JP5406253B2 - Amino acid bioassay based on protein expression - Google Patents
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Description
本発明は、検出可能なタンパク質を発現調節可能な状態で含むアミノ酸要求性乳酸菌を用いて、検体中の含有アミノ酸量を定量する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for quantifying the amount of amino acids contained in a sample using an amino acid-requiring lactic acid bacterium containing a detectable protein in a state in which expression can be regulated.
アミノ酸分析は食品の品質管理や様々な疾病検出のマーカーとして用いられ、その迅速・簡便な定量法の開発は工業的・医療的見地から強く望まれている。 Amino acid analysis is used as a marker for food quality control and detection of various diseases, and the development of a rapid and simple quantitative method is strongly desired from an industrial and medical standpoint.
これまでに知られているアミノ酸定量法としては、HPLCを用いた機器分析法や、定量用酵素を用いた酵素法と共に、乳酸菌を用いたバイオアッセイ法が挙げられる(非特許文献1)。このバイオアッセイ法では、測定対象のアミノ酸種に対し要求性を示す乳酸菌が用いられる。この乳酸菌株を目的アミノ酸種制限培地および検体の混合液中で静止期まで培養させると、目的アミノ酸の検体中含有量に比例した菌体増殖量が得られる。上記バイオアッセイ法は、このような乳酸菌の増殖量に基づいてアミノ酸を定量する手法である。 Examples of known amino acid quantification methods include an instrumental analysis method using HPLC, an enzyme method using a quantification enzyme, and a bioassay method using lactic acid bacteria (Non-patent Document 1). In this bioassay method, lactic acid bacteria exhibiting requirements for the amino acid species to be measured are used. When this lactic acid strain is cultured in a mixed solution of a target amino acid species-restricted medium and a sample until the stationary phase, a cell growth amount proportional to the content of the target amino acid in the sample can be obtained. The bioassay method is a method for quantifying amino acids based on the amount of growth of such lactic acid bacteria.
非特許文献2は、アミノ酸要求性大腸菌を用いたアミノ酸の定量方法について開示する。この方法では、アミノ酸要求性乳酸菌に替えて、アミノ酸要求性大腸菌を用い、かつ遺伝子導入したルシフェラーゼを発現させ、発現したルシフェラーゼの作用を利用してアミノ酸の定量を行う。 Non-Patent Document 2 discloses an amino acid quantification method using amino acid-requiring E. coli. In this method, amino acid-requiring Escherichia coli is used in place of amino acid-requiring lactic acid bacteria, gene-transferred luciferase is expressed, and amino acid quantification is performed using the action of the expressed luciferase.
非特許文献3は、Bifidobacteriumにルシフェラーゼ遺伝子を導入し、遺伝子したルシフェラーゼの発現により、Bifidobacteriumが生成するATPを定量したことを開示する。しかし、非特許文献3には、アミノ酸の定量には言及していない。 Non-patent document 3 discloses that ATP produced by Bifidobacterium was quantified by introducing a luciferase gene into Bifidobacterium and expressing the gene-generated luciferase. However, Non-Patent Document 3 does not mention quantification of amino acids.
上記非特許文献1に記載の乳酸菌増殖に基づくバイオアッセイ法は、以下のような問題点を有する。
(a)静止期まで増殖させる必要があるため、測定には長時間(16時間以上)の培養を要する
(b)菌の増殖量を濁度によって測定するため、感度・精度が悪い
(C)菌の増殖量に基づく定量法のため、増殖に影響を与えるような夾雑物質の影響を大きく受ける
The bioassay method based on the growth of lactic acid bacteria described in Non-Patent Document 1 has the following problems.
(a) Because it is necessary to grow until the stationary phase, the culture requires a long time (16 hours or more)
(b) Since the amount of bacterial growth is measured by turbidity, sensitivity and accuracy are poor.
(C) Because it is a quantitative method based on the amount of bacterial growth, it is greatly affected by contaminants that affect growth.
上記非特許文献2に記載の方法では定量に4時間以上という長い培養時間を要し、大腸菌の生育量の指標としてルシフェラーゼの作用による発光を見ている。従って、この観点からは、非特許文献2に記載の方法は、非特許文献1に記載の乳酸菌でのバイオアッセイ法と同原理の測定法である。また、非特許文献2に記載の方法で用いられている大腸菌は1種類のアミノ酸に対してしか要求性を示さず、測定するアミノ酸の種類と同じ数の菌株を準備・使用する必要がある。さらに、この大腸菌は、ランダム変異株から取得したもので、それぞれの株がどのような変異を有しているか不明であり、どのような性状(特にアミノ酸要求性)を有しているかも分からず、所望のアミノ酸要求性を有する大腸菌の提供は容易ではない。 In the method described in Non-Patent Document 2, a long culture time of 4 hours or more is required for quantification, and light emission due to the action of luciferase is observed as an indicator of the growth amount of E. coli. Therefore, from this viewpoint, the method described in Non-Patent Document 2 is a measurement method based on the same principle as the bioassay method using lactic acid bacteria described in Non-Patent Document 1. Further, E. coli used in the method described in Non-Patent Document 2 shows requirements only for one type of amino acid, and it is necessary to prepare and use the same number of strains as the type of amino acid to be measured. Furthermore, this Escherichia coli was obtained from random mutant strains, and it is unclear what mutation each strain has, and what properties (especially amino acid requirement) it does not know. Thus, it is not easy to provide E. coli having the desired amino acid requirement.
上記非特許文献3に記載の方法で用いられているBifidobacteriumは「ビフィズス菌」であり、少なくとも狭義の「乳酸菌」には含まれない。さらに、非特許文献3において試験されたBifidobacterium longumについては、アミノ酸要求性を詳細に調べた文献は見あたらない。しかし、ゲノム解析が報告済みであり、それによれば、ゲノム中にほぼすべてのアミノ酸の生合成経路遺伝子が存在することから、各種アミノ酸の生合成能を有すると推測される(Schell, M. A. et al., (2002), Proc Natl Acad Sci USA 99, 14422-14427 参照)。従って、非特許文献3に記載の方法で作製された菌を用いて、菌のアミノ酸要求性を利用したアミノ酸の定量は原理的に不可能であると推察される。 Bifidobacterium used in the method described in Non-Patent Document 3 is “Bifidobacteria”, and is not included in “lactic acid bacteria” in a narrow sense at least. Furthermore, with regard to Bifidobacterium longum tested in Non-Patent Document 3, there is no document that has examined the amino acid requirement in detail. However, genome analysis has been reported, and it is estimated that it has biosynthetic ability of various amino acids because there are biosynthetic pathway genes of almost all amino acids in the genome (Schell, MA et al , (2002), Proc Natl Acad Sci USA 99, 14422-14427). Therefore, it is presumed that, in principle, it is impossible to quantify amino acids using the bacteria prepared by the method described in Non-Patent Document 3 using the amino acid requirement of the bacteria.
乳酸菌は、菌株によっては複数種のアミノ酸に対し要求性を示すものが多数あり、そのため一種類の菌株で多種類のアミノ酸定量が可能である。また、乳酸菌は、長年、性状解析やゲノム解析がなされており、性状は十分に把握されている。従って、このような乳酸菌を用い、上記(a)〜(c)に挙げたい問題点を解決できる方法の提供が待たれるところである。 There are many lactic acid bacteria that exhibit requirements for a plurality of types of amino acids depending on the strain, and therefore, a single type of strain can be used to determine many types of amino acids. In addition, lactic acid bacteria have been subjected to property analysis and genome analysis for many years, and their properties are well understood. Accordingly, there is an awaiting provision of a method that can solve the above-mentioned problems (a) to (c) using such lactic acid bacteria.
そこで本発明は、アミノ酸に関する栄養要求性を有する乳酸菌を用いて、短時間で高感度・高精度な測定が可能であり、また菌の増殖に影響を与える因子にも影響を受けにくいアミノ酸定量法の提供を目的とする。 Therefore, the present invention is a method for quantifying amino acids that can be measured with high sensitivity and high accuracy in a short time by using lactic acid bacteria having auxotrophy related to amino acids, and is less susceptible to factors that affect the growth of bacteria. The purpose is to provide.
