JP5357778B2

JP5357778B2 - Optimized CD40 antibodies and methods of using the same

Info

Publication number: JP5357778B2
Application number: JP2009545016A
Authority: JP
Inventors: マシュージェイバーネット; スンユップチュー; ジョンアールデジャルレ; シャーバハデュアカルキ; グレゴリーアランラザー; エリックウェイキンポン; ユージーンアレクサンダーズコフスキー
Original assignee: Xencor Inc
Current assignee: Xencor Inc
Priority date: 2007-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2028-01-23
Also published as: CA2669412A1; WO2008091954A3; JP2010514460A; AU2008207898B2; WO2008091954A2; WO2008091954A4; EP2125893A2; AU2008207898A1

Abstract

The present invention describes antibodies that target CD40, wherein the antibodies comprise at least one modification relative to a parent antibody, wherein the modification alters affinity to an FcyR or alters effector function as compared to the parent antibody. Also disclosed are methods of using the antibodies of the invention.

Description

本出願は、米国仮特許出願60/886,291号（2007年1月23日出願）（前記は参照により本明細書に含まれる）に関し、35U.S.C.§119(e)に基づいて優先権を主張する。 This application claims priority under 35 U.SC §119 (e) with respect to US Provisional Patent Application No. 60 / 886,291 (filed Jan. 23, 2007), which is hereby incorporated by reference. To do.

本発明は、CD40を標的とする最適化タンパク質、およびそれらの利用、特に治療目的の利用に関する。 The present invention relates to optimized proteins that target CD40 and their use, particularly for therapeutic purposes.

B細胞：B細胞は液性免疫応答で大きな役割を果たすリンパ球である。それらは、ほとんどの哺乳動物の骨髄で生産され、循環性リンパ性細胞プールの5−15％を占める。B細胞の主要機能は種々の抗原に対する抗体を作ることであり、適応免疫系の必須の成分である。
人間の体は何百万もの異なるタイプのB細胞を毎日産生し、これらは、免疫監視の役割を果たしながら血液およびリンパを循環する。B細胞（Bリンパ球とも称される）は、それらが完全に活性化されるまで抗体を産生しない。各B細胞は、１つの特定の抗原と結合する固有のレセプタータンパク質（B細胞レセプター（BCR）と称される）をその表面に有する。BCRは膜結合免疫グロブリンであり、B細胞活性化に必要な主要レセプターであるとともに他のタイプのリンパ球からB細胞を区別することを可能にするのはこの分子である。B細胞がその同族抗原と出会い、さらにTヘルパー細胞から追加シグナルを受け取るやいなや、前記細胞は、下記に列挙する多様なB細胞タイプへと更なる分化を遂げることができる。B細胞は直接的にこれら細胞タイプの1つになるか、又は中間分化工程（胚中心反応）を経ることができ、この工程でB細胞はその免疫グロブリン遺伝子の可変領域に高度変異が導入され、さらにおそらくはクラススイッチを受けるであろう。
B細胞発達はいくつかのステージを通して生じる（各ステージは抗体遺伝子座のゲノム組成における変化を示す）。B細胞の発達ステージは、B前駆細胞（Progenitor B cell）、初期プロ-B細胞、後期プロ-B細胞、大プレ-B細胞、小プレ-B細胞、未成熟B細胞および成熟B細胞を含む。 B cells : B cells are lymphocytes that play a major role in the humoral immune response. They are produced in the bone marrow of most mammals and occupy 5-15% of the circulating lymphoid cell pool. The main function of B cells is to make antibodies against various antigens and is an essential component of the adaptive immune system.
The human body produces millions of different types of B cells every day that circulate in the blood and lymph while serving as immune surveillance. B cells (also called B lymphocytes) do not produce antibodies until they are fully activated. Each B cell has a unique receptor protein (referred to as a B cell receptor (BCR)) on its surface that binds to one specific antigen. BCR is a membrane-bound immunoglobulin that is the primary receptor required for B cell activation and it is this molecule that makes it possible to distinguish B cells from other types of lymphocytes. As soon as the B cell encounters its cognate antigen and receives additional signals from the T helper cells, the cells can undergo further differentiation into the various B cell types listed below. B cells can directly become one of these cell types, or can undergo an intermediate differentiation process (germinal center reaction), in which B cells are hypermutated into the variable region of their immunoglobulin genes. And perhaps more likely to get a class switch.
B cell development occurs through several stages, each stage showing a change in the genomic composition of the antibody locus. B cell development stages include Progenitor B cells, early pro-B cells, late pro-B cells, large pre-B cells, small pre-B cells, immature B cells and mature B cells .

成熟B細胞は以下の4つの主要なタイプに分類することができる：
B-1細胞はCD5（T細胞で通常的に見出されるマーカー）を発現する。B-1細胞はまた、IgGよりも大量にIgMを発現する。それらは、血清中で見出される天然の低親和性多反応性抗体を分泌し、しばしば自己抗原および一般的細菌多糖類に対する特異性を有する。B-1細胞はリンパ節および脾臓に小数存在するが、むしろ腹腔および胸膜腔内にもっぱら見出される。
B-2細胞は、ほとんどの教科書が言及している一般的なB細胞である。それらは、骨髄、脾臓およびリンパ節に存在する。それらは短命で、抗原によって始動させられるとIgG産生メモリーB細胞に分化することができる。これらの抗体応答過程で、IgGは実質的な親和性成熟を経ることができる。
プラズマB細胞（プラズマ細胞としても知られている）は、抗原に暴露され大量の抗体を産生および分泌する大きなB細胞であり、前記は、食細胞の結合および標的到達の促進とともに補体系の活性化により微生物の破壊を助ける。
メモリーB細胞は、一次免疫応答時に遭遇した抗原に特異的である活性化B細胞から形成される。これらの細胞は長期間生存し、同じ抗原に対する二回目の暴露後に迅速に応答することができる。
B細胞が前記成熟プロセスのいずれかの工程で不完全であるとき、その細胞はアポトーシスと呼ばれるメカニズムによって死滅する。前記が成熟過程で自己抗原を認識する場合、このB細胞はサプレス状態（アネルギーとして知られている）になるか、アポトーシスを受ける。B細胞は持続的に骨髄で産生されるが、新しく作られたB細胞のわずかな部分のみが生存し、長命の抹消B-細胞プールに加えられる。
近年、Bリンパ球が免疫応答でより広い役割を果たし、抗体産生プラズマ細胞への分化をもたらすシグナルの単なる受動的な受取り手ではないことを提唱するデータが得られている。抗原提示細胞および抗体産生プラズマ細胞の前駆細胞としてのそれらの従来の役割とともに、B細胞はまた、抗原提示細胞（APC）およびT細胞機能を調節し、サイトカインを産生し、さらに以前には他の細胞タイプに限定されると考えられていたレセプター／リガンドペアを発現することが判明した。本明細書に開示されるものは、B細胞に対して最適化させた新規な抗体およびそれらを使用する方法である。 Mature B cells can be divided into four main types :
B-1 cells express CD5, a marker normally found on T cells. B-1 cells also express IgM in greater amounts than IgG. They secrete natural low affinity polyreactive antibodies found in serum and often have specificity for self antigens and common bacterial polysaccharides. B-1 cells are present in small numbers in the lymph nodes and spleen but rather are found exclusively in the peritoneal cavity and pleural cavity.
B-2 cells are common B cells mentioned in most textbooks. They are present in the bone marrow, spleen and lymph nodes. They are short lived and can differentiate into IgG producing memory B cells when triggered by antigen. In these antibody response processes, IgG can undergo substantial affinity maturation.
Plasma B cells (also known as plasma cells) are large B cells that are exposed to an antigen to produce and secrete large amounts of antibodies, which promote phagocytic cell binding and target reaching as well as complement system activity. Helps destroy microorganisms.
Memory B cells are formed from activated B cells that are specific for the antigen encountered during the primary immune response. These cells survive for a long time and can respond quickly after a second exposure to the same antigen.
When a B cell is defective at any step of the maturation process, the cell dies by a mechanism called apoptosis. If it recognizes an autoantigen during maturation, the B cell becomes depressed (known as anergy) or undergoes apoptosis. B cells are produced continuously in the bone marrow, but only a small portion of newly created B cells survive and are added to the long-lived peripheral B-cell pool.
In recent years, data have been obtained that suggest that B lymphocytes play a broader role in the immune response and are not merely passive recipients of signals that lead to differentiation into antibody-producing plasma cells. Along with their traditional role as progenitors of antigen-presenting cells and antibody-producing plasma cells, B cells also regulate antigen-presenting cell (APC) and T cell functions, produce cytokines, and previously others It was found to express a receptor / ligand pair that was thought to be limited to cell types. Disclosed herein are novel antibodies optimized for B cells and methods of using them.

本発明は、抗体および前記を使用する方法を目的とする。ある種の特徴では、本抗体は変種Fc領域を含む。本発明はさらに多様な適応症で本抗体を使用する方法を目的とする。
ある特徴では、本発明はCD40と結合する抗体を目的とし、この場合、前記抗体は親の抗体に比して定常領域内に少なくとも1つの改変を含む。ある特徴では、本発明の抗体は、親抗体と比較したとき改変された親和性でFcレセプターと結合するか、または改変されたエフェクター機能を有する。 The present invention is directed to antibodies and methods of using the same. In certain aspects, the antibody comprises a variant Fc region. The present invention is further directed to methods of using the antibodies in a variety of indications.
In one aspect, the invention is directed to an antibody that binds to CD40, wherein the antibody comprises at least one modification in the constant region relative to the parent antibody. In one aspect, an antibody of the invention binds to an Fc receptor with altered affinity when compared to the parent antibody or has altered effector function.

ある種の特徴では改変はアミノ酸である。前記改変は、221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336および337から成る群から選択される位置に存在することができ、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう。前記アミノ酸改変は、221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337Hおよび337Nから成る群から選択される置換であってもよく、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう。 In certain features, the modification is an amino acid. The modifications include 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 and 337, where the numbering is EU Follow the index. The amino acid modifications are 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y , 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V , 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235F, 235G , 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q , 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238D, 238E , 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N , 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R , 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S , 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N , 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 265Y, 266A , 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268I, 268K , 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270F, 270G , 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S , 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 27 2W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283R 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293W 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299V 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y , 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I , 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y , 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q332 , 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335H, 335I , 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H and 337N, where the numbering is in the EU index Follow.

さらに別の特徴では、前記アミノ酸改変は221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336および337から成る群から選択される位置にあってもよい。追加される特徴では、前記置換は、221K, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233F, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234W, 234Y, 235D, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240M, 240T, 241D, 241E, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 245A, 246D, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267V, 267W, 267Y, 268F, 268G, 268I, 268M, 268P, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280P, 280W, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Y, 282G, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286G, 286P, 286Y, 288Y, 290H, 290L, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298Q, 298R, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327P, 327R, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332F, 332H, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334F, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337Hおよび337Nから成る群から選択されてもよい。 In yet another aspect, the amino acid modification is 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, It may be in a position selected from the group consisting of 322, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 and 337. In an additional feature, the substitution is 221K, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233F, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 233Y 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234W, 234Y, 235D, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235Q, 235 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240M, 240T 241D, 241E, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 245A, 246D , 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T , 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265L, 265M , 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267V, 267R, 267V , 267Y, 268F, 268G, 268I, 268M, 268P, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 269Y, 270F , 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R , 271T, 271V, 271W, 271Y, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I , 274M, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 27 6P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280P, 280W 281E, 281K, 281N, 281P, 281Y, 282G, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286Y 286P, 286Y, 288Y, 290H, 290L, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293 293R, 293S, 293T, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295F, 295G, 295H, 295I, 295 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298Q, 298R, 298W, 298Y, 299A, 299 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327 327L, 327M, 327P, 327R, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329Y 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332F, 332H, 332L , 332M, 332N, 332P, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334F, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335G, 335H , 335L, 335M, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337H and 337N.

さらに別の特徴では、前記改変は、221, 222, 223, 224, 225, 228, 230, 231, 232, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 299, 302, 304, 313, 323, 325, 328, 332, 336から成る群から選択される位置にあり、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう。追加される特徴では、前記改変は、221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 244H, 245A, 247G, 247V, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 266A, 266I, 266M, 266T, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 273I, 275L, 275W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 323I, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 336E, 336Kおよび336Yから成る群から選択される。 In yet another aspect, the modification is 221, 222, 223, 224, 225, 228, 230, 231, 232, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 299, 302, 304, 313, 323, 325, 328, 332, 336, where the numbering is according to the EU index. In additional features, the modifications are 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 244H, 245A, 247G, 247V, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 266A, 266I, 266M, 266T, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 273I, 275L, 275W 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 299A, 299D, 299E, 299F 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 323I, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L , 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 336E, 336K, and 336Y.

