JP5381741B2

JP5381741B2 - Optical measuring apparatus and optical measuring method

Info

Publication number: JP5381741B2
Application number: JP2010011349A
Authority: JP
Inventors: 学治橋本; 慎悟今西; 優堂脇; 俊平鈴木
Original assignee: Sony Corp
Current assignee: Sony Corp
Priority date: 2010-01-21
Filing date: 2010-01-21
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2030-01-21
Also published as: JP2011149822A

Description

本発明は、微小粒子などの試料を識別する光学的測定装置及び光学的測定方法に関する。より詳しくは、特定波長の光が照射されたときに試料から発せられる蛍光や散乱光を検出し、その種類などを識別する技術に関する。 The present invention relates to an optical measurement apparatus and an optical measurement method for identifying a sample such as a microparticle. More specifically, the present invention relates to a technique for detecting fluorescence or scattered light emitted from a sample when irradiated with light of a specific wavelength and identifying the type thereof.

一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する方法である。 In general, in order to identify biologically relevant microparticles such as cells, microorganisms, and liposomes, an optical measurement method using flow cytometry (flow cytometer) is used (for example, see Non-Patent Document 1). Flow cytometry irradiates laser light of a specific wavelength to minute particles that flow in a line in a flow path, and detects fluorescence or scattered light emitted from each minute particle, thereby detecting a plurality of minute particles. This is a method for identifying one by one.

具体的には、フローセル内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態でフローセルにレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、ＰＤ（Photo diode；フォトダイオード）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などの光検出器を用いて検出する。 Specifically, in the flow cell, a laminar flow is formed by a sample liquid containing microparticles to be measured and a sheath liquid flowing around the sample liquid, and a plurality of microparticles contained in the sample liquid are arranged in one row. Line up. When the flow cell is irradiated with laser light in this state, fine particles pass one by one so as to cross the laser beam. At this time, fluorescence and / or scattered light emitted from each microparticle when excited by laser light is converted into PD (Photo diode), CCD (Charge Coupled Device) or PMT (Photo-Multiplier Tube). Detection using a photodetector such as a photomultiplier tube).

そして、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化して統計解析を行い、微小粒子の大きさ及び構造、構成するタンパク質などの情報から微小粒子の種類を判定する。また、従来、蛍光や散乱光に代えて、非線形ラマン散乱光を検出することにより、細胞などの生体関連微小粒子の内部構造を分析するフローサイトメーターも提案されている（特許文献１参照）。 Then, the light detected by the photodetector is converted into an electrical signal, digitized, and subjected to statistical analysis, and the type of the microparticle is determined from information such as the size and structure of the microparticle and the constituent protein. Conventionally, a flow cytometer that analyzes the internal structure of living body-related microparticles such as cells by detecting nonlinear Raman scattered light instead of fluorescence or scattered light has also been proposed (see Patent Document 1).

一方、前述したフローサイトメトリーにおいて、試料を定量的及び安定的に分析するためには、試料に照射される励起光の光量を常に一定にしておくことが望ましい。しかしながら、一般に、励起光のビームスポットは数十μｍと小さく、また、ビームスポット内でも、３次元方向（光軸深さ方向及び光軸と直交する方向）において、パワー密度にばらつきが生じてしまう。 On the other hand, in the above-described flow cytometry, in order to analyze a sample quantitatively and stably, it is desirable to always keep the amount of excitation light irradiated to the sample constant. However, generally, the beam spot of the excitation light is as small as several tens of μm, and even within the beam spot, the power density varies in the three-dimensional direction (the optical axis depth direction and the direction perpendicular to the optical axis). .

このため、励起光のビームスポットの特定位置に、測定対象の試料を正確に投入する必要があり、従来、励起光の照射位置と試料の通流位置とを位置合わせする方法が提案されている（特許文献２〜４参照。）。例えば、特許文献２に記載のフローサイトメーターでは、先ず、テスト用サンプルを含むテストサンプル液を流し、散乱光又は蛍光の強度が最も高くなるように、サンプル液流の位置を調整した後、測定対象の試料を含むサンプル液を流して測定を行っている。 For this reason, it is necessary to accurately put the sample to be measured at a specific position of the beam spot of the excitation light, and conventionally, a method for aligning the irradiation position of the excitation light and the flow position of the sample has been proposed. (See Patent Documents 2 to 4.) For example, in the flow cytometer described in Patent Document 2, first, a test sample liquid containing a test sample is flowed, and the position of the sample liquid flow is adjusted so that the intensity of scattered light or fluorescence becomes the highest, and then measured. Measurement is performed by flowing a sample solution containing the target sample.

また、特許文献３に記載の流動粒子分析装置では、前方散乱光、側方散乱光又は後方散乱光から、光分割器を介して取りだした検出光（散乱光）を、４分割フォトダイオードやエリアＣＣＤなどによって検出している。そして、その検出位置から、励起光の中心とシースフローの中心との位置ずれを検出し、この位置ずれが所定の範囲内に入るように、フローセルの位置を調節している。 Further, in the fluidized particle analyzer described in Patent Document 3, detection light (scattered light) extracted from forward scattered light, side scattered light, or back scattered light through a light splitter is divided into four-division photodiodes and areas. It is detected by a CCD or the like. Then, a position shift between the center of the excitation light and the center of the sheath flow is detected from the detection position, and the position of the flow cell is adjusted so that the position shift falls within a predetermined range.

更に、特許文献４に記載の平板状フローセル測定装置では、先ず、試料が流れていない状態で、流路の幅方向に移動させながら励起光を照射して散乱光の測定を行い、流路側壁からの散乱光を測定することにより、流路の位置を求める。そして、その位置情報に基づいて、流路の中心に励起光のビームスポットがくるように、ステージを移動させて平板状フローセルの位置合わせをしている。 Furthermore, in the flat flow cell measuring apparatus described in Patent Document 4, first, in the state where the sample is not flowing, the scattered light is measured by irradiating excitation light while moving in the width direction of the flow path, and the flow path side wall. The position of the flow path is obtained by measuring the scattered light from. Then, based on the position information, the stage is moved so that the beam spot of the excitation light comes to the center of the flow path, thereby aligning the flat flow cell.

特開２００９−２５８０７１号公報JP 2009-258071 A 特開２００６−１７０６８７号公報JP 2006-170687 A 特開平９−１６６５４１号公報JP-A-9-166541 特開２００４−６９６３４号公報JP 2004-69634 A

中内啓光監修，「細胞工学別冊実験プロトコルシリーズフローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行Supervised by Hiromitsu Nakauchi, "Cell Engineering Separate Volume, Experimental Protocol Series, Flow Cytometry," Second Edition, Shujunsha Co., Ltd., August 31, 2006

しかしながら、前述した従来の技術には、以下に示す問題点がある。フローサイトメトリーのように光を利用した分析方法において、測定対象の試料を定量的かつ安定的に分析しようとすると、ビームスポット内であってもビーム強度が許容できる範囲は、数μｍと極めて小さくなる。このため、ビームスポットの特定位置に、測定対象の試料を正確に通流させる必要があるが、試料の通流位置を常に一定に保つことは難しい。 However, the conventional techniques described above have the following problems. When analyzing a sample to be measured quantitatively and stably in an analysis method using light such as flow cytometry, the allowable range of the beam intensity even within the beam spot is as small as several μm. Become. For this reason, it is necessary to accurately flow the sample to be measured to a specific position of the beam spot, but it is difficult to always keep the flow position of the sample constant.

特に、マイクロ流路が形成された分析チップを使用して測定を行う場合は、流路の形状のばらつきや送液速度の変化によって、サンプル液の通流位置が変動しやすい。一方、分析チップの形状のばらつきをなくすには、製造時の加工精度を上げることが考えられるが、その場合、コストアップや歩留まりの低下が問題となる。 In particular, when measurement is performed using an analysis chip on which a microchannel is formed, the flow position of the sample liquid is likely to fluctuate due to variations in the shape of the channel and changes in the liquid feeding speed. On the other hand, in order to eliminate the variation in the shape of the analysis chip, it is conceivable to increase the processing accuracy at the time of manufacture. In this case, however, an increase in cost and a decrease in yield become problems.

また、特許文献２に記載のフローサイトメーターのように、測定前に、テストサンプル液を流して位置合わせをする方法は、微小粒子から発散される散乱光の信号強度のみを検出する方法であり、必然的に散乱信号の最大値を示した位置が最適位置となる。従って、この方法では、調整用信号に極性は存在せず、アクチュエータを動かしながら最大値になっているかを判別する動作が必要となるため、瞬時に最適値に調整を行うことが困難であり、リアルタイムでサーボをかけることができないという問題点がある。 In addition, as in the flow cytometer described in Patent Document 2, the method of flowing and aligning the test sample solution before the measurement is a method of detecting only the signal intensity of the scattered light emitted from the microparticles. Naturally, the position showing the maximum value of the scattered signal is the optimum position. Therefore, in this method, since there is no polarity in the adjustment signal, and it is necessary to determine whether the maximum value is obtained while moving the actuator, it is difficult to instantaneously adjust to the optimum value. There is a problem that the servo cannot be applied in real time.

