JP5409636B2 - 抗ｃ型肝炎ウイルス組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、「HCV」ともいう）の感染予防又は増殖抑制に有用な医薬組成物に主に関する。
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、プラス一本鎖RNAを遺伝子として持っている。HCVのRNAから翻訳される約3000アミノ酸からなる巨大な前駆体蛋白質は、宿主細胞由来およびウイルス由来の蛋白分解酵素により、ウイルス粒子を構成するコア蛋白質とエンベロープ蛋白質、その他の非構造蛋白質に切断される。
前記コア蛋白質は、ウイルス粒子を構成するだけでなく、宿主細胞の核内へ移行することが知られている。近年、コア蛋白質が宿主細胞の機能を多様に調節して肝臓癌の発症に深く関与していることが報告された。非特許文献１には、例えば、HCVのコア蛋白質を発現するトランスジェニックマウスが、脂肪肝を経て肝臓癌を高率に発症することが示されている。その後、コア蛋白質が肝癌発症を引き起こす分子機構を解明する目的で、コア蛋白質と相互作用する宿主内蛋白質を同定し、その機能を解析する方法が広く行われている。
これまで、コア蛋白質と相互作用する宿主内蛋白質として、p53（非特許文献２)、RNAヘリケース（非特許文献３）、STAT3（非特許文献４）、PA28γ（非特許文献５）、等多数報告されている。
非特許文献５には、コア蛋白質がPA28γと相互作用して核内に局在することが示されている。なお、PA28γは、細胞核内に局在し、20Sプロテアソームと相互作用してそのペプチダーゼ活性を向上するプロテアソーム調節蛋白質として知られている。さらに、上記文献は、コア蛋白質の44〜71アミノ酸領域がPA28γとの結合と核内局在の両方に関与すること、コア蛋白質がPA28γ依存性の分解を受けることを報告している。しかし、これらの文献には、コア蛋白質が肝臓癌の発症に関与する具体的なメカニズムは十分に明らかにされていない。
また、特許文献１には、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質とPA28γとの蛋白質間相互作用の阻害活性を評価する工程を含むＣ型肝炎ウイルス関連疾患の予防及び／又は治療に有用な薬剤のスクリーニング方法、及び当該方法で得られるＣ型肝炎ウイルス関連疾患の予防及び／又は治療薬が開示されている。しかし、当該文献は、PA28γによる、Ｃ型肝炎ウイルス由来のコア蛋白質による発症の抑制、即ち、肝炎の状態から、脂肪肝、肝硬変、肝臓癌に進展することの抑制に関するものであり、Ｃ型肝炎ウイルスの感染予防又は増殖抑制に対する機能は明らかにされていない。したがって、当該文献によるＣ型肝炎ウイルス関連疾患の予防及び／又は治療薬は抗ウイルス薬とは異なり、ウイルス量を抑制または減少させるような目的ではなく、対症療法としての機能しか有していないため、投与方法は恒久的な使用となるばかりでなく、持続感染から肝硬変や肝臓癌などのＣ型肝炎ウイルス関連疾患発症まで10〜15年を有するため、臨床開発期間の長期化が予想されるなどの問題があった。
しかし、抗ウイルス薬により、HCVを排除することができれば、HCV感染症の治癒が可能である。
更に、これまでの抗ウイルス薬はウイルス複製を標的にしたものが主流であったが、新たな機序によりウイルス感染を予防又は増殖を抑制する抗ウイルス薬が提供されれば、抗ウイルス効果をより高めることができると考えられる。
WO2008/041665
Nature Medicine 4, 1065-1067(1998) J. Biol. Chem., 275:34122-34130(2000) J. Virol., 73:2841-2853(1999) J. Exp. Med., 196:641-653 (2002) J. Virol., 77, 19, 10237-10249 (2003)
本発明の主な目的は、HCVの感染予防又は増殖抑制に有用な組成物、当該組成物を用いたHCV感染予防又は増殖抑制方法、並びに、前記組成物の有効成分として有用な物質を効率よく選定し得る方法を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、HCVの感染にPA28γが関与していることを見出し、更に鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の事項に関する。
項１：PA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を含む抗Ｃ型肝炎ウイルス組成物。
項２：PA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質が、以下の(a)〜(c）のいずれかである項１に記載の組成物。
（a）PA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する核酸
(b)(a)に記載の核酸を修飾してなる修飾核酸
(c)(a)に記載の核酸を発現することのできる発現ベクター。
項３：前記(a)に記載の核酸がRNAである項２に記載の組成物。
項４：RNAがsiRNA（small interfering RNA）又はshRNA （short hairpin RNA）である項３に記載の組成物。
項５：Ｃ型肝炎ウイルス感染予防用又は増殖抑制用である項１〜４のいずれかに記載の組成物。
特に、PA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を有効成分として含むＣ型肝炎ウイルス感染予防又は増殖抑制のための組成物。または、Ｃ型肝炎ウイルス感染予防又は増殖抑制用医薬を製造するためのPA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質の使用。
