、この菌種は、健常なサラブレッドの消化管内に広く分布し、またバンドの濃さの強弱は菌数を反映していることから、腸内フローラの中で優勢に生育していることが認められた。 As shown in FIG. 6, Charpea azabuensis ST18 strain was detected from 10 out of 12 (AH, K, L) thoroughbreds. From this result, this bacterial species is widely distributed in the digestive tract of healthy Thoroughbreds, and the intensity of the band reflects the number of bacteria, so it grows predominantly in the intestinal flora It was recognized that

試験例９
ダイハイドロダイゼインおよびエクオール産生：
９９０ｍｌの蒸留水にＡＢＣＭブイヨン培地（栄研）４６ｇを溶解し、オートクレーヴで１２１℃、１５分間の滅菌を行なった。室温にもどしたＡＢＣＭブイヨン培地に、フィルター滅菌した１０ｍｌ水溶液のダイゼインを２００μｌになるように添加した。ＳＴ１８を予めＡＢＣＭブイヨン培地で培養し、その培養液０．２％を接種して、スチールウール法にて嫌気し、３７℃で３６時間培養した。
その培養液について、Ｗａｎｇらの方法（ＷａｎｇＸ．Ｌ．，ＨｕｒＨ．Ｇ．，ＬｅｅＪ．Ｈ．ａｎｄＫｉｍＳ．Ｉ．，ＥｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＳ−ｅｑｕｏｌｆｒｏｍｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎｂｙａｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄａｎａｅｒｏｂｉｃｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１，２１４−２１９（２００５））に基づくＨＰＬＣ法により、ダイゼイン、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールを定量した。標品として用いたダイゼインはＬＣＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、ダイハイドロダイゼインはＴｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓから、エクオールはＬＣＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからそれぞれ購入した。ＨＰＬＣのクロマトグラムを図７に示す。 Test example 9
Daihydrodaidzein and equol production:
46 g of ABCM bouillon medium (Eiken) was dissolved in 990 ml of distilled water and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes in an autoclave. A 10 ml aqueous solution of daidzein sterilized by filter was added to the ABCM bouillon medium returned to room temperature so as to be 200 μl. ST18 was previously cultured in ABCM broth medium, 0.2% of the culture solution was inoculated, anaerobic by the steel wool method, and cultured at 37 ° C. for 36 hours.
For the culture solution, the method of Wang et al. (Wang XL, Hur H. G., Lee J. H. and Kim S. I., and the biosynthesis of the biosynthesis of the physic acid in the physics of the biophysic acid in the physic physic. , Appl. Environ. Microbiol., 71, 214-219 (2005)), daidzein, dihydrodaidzein and equol were quantified. Daidzein used as a sample was purchased from LC Laboratories, Daihydrodaidzein was purchased from Toronto Research Chemicals, and equol was purchased from LC Laboratories. The chromatogram of HPLC is shown in FIG.

ＳＴ１８培養前のクロマトグラムでは、培地に予め添加したダイゼインのピークのみが検出された。培養３６時間後のクロマトグラムでは、ダイゼインのピークは予め添加した量のほぼ半分になり、図７のとおり、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールのピークが検出されたことから、そのダイゼインのピーク減少分が、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールに転換されていた。さらに３日間以上培養すると、ダイゼインとダイハイドロダイゼインを示すピークは完全に消失し、エクオールを示すピークが、培養３６時間時の２倍を示していた。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株は、ダイゼインを資化し、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールを産生する能力を有することが示された。 In the chromatogram before ST18 culture, only the peak of daidzein previously added to the medium was detected. In the chromatogram after 36 hours of culturing, the peak of daidzein was almost half of the amount added in advance, and as shown in FIG. 7, the peaks of daid hydrodaidzein and equol were detected. Dihydrodaidzein and equol were converted. When the cells were further cultured for 3 days or more, the peaks indicating daidzein and dihydrodaidzein disappeared completely, and the peak indicating equol was double that at 36 hours of culture. The Charpea Azabu Ensis ST18 strain was shown to have the ability to assimilate daidzein and produce daid hydrodaidzein and equol.