さらに、抗体は、221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336および337から成る群から選択される位置に第二のアミノ酸改変を含むことができ、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう。第二のアミノ酸改変は、221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337Hおよび337Nから成る群から選択される置換であってもよく、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう。 In addition, antibodies are available for 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246 , 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 281, 282, 283 , 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322 , 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 and 337, and can include a second amino acid modification at a position selected from the group consisting of: The numbering here follows the EU index. The second amino acid modification is 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G , 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T , 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235E, 235F , 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, , 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D , 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239L, 239M , 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 2 41R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266W 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270F 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283R 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293W 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296 S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 3 27Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329H 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H and 337N, where the numbering is the EU index Follow.

さらに別の特徴では、前記アミノ酸改変は332Eである。第二のアミノ酸改変は、236A、239D、332E、268D、268E、330Yおよび330Lから成る群から選択することができる。ある種の実施態様では、第二のアミノ酸改変は239Dである。
他の特徴では、前記改変は、親抗体と比してフコースレベルが低い糖型改変である。さらに他の特徴では、本発明は、複数のグリコシル化抗体を含む組成物を目的とし、この場合、前記組成物中のグリコシル化抗体の約80−100%が、フコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む。
さらに別の実施態様では、抗体は、親抗CD40抗体と比較したときFcγRIIbとの結合が低下している。
別の特徴では、本発明は、CD40と結合する抗体を目的とし、前記は、重鎖および／または軽鎖を含み、さらに親抗体と比較したときFcγRIIIaレセプターとの親和性が増加している。前記重鎖は、配列番号:16、22および28から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号:17、23および29から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR2、ならびに配列番号:18、24および30から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する。前記軽鎖は、配列番号:19、25および31から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号:20、26および32から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR2、ならびに配列番号:21、27および33から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する。 In yet another aspect, the amino acid modification is 332E. The second amino acid modification can be selected from the group consisting of 236A, 239D, 332E, 268D, 268E, 330Y and 330L. In certain embodiments, the second amino acid modification is 239D.
In other features, the modification is a glycoform modification with a lower fucose level compared to the parent antibody. In yet another aspect, the invention is directed to a composition comprising a plurality of glycosylated antibodies, wherein about 80-100% of the glycosylated antibodies in the composition contain mature core carbohydrate structures lacking fucose. Including.
In yet another embodiment, the antibody has reduced binding to FcγRIIb when compared to the parent anti-CD40 antibody.
In another aspect, the invention is directed to an antibody that binds to CD40, which comprises a heavy and / or light chain and further has increased affinity for the FcγRIIIa receptor when compared to the parent antibody. The heavy chain comprises a CDR1 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16, 22, and 28, a CDR2 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17, 23 and 29, and SEQ ID NO: Have CDR3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: 18, 24 and 30. The light chain is CDR1 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19, 25 and 31, CDR2 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20, 26 and 32, and SEQ ID NO: : Has CDR3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of 21, 27 and 33.

さらに別の変型では、抗体は、配列番号:10、12、14および16−19から成る群から選択される可変重鎖配列、および／または配列番号:11、13、15および20−22から成る群から選択される可変軽鎖配列を有する。
多様な追加の特徴では、本発明は、本明細書に開示する抗体のいずれかをコードする核酸配列を目的とする。
さらに別の特徴では、本発明は、請求項1に記載の抗体を投与することによってB細胞関連疾患を治療する方法を目的とする。ある種の変型では、前記疾患は、非ホジキンリンパ腫（NHL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、急性Bリンパ芽球性白血病／リンパ腫（B-ALL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）および多発性ミエローマ（MM）から選択される。ある種の特徴では、前記疾患は、自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ（RA）、全身性紅斑性狼瘡（SLEまたは狼瘡）、多発性硬化症、シェーグレン症候群および特発性血小板減少性紫斑病（ITP）である。
さらに別の特徴では、本発明は、本明細書に記載の抗体および許容可能な担体を含む組成物を目的とする。 In yet another variation, the antibody consists of a variable heavy chain sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10, 12, 14 and 16-19, and / or SEQ ID NOs: 11, 13, 15 and 20-22. Having a variable light chain sequence selected from the group.
In various additional features, the present invention is directed to nucleic acid sequences that encode any of the antibodies disclosed herein.
In yet another aspect, the present invention is directed to a method of treating a B cell related disease by administering the antibody of claim 1. In certain variants, the disease is non-Hodgkin lymphoma (NHL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), acute B lymphoblastic leukemia / lymphoma (B-ALL), mantle cell lymphoma (MCL) and multiple Selected from Myeloma (MM). In certain aspects, the disease is an autoimmune disease such as rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE or lupus), multiple sclerosis, Sjogren's syndrome and idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). ).
In yet another aspect, the present invention is directed to a composition comprising an antibody described herein and an acceptable carrier.

ある特徴では、本発明はCD40と結合する抗体を目的とし、この場合、前記抗体はエフェクター機能を最適化するための手段を含む。ある実施態様では、前記手段は、親抗体と比較しととき増加した親和性で抗体がFcγRIIIaレセプターと結合することを可能にする。別の実施態様では、前記手段はアミノ酸改変である。いくつかの実施態様では、エフェクター機能の最適化のための手段は、位置的手段、例えば以下の重鎖定常領域の位置の1つ以上におけるアミノ酸の改変であり、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう：221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336および337。他の実施態様では、エフェクター機能の最適化のための手段は、置換による手段、例えば重鎖定常領域の位置における1つ以上の以下のアミノ酸置換であり、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう：221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337Hおよび337N。 In one aspect, the invention is directed to an antibody that binds to CD40, wherein the antibody comprises a means for optimizing effector function. In certain embodiments, the means allows the antibody to bind to the FcγRIIIa receptor with an increased affinity when compared to the parent antibody. In another embodiment, the means is an amino acid modification. In some embodiments, the means for optimization of effector function is positional means, such as amino acid modifications at one or more of the following heavy chain constant region positions, wherein numbering is in the EU index: Follow: 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 and 337. In other embodiments, the means for optimization of effector function is by substitution, eg, one or more of the following amino acid substitutions at heavy chain constant region positions, where the numbering is according to the EU index: 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233A, 233Y, 233Y 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236T, 236T 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 2 38E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265F 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267I 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269F 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271S, 271T 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292D 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294 G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299Y 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 3 24W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329T 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E 336K, 336Y, 337E, 337H and 337N.

他の実施態様では、エフェクター機能の最適化のための手段は、位置的手段、例えば以下の位置、221、222、223、224、225、228、230、231、232、240、244、245、247、262、263、266、271、273、275、281、284、291、299、302、304、313、323、325、328、332、336の1つ以上におけるアミノ酸の改変であり、ここで前記位置の番号付与はEUインデックスにしたがう。いくつかの実施態様では、エフェクター機能の最適化のための手段は、置換による手段、例えば1つ以上の以下の置換である：221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 244H, 245A, 247G, 247V, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 266A, 266I, 266M, 266T, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 273I, 275L, 275W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 323I, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 336E, 336Kおよび336Y。他の実施態様では、エフェクター機能の最適化のための手段は、第二のアミノ酸改変、例えば以下から成る群から選択される位置における前記改変を含み、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう：221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336および337。例えばエフェクター機能の最適化のための手段は、第二のアミノ酸置換、例えば1つ以上の以下の置換を含むことができ、ここで番号付与はEUインデックスにしたがう：221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337Hおよび337N。 In other embodiments, the means for optimization of effector function is positional means, such as the following positions: 221, 222, 223, 224, 225, 228, 230, 231, 232, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 299, 302, 304, 313, 323, 325, 328, 332, 336, amino acid modifications, wherein The position numbering is according to the EU index. In some embodiments, the means for optimization of effector function is by substitution, eg, one or more of the following substitutions: 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E , 225K, 225W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 244H, 245A , 247G, 247V, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 266A, 266I, 266M, 266T, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L , 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 273I, 275L, 275W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T , 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W , 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 323I, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y , 328A, 328D, 328E, 328F, 328 G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 336E, 336K and 336Y. In another embodiment, the means for optimization of effector function comprises a second amino acid modification, for example said modification at a position selected from the group consisting of wherein the numbering is according to the EU index: 221 , 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255 , 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286 , 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325 , 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 and 337. For example, the means for optimization of effector function can include a second amino acid substitution, eg one or more of the following substitutions, where the numbering is according to the EU index: 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237W 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238L 2 38N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265N 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267T, 267V, 267T 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274W 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282K, 282P, 282K 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288Y 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293L 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294 S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 3 25I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327L 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H and 337N.

別の実施態様では、エフェクター機能の最適化のための手段はアミノ酸改変332Eである。いくつかの実施態様では、エフェクター機能の最適化のための手段は、アミノ酸改変332Eならびに以下のアミノ酸改変、236A、239D、332E、268D、268E、330Yおよび330Lの1つ以上、例えば239Dである。
他の実施態様では、本発明の抗体は、親抗体と比して低いフコースレベルを有する。例えば、本発明の組成物は複数のグリコシル化抗体を含むことができ、この場合、前記グリコシル化抗体の約80−100%がフコースのレベルの低下を有する。
他の実施態様では、本発明の抗体は、親の抗CD40抗体と比較したときFcγRIIbとの結合を低下させる手段を含む。
以下の図面は本発明の特徴をさらに例証するものであり、いずれの特定の応用または作業理論に本発明を拘束しようとするものではない。 In another embodiment, the means for optimization of effector function is amino acid modification 332E. In some embodiments, the means for optimization of effector function is amino acid modification 332E and one or more of the following amino acid modifications, 236A, 239D, 332E, 268D, 268E, 330Y and 330L, such as 239D.
In other embodiments, the antibodies of the invention have low fucose levels compared to the parent antibody. For example, a composition of the invention can comprise a plurality of glycosylated antibodies, in which about 80-100% of the glycosylated antibodies have a reduced level of fucose.
In other embodiments, the antibodies of the invention comprise means for reducing binding to FcγRIIb when compared to the parent anti-CD40 antibody.
The following drawings further illustrate the features of the present invention and are not intended to constrain the present invention to any particular application or theory of work.