また、検出信号の散乱強度は測定対象物の粒子径に依存し、測定する微小粒子によって検出最大値が異なるため、特許文献２に記載の方法では、均一な大きさの粒子を調整に使用しないと、精度良く調整を行うことができない。更に、このような信号強度のみを検出する調整方法においては、３軸調整などの多軸調整では、各軸の移動に伴う信号強度変化が独立しておらず、複雑な調整シーケンスが必要となる。 In addition, the scattering intensity of the detection signal depends on the particle diameter of the measurement object, and the maximum detection value differs depending on the microparticles to be measured. Therefore, the method described in Patent Document 2 does not use particles of uniform size for adjustment. Therefore, the adjustment cannot be performed with high accuracy. Furthermore, in such an adjustment method for detecting only the signal intensity, in multi-axis adjustment such as triaxial adjustment, the signal intensity change accompanying the movement of each axis is not independent, and a complicated adjustment sequence is required. .

一方、特許文献３に記載の装置のように、散乱光の検出位置に基づいてフローセルを位置決めする方法は、光軸に直交する方向については粒子検出位置を検知することができるが、光軸方向については検知することができないという問題点がある。即ち、この方法では、光軸と直交する方向にのみ極性をもった検出信号を得ることが可能であり、光軸方向では微小粒子から発散される散乱光の信号強度のみを検出しているため、調整用信号に極性は存在せず、アクチュエータを動かしながら、最大値になっているか否か判別する動作が必要となる。このため、瞬時に最適値に調整を行うことは困難であり、リアルタイムでサーボをかけることができない。 On the other hand, the method of positioning the flow cell based on the detection position of the scattered light as in the device described in Patent Document 3 can detect the particle detection position in the direction orthogonal to the optical axis. There is a problem that cannot be detected. That is, in this method, it is possible to obtain a detection signal having a polarity only in the direction orthogonal to the optical axis, and only the signal intensity of the scattered light emitted from the microparticles is detected in the optical axis direction. There is no polarity in the adjustment signal, and it is necessary to determine whether or not the adjustment signal has the maximum value while moving the actuator. For this reason, it is difficult to instantaneously adjust to the optimum value, and the servo cannot be applied in real time.

また、微小粒子から生じる散乱光は、非常に微弱であり、その信号は測定対象である粒子の大きさに依存する。このため、測定対象の粒子が小さくなるほど、十分な信号強度を得ることが困難になり、十分な検出精度を得るための何らかの対策が必要となる。そして、前述したように、検出信号の散乱強度は測定対象物の粒子径に依存し、測定する粒子により検出最大値が異なるため、この特許文献３に記載の方法においても、均一な大きさの粒子を調整用に使用しないと、精度よく調整を行うことができないという問題点がある。 Further, the scattered light generated from the fine particles is very weak, and the signal depends on the size of the particle to be measured. For this reason, as the particle to be measured becomes smaller, it becomes more difficult to obtain a sufficient signal intensity, and some measures for obtaining a sufficient detection accuracy are required. As described above, the scattering intensity of the detection signal depends on the particle diameter of the measurement object, and the maximum detection value varies depending on the particle to be measured. Therefore, even in the method described in Patent Document 3, the detection signal has a uniform size. If the particles are not used for adjustment, there is a problem that adjustment cannot be performed with high accuracy.

また、特許文献４に記載の装置のように、流路側壁からの散乱光に基づいてフローセルの位置決めする方法は、流路の中心部を探し出すことは可能であるが、フローセルの状態やシース液及びサンプル液の流速変化などにより、測定対象の微小粒子が中心部を通過している保証はない。このため、高精度な分析を目的とした装置では、十分な精度を保証することが難しいという問題点がある。 Further, as in the apparatus described in Patent Document 4, the method of positioning the flow cell based on the scattered light from the side wall of the flow path can find the center of the flow path, but the state of the flow cell and the sheath liquid There is no guarantee that the microparticles to be measured pass through the center due to changes in the flow rate of the sample liquid and the like. For this reason, there is a problem that it is difficult to guarantee sufficient accuracy in an apparatus intended for high-precision analysis.

そこで、本発明は、測定対象が微小粒子であっても良好な位置信号調整信号を得ることができ、測定対象の試料（微小粒子）の位置を精度良く検出し、試料から発せられる蛍光や散乱光などを効率よく測定ことが可能な光学的測定装置及び光学的測定方法を提供することを主目的とする。 Therefore, the present invention can obtain a good position signal adjustment signal even if the measurement object is a fine particle, accurately detect the position of the sample (microparticle) to be measured, and emit fluorescence or scattering emitted from the sample. The main object is to provide an optical measuring apparatus and an optical measuring method capable of efficiently measuring light and the like.

本発明に係る光学的測定装置は、試料に光を照射する光照射部と、光が照射された試料から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部とを有し、前記散乱光検出部は、少なくとも、試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光ビームスプリッターと、前記Ｐ偏光成分を受光して散乱光の強度を検出する第１検出器と、前記Ｓ偏光成分を受光してその受光位置の変化から試料位置を検出する第２検出器とを備えるものである。
本発明においては、散乱現象により生じたＳ偏光成分だけを取り出し、その変化から試料位置を検出しているため、試料が小さく、散乱光が微弱な場合でも、精度よくその位置を検出することが可能である。このように試料位置を高精度で検出できると、それに基づき試料位置を調整することができるため、試料から発せられる蛍光や散乱光などを効率よく測定することが可能となる。
この測定装置は、マイクロ流路を備えた分析チップを有していてもよく、その場合、光照射部はマイクロ流路内を通流する試料に光を照射する。
また、偏光ビームスプリッターと第２検出器との間に、シリンドリカルレンズを配設し、非点収差法により光軸方向における試料位置を検出することもできる。
更に、試料と偏光ビームスプリッターとの間に、試料に照射されずに透過した光を除去する遮光マスクを配置してもよい。
更にまた、光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部を設けることもでき、その場合、試料と蛍光検出部及び散乱光検出部との間に、蛍光と散乱光とを分離するミラーを配設することが望ましい。
更にまた、第２検出器での検出結果に基づいて試料位置を調整する試料位置調整部を設けてもよい。 An optical measurement apparatus according to the present invention includes a light irradiation unit that irradiates light to a sample, and a scattered light detection unit that detects scattered light emitted from the sample irradiated with light, and the scattered light detection unit Includes at least a polarization beam splitter that splits scattered light emitted from the sample into an S-polarized component and a P-polarized component, a first detector that receives the P-polarized component and detects the intensity of the scattered light, and A second detector that receives the S-polarized light component and detects the sample position from the change in the light-receiving position.
In the present invention, since only the S-polarized light component generated by the scattering phenomenon is extracted and the sample position is detected from the change, the position can be accurately detected even when the sample is small and the scattered light is weak. Is possible. If the sample position can be detected with high accuracy in this way, the sample position can be adjusted based on the detected position, so that fluorescence, scattered light, and the like emitted from the sample can be efficiently measured.
This measuring apparatus may have an analysis chip provided with a microchannel, and in that case, the light irradiation unit irradiates the sample flowing through the microchannel with light.
Further, a cylindrical lens can be disposed between the polarization beam splitter and the second detector, and the sample position in the optical axis direction can be detected by the astigmatism method.
Furthermore, a light shielding mask for removing light transmitted without being irradiated on the sample may be disposed between the sample and the polarizing beam splitter.
Furthermore, a fluorescence detection unit that detects fluorescence emitted from the sample irradiated with light can be provided. In that case, fluorescence and scattered light are placed between the sample, the fluorescence detection unit, and the scattered light detection unit. It is desirable to provide a separating mirror.
Furthermore, a sample position adjusting unit that adjusts the sample position based on the detection result of the second detector may be provided.

本発明に係る光学的測定方法は、測定対象の試料に光を照射する工程と、前記試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する工程と、Ｐ偏光成分を測定して散乱光の強度を検出する工程と、Ｓ偏光成分を測定して非点収差法により試料位置を検出する工程と、を有する。
本発明においては、試料での散乱により生じたＳ偏光成分を取り出し、非点収差法により試料位置を検出しているため、検出精度が高い。このため、検出結果に基づき、試料位置を調整することで、高感度での測定を安定して行うことができる。 The optical measurement method according to the present invention includes a step of irradiating a sample to be measured with light, a step of dispersing scattered light emitted from the sample into an S-polarized component and a P-polarized component, and measuring a P-polarized component. And detecting the intensity of the scattered light and measuring the S-polarized component and detecting the sample position by the astigmatism method.
In the present invention, since the S-polarized light component generated by scattering at the sample is taken out and the sample position is detected by the astigmatism method, the detection accuracy is high. For this reason, the measurement with high sensitivity can be stably performed by adjusting the sample position based on the detection result.