本発明者らは、アミノ酸要求性乳酸菌に検出可能なタンパク質の発現系を導入し、アミノ酸量を各種濃度に振った条件でタンパク質発現を行わせたところ、タンパク質発現量とアミノ酸濃度が高い相関を示すことを発見した。但し、アミノ酸濃度定量に用いる乳酸菌が、タンパク質発現の調節機構を有するものでない場合、定量に用いる前の乳酸菌の培養においても、タンパク質が発現し、その結果、この事前に発現したタンパク質は、アミノ酸定量の際のバックグランドとなり、高感度・高精度な測定の妨げになることが判明した。そこで本発明ではこのような新たな課題を解消するための手段も取り込んで、本発明を完成させた。 The present inventors introduced a detectable protein expression system into amino acid-requiring lactic acid bacteria and allowed protein expression under conditions in which the amino acid amount was varied in various concentrations. As a result, there was a high correlation between the protein expression amount and the amino acid concentration. Found to show. However, if the lactic acid bacterium used for amino acid concentration quantification does not have a protein expression regulation mechanism, the protein is also expressed in the culture of the lactic acid bacterium before use for quantification. It became clear that it became a background in the case of, and hindered measurement with high sensitivity and high accuracy. Therefore, the present invention has been completed by incorporating means for solving such a new problem.
即ち、上記検出可能なタンパク質を発現調節可能な状態で導入したアミノ酸要求性乳酸菌を、事前の培養は発現抑制条件下で行い、検体と目的アミノ酸制限培地との混合の後の培養は発現誘導条件下で行うことでタンパク質を発現させ、発現タンパク質の量を定量することで、バックグランドを抑制して、高感度・高精度にアミノ酸定量が可能であることを見出し、本発明を完成させた。 That is, the amino acid-requiring lactic acid bacterium introduced with the detectable protein in a state in which expression can be regulated is preliminarily cultured under expression-suppressing conditions, and the culture after mixing the specimen with the target amino acid-restricted medium is performed under expression-inducing conditions. It was found that the protein was expressed by quantifying the amount of the expressed protein and the amount of the expressed protein was quantified to suppress the background, and the amino acid could be quantified with high sensitivity and high accuracy, thereby completing the present invention.
本発明は、以下に示す通りである。
[1]
測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌に、タンパク質遺伝子を発現調節可能な状態で導入して乳酸菌組換体を得る、但し、前記タンパク質は発現量を定量可能なタンパク質である、工程(A)、
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下、前記乳酸菌組換体が生成するタンパク質の量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(B)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下で、前記乳酸菌組換体を培養して、培養中または培養後の培養液に含まれるタンパク質の量を測定する工程(C)、及び
前記工程(B)で求めた相関関係に基づいて、前記工程(C)で測定したタンパク質の量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。
[2]
工程(A)で得られた前記乳酸菌組換体は、前記タンパク質遺伝子の発現抑制条件下で培養され、次いで必要により集菌され、培養または集菌された乳酸菌組換体が工程(B)及び工程(C)で用いられる[1]に記載の方法。
[3]
前記タンパク質遺伝子を発現調節配列の下流に含むベクターを前記乳酸菌に導入して前記組換体を得る[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記発現調節配列が、nisin誘導プロモータ、である[3]に記載の方法。
[5]
前記タンパク質が、発光タンパク質、蛍光タンパク質、結合性タンパク質及び酵素から成る群から選ばれる[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[6]
前記タンパク質は発現量を光学的、免疫的、電気化学的または酵素的方法により定量可能である[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
The present invention is as follows.
[1]
A lactic acid bacterium having auxotrophy for the amino acid to be measured is introduced in a state in which the expression of the protein gene can be regulated to obtain a recombinant lactic acid bacterium, provided that the protein is a protein whose expression level can be quantified, step (A),
In a medium containing a measurement target amino acid at a predetermined concentration, a step of obtaining a correlation between the amount of the protein produced by the recombinant lactic acid bacteria and the amino acid concentration under expression induction conditions of the protein gene (B),
Specimens are mixed in a medium not containing the amino acid to be measured, and the recombinant lactic acid bacteria are cultured in the obtained medium under the conditions for inducing expression of the protein gene, and are contained in the culture solution during or after the culture. Step (C) for measuring the amount of protein, and step (D) for determining the amount of amino acid contained in the sample from the amount of protein measured in step (C) based on the correlation obtained in step (B) (D )
Method for quantifying amino acids in a sample containing
[2]
The recombinant lactic acid bacterium obtained in the step (A) is cultured under the condition for suppressing the expression of the protein gene, and then collected if necessary, and the cultured or collected lactic acid bacterium recombinant is the step (B) and the step ( The method according to [1], which is used in C).
[3]
The method according to [1] or [2], wherein the recombinant is obtained by introducing a vector containing the protein gene downstream of an expression regulatory sequence into the lactic acid bacterium.
[Four]
The method according to [3], wherein the expression regulatory sequence is a nisin-inducible promoter.
[Five]
The method according to any one of [1] to [3], wherein the protein is selected from the group consisting of a photoprotein, a fluorescent protein, a binding protein, and an enzyme.
[6]
The method according to any one of [1] to [5], wherein the expression level of the protein can be quantified by an optical, immunological, electrochemical, or enzymatic method.
本発明は、以下のように非特許文献1に記載の乳酸菌増殖に基づくバイオアッセイ法より優れた特長を有する。
・30分程度の短時間でも測定可能である。(但し、測定時間を限定する意図ではない。)
・ルシフェラーゼなどの検出可能なタンパク質を発現調節可能な状態で導入して用いることで、高感度・高精度な測定が可能である。
・増殖に影響を与えるような夾雑物質存在下でも測定可能である。
The present invention has advantages over the bioassay method based on the growth of lactic acid bacteria described in Non-Patent Document 1 as follows.
・ Measurement is possible in a short time of about 30 minutes. (However, it is not intended to limit the measurement time.)
-Highly sensitive and highly accurate measurement is possible by introducing and using a detectable protein such as luciferase in a state where expression can be regulated.
・ It can be measured even in the presence of contaminants that affect growth.
さらに本発明は、非特許文献2に記載のアミノ酸要求性大腸菌を用いたアミノ酸の定量方法に比べて、以下の利点を有する。
・宿主の使用にあたって、ランダム変異ライブラリーの作製や栄養要求性株のスクリーニングなどの煩瑣な作業が必要ない
・単一の菌株で複数種類のアミノ酸の定量が可能であり、菌の調製を簡便に行える
・発現させるタンパク質はルシフェラーゼに限られず、発光以外の様々な検出法が利用可能である
Furthermore, the present invention has the following advantages over the amino acid quantification method using amino acid-requiring E. coli described in Non-Patent Document 2.
・ There is no need for cumbersome operations such as the creation of random mutation libraries and screening of auxotrophic strains when using the host. ・ Multiple amino acids can be quantified in a single strain, making it easy to prepare bacteria. The protein that can be expressed and expressed is not limited to luciferase, and various detection methods other than luminescence can be used.
尚、非特許文献2に記載の方法では、タンパク質発現に基づくアミノ酸の高感度・高精度な定量は困難と考えられる。その理由は、非特許文献2の遺伝子発現法では、試料との混合前に必要な発現抑制がかかりにくい系であり、バックグラウンドが高くなると予想される。発現誘導前の抑制が十分かからない場合には、乳酸菌の生育に基づくアミノ酸定量は可能であっても、タンパク質発現に基づく定量は困難であると予想されるからである。 In the method described in Non-Patent Document 2, it is considered difficult to quantify amino acids with high sensitivity and high accuracy based on protein expression. The reason for this is that the gene expression method of Non-Patent Document 2 is a system in which it is difficult to suppress the necessary expression before mixing with the sample, and the background is expected to be high. This is because it is expected that quantification based on protein expression is difficult even if amino acid quantification based on the growth of lactic acid bacteria is possible when suppression before expression induction is not sufficient.
本発明の検体中のアミノ酸の定量方法は、以下の工程(A)〜(D)を含む
工程(A):
測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌に、タンパク質遺伝子を発現調節可能な状態で導入して乳酸菌組換体を得る。但し、前記タンパク質は発現量を定量可能なタンパク質である。
工程(B):
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下、前記乳酸菌組換体が生成するタンパク質の量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める。
工程(C):
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下で、前記乳酸菌組換体を培養して、培養中または培養後の培養液に含まれるタンパク質の量を測定する。
工程(D):
前記工程(B)で求めた相関関係に基づいて、前記工程(C)で測定したタンパク質の量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める。
The method for quantifying amino acids in a sample of the present invention includes the following steps (A) to (D) (A):
A protein gene is introduced into a lactic acid bacterium having auxotrophy for the amino acid to be measured in a state in which the expression can be regulated to obtain a recombinant lactic acid bacterium. However, the protein is a protein whose expression level can be quantified.
Process (B):
In a medium containing the amino acid to be measured at a predetermined concentration, a correlation between the amount of protein produced by the recombinant lactic acid bacteria and the amino acid concentration is determined under the expression induction condition of the protein gene.