天然の抗体の定常領域の配列（カッパ定常軽鎖（配列番号:1）およびIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のガンマ定常重鎖（それぞれ配列番号:2−5）を含む）を示す。The sequence of the natural antibody constant region, including the kappa constant light chain (SEQ ID NO: 1) and IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 gamma constant heavy chains (SEQ ID NO: 2-5, respectively) is shown. 図1bではまた、ハイブリッドIgG定常鎖（配列番号:6）ならびに置換239DおよびI332Eを含むハイブリッドIgG定常鎖（配列番号:7）が提供されている。図1cは、ヒトIgG免疫グロブリンIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のアミノ酸配列のアラインメントを示す。FIG. 1b also provides a hybrid IgG constant chain (SEQ ID NO: 6) and a hybrid IgG constant chain (SEQ ID NO: 7) comprising substitutions 239D and I332E. FIG. 1c shows an amino acid sequence alignment of human IgG immunoglobulins IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. 図1cは、CH1（Cγ1）ドメイン、ヒンジドメイン、CH2（Cγ2）ドメインおよびCH3（Cγ3）ドメインの配列を提供する。位置はIgG1配列のEUインデックスにしたがって番号付与され、IgG1と他の免疫グロブリン（IgG2、IgG3およびIgG4）との間の相違は灰色で示されている。多形性が多くの位置に存在し（Kim et al. 2001, J Mol Evol 54:1-9、前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）、したがって、提示の配列と従来の配列との間には小さな相違が存在しえる。Fc領域の可能な開始部は標識されてあり、本明細書ではEU226位または230位と規定される。FIG. 1c provides the sequence of the CH1 (Cγ1) domain, hinge domain, CH2 (Cγ2) domain and CH3 (Cγ3) domain. The positions are numbered according to the EU index of the IgG1 sequence and the differences between IgG1 and other immunoglobulins (IgG2, IgG3 and IgG4) are shown in gray. Polymorphisms exist in many positions (Kim et al. 2001, J Mol Evol 54: 1-9, which is hereby incorporated by reference in its entirety), and thus the sequences presented and conventional There may be minor differences between the sequences. The possible start of the Fc region is labeled and is defined herein as EU position 226 or 230. 図１ｃ−１の続き。Continuation of FIG. ヒトIgG1（図２ａ）およびIgG2（図２ｂ）ガンマ鎖の一般的ハプロタイプであり、位置と対応するアミノ酸置換を示す。Human IgG1 (FIG. 2a) and IgG2 (FIG. 2b) are common haplotypes of the gamma chain, showing the amino acid substitutions corresponding to the positions. 多様なレセプターとの結合増加、結合低下または結合への影響の不在を含む具体的なレセプター結合プロフィルである。そのような変化はある種の状況で有益でありえる。Specific receptor binding profiles including increased binding, decreased binding or absence of effects on binding to various receptors. Such changes can be beneficial in certain situations. 本発明の抗体が標的とするCD40抗原のアミノ酸配列である。図4は、ホモ・サピエンスCD40の両アイソフォームの配列を提供する。It is the amino acid sequence of the CD40 antigen targeted by the antibody of the present invention. FIG. 4 provides the sequences of both isoforms of Homo sapiens CD40. ネズミ抗CD40抗体の可変領域をコードする配列である。図5は、抗CD40抗体S2C6、G28-5および5D12の軽鎖および重鎖可変領域配列をそれぞれ提供する。CDRには下線が付されている。A sequence encoding the variable region of a murine anti-CD40 antibody. FIG. 5 provides the light and heavy chain variable region sequences of anti-CD40 antibodies S2C6, G28-5 and 5D12, respectively. CDRs are underlined. ネズミ抗CD40抗体の可変領域をコードする配列である。図5は、抗CD40抗体S2C6、G28-5および5D12の軽鎖および重鎖可変領域配列をそれぞれ提供する。CDRには下線が付されている。さらにまた、図5bには、抗CD40抗体S2C6（図5b；配列番号:16−21）の重鎖可変（VH）および軽鎖可変（VL）CDR配列が示されている。A sequence encoding the variable region of a murine anti-CD40 antibody. FIG. 5 provides the light and heavy chain variable region sequences of anti-CD40 antibodies S2C6, G28-5 and 5D12, respectively. CDRs are underlined. Furthermore, FIG. 5b shows the heavy chain variable (VH) and light chain variable (VL) CDR sequences of anti-CD40 antibody S2C6 (FIG. 5b; SEQ ID NOs: 16-21). ネズミ抗CD40抗体の可変領域をコードする配列である。図5は、抗CD40抗体S2C6、G28-5および5D12の軽鎖および重鎖可変領域配列をそれぞれ提供する。CDRには下線が付されている。図5cには、抗CD40抗体G28-5（図5c；配列番号:22−27）の重鎖可変（VH）および軽鎖可変（VL）CDR配列が示されている。A sequence encoding the variable region of a murine anti-CD40 antibody. FIG. 5 provides the light and heavy chain variable region sequences of anti-CD40 antibodies S2C6, G28-5 and 5D12, respectively. CDRs are underlined. FIG. 5c shows the heavy chain variable (VH) and light chain variable (VL) CDR sequences of anti-CD40 antibody G28-5 (FIG. 5c; SEQ ID NOs: 22-27). ネズミ抗CD40抗体の可変領域をコードする配列である。図5は、抗CD40抗体S2C6、G28-5および5D12の軽鎖および重鎖可変領域配列をそれぞれ提供する。CDRには下線が付されている。さらにまた、図5dには、抗CD40抗体5D12（図5d；配列番号:28−33）の重鎖可変（VH）および軽鎖可変（VL）CDR配列が示されている。A sequence encoding the variable region of a murine anti-CD40 antibody. FIG. 5 provides the light and heavy chain variable region sequences of anti-CD40 antibodies S2C6, G28-5 and 5D12, respectively. CDRs are underlined. Furthermore, FIG. 5d shows the heavy chain variable (VH) and light chain variable (VL) CDR sequences of anti-CD40 antibody 5D12 (FIG. 5d; SEQ ID NOs: 28-33). バーキットリンパ腫細胞株DaudiおよびRaji、ならびに多発性ミエローマ細胞株RPMI8226でWT IgG1、ハイブリッドS239D/I332E（エフェクター機能増強）抗CD40抗体、および抗CD20抗体リツキシマブを比較したADCCアッセイである。図6aはS2C6の結果を示し、図6bは5D12の結果を示し、図6cはG28-5の結果を示す。ADCC assay comparing WT IgG1, hybrid S239D / I332E (enhanced effector function) anti-CD40 antibody, and anti-CD20 antibody rituximab in Burkitt lymphoma cell lines Daudi and Raji and multiple myeloma cell line RPMI8226. FIG. 6a shows the results for S2C6, FIG. 6b shows the results for 5D12, and FIG. 6c shows the results for G28-5. 図６ａ−１の続き。Continuation of FIG. バーキットリンパ腫細胞株DaudiおよびRaji、ならびに多発性ミエローマ細胞株RPMI8226でWT IgG1、ハイブリッドS239D/I332E（エフェクター機能増強）抗CD40抗体、および抗CD20抗体リツキシマブを比較したADCCアッセイである。図6bは5D12の結果を示す。ADCC assay comparing WT IgG1, hybrid S239D / I332E (enhanced effector function) anti-CD40 antibody, and anti-CD20 antibody rituximab in Burkitt lymphoma cell lines Daudi and Raji and multiple myeloma cell line RPMI8226. FIG. 6b shows the 5D12 results. 図６ｂ−１の続き。Continuation of FIG. バーキットリンパ腫細胞株DaudiおよびRaji、ならびに多発性ミエローマ細胞株RPMI8226でWT IgG1、ハイブリッドS239D/I332E（エフェクター機能増強）抗CD40抗体、および抗CD20抗体リツキシマブを比較したADCCアッセイである。図6cはG28-5の結果を示す。ADCC assay comparing WT IgG1, hybrid S239D / I332E (enhanced effector function) anti-CD40 antibody, and anti-CD20 antibody rituximab in Burkitt lymphoma cell lines Daudi and Raji and multiple myeloma cell line RPMI8226. FIG. 6c shows the results for G28-5. 図６ｃ−１の続き。Continuation of FIG. 抗CD抗体S2C6を用いた血小板活性化アッセイである。アッセイに含まれたサンプルはS2C6 IgG1、S2C6ハイブリッドS239D/I332E、陽性コントロール抗体IV.3（マウス抗ヒトIgG FcgRIIa特異抗体）、およびアイソタイプコントロール抗体であった。It is a platelet activation assay using anti-CD antibody S2C6. Samples included in the assay were S2C6 IgG1, S2C6 hybrid S239D / I332E, positive control antibody IV.3 (mouse anti-human IgG FcgRIIa specific antibody), and isotype control antibody. バーキットリンパ腫細胞株HS-Sultanでの抗CD40抗体の抗増殖アッセイである。アッセイに含まれたサンプルは、５D12 IgG1、S2C6 IgG1およびCD40リガンド添加もしくは非添加ヒトIgGであり、細胞単独をコントロールとして用いた。Anti-proliferation assay of anti-CD40 antibody in Burkitt lymphoma cell line HS-Sultan. Samples included in the assay were 5D12 IgG1, S2C6 IgG1 and human IgG with or without CD40 ligand, and cells alone were used as controls.

発明の詳細な説明
B細胞障害：免疫系の調節におけるそれらの重要な役割のために、B細胞の制御異常は多様な障害を伴う。B-細胞障害（本明細書ではまたB-細胞関連疾患と呼ぶ）は、過剰又は無制御増殖（リンパ腫、白血病）とB-細胞発達／免疫グロブリン産生の欠陥（免疫不全）とに分類される。リンパ腫症例の大半（80％）がB-細胞起源である。これらには非ホジキンリンパ腫（NHL）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、および自己免疫関連疾患が含まれる。
NHLはリンパ球に由来する不均質性悪性疾患である。米国では、その発生率は年間65,000人、死亡率は20,000人と概算されている（アメリカ癌学会（2006）；およびSEER癌統計便覧）。前記疾患は全ての年齢で発生し、通常は、発生は40歳を超える成人で始まり、発症率は年齢とともに増加する。NHLは、リンパ節、血液、骨髄および脾臓に蓄積する（ただし主要器官はいずれも含まれえる）、リンパ球のクローン性増殖を特徴とする。
NHLの診断および組織学的特徴の決定は、形態学的基準および免疫表現型基準の組合せを用いて実施される。病理検査技師および医師が用いる従来の分類系は世界保健機構（WHO）の腫瘍分類であり、前記は、NHLを前駆および成熟B-細胞又はT-細胞新形成に系統立てる。PDQは、これまでNHLを臨床試験への登録のために不活性型又は攻撃型に分類している。統一のために、本明細書もまた同様な分類を用いる。不活性NHL群は、主として濾胞性NHL亜型、小リンパ球性リンパ腫、MALT、および境界ゾーンのNHLを含み、不活性型は、新規に診断されるB-細胞NHL患者のほぼ50％を占める。攻撃型NHLは、主としてびまん性大型B細胞（新規に診断された患者の40％がびまん性大型細胞を有する）、バーキット細胞およびマントル細胞の組織学的診断を受けた患者を含む。 Detailed Description of the Invention
B cell disorders : Due to their important role in the regulation of the immune system, dysregulation of B cells is associated with a variety of disorders. B-cell disorders (also referred to herein as B-cell-related disorders) are classified as excessive or uncontrolled proliferation (lymphoma, leukemia) and defects in B-cell development / immunoglobulin production (immunodeficiency) . The majority of lymphoma cases (80%) are of B-cell origin. These include non-Hodgkin lymphoma (NHL), acute lymphoblastic leukemia (ALL), and autoimmune related diseases.
NHL is a heterogeneous malignant disease derived from lymphocytes. In the United States, the incidence is estimated at 65,000 annually and mortality is estimated at 20,000 (American Cancer Society (2006); and SEER Cancer Statistics Handbook). The disease occurs at all ages, and usually begins in adults over 40 years of age, with the incidence increasing with age. NHL is characterized by clonal expansion of lymphocytes that accumulate in lymph nodes, blood, bone marrow, and spleen (but can include any major organ).
Diagnosis of NHL and determination of histological characteristics are performed using a combination of morphological and immunophenotypic criteria. The traditional classification system used by pathologists and physicians is the World Health Organization (WHO) tumor classification, which organizes NHL into progenitor and mature B-cell or T-cell neoplasia. PDQ has previously classified NHL as inactive or aggressive for registration in clinical trials. For consistency, this specification also uses a similar classification. The inactive NHL group primarily includes follicular NHL subtypes, small lymphocytic lymphomas, MALT, and border zone NHL, with inactive forms accounting for almost 50% of newly diagnosed B-cell NHL patients . Aggressive NHL primarily includes patients who have undergone histological diagnosis of diffuse large B cells (40% of newly diagnosed patients have diffuse large cells), Burkitt cells and mantle cells.

NHLの臨床経過は高度に変動しえる。臨床経過の主要な決定因子は組織学的サブタイプである。ほとんどのNHL不活性型は不治の疾患であると考えられる。患者は、化学療法又は抗体療法のどちらかに最初は応答し、大半が再発するであろう。今日までの研究は、早期介入による生存の改善は示されていない。無症候性患者では、患者が症状を示すようになるか又は疾患ペースが加速しつつあるように思われるまで“観察しつつ待機する”ことは許容できる。時間がたつとともに、この疾患はより攻撃的な組織学所見へと変化しえる。平均生存は8から10年であり、不活性型の患者は、治療期の間しばしば3つ以上の治療を受ける。症状が出現した不活性型のNHL患者の最初の治療は、歴史的には組合せ化学療法であった。極めて一般的に用いられる薬剤には以下が含まれる：シクロホスファミド、ヴィンクリスチンおよびプレドニゾン（CVP）；シクロホスファミド、アドリアマイシン、ヴィンクリスチン、プレドニゾン（CHOP）；又はプリン類似体、フルダラビン。ほぼ70から80％の患者が最初の化学療法に応答し、緩解期間は2−3年の規模で続く。最終的には、患者の大半が再発する。抗CD20抗体、リツキシマブの発見および臨床使用は、応答および生存率の甚だしい改善を提供した。ほとんどの患者の従来の治療スタンダードは、リツキシマブ＋CHOP（R-CHOP）又はリツキシマブ＋CVP（R-CVP）である。インターフェロンは、アルキル化剤と併用したNHL初期治療について承認されているが、米国で使用は限定されている。 The clinical course of NHL can be highly variable. The main determinant of the clinical course is the histological subtype. Most NHL inactive forms are considered incurable diseases. Patients will initially respond to either chemotherapy or antibody therapy and most will relapse. Studies to date have not shown improved survival with early intervention. In asymptomatic patients, it is acceptable to “wait for observation” until the patient becomes symptomatic or the disease pace seems to be accelerating. Over time, the disease can turn into a more aggressive histological finding. Average survival is 8 to 10 years, and inactive patients often receive more than two treatments during the treatment period. The first treatment for inactive NHL patients with manifestations has historically been combination chemotherapy. Very commonly used drugs include: cyclophosphamide, vincristine and prednisone (CVP); cyclophosphamide, adriamycin, vincristine, prednisone (CHOP); or purine analog, fludarabine. Nearly 70 to 80% of patients respond to initial chemotherapy, and the remission period lasts on a 2-3 year scale. Eventually, most patients will relapse. The discovery and clinical use of the anti-CD20 antibody, rituximab, provided a significant improvement in response and survival. The conventional treatment standard for most patients is rituximab + CHOP (R-CHOP) or rituximab + CVP (R-CVP). Interferon is approved for initial treatment of NHL in combination with alkylating agents, but has limited use in the United States.

