JP5373427B2 - 滑膜細胞および細切軟骨片の軟骨修復における使用 - Google Patents
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Description
1.滑膜細胞および細切軟骨片の軟骨修復処置における使用、
2.前記滑膜細胞が軟骨修復を要する対象から採取された滑膜より調製された滑膜細胞である、上記の滑膜細胞および細切軟骨片の軟骨修復処置における使用、
3.前記細切軟骨片が軟骨修復を要する対象から採取された軟骨を細切することにより調製された細切軟骨片である、上記の滑膜細胞および細切軟骨片の軟骨修復処置における使用、
4.前記滑膜細胞および前記細切軟骨片が支持体に担持された滑膜細胞および細切軟骨片である、上記いずれかの滑膜細胞および細切軟骨片の軟骨修復処置における使用、
5.下記工程(1)から(3)を含む軟骨修復のための処置方法:
(1)軟骨修復処置を要する対象から採取された滑膜より滑膜細胞を調製する工程;
(2)軟骨修復処置を要する対象から採取された軟骨を細切する工程;
および
(3)前記調製された滑膜細胞および前記細切軟骨片を同時に、軟骨修復処置を要する部位に充填する工程、
6.前記調製された滑膜細胞および前記細切軟骨片を同時に、軟骨修復処置を要する部位に充填する工程の前に、前記調製された滑膜細胞および前記細切軟骨片を支持体に担持させる工程をさらに含む上記処置方法、
7.滑膜細胞および細切軟骨片を含有する軟骨修復用組成物、
8.前記滑膜細胞が軟骨修復を要する対象から採取された滑膜より調製された滑膜細胞である上記軟骨修復用組成物、
9.前記細切軟骨片が軟骨修復を要する対象から採取された軟骨を細切することにより調製された細切軟骨片である上記軟骨修復用組成物、
10.前記滑膜細胞および前記細切軟骨片が支持体に担持された滑膜細胞および細切軟骨片である上記いずれかの軟骨修復用組成物。
1. 滑膜細胞と軟骨の調製および処理
白色家兎は12-14週齢(New Zealand White rabbit、体重:2.0-2.5kg)のものを用い、その膝関節から滑膜と関節軟骨を採取した。採取した滑膜を0.3% コラゲナーゼと共に37℃で1時間インキュベーションすることにより酵素処理し、滑膜細胞を分離した。採取した関節軟骨は1mm×2mm程度の大きさになるように細切して細切軟骨片を得た。また、家兎から採取した血液を2000rpmで15分間遠心分離処理し、血漿を採取した。
分離した滑膜細胞を培養せずに1×106/mlの濃度となるように血漿にけん濁し、その200μlにトロンビンとCaCl2を添加することにより血漿中のフィブリノゲンからフィブリンゲルを形成させ、その上に細切軟骨片を添加した。このように作製した組成物を免疫不全マウス(ヌードマウス)の背部皮下に移植した。また、細切軟骨片を加えず、非培養分離滑膜細胞のみを同様に同一のマウスに移植し、比較対象とした。さらに、滑膜細胞や細切軟骨片を加えずにフィブリンゲルのみを移植したものを陰性コントロールとした。
滑膜細胞の軟骨分化の評価は、移植後1週間目および2週間目に移植片を摘出して実施した。組織学的検討は、トルイジンブルー染色およびサフラニン-O染色により実施した。また、移植片のDNA含有量およびプロテオグリカン含有量を測定した。滑膜細胞と細切軟骨片とを移植した移植片は、摘出後、滑膜細胞部分(以下、AC+SCと称することがある)と細切軟骨片部分(以下、ACと称することがある)とを切断分離し、それぞれについて評価を行った。また、非培養分離滑膜細胞のみを移植した移植片(以下、SCと称することがある)、および滑膜細胞や細切軟骨片を加えずにフィブリンゲルのみを移植した移植片(以下、No Cellsと称することがある)は、摘出後、そのまま評価に用いた。トルイジンブルー染色およびサフラニン-O染色は、周知の方法に従って行った。DNA含有量の測定はヘキスト染色法(Hoechst dye法)により、また、プロテオグリカン含有量の測定はDMMB(Dimethylmethylene Blue)法により実施した。これら方法は当業者には周知である。
1. 組織学的検討
サフラニン-Oでの染色性は、細切軟骨片と滑膜細胞とを同時移植した移植片の滑膜細胞部分(AC+SC)において、滑膜細胞のみを移植した移植片(SC)と比較して、増加していた。また、トルイジンブルーで染色される部位は、AC+SCにおいて、SCと比較して増加していた。このことから、AC+SCでは、軟骨分化の指標であるプロテオグリカンが、SCと比較して増加したことが判明した。
滑膜細胞と細切軟骨片とを同時移植すると、滑膜細胞のみを移植したときと比較して、移植後の滑膜細胞のDNA含有量が有意に増加した(図1)。
滑膜細胞と細切軟骨片とを同時移植すると、滑膜細胞のみを移植したときと比較して、移植後の移植片のプロテオグリカン含有量が増加した(図2-Aおよび図2-B)。プロテオグリカン含有量を移植片の重量1μg当りに対する重量に換算した場合(図2-A)、その増加には有意差が認められた。
Claims (4)
- 滑膜細胞および細切軟骨片を含有する軟骨修復用組成物。
- 前記滑膜細胞が軟骨修復を要する対象から採取された滑膜より調製された滑膜細胞である請求項1に記載の軟骨修復用組成物。
- 前記細切軟骨片が軟骨修復を要する対象から採取された軟骨を細切することにより調製された細切軟骨片である請求項1または2に記載の軟骨修復用組成物。
- 前記滑膜細胞および前記細切軟骨片が支持体に担持された滑膜細胞および細切軟骨片である請求項1から3のいずれか1項に記載の軟骨修復用組成物。
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