本発明によれば、Ｐ偏光成分とＳ偏光成分とを分離し、Ｓ偏光成分の変化から試料位置を検出しているため、測定対象の試料の位置を精度良く検出することができると共に、微弱な散乱光を励起光及び迷光と分離することができるため、測定対象が微小な粒子であっても、良好な位置検出信号を得ることができるため、試料から発せられる蛍光や散乱光などを効率よく測定することが可能となる。 According to the present invention, since the P-polarized component and the S-polarized component are separated and the sample position is detected from the change of the S-polarized component, the position of the sample to be measured can be detected with high accuracy and weak. Since the scattered light can be separated from the excitation light and stray light, a good position detection signal can be obtained even if the measurement target is a minute particle, so that the fluorescence and scattered light emitted from the sample can be efficiently used. It becomes possible to measure well.

本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the structure of the optical measuring device which concerns on the 1st Embodiment of this invention. 遮光マスク４１の構成を模式的に示す図である。3 is a diagram schematically showing a configuration of a light shielding mask 41. FIG. 本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the structure of the optical measuring device which concerns on the 2nd Embodiment of this invention. （ａ）はマイクロ流路２２におけるサンプル液の通流位置を示す図であり、（ｂ）はマイクロ流路２２内を通流する液の速度分布を示す図である。(A) is a figure which shows the flow position of the sample liquid in the microchannel 22, (b) is a figure which shows the velocity distribution of the liquid which flows through the inside of the microchannel 22. 本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the structure of the optical measuring device which concerns on the 3rd Embodiment of this invention. （ａ）及び（ｂ）はシリンドリカルレンズ５０を用いた検出例を示す図である。(A) And (b) is a figure which shows the example of a detection using the cylindrical lens 50. FIG.

以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。

１．第１の実施の形態
（散乱光から試料位置を検出する光学的測定装置の例）
２．第２の実施の形態
（マイクロ流路を備える分析チップを使用した装置の例）
３．第３の実施の形態
（シリンドリカルレンズを配設した装置の例）
DESCRIPTION OF EMBODIMENTS Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In addition, this invention is not limited to each embodiment shown below. The description will be given in the following order.

1. First embodiment (an example of an optical measuring device that detects a sample position from scattered light)
2. Second Embodiment (Example of an apparatus using an analysis chip having a microchannel)
3. Third Embodiment (Example of an apparatus provided with a cylindrical lens)

＜１．第１の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図１は本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態の光学的測定装置１には、例えば測定用セル２０内の試料２に、励起光５を照射する光照射部３と、励起光５が照射された試料２から発せられた蛍光６及び散乱光７などを検出する検出部４が設けられている。 <1. First Embodiment>
[Overall configuration of optical measuring device]
FIG. 1 is a diagram schematically showing the configuration of an optical measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention. As shown in FIG. 1, the optical measurement apparatus 1 of the present embodiment includes, for example, a light irradiation unit 3 that irradiates excitation light 5 onto a sample 2 in a measurement cell 20 and a sample that is irradiated with excitation light 5. A detection unit 4 for detecting the fluorescence 6 emitted from 2 and the scattered light 7 is provided.

［試料２について］
本実施形態の光学的測定装置１により測定される試料２は、励起光５を照射することにより、蛍光６及び散乱光７を発するものであればよく、例えば、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子、ウィルス、バクテリア、酵母などが挙げられる。また、試料２は、１又は複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。 [Sample 2]
The sample 2 measured by the optical measuring device 1 of the present embodiment may be anything that emits fluorescence 6 and scattered light 7 when irradiated with excitation light 5. For example, microparticles such as cells and microbeads. , Viruses, bacteria, yeast and the like. Sample 2 may be modified with one or more fluorescent dyes.

［光照射部３の構成］
光照射部３は、励起光５を発する光源３０と、この励起光５を試料２に向けて集光する対物レンズ３１などを備えている。ここで使用する光源３０は、測定内容などに応じて適宜選択することができるが、例えばレーザダイオード、ＳＨＧ(Second Harmonic Generation)レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Light Emitting Diode:発光ダイオード）などを使用することができる。 [Configuration of Light Irradiation Unit 3]
The light irradiation unit 3 includes a light source 30 that emits excitation light 5 and an objective lens 31 that condenses the excitation light 5 toward the sample 2. The light source 30 used here can be selected as appropriate according to the measurement contents and the like. For example, a laser diode, an SHG (Second Harmonic Generation) laser, a gas laser, a high-intensity LED (Light Emitting Diode), or the like is used. can do.

更に、この試料２の手前に配置される対物レンズ３１は、開口数ＮＡが低いことが望ましい。これにより、測定対象である微小粒子に対して励起ビームスポットが小さくなりすぎるのを避け、かつ焦点深度を広く確保することが可能となるため、励起光の位置決めマージンを広くすることができる。 Furthermore, it is desirable that the objective lens 31 disposed in front of the sample 2 has a low numerical aperture NA. As a result, the excitation beam spot can be prevented from becoming too small with respect to the microparticles to be measured, and a wide focal depth can be secured, so that the excitation light positioning margin can be widened.

更にまた、光源３０と対物レンズ３１との間に、特定波長の光のみを透過し、それ以外の光は反射する特性をもつバンドパスフィルター（図示せず）を配設することもできる。これにより、不要な光成分を除去することができるため、特にＬＥＤや白色光源を励起光として用いる場合には有効な手段である。なお、光照射部３は、特定波長の光（励起光５）を、試料２に照射可能な構成であればよく、光源、レンズ及び光学フィルターなどの各種光学部品の種類及び配置は適宜選択可能であり、前述した構成に限定されるものではない。 Furthermore, a band pass filter (not shown) having a characteristic of transmitting only light of a specific wavelength and reflecting other light can be disposed between the light source 30 and the objective lens 31. Thereby, unnecessary light components can be removed, which is an effective means particularly when an LED or a white light source is used as excitation light. In addition, the light irradiation part 3 should just be the structure which can irradiate the light of a specific wavelength (excitation light 5) to the sample 2, and the kind and arrangement | positioning of various optical components, such as a light source, a lens, and an optical filter, can be selected suitably. However, the present invention is not limited to the configuration described above.

［検出部４の構成］
検出部４には、少なくとも、試料２から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出器（図示せず）、並びに試料２から発せられた散乱光７を検出する散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９が設けられている。また、試料２と蛍光検出器との間には、試料２側から順に、試料２から発せられた蛍光６及び散乱光７を集光する対物レンズ４０、励起光５を除去する遮光マスク４１、蛍光６と散乱光７を分離するダイクロックミラー４２が設けられている。 [Configuration of Detection Unit 4]
The detection unit 4 includes at least a fluorescence detector (not shown) that detects the fluorescence 6 emitted from the sample 2, a scattered light intensity detector 46 that detects the scattered light 7 emitted from the sample 2, and the sample position. A detector 49 is provided. Further, between the sample 2 and the fluorescence detector, in order from the sample 2 side, an objective lens 40 that condenses the fluorescence 6 and scattered light 7 emitted from the sample 2, a light shielding mask 41 that removes the excitation light 5, A dichroic mirror 42 for separating the fluorescence 6 and the scattered light 7 is provided.

一方、ダイクロックミラー４２と散乱光強度検出器４６との間には、ダイクロックミラー４２側から順に、偏光ビームスプリッター（Polarizing Beam Splitter：ＰＢＳ）４３、集光レンズ４４、ピンホール４５が配設されている。また、偏光ビームスプリッター４３と試料位置検出器４９との間には、偏光ビームスプリッター４３側から順に、集光レンズ４７及びピンホール４８が配設されている。 On the other hand, between the dichroic mirror 42 and the scattered light intensity detector 46, a polarizing beam splitter (PBS) 43, a condensing lens 44, and a pinhole 45 are arranged in this order from the dichroic mirror 42 side. Has been. A condensing lens 47 and a pinhole 48 are arranged between the polarizing beam splitter 43 and the sample position detector 49 in order from the polarizing beam splitter 43 side.

（対物レンズ４０）
検出器側の対物レンズ４０は、開口数ＮＡが高いことが望ましく、これにより、測定対象である微小粒子から生じる微弱な散乱光及び蛍光を高感度に計測することが可能となる。 (Objective lens 40)
The detector-side objective lens 40 desirably has a high numerical aperture NA, which makes it possible to measure weakly scattered light and fluorescence generated from the microparticles to be measured with high sensitivity.

（遮光マスク４１）
励起光５の照射により、試料２からは、励起光５と同波長の散乱光７と、励起光５とは波長が異なる蛍光６が発せられるが、検出部４側に入射する光には、試料２に照射されずに測定セル２０を透過した励起光５も含まれる。しかしながら、試料２から発せられる蛍光６及び散乱光７は、励起光５に比べて非常に微弱な光であり、検出部４側に入射した光から励起光５を分離する必要がある。そこで、本実施形態の光学的測定装置１においては、検出部４に入射した光から励起光５を除去するため、対物レンズ４０とダイクロックミラー４２との間に、遮光マスク４１を配設している。 (Shading mask 41)
By irradiating the excitation light 5, the sample 2 emits scattered light 7 having the same wavelength as the excitation light 5 and fluorescence 6 having a wavelength different from that of the excitation light 5. The excitation light 5 that has passed through the measurement cell 20 without being irradiated on the sample 2 is also included. However, the fluorescence 6 and scattered light 7 emitted from the sample 2 are very weak compared to the excitation light 5, and it is necessary to separate the excitation light 5 from the light incident on the detection unit 4 side. Therefore, in the optical measurement apparatus 1 of the present embodiment, a light shielding mask 41 is disposed between the objective lens 40 and the dichroic mirror 42 in order to remove the excitation light 5 from the light incident on the detection unit 4. ing.