リツキシマブ療法はいくつかの型のNHLで有効であることが示され、これまでのところ不活性NHL（ろ胞性リンパ腫）および攻撃型NHL（びまん性大型B細胞リンパ腫）の両方に対する最善の治療として承認されている。しかしながら、抗CD20モノクローナル抗体（mAb）には以下を含む重大な制限が存在する：一次性耐性（再発した不活性型患者では50％が応答）、後天的耐性（再治療については50％応答率）、完全応答は稀であること（再発集団の完全応答率は2％）、および持続的再発パターン。結局、多くのB細胞がCD20を発現せず、したがって多くのB細胞障害が、抗CD20抗体療法では治療不能である。CD20以外の抗原に対する抗体が、抗CD20耐性を克服しえるか又は抗CD20療法を増強しえる、抗リンパ腫作用を有するかもしれない。
NHLの他に、B細胞の脱調整により生じるくつかのタイプの白血病が存在する。慢性リンパ球性白血病（“慢性リンパ性白血病”又は“CLC”としても知られている）は、Bリンパ球の異常な蓄積によって引き起こされる成人白血病の一タイプである。CLLでは、悪性リンパ球は正常で成熟しているように見えるかもしれないが、それらは感染に有効に対処できない。CLLは成人の白血病のもっとも一般的な型である。男性は女性よりも2倍CLLを発症しやすい。しかしながら、重要なリスク因子は年齢である。75％を越える新規症例が50歳を超える患者で診断されている。毎年、10,000人を越える症例が診断され、死亡率はほぼ5000人/年である（アメリカ癌学会（2006）；およびSEER癌統計便覧）。 Rituximab therapy has been shown to be effective with several types of NHL and so far approved as the best treatment for both inactive NHL (follicular lymphoma) and aggressive NHL (diffuse large B-cell lymphoma) Has been. However, anti-CD20 monoclonal antibodies (mAbs) have significant limitations including: primary resistance (50% responding in relapsed inactive patients), acquired resistance (50% response rate for retreatment) ), Complete response is rare (2% complete response rate), and persistent recurrence pattern. Eventually, many B cells do not express CD20 and thus many B cell disorders are not treatable with anti-CD20 antibody therapy. Antibodies against antigens other than CD20 may have anti-lymphoma effects that can overcome anti-CD20 resistance or enhance anti-CD20 therapy.
In addition to NHL, there are several types of leukemia that result from B cell deregulation. Chronic lymphocytic leukemia (also known as “chronic lymphocytic leukemia” or “CLC”) is a type of adult leukemia caused by abnormal accumulation of B lymphocytes. In CLL, malignant lymphocytes may appear normal and mature, but they cannot cope effectively with infection. CLL is the most common type of adult leukemia. Men are twice as likely to develop CLL than women. However, an important risk factor is age. Over 75% of new cases have been diagnosed in patients over 50 years of age. Each year, more than 10,000 cases are diagnosed and the mortality rate is approximately 5000 people / year (American Cancer Society (2006); and SEER Cancer Statistics Handbook).

CLLは不治の疾患であるが、ほとんどの症例でゆっくりと進行する。CLLに罹患している多くの人々が正常で活動的な生活を何年間も送っている。その緩徐な発症のために、初期CLLは一般的には治療されない。なぜならば、初期CLLの介入は生存期間又は生活の質を改善しないと考えられているからである。むしろ、症状は長期にわたって監視される。初期CLL治療は、疾患の厳密な診断および進行に応じて変動する。CLL治療に用いられる多数の薬剤が存在する。初期治療としてクロラムブシルよりもプリン類似体フルダラビンは優れた応答率を示したが、フルダラビンの初期使用が全体的な生存を改善するという証拠は存在しない。例えばフルダラビンとシクロホスファミドとの組合せ療法、FCR（フルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ）およびCHOPによる治療計画は、新規に診断されたCLLおよび再発CLLの療法で有効である。同種異系骨髄（幹細胞）移植は、そのリスクのために最善の治療としては稀にしか用いられない。
“難治性”CLLは、治療に対してもはや良好に応答しない疾患である。この症例では、より攻撃的な治療方法（骨髄（幹細胞）移植を含む）が考慮される。モノクローナル抗体アレムツズマブ（CD52に対して作成）は、難治性の骨髄系疾患に罹患した患者で用いられる。
また別のタイプの白血病は急性リンパ芽球性白血病（ALL）（急性リンパ球性白血病としても知られている）である。ALLは、骨髄中での悪性で未成熟な白血球細胞（リンパ芽球としてもまた知られている）の過剰生産および持続的増殖を特徴とする。“急性”とは、循環リンパ球の未分化で未成熟状態（“芽細胞”）を意味し、もし治療されなければ数週間から数ヶ月の余命で疾患が急速に進行することを意味する。ALLは、4−5歳を発症率のピークとし小児でもっとも一般的である。12−16歳の小児は、他の者よりALLでより死亡しやすい。これまでのところ、少なくとも80％の小児のALLが治癒可能と考えられている。毎年4000症例未満が診断され、死亡率はほぼ1500人/年である（アメリカ癌学会（2006）；およびSEER癌統計便覧）。 CLL is an incurable disease but progresses slowly in most cases. Many people with CLL have lived normal and active lives for years. Because of its slow onset, early CLL is generally not treated. This is because early CLL intervention is believed not to improve survival or quality of life. Rather, symptoms are monitored over time. Initial CLL treatment varies according to the exact diagnosis and progression of the disease. There are a number of drugs that are used to treat CLL. Although the purine analog fludarabine showed better response rates than chlorambucil as an initial treatment, there is no evidence that initial use of fludarabine improves overall survival. For example, fludarabine and cyclophosphamide combination therapy, FCR (fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab) and CHOP treatment regimens are effective in the treatment of newly diagnosed and recurrent CLL. Allogeneic bone marrow (stem cell) transplantation is rarely used as the best treatment because of its risk.
“Refractory” CLL is a disease that no longer responds well to treatment. In this case, more aggressive treatment methods (including bone marrow (stem cell) transplantation) are considered. The monoclonal antibody alemtuzumab (made against CD52) is used in patients with refractory myeloid disease.
Another type of leukemia is acute lymphoblastic leukemia (ALL) (also known as acute lymphocytic leukemia). ALL is characterized by overproduction and sustained proliferation of malignant immature white blood cells (also known as lymphoblasts) in the bone marrow. “Acute” means an undifferentiated and immature state of circulating lymphocytes (“blasts”), and if not treated, the disease progresses rapidly with a life expectancy of weeks to months. ALL is most common in children with a peak incidence of 4-5 years of age. Children aged 12-16 are more likely to die from ALL than others. So far, at least 80% of childhood ALL is considered curable. Each year, less than 4000 cases are diagnosed and the mortality rate is approximately 1500 people / year (American Cancer Society (2006); and SEER Cancer Statistics Handbook).

多発性ミエローマ（MM）は、最終分化プラズマ細胞を含むB細胞悪性疾患である。この疾患は引き続き骨および骨髄を攻撃し、その結果、骨格系全体に多発性腫瘍および病巣を生じる。前記は、米国では二番目に多い血液学的悪性疾患であり、米国だけでほぼ55,000人が罹患している。多発性ミエローマの年間発症率は100,000人に3から4症例であり、成人でもっとも多い骨腫瘍となっている。化学療法剤の組み合わせを含む従来の治療プロトコルはわずかに5%の完全緩解率をもたらし、平均生存は診断時点からほぼ36−48ヶ月である。治療方針は、低い細胞増殖速度および多剤耐性によって制限される。したがって、プラズマ細胞の表面抗原を標的とする治療用抗体を用いるまた別の治療方針は極めて有利であろう。
自己免疫は、液性および／または細胞媒介免疫メカニズムを含む自己寛容の崩壊から生じる。中枢および／または抹消の寛容不全の結果は、自己反応性B細胞およびT細胞の生存および活性化を含む。自己免疫疾患の例には、例えば慢性関節リウマチ（RA）、全身性紅斑性狼瘡（SLE又は狼瘡）、多発性硬化症（MS）、シェーグレン症候群、および特発性血小板減少性紫斑病（ITP）が含まれる。ほとんどの自己免疫疾患の病因は、自己抗原に対する自己抗体の産生と対をなし、多様な随伴病変をもたらす。自己抗体は、ナイーブB又はメモリーB細胞に由来する最終分化プラズマ細胞によって産生される。さらにまた、B細胞は、ヘルパーT細胞と相互作用しこれを刺激することができる抗原提示細胞（APC）として、自己免疫の病理に対し他の作用を有し、自己免疫応答サイクルをさらに刺激することができる。B細胞の枯渇は、自己抗体の産生に直接的な強い影響を与えることができる。実際のところ、B細胞枯渇療法（例えばリツキシマブ）によるRAおよびSLEの治療は、両疾患クラスについて臨床的に有益であることが示された（Edwards & Cambridge, Nat Rev Immunol 2006；Dass et al. Future Rheumatol 2006；Martin & Chan, Annu Rev Immuno 2006、前記文献は各々参照によりその全体が本明細書に含まれる）。 Multiple myeloma (MM) is a B cell malignancy involving terminally differentiated plasma cells. The disease continues to attack bone and bone marrow, resulting in multiple tumors and lesions throughout the skeletal system. It is the second most common hematological malignancy in the United States, affecting almost 55,000 people in the United States alone. The annual incidence of multiple myeloma is 3 to 4 cases per 100,000 people, making it the most common bone tumor in adults. Conventional treatment protocols involving combinations of chemotherapeutic agents result in a complete remission rate of only 5%, with an average survival of approximately 36-48 months from the time of diagnosis. Treatment strategies are limited by low cell growth rates and multidrug resistance. Thus, another therapeutic strategy using therapeutic antibodies that target plasma cell surface antigens would be highly advantageous.
Autoimmunity results from the breakdown of self tolerance, including humoral and / or cell-mediated immune mechanisms. The consequences of central and / or peripheral intolerance include the survival and activation of autoreactive B cells and T cells. Examples of autoimmune diseases include, for example, rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE or lupus), multiple sclerosis (MS), Sjogren's syndrome, and idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). included. The pathogenesis of most autoimmune diseases is paired with the production of autoantibodies against self antigens, resulting in a variety of associated lesions. Autoantibodies are produced by terminally differentiated plasma cells derived from naive B or memory B cells. Furthermore, B cells, as antigen presenting cells (APCs) that can interact with and stimulate helper T cells, have other effects on autoimmune pathology and further stimulate the autoimmune response cycle be able to. B cell depletion can have a strong direct impact on autoantibody production. In fact, treatment of RA and SLE with B cell depletion therapy (eg rituximab) has been shown to be clinically beneficial for both disease classes (Edwards & Cambridge, Nat Rev Immunol 2006; Dass et al. Future Rheumatol 2006; Martin & Chan, Annu Rev Immuno 2006, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety).

