JP5380888B2 - Method for quantitative determination of glucose and quantitative composition - Google Patents

Description

本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサにおいて、グルコースに応答して発生するシグナル強度を向上させる方法に関する。   The present invention relates to a method for improving the intensity of a signal generated in response to glucose in a glucose sensor including a flavin adenine dinucleotide (FAD) -dependent glucose dehydrogenase.

血中グルコース濃度の測定は、糖尿病患者が適当な血糖コントロールを行うにあたって必要不可欠である。日常的に血糖値をチェックするために使われるのは簡易型自己血糖測定キットであり、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）もしくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を利用したものが知られている。ＧＯＤは血糖測定用酵素として古くから用いられているが、溶存酸素が測定値に影響を与えることから、近年ではＧＤＨを用いたものが主流となってきている。ＧＤＨを原料としたグルコースセンサは、ＧＤＨの以下の反応を利用して血液中のグルコース濃度を測定するものである。
Ｄ−グルコース ＋ 電子受容体（酸化型） →
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ 電子受容体（還元型）
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているＧＤＨとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型の３種類が知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるＮＡＤ等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、ＰＱＱ依存型ＧＤＨはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型ＧＤＨが浸透しつつある。 Measurement of blood glucose concentration is indispensable for diabetic patients to perform appropriate blood glucose control. A simple self-blood glucose measurement kit that is used to check blood glucose levels on a daily basis is known, which uses glucose oxidase (GOD) or glucose dehydrogenase (GDH). GOD has long been used as an enzyme for measuring blood glucose, but since dissolved oxygen has an effect on the measured value, GDH has become the mainstream in recent years. A glucose sensor using GDH as a raw material measures the glucose concentration in blood using the following reaction of GDH.
D-glucose + electron acceptor (oxidized) →
D-glucono-δ-lactone + electron acceptor (reduced form)
In other words, glucose can be quantified by measuring the flow of electrons generated by oxidizing glucose. There are three types of GDH that have been used for blood glucose measurement so far: nicotinamide-dependent, pyrroloquinolinequinone (PQQ) -dependent, and flavin adenine dinucleotide (FAD) -dependent because of the difference in coenzyme required for the reaction. Are known. As a nicotinamide-dependent type, those derived from the genus Bacillus are commercially available, but since they cannot be purified in the state of a holoenzyme containing a coenzyme, nicotinamide adenine dinucleotide (which becomes a coenzyme in producing a sensor) NAD) etc. must be added. The problem is that this complexity and NAD that is a coenzyme are expensive. On the other hand, PQQ-dependent GDH can be provided by a holoenzyme and has an advantage of high specific activity and a sufficient response signal to glucose. The point that it reacts with saccharides other than glucose is regarded as a problem. Flavin adenine dinucleotide (FAD) -dependent GDH is penetrating as a solution to these problems.

血糖センサの特性としてグルコース以外の糖類に反応しない高い基質特異性を持たせることは、正確な血糖値を得るために重要な事柄であるが、血糖測定の感度もまたセンサの開発にあたって重視される事柄である。グルコースセンサ上のＦＡＤ依存型ＧＤＨの単位量あたりの応答シグナルの強度を増大させることができれば、グルコースセンサにおいて検出可能な濃度範囲の下限値を高めることが可能である。また別の観点からは、応答シグナル強度の増大を実現することにより、グルコース定量におけるＦＡＤ依存型ＧＤＨの必要量を低減してセンサ作製のコストを低減するという優位さを生み出すことにもつながる。さらに別の観点からは、応答シグナルを積算してグルコース濃度の定量を行う場合にあっては、濃度の算出に必要な応答シグナル値を積算に要する時間を低減でき、それによってグルコース定量に要する時間を低減するという優位さを生み出すことにもつながる。
ＷＯ２００４／５８９５８ Giving high substrate specificity that does not react with saccharides other than glucose is an important matter for obtaining accurate blood glucose levels, but the sensitivity of blood glucose measurement is also important in sensor development. It is a matter. If the intensity of the response signal per unit amount of FAD-dependent GDH on the glucose sensor can be increased, the lower limit value of the concentration range detectable in the glucose sensor can be increased. From another point of view, realizing an increase in response signal intensity also leads to the advantage of reducing the cost of sensor production by reducing the required amount of FAD-dependent GDH in glucose quantification. From another point of view, in the case of quantifying the glucose concentration by integrating the response signal, it is possible to reduce the time required for integrating the response signal value necessary for calculating the concentration, and thereby the time required for the glucose quantification. It also leads to the advantage of reducing
WO2004 / 58958