Process (C):
Specimens are mixed in a medium not containing the amino acid to be measured, and the recombinant lactic acid bacteria are cultured in the obtained medium under the conditions for inducing expression of the protein gene, and are contained in the culture solution during or after the culture. Measure the amount of protein.
Process (D):
Based on the correlation obtained in the step (B), the amount of amino acid contained in the sample is obtained from the amount of protein measured in the step (C).
工程(A)
本発明において、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌」における「測定対象アミノ酸」とは、例えば、タンパク質構成アミノ酸であることができ、タンパク質構成アミノ酸とは、L-アラニン、L-プロリン、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-グルタミン、L-セリン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-メチオニン、L-グリシン、L-チロシン、L-アスパラギン、L-トリプトファン、L-システインを意味する。さらに、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性」とは、乳酸菌が、自ら体内で測定対象アミノ酸を合成できず、生育するためには培地から供給される必要がある性質を意味する。さらに、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌」とは、「測定対象アミノ酸」を包含するアミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌を意味する。測定対象アミノ酸は、1種類であることも複数種類であることもできる。
Process (A)
In the present invention, the “measuring amino acid” in “lactic acid bacteria having auxotrophy for the measuring amino acid” can be, for example, a protein-constituting amino acid, and the protein-constituting amino acids are L-alanine, L-proline, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-lysine, L-histidine, L-arginine, L-glutamine, L-serine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-threonine, L-phenylalanine, L -Methionine, L-glycine, L-tyrosine, L-asparagine, L-tryptophan, L-cysteine. Further, “nutritional requirement for measurement target amino acid” means a property that lactic acid bacteria cannot synthesize the measurement target amino acid themselves in the body and need to be supplied from the medium in order to grow. Furthermore, the “lactic acid bacterium having an auxotrophy for the measurement target amino acid” means a lactic acid bacterium having an auxotrophy for the amino acid including the “measurement target amino acid”. The amino acid to be measured can be one kind or plural kinds.
アミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌の例は、特に制限はされないが、以下の表に示すものを挙げることができる。表1には、乳酸菌の菌株名と栄養要求性を示すアミノ酸を記載する。さらに表2には、日本乳酸菌学会編・京都大学学術出版会・2010年『乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス』より引用したアミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌の例を示す。尚、表2の脚注にある「乳酸菌の科学と技術」は、乳酸菌研究集談会編・学会出版センター・1996年刊である。 Examples of lactic acid bacteria having auxotrophy for amino acids are not particularly limited, but examples include those shown in the following table. Table 1 lists the lactic acid bacteria strain names and amino acids showing auxotrophy. Furthermore, Table 2 shows examples of lactic acid bacteria having auxotrophy for amino acids quoted from the Japanese Society for Lactic Acid Bacteria, Kyoto University Academic Press, and 2010 “Science of Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria”. In addition, “Science and Technology of Lactic Acid Bacteria” in the footnotes in Table 2 is edited by the Lactic Acid Bacteria Research Meeting, Society Publication Center, 1996.
§:ビタミンB6系を培地から除いた場合
A:ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum) ATCC 8014
B:ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) ATCC 7469
C:ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum) ATCC 9338
D:エンテロコッカス・ヒラエ(Enterococcus hirae) ATCC 8043
E:ペディオコッカス・アシディラクチシ(Pediococcus acidilactici) ATCC 8042
F:ペディオコッカス・アシディラクチシ(Pediococcus acidilactici) ATCC 8081
G:ラクトバチルス・レイヒマンニ(Lactobacillus leichmanni)
B: Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469
C: Lactobacillus fermentum ATCC 9338
D: Enterococcus hirae ATCC 8043
E: Pediococcus acidilactici ATCC 8042
F: Pediococcus acidilactici ATCC 8081
G: Lactobacillus leichmanni
尚、表1に記載された各乳酸菌のアミノ酸要求性において「※:必須要求」と標記されたアミノ酸については本発明の方法によりアミノ酸の定量が可能である。表1に記載された全ての乳酸菌は、少なくとも1つの「※:必須要求」と標記されたアミノ酸を有することから、いずれも本発明の方法によるアミノ酸の定量方法に使用できる。それに対して、「+:促進」と標記されたアミノ酸については、「+:促進」と標記されたアミノ酸の非存在時に、乳酸菌が示す挙動によって、本発明の方法によるアミノ酸の定量に使用できる場合とできない場合とがある。
(1)定量に使用可能な場合:
・生育するまで一定時間のラグが空いてから生育を始める場合
または
・生育は可能だが、生育速度はきわめて低い場合
(2)定量に使用不可能な場合(アミノ酸非存在時のバックグラウンドの発現が高くなる):
・存在時に近い生育速度を示し、また生育開始までのラグがない場合
各乳酸菌が各「促進」アミノ酸非添加時に上記挙動のどれを示すかは、予備実験をすることで簡単に明らかにできる。
In addition, in the amino acid requirement of each lactic acid bacterium described in Table 1, amino acids marked as “*: essential requirement” can be quantified by the method of the present invention. Since all the lactic acid bacteria described in Table 1 have at least one amino acid marked “*: Essential requirement”, any of them can be used in the amino acid quantification method according to the method of the present invention. On the other hand, when the amino acid marked “+: accelerated” can be used for the quantification of amino acids according to the method of the present invention due to the behavior of lactic acid bacteria in the absence of the amino acid labeled “+: accelerated”. There are cases where it is impossible.
(1) When available for quantification:
・ When growth starts after a certain amount of lag is left until growth or when growth is possible but the growth rate is extremely low
(2) When it cannot be used for quantification (background expression in the absence of amino acids increases):
-It shows the growth rate close to that at the time of existence, and when there is no lag until the start of growth, it can be easily clarified by preliminary experiments whether each lactic acid bacterium shows the above behavior when each "promoting" amino acid is not added.
工程(A)においては、タンパク質遺伝子を発現調節可能な状態で導入して乳酸菌組換体を得る。前記タンパク質は乳酸菌組換体における発現量を定量可能なタンパク質である。そのようなタンパク質の例を以下の表に、発現量の定量方法とともに示す。但し、これらに限定される意図ではない。 In step (A), a protein gene is introduced in a state in which expression can be regulated to obtain a recombinant lactic acid bacterium. The protein is a protein capable of quantifying the expression level in the recombinant lactic acid bacteria. Examples of such proteins are shown in the following table together with the method for quantifying the expression level. However, it is not the intention limited to these.
タンパク質の具体例と各タンパク質の遺伝子情報源を以下に示す。 Specific examples of proteins and gene information sources of each protein are shown below.
タンパク質発現量の定量方法は特に制限はなく、例えば、光学的、免疫的、電気化学的または酵素的方法や生育試験など、またはそれらの組合せを挙げることができる。尚、タンパク質は発現量の定量方法については、工程(B)で詳述する。 The method for quantifying the protein expression level is not particularly limited, and examples thereof include optical, immunological, electrochemical or enzymatic methods, growth tests, and the like, or combinations thereof. The method for quantifying the expression level of protein will be described in detail in step (B).
本発明で用いる乳酸菌組換体は、宿主である乳酸菌に、タンパク質遺伝子を発現調節可能な状態で導入することで得られる。タンパク質遺伝子を発現調節可能な状態で導入するには、発現調節配列及びこの発現調節配列の下流にタンパク質遺伝子を含む発現用ベクターを用いることができる。発現用ベクターは、用いるアミノ酸要求性宿主中でタンパク質を発現可能なものであれば、如何なるものでもよい。目的タンパク質の発現効率が高いものであるほど、少ない乳酸菌組換体量の使用で測定が可能となる。発現系としては例えば、乳酸菌で知られるNICE system(MoBiTec社)などが例として挙げられる。発現調節配列及びこの発現調節配列の下流にタンパク質遺伝子を含む発現用ベクターの宿主である乳酸菌への導入は、常法により実施できる。 The recombinant lactic acid bacterium used in the present invention can be obtained by introducing a protein gene into a host lactic acid bacterium in a state in which expression can be regulated. In order to introduce a protein gene in a state in which expression control is possible, an expression control sequence and an expression vector containing the protein gene downstream of the expression control sequence can be used. The expression vector may be any vector as long as it can express the protein in the amino acid-requiring host to be used. The higher the expression efficiency of the target protein, the more measurement is possible with the use of a smaller amount of recombinant lactic acid bacteria. As an expression system, for example, NICE system (MoBiTec) known for lactic acid bacteria can be mentioned. Introduction of an expression regulatory sequence and an expression vector containing a protein gene downstream of the expression regulatory sequence into a lactic acid bacterium which is a host can be performed by a conventional method.