B細胞障害および固形腫瘍の治療のための治療薬としての抗体
モノクローナル抗体は、B細胞障害の治療に用いることができる治療用タンパク質の一クラスである。抗体の好ましい多数の特性（標的に対する特異性、免疫のエフェクターメカニズムを媒介する能力および長い血中半減期を含むが、ただしこれらに限定されない）は、抗体を強力な治療薬にする。本発明は、B細胞および固形腫瘍抗原CD40に対する抗体について述べる。
CD40：CD40抗原は腫瘍壊死因子レセプター（TNF-R）ファミリーに属する細胞表面糖タンパク質であり、全ての成熟B細胞の表面、大半の成熟B細胞悪性疾患、いくつかの初期のB細胞急性リンパ球性白血病、および全ての固形腫瘍のほぼ70%で発現される。CD40はまた、樹状細胞、単球、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、および多くのヒトの固形腫瘍（メラノーマおよび癌腫を含む）で発現される。CD40を介するシグナリングは、抗原提示細胞（B細胞および樹状細胞を含む）を活性化させる。CD154（CD40の天然のリガンドである）は、活性化Tリンパ球の表面で発現され、免疫応答に向けてのT細胞始動の重要な成分を提供する。結果として、CD40アゴニストは、多くの腫瘍関連抗原に対抗する免疫応答を始動させる。これらの特性のために、さらにB細胞悪性疾患および固形腫瘍でのその発現のために、治療用抗CD40抗体は疾患の治療に極めて有用であろう。
CD40は、TNFR-1、TNFR-2、CD30、CD27、4-1BB、OX40およびFasを含むTNFRファミリーの50kdのI型トランスメンブレンタンパク質である。CD40コード遺伝子は、ヒトでは染色体20に、マウスでは染色体2に存在する。種々の細胞タイプにおけるその免疫調節機能との相関性から、CD40は、B細胞、DC、単球およびマクロファージ、甲状腺上皮細胞、内皮細胞、マスト細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞で広く発現される。CD40リガンド（CD154）は、II型トランスメンブレンタンパク質（見かけの分子量は32から33kd）として産生される。前記はTNFファミリー（TMF-α、CD153、CD70、4-1BBL、OX40LおよびFasLもまた前記に含まれる）のメンバーである。CD154の可溶型は31または18-kdのタンパク質として存在し、両者は膜結合CD154の生物学的活性を保持し、遠位のCD40+細胞に対するサイトカインとして潜在的機能を有することができる。CD154コード遺伝子は、ヒトおよびマウスのX染色体に存在する。CD154遺伝子の変異は、ヒトでX-連鎖過剰免疫グロブリン（Ig）M症候群をもたらす。CD154発現（初期には、主としてCD4系列の活性化T細胞に限定されると考えられていた）は、今はCD8+T細胞、B細胞、好酸球、マスト細胞、好塩基球、DC、および他の細胞タイプで確認されている。最近では、血小板が同様にCD154を発現することが見出された。 Antibody monoclonal antibodies as therapeutic agents for the treatment of B cell disorders and solid tumors are a class of therapeutic proteins that can be used to treat B cell disorders. Numerous favorable properties of antibodies, including but not limited to specificity for the target, ability to mediate immune effector mechanisms and long blood half-lives, make antibodies potent therapeutics. The present invention describes antibodies against B cells and solid tumor antigen CD40.
CD40 : The CD40 antigen is a cell surface glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor receptor (TNF-R) family, the surface of all mature B cells, most mature B cell malignancies, and some early B cell acute lymphocytes It is expressed in sex leukemia and almost 70% of all solid tumors. CD40 is also expressed on dendritic cells, monocytes, endothelial cells, epithelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells, and many human solid tumors, including melanomas and carcinomas. Signaling through CD40 activates antigen presenting cells, including B cells and dendritic cells. CD154, which is the natural ligand for CD40, is expressed on the surface of activated T lymphocytes and provides an important component of T cell triggering for an immune response. As a result, CD40 agonists trigger an immune response against many tumor-associated antigens. Because of these properties, and because of its expression in B cell malignancies and solid tumors, therapeutic anti-CD40 antibodies would be very useful in the treatment of the disease.
CD40 is a 50 kd type I transmembrane protein of the TNFR family, including TNFR-1, TNFR-2, CD30, CD27, 4-1BB, OX40 and Fas. The CD40 encoding gene is present on chromosome 20 in humans and on chromosome 2 in mice. CD40 is widely expressed on B cells, DCs, monocytes and macrophages, thyroid epithelial cells, endothelial cells, mast cells, fibroblasts, and smooth muscle cells because of its correlation with its immunoregulatory function in various cell types The CD40 ligand (CD154) is produced as a type II transmembrane protein (apparent molecular weight of 32 to 33 kd). The above are members of the TNF family (TMF-α, CD153, CD70, 4-1BBL, OX40L and FasL are also included). Soluble forms of CD154 exist as 31 or 18-kd proteins, both of which retain the biological activity of membrane-bound CD154 and can have potential functions as cytokines to distal CD40 + cells. The CD154 coding gene is present on the X chromosome of humans and mice. Mutations in the CD154 gene result in X-linked hyperimmunoglobulin (Ig) M syndrome in humans. CD154 expression (initially thought to be mainly restricted to CD4 lineage activated T cells) is now CD8 + T cells, B cells, eosinophils, mast cells, basophils, DCs, And other cell types have been identified. Recently, platelets were found to express CD154 as well.

TおよびB細胞との間の分子相互作用として最初に確認されたように、CD154-CD40経路は、胸腺依存液性応答の調節に重要な役割を果たす。実際のところ、X-連鎖過剰IgM症候群の患者は、IgMレベルは上昇するが、IgA、IgG、およびIgEのレベルは低く；胚中心を欠き；胸腺依存液性応答を高めることができない。マウスでは、CD154-CD40シグナリングは、B細胞増殖、Ig産生、Igクラススィッチング、アポトーシスからのB細胞の救済、胚中心の形成、B細胞メモリーの形成、ならびにB細胞のクローン発現および枯渇の調節で必須であることが示された。
休止期のAPCの大半が低レベルの共同刺激分子、例えばCD80またはCD86を発現する。T細胞由来のCD154によるCD40の結合は、APCを活性化して共同刺激分子の発現を増強する重要なステップであり、前記によってAPCは完全にT細胞を活性化する能力を有することができる。前炎症サイトカイン（DCによるインターロイキン（IL）12を含む）の誘発はこのAPC相互作用のまた別の所産であり、前記は、TH1-型の免疫応答の発達に必須である。したがって、CD154-CD40経路の遮断はAPC活性化の欠如を生じ、前記は明白にT細胞活性化の全体的不全をもたらすであろう。しかしながら、T細胞に対するこの間接的な作用は、CD154遮断後の非効率的なT細胞応答の唯一の理由ではない。CD154-CD40相互作用は二方向性であることが今や理解された。T細胞へのCD154のin vitro結合はサイトカイン産生（特にTH2型）を顕著に増強するので、CD4 T細胞でのCD54のin vivo架橋は、ヘルパー機能および胚中心の形成に寄与する。CD154-CD40相互作用は、細胞傷害性CD8+ T細胞の活性化におけるCD4支援の分子的基礎を提供し、DCはこの2つの細胞タイプ間の架橋として役立つ。この3細胞の相互作用の分子的詳細は完全には解明されていないが、今や活性化CD4+ T細胞はCD154-CD40を介してDCを刺激し、DCに続いてCD8+ T細胞を活性化し細胞傷害性エフェクターに分化させることが明らかになった。 As initially confirmed as a molecular interaction between T and B cells, the CD154-CD40 pathway plays an important role in the regulation of the thymus-dependent humoral response. In fact, patients with X-linked excess IgM syndrome have elevated IgM levels but low levels of IgA, IgG, and IgE; lack germinal centers; fail to enhance thymic dependent humoral responses. In mice, CD154-CD40 signaling is the regulation of B cell proliferation, Ig production, Ig class switching, B cell rescue from apoptosis, germinal center formation, B cell memory formation, and regulation of B cell clonal expression and depletion It was shown to be essential.
Most quiescent APCs express low levels of costimulatory molecules such as CD80 or CD86. Binding of CD40 by T cell-derived CD154 is an important step in activating APC to enhance the expression of costimulatory molecules, which allows APC to have the ability to fully activate T cells. Induction of pro-inflammatory cytokines (including interleukin (IL) 12 by DC) is another product of this APC interaction, which is essential for the development of TH1-type immune responses. Thus, blockade of the CD154-CD40 pathway results in a lack of APC activation, which will obviously lead to an overall failure of T cell activation. However, this indirect effect on T cells is not the only reason for an inefficient T cell response after CD154 blockade. It has now been understood that the CD154-CD40 interaction is bidirectional. Since in vitro binding of CD154 to T cells significantly enhances cytokine production (particularly the TH2 type), in vivo cross-linking of CD54 on CD4 T cells contributes to helper function and germinal center formation. The CD154-CD40 interaction provides a CD4 assisted molecular basis in the activation of cytotoxic CD8 + T cells, and DCs serve as a bridge between the two cell types. Although the molecular details of these three-cell interactions have not been fully elucidated, activated CD4 + T cells now stimulate DC through CD154-CD40, which in turn activates CD8 + T cells and cytotoxicity It became clear to differentiate into sex effector.

CD40は、多くの非造血細胞で、特に前炎症条件下で発現される。血管内皮細胞上でのCD40の架橋はこれらの細胞を活性化させ、粘着分子（例えばCD62E、CD106、CD54および）、ならびにケモカインおよびサイトカイン（IL-6およびIL-8を含む）の発現を増加させる。前記は、炎症部位での活性化T細胞の溢出および蓄積を促進することができる。活性化T細胞に加えて、血小板は、内皮細胞活性化のまた別の供給源を提供するかもしれない、実際のところ、トロンビン活性化血小板は急速にCD154発現をアップレギュレートし、前記は続いて内皮細胞上のCD40と相互作用し、したがってT細胞とは別個に、内皮の活性化または損傷から生じる化学走性作用に寄与する。前記は、いくつかのCD154抗体で処置された霊長類および人間で近年検出された予想外の血栓塞栓性合併症に少なくとも部分的に影響を与えた可能性がある。
CD154/CD40シグナリングはまた、免疫および炎症に対して決定的に重要である。明らかになってきた臨床像は、CD154を介するレセプターCD40のライゲーション（三量体型がもっとも強力である）は2つの態様で機能することを示唆した。CD154は、生理学的プロセス（例えばT細胞媒介エフェクター機能および適切な宿主防衛に必要な一般的免疫応答）を調節するが、それらは、前炎症媒介物質（例えばサイトカイン、粘着分子、およびマトリックス分解活性、それらは全て慢性炎症疾患（例えば自己免疫異常、関節炎、アテローム性硬化症）および癌の病理と密接に関連する）の発現もまた始動させる。したがって、CD40/CD154相互作用は、これらの疾患のための治療標的として進歩し、それによって対立する2つの戦略（CD40シグナリングの妨害と増強）が有益な成果を求めて探索されている。T細胞依存液性免疫におけるそれらの重大な役割の他に、CD40-CD40L相互作用は、したがって自己免疫疾患（例えばアテローム性硬化症、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、対宿主移植片病、実験的自己免疫脳炎および慢性関節リウマチ）に関与している。 CD40 is expressed on many non-hematopoietic cells, particularly under pro-inflammatory conditions. Cross-linking of CD40 on vascular endothelial cells activates these cells and increases the expression of adhesion molecules such as CD62E, CD106, CD54 and chemokines and cytokines (including IL-6 and IL-8) . The above can promote the overflow and accumulation of activated T cells at the site of inflammation. In addition to activated T cells, platelets may provide another source of endothelial cell activation. In fact, thrombin activated platelets rapidly upregulate CD154 expression, which continues Interacts with CD40 on endothelial cells, and thus contributes to chemotaxis resulting from endothelial activation or damage separately from T cells. This may have at least partially influenced the unexpected thromboembolic complications recently detected in primates and humans treated with several CD154 antibodies.
CD154 / CD40 signaling is also critical for immunity and inflammation. The emerging clinical picture suggested that ligation of the receptor CD40 via CD154 (trimeric form is most potent) functions in two ways. CD154 regulates physiological processes such as T cell mediated effector functions and general immune responses required for proper host defense, but they are pro-inflammatory mediators such as cytokines, adhesion molecules, and matrix degrading activity, They all also trigger the onset of chronic inflammatory diseases (eg closely related to autoimmune disorders, arthritis, atherosclerosis) and cancer pathology. Thus, the CD40 / CD154 interaction has progressed as a therapeutic target for these diseases, whereby two opposing strategies (interference and enhancement of CD40 signaling) are being sought for beneficial outcomes. In addition to their critical role in T cell-dependent humoral immunity, CD40-CD40L interactions are therefore implicated in autoimmune diseases such as atherosclerosis, asthma, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, versus host transplantation It is involved in migraine, experimental autoimmune encephalitis and rheumatoid arthritis.