したがって、本発明の目的は、グルコースセンサにおいてＦＡＤ依存型ＧＤＨがグルコースと反応して生じる応答シグナルを増大させることである。   Accordingly, an object of the present invention is to increase the response signal generated by FAD-dependent GDH reacting with glucose in a glucose sensor.

本発明者らは、センサ上のＧＤＨおよび電子受容体を含む組成物中に促進剤を加えることでＧＤＨがグルコースと反応して電子を電子受容体へ供与するまでの過程を促進し、結果として血糖センサにおける血糖値算出までの時間を短縮可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。   The present inventors promoted the process until GDH reacts with glucose and donates electrons to the electron acceptor by adding an accelerator to the composition containing GDH and the electron acceptor on the sensor. It has been found that the time until blood glucose level calculation in the blood glucose sensor can be shortened, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼを用いてグルコースを定量する過程において、少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む組成物中に、Ｎ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を共存させてなる、応答シグナルを増大させる方法。
［項２］
少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む組成物が、グルコースセンサ上の反応層中に存在することを特徴とする項１に記載の応答シグナルを増大させる方法。
［項３］
応答シグナルが電気化学シグナルであることを特徴とする項１または２に記載の方法。
［項４］
Ｎ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含んでなるグルコース定量用組成物。
［項５］
項４に記載する組成物を反応層中に固定してなるグルコースセンサ。 That is, the present invention has the following configuration.
[Claim 1]
In the process of quantifying glucose using glucose dehydrogenase using flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme, N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA) is contained in a composition containing at least glucose dehydrogenase and an electron acceptor. ), Bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole, and a method for increasing the response signal.
[Section 2]
Item 2. The method for increasing the response signal according to Item 1, wherein a composition comprising at least glucose dehydrogenase and an electron acceptor is present in a reaction layer on the glucose sensor.
[Section 3]
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the response signal is an electrochemical signal.
[Claim 4]
One or more substances selected from the group consisting of N- (2-acetamido) imide diacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), sodium carbonate and imidazole, flavin adenine A composition for quantifying glucose, comprising glucose dehydrogenase using dinucleotide (FAD) as a coenzyme and an electron acceptor.
[Section 5]
A glucose sensor formed by fixing the composition according to item 4 in a reaction layer.

本発明により、ＦＡＤ依存型ＧＤＨを用いたグルコースセンサ上においてグルコースを酸化して電子受容体へ電子を供与する過程を促進することができ、結果としてグルコースに応答して得られるシグナル強度を高め、グルコース濃度算出に要するシグナルを短時間に得ることができる。すなわちＦＡＤ依存型ＧＤＨを用いたグルコースセンサにおける血糖値算出までの所要時間を短縮し、使用者の煩労を低減することができる。   According to the present invention, the process of oxidizing glucose and donating electrons to an electron acceptor on a glucose sensor using FAD-dependent GDH can be promoted, and as a result, the signal intensity obtained in response to glucose is increased, A signal required for calculating the glucose concentration can be obtained in a short time. That is, it is possible to shorten the time required until blood glucose level calculation in the glucose sensor using the FAD-dependent GDH, and to reduce the user's trouble.

本発明は、ＦＡＤ依存型ＧＤＨを含むグルコースセンサ上の組成に添加剤を加えて反応を促進させる方法に関する。より具体的には、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼを用いてグルコースを定量する過程において、少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む組成物中に、反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を添加することにより、グルコースに応答して発生する応答シグナル強度を増大させる方法である。   The present invention relates to a method for promoting a reaction by adding an additive to a composition on a glucose sensor containing FAD-dependent GDH. More specifically, in the process of quantifying glucose using glucose dehydrogenase using flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme, N-as a reaction accelerator in a composition containing at least glucose dehydrogenase and an electron acceptor. By adding one or more substances selected from the group consisting of (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), sodium carbonate and imidazole This is a method for increasing the response signal intensity generated in response to glucose.