項６：項１〜５のいずれかに記載の組成物を被験体に投与する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染予防又は増殖抑制方法。また、Ｃ型肝炎ウイルス感染予防又は増殖抑制方法におけるPA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質の使用。
項７：抗Ｃ型肝炎ウイルス組成物の有効成分のスクリーニング方法であって、
試験物質をPA28γ遺伝子の発現細胞又は発現能を有する細胞に接触させる工程、
試験物質を接触させた細胞と対照細胞におけるPA28γ遺伝子の発現レベルを比較する工程、及び、前記比較によりPA28γ遺伝子の発現を阻害すると評価された試験物質を選択する工程を備えたスクリーニング方法。
特に、抗Ｃ型肝炎ウイルス組成物の有効成分のスクリーニング方法であって、
試験物質をPA28γ遺伝子の発現細胞又は発現能を有する細胞に接触させる工程、
試験物質を接触させた細胞と対照細胞におけるPA28γ遺伝子の発現レベルを比較する工程、及び、前記比較において対照よりPA28γ遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する工程を備えたスクリーニング方法。
項８．抗Ｃ型肝炎ウイルス組成物の有効成分のスクリーニング方法であって、
PA28γ、トリプシン様基質及び20Sプロテアソームを含む反応系に、試験物質を投与する工程、
試験物質を投与した系と対照におけるプロテアソームのトリプシン様活性を比較する工程、及び
前記比較において対照よりトリプシン様活性を抑制させる試験物質を選択する工程
を備えたスクリーニング方法。
以下、本発明について、詳細に説明する。
本明細書において、抗HCVとは、HCVの細胞表面への吸着、細胞内への侵入、脱殻、翻訳、複製、集合、細胞膜への輸送、細胞からの放出というライフサイクルにおける少なくとも１つの工程を阻害する作用をいう。また、HCVの感染予防又は増殖抑制とは、上記作用により、HCVの細胞感染乃至増殖を防御抑制することを意味する。例えば、本発明のHCV感染予防乃至増殖抑制には、ウイルスの増殖を抑制し、ウイルス量を抑制または減少することにより、HCVに持続感染することを防止乃至抑制することが含まれる。
特に、抗HCV作用には、ウイルスの細胞内侵入阻害、脱殻阻害、ウイルス粒子の集合阻害、細胞膜への輸送阻害又はウイルス粒子の細胞からの放出阻害のいずれかの作用が含まれる。
PA28γは、プロテアソーム調節蛋白質として公知の核局在蛋白質である。PA28γのアミノ酸配列及び該蛋白質をコードする塩基配列は公知であり、例えばアミノ酸配列として、Swiss-Prot accession number P61289で表される配列のヒト由来PA28γ等が知られている。PA28γには、ヒト以外に、サル、マウス、ブタ等のホモログの存在が知られ、これらのアミノ酸配列はSwiss-Protに公開されており、いずれも本発明におけるPA28γとして利用できる。本発明で述べるPA28γとしては、前記配列からなる野生型蛋白質に限定されず、例えば、野生型蛋白質のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは他のアミノ酸配列が付加された配列からなる変異型蛋白質を用いることもできる。このような変異型蛋白質として、例えば、プロテアソーム調節活性又は核内移行活性を少なくとも有する変異型蛋白質を用いることもできる。
１．抗HCV組成物
本発明の抗HCV組成物は、PA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を有効成分として含む。
本明細書において、「発現」とは、蛋白質が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。従って、「発現を抑制する物質」は、遺伝子の転写、転写後調節、蛋白質への翻訳、翻訳後修飾、局在化、核内移行及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用して発現を抑制するものであってよい。
また「機能」とは、PA28γの作用により奏される効果をいう。従って「機能を抑制する物質」には、PA28γの作用を抑制する物質をいう。PA28γの作用の一つとしては、20Sプロテアソームにおけるトリプシン様活性の活性化作用が挙げられる。従って、「機能を抑制する物質には」、PA28γによる20Sプロテアソームのトリプシン様活性を阻害する化合物が含まれる。
具体的に、遺伝子の発現又は機能を抑制する物質としては、転写抑制因子、RNAポリメラーゼ阻害剤、蛋白質合成阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性因子、スプライシングやmRNAの細胞質移行を阻害しうる因子、mRNA分解因子、mRNAに結合して不活化する因子等が挙げられる。このうち、他の遺伝子又は蛋白質に対する悪影響が妨げられるように、標的分子に特異的に作用する物質が好ましい。
標的分子に特異的に作用する物質としては、核酸や、抗体、ペプチド等が挙げられる。
抗体としては、例えば、PA28γとプロテアソームとの結合阻害作用を有する抗体が挙げられる。特に特異的に作用させるためにモノクローナル抗体であることが好ましい。
また、ペプチドとしては、例えば、PA28γとプロテアソームとの結合阻害作用を有するペプチドが挙げられる。ペプチドは、ペプチド構造のみからなるものであってもよく、糖鎖や脂肪酸が結合した複合ペプチドであってもよい。またアミノ酸残基の側鎖の一部が修飾されたもの又は保護基により保護されたものであってもよい。
特に本発明では、核酸が好適に用いられる。
核酸には、DNA及びRNAが含まれる。またRNAには、二本鎖(dsRNA)、一本鎖(ssRNA)または一本鎖オーバーハングを有する二本鎖の構造を有するものが含まれる。
具体的に、遺伝子の発現又は機能を抑制する核酸としては、リボザイム、アンチセンス核酸、アプタマー、デコイ核酸、低分子RNA等が挙げられる。
低分子RNAには、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)およびスモールヘアピンRNA(shRNA)、DsiRNAs (Dicer Substrate Small Interfering RNAs)等が含まれる。