図２は遮光マスク４１の構成を模式的に示す図である。図２に示すように、遮光マスク４１は、中心部分に遮光領域４１ａが設けられ、その周囲に透過領域４１ｂが設けられている。この遮光マスク４１では、開口数ＮＡが低い対物レンズ３１を介して検出部４に入射する励起光５は、中心部分に設けられた遮光領域４１ａで遮光されるようになっている。一方、試料２から広い角度で出射される蛍光６や散乱光７は、遮光マスク４１の透過領域４１ｂを通過し、各検出器に入射する。 FIG. 2 is a diagram schematically showing the configuration of the light shielding mask 41. As shown in FIG. 2, the light-shielding mask 41 is provided with a light-shielding region 41a at the center and a transmissive region 41b around it. In the light shielding mask 41, the excitation light 5 incident on the detection unit 4 through the objective lens 31 having a low numerical aperture NA is shielded by a light shielding region 41a provided in the central portion. On the other hand, the fluorescence 6 and scattered light 7 emitted from the sample 2 at a wide angle pass through the transmission region 41b of the light shielding mask 41 and enter each detector.

ここで、遮光マスク４１の遮光領域４１ａは、より大きい方が励起光５の遮光性に優れるが、その場合、信号強度が小さい蛍光６及び散乱光７の感度が低下してしまうという問題がある。このため、蛍光６及び散乱光７を高感度で検出するためには、遮光マスク４１の遮光領域４１ａは、励起光のＮＡを遮光できる最低限の大きさであることが望ましい。 Here, the larger the light shielding region 41a of the light shielding mask 41 is, the better the light shielding property of the excitation light 5 is. However, in that case, there is a problem that the sensitivity of the fluorescence 6 and the scattered light 7 having a low signal intensity is lowered. . Therefore, in order to detect the fluorescence 6 and the scattered light 7 with high sensitivity, it is desirable that the light shielding region 41a of the light shielding mask 41 has a minimum size capable of shielding the NA of the excitation light.

なお、遮光領域４１ａが励起光のＮＡを大幅に超えると、蛍光６及び散乱光７の検出感度が低下することがある。また、遮光領域４１ａが励起光のＮＡと同等又は励起光のＮＡ未満であると、透過領域４１ｂを通過する光にビーム強度が強い励起光が混入してしまい、蛍光及び励起光の測定に支障をきたすことがある。また、光学部品の内部反射などによる迷光（励起光５）の混入も、測定に支障をきたすので、迷光及び散乱光以外の励起光成分は除去することが望ましい。 If the light shielding region 41a greatly exceeds the NA of the excitation light, the detection sensitivity of the fluorescence 6 and the scattered light 7 may decrease. Further, if the light shielding area 41a is equal to or less than the NA of the excitation light, the excitation light having a high beam intensity is mixed into the light passing through the transmission area 41b, which hinders measurement of fluorescence and excitation light. May come. In addition, mixing of stray light (excitation light 5) due to internal reflection or the like of the optical component also hinders measurement, so it is desirable to remove excitation light components other than stray light and scattered light.

（ダイクロックミラー４２）
ダイクロックミラー４２は、特定波長の光のみを反射し、それ以外の波長成分を透過するものであり、本実施形態の光学的測定装置１では、散乱光７（励起光５を含む）を反射し、蛍光６を透過するものを使用する。そして、このダイクロックミラー４２によって、蛍光６と散乱光７（遮光マスク４１で除去できなかった励起光５を含む）とが分離される。 (Diclock mirror 42)
The dichroic mirror 42 reflects only light of a specific wavelength and transmits other wavelength components. In the optical measurement device 1 of the present embodiment, the dichroic mirror 42 reflects scattered light 7 (including excitation light 5). And those that transmit fluorescence 6 are used. The dichroic mirror 42 separates the fluorescence 6 and the scattered light 7 (including the excitation light 5 that could not be removed by the light shielding mask 41).

（蛍光検出器）
蛍光検出器は、試料２から発せられる蛍光６を検出可能なものであればよく、特に限定されるものではないが、例えばＰＤ（Photo diode）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube）などを使用することができる。 (Fluorescence detector)
The fluorescence detector is not particularly limited as long as the fluorescence 6 emitted from the sample 2 can be detected. For example, PD (Photo diode), CCD (Charge Coupled Device) or PMT (Photo-Multiplier) Tube) and the like can be used.

（偏光ビームスプリッター４３）
偏光ビームスプリッター４３は、入射する非偏光を、振動方向が直交する２つの偏光に分離するものであり、本実施形態の光学的測定装置１では、散乱光７を、Ｓ偏光７ｓとＰ偏光７ｐとに分離する。具体的には、偏光ビームスプリッター４３により、入射した散乱光７のうちＰ偏光７ｐを透過し、Ｓ偏光７ｓを反射する。これにより、Ｐ偏光７ｐのみが散乱光強度検出器４６に入射し、Ｓ偏光７ｓのみが試料位置検出器４９に入射することとなる。 (Polarized beam splitter 43)
The polarization beam splitter 43 separates incident non-polarized light into two polarized light whose vibration directions are orthogonal to each other. In the optical measuring device 1 of this embodiment, the scattered light 7 is converted into S-polarized light 7s and P-polarized light 7p. And to separate. Specifically, the polarization beam splitter 43 transmits the P-polarized light 7p of the incident scattered light 7 and reflects the S-polarized light 7s. As a result, only the P-polarized light 7p enters the scattered light intensity detector 46, and only the S-polarized light 7s enters the sample position detector 49.

なお、本実施形態の光学的測定装置１で使用される偏光ビームスプリッター４３は、例えば励起光５と同じの波長の光を分光可能なものあればよく、これにより、分光による損失を抑制することができる。 Note that the polarization beam splitter 43 used in the optical measurement apparatus 1 of the present embodiment only needs to be able to split light having the same wavelength as the excitation light 5, for example, thereby suppressing loss due to spectroscopy. Can do.

（集光レンズ４４，４７）
集光レンズ４４，４７は、Ｐ偏光７ｐ及びＳ偏光７ｓを、それぞれ散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９に向けて集光するものであり、例えば凸レンズ、フレネルレンズ、球面ミラーなどを使用することができる。 (Condenser lenses 44, 47)
The condensing lenses 44 and 47 condense the P-polarized light 7p and the S-polarized light 7s toward the scattered light intensity detector 46 and the sample position detector 49, respectively. For example, a convex lens, a Fresnel lens, a spherical mirror, and the like are used. Can be used.

（ピンホール４５，４８）
ピンホール４５，４８は、それぞれ散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９に入射するＰ偏光７ｐ又はＳ偏光７ｓから、外乱成分を除去するものであり、例えば遮光プレート、ホログラム、光ファイバーなどを使用することができる。 (Pinhole 45, 48)
The pinholes 45 and 48 are for removing disturbance components from the P-polarized light 7p or S-polarized light 7s incident on the scattered light intensity detector 46 and the sample position detector 49, respectively. Can be used.

（散乱光強度検出器４６）
散乱光強度検出器４６は、試料２から発せられた前方散乱光の強度を検出するものであり、偏光ビームスプリッター４３により分光されたＰ偏光７ｐを検出可能なものであればよい。このように、前方散乱光（Ｐ偏光７ｐ）の強度を検出することにより、例えば試料２の大きさに関する情報を得ることができる。 (Scattered light intensity detector 46)
The scattered light intensity detector 46 detects the intensity of the forward scattered light emitted from the sample 2 and may be any one that can detect the P-polarized light 7p dispersed by the polarization beam splitter 43. Thus, for example, information on the size of the sample 2 can be obtained by detecting the intensity of the forward scattered light (P-polarized light 7p).

（試料位置検出器４９）
散乱光位置検出器４９は、試料２から発せられた前方散乱光７の偏光角の変化を検出するものであり、例えば４分割フォトダイオードやＣＣＤなどを使用することができる。試料２において、励起光５に散乱現象が起きると、その前後、即ち、励起光５と散乱光７とで偏光角に変化が生じる。そして、本発明者は、この散乱現象による偏光角変化を利用することにより、遮光マスク４１で除去できなかった励起光５及び光学部品の内部反射などにより生じる迷光を、偏光ビームスプリッター４３を用いて、散乱光７と完全に分離し、散乱光の発光点位置、即ち、試料２の位置を高精度に検出可能となることを見出した。 (Sample position detector 49)
The scattered light position detector 49 detects a change in the polarization angle of the forward scattered light 7 emitted from the sample 2. For example, a quadrant photodiode or a CCD can be used. In the sample 2, when a scattering phenomenon occurs in the excitation light 5, the polarization angle changes before and after that, that is, between the excitation light 5 and the scattered light 7. Then, the inventor uses the polarization beam splitter 43 to detect the stray light generated by the internal reflection of the excitation light 5 and the optical component that could not be removed by the light shielding mask 41 by using the polarization angle change due to the scattering phenomenon. It was found that it was completely separated from the scattered light 7 and the emission point position of the scattered light, that is, the position of the sample 2 can be detected with high accuracy.