また本発明は、グルコースに応答して発生する応答シグナル強度を増大させる組成を含むグルコースセンサに関し、より具体的には、少なくともフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ、および電子受容体から構成される組成物中に、さらに反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含んでなるグルコースセンサである。   The present invention also relates to a glucose sensor including a composition that increases the intensity of a response signal generated in response to glucose, and more specifically, glucose dehydrogenase having at least flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme, and electron acceptance N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), sodium carbonate as a reaction accelerator And a glucose sensor comprising one or more substances selected from the group consisting of imidazole.

本発明に述べる応答シグナルとは、ＧＤＨがグルコースを酸化させることにより発生する電子の量に比例して発生する計測可能な発色・退色もしくは電流のことを示し、これらを数値化することでグルコースの定量が可能となる。すなわちシグナル強度の増大とは、これら発色・退色もしくは電流の発生する度合いが増大することを意味する。   The response signal described in the present invention refers to measurable color development / fading or current generated in proportion to the amount of electrons generated by GDH oxidizing glucose. Quantification is possible. That is, increasing the signal intensity means increasing the degree of color development / fading or generation of current.

組成中へのＡＤＡ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質の反応促進剤としての添加量は、ＧＤＨがグルコースを酸化して得られる電子を電子受容体に供与する反応を促進する効果が得られる範囲であれば特に限定しないが、液状での濃度として好ましい下限は１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ以上であり、さらに好ましくは１０ｍＭ以上である。液状での濃度として好ましい上限は２００ｍＭ以下であり、さらに好ましくは１００ｍＭ以下である。本発明の反応促進剤はセンサ作製時に組成中に混合してもよく、また血糖測定時に添加してもよい。あるいは、測定対象となる血液中に添加するかもしくは血液を希釈する場合においては希釈溶液中に含有させてもよい。   The addition amount of one or more substances selected from the group consisting of ADA, Bis-Tris, sodium carbonate and imidazole as a reaction accelerator in the composition donates electrons obtained by oxidation of glucose by GDH to the electron acceptor. The lower limit is preferably 1 mM or more, more preferably 5 mM or more, and even more preferably 10 mM or more. The upper limit preferable as the concentration in the liquid state is 200 mM or less, and more preferably 100 mM or less. The reaction accelerator of the present invention may be mixed in the composition at the time of sensor production, or may be added at the time of blood glucose measurement. Or when adding to the blood used as a measuring object or diluting blood, you may make it contain in a dilution solution.

本発明に用いるＦＡＤ依存型ＧＤＨとしては、ＦＡＤを補酵素とし、かつグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する酵素であれば特に限定しない。このようなＦＡＤ依存型ＧＤＨの例としては、アスペルギルス・テレウス由来、アスペルギルス・オリゼ由来、ペニシリウム・リラシノエキヌラタム由来、およびペニシリウム・イタリカム由来のＧＤＨが例示される。さらに該ＧＤＨは由来する微生物を培養して得られた酵素であってもよく、また該ＧＤＨをコードする遺伝子を宿主細胞に形質転換し、組換え発現させて得られた酵素であってもよい。さらに、該ＧＤＨをコードする遺伝子に遺伝子工学的に変異を導入した上で発現させることによって得られる変異型ＧＤＨであってもよい。   The FAD-dependent GDH used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that catalyzes a reaction in which FAD is a coenzyme and glucose is oxidized to produce D-glucono-δ-lactone. Examples of such FAD-dependent GDH include GDH derived from Aspergillus terreus, derived from Aspergillus oryzae, derived from Penicillium lilacinoechinatum, and derived from Penicillium italicam. Furthermore, the GDH may be an enzyme obtained by culturing the microorganism from which it is derived, or may be an enzyme obtained by transforming a gene encoding the GDH into a host cell and recombinantly expressing it. . Further, it may be a mutant GDH obtained by introducing a mutation into a gene encoding the GDH and then expressing it.