以下、RNA干渉によりmRNAの分解を引き起こすsiRNA又はshRNAについてより詳細を説明するが、本発明をこれらに限定する趣旨ではない。
siRNA は、標的遺伝子のmRNAもしくは初期転写産物のヌクレオチド配列又はその部分配列と相同な配列を有するRNAとその相補鎖からなる二本鎖オリゴRNAである。 また、shRNA（small hairpin RNA: shRNA）は、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相同な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖RNAであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造を形成するRNAである。
siRNA 及びshRNAに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相同な部分の長さは、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。
また、siRNA 又はshRNAの全長も、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されないが、通常20〜25程度、特に21〜23程度である。
なお、shRNAの核酸の全長は、二本鎖構造をとった場合の二本鎖部分の長さとして示すものとする。
標的ヌクレオチド配列と、siRNA又はshRNA に含まれるそれに相同な配列は、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98若しくは99％以上の配列同一性を有することが好ましい。
siRNA 又はshRNAは、5’又は3’末端に、塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとsiRNA の安定性を向上させることができる。
shRNAのヘアピンループのループ部分の長さは、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されないが、通常、3〜23塩基程度、特に6〜9塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、shRNAがRNA干渉を引き起こすことができる限り、特に限定されない。
siRNA及びshRNA は、公知の方法に従って化学合成することもでき、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いた転写系によりin vitroで合成することもできる。
化学合成による合成は、互いに相補的な配列を逆方向配列として有するRNAを合成し、自己相補性部分で結合させればよい。また、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いた合成は、１つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有するテンプレートDNAを合成しRNAポリメラーゼによりRNAを転写して、合成してもよい。
siRNA及びshRNAの具体的な例として、GenBank: XM_032767で示されるPA28γmRNAの338〜401位の部分から選択されるいずれかの配列等を例示できる。但し、当該例示は本発明を限定的に解釈させるものではない。
これらのRNAにより引き起こされるPA28γ遺伝子発現の抑制は、一過性であってもよく、または、恒常的であってもあってもよい。
上記核酸は、修飾されていてもよい。修飾は、標的に特異的に結合することができ、かつ、酵素的分解に耐性である限り、核酸分子の任意の位置において行うことができる。
例えば、siRNAにおける修飾は、ヌクレオチド塩基、すなわち、プリンもしくはピリミジン、リボースまたはリン酸の少なくとも１つにおいて行うことができる。
また、上記核酸は、細胞に安定に到達させることができるように、発現ベクターの形態で含まれていてもよい。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。
本発明の組成物は、上記PA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質に加え、医薬上許容される担体を含むことができる。
また、本発明の組成物には、本発明の目的を奏する範囲内で、たとえばインターフェロン、ペグ化インターフェロンおよびリバビリンなどの本発明とは違うメカニズムで働く抗HCV薬効成分、さらに他の薬効成分や医薬上許容される公知の添加剤を添加することもできる。
本発明の組成物は、公知の方法に従って製剤化することにより、抗HCV薬又は抗HCV剤として用いることができる。
抗HCV薬又は抗HCV剤の剤型は、特に限定されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、液剤又は固形剤等として用いることができる。液剤としては、例えば、水、生理食塩水等の希釈液又は分散媒に有効量のPA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を溶解、分散、乳化させた液剤等が挙げられる。また固形剤としては、有効量のPA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を固体や顆粒として含むカプセル剤、サッシェ剤、錠剤等が挙げられる。
抗HCV薬又は抗HCV剤は、肝臓又はその近傍の細胞にPA28γ遺伝子の発現乃至機能を抑制する物質を安定に到達させるように、DDS（Drug Delivery System）に基づく設計がなされていることが好ましい。例えば、siRNAを肝臓又はその近傍の細胞に送達させるために、コレステロール又はその誘導体を、siRNA分子の5'末端および／又は3'末端に付着すること等が挙げられる。