抗体のFc最適化は臨床成果の改善を提供することができる
CD40に対して作成した抗体の臨床的成功は、それらの潜在的作用メカニズムに極めて左右されるであろう。抗体が細胞性作用を媒介する以下を含む可能な多数のメカニズムが存在する：必要とされる増殖経路の遮断を介する抗増殖、アポトーシスをもたらす細胞内シグナリング、レセプターのダウンレギュレーションおよび／または消長の増強、補体依存細胞傷害性（CDC）、抗体依存細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、抗体依存細胞媒介性食作用（ADCP）および適応免疫応答の促進（Cragg et al. 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547；Glennie et al. 2000, Immunol Today 21:403-410、前記文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に含まれる）。抗体の有効性はこれらメカニズムの組合せによる可能性があり、腫瘍に対する臨床治療におけるそれらの相対的な重要性は癌によって左右されるように思われる。
いくつかの抗体の活性に対するFcγR-媒介エフェクター機能の重要さが、マウスにおいて（Clynes et al. 1998, Proc Natl Acad Sci USA, 95:652-656；Clynes et al. 2000, Nat Med 6:443-446、前記文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に含まれる）、および、人間での臨床有効性とFcγRIIIaの高親和性（V158）または低親和性（F158）多形性型のそれらのアロタイプとの間で観察された相関性から明示された（Cartron et al. 2002, Blood 99:754-758；Weng & Lavy, 2003, J Clin Oncol 21:3940-3947、前記文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に含まれる）。これらのデータを総合すれば、ある種のFcγRとの結合について最適化された抗体はより良好にエフェクター機能を媒介し、それによって患者でより良好に標的細胞を破壊できることを示唆している。したがって、抗体の抗腫瘍効力を増強する有望な手段は、細胞傷害性エフェクター機能（例えばADCC、ADCPおよびCDC）を媒介するそれらの能力の増強による。さらにまた、抗体が腫瘍細胞上のその標的と結合するときに生じえる増殖阻害またはアポトーシスシグナリングを介して、抗体は抗腫瘍メカニズムを媒介することができる。そのようなシグナリングは、FcγRを介して免疫細胞と結合した抗体が腫瘍細胞に提示されるときに増強される可能性がある。したがって、FcγRに対する抗体の親和性の増大は、抗増殖作用の増強をもたらすかもしれない。 Antibody Fc optimization can provide improved clinical outcomes
The clinical success of antibodies raised against CD40 will depend very much on their potential mechanism of action. There are a number of possible mechanisms by which antibodies mediate cellular effects including: anti-proliferation through blocking the required growth pathway, intracellular signaling leading to apoptosis, receptor down-regulation and / or enhanced fate. Complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) and promoting adaptive immune responses (Cragg et al. 1999, Curr Opin Immunol 11: 541-547; Glennie et al. 2000, Immunol Today 21: 403-410, each of which is incorporated herein by reference in its entirety). The effectiveness of antibodies may be due to a combination of these mechanisms, and their relative importance in clinical treatment for tumors appears to depend on cancer.
The importance of FcγR-mediated effector function for the activity of several antibodies has been demonstrated in mice (Clynes et al. 1998, Proc Natl Acad Sci USA, 95: 652-656; Clynes et al. 2000, Nat Med 6: 443- 446, each of which is incorporated herein by reference in its entirety), and clinical efficacy in humans and those of the high affinity (V158) or low affinity (F158) polymorphic forms of FcγRIIIa Clarified from the observed correlation between allotypes (Cartron et al. 2002, Blood 99: 754-758; Weng & Lavy, 2003, J Clin Oncol 21: 3940-3947, each of which is referred to by reference) The entirety of which is included herein). Taken together, these data suggest that antibodies optimized for binding to certain FcγRs can better mediate effector function and thereby better destroy target cells in patients. Thus, a promising means to enhance the anti-tumor efficacy of antibodies is by enhancing their ability to mediate cytotoxic effector functions (eg, ADCC, ADCP and CDC). Furthermore, antibodies can mediate anti-tumor mechanisms through growth inhibition or apoptosis signaling that can occur when an antibody binds to its target on tumor cells. Such signaling may be enhanced when antibodies bound to immune cells via FcγR are presented to tumor cells. Thus, increasing the affinity of an antibody for FcγR may result in enhanced antiproliferative effects.

FcγRとの結合が選択的に増強されエフェクター機能が増強された抗体の改変でいくつかの成功が得られた。エフェクター機能の最適化を目的とする抗体の操作は、アミノ酸の改変（例えばUSSN10/672,280およびUSSN11/124,620ならびにそれらの中に引用された参考文献を参照されたい、前記文献はそれぞれ参照により本明細書にその全体が含まれる）および糖型の操作（例えば以下を参照されたい：Umana et al. 1999, Nat Biotechnol 17:176-180；Shinkawa et al. 2003, J Biol Chem 278:3466-3473；Yamane-Ohnuki et al. 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(5):614-621、前記文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に含まれる）を用いて達成された。
残念なことに、ある標的抗原に対してどの作用メカニズムが最適でありえるかは、先験的には理解されていない。さらにまた、どの抗体が、標的細胞に対してある作用メカニズムを媒介できるかも理解されていない。いくつかの事例では、抗体活性の欠如（Fv媒介であれFc媒介であれ）は、そのような活性を媒介するには貧弱な標的抗原上のエピトープの標的誘導に起因するかもしれない。他の事例では、標的エピトープは所望されるFv-媒介またはFc-媒介活性に適切であるとしても、親和性（抗原に対するFv領域の親和性またはFcレセプターに対するFc領域の親和性）がなお不十分であるかもしれない。この問題に取り組むため、本発明は、最適化されたFv-媒介およびFc-媒介活性を提供する抗CD40抗体の改変について述べる。
本発明をより完全に理解できるように、下記にいくつかの定義を示す。そのような定義は文法上の同等物も包含することが意図される。
本明細書で用いられる“ADCC”または“抗体依存細胞媒介性細胞傷害”とは、FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて前記標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。
本明細書で用いられる、“ADCP”又は“抗体依存細胞媒介性食作用”とは、FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて前記標的細胞に対する食作用を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。
本明細書で用いられる“アミノ酸”および“アミノ酸実体”とは、特定の規定された位置に存在しえる、天然に存在する20のアミノ酸の1つまたは任意の非天然アナローグを意味する。したがって、本明細書で用いられる“アミノ酸”は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考えられる。“アミノ酸”はまた、イミノ酸残基、例えばプロリンおよびヒドロキシプロリンを含む。側鎖は（R）又は（S）立体配置のどちらでもよい。ある実施態様では、アミノ酸は（S）又はL-立体配置で存在する。天然には存在しない側鎖が用いられる場合は、非アミノ酸置換基を、例えばin vivo分解を防ぐために又は前記分解を遅らせるために用いることができる。 Some success has been achieved in modifying antibodies with selectively enhanced FcγR binding and enhanced effector function. Antibody manipulations aimed at optimizing effector function are described in amino acid modifications (eg, USSN 10 / 672,280 and USSN 11 / 124,620 and references cited therein, each of which is incorporated herein by reference). ) And glycoform manipulation (see, eg, Umana et al. 1999, Nat Biotechnol 17: 176-180; Shinkawa et al. 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473; Yamane -Ohnuki et al. 2004, Biotechnology and Bioengineering 87 (5): 614-621, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety.
Unfortunately, it is not understood a priori which mechanism of action may be optimal for a given target antigen. Furthermore, it is not understood which antibodies can mediate a mechanism of action on target cells. In some cases, the lack of antibody activity (whether Fv-mediated or Fc-mediated) may result from targeted induction of epitopes on target antigens that are poor to mediate such activity. In other cases, the target epitope is still insufficient in affinity (affinity of Fv region for antigen or Fc region for Fc receptor) even though it is suitable for the desired Fv-mediated or Fc-mediated activity May be. To address this issue, the present invention describes the modification of anti-CD40 antibodies that provide optimized Fv-mediated and Fc-mediated activities.
In order that the present invention may be more fully understood, some definitions are set forth below. Such definitions are intended to encompass grammatical equivalents.
As used herein, “ADCC” or “antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity” refers to non-specific cytotoxic cells expressing FcγR that recognize a bound antibody on a target cell, followed by By cell-mediated reaction that causes lysis.
As used herein, “ADCP” or “antibody-dependent cell-mediated phagocytosis” refers to non-specific cytotoxic cells that express FcγR recognize a bound antibody on a target cell, followed by said target cell Means a cell-mediated reaction that causes phagocytosis to
As used herein, “amino acid” and “amino acid entity” means one of the 20 naturally occurring amino acids or any non-natural analog that may be present in a specific defined position. Thus, “amino acid” as used herein refers to both naturally occurring and synthetic amino acids. For example, homophenylalanine, citrulline, and norleucine are considered amino acids for the purposes of the present invention. “Amino acid” also includes imino acid residues such as proline and hydroxyproline. The side chain may have either (R) or (S) configuration. In certain embodiments, the amino acid is present in the (S) or L-configuration. If non-naturally occurring side chains are used, non-amino acid substituents can be used, for example, to prevent in vivo degradation or to delay the degradation.

本明細書で用いられる“抗体”とは、認知されている免疫グロブリン遺伝子の全部または部分によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドから成るタンパク質を意味する。認知されている、例えばヒトの免疫グロブリン遺伝子には以下が含まれる：カッパ（κ）、ラムダ（λ）、および重鎖遺伝子座（前記は一緒になって無数の可変領域遺伝子を構成する）、ならびに定常領域遺伝子ミュー（υ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（σ）およびアルファ（α）（前記はそれぞれIgM、IgD、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4）、IgE、およびIgA（IgA1およびIgA2）アイソタイプをコードする）。本明細書では抗体は完全長抗体および抗体フラグメントを含むことを意図し、さらに任意の生物に由来する天然の抗体、操作された抗体、または、実験的、治療的もしくは他の目的のために組換えにより生成された抗体に適用されえる。
本明細書で用いられる“B細胞”又は“Bリンパ球”とは、骨髄で発達し、血液およびリンパ中を循環しさらに液性免疫を提供するリンパ球タイプを意味する。B細胞は遊離抗原分子を認識し、さらに抗原を不活化する免疫グロブリン（抗体）を分泌するプラズマ細胞に分化または成熟する。そのような抗原と後に遭遇する時に特異的な免疫グロブリン（抗体）を産生するメモリー細胞もまた生成される。B細胞はまた、ランゲルハンス小島の“ベータ細胞”としても知られている。
本明細書で用いられる“B細胞抗原”又は“B細胞マーカー”とは、B細胞上で発現される任意のタンパク質を意味する。本発明のB細胞マーカーにはCD40が含まれる。
本明細書で用いられる“CD40”は、CD40と称される遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。CD40はまた、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー5（TNFRSF5）、CD40Lレセプター、CD154レセプター、B細胞表面抗原CD40、CDw40、およびBp50としても知られている。ヒトCD40は、Entrez Geneでは遺伝子ID:958（Maglott et al. 2005, Nucleic Acids Res, 33(データベース版):D54-D58）、およびHUGO（The Human Genome Organisation）遺伝子命名委員会（HGNC）ではHGNC:11919（Wain et al. 2004, Genew:The Human Gene Nomenclature Database, 2004 updates, Nucleic Acids Res, 32(データベース版):D255-7）と称されている。本明細書のCD40の使用は、CD40の全ての公知のまたは未発見の対立遺伝子および多形性型を包含することを意図する。本実験で用いたヒトCD40抗原の配列は図4の配列番号:8で提供されている。 “Antibody” as used herein refers to a protein consisting of one or more polypeptides substantially encoded by all or part of a recognized immunoglobulin gene. Recognized, eg, human immunoglobulin genes include: kappa (κ), lambda (λ), and heavy chain loci (which together form countless variable region genes), And constant region genes mu (υ), delta (δ), gamma (γ), sigma (σ) and alpha (α) (previously IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, respectively), IgE, And IgA (IgA1 and IgA2) isotypes). As used herein, antibodies are intended to include full-length antibodies and antibody fragments, and further include natural antibodies from any organism, engineered antibodies, or experimental, therapeutic or other purposes. It can be applied to antibodies produced by replacement.
As used herein, “B cell” or “B lymphocyte” refers to a lymphocyte type that develops in the bone marrow, circulates in the blood and lymph, and provides humoral immunity. B cells recognize free antigen molecules and differentiate or mature into plasma cells that secrete immunoglobulins (antibodies) that inactivate the antigen. Memory cells that produce specific immunoglobulins (antibodies) when later encountered with such antigens are also generated. B cells are also known as “beta cells” in the islets of Langerhans.
As used herein, “B cell antigen” or “B cell marker” refers to any protein expressed on a B cell. B cell markers of the present invention include CD40.
As used herein, “CD40” means a protein encoded by a gene called CD40. CD40 is also known as tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 (TNFRSF5), CD40L receptor, CD154 receptor, B cell surface antigens CD40, CDw40, and Bp50. Human CD40 is gene ID: 958 (Maglott et al. 2005, Nucleic Acids Res, 33 (database version): D54-D58) in Entrez Gene, and HGNC in HUGO (The Human Genome Organization) gene naming committee (HGNC). : 11919 (Wain et al. 2004, Genew: The Human Gene Nomenclature Database, 2004 updates, Nucleic Acids Res, 32 (database version): D255-7). The use of CD40 herein is intended to encompass all known or undiscovered alleles and polymorphic forms of CD40. The sequence of the human CD40 antigen used in this experiment is provided by SEQ ID NO: 8 in FIG.