本発明に用いる電子受容体としては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、場合によっては発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。   Examples of the electron acceptor used in the present invention include those that receive electrons from FAD, which is a coenzyme of GDH, and in some cases, can donate electrons to a coloring substance or an electrode, such as ferricyanide salts, phenazine etsulfate, Phenazine methosulfate, phenylenediamine, N, N, N ′, N′-tetramethylphenylenediamine, 1-methoxy-phenazine methosulfate, 2,6-dichlorophenolindophenol, 2,5-dimethyl-1,4-benzoquinone 2,6-dimethyl-1,4-benzoquinone, 2,5-dichloro-1,4-benzoquinone, nitrosoaniline, ferrocene derivative, osmium complex, ruthenium complex and the like, but are not limited thereto.

上記のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ、電子受容体、および反応促進剤としてのＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質から構成される組成物の中には、さらに緩衝剤成分、界面活性剤、タンパク質安定化剤、親水性ポリマー等を含んでいてもよく、あるいはＧＤＨを保持するための担体を含んでもよい。該担体にはＧＤＨを吸着させるための官能基および該官能基と該担体とを繋ぐスペーサーを有していてもよい。   Glucose dehydrogenase using the above flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme, an electron acceptor, and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris as a reaction accelerator ( Among the compositions composed of one or more substances selected from the group consisting of hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), sodium carbonate and imidazole, there are further buffer components, surfactants, protein stabilizers, hydrophilic May contain a functional polymer or the like, or may contain a carrier for holding GDH. The carrier may have a functional group for adsorbing GDH and a spacer connecting the functional group and the carrier.

本発明においてＧＤＨおよび電子受容体を含む組成物に緩衝能を持たせる場合においては、反応促進剤であるＡＤＡ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、イミダゾール自体の有する緩衝能を利用してもよく、また他のバッファー成分を使用してもよい。バッファー成分としてはリン酸塩、ホウ酸塩、酢酸や各種ジカルボン酸等の有機酸塩、アミノ酸、トリス塩酸塩、ＧＯＯＤのバッファー等が挙げられるがこれらに限定されない。反応促進剤を緩衝剤として用いる場合を含めて、緩衝剤の添加量は保存中及び反応の前後でｐＨの変動を抑えることができる範囲であれば限定しないが、好ましくは液状における濃度（ＧＤＨを含む固体のマトリクスであれば溶解後の濃度）の下限が１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ以上であり、さらに好ましくは１０ｍＭ以上である。液状における濃度の好ましい上限は２００ｍＭ以下であり、さらに好ましくは１００ｍＭ以下である。   In the present invention, when a composition containing GDH and an electron acceptor is provided with a buffer capacity, the buffer capacity of the reaction accelerators ADA, Bis-Tris, and imidazole itself may be used. Ingredients may be used. Examples of the buffer component include, but are not limited to, phosphates, borates, organic acid salts such as acetic acid and various dicarboxylic acids, amino acids, tris hydrochloride, GOOD buffers, and the like. The amount of addition of the buffering agent is not limited as long as the pH can be suppressed during storage and before and after the reaction, including the case where a reaction accelerator is used as a buffering agent. In the case of a solid matrix to be contained, the lower limit of the concentration after dissolution is 1 mM or more, more preferably 5 mM or more, and further preferably 10 mM or more. The upper limit with the preferable density | concentration in a liquid state is 200 mM or less, More preferably, it is 100 mM or less.

また、組成物は酵素安定化剤として糖アルコール、アミノ酸、グリセロール、ウシ血清アルブミンに代表されるタンパク質等を含んでもよい。あるいはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースなどに代表される親水性ポリマーを賦形剤として含んでもよく、あるいはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム等に代表される界面活性剤をさらに含んでもよい。   In addition, the composition may contain sugar alcohol, amino acid, glycerol, protein represented by bovine serum albumin, and the like as an enzyme stabilizer. Alternatively, a hydrophilic polymer typified by pullulan, dextran, polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, etc. may be included as an excipient, or a surfactant typified by Triton X-100, Tween 20, sodium deoxycholate, etc. may be further included. Good.