特に本発明の組成物は、HCV感染予防用又は増殖抑制用の医薬又は薬剤として有用である。
例えば、本発明の組成物は、感染前および感染後初期の段階に投与するため等に好適に用いることができる。
また、本発明の組成物は、感染していない者に対する感染予防用の医薬として用いることができる。
また、本発明の組成物は、HCV感染直後の者、HCV潜伏期にある者、又はHCVに感染しているが肝臓に異常がみられない者等に対するHCV増殖抑制用又はHCV排除用の医薬として用いることができる。
また本発明の組成物は、感染の可能性がある者、既に感染したもので感染の進行の阻止又は遅延が必要な者、また他の抗HCV療法に適応しなかった者等にも用いることができる。
感染前又は感染後初期の段階で投与して、HCVの感染予防又は増殖抑制を行うことにより、C型肝炎の発症防止や、肝炎の活動期への移行、例えば、GPTの値が2〜3倍に上昇する状態が持続的に続く状態等の肝機能異常に移行することを防ぐことができる。
２．HCV感染予防又は増殖抑制方法
本発明の抗HCV組成物又はそれを製剤化したものを、被験体に投与することにより、HCV感染予防又は増殖抑制を行うことができる。
被験体とは、HCVの感染又は増殖の可能性を有するヒト又はヒト以外の動物の個体全体、器官、組織又は細胞を含む概念であって、被験者、実験動物等も含む。
細胞は単離細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。
また、ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、ブタ、サル、ツパイ等のヒトを除く哺乳動物が挙げられる。
投与量は、投与方法、症状、投与対象の種類、大きさ、薬物特性等に応じて、適宜設定することができる。
投与方法も、適宜設定することができ、経口投与であってもよく、非経口投与であってよい。非経口投与としては、例えば、静脈、動脈、筋肉、腹腔、気道等を経路とする全身投与、又は肝臓又はその近傍への局所投与を利用できるが、これらに限定されない。
特に、PA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質が低分子RNAである場合は、公知の低分子RNAの投与方法、特に肝臓を標的とした方法に従って、投与することができる。
本発明は、特に、感染の可能性がある者、急性肝炎患者、又は慢性肝炎の非活動期の患者を対象とした方法として好適である。また、特に、感染前、急性肝炎又は慢性肝炎の非活動期の段階で組成物を投与する方法として好適である。
これらの段階で投与して、ウイルス量を抑制または減少することにより、HCVの感染予防又は増殖抑制を行うことができ、HCV感染症の治癒又はHCV排除のための治療を行うことができる。
３．スクリーニング方法
本発明の抗Ｃ型肝炎ウイルス組成物の有効成分は、PA28γ遺伝子の発現又は機能の抑制を指標とするスクリーニング方法によって選択することができる。
例えば、スクリーニング方法としては、
試験物質をPA28γ遺伝子の発現細胞又は発現能を有する細胞に接触させる工程、
試験物質を接触させた細胞と対照細胞におけるPA28γ遺伝子の発現レベルを比較する工程、及び、
前記比較によりPA28γ遺伝子の発現を阻害すると評価された試験物質を選択する工程
を備えた方法が挙げられる。
試験物質は、公知又は新規化合物の何れであってもよく、例えば、核酸、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物等の合成又は天然由来の化合物等が挙げられる。
PA28γ遺伝子の発現細胞又は発現能を有する細胞は、由来は特に限定されず、マウス細胞、ヒト細胞等を用いることができる。また、PA28γ遺伝子の発現能を備えた細胞であれば、樹立細胞株、動物の肝臓から採取した生細胞であってもよく、遺伝子導入細胞又はsiRNA導入細胞であってもよい。
試験物質と細胞の接触方法も特に限定されず、公知の方法に従うことができ、例えば、細胞培地に試験物質を添加することにより行うことができる。
PA28γ遺伝子の発現レベルの測定も、公知の方法に従って行うことができ、例えば、mRNAを逆転写したcDNAを増幅して定量的RT-PCRにより測定する方法、プローブを用いてmRNAを直接的に定量するノーザンブロッティング法、マーカー遺伝子群を搭載したDNAマイクロアレイを用いてその発現量を解析する方法等を用いることができる。
試験物質を接触させた細胞と、試験物質を接触させない以外は同様の条件とした対照細胞におけるPA28γ遺伝子の発現レベルを比較し、試験物質を接触した細胞において、PA28γ遺伝子の発現量が対照細胞における発現量より低い場合は、当該試験物質は、PA28γ遺伝子の発現を阻害すると評価される。PA28γ遺伝子の発現を阻害すると評価された試験物質は、本発明の抗HCV組成物の有効成分の候補物質として選定される。
また、他のスクリーニング方法としては、
PA28γ、トリプシン様基質及び20Sプロテアソームを含む反応系に試験物質を投与する工程、
試験物質を投与した系と対照におけるプロテアソームのトリプシン様活性を比較する工程、及び
前記比較において対照よりトリプシン様活性を抑制させる試験物質を選択する工程
を備えたスクリーニング方法が挙げられる。
トリプシン様基質としては、トリプシン様活性を測定するための基質として用いられている公知のものを使用することができる。例えば、Bz-VGR-AMC（benzoyl-Val-Gly-Arg-7-amido-4-methylcoumarin）、Boc-LRR-AMC （tert-butoxycarbonyl -Leu-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin）などを用いることができる。
試験物質は、公知又は新規化合物の何れであってもよいが、例えば、核酸、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物等の合成又は天然由来の化合物等が挙げられる。
また反応系は、バッファー、標準物質、定量試薬等の他の物質を含んでもよい。