発現調節配列としては、nisin誘導プロモータ配列(AAACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAATGATTTCGTTCGAAGGAACTACAAAATAAATTATAAGGAGGCACTCA、配列番号2)などを例示することができる。 Examples of the expression regulatory sequence include a nisin-inducible promoter sequence (AAACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAATGATTTCGTTCGAAGGAACTACAAAATAAATTATAAGGAGGCACTCA, SEQ ID NO: 2).
タンパク質遺伝子を発現調節可能な状態で導入した乳酸菌組換体を用いることで、発現誘導物質不存在下における発現調節されたタンパク質発現量が低くまたはゼロに抑えられ、バックグラウンドを下げることができ、一方で、工程(B)において発現誘導物質を添加した発現誘導条件下での培養において、発現調節されたタンパク質の発現量が多くなるか発現が初めて得られるようになり、高感度・高精度の測定を可能にする。nisin誘導プロモータ配列に対する発現誘導物質はnisin(ナイシン)である。nisin(ナイシン)は、34 アミノ酸残基で構成される抗菌ペプチドである。 By using a recombinant lactic acid bacterium introduced with a protein gene in a state in which expression can be regulated, the expression level of the protein whose expression is regulated in the absence of an expression inducer can be suppressed to low or zero, and the background can be lowered. Thus, in culture under the expression-inducing condition to which an expression-inducing substance is added in step (B), the expression level of the protein whose expression is regulated is increased or the expression can be obtained for the first time. Enable. The expression inducer for the nisin-inducible promoter sequence is nisin. Nisin is an antimicrobial peptide composed of 34 amino acid residues.
工程(A)で得られる乳酸菌組換体は、常法により培養して、工程(B)及び(C)に用いる乳酸菌組換体とすることができる。この培養は、導入されたタンパク質の発現抑制条件下で実際されることが適当である。発現抑制条件下における培養とは、発現誘導物質不存在下における培養である。発現誘導物質不存在下に行われること以外は、乳酸菌組換体が正常に生育できる環境下において培養は行われる。培養後、乳酸菌組換体は、培養液とともにそのまま工程(B)及び(C)に用いられるか、または培養液から分離され、集菌されて工程(B)及び(C)に用いられる。発現抑制条件下における培養で得られた乳酸菌組換体においては、導入されたタンパク質の発現は抑制されており、乳酸菌組換体は実質的に導入されたタンパク質遺伝子の発現物は含まない。そのため、発現誘導条件下で行われる工程(B)及び(C)において、培養されて初めて導入されたタンパク質が発現されることから、測定対象であるアミノ酸の存在の有無と存在量に依存してタンパク質の発現量が変化し、高感度・高精度の測定を可能にする。 The recombinant lactic acid bacterium obtained in step (A) can be cultured by a conventional method to obtain a lactic acid bacterium recombinant used in steps (B) and (C). It is appropriate that this culture is carried out under conditions for suppressing the expression of the introduced protein. The culture under expression suppression conditions is culture in the absence of an expression inducer. The culture is performed in an environment in which the recombinant lactic acid bacteria can grow normally, except that it is performed in the absence of an expression inducer. After culturing, the recombinant lactic acid bacteria is used as it is together with the culture solution in the steps (B) and (C), or separated from the culture solution, collected and used in the steps (B) and (C). In the recombinant lactic acid bacterium obtained by culturing under the expression suppression condition, the expression of the introduced protein is suppressed, and the recombinant lactic acid bacterium does not substantially contain an expression product of the introduced protein gene. Therefore, in steps (B) and (C) performed under expression-inducing conditions, the introduced protein is expressed for the first time after culturing, and therefore depends on the presence and amount of the amino acid to be measured. The amount of protein expression changes, enabling highly sensitive and highly accurate measurement.
工程(B):
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下、前記乳酸菌組換体が生成するタンパク質の量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める。
測定対象アミノ酸は、検体の種類と用いる乳酸菌組換体が有するアミノ酸要求性を考慮して決定される。本発明で用いる培地は、測定対象アミノ酸を含まず、測定対象アミノ酸非添加時にはタンパク質合成が抑制され、また測定対象アミノ酸添加時には速やかなタンパク質合成が起きるようなものであれば、如何なるものでもよい。即ち、培地としては、測定対象以外のアミノ酸は、乳酸菌組換体の生育に必要な種類及び量を含有し、アミノ酸以外の栄養成分についても含有するものである。
Process (B):
In a medium containing the amino acid to be measured at a predetermined concentration, a correlation between the amount of protein produced by the recombinant lactic acid bacteria and the amino acid concentration is determined under the expression induction condition of the protein gene.
The amino acid to be measured is determined in consideration of the type of specimen and the amino acid requirement of the lactic acid bacteria recombinant used. The medium used in the present invention may be any medium as long as it does not contain the measurement target amino acid, suppresses protein synthesis when the measurement target amino acid is not added, and causes rapid protein synthesis when the measurement target amino acid is added. That is, as a culture medium, amino acids other than the measurement target contain types and amounts necessary for the growth of recombinant lactic acid bacteria, and also contain nutritional components other than amino acids.
この培地に、測定濃度範囲に応じた、所定濃度の測定対象アミノ酸を含有させた複数種類の培地を準備する。さらに、各培地を用いた培養は、タンパク質遺伝子の発現誘導条件下で行うため、各培地に発現誘導物質を添加する。発現誘導物質は、発現調節配列を作動させる物質から適宜選択される。発現誘導物質の添加量は、発現誘導物質の種類等に応じて適宜決定できる。 A plurality of types of media containing a predetermined concentration of the measurement target amino acid corresponding to the measurement concentration range are prepared in this medium. Furthermore, since culture using each medium is performed under the conditions for inducing protein gene expression, an expression inducer is added to each medium. The expression inducer is appropriately selected from substances that activate the expression regulatory sequence. The addition amount of the expression inducer can be appropriately determined according to the type of the expression inducer.
乳酸菌組換体が生成するタンパク質の量の定量は、タンパク質の種類に応じて適宜選択でき、例えば、光学的、免疫的、電気化学的または酵素的方法やバイオアッセイにより実施できる。光学的方法は、例えば、発光量、蛍光量、吸光度などを測定する方法である。発光検出及び蛍光検出による方法では、高感度な定量が可能である。免疫的方法は、タンパク質に対する抗体を用いる方法であり、抗体に蛍光標識を付したものを用いる場合には、光学的方法と組み合わせて実施できる。電気化学的方法は、タンパク質が例えば、酵素である場合、この酵素の作用で生成する物質の濃度を電気化学的に測定する方法である。例えば、酵素の作用で生成する物質が、水素イオンまたは水酸化物イオンの場合、pH電極を用いて水素イオン濃度を電気化学的に測定することができる。酵素的方法は、タンパク質が例えば、酵素である場合であり、酵素の作用により、例えば、発光や電気化学的に測定可能な物質を生成させ、それらを光学的方法または電気化学的方法により測定することができる。毒素のバイオアッセイは、毒素に感受性の菌または細胞を用いる方法であり、その阻止円の大きさや最小生育濃度を調べることで測定することができる。 The quantification of the amount of protein produced by the recombinant lactic acid bacterium can be appropriately selected depending on the type of protein, and can be performed, for example, by an optical, immunological, electrochemical or enzymatic method or bioassay. The optical method is, for example, a method for measuring a light emission amount, a fluorescence amount, an absorbance, or the like. The method based on luminescence detection and fluorescence detection enables highly sensitive quantification. The immunological method is a method using an antibody against a protein, and when an antibody with a fluorescent label is used, it can be combined with an optical method. The electrochemical method is a method of electrochemically measuring the concentration of a substance produced by the action of an enzyme when the protein is an enzyme, for example. For example, when the substance produced by the action of the enzyme is hydrogen ion or hydroxide ion, the hydrogen ion concentration can be electrochemically measured using a pH electrode. In the enzymatic method, for example, a protein is an enzyme, and substances that can be measured, for example, luminescence or electrochemically are generated by the action of the enzyme, and these are measured by an optical method or an electrochemical method. be able to. Toxin bioassay is a method using bacteria or cells sensitive to toxin and can be measured by examining the size of the inhibition circle and the minimum growth concentration.