例えば、光源３０から発せられる励起光５の偏光をＰ偏光のみとし、試料２において生じた散乱光７から偏光角が回転した成分（Ｓ偏光７ｓ）のみを分離して、散乱光強度検出器４９で検出することにより、測定セル２０内における試料２の位置を知ることができる。これにより、測定された試料２の位置に応じて、励起光５の焦点位置を高精度に調整することができるようになるため、高感度で安定した測定を実現することができる。 For example, the polarized light of the excitation light 5 emitted from the light source 30 is only P-polarized light, and only the component whose polarization angle is rotated (S-polarized light 7 s) is separated from the scattered light 7 generated in the sample 2, and the scattered light intensity detector 49. By detecting at, the position of the sample 2 in the measurement cell 20 can be known. Thereby, since the focus position of the excitation light 5 can be adjusted with high accuracy according to the measured position of the sample 2, it is possible to realize highly sensitive and stable measurement.

［光学的測定装置１の動作］
次に、本実施形態の光学的測定装置１の動作について説明する。本実施形態の光学的測定装置１を使用して試料２を光学的に測定する際は、先ず、光照射部３の光源３０から励起光５を出射し、測定用セル２０内の試料２に照射する。そして、試料２から発せられた蛍光６及び散乱光７を、検出部４の対物レンズ４０で捕捉する。 [Operation of Optical Measuring Apparatus 1]
Next, the operation of the optical measuring device 1 of the present embodiment will be described. When optically measuring the sample 2 using the optical measuring device 1 of the present embodiment, first, the excitation light 5 is emitted from the light source 30 of the light irradiation unit 3 and applied to the sample 2 in the measurement cell 20. Irradiate. Then, the fluorescence 6 and scattered light 7 emitted from the sample 2 are captured by the objective lens 40 of the detection unit 4.

その際、検出部４には、蛍光６及び散乱光７と共に、試料２に照射されずに測定セル２０を透過した励起光５も入射するが、この励起光５は、対物レンズ４０を通過した後、遮光マスク４１によって大部分が除去される。その後、ダイクロックミラー４２により、蛍光６と散乱光７（遮光マスク４１で除去できなかった励起光５を含む）とが分離され、蛍光６については、蛍光検出器（図示せず）によって検出される。 At that time, the excitation light 5 that has passed through the measurement cell 20 without being irradiated on the sample 2 is also incident on the detection unit 4 together with the fluorescence 6 and the scattered light 7. The excitation light 5 has passed through the objective lens 40. Thereafter, most of the light is removed by the light shielding mask 41. Thereafter, the dichroic mirror 42 separates the fluorescence 6 and the scattered light 7 (including the excitation light 5 that could not be removed by the light shielding mask 41), and the fluorescence 6 is detected by a fluorescence detector (not shown). The

一方、散乱光７は、偏光ビームスプリッター４３によって、Ｓ偏光７ｓとＰ偏光７ｐとに分光される。そして、Ｐ偏光７ｐは、従来同様、散乱光強度検出器４６によりその強度を測定し、例えば試料２の大きさに関する情報を得る。また、Ｓ偏光７ｓは、集光レンズ４７により散乱光位置検出器４９の検出部に結像させて、その位置（結像位置）から試料２の位置を検出し、その結果に応じて、測定用セル２０の位置や励起光５の焦点位置を調整する。 On the other hand, the scattered light 7 is split by the polarization beam splitter 43 into S-polarized light 7s and P-polarized light 7p. The intensity of the P-polarized light 7p is measured by the scattered light intensity detector 46 as in the prior art, and information on the size of the sample 2 is obtained, for example. The S-polarized light 7s is imaged on the detection unit of the scattered light position detector 49 by the condensing lens 47, and the position of the sample 2 is detected from the position (imaging position), and measured according to the result. The position of the working cell 20 and the focal position of the excitation light 5 are adjusted.

なお、本実施形態の光学的測定装置１では、別途、散乱光位置検出器４９での検出結果に基づいて、測定用セル２０の位置や励起光の焦点位置を調整する調整部（図示せず）を設け、これらの調整を自動で行うようにしてもよい。 In the optical measurement apparatus 1 of the present embodiment, an adjustment unit (not shown) that adjusts the position of the measurement cell 20 and the focus position of excitation light based on the detection result of the scattered light position detector 49 separately. These adjustments may be performed automatically.

このように、本実施形態の光学的測定装置１では、遮光マスク４１で除去しきれなかった励起光５を含む散乱光７から、散乱光７のみが偏光角変化を生じることを利用し、散乱光７の発光点、即ち試料２の位置情報のみを検出している。このため、測定用セル２０の位置や励起光５の焦点位置を、高精度で調整することができる。これにより、試料２を、定量的かつ安定的に分析することができる。また、光利用効率が最も高い位置で検出を行うことが可能となるため、従来に比べて、高感度かつ高精度で測定することができる。 As described above, the optical measurement apparatus 1 according to the present embodiment uses the fact that only the scattered light 7 causes the change in the polarization angle from the scattered light 7 including the excitation light 5 that cannot be completely removed by the light shielding mask 41. Only the light emission point of the light 7, that is, the position information of the sample 2 is detected. For this reason, the position of the measurement cell 20 and the focal position of the excitation light 5 can be adjusted with high accuracy. Thereby, the sample 2 can be analyzed quantitatively and stably. In addition, since detection can be performed at a position where the light utilization efficiency is highest, measurement can be performed with higher sensitivity and higher accuracy than in the past.

なお、本実施形態の光学的測定装置１は、微小粒子や細胞などの分析装置に限らず、例えば、製造装置、検査装置及び医療用装置などとしても使用することができる。 In addition, the optical measuring device 1 of this embodiment can be used not only for analysis devices, such as a microparticle and a cell, but also as a manufacturing device, a test device, a medical device, etc., for example.

＜２．第２の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図３は本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す斜視図である。なお、図３においては、前述した第１の実施形態の光学的測定装置の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図３に示すように、本実施形態の光学的測定装置１１は、マイクロ流路が形成された分析チップ２１を使用して測定を行うものであり、マイクロチップ型ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）システムに使用される。 <2. Second Embodiment>
[Overall configuration of optical measuring device]
FIG. 3 is a perspective view schematically showing a configuration of an optical measuring apparatus according to the second embodiment of the present invention. In FIG. 3, the same components as those of the optical measuring device according to the first embodiment described above are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted. As shown in FIG. 3, the optical measurement apparatus 11 of the present embodiment performs measurement using an analysis chip 21 in which a microchannel is formed, and is a microchip type FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) system. Used for.

本実施形態の光学的測定装置１１は、分析チップ２１に設けられた流路を通流する試料２ａ，２ｂに励起光を照射する光照射部と、励起光５が照射された試料２ａ，２ｂから発せられた蛍光６及び散乱光７などを検出する検出部を備えている。この光学的測定装置１１における光照射部には、励起光５を発する光源３０と、励起光５を試料２に向けて集光する対物レンズ３１との間に、半導体レーザ３０のビーム形状を成形するコリメータレンズ３２が設けられている。 The optical measurement apparatus 11 of this embodiment includes a light irradiation unit that irradiates excitation light to the samples 2 a and 2 b that flow through the flow path provided in the analysis chip 21, and the samples 2 a and 2 b that are irradiated with the excitation light 5. The detection part which detects the fluorescence 6 emitted from, the scattered light 7, etc. is provided. A beam shape of the semiconductor laser 30 is formed between the light source 30 that emits the excitation light 5 and the objective lens 31 that condenses the excitation light 5 toward the sample 2 in the light irradiation unit of the optical measurement device 11. A collimator lens 32 is provided.

また、検出部には、試料２から発せられた蛍光６を検出するための蛍光検出器５０及び回折格子５１と、散乱光７を検出するための散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９とが設けられている。そして、試料２から発せられた光は、ダイクロックミラー４２により蛍光６と散乱光７に分離され、蛍光６は回折格子５１で分光された後、蛍光検出器５０で検出されるようになっている。一方、散乱光７は、偏光ビームスプリッター４３によりＰ偏光７ｐとＳ偏光７ｓとに分光され、それぞれ散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９で検出される構成となっている。 The detection unit includes a fluorescence detector 50 and a diffraction grating 51 for detecting the fluorescence 6 emitted from the sample 2, a scattered light intensity detector 46 and a sample position detector 49 for detecting the scattered light 7. And are provided. The light emitted from the sample 2 is separated into fluorescence 6 and scattered light 7 by the dichroic mirror 42, and the fluorescence 6 is separated by the diffraction grating 51 and then detected by the fluorescence detector 50. Yes. On the other hand, the scattered light 7 is split into P-polarized light 7p and S-polarized light 7s by the polarization beam splitter 43, and is detected by the scattered light intensity detector 46 and the sample position detector 49, respectively.