対照としては、試験物質を投与しない以外は試験物質を投与した系と同じ条件とした反応系や、試験物質に代えて比較の基準となる物質を投与する以外は試験物質を投与した系と同じ条件とした反応系等が挙げられる。
プロテアソームのトリプシン様活性の比較方法も、公知の方法に従って行うことができ、特に限定されないが、例えば、トリプシン様基質に蛍光標識を付加し、基質の分解により生じる蛍光を測定し、蛍光レベルを比較することにより行うことができる。
また、上記スクリーニング方法は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば、市販の20S プロテアソームキットにおいて、基質としてトリプシン様基質を用い、PA28γを添加した系において、試験物質を添加して、プロテアソームのトリプシン様活性の測定及び比較を行うことにより、スクリーニングを行うことができる。
試験物質を投与した系と対照におけるプロテアソームのトリプシン様活性を比較し、対照に比べてトリプシン様活性を抑制させる試験物質は、PA28γによるプロテアソームにおけるトリプシン様活性を阻害する物質と評価される。当該物質は、本発明の抗HCV組成物の有効成分の候補物質として選定される。
上述のように、本発明のスクリーニング方法によれば、in vitro又は無細胞系においても、HCVの感染予防又は増殖抑制に有効な物質を、効率よく簡便にスクリーニングすることができる。
本発明により、HCVの感染予防又は増殖抑制に有用な医薬組成物及び方法が提供される。
本発明によれば、HCVの感染阻害又はHCV産生量の抑制または減少を行うことができ、HCV感染予防、感染症からの治癒又はHCV排除のための治療を図ることができる。
これまで、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質とPA28γとの蛋白質間相互作用の阻害活性を評価する工程を含むスクリーニング方法によって得られる物質を有効成分として含むＣ型肝炎ウイルス関連疾患の予防及び／又は治療薬も報告されている（特許文献１）。しかし当該文献は、当該文献の段落［0010］及び[0011]等に示されるように、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、及び肝臓癌から選択される少なくとも一つの疾患の予防及び／又は治療を目的とするものにすぎない。
一方、本発明は、HCVの感染予防、HCV感染症からの治癒又はHCV排除を目的とするものである。肝臓は、予備能力が高い臓器であることから、HCVに感染しても、すぐに症状が現れない場合が多い。しかし、C型肝炎の症状が明らかになってからでは、病状が進行し、完全な治癒は困難となる。更に、感染したままでは、将来発症するリスクを抱えた状態となる。従って、HCVの感染前又は感染後早期の段階で適切な処置を行うことが重要である。
本発明によれば、HCVの感染乃至増殖を防御抑制することができることから、HCVを排除し、HCV感染症からの治癒が可能となる。
また、本発明はPA28γ遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とするため、特異的に作用させることが可能であり、また副作用も少ない。
更に、本発明によれば、HCVの感染予防又は増殖抑制に有用な物質を、効率よく簡便にスクリーニングする方法が提供される。
このように、本発明は、HCVの感染予防又は増殖抑制に有用な技術を提供するものである。
Huh7 Ok1 細胞、コントロール細胞並びにPA28γノックダウン細胞C5及びC7細胞において、ウエスタンブロット法により、PA28γおよびβ-actin を検出した結果を示す。 コントロール細胞（Control shRNA）、PA28γノックダウン細胞C5 およびC7 に空プラスミド（pEFFLAGGspGBK）あるいはshRNA耐性PA28γ発現プラスミド（pEFFLAGGsPA28gammaSI）プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるウイルス感染価を測定した結果を示す。 Negative control siRNA をトランスフェクションしたサンプル（陰性コントロール）、PA28γに対するsiRNAをトランスフェクションしたサンプル（(PA28γ138669)、及び、siRNAをトランスフェクションしていないサンプル（未処理）における、ウイルス感染細胞の細胞上清および細胞内のコア蛋白質量を測定した結果を示す。 Negative control siRNA をトランスフェクションしたサンプル（陰性コントロール）、PA28γに対するsiRNAをトランスフェクションしたサンプル（(PA28γ138669)、及び、siRNAをトランスフェクションしていないサンプル（未処理）における、ウイルス感染価を測定した結果を示す。 Negative control siRNAをトランスフェクションした細胞（陰性コントロール）と、PA28γに対するsiRNAをトランスフェクションした細胞（PA28γ138669）における、PA28γの発現量をウエスタンブロット法によって測定した結果を示す。 HCV レプリコンRNAを導入したControl shRNA 細胞（レプリコン／Cntrl5）、HCV レプリコンRNAを導入したPA28γノックダウン細胞C5（レプリコン／KD5）、RNA ポリメラーゼ活性不活化HCV レプリコンGND RNA を導入したPA28γノックダウン細胞C5（レプリコンGND／Cntrl5）、及びRNA ポリメラーゼ活性不活化HCV レプリコンGND RNA を導入したPA28γノックダウン細胞C5（レプリコンGND/KD5)を用いて、ルシフェラーゼ活性により、ウイルス複製に対する影響を測定した結果を示す。 PA28γノックダウン細胞に、PA28γ（Native form）又はPA28γ変異体（G150S, N151Y, P245Y又はK188E）の遺伝子を組み込んだプラスミド或いは空プラスミドを導入し、ウイルスを感染させた後のウイルス産生量を測定した結果を示す。