本発明の血糖センサは、比色式であってもよく、また電気化学式であってもよい。またセンサにはグルコースに応答して得られたシグナル強度から血糖値を算出するための演算装置並びに算出された血糖値を表示するためのディスプレイを具備していてもよい。さらに該血糖センサは、反応層上に検体となる血液もしくは血液の希釈液を滴下するタイプであってもよいが、被検者の皮膚を窄孔し血液を採取するための針及び／または血液を移送させる流路を具備するかまたは装着可能であってもよい。比色式センサの場合はさらに吸光度を測定するための光源ランプおよび光度計を具備していてもよい。電気化学式センサの場合は作用極と対極を有しているかこれら電極上にＧＤＨおよび電子受容体を保持したチップを装着できるタイプであってもよい。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、電子受容体とともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。   The blood glucose sensor of the present invention may be a colorimetric type or an electrochemical type. In addition, the sensor may include an arithmetic unit for calculating a blood glucose level from a signal intensity obtained in response to glucose and a display for displaying the calculated blood glucose level. Furthermore, the blood glucose sensor may be of a type in which blood or blood dilution liquid as a specimen is dropped onto the reaction layer, but a needle and / or blood for stenosis of the subject's skin and collecting blood It may be provided with a flow path for transferring or may be mounted. In the case of a colorimetric sensor, a light source lamp and a photometer for measuring absorbance may be further provided. In the case of an electrochemical sensor, it may have a working electrode and a counter electrode, or a type in which a chip holding GDH and an electron acceptor can be mounted on these electrodes. As the electrode, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used, and GDH is immobilized on the electrode. Examples of the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a method using a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, At the same time, it may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode, or these may be used in combination. Typically, GDH is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.

グルコース濃度の測定は、比色式グルコースセンサの場合にあっては例えば以下のようにして行うことができる。グルコースセンサ上の反応層にはＦＡＤ依存型ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることで重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化より、あらかじめ標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブを元に試料中のグルコース濃度を算出することができる。この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、たとえば２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。いうまでもなく使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。   In the case of a colorimetric glucose sensor, the glucose concentration can be measured as follows, for example. The reaction layer on the glucose sensor includes FAD-dependent GDH, an electron acceptor, and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (as a reaction accelerator) Bis-Tris), a liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole is retained. Here, a pH buffer and a coloring reagent are added as necessary. A sample containing glucose is added to this and allowed to react for a certain time. During this time, the absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the dye that is polymerized and formed by receiving electrons from the electron acceptor or the electron acceptor that fades upon reduction is monitored. Based on the rate of change in absorbance per hour for the rate method and the change in absorbance until the time when all glucose in the sample was oxidized for the endpoint method, the calibration curve prepared in advance with a standard concentration glucose solution was used as the basis. The glucose concentration in the sample can be calculated. As a mediator and coloring reagent that can be used in this method, for example, 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP) is added as an electron acceptor, and glucose can be quantified by monitoring a decrease in absorbance at 600 nm. Further, phenazine methosulfate (PMS) is added as an electron acceptor, nitrotetrazolium blue (NTB) is further added as a coloring reagent, and the amount of diformazan produced is determined by measuring absorbance at 570 nm to calculate the glucose concentration. Is possible. Needless to say, the electron acceptor and the coloring reagent used are not limited to these.

またグルコース濃度の測定は、電気化学式センサの場合にあっては以下のようにして行うことができる。グルコースセンサ上の電極に接続された反応層にはＦＡＤ依存型ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。この組成物にはさらにｐＨ緩衝剤等を含んでいてもよい。ここにグルコースを含む試料を加えて反応させ、さらに電極に一定の電圧を印加する。電流をモニタリングし、電圧印加開始から一定時間に蓄積される電流を積算するかあるいは電圧印加開始から一定時間を経過したある時点での電流値を測定する。この値を元に、標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い試料中のグルコース濃度を計算することができる。   In addition, the measurement of the glucose concentration can be performed as follows in the case of an electrochemical sensor. The reaction layer connected to the electrode on the glucose sensor includes FAD-dependent GDH, an electron acceptor, and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris ( A liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), sodium carbonate and imidazole is retained. This composition may further contain a pH buffering agent and the like. A sample containing glucose is added and reacted, and a certain voltage is applied to the electrode. The current is monitored, and the current accumulated at a certain time from the start of voltage application is integrated, or the current value at a certain time after a certain time has elapsed from the start of voltage application is measured. Based on this value, the glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to a following example.