本明細書で用いられる“CDC”または“補体依存細胞傷害性”とは、1つ以上の補体タンパク質成分が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす反応を意味する。
本明細書で用いられる抗体の“定常領域”とは、軽鎖または重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の1つによってコードされる抗体の領域を意味する。本明細書で用いられる“定常軽鎖”または“軽鎖定常領域”とは、カッパ（Cκ）またはラムダ（Cλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域を意味する。定常軽鎖は典型的には単一ドメインを含み、本明細書で定義するようにCκまたはCλの108−214位に該当する（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。本明細書で用いられる“定常重鎖”または“重鎖定常領域”とは、それぞれIgM、IgD、IgG、IgA、またはIgEとして抗体のアイソタイプを規定するミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはエプシロンによってコードされる抗体の領域を意味する。完全長のIgG抗体については、定常重鎖は、本明細書に定義するようにCH1ドメインのN-末端からCH3ドメインのC-末端に該当し、したがって118位−447位を含む（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。
本明細書で用いられる“エフェクター機能”とは、抗体のFc領域とFcレセプターまたはリガンドとの相互作用により生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、FcγR-媒介エフェクター機能（例えばADCCおよびADCP）、および補体媒介エフェクター機能（例えばCDC）が含まれる。本明細書で用いられる“エフェクター細胞”は、1つ以上のFcレセプターを発現し、1つ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、B細胞、顆粒大リンパ球（large granular lymphocyte）、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびT細胞が含まれ（ただしこれらに限定されない）、さらにヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含む（ただしこれらに限定されない）任意の生物に由来しえる。
本明細書で用いられる“Fab”又は“Fab領域”は、V_H、CH1、V_HおよびC_L免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Fabは、単離されてあるこの領域、又は完全長抗体もしくは抗体フラグメントの環境内にあるこの領域に適用されえる。 As used herein, “CDC” or “complement dependent cytotoxicity” refers to a reaction in which one or more complement protein components recognize a bound antibody on a target cell and subsequently cause lysis of the target cell. means.
As used herein, “constant region” of an antibody refers to the region of an antibody encoded by one of the light or heavy chain immunoglobulin constant region genes. As used herein, “constant light chain” or “light chain constant region” refers to the region of an antibody encoded by a kappa (Cκ) or lambda (Cλ) light chain. A constant light chain typically comprises a single domain and corresponds to positions 108-214 of Cκ or Cλ as defined herein (where the numbering is according to the EU index). As used herein, “constant heavy chain” or “heavy chain constant region” refers to mu, delta, gamma, alpha, or epsilon that defines the antibody's isotype as IgM, IgD, IgG, IgA, or IgE, respectively. Refers to the region of the antibody that is encoded. For full-length IgG antibodies, the constant heavy chain falls from the N-terminus of the CH1 domain to the C-terminus of the CH3 domain as defined herein, and thus includes positions 118-447 (herein numbered Grant according to EU index).
As used herein, “effector function” refers to a biochemical event that results from the interaction of an antibody Fc region with an Fc receptor or ligand. Effector functions include FcγR-mediated effector functions (eg, ADCC and ADCP), and complement-mediated effector functions (eg, CDC). As used herein, “effector cell” means a cell of the immune system that expresses one or more Fc receptors and mediates one or more effector functions. Effector cells include monocytes, macrophages, neutrophils, dendritic cells, eosinophils, mast cells, platelets, B cells, large granular lymphocytes, Langerhans cells, natural killer (NK) cells, And T cells, including, but not limited to, any organism including but not limited to humans, mice, rats, rabbits and monkeys.
As used herein, “Fab” or “Fab region” means a polypeptide comprising V _H , CH1, V _H and C _L immunoglobulin domains. Fab can be applied to this region that has been isolated or to this region that is within the environment of a full-length antibody or antibody fragment.

本明細書で用いられる、“Fc”又は“Fc領域”は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Fcは、IgA、IgDおよびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインのN末端の可撓性ヒンジに適用される。IgAおよびIgMについては、FcはJ鎖を含むことができる。IgGについては、Fcは、免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3（Cγ2およびCγ3）、ならびにCガンマ1（Cγ1）およびCガンマ2（Cγ2）の間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変動しえるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常は残基C226またはP230からそのカルボキシ末端を含むと定義され、この場合その番号付与は、Kabat記載のEUインデックスにしたがう。Fcは、単離されてあるこの領域、またはFcポリペプチド（例えばある抗体）の環境内に存在するこの領域に適用されえる。本明細書で用いられる“Fcポリペプチド”は、Fc領域の全部又は部分を含むポリペプチドを意味する。Fcポリペプチドには、抗体、Fc融合物、単離Fc、およびFcフラグメントが含まれる。
本明細書で用いられる“Fcガンマレセプター”または“FcγR”は、IgG抗体のFc領域と結合するタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味し、実質的にFcγR遺伝子によってコードされる。ヒトでは、このファミリーには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：FcγRI（CD64）（アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含む）；FcγRII（CD32）（アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含む）；およびFcγRIII（CD16）（アイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）（Jefferies et al. 2002, Immunol Lette 82:57-65、前記文献は参照により本明細書に含まれる）とともに任意の未発見ヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプ。マウスFcγRには、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、およびFcγRIII-2（CD16-2）とともに任意の未発見マウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、ただしこれらに限定されない。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル（ただしこれらに限定されない）を含む任意の生物に由来しえる。 As used herein, “Fc” or “Fc region” means a polypeptide comprising the constant region of an antibody except the first constant region immunoglobulin domain. Thus, Fc applies to the last two constant region immunoglobulin domains of IgA, IgD and IgG, and the last three constant region immunoglobulin domains of IgE and IgM, and the N-terminal flexible hinge of these domains Is done. For IgA and IgM, Fc can include the J chain. For IgG, Fc contains immunoglobulin domains Cgamma2 and Cgamma3 (Cγ2 and Cγ3), and a hinge between Cgamma1 (Cγ1) and Cgamma2 (Cγ2). Although the boundaries of the Fc region may vary, the human IgG heavy chain Fc region is usually defined to include its carboxy terminus from residue C226 or P230, in which case the numbering is according to the EU index as described in Kabat. Fc can be applied to this region that has been isolated, or to this region that exists within the environment of an Fc polypeptide (eg, an antibody). As used herein, “Fc polypeptide” means a polypeptide comprising all or part of the Fc region. Fc polypeptides include antibodies, Fc fusions, isolated Fc, and Fc fragments.
As used herein, “Fc gamma receptor” or “FcγR” refers to any member of the protein family that binds to the Fc region of an IgG antibody and is substantially encoded by the FcγR gene. In humans, this family includes (but is not limited to): FcγRI (CD64) (including isoforms FcγRIa, FcγRIb, and FcγRIc); FcγRII (CD32) (isoforms FcγRIIa (allotypes H131 and R131) Including), FcγRIIb (including FcγRIIb-1 and FcγRIIb-2), and FcγRIIc; and FcγRIII (CD16) (isoform FcγRIIIa (including allotypes V158 and F158) and FcγRIIIb (allotypes FcγRIIIb-NA1 and FcγRIIIb) (Jefferies et al. 2002, Immunol Lette 82: 57-65, which is incorporated herein by reference) and any undiscovered human FcγR or FcγR isoforms or allotypes. (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), and FcγRIII-2 (CD16-2) together with any undiscovered mouse FcγR or FcγR isoform or Allotypes include, but are not limited to, FcγR may be derived from any organism, including but not limited to humans, mice, rats, rabbits, and monkeys.

本明細書で用いられる“Fcリガンド”または“Fcレセプター”は、抗体のFc領域と結合しFc-リガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、例えばポリペプチドを意味する。Fcリガンドには、FcγR、FcRn、C1q、C3、マンナン結合レクチン、マンノースレセプター、スタフィロコッカスプロタインA、ストレプトコッカスプロテインG、およびウイルスFcγRが含まれる（ただしこれらに限定されない）。FcリガンドはまたFcレセプターホモローグ（FcRH）を含み、前記は、FcγRと同種のFcレセプターファミリーである（Davis et al. 2002, Immunological Reviews 190:123-136、前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。Fcリガンドは、Fcと結合する未発見分子を含むことができる。
本明細書で用いられる“IgG”は、認知されている免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる、抗体クラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む。マウスでは、このクラスは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3を含む。本明細書の“免疫グロブリン（Ig）”は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドから成るタンパク質を意味する。免疫グロブリンには抗体が含まれるが、ただしこれに限定されない。免疫グロブリンは多数の構造形態を有しえる。前記には完全長抗体、抗体フラグメントおよび個々の免疫グロブリンドメインが含まれるが、ただしこれらに限定されない。本明細書の“免疫グロブリン（Ig）ドメイン”は、タンパク質構造の分野の業者によって確定された明瞭な構造的実体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Igドメインは、典型的には特徴的なβ-サンドイッチ型折りたたみトポロジーを有する。IgG抗体クラスの公知のIgドメインはV_H、Cγ1、Cγ2、Cγ3、V_L、およびC_Lである。
本明細書の“改変”は、タンパク質、ポリペプチド、抗体又は免疫グロブリンの物理的、化学的又は配列特性の変更を意味する。本発明の改変はアミノ酸改変および糖型改変である。 As used herein, “Fc ligand” or “Fc receptor” refers to any organism-derived molecule that binds to the Fc region of an antibody to form an Fc-ligand complex, eg, a polypeptide. Fc ligands include (but are not limited to) FcγR, FcRn, C1q, C3, mannan-binding lectin, mannose receptor, staphylococcal protain A, streptococcal protein G, and viral FcγR. Fc ligands also include the Fc receptor homologue (FcRH), which is a family of Fc receptors homologous to FcγR (Davis et al. 2002, Immunological Reviews 190: 123-136, which is hereby incorporated by reference in its entirety. Included in the book). Fc ligands can include undiscovered molecules that bind to Fc.
As used herein, “IgG” refers to a polypeptide belonging to the antibody class that is substantially encoded by a recognized immunoglobulin gamma gene. In humans, this class includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. In mice, this class includes IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. As used herein, “immunoglobulin (Ig)” means a protein consisting of one or more polypeptides substantially encoded by immunoglobulin genes. Immunoglobulins include but are not limited to antibodies. Immunoglobulins can have a number of structural forms. Such includes, but is not limited to, full-length antibodies, antibody fragments and individual immunoglobulin domains. By “immunoglobulin (Ig) domain” herein is meant a region of an immunoglobulin that exists as a distinct structural entity as determined by a person skilled in the field of protein structure. Ig domains typically have a characteristic β-sandwich folding topology. Known Ig domains in the IgG class of antibodies are _{V H, Cγ1, Cγ2, Cγ3} , a V _L, and C _L.
“Modification” as used herein means a change in the physical, chemical or sequence properties of a protein, polypeptide, antibody or immunoglobulin. The modifications of the present invention are amino acid modifications and glycotype modifications.