乳酸菌組換体が生成するタンパク質の量の定量は、定量方法によっては、乳酸菌組換体によるタンパク質の発現と並行して連続的または断続的に実施することができる。例えば、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質やGFPなどの蛍光タンパク質を用いる場合には、タンパク質発現を行わせつつ同時に発光や蛍光を経時的にモニタリングすることができる。また、電気化学的方法においても、電気化学的に測定対象である物質をタンパク質発現を行わせつつ同時に測定することができる。 Quantification of the amount of protein produced by the recombinant lactic acid bacteria can be performed continuously or intermittently in parallel with the expression of the protein by the recombinant lactic acid bacteria depending on the quantitative method. For example, when a photoprotein such as luciferase or a fluorescent protein such as GFP is used, luminescence and fluorescence can be monitored over time while protein expression is performed. Also, in the electrochemical method, a substance to be measured electrochemically can be measured simultaneously with protein expression.
工程(B)においては、前記乳酸菌組換体が生成するタンパク質の量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める。求められた相関関係は、例えば、検量線としておくことや、相関関係式をコンピュータに入力しておくこともできる。 In step (B), the correlation between the amount of protein produced by the recombinant lactic acid bacteria and the amino acid concentration is determined. The obtained correlation can be, for example, a calibration curve or a correlation equation can be input to a computer.
工程(C):
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下で、前記乳酸菌組換体を培養して、培養中または培養後の培養液に含まれるタンパク質の量を測定する。乳酸菌組換体の培養及びタンパク質の量の測定は、工程(B)と同様の方法で実施できる。
培養液に含まれるタンパク質の量の測定は、測定方法によっては、培養中に連続的または断続的に実施することができ、また、測定方法によっては、培養後に培養液中の成分を分析することでの行われる場合もある。また、培養後に測定を行う場合には、いったん菌体を培養液から分離後、菌体サンプル中のタンパク質の量を測定することで、培養液に含まれるタンパク質の量の測定を行うこともできる。
Process (C):
Specimens are mixed in a medium not containing the amino acid to be measured, and the recombinant lactic acid bacteria are cultured in the obtained medium under the conditions for inducing expression of the protein gene, and are contained in the culture solution during or after the culture. Measure the amount of protein. Culture of the recombinant lactic acid bacteria and measurement of the amount of protein can be carried out in the same manner as in step (B).
Depending on the measurement method, the amount of protein contained in the culture solution can be measured continuously or intermittently during the culture, and depending on the measurement method, the components in the culture solution can be analyzed after the culture. Sometimes it is done at. Moreover, when measuring after culture | cultivation, after isolate | separating a microbial cell from a culture solution, the quantity of the protein contained in a culture solution can also be measured by measuring the quantity of the protein in a microbial cell sample. .
本発明のアミノ酸の定量方法が対象とする検体は、特に制限はない。本発明に用いる検体は、測定対象アミノ酸を含む可能性のある試料であれば、如何なるものでもよい。用いる乳酸菌組換体のタンパク質合成や細胞内へのアミノ酸取り込みを阻害する物質が含まれていなければ、用いる乳酸菌組換体の増殖を阻害・促進する物質が含まれていてもよい。例えば、食品サンプルや各種培地、血漿などの生体試料が例として挙げられる。 There is no particular limitation on the sample targeted by the amino acid quantification method of the present invention. The sample used in the present invention may be any sample as long as it may contain the measurement target amino acid. A substance that inhibits / promotes the growth of the recombinant lactic acid bacterium to be used may be included as long as it does not contain a substance that inhibits protein synthesis of the recombinant lactic acid bacterium used and amino acid incorporation into the cell. Examples thereof include biological samples such as food samples, various media, and plasma.
工程(C)は、より具体的には、
測定対象アミノ酸のみを制限した培地と検体、測定対象アミノ酸に要求性であるタンパク質を発現調節可能な状態で導入した乳酸菌組換体、タンパク質発現誘導物質、さらに必要により水または緩衝液を混合する工程(C1)、
前記混合により得られた反応液をタンパク質発現に適した温度で所定時間放置する工程(C2)、及び
放置後の反応液中に存在する発現タンパク質の量を計測する工程(C3)
を含む。
Step (C) is more specifically,
A step of mixing a medium and sample limited only to the measurement target amino acid, a recombinant lactic acid bacterium introduced in a state in which the expression of the protein required for the measurement target amino acid can be regulated, a protein expression inducer, and, if necessary, water or a buffer ( C1),
The step of leaving the reaction solution obtained by the mixing for a predetermined time at a temperature suitable for protein expression (C2), and the step of measuring the amount of expressed protein present in the reaction solution after standing (C3)
including.
工程(C2)における温度は、乳酸菌組換体の生育に適した温度であれば良く、例えば、10〜40℃の範囲であることができる。また、工程(C2)における放置のための所定時間は検体に含まれる測定対象アミノ酸の濃度、乳酸菌組換体の種類、特に宿主となった菌体の種類及び発現されるタンパク質の種類に応じて適宜決定できる。 The temperature in the step (C2) may be any temperature that is suitable for the growth of recombinant lactic acid bacteria, and may be, for example, in the range of 10 to 40 ° C. In addition, the predetermined time for leaving in the step (C2) is appropriately determined according to the concentration of the amino acid to be measured contained in the specimen, the type of recombinant lactic acid bacteria, particularly the type of bacterial cells that became the host and the type of protein to be expressed. Can be determined.
工程(C1)〜(C3)はそれぞれ別個の容器に移して行ってもよいし、あるいは工程(C1)〜(C3)を単一の容器で行ってもよい。前者の例としては、工程(C1)終了後、混合液をタンパク質発現用容器に移して工程(C2)に供し、その後測定用容器に移して工程(C3)に供する、といった例が挙げられる。後者の例としては、各種成分の混合、タンパク質発現および測定が可能な容器において工程(C1)〜(C3)を連続して行う、といった例が挙げられる。また後者の例では、工程(C2)と工程(C3)を同時に行う、すなわちタンパク質を発現させつつその量をモニタリングする、という手法を取ってもよい。 Steps (C1) to (C3) may be carried out in separate containers, or steps (C1) to (C3) may be carried out in a single container. As an example of the former, after completion of the step (C1), the mixed solution is transferred to a protein expression container and used for the step (C2), and then transferred to a measurement container and used for the step (C3). Examples of the latter include an example in which steps (C1) to (C3) are continuously performed in a container capable of mixing various components and expressing and measuring proteins. In the latter example, a method may be used in which the step (C2) and the step (C3) are performed simultaneously, that is, the amount of the protein is monitored while being expressed.
工程(C1)〜(C3)でのサンプル液量は、混合および測定が可能であればいくらでもよい。ミリリットルオーダー以上の溶液でもよいし、数十〜数百マイクロリットルオーダーの溶液を96穴プレートなどで測定してもよいし、あるいはマイクロリットルオーダー以下の微量溶液を、マイクロ流路デバイスを用いて測定してもよい。また、乳酸菌組換体をマイクロアレイ状に固定化し、そこにサンプルを滴下することで工程(C1)〜(C3)を行ってもよい。 The amount of sample liquid in the steps (C1) to (C3) may be any as long as mixing and measurement are possible. A solution of the order of milliliters or more may be measured, a solution of the order of several tens to several hundreds of microliters may be measured with a 96-well plate, or a trace amount solution of the order of microliters or less is measured using a microchannel device. May be. Alternatively, the steps (C1) to (C3) may be performed by immobilizing the recombinant lactic acid bacteria in a microarray and dropping a sample thereon.
工程(D):
前記工程(B)で求めた相関関係に基づいて、前記工程(C)で測定したタンパク質の量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める。工程(B)において、相関関係式をコンピュータに入力しておき、工程(C)で得られたタンパク質の量の測定結果を前記コンピュータに入力し、コンピュータにおいてアミノ酸濃度を換算させ、結果を出力させることもできる。あるいは、工程(B)において、検量線を作成してある場合には、工程(C)で得られたタンパク質の量の測定結果を、検量線に照らしてアミノ酸濃度を換算することもできる。
Process (D):
Based on the correlation obtained in the step (B), the amount of amino acid contained in the sample is obtained from the amount of protein measured in the step (C). In step (B), the correlation equation is input to the computer, the measurement result of the amount of protein obtained in step (C) is input to the computer, the amino acid concentration is converted by the computer, and the result is output. You can also Alternatively, when a calibration curve is prepared in step (B), the amino acid concentration can also be converted by comparing the measurement result of the amount of protein obtained in step (C) with the calibration curve.