本発明の新属であるシャーペア属微生物は、消化管に対して良好な付着性および定着性を示し、下痢や疝痛など消化器疾患の予防・治療効果を有し、またにストレス軽減効果などプロバイオティクス効果をも有するとともに、エストロゲン受容体活性を示すダイハイドロダイゼインおよびエクオール産生能を有するものである。 A new genus of the present invention, the Charpea microorganism, exhibits good adhesion and colonization to the gastrointestinal tract, has the effect of preventing and treating gastrointestinal diseases such as diarrhea and colic, and has a prophylactic effect such as stress reduction. In addition to having a biotic effect, it has the ability to produce dihydrodaidzein and equol exhibiting estrogen receptor activity.

ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、弱い女性ホルモン（エストロゲン）作用を示す。ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、腸内細菌によりダイゼインから産生されるが、その産生能力は個人差が大きい。ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、女性の乳がんなど性ホルモンが関連する病気に影響を与えているのではないかと考えられている。また男性においても、前立腺がんは、性ホルモンと関連するがんで、女性ホルモンの働きをする薬や男性ホルモンの働きを押さえる薬が治療に使われてきた。本菌の作るダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、上記のような効果にも貢献する。 Daihydrodaidzein and equol show a weak female hormone (estrogenic) action. Daihydrodaidzein and equol are produced from daidzein by intestinal bacteria, but their production ability varies greatly from individual to individual. Daihydrodaidzein and equol are thought to affect diseases related to sex hormones, such as breast cancer in women. Also in men, prostate cancer is related to sex hormones, and drugs that act as female hormones or drugs that suppress male hormones have been used for treatment. Daihydrodaidzein and equol produced by this bacterium contribute to the above effects.

哺乳動物の糞便を用いることにより、安価、簡便かつ迅速なエクオール検出法（特願２００５−５５０５８号：特開２００６−２４２６０２号公報）が開発された。それにより、エクオール産生菌の有無を試験できるので、消化管内でエクオールを産生していない個体ごとに本菌の投与を行なうことも可能となる。 An inexpensive, simple and quick equol detection method (Japanese Patent Application No. 2005-55058: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-242602) has been developed by using mammalian feces. Thereby, since the presence or absence of equol-producing bacteria can be tested, it is possible to administer this bacteria for each individual who does not produce equol in the digestive tract.

したがって、本発明の微生物は、哺乳動物に投与する微生物製剤やその発酵物を含有する飲食品または医薬品として有用なものである。 Therefore, the microorganism of the present invention is useful as a food / beverage product or a medicine containing a microbial preparation to be administered to a mammal or a fermented product thereof.

シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の光学顕微鏡写真である。It is an optical micrograph of Charpea pair azabuensis ST18 strain. クロストリジウムクラスターＸＶ〜ＸＩＸに属する既知の種とシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０およびＤＩ４９との関係を示した系統樹である。It is a phylogenetic tree showing the relationship between known species belonging to the Clostridium clusters XV to XIX and Charpea azabuensis ST18, HM244, HM250 and DI49. 試験例４において、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群と無投与群との血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を示す図である。In Experiment 4, it is a figure which shows the free SH group possession rate in the serum albumin of a Charpea azabuensis ST18 strain administration group and a non-administration group. 試験例５における、拘束ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。It is a figure which shows the blood corticosterone density | concentration before and after restraint stress load in the test example 5. FIG. 試験例６における、強制水泳ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。It is a figure which shows the blood corticosterone density | concentration before and after the forced swimming stress load in the test example 6. FIG. 試験例８における、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のＰＣＲ−ＤＧＧＥ電気泳動図である。It is a PCR-DGGE electrophoretic diagram of Charpea azabuensis ST18 strain in Test Example 8. 試験例９における、培養３６時間後のＨＰＬＣクロマトグラムである。10 is an HPLC chromatogram after 36 hours of culture in Test Example 9.

Claims

配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％ It comprises the nucleotide sequence of 16S rRNA gene shown in SEQ ID NO: 1 in homology of 97% or more, Shapea exhibits the following mycological properties having stress-reducing action, Azabuenshisu (Sharpea azabuensis).
(1) Bacterial form: Neisseria gonorrhoeae (2) Motility: No (3) Sporulation: No (4) Gram staining: Positive (5) Catalase reaction: Negative (6) Attitude toward oxygen: Absolute anaerobic (7) G + C content: 36-38 mol%