＜実施例１＞
電気化学式センサにおける応答シグナルの増大
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ＝７．０）を作製した。
１６ｍＭ リン酸カリウム
１０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）
５０００Ｕ／ｍｌ ＦＡＤ依存型ＧＤＨ（アスペルギルス・オリゼ由来）
２０ｍＭ ｏｒ １００ｍＭ 反応促進剤
上記溶液１５μＬを、３電極を具備するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ−ＣＨＩＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極上に滴下することでセンサチップとし、ポテンショ／ガルバノスタットに接続した。この作用極上の組成物に３０ｍＭの標準グルコース溶液１５μＬを添加してグルコースの終濃度が１５ｍＭとなった状態で＋０．１５Ｖの電圧を印加し、電流値をモニタリングした。電圧印加から１秒後の電流値を応答シグナルとして測定し、反応促進剤を含まない条件での応答シグナルとの比較を行った。なお、この測定方法における反応促進剤の最終濃度は１０ｍＭもしくは５０ｍＭである。結果を表１に示す。 <Example 1>
Increase in response signal in electrochemical sensor First, a solution (pH = 7.0) having the following composition was prepared as a reagent for measuring glucose.
16 mM potassium phosphate 10 mM 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP)
5000 U / ml FAD-dependent GDH (derived from Aspergillus oryzae)
20 mM or 100 mM reaction accelerator 15 μL of the above solution was dropped on the working electrode of a disposable chip (DEP-CHIP, manufactured by Biodevice Technologies) having three electrodes to form a sensor chip, which was connected to a potentio / galvanostat. To the composition on the working electrode, 15 μL of a 30 mM standard glucose solution was added, a voltage of +0.15 V was applied in a state where the final glucose concentration was 15 mM, and the current value was monitored. The current value 1 second after the voltage application was measured as a response signal, and compared with the response signal under the condition not containing the reaction accelerator. In addition, the final concentration of the reaction accelerator in this measurement method is 10 mM or 50 mM. The results are shown in Table 1.

なお、表中の相対値は、反応促進剤を含まない条件での応答値を１００として換算した値である。Ｎ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールのいずれも、電気化学センサにおける応答シグナルを増大させる効果があることが確認された。   In addition, the relative value in a table | surface is the value converted into 100 as the response value on the conditions which do not contain a reaction accelerator. N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), sodium carbonate and imidazole all increase response signals in electrochemical sensors It was confirmed that there was an effect.

本発明は、血糖値測定用試薬、血糖センサ並びにグルコース濃度定量キットとしての供給が可能であり、また血液その他の試料中のグルコースの定量において有効な方法である。   The present invention can be supplied as a reagent for measuring blood glucose level, a blood glucose sensor, and a glucose concentration determination kit, and is an effective method for determining glucose in blood and other samples.

Claims (3)

フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼを用いてグルコースを定量する過程において、少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む組成物中に、Ｎ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質をシグナル増強剤として共存させてなる、応答シグナルを増大させる方法。 In the process of quantifying glucose using glucose dehydrogenase using flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme, N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA) is contained in a composition containing at least glucose dehydrogenase and an electron acceptor. ), Bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole coexist as a signal enhancer, and increase the response signal Method. 少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む組成物が、グルコースセンサ上の反応層中に存在することを特徴とする請求項１に記載の応答シグナルを増大させる方法。   The method of increasing a response signal according to claim 1, wherein a composition comprising at least glucose dehydrogenase and an electron acceptor is present in the reaction layer on the glucose sensor. 応答シグナルが電気化学シグナルであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。   The method according to claim 1 or 2, wherein the response signal is an electrochemical signal.