本発明の方法における検体は、前述のように、例えば、食品サンプルや各種培地、血漿などの生体試料であることができる。従って、本発明の方法は食品中のアミノ酸分析方法として用いることができ、さらには、血漿などの生体試料中のアミノ酸分析方法として用いることができる。 As described above, the specimen in the method of the present invention can be, for example, a biological sample such as a food sample, various media, or plasma. Therefore, the method of the present invention can be used as a method for analyzing amino acids in foods, and further can be used as a method for analyzing amino acids in biological samples such as plasma.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
例1 乳酸菌組換体の構築(工程(A))
1. ルシフェラーゼ発現系の構築例
発現ベクターにはpNZ8148(MoBiTec社)を、ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子はpGL3(Promega社)上の遺伝子を用いた。pGL3をNcoIおよびXbaI処理に供し、ルシフェラーゼ遺伝子断片(配列番号1)を単離した。これに同じ組み合わせの制限酵素処理に供したpNZ8148ベクターをligationさせ、nisin誘導プロモータ(配列番号2、起源Lactococcus lactis NZ9700株)下流にルシフェラーゼ遺伝子を有する発現用プラスミドを構築した。
Example 1 Construction of recombinant lactic acid bacteria (step (A))
1. Example of construction of luciferase expression system pNZ8148 (MoBiTec) was used as an expression vector, and a gene on pGL3 (Promega) was used as a firefly-derived luciferase gene. pGL3 was subjected to NcoI and XbaI treatment, and a luciferase gene fragment (SEQ ID NO: 1) was isolated. This was ligated with the pNZ8148 vector subjected to the same combination of restriction enzyme treatments, and an expression plasmid having a luciferase gene downstream of the nisin-inducible promoter (SEQ ID NO: 2, origin Lactococcus lactis NZ9700 strain) was constructed.
2. β-ガラクトシダーゼ発現系の構築例
大腸菌(Escherichia coli) K-12株のゲノムを鋳型として、下記のlacZ-FとlacZ-Rをプライマーとして用いてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子lacZ(配列番号3、起源大腸菌(Escherichia coli) K-12株)を増幅した。得られたPCR産物とpNZ8148をNcoIおよびHindIII処理に供し、ligationさせた。得られた発現用プラスミドは、nisin誘導プロモータ(配列番号2)下流にlacZを有している。
lacZ-F: AACCATGGGGACCATGATTACGGATTCAC (配列番号4)
lacZ-R:TATAAGCTTATTTTTGACACCAGACCAACTG(配列番号5)
2. Example of construction of β-galactosidase expression system β-galactosidase gene lacZ (SEQ ID NO: 3, origin) using Escherichia coli K-12 genome as a template and the following lacZ-F and lacZ-R as primers Escherichia coli K-12 strain) was amplified. The obtained PCR product and pNZ8148 were subjected to NcoI and HindIII treatment and ligation. The resulting expression plasmid has lacZ downstream of the nisin inducible promoter (SEQ ID NO: 2).
lacZ-F: AACCATGGGGACCATGATTACGGATTCAC (SEQ ID NO: 4)
lacZ-R: TATAAGCTTATTTTTGACACCAGACCAACTG (SEQ ID NO: 5)
3. ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)各株への発現プラスミド導入
ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ発現系のホストとして、L. ラクティス(lactis) NZ9000株およびL. ラクティス(lactis)NBRC 100933株を用いた。Promega社NICE system説明書に従った手順でコンピテントセル調製を行った。コンピテントセルを上記ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼ発現用プラスミドと混合し、1 mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移し、BTX社製Electro Cell Manipulator 600で1500 V, 182Ωでエレクトロポレーションした。菌懸濁液を選択培地で培養し、上記発現用プラスミドを保持する形質転換体が得られた。
3. Expression plasmid introduction into each strain of Lactococcus lactis L. lactis NZ9000 strain and L. lactis NBRC 100933 strain were used as hosts for luciferase and β-galactosidase expression systems. Competent cell preparation was performed according to the procedure according to the Promega NICE system manual. Competent cells were mixed with the above luciferase or β-galactosidase expression plasmid, transferred to a 1 mm gap electroporation cuvette, and electroporated with an Electro Cell Manipulator 600 manufactured by BTX at 1500 V and 182Ω. The bacterial suspension was cultured in a selective medium, and a transformant retaining the expression plasmid was obtained.
Nisin誘導プロモータからの転写が起きるためにはnisin応答レギュレーターが必要になる。L. ラクティス(lactis) NZ9000株はゲノム中にレギュレーター遺伝子を有するのに対し、L. ラクティス(lactis) NBRC 100933株はレギュレーター遺伝子を有さない。そこで上記の発現用プラスミド保持L. ラクティス(lactis) NBRC 100933株についてはさらにコンピテントセルを調製し、nisinレギュレーター遺伝子(配列番号6, 7、起源Lactococcus lactis NZ9700株)を有するプラスミドpNZ9530(MoBiTec社)で再度形質転換した。得られた菌株を発現用L. ラクティス(lactis) NBRC 100933株として用いた。 In order for transcription from the Nisin-inducible promoter to occur, a nisin response regulator is required. The L. lactis NZ9000 strain has a regulator gene in the genome, whereas the L. lactis NBRC 100933 strain has no regulator gene. Therefore, for the above-mentioned expression plasmid-retaining L. lactis NBRC 100933 strain, a competent cell was further prepared, and plasmid pNZ9530 (MoBiTec) having a nisin regulator gene (SEQ ID NO: 6, 7, origin Lactococcus lactis NZ9700 strain) And transformed again. The obtained strain was used as L. lactis NBRC 100933 strain for expression.
例2 検量線の作成(工程(B))
1. ルシフェラーゼ発現L. ラクティス(lactis) NZ9000株の各種アミノ酸測定条件での発光プロファイルおよび検量線
L. ラクティス(lactis) NZ9000株はLeu要求性を示すことから、各種濃度のLeu存在下での発光プロファイルを調べた。
上記ルシフェラーゼ発現L. ラクティス(lactis) NZ9000株を通常の乳酸菌用培地(0.5%グルコース添加M17培地; nisinは非添加)で培養した後、集菌後20 mM K-PO4バッファー(pH 7.0)でウォッシュし、培地成分を除いた菌懸濁液を調製した。2%植菌量となるように、菌懸濁液と、表5及び表6に示す組成のLeu測定用培地、nisin溶液(終濃度10μg/ml)、ルシフェラーゼの基質となるルシフェリン溶液(終濃度250μM)、および各種濃度Leu溶液を混合した。上記混合液を30℃設定のマイクロプレートリーダーにセットし、発光強度の経時的変化をモニタリングした。
Example 2 Creating a calibration curve (process (B))
1. Luciferase expression L. lactis NZ9000 strain luminescence profile and calibration curve under various amino acid measurement conditions
Since L. lactis NZ9000 strain shows Leu requirement, the luminescence profile in the presence of various concentrations of Leu was examined.
The above luciferase-expressing L. lactis NZ9000 strain was cultured in a normal medium for lactic acid bacteria (M17 medium supplemented with 0.5% glucose; nisin not added), and then collected with 20 mM K-PO 4 buffer (pH 7.0) Washed to prepare a bacterial suspension from which the medium components were removed. To achieve 2% inoculum, the suspension of the fungus, Leu measurement medium with the composition shown in Tables 5 and 6, nisin solution (final concentration 10 μg / ml), and luciferin solution (final concentration) as a substrate for luciferase 250 μM) and various concentrations of Leu solution were mixed. The above mixed solution was set in a microplate reader set at 30 ° C., and the change in luminescence intensity over time was monitored.
異なる濃度のLeuを含む各サンプルの発光強度変化は図1のようになった。Leu濃度の高いサンプルでは、モニタリング開始から発光強度に上昇が見られた。発光強度上昇速度とLeu添加濃度の間には高い正の相関が見られた。 The change in luminescence intensity of each sample containing different concentrations of Leu is shown in FIG. In the sample with high Leu concentration, the emission intensity increased from the start of monitoring. A high positive correlation was found between the rate of increase in luminescence intensity and the Leu addition concentration.
上記表6に示すアミノ酸測定用培地の基礎組成からの変更点において、測定対象アミノ酸が、Gluの場合、及びIleの場合、Glu測定ではAspからAsnへの置換を行い、Ile測定ではLeu・Val量を低減した。この等の変更は非特許文献1の記載に基づいて行った。但し、本発明の方法では、これらの変更を行わない条件での測定においても、変更を行った場合と定量結果に大きな差は見られなかった。また、Glu測定におけるAla非添加については、本発明者の検討の結果、Ala非添加の方がGlu検量線の直線性が若干向上することがわかったため、採用した。但し、Ala添加条件においてもGluの定量は可能である。 In the change from the basic composition of the medium for amino acid measurement shown in Table 6 above, when the amino acid to be measured is Glu and Ile, Asp is replaced with Asn in Glu measurement, and Leu Val is used in Ile measurement. Reduced the amount. These changes were made based on the description of Non-Patent Document 1. However, in the method of the present invention, even in the measurement under the conditions where these changes are not made, there was no significant difference between the quantitative results and the cases where the changes were made. In addition, Ala non-addition in Glu measurement was adopted as a result of examination by the present inventor because it was found that non-Ala addition slightly improved the linearity of the Glu calibration curve. However, Glu can be quantified even under Ala addition conditions.