［分析チップ２１］
本実施形態の光学的測定装置１１で使用する分析チップ２１には、試料２ａ，２ｂを通流させるマイクロ流路２２が設けられている。このマイクロ流路２２は、試料２ａ，２ｂを含むサンプル液の周囲をシース液で囲んで層流を形成し、励起光５が照射される測定領域において、試料２ａ，２ｂが一列に並んで通流するような構成となっている。また、マイクロ流路２２には、測定領域よりも下流側に、採取対象の試料２ａが集められる回収液貯留部２３、又は採取対象外の試料２ｂが集められる排液貯留部２４に連通する複数の分岐流路が設けられている。 [Analysis chip 21]
The analysis chip 21 used in the optical measurement apparatus 11 of the present embodiment is provided with a micro flow path 22 through which the samples 2a and 2b flow. The microchannel 22 surrounds the sample liquid including the samples 2a and 2b with a sheath liquid to form a laminar flow, and the samples 2a and 2b are arranged in a line in the measurement region irradiated with the excitation light 5. It is configured to flow. Further, a plurality of microchannels 22 communicated with a collection liquid storage unit 23 for collecting a sample 2a to be collected or a drainage storage unit 24 for collecting a sample 2b that is not to be collected downstream of the measurement region. The branch flow path is provided.

更に、分析チップ２１には、マイクロ流路２２の測定領域よりも下流側で、分岐流路の手前に、試料２ａ，２ｂを各分岐流路に流入させるための分取機構２５が設けられている。この分取機構２５の構成は特に限定するものではないが、例えば圧電素子や電磁バルブを使用したもの、アクチュエータなどの可動デバイスを使用したものなどが挙げられる。 Further, the analysis chip 21 is provided with a sorting mechanism 25 for allowing the samples 2a and 2b to flow into each branch channel downstream of the measurement region of the micro channel 22 and before the branch channel. Yes. The configuration of the sorting mechanism 25 is not particularly limited, and examples thereof include those using a piezoelectric element and an electromagnetic valve, and those using a movable device such as an actuator.

図４（ａ）はマイクロ流路２２におけるサンプル液の通流位置を示す図であり、図４（ｂ）はマイクロ流路２２内を通流する液の速度分布を示す図である。なお、図４（ｂ）は図４（ａ）に示すＡ−Ａ線による断面図に相当する。図３に示す分析チップ２１のように、測定領域と分取領域（分取機構２５）とが離れた位置に設けられている場合、分取領域において試料２ａ，２ｂの位置を特定するためには、これらがマイクロ流路２２内を一定速度で通流していることが望ましい。 FIG. 4A is a view showing the flow position of the sample liquid in the micro flow path 22, and FIG. 4B is a view showing the velocity distribution of the liquid flowing in the micro flow path 22. 4B corresponds to a cross-sectional view taken along line AA shown in FIG. When the measurement area and the sorting area (sorting mechanism 25) are provided at positions separated from each other as in the analysis chip 21 shown in FIG. 3, in order to specify the positions of the samples 2a and 2b in the sorting area. It is desirable that they pass through the microchannel 22 at a constant speed.

一方、図４（ｂ）に示すように、マイクロ流路２２内を通流する液は、ハーゲン・ポアズイユの原理により、壁面で遅く中心部で速い速度分布をもつ。そこで、本実施形態の光学的測定装置１１においては、図４（ｂ）に示すように、マイクロ流路２２内に所望の速度でシース液を流し、その中心部にのみサンプル液を流している。これにより、壁面からのダメージを受けずに、試料２ａ，２ｂを一定速度で通流させることができる。 On the other hand, as shown in FIG. 4 (b), the liquid flowing through the microchannel 22 has a velocity distribution that is slow on the wall surface and fast on the center portion according to the Hagen-Poiseuille principle. Therefore, in the optical measuring device 11 of the present embodiment, as shown in FIG. 4B, the sheath liquid is caused to flow through the microchannel 22 at a desired speed, and the sample liquid is allowed to flow only at the center thereof. . This allows the samples 2a and 2b to flow at a constant speed without receiving damage from the wall surface.

ただし、サンプル液の通流速度を常に一定に保つことは困難であり、その変動により試料２ａ，２ｂの通流位置が変化することがある。このため、本実施形態の光学的測定装置１１では、散乱光の偏光角変化を利用して試料２ａ，２ｂの通流位置を検出し、その結果に基づいて分析チップ１の位置を調整する。 However, it is difficult to always keep the flow rate of the sample liquid constant, and the flow position of the samples 2a and 2b may change due to the fluctuation. For this reason, in the optical measuring device 11 of the present embodiment, the flow position of the samples 2a and 2b is detected using the change in the polarization angle of the scattered light, and the position of the analysis chip 1 is adjusted based on the result.

［光学的測定装置１１の動作］
次に、本実施形態の光学的測定装置１１により、分析チップ２１を使用して、複数の試料２ａ，２ｂを個別に測定し、分取する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１１では、先ず、光照射部の光源３０から励起光５を出射し、分析チップ２１のマイクロ流路２２を通流する試料２ａ，２ｂに照射する。このとき、試料２ａ，２ｂは、マイクロ流路２２内を一列に並んで通流しているため、励起光５を個別に照射することができる。 [Operation of Optical Measuring Device 11]
Next, a method for individually measuring and sorting a plurality of samples 2a and 2b using the analysis chip 21 by the optical measuring device 11 of the present embodiment will be described. In the optical measuring device 11 of the present embodiment, first, the excitation light 5 is emitted from the light source 30 of the light irradiation unit, and is irradiated to the samples 2 a and 2 b flowing through the microchannel 22 of the analysis chip 21. At this time, since the samples 2a and 2b flow in the microchannel 22 in a line, the excitation light 5 can be individually irradiated.

各試料２ａ，２ｂから発せられた蛍光６及び散乱光７は、検出部の対物レンズ４０で捕捉された後、ダイクロックミラー４２によって蛍光６と散乱光７とに分離される。そして、蛍光６は、回折格子５１で分光された後、蛍光検出器５０で検出される。その結果、採取対象の試料２ａであると判定された場合には、蛍光スペクトル、試料２ａの大きさ及び通流速度などに基づいて最適なタイミングを算出され、分取機構２５に駆動信号が送信される。これにより、分取機構２５が動作し、試料２ａを回収液貯留部２３に流入させる。また、採取対象外の試料２ｂであると判定された場合は、分取機構２５は動作させずに、試料２ｂを排液貯留部２４に流入させる。 The fluorescence 6 and scattered light 7 emitted from each sample 2a, 2b are captured by the objective lens 40 of the detection unit, and then separated into the fluorescence 6 and the scattered light 7 by the dichroic mirror 42. Then, the fluorescence 6 is separated by the diffraction grating 51 and then detected by the fluorescence detector 50. As a result, when it is determined that the sample 2a is to be collected, an optimal timing is calculated based on the fluorescence spectrum, the size of the sample 2a, the flow velocity, and the like, and a drive signal is transmitted to the sorting mechanism 25. Is done. As a result, the sorting mechanism 25 operates, and the sample 2 a is caused to flow into the collected liquid storage unit 23. If it is determined that the sample 2b is not to be collected, the sorting mechanism 25 is not operated, and the sample 2b is caused to flow into the drainage reservoir 24.

一方、散乱光７は、偏光ビームスプリッター４３によって、Ｓ偏光７ｓとＰ偏光７ｐとに分光される。そして、Ｐ偏光７ｐは、散乱光強度検出器４６によりその強度を測定し、例えば試料２ａ，２ｂの大きさに関する情報を得る。また、Ｓ偏光７ｓは、集光レンズ４７により散乱光位置検出器４９の検出部に結像させて、その位置（結像位置）から試料２の位置を検出し、その結果に応じて、分析チップ２１の位置や励起光５の焦点位置を調整する。 On the other hand, the scattered light 7 is split by the polarization beam splitter 43 into S-polarized light 7s and P-polarized light 7p. The intensity of the P-polarized light 7p is measured by the scattered light intensity detector 46, and information on the sizes of the samples 2a and 2b, for example, is obtained. The S-polarized light 7s is imaged on the detection unit of the scattered light position detector 49 by the condensing lens 47, and the position of the sample 2 is detected from the position (imaging position), and analyzed according to the result. The position of the chip 21 and the focal position of the excitation light 5 are adjusted.