以下、実施例及び比較例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．PA28γノックダウン細胞の樹立
ヒト PA28γ 遺伝子をRNA 干渉によりノックダウンするためのshort hairpinRNA をコードするDNA フラグメントを以下の手順により設計した。
ターゲット配列として、PA28γ遺伝子のOpen reading frameから、以下の４つの配列を選択した。
配列番号１：AAGTGAAGCTCAAGGTTGATT
配列番号２：AAGGTTGGATGAGTGTGAAGA
配列番号３：AAGTGAGGCAGAAGACTTGGT
配列番号４：AAGGTGGATCAGGAAGTGAAG
このうち、発現抑制効果が顕著な配列番号４の配列を選択した。配列番号４の配列は、配列番号５に示すPA28γコード領域の16-36番目に相当する。
当該配列のshort hairpinRNA をコードするDNA フラグメントを、
Insert Design Tool for the pSilencer（登録商標）Vectors（Ambion 社、http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）を使用して設計した。設計したフラグメントの配列を、配列表の配列番号６に示す。
上記DNAフラグメントを、pSilencer 2.1 U6-hygro vector (Ambion, Austin, TX)のBamHI と Hind III サイトの間に組み込んで、Ｃ型肝炎ウイルスJFH1 株に感受性をもつ Huh7 OK1 細胞にリポフェクションで導入し、0.1mg/mL ハイグロマイシンを含む10％牛胎児血清ダルベッコ変法イーグル培地で1 週間培養した。その後、限界希釈により、細胞をクローン化し、ウエスタンブロット法によってPA28γの発現が低い2 クローンを選び、それをC5 およびC7と名付けた。
なお、前記Huh7 OK1 細胞は、J. Virol., 82: 3480-3489.,2008に記載の方法に従って得た。具体的には、HCVレプリコン細胞9-13株をインターフェロンα処理し、ウイルスレプリコンRNAを排除し、限定希釈によって細胞をクローン化し、クローン化した細胞の中から、JFH1の感染効率がよいものを選択して得た。
また、ヒト PA28γ 遺伝子と相補性を持たない市販のpSilencer 2.1-U6 hygro negative control vector (Ambion)も同様の操作をし、親株とPA28γの発現量が同一の単一クローンを樹立し、コントール細胞(以下、Control shRNAともいう)とした。
Huh7 Ok1 細胞、コントロール細胞並びにPA28γノックダウン細胞であるC5及びC７を溶解し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にその溶解液をかけ、抗PA28γ抗体（Affiniti社）および抗actin 抗体（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）を用いたウェスタンブロット法によって、PA28γおよびβ-actin を検出した。
結果を図１に示す。
図１に示すように、Huh7 Ok1細胞及びコントロール細胞(Control shRNA)に比べ、PA28γに対するshRNAをトランスフェクションした樹立細胞であるC5およびC7のPA28γの発現レベルは低下していた。
２．RNA 干渉耐性PA28γ発現プラスミドの作製
上記１．のshRNAのPA28γ標的領域であるPA28γコード領域の16-36番目の内、18番目のGをA、24 番目T をC、30 番目のA をG に変異させたPA28γ遺伝子を、Huang et al. Oncogene 14:405-414, 1997に基づいて作製したプラスミドpEFFLAGGspGBKに組み込み、shRNA に対して耐性をもつPA28γを発現するためのプラスミド(pEFFLAGGsPA28gammaSI)を作製した。
３．PA28γの恒常的ノックダウンによるHCV 感染への影響
コントロール細胞（Control shRNA）、PA28γノックダウン細胞C5 およびC7 にpEFFLAGGspGBKあるいはpEFFLAGGsPA28gammaSI プラスミドをトランスフェクションし、翌日、3μg／mLピューロマイシンを含む10％牛胎児血清ダルベッコ変法イーグル培地に置換し、更に24時間培養し、生き残った細胞を12 well plate に2.5 x 104 Cell/well で撒き直した。M.O.Iが0.024 の割合でＣ型肝炎ウイルスJFH1を感染させた。
尚、JFH1は、Nature Protocols, 1(5),2334-2339,2006に記載の方法に従って作製したものを使用した。
JFH1遺伝子含有プラスミドpJFH1をXbaI酵素で切断し、Mung Bean nucleaseによって平滑にし、MEGAscript T7 kit（Ambion）によってウイルスRNAを合成した。そのウイルスRNAをHuh7 OK1細胞に260V960μFの条件でエレクトロポレーションにより導入し、一週間後のウイルスを含む細胞上清を再度、Huh7OK1に感染させ、10日後の細胞上清をウイルス液として使用した。
感染翌日に10％牛胎児血清ダルベッコイーグル培地と置換し、10 日間培養した。Huh7 OK1 を用いて、その培養上清のウイルス感染価（ffu/mL）をWakita らの方法(Nat.Med. 11:791-796,2005)に従って、次のように測定した。測定対象の培養上清をHuh7 OK1細胞に37度三時間で感染させ、一回、10％FBS−DMEMで洗浄した後、0.8％メチルセルロース含有10％FBS−DMEMを加えて、96時間培養した。次いでメディウムを取り除き、100％メタノールを加えて細胞を固定した。