下記の化学分類学的性質を有するものである請求項１記載のシャーペア・アザブエンシ
ス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）。
近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｍｉｔｓｕｏｋａｉ）ＪＣＭ０６０９^Ｔ株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）ＪＣＭ１１２１^Ｔ株およびラク
トバチルス・カテナフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｔｅｎａｆｏｒｍ
ｉｓ）ＪＣＭ１１４３^Ｔ株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満 The Charpea azabuenshi according to claim 1, which has the following chemical taxonomic properties :
Scan (Sharpea azabuensis).
Is a closely related species of the type strain catheter two Corynebacterium Mitsuokai (Catenibacter
ium mitsuokai) JCM 0609 ^T Co., Lactobacillus Viturinisu (Lactobacillus vitulinus) JCM 1121 ^T lines and easy Tobachirusu Catena folder miss (Lactobacillus catenaform
is ) DNA-DNA homology with JCM 1143 ^T strain is less than 60%

シャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）ＳＴ１８株（寄託番号ＮＩＴＥＰ−３００）である請求項１または２に記載のシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）。 The Charpea azabuensis ( Sharpea azabuensis ) ST18 strain (deposit number NITE P-300), the Charpea azabuensis ( Sharpea azabuensis ) according to claim 1 or 2.

請求項１ないし３の何れかの項に記載のシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）を含有することを特徴とする微生物製剤。 A microbial preparation comprising the Sharpa azabuensis according to any one of claims 1 to 3 .

哺乳動物用である請求項４に記載の微生物製剤。 The microorganism preparation according to claim 4 , which is used for mammals.

哺乳動物が馬である請求項５記載の微生物製剤。 The microbial preparation according to claim 5 , wherein the mammal is a horse.

哺乳動物の下痢および／または疝痛の予防・治療用である請求項４ないし６の何れかの項に記載の微生物製剤。 The microbial preparation according to any one of claims 4 to 6 , which is used for prevention / treatment of diarrhea and / or colic in mammals.

哺乳動物が馬である請求項７記載の微生物製剤。 The microorganism preparation according to claim 7 , wherein the mammal is a horse.

哺乳動物の抗ストレス用である請求項４ないし６の何れかの項に記載の微生物製剤。 The microorganism preparation according to any one of claims 4 to 6 , which is used for antistress in mammals.

哺乳動物が馬である請求項９記載の微生物製剤。 The microorganism preparation according to claim 9 , wherein the mammal is a horse.

非ヒト哺乳動物に請求項１ないし３の何れかの項記載のシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）を含有する微生物製剤を投与することを特徴とする非ヒト哺乳動物のストレス低減方法。 Stress reduction method of a non-human mammal, which comprises administering a microorganism formulation containing Shapea-Azabuenshisu of any claim, wherein of claims 1 to non-human mammal 3 (Sharpea azabuensis).

非ヒト哺乳動物が馬である請求項１１記載のストレス低減方法。 Stress-reducing method according to claim 1 1, wherein the non-human mammal is a horse.

請求項１ないし３の何れかの項に記載のシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有することを特徴とする経口組成物。 Shapea-Azabuenshisu (Sharpea azabuensis) an oral composition characterized by containing a fermented product obtained by acting on the daidzein-containing substance according to any one of claims 1 to 3.

ダイゼイン含有物が、大豆、豆乳、クズ、葛根、グワーオクルアおよびザクロよりなる群から選ばれたものである請求項１３記載の経口組成物。 Daidzein inclusions, soybean, soybean milk, kudzu, kudzu root, claims 1 to 3 oral composition, wherein a member selected from the group consisting of Guwaokurua and pomegranate.

飲食物である請求項１３または１４記載の経口組成物。 Food in a claim 1 3 or 1 4 oral composition.

医薬品である請求項１３または１４記載の経口組成物。 Claim 1 3 or 1 4 oral composition wherein the pharmaceutical.

骨粗鬆症または動脈硬化の予防・治療用である請求項１６記載の経口組成物。 The oral composition according to claim 16, which is used for prevention / treatment of osteoporosis or arteriosclerosis.

請求項１ないし３の何れかの項に記載のシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）をダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするハイドロダイゼインおよび／またはエクオールの製造方法。 Hydro daidzein and / or equol production method which comprises causing to act Shapea-Azabuenshisu according to (Sharpea azabuensis) daidzein-containing substance to any of claims 1 to 3.

請求項１ないし３の何れかの項に記載のシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）をダイゼインおよび／またはハイドロダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするエクオールの製造方法。 Equol production method which comprises causing to act Shapea-Azabuenshisu according to any one of claims 1 to 3 (Sharpea azabuensis) to daidzein and / or hydro-daidzein-containing substance.