このように、本実施形態の光学的測定装置１１は、散乱光７の偏光角変化を検出しているため、試料２ａ，２ｂの通流位置を高精度で検出することができる。そして、その結果に基づいて、励起光５照射のための光学系及び蛍光６・散乱光７を検出するための光学系に対して、分析チップ２１の位置やサンプル液の通流位置を調整することにより、チップの形状精度に依存しない測定をすることができる。これにより、チップの製造コストを低減することもできる。 Thus, since the optical measuring device 11 of the present embodiment detects the change in the polarization angle of the scattered light 7, it can detect the flow positions of the samples 2a and 2b with high accuracy. Based on the result, the position of the analysis chip 21 and the flow position of the sample liquid are adjusted with respect to the optical system for irradiating the excitation light 5 and the optical system for detecting the fluorescence 6 and scattered light 7. Thus, measurement independent of the shape accuracy of the chip can be performed. Thereby, the manufacturing cost of a chip can also be reduced.

また、散乱光の偏光角変化の検出信号を基に、サンプル液の通流位置を安定させることにより、流速の変化に対応することが可能となるため、装置の分析速度範囲（流速指定範囲）を拡大することができる。更に、励起光５のパワー密度が最大となる位置又は検出用の対物レンズ４０の焦点位置に、サンプル液を通流させることにより、試料２ａ，２ｂから放出される光（蛍光６，散乱光７）の受光強度を最大にすることできるため、高感度での測定が可能となる。 In addition, by stabilizing the flow position of the sample liquid based on the detection signal of the change in the polarization angle of the scattered light, it becomes possible to respond to changes in the flow velocity, so the analysis speed range of the device (flow velocity designation range) Can be enlarged. Furthermore, light (fluorescence 6, scattered light 7) emitted from the samples 2a and 2b is caused by passing the sample liquid through the position where the power density of the excitation light 5 is maximized or the focal position of the detection objective lens 40. ) Can be maximized, and measurement with high sensitivity becomes possible.

なお、本実施形態の光学的測定装置１１における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。 The configuration, operation, and effects other than those described above in the optical measurement device 11 of the present embodiment are the same as those of the first embodiment described above.

＜３．第３の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図５は本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図５においては、前述した第１及び第２の実施形態の光学的測定装置の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図５に示すように、本実施形態の光学的測定装置１２は、散乱光の偏光角変化を検出するための光学系の集光レンズ４７とピンホール４８との間に、シリンドリカルレンズ５０が配置されている以外は、前述した第１の実施形態と同様である。 <3. Third Embodiment>
[Overall configuration of optical measuring device]
FIG. 5 is a diagram schematically showing a configuration of an optical measuring apparatus according to the third embodiment of the present invention. In FIG. 5, the same components as those of the optical measurement devices of the first and second embodiments described above are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted. As shown in FIG. 5, in the optical measuring device 12 of this embodiment, a cylindrical lens 50 is disposed between a condensing lens 47 and a pinhole 48 of an optical system for detecting a change in the polarization angle of scattered light. Except for this, it is the same as the first embodiment described above.

［シリンドリカルレンズ５０］
シリンドリカルレンズ５０は、Ｓ偏光７ｓの結像パターンに楕円の収差を発生させるものであり、例えば、長軸が散乱光位置検出器４９の対角線と平行になるように、４５°の角度で配置される。これにより、非点収差法を用いて、試料２の励起光５における光軸方向の位置を検出することが可能となる。ここで、シリンドリカルレンズ５０としては、例えば凸レンズ、フレネルレンズ、球面ミラーなどを使用することができる。 [Cylindrical lens 50]
The cylindrical lens 50 generates an elliptical aberration in the image pattern of the S-polarized light 7s, and is arranged at an angle of 45 ° so that the long axis is parallel to the diagonal line of the scattered light position detector 49, for example. The This makes it possible to detect the position in the optical axis direction of the excitation light 5 of the sample 2 using the astigmatism method. Here, as the cylindrical lens 50, for example, a convex lens, a Fresnel lens, a spherical mirror, or the like can be used.

［光学的測定装置１２の動作］
次に、光学的測定装置１２の動作として、非点収差法を用いて試料２の位置を検出方法について説明する。図６（ａ）及び（ｂ）はシリンドリカルレンズ５０を用いた検出例を示す図である。例えば、図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、試料位置検出器４９に４分割の検出器を使用し、分析チップ２１における試料２の通流方向をＡからＢ方向（紙面右方向）とした場合、それと直交する方向（紙面上下方向）をトラッキング方向とする。 [Operation of Optical Measuring Device 12]
Next, a method for detecting the position of the sample 2 using the astigmatism method will be described as an operation of the optical measuring device 12. 6A and 6B are diagrams showing a detection example using the cylindrical lens 50. FIG. For example, as shown in FIGS. 6A and 6B, a four-division detector is used for the sample position detector 49, and the flow direction of the sample 2 in the analysis chip 21 is changed from the A direction to the B direction (the right direction on the page). ), The direction perpendicular to the direction (the vertical direction on the paper surface) is the tracking direction.

これにより得られる楕円状の結像パターンは、試料２から発せられた散乱光７のＳ偏光７ｓを結像させた像であり、図５に示す検出側の対物レンズ４０の焦点位置から励起光５の光軸方向にずれた位置に試料２が存在する場合、このような楕円状となる。一方、対物レンズ４０の焦点位置に試料２が存在する場合は、真円状の像となる。 The elliptical imaging pattern thus obtained is an image obtained by imaging the S-polarized light 7s of the scattered light 7 emitted from the sample 2, and excitation light from the focal position of the detection-side objective lens 40 shown in FIG. When the sample 2 exists at a position shifted in the direction of the optical axis 5, such an ellipse is formed. On the other hand, when the sample 2 exists at the focal position of the objective lens 40, a perfect circular image is formed.

このような非点収差光学系を用いた検出方法を、試料２の発光点検出に用いることにより、光軸方向とそれと直交する方向の検出を、独立した現象として検出することが可能となる。これは、光学的に独立した現象を利用しているものであり、光軸検出には非点収差による結像パターン変化、及びこれと直交する方向には入射軸倒れによる結像パターンの移動を利用しているためである。これにより、３次元方向に独立して検出を行うことが可能となるため、高精度で簡便な位置制御方法を実現することができる。 By using such a detection method using an astigmatism optical system for detection of the light emission point of the sample 2, it is possible to detect the detection in the direction perpendicular to the optical axis direction as an independent phenomenon. This utilizes an optically independent phenomenon, and changes in the image pattern due to astigmatism for optical axis detection, and movement of the image pattern due to tilting of the incident axis in the direction perpendicular to this. This is because it is used. Thereby, since it becomes possible to perform detection independently in the three-dimensional direction, a highly accurate and simple position control method can be realized.

この散乱光（Ｓ偏光７ｓ）の結像パターンは、通流方向（Ａ→Ｂ）に移動するが、それと直交する方向には変化しない。そこで、Ａ→Ｄの中間点を基準にすると、（Ａ＋Ｂ）−（Ｃ＋Ｄ）の演算を行うことにより、変位量ＴＥを、試料２の位置に対するエラー信号（Tracking Error）として検出することができる。一方、光軸方向の位置検出には非点収差法が適用できるが、測定対象である試料２が通流している場合は、前述した方法によりトラッキング制御を行い、変位量ＴＥが０で、かつ結像パターンが検出器４９の４分割の中心に位置した時の状態のみを用いて判断を行う必要がある。 The image formation pattern of the scattered light (S-polarized light 7s) moves in the flow direction (A → B), but does not change in the direction orthogonal thereto. Therefore, when the intermediate point A → D is used as a reference, the displacement TE can be detected as an error signal (Tracking Error) with respect to the position of the sample 2 by performing the calculation of (A + B) − (C + D). On the other hand, the astigmatism method can be applied to the position detection in the optical axis direction. However, when the sample 2 to be measured is flowing, tracking control is performed by the above-described method, and the displacement TE is zero. It is necessary to make a determination using only the state when the imaging pattern is positioned at the center of the four divisions of the detector 49.

また、光軸方向については、（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）の演算を行うことにより、変位量ＦＥをエラー信号（Focus Error）として検出することができる。ただし、その際、検出器４９の分割中心に試料２の結像パターンが位置していることを判定するため、（Ａ＋Ｄ）−（Ｂ＋Ｃ）＝０となった間、又は和信号（ＳＵＭ＝Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）が最大となった時に検出する必要がある。なお、和信号が分割中心部で最大となるのは、図６（ａ）及び（ｂ）に示す励起光強度分布が、検出器４９の中心部に集中している場合とする。 For the optical axis direction, the displacement amount FE can be detected as an error signal (Focus Error) by calculating (A + C)-(B + D). However, at this time, in order to determine that the imaging pattern of the sample 2 is located at the division center of the detector 49, the sum signal (SUM = A + B + C + D) is obtained while (A + D) − (B + C) = 0. ) Must be detected when it reaches the maximum. The sum signal is maximized at the division center when the excitation light intensity distribution shown in FIGS. 6A and 6B is concentrated at the center of the detector 49.