J.Virol.79:13473-13482,2005に記載の方法に従ってNS5Aのアミノ酸残基409番目から422番目のペプチドを免疫して作製したウサギ抗NS5A抗体と、Alexa Fluor（登録商標） 488−抗ウサギIgG抗体（Molecular Probe社）を反応させ、蛍光を呈している細胞fociを数えて、ウイルス感染価を算出した。
測定結果を図２に示す。
図２中、空プラスミドとして示される値は、pEFFLAGGspGBKプラスミド（以下「空プラスミド」）をトランスフェクションした後、ウイルス感染させた場合の結果を示す。
また、shRNA耐性PA28γ発現プラスミドとして示される値は、pEFFLAGGsPA28gammaSI プラスミド（以下「RNA 干渉耐性プラスミド」）をトランスフェクションした後、ウイルス感染させた結果を示す。
図２に示されるように、空プラスミドをトランスフェクションした場合に、PA28γノックダウン細胞では、ウイルス産生量がコントロール細胞より有為に減少した。
更に、コントロール細胞において、空プラスミドをトランスフェクションした場合に対し、RNA 干渉耐性プラスミドをトランスフェクションした場合は、僅かにウイルス産生量が上昇した。一方、PA28γノックダウン細胞C5およびC7において、RNA 干渉耐性プラスミドをトランスフェクションした場合は、ウイルス産生が空プラスミドをトランスフェクションしたコントロール細胞と同等に回復した。
このことから、PA28γノックダウン細胞で認められるウイルス産生減少は、非特異的なPA28γ以外の宿主蛋白質の減少によってウイルス産生が減少したのではなく、PA28γの減少によってウイルス産生量が減少したことが示唆された。
４．PA28γの一過性ノックダウンによるHCV 感染への影響
PA28 γ 遺伝子コード領域の162-180位を標的配列とするsiRNA（ Ambion、 Cat No. 138669）と0.1mL のOpti-MEM(Invitrogen)を混和し、1μL のLipofectamineTM RNAiMax（Invitrogen）を加えさらによく混和し、室温で20 分間静置した。コンフルエントになったHuh7 OK1 細胞をトリプシンによって剥がし、10％牛胎児血清ダルベッコ変法イーグル培地に入れ、105個／mL の濃度になるように混和した。先に調製したsiRNA 混液0.1mL を24 ウェルプレートの1 wellに移し、さらに0.5mL の細胞混液を加えて、よく混ぜ合わせた。
24 時間後、JFH1 ウイルスをMOI=0.03 で感染させて、さらに4 日後にコア蛋白質量およびウイルス感染価を測定した。
またStealth TM RNAi Negative Control Low GC duplex (12935-200) （Invitrogen社）を使用して陰性コントロールを作製し、コア蛋白質量およびウイルス感染価を上記と同様に測定した。
コア蛋白質量は、細胞内と細胞上清のそれぞれについて、オーソHCV 抗原ELISA テスト（栄研化学株式会社）により測定した。ウイルス感染価は、上記３．と同様にWakita らの方法(Nat. Med. 11:791-796,2005)に従って測定した。
更に、Negative control siRNAをトランスフェクションした細胞と、PA28γに対するsiRNAをトランスフェクションした細胞における、PA28γの発現量を、ウエスタンブロット法によって測定した。
結果を図３〜５に示す。
図３に示すように、Negative control siRNA をトランスフェクションしたサンプル（陰性コントロール）およびsiRNAをトランスフェクションしていないサンプル（未処理）に比べ、前記PA28γに対するsiRNAをトランスフェクションしたサンプル(PA28γ138669)では細胞上清および細胞内コア蛋白質量が低下していた。
また、図４に示すように、ウイルス量もPA28γ138669では低下していた。
また、図５に示すように、細胞内のPA28γの量をウェスタンブロッティングで確認したところ、陰性コントロールに比べ、PA28γ138669では、PA28γの発現が低下しており、siRNAによるノックダウンの効果が確認された。
このことから、PA28γ遺伝子の別の領域を標的にしたsiRNA を導入し、一時的にPA28γの発現を抑制しても、HCV ウイルス増殖が抑制されることが確認された。
５．レプリコンによるウイルス複製への影響
Krieger らの方法(Krieger et al., J. Virol., 75:4614-4624,2001)に従い、上記１で作製したコントロール細胞及びノックダウン細胞を使用する以外は同様にして、レプリコンによるウイルス複製を次のように評価した。
ウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）をコードするcDNAを、プラスミド pFK-I389 neo/NS3-3’/NK5.1の AscI 及び PmeI の間に、neo遺伝子に代えて導入した。得られたプラスミドpFK-I389 hRL/NS3-3’/NK5.1をScaIで開裂し、MEGAscript T7 キット(Ambion社)を使用してin vitroで翻訳した。Huh7 細胞を、1mlあたり10×106cellとして懸濁液を調製し、得られた懸濁液400-μlを、10 μgのin vitro転写 RNAと混合した。次いで、270 V 及び960 μF の条件でGene PulserTM (Bio-Rad)によりエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後の細胞を25ml培地で懸濁し、1wellあたり1mlとして12wellの培養プレートに接種した。感染後、4、24、48及び96時間後のルシフェラーゼ活性を、Renilla Luciferase assay system (Promega社)により測定した。
合成したHCV レプリコンRNA 、およびRNA ポリメラーゼ活性を不活化したHCV レプリコンGND RNA を、それぞれControl shRNA 細胞およびPA28γノックダウン細胞C5 に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