尚、非特許文献1で上記のような変更をしている理由としては、AspからGlu、LeuやValからIleの生合成されてしまうのを抑えるためではないかと推察される。非特許文献1の定量法で上記の変更をしなかった場合、本発明の定量法と同様にほとんど影響は出ないのか、あるいは大きな影響が出るのか、どちらになるかは不明である。後者である場合には、菌の種類によって上記生合成が起きることがある、あるいは非特許文献1の方法では、本発明に比べて増殖を終えるまでに長時間培養を要するので、生育に影響を与える、といった可能性が考えられる。いずれにして本発明の方法では、影響はほとんどなかった。 In addition, it is guessed that the reason for making the above changes in Non-Patent Document 1 is to suppress biosynthesis of Asle to Glu, Leu, or Val from Ile. If the above-described change is not made in the quantification method of Non-Patent Document 1, it is unclear whether it will have little or no significant effect as in the quantification method of the present invention. In the latter case, the above-mentioned biosynthesis may occur depending on the type of bacteria, or the method of Non-Patent Document 1 requires a longer period of culture to complete the growth compared to the present invention. The possibility of giving is considered. In any case, the method of the present invention had little influence.
2. ルシフェラーゼ発現L. ラクティス(lactis) NZ9000株によるArg, His, Glu, Leu, Ile, Val検量線
上記の手順で得られた図1の発光量経時的変化のデータから、モニタリング開始30分後の発光強度を抜き出し、横軸をLeu濃度にしてプロットすると図2のようになり、Leu濃度と発光強度の間に高い相関関係が見られた。よって、上記のような測定法により、高い直線性を有するLeu検量線が得られることが示された。
2. Luciferase expression L. lactis NZ9000 strain Arg, His, Glu, Leu, Ile, Val calibration curve 30 minutes after the start of monitoring from the luminescence amount change data of Fig. 1 obtained by the above procedure When the luminescence intensity was extracted and plotted with the horizontal axis as the Leu concentration, it was as shown in FIG. 2, and a high correlation was observed between the Leu concentration and the luminescence intensity. Therefore, it was shown that a Leu calibration curve having high linearity can be obtained by the measurement method as described above.
さらに、Leuと同様の手順で、L. ラクティス(lactis) NZ9000株の要求性アミノ酸であるArg, His, Glu, Ile, Valでも測定を行った。得られた発光強度とそのときの各アミノ酸濃度を図3〜7に示す。いずれのアミノ酸に関しても、アミノ酸濃度と発光強度の間に高い相関関係が見られた。よって、上記のような測定法により、高い直線性を有するArg, His, Glu, Ile, Val検量線が得られることが示された。 Furthermore, measurement was also performed on Arg, His, Glu, Ile, and Val, which are required amino acids of L. lactis NZ9000 strain, by the same procedure as Leu. The obtained luminescence intensity and each amino acid concentration at that time are shown in FIGS. For any amino acid, a high correlation was observed between the amino acid concentration and the luminescence intensity. Therefore, it was shown that an Arg, His, Glu, Ile, Val calibration curve having high linearity can be obtained by the measurement method as described above.
3. ルシフェラーゼ発現L. ラクティス(lactis) NBRC 100933株によるPro検量線
L. ラクティス(lactis) NZ9000株はPro非要求性であり、上記Arg, His, Glu, Leu, Ile, Valとは異なり、Proに対してはアミノ酸濃度依存的な発光上昇を示さない。一方、L. ラクティス(lactis) NBRC 100933はPro要求性であることが知られている。このL. ラクティス(lactis) NBRC 100933を元株に構築したルシフェラーゼ発現株により、Pro検量線作成が可能かを検証した。L. ラクティス(lactis) NBRC 100933株を用いた測定では、nisin濃度を50μg/mlにした以外は、上記のL. ラクティス(lactis) NZ9000株での測定と同じ手順で行った。
3. Pro calibration curve with luciferase expression L. lactis NBRC 100933 strain
L. lactis NZ9000 strain is non-Pro-required, and unlike the above Arg, His, Glu, Leu, Ile, Val, it does not show an increase in luminescence depending on the amino acid concentration for Pro. On the other hand, L. lactis NBRC 100933 is known to have Pro requirements. It was verified whether or not a Pro calibration curve could be created using a luciferase-expressing strain constructed from the original strain of L. lactis NBRC 100933. The measurement using the L. lactis NBRC 100933 strain was carried out in the same procedure as the above-mentioned measurement using the L. lactis NZ9000 strain except that the nisin concentration was 50 μg / ml.
得られた発光強度とそのときの各Pro酸濃度を図8に示す。Pro濃度と発光強度の間に高い相関関係が見られた。よって、上記のような測定法により、高い直線性を有するPro検量線が得られることが示された。また、測定したいアミノ酸に要求性を示す生物に発現系を導入することで、目的アミノ酸の定量が可能になることが示された。 The obtained emission intensity and each Pro acid concentration at that time are shown in FIG. A high correlation was found between Pro concentration and luminescence intensity. Therefore, it was shown that a Pro calibration curve having high linearity can be obtained by the measurement method as described above. Moreover, it was shown that the target amino acid can be quantified by introducing an expression system into an organism exhibiting a requirement for the amino acid to be measured.
4. β-ガラクトシダーゼ発現L. ラクティス(lactis) NZ9000株によるArg検量線
上記のβ-ガラクトシダーゼ発現L. ラクティス(lactis) NZ9000株通常の乳酸菌用培地(0.5%グルコース添加M17培地; nisinは非添加)で培養した後、集菌後20 mM K-PO4バッファー(pH 7.0)でウォッシュし、培地成分を除いた菌懸濁液を調製した。5%植菌量となるように、菌懸濁液と、表5及び表6に示す組成のArg測定用培地、nisin溶液(終濃度10μg/ml)、および各種濃度Arg溶液を混合した。混合液を30℃で1時間静置した後、ガラクトシダーゼ活性を測定した。
4. β-galactosidase expression L. lactis Arg standard curve with NZ9000 strain Above β-galactosidase expression L. lactis NZ9000 strain normal medium for lactic acid bacteria (0.5% glucose added M17 medium; nisin not added) After culturing, the cells were washed and washed with 20 mM K-PO 4 buffer (pH 7.0) to prepare a bacterial suspension from which the medium components were removed. The bacterial suspension was mixed with an Arg measurement medium having the composition shown in Tables 5 and 6, a nisin solution (final concentration of 10 μg / ml), and various concentrations of Arg solutions so that the amount of inoculation was 5%. The mixture was allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour, and then galactosidase activity was measured.
測定結果は図9になり、Arg濃度とルシフェラーゼ活性の間に高い相関関係が見られた。よって、上記のような測定法により、高い直線性を有するArg検量線が得られることが示された。また、発現させるタンパク質はルシフェラーゼに限られず、他のタンパク質の発現量を見ることでもアミノ酸定量が可能であることが示された。 The measurement result is shown in FIG. 9, and a high correlation was observed between the Arg concentration and the luciferase activity. Therefore, it was shown that an Arg calibration curve having high linearity can be obtained by the measurement method as described above. Moreover, the protein to be expressed is not limited to luciferase, and it was shown that amino acid quantification is possible by looking at the expression level of other proteins.
例3 カザミノ酸溶液におけるArgの添加回収実験(工程(B), (C))
上記参考例2のルシフェラーゼ発現L. ラクティス(lactis) NZ9000株によるArg検量線を作製するのと同じ手順で、混合液中に終濃度0.75μg/mlカザミノ酸を添加したサンプル1組と、添加しなかったサンプルもう1組を調製した。
得られた発光強度とそのときのArg添加濃度を図10に示す。カザミノ酸を添加した組と非添加の組が図10で同等の傾きを示したことから、本手法による定量性はカザミノ酸の添加により損なわれないことが示された。
カザミノ酸添加かつArg非添加サンプルの発光強度から、サンプル中のカザミノ酸由来Arg濃度は140 nMと算出された。一方、カザミノ酸溶液をアミノ酸分析システムWaters UPLC Amino Acid Analysis Solution systemで分析したところ、0.75μg/mlカザミノ酸溶液中Arg濃度は133 nMと算出された。両手法でほぼ同等の定量値が得られたことから、本発明の手法による定量性が裏付けられた。
Example 3 Arg addition and recovery experiment in casamino acid solution (process (B), (C))
Luciferase expression in Reference Example 2 above L. lactis NZ9000 strain In the same procedure as preparing an Arg calibration curve, a sample with a final concentration of 0.75 μg / ml casamino acid added to the mixture was added. Another set of samples that did not exist was prepared.