なお、図６における励起光強度分布が示すように、励起ビームが偏平形状になっており、通流方向において散乱光及び蛍光信号が出力される範囲が小さい場合には、常に分割ディテクタの中心部のみでしか検知しないため、特定時間検出する必要はない。また、サーボ信号の演算方法は、リアルタイムでの演算を行ってもよいし、各チャンネルの値を積分した後（ＡＲＥＡ）、前述した除算を行うことも可能である。更に、各チャンネルの最大値（ＨＩＧＨＴ）を用いて演算を行うこともできる。 As shown in the excitation light intensity distribution in FIG. 6, when the excitation beam has a flat shape and the range in which the scattered light and the fluorescence signal are output in the flow direction is small, the central portion of the split detector is always provided. It is not necessary to detect for a specific time because it is detected only by the detection. As a servo signal calculation method, the calculation may be performed in real time, or after the values of the respective channels are integrated (AREA), the above-described division may be performed. Furthermore, the calculation can be performed using the maximum value (HIGH) of each channel.

一方、本実施形態においては、マイクロ流路における通流方向がＡ→Ｂとなっており、試料２が検出ビームに対して流れ込んでくるため、分析チップ２１の通流方向の位置合わせを行う必要はない。しかしながら、試料２から生じる蛍光及び散乱光を効率よく検知するためには、検出側の対物レンズ４０と励起光５の光軸を一致させる必要がある。図６に示すような４分割の場合、（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）の演算を用いることで、通流方向における励起光５の位置を最適な位置に調整することができる。 On the other hand, in this embodiment, the flow direction in the microchannel is A → B, and the sample 2 flows into the detection beam. Therefore, it is necessary to align the flow direction of the analysis chip 21. There is no. However, in order to efficiently detect the fluorescence and scattered light generated from the sample 2, it is necessary to match the optical axes of the detection-side objective lens 40 and the excitation light 5. In the case of four divisions as shown in FIG. 6, the position of the excitation light 5 in the flow direction can be adjusted to the optimum position by using the calculation of (A + C) − (B + D).

また、一般に、偏光ビームスプリッターは、その偏光分離特性として、僅かながらＰ偏光成分に漏れが生じる。遮光マスク４１を取り除いた場合、全ての励起光５が偏光ビームスプリッターに入射されることになるため、励起光５がＰ偏光のみで構成されていても、分割ディテクタ（試料位置検出器４９）により励起光５の位置検出を行うことが可能である。即ち、本実施形態の光学的測定装置１２は、遮光マスク４１を取り除くことで、励起光５の位置を検出することが可能である。そして、前述した方法と同様の方式を適用することにより、励起光５の集光位置（励起側対物レンズ３１の焦点）を、検出側の対物レンズの焦点位置と３次元的に一致させることもできる。 In general, the polarization beam splitter has a slight leakage of the P-polarized component as its polarization separation characteristic. When the light shielding mask 41 is removed, all the excitation light 5 is incident on the polarization beam splitter. Therefore, even if the excitation light 5 is composed only of P-polarized light, the split detector (sample position detector 49) is used. The position of the excitation light 5 can be detected. That is, the optical measuring device 12 of the present embodiment can detect the position of the excitation light 5 by removing the light shielding mask 41. Then, by applying a method similar to the method described above, the condensing position of the excitation light 5 (the focal point of the excitation-side objective lens 31) can be three-dimensionally matched with the focal position of the detection-side objective lens. it can.

このように、本実施形態の光学的測定装置１２は、測定対象である試料２の位置及び励起光５の集光位置を３次元的に検出することが可能であり、その検出された信号により、試料２の通流位置（チップ位置）を光学系の焦点位置に高精度に調整することができる。これにより、高感度で安定した測定を実現できる。 As described above, the optical measurement device 12 according to the present embodiment can detect the position of the sample 2 to be measured and the condensing position of the excitation light 5 in a three-dimensional manner. The flow position (chip position) of the sample 2 can be adjusted with high accuracy to the focal position of the optical system. Thereby, highly sensitive and stable measurement can be realized.

また、本実施形態の光学的測定装置１２では、分割ディテクタと非点収差光学系により散乱光の検出を行っているため、極性をもったサーボ信号を取得することができる。これにより、リアルタタイムでサーボをかけることが可能となる。そして、粒子径や散乱光の信号強度によらず、散乱光の結像パターンによりサーボ信号の検出が可能であり、かつ極性判断を行うことが可能であるため、リアルタイムで位置調整を行うことができる。 Further, in the optical measuring device 12 of the present embodiment, since the scattered light is detected by the split detector and the astigmatism optical system, it is possible to acquire a servo signal having polarity. This makes it possible to apply servo in real time. The servo signal can be detected by the scattered light imaging pattern and the polarity can be determined regardless of the particle diameter or the signal intensity of the scattered light, so that the position can be adjusted in real time. it can.

なお、本実施形態の光学的測定装置１２における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１及び第２の実施形態と同様である。 The configuration, operation, and effects other than those described above in the optical measuring device 12 of the present embodiment are the same as those of the first and second embodiments described above.

１、１１、１２光学的測定装置
２試料
２ａ採取対象試料
２ｂ採取対象外試料
３光照射部
４検出部
５励起光
６蛍光
７散乱光
７ｐＰ偏光
７ｓＳ偏光
２０測定用セル
２１分析チップ
２２マイクロ流路
２３回収液貯留部
２４排液貯留部
２５分取機構
３０光源
３１、４０対物レンズ
３２コリメータレンズ
４１遮光マスク
４２ダイクロックミラー
４３偏光ビームスプリッター
４４、４７集光レンズ
４５、４８ピンホール
４６、４９検出器
５０シリンドリカルレンズ
５１蛍光検出器
５２回折格子 1, 11, 12 Optical measurement apparatus 2 Sample 2a Sample to be collected 2b Sample not to be collected 3 Light irradiation unit 4 Detection unit 5 Excitation light 6 Fluorescence 7 Scattered light 7p P-polarized light 7s S-polarized light 20 Measurement cell 21 Analysis chip 22 Micro Flow path 23 Collected liquid storage unit 24 Drainage storage unit 25 Sorting mechanism 30 Light source 31, 40 Objective lens 32 Collimator lens 41 Shading mask 42 Dichroic mirror 43 Polarizing beam splitter 44, 47 Condensing lens 45, 48 Pinhole 46, 49 Detector 50 Cylindrical lens 51 Fluorescence detector 52 Diffraction grating

Claims

試料に光を照射する光照射部と、
光が照射された試料から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部と、を有し、
前記散乱光検出部は、少なくとも、
試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光ビームスプリッターと、
前記Ｐ偏光成分を受光して散乱光の強度を検出する第１検出器と、
前記Ｓ偏光成分を受光してその受光位置の変化から試料位置を検出する第２検出器と、
を備える光学的測定装置。 A light irradiation unit for irradiating the sample with light;
A scattered light detector that detects scattered light emitted from the sample irradiated with light,
The scattered light detection unit is at least
A polarizing beam splitter that splits scattered light emitted from the sample into an S-polarized component and a P-polarized component;
A first detector that receives the P-polarized component and detects the intensity of the scattered light;
A second detector for receiving the S-polarized component and detecting a sample position from a change in the light receiving position;
An optical measuring device.

マイクロ流路を備えた分析チップを有し、前記光照射部は前記マイクロ流路内を通流する試料に光を照射する請求項１に記載の光学的測定装置。 The optical measurement apparatus according to claim 1, further comprising: an analysis chip including a microchannel, wherein the light irradiation unit irradiates light to a sample flowing through the microchannel.

偏光ビームスプリッターと第２検出器との間に、シリンドリカルレンズが配設されており、非点収差法により光軸方向における試料位置を検出する請求項１又は２に記載の光学的測定装置。 The optical measurement apparatus according to claim 1, wherein a cylindrical lens is disposed between the polarization beam splitter and the second detector, and the sample position in the optical axis direction is detected by an astigmatism method.

試料と偏光ビームスプリッターとの間に、試料に照射されずに透過した光を除去する遮光マスクが配置されている請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光学的測定装置。 The optical measurement apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein a light-shielding mask that removes light transmitted without being irradiated to the sample is disposed between the sample and the polarizing beam splitter.

更に、光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部を有し、
前記試料と蛍光検出部及び散乱光検出部との間には、蛍光と散乱光とを分離するミラーが配設されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の光学的測定装置。 Furthermore, it has a fluorescence detection unit that detects fluorescence emitted from the sample irradiated with light,
The optical measuring device according to any one of claims 1 to 4, wherein a mirror that separates fluorescence and scattered light is disposed between the sample, the fluorescence detection unit, and the scattered light detection unit.

第２検出器での検出結果に基づいて試料位置を調整する試料位置調整部を有する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の光学的測定装置。 The optical measurement apparatus according to claim 1, further comprising a sample position adjusting unit that adjusts a sample position based on a detection result of the second detector.

測定対象の試料に光を照射する工程と、
前記試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する工程と、
Ｐ偏光成分を測定して散乱光の強度を検出する工程と、
Ｓ偏光成分を測定して非点収差法により試料位置を求める工程と、
を有する光学的測定方法。 Irradiating the sample to be measured with light;
Separating the scattered light emitted from the sample into an S-polarized component and a P-polarized component;
Measuring the P-polarized component to detect the intensity of the scattered light;
Measuring the S-polarized component and determining the sample position by the astigmatism method;
An optical measurement method.