それぞれの組み合わせにおいて、4 時間後の値で、24、48及び96 時間後の値を割って、標準化した。
結果を図６に示す。
コントロール細胞（Cntrl5）とPA28γノックダウン細胞(KD5)へreplicon RNAをトランスフェクションしたときのルシフェラーゼの値は時間ごとに上昇し複製していた。しかしながら、両細胞でルシフェラーゼの値に差を認められない。一方、陰性コントロールとして、それら細胞へreplicon GND RNAをトランスフェクションしたときのルシフェラーゼの値は、時間ごとに低下し、複製していなかった。
このように、レプリコンRNA を導入し、その複製を観察することによって、PA28γノックダウンによるウイルス複製への影響を評価したが、PA28γノックダウンによるウイルス複製への影響は認められなかった。このことから、PA28γは、ウイルス侵入、脱殻、ウイルス粒子の集合、細胞膜への輸送、ウイルス粒子の放出のいずれかの過程でウイルス感染を阻害又は増殖を抑制していると考えられる。
６．PA28γのトリプシン様プロテアソーム活性がHCV 感染に与える影響
上記１．に記載のHuh7 Ok1細胞を0.25 x 105／wellで24 well-plateに播いた。
次いで、PA28γあるいはPA28γ変異体の遺伝子を組み込んだpEF FLAG Gs pGKpuroプラスミド及び空プラスミド0.25μgを、Lipofectamine LTXとPlus試薬（Invitrogen）によって各ウェルの細胞にトランスフェクションさせた。
PA28γ変異体としては、G150S, N151Y, P245Y又はK188Eを用いた。G150Sは、PA28γのアミノ酸配列のうち150番目のアミノ酸残基GlyをSerに変異させた変異体である。またN151Y は、PA28γのアミノ酸配列のうち151番目のアミノ酸残基AsnをTyr に変異させた変異体である。またP245Yは、PA28γのアミノ酸配列のうち245番目のアミノ酸残基ProをTyr に変異させた変異体である。またK188Eは、PA28γのアミノ酸配列のうち188番目のアミノ酸残基LysをGlu に変異させた変異体である。PA28γは20Sプロテアソームのトリプシン活性を活性化する。しかし、G150Sは、20Sプロテアソームを活性化できない。また、N151Yは20Sプロテアソームを活性化できない。P245Yは20Sプロテアソームに結合することができない。またK188Eは、20Sプロテアソームのキモトリプシン活性を活性化するが、トリプシン活性を活性化できない（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2807-2811, 1998）。
トランスフェクション後の各細胞に、JFH1ウイルスをm.o.i=0.03で感染させた。
感染後4日目のウイルス産生量をTitrationにて定量した。
結果を図７に示す。
図７に示されるように、PA28γノックダウン細胞にPA28γ遺伝子を組み込んだプラスミドを導入した場合、ウイルスを感染させたとき、空プラスミドを導入した場合に比べて、ウイルス産生量が上昇した。
しかし、プロテアソームを活性化できないPA28γ変異体であるG150S, N151Y又はP245Yの遺伝子を組み込んだプラスミドを導入した場合は、ウイルス産生量の上昇は認められなかった。また、プロテアソームに対してトリプシン様活性を活性化できないがキモトリプシン様活性を持つPA28γ変異体であるK188Eの遺伝子を含むプラスミドを導入した場合においても、ウイルス産生量の上昇は認められなかった。
当該結果から、PA28γによる20Sプロテアソームに対するトリプシン様活性の活性化がウイルス産生に必要である事が示唆された。
配列番号１：PA28γ遺伝子RNA干渉標的配列の1例
配列番号２：PA28γ遺伝子RNA干渉標的配列の1例
配列番号３：PA28γ遺伝子RNA干渉標的配列の1例
配列番号４：PA28γ遺伝子RNA干渉標的配列の1例
配列番号５：PA28γコード領域
配列番号６：配列番号４の配列に対するshort hairpinRNA をコードするDNA フラグメント

Claims (4)

  1. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの、ＰＡ２８γによる２０Ｓプロテアソームのトリプシン様活性の活性化を阻害する化合物を有効成分として含む抗Ｃ型肝炎ウイルス組成物：
    （ａ）ＰＡ２８γの２０Ｓプロテアソームのトリプシン様活性の活性化を抑制するＰＡ２８γに対するＲＮＡ、
    （ｂ）（ａ）に記載のＲＮＡを修飾してなる修飾ＲＮＡ、
    （ｃ）（ａ）に記載のＲＮＡを発現することのできる発現ベクター、
    ここで、該ＲＮＡはｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）又はｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）である。
  2. Ｃ型肝炎ウイルス感染予防用又は増殖抑制用である請求項１に記載の組成物。
  3. 請求項１または２に記載の組成物を動物に投与する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染予防又は増殖抑制方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
  4. 請求項１または２に記載の抗Ｃ型肝炎ウイルス組成物の有効成分のスクリーニング方法であって、
    ＰＡ２８γ、トリプシン様基質及び２０Ｓプロテアソームを含む反応系に、試験物質を投与する工程、
    試験物質を投与した系と対照におけるプロテアソームのトリプシン様活性を比較する工程、及び
    前記比較において対照よりトリプシン様活性を抑制させる試験物質を選択する工程
    を備えたスクリーニング方法。
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