FIG. 10 shows the obtained emission intensity and the Arg concentration at that time. The group with and without casamino acid added showed the same slope in FIG. 10, indicating that the quantitativeness by this method was not impaired by the addition of casamino acid.
From the luminescence intensity of the sample added with casamino acid and not added with Arg, the concentration of Arg derived from casamino acid in the sample was calculated to be 140 nM. On the other hand, when the casamino acid solution was analyzed with an amino acid analysis system Waters UPLC Amino Acid Analysis Solution system, the Arg concentration in the 0.75 μg / ml casamino acid solution was calculated to be 133 nM. Since almost the same quantitative values were obtained by both methods, the quantitative property by the method of the present invention was supported.
例4
1. 抗生物質存在下での発光プロファイルおよびアミノ酸検量線
上記ルシフェラーゼ発現L. ラクティス(lactis) NZ9000株を通常の乳酸菌用培地(0.5%グルコース添加M17培地; nisinは非添加)で培養した後、集菌後20 mM K-PO4バッファー(pH 7.0)でウォッシュし、培地成分を除いた菌懸濁液を調製した。2%植菌量となるように、菌懸濁液と、表5に示す基礎組成の培地、およびnisin溶液(終濃度10μg/ml)を混合した。この混合液に、ampicillin、erythromycin、tetracycline、または水を添加した後、混合液を30℃設定のマイクロプレートリーダーにセットし、発光強度の経時的変化をモニタリングした。
Example 4
1. Luminescence profile and amino acid calibration curve in the presence of antibiotics The above luciferase-expressing L. lactis strain NZ9000 was cultured in a normal medium for lactic acid bacteria (M17 medium supplemented with 0.5% glucose; nisin not added). After the bacterium was washed with 20 mM K-PO 4 buffer (pH 7.0) to prepare a microbial suspension excluding the medium components. The bacterial suspension, the medium having the basic composition shown in Table 5, and the nisin solution (final concentration 10 μg / ml) were mixed so that the amount of inoculation was 2%. After adding ampicillin, erythromycin, tetracycline, or water to this mixed solution, the mixed solution was set in a microplate reader set at 30 ° C., and the change in luminescence intensity over time was monitored.
各サンプルの発光強度の経時的変化を図11に示した。Ampicillin添加サンプルは混合後30分程度の短時間の間は非添加サンプルとほぼ同等の発光量増加を示した。Ampicillinは細胞壁合成を阻害して菌の増殖を停止させるが、タンパク質翻訳などは阻害しないことが知られている。上記の結果は、本系での発光量増加が菌の増殖によるものではないことを明確に示している。一方、タンパク質翻訳を阻害するerythromycinまたはtetracyclineを添加したサンプルでは、有意な発光量増加は見られなかった。この結果は、本系での発光量増加がタンパク質翻訳に依存して起きていることを示している。 FIG. 11 shows changes with time in the emission intensity of each sample. The ampicillin added sample showed almost the same increase in luminescence as the non-added sample for a short time of about 30 minutes after mixing. Ampicillin is known to inhibit cell wall synthesis and stop bacterial growth, but not protein translation. The above results clearly show that the increase in the amount of luminescence in this system is not due to bacterial growth. On the other hand, in the sample to which erythromycin or tetracycline that inhibits protein translation was added, no significant increase in luminescence was observed. This result indicates that an increase in the amount of luminescence in this system occurs depending on protein translation.
上記Arg検量線作成と同じ手順で、混合液中に10μg/ml ampicillinを添加したサンプルも作製し、混合後約30分後に発光強度を測定した。Ampicillin添加または非添加サンプルから作成したArg検量線を図12に示す。Ampicillinの存在下でも、非存在下での検量線と顕著な差のない検量線が得られた。このことから、ampicillinのように菌の増殖に影響を及ぼすような物質共存下でも、本定量法は影響を受けずに定量が可能であることが示された。また、菌の増殖を阻害するampicillin存在下でも検量線が作成できたことからも、本定量法が従来のバイオアッセイ法のような菌の増殖に基づく手法ではないことが明確に示された。 A sample in which 10 μg / ml ampicillin was added to the mixed solution was also prepared by the same procedure as the above Arg calibration curve preparation, and the luminescence intensity was measured about 30 minutes after mixing. FIG. 12 shows an Arg calibration curve prepared from the sample with or without Ampicillin added. Even in the presence of Ampicillin, a calibration curve that was not significantly different from the calibration curve in the absence was obtained. From this, it was shown that this quantification method can be quantified without being affected even in the presence of substances such as ampicillin that affect the growth of bacteria. Moreover, since a calibration curve could be created even in the presence of ampicillin that inhibits the growth of bacteria, it was clearly shown that this quantification method is not a technique based on the growth of bacteria as in the conventional bioassay method.
アミノ酸分析は食品の品質管理や様々な疾病検出のマーカーとして用いられ、産業上広い分野で需要のある技術と言える。多種類のアミノ酸分析を行うためには、HPLCなどの機器分析を用いるという選択肢しかほぼないのが現状である。しかし機器分析は高価・大規模な分析機器を要し、現場で迅速な測定を行うことは困難である。また、現場での測定ではなく依頼分析を行う場合は、サンプル分析をはじめ保管や輸送のため高額な費用を要し、その利用はごく限られた範囲に留まっている。
本発明の手法は多種類のアミノ酸を迅速に測定することが可能である。また、利用可能な検出機器に応じて発現させるタンパク質を変えてやることで、様々な方法で安価に検出を行うことが可能である。よって本発明は、測定環境に応じた汎用性が高く、食品・医療分野で広く利用可能な技術と言える。さらに本技術はマイクロ流路などを用いた集積化・小型化が可能であり、high-throughputな測定系へ応用も可能である。
Amino acid analysis is used as a marker for food quality control and detection of various diseases, and can be said to be a technology in demand in a wide range of industrial fields. At present, there is almost no choice but to use instrumental analysis such as HPLC in order to perform various types of amino acid analysis. However, instrumental analysis requires expensive and large-scale analytical instruments, and it is difficult to perform quick measurements on site. In addition, when request analysis is performed instead of on-site measurement, expensive analysis is required for sample analysis, storage and transportation, and its use is limited to a limited range.
The method of the present invention can rapidly measure many kinds of amino acids. In addition, by changing the protein to be expressed according to available detection equipment, it is possible to perform detection at low cost by various methods. Therefore, the present invention is highly versatile according to the measurement environment, and can be said to be a technique that can be widely used in the food and medical fields. Furthermore, this technology can be integrated and miniaturized using microchannels, and can be applied to high-throughput measurement systems.
Claims (6)
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下、前記工程(A)で得た乳酸菌組換体を培養して、培養開始後60分間以内に生成するタンパク質量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(B)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で、前記工程(B)と同一である、前記タンパク質遺伝子の発現誘導条件下で、前記工程(A)で得た乳酸菌組換体を培養して、培養開始後60分間以内に培養液中に生成するタンパク質量を測定する工程(C)、及び
前記工程(B)で求めた相関関係に基づいて、前記工程(C)で測定したタンパク質量から検体中に含まれる測定対象アミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。 A protein gene is introduced into a lactic acid bacterium having an auxotrophy for the amino acid to be measured in a state in which the expression of the protein gene can be regulated, and cultured under conditions for suppressing the expression of the protein gene to obtain a recombinant lactic acid bacterium, provided that the expression level of the protein is Step (A), which is a quantifiable protein
In a medium containing a measurement target amino acid at a predetermined concentration, culturing the recombinant lactic acid bacteria obtained in the step (A) under the conditions for inducing expression of the protein gene, and the amount of protein produced within 60 minutes after the start of the culture and the above Step of obtaining a correlation with amino acid concentration (B),
A sample is mixed in a medium not containing an amino acid to be measured, and in the obtained medium, the lactic acid bacteria group obtained in the step (A) is the same as the step (B), under the conditions for inducing expression of the protein gene. Culturing the recombinant, measuring the amount of protein produced in the culture solution within 60 minutes after the start of the culture (C), and based on the correlation obtained in the step (B), in the step (C) Step of determining the amount of amino acid to be measured contained in the sample from the measured protein amount (D)
Method for quantifying amino acids in a sample containing
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