本明細書の“アミノ酸改変”は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書の“アミノ酸置換”または“置換”は、親のポリペプチド配列内の特定の位置のアミノ酸の別のアミノ酸による置き換えを意味する。例えば、置換I132Eは変種ポリペプチド、この事例では定常重鎖変種に該当し、332位のイソロイシンがグルタミン酸で置き換えられている。WT残基は明示されてもされなくてもよい。先の例の場合、332Eはグルタミン酸による332位の置換を表示している。本明細書での目的のために、多重置換は典型的には斜線によって分けられる。例えば、239D／332Eは、置換239Dおよび332Eを含む二重変種に該当する。本明細書で用いられる、“アミノ酸挿入”または“挿入”は、親ポリペプチド配列内の特定の位置におけるアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入-236Gは236位におけるグリシンの挿入を示す。本明細書で用いられる“アミノ酸欠失”または“欠失”は、親ポリペプチド配列内の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。例えば、G236-は236位におけるグリシンの欠失を示す。
本明細書で用いられる“糖型改変”または“改変糖型”または“操作糖型”は、タンパク質（例えば抗体）と共有結合される炭水化物組成物を意味し、この場合、前記炭水化物組成物は親タンパク質のそれとは化学的に異なる。改変糖型は、典型的には異なる炭水化物またはオリゴ糖に適用され、したがって、例えば抗体は改変糖型を含むことができる。また別には、改変糖型は、異なる炭水化物又はオリゴ糖を含む抗体を意味することができる。
本明細書で用いられる“親ポリペプチド”、“親タンパク質”、“前駆体ポリペプチド”または“前駆体タンパク質”は、その後に改変されて変種を生じるポリペプチド、例えば本明細書に記載の少なくとも1つのアミノ酸改変のための鋳型および／または土台として供される任意のポリペプチドを意味する。前記親ポリペプチドは天然に存在するポリペプチドであっても、天然に存在するポリペプチドの変種もしくは操作型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチドそのもの、親ポリペプチドを含む組成物、又は前記をコードするアミノ酸配列に適用されえる。したがって、本明細書で用いられる“親抗体”または“親免疫グロブリン”は、改変されて変種を生じる抗体又は免疫グロブリンを意味する（例えば親抗体には天然に存在するIgの定常領域を含むタンパク質が含まれえる（ただし前記に限定されない））。 As used herein, “amino acid modification” refers to an amino acid substitution, insertion, and / or deletion within a polypeptide sequence. As used herein, “amino acid substitution” or “substitution” refers to the replacement of an amino acid at a particular position within a parent polypeptide sequence by another amino acid. For example, substitution I132E corresponds to a variant polypeptide, in this case a constant heavy chain variant, in which isoleucine at position 332 has been replaced with glutamic acid. The WT residue may or may not be specified. In the previous example, 332E indicates substitution at position 332 with glutamic acid. For purposes herein, multiple substitutions are typically separated by diagonal lines. For example, 239D / 332E corresponds to a double variant containing substitutions 239D and 332E. As used herein, “amino acid insertion” or “insertion” means the addition of an amino acid at a particular position within the parent polypeptide sequence. For example, insertion-236G indicates insertion of glycine at position 236. As used herein, “amino acid deletion” or “deletion” refers to the removal of an amino acid at a particular position within a parent polypeptide sequence. For example, G236- indicates a deletion of glycine at position 236.
As used herein, “glycomodified” or “modified glycoform” or “engineered glycoform” refers to a carbohydrate composition that is covalently linked to a protein (eg, an antibody), wherein the carbohydrate composition is It is chemically different from that of the parent protein. Modified glycoforms typically apply to different carbohydrates or oligosaccharides, and thus, for example, antibodies can include modified glycoforms. Alternatively, modified glycoforms can refer to antibodies that contain different carbohydrates or oligosaccharides.
As used herein, a “parent polypeptide”, “parent protein”, “precursor polypeptide” or “precursor protein” is a polypeptide that is subsequently modified to produce a variant, eg, at least those described herein. It means any polypeptide that serves as a template and / or foundation for one amino acid modification. The parent polypeptide may be a naturally occurring polypeptide or a variant or engineered version of a naturally occurring polypeptide. The parent polypeptide can be applied to the polypeptide itself, a composition comprising the parent polypeptide, or the amino acid sequence that encodes it. Thus, as used herein, “parent antibody” or “parent immunoglobulin” refers to an antibody or immunoglobulin that is modified to produce a variant (eg, a protein that contains a constant region of Ig that is naturally present in the parent antibody). (But not limited to)).

本明細書で用いられる“タンパク質”または“ポリペプチド”は、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を意味し、前記にはタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣体構造物、すなわち“アナローグ”、例えばペプトイドで構成されえる。
本明細書で用いられる“位置”は、タンパク質配列内の場所を意味する。位置は、連続的に、または確立された様式、例えばKabat記載のEUインデックスにしたがって番号付与することができる。対応する位置は、本明細書で概略するように、一般的には他の親配列とのアラインメントを通して決定される。
本明細書で用いられる“残基”は、タンパク質内の位置およびその付随するアミノ酸を意味する。例えば、アスパラギン297（Asn297およびN297とも称される）はヒト抗体IgG1の297位の残基である。
本明細書で用いられる“標的抗原”または“標的”または“抗原”は、ある抗体の可変領域と特異的に結合する分子を意味する。標的抗原は、タンパク質でも炭水化物でも脂質でもまたは他の化合物でもよい。本明細書で用いられる“標的細胞”は、標的抗原を発現する細胞を意味する。
本明細書で用いられる“可変領域”は、それぞれカッパ、ラムダおよび重鎖免疫グロブリンの遺伝子座を構成するVκ、Vλおよび／またはV_H遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる、1つ以上のIgドメインを含む免疫グロブリン領域を意味する。 As used herein, “protein” or “polypeptide” means at least two covalently linked amino acids, including proteins, polypeptides, oligopeptides and peptides. Proteins can be composed of naturally occurring amino acids and peptide bonds, or synthetic peptidomimetic structures, or “analogs”, such as peptoids.
As used herein, “position” means a location within a protein sequence. The positions can be numbered consecutively or according to established formats, for example according to the EU index described in Kabat. Corresponding positions are generally determined through alignment with other parental sequences, as outlined herein.
As used herein, “residue” means a position in a protein and its associated amino acid. For example, asparagine 297 (also referred to as Asn297 and N297) is the residue at position 297 of the human antibody IgG1.
As used herein, “target antigen” or “target” or “antigen” refers to a molecule that specifically binds to the variable region of an antibody. The target antigen may be a protein, carbohydrate, lipid, or other compound. As used herein, “target cell” means a cell that expresses a target antigen.
As used herein, a “variable region” is one or more substantially encoded by any of the Vκ, Vλ, and / or V _H genes that make up the kappa, lambda, and heavy chain immunoglobulin loci, respectively. An immunoglobulin region containing the Ig domain of

本明細書で用いられる“変種タンパク質”、“タンパク質変種”、“変種ポリペプチド”または“ポリペプチド変種”は、少なくとも1つのアミノ酸改変または少なくとも1つの糖型改変のために、親ポリペプチド配列の配列とは異なるポリペプチド配列を意味する。変種ポリペプチドは、ポリペプチドそのもの、前記ポリペプチドを含む組成物、又は前記をコードするアミノ酸配列に適用されえる。ある実施態様では、変種ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸改変、例えば約1つから約10のアミノ酸改変、例えば親ポリペプチドと比較して約1つから約5つのアミノ酸改変を有する。本明細書の変種ポリペプチド配列は、親ポリペプチド配列と少なくとも約80％の相同性、例えば少なくとも約90％の相同性、少なくとも約95％の相同性、等々を有する。したがって、本明細書で用いられる“変種抗体”または“抗体変種”は、少なくとも1つのアミノ酸改変または少なくとも1つ糖型改変のために親抗体配列の配列とは異なる抗体配列を意味する。抗体変種は、抗体ポリペプチドそのもの、前記抗体変種ポリペプチドを含む組成物、又は前記をコードするアミノ酸配列に適用されえる。したがって、本明細書で用いられる“定常重鎖変種”または“定常軽鎖変種”または“Fc変種”は、少なくとも1つのアミノ酸改変または少なくとも１つの糖型改変のために、親配列のそれとは配列が異なる定常重鎖、定常軽鎖またはFc領域ペプチドもしくは配列をそれぞれ意味する。
本明細書の“野生型またはWT”は、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列（対立遺伝子変種を含む）を意味する。WTタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、IgGなどは、意図的には改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
本発明で考察される全ての免疫グロブリン重鎖定常領域の位置については、番号付与はKabat記載のEUインデックスにしたがう（Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda；前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。“Kabat記載のEUインデックス”は、Edelmanら（Biocemistry, 1969, 63:78-85；前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）が記載したヒトIgG1 EU抗体残基の番号付与に該当する。 As used herein, a “variant protein”, “protein variant”, “variant polypeptide” or “polypeptide variant” refers to a parent polypeptide sequence for at least one amino acid modification or at least one glycoform modification. By polypeptide sequence is meant a different polypeptide sequence. Variant polypeptides can be applied to the polypeptide itself, a composition comprising the polypeptide, or the amino acid sequence that encodes it. In certain embodiments, the variant polypeptide has at least one amino acid modification, for example about 1 to about 10 amino acid modifications, for example about 1 to about 5 amino acids compared to the parent polypeptide. Has modifications. The variant polypeptide sequences herein have at least about 80% homology with the parent polypeptide sequence, such as at least about 90% homology, at least about 95% homology, and so on. Thus, a “variant antibody” or “antibody variant” as used herein means an antibody sequence that differs from the sequence of the parent antibody sequence due to at least one amino acid modification or at least one glycoform modification. Antibody variants can be applied to the antibody polypeptide itself, a composition comprising said antibody variant polypeptide, or the amino acid sequence encoding said. Thus, as used herein, a “constant heavy chain variant” or “constant light chain variant” or “Fc variant” is a sequence that differs from that of the parent sequence due to at least one amino acid modification or at least one glycoform modification. Means different constant heavy chains, constant light chains or Fc region peptides or sequences, respectively.
By “wild type or WT” herein is meant an amino acid sequence or nucleotide sequence (including allelic variants) found in nature. WT proteins, polypeptides, antibodies, immunoglobulins, IgG, etc. have amino acid sequences or nucleotide sequences that are not intentionally modified.
For the positions of all immunoglobulin heavy chain constant regions considered in the present invention, the numbering is according to the EU index described in Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda; the literature is incorporated herein by reference in its entirety). The “EU index as described in Kabat” is a numbering system for human IgG1 EU antibody residues described by Edelman et al. (Biocemistry, 1969, 63: 78-85; the literature is incorporated herein by reference in its entirety) Applicable.

抗体
抗体は、特異的抗原と結合する免疫学的タンパク質である。ほとんどの哺乳動物（ヒトおよびマウスを含む）では、抗体は、ペアを形成する重鎖および軽鎖ポリペプチドから構築される。軽鎖および重鎖可変領域は抗体間で顕著な多様性を示し、標的抗原との結合をもたらす。各鎖は個々の免疫グロブリン（Ig）ドメインで構成され、したがって一般的用語の免疫グロブリンはそのようなタンパク質のために用いられる。
天然の抗体構造ユニットは典型的にはテトラマーを含む。各テトラマーは典型的には2つの同一のポリペプチド鎖ペアで構成され、各ペアは1つの“軽”鎖（典型的には約25kDaの分子量を有する）および1つの“重”鎖（典型的には約50−70kDaの分子量を有する）を有する。軽鎖および重鎖の各々は、2つの別個の領域で構成され、前記は可変領域および定常領域と称される。免疫グロブリンのIgGクラスについては、重鎖は4つの免疫グロブリンドメインで構成され、前記ドメインはN末端からC末端へV_H-CH1-CH2-CH3の順序で連結され、前記はそれぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン1、重鎖定常ドメイン2および重鎖定常ドメイン3と称される（前記はまたV_H-Cγ1-Cγ2-Cγ3と称され、それぞれ、重鎖可変ドメイン、定常ガンマ1ドメイン、定常ガンマ2ドメインおよび定常ガンマ3ドメインと称される）。IgG軽鎖は2つの免疫グロブリンドメインで構成され、前記はN末端からC末端へV_L-C_Lの順序で連結され、前記はそれぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインと称される。定常領域はより低い配列多様性を示し、重要な生化学的事象を誘引する多数の天然のタンパク質との結合に必要である。
抗体の可変領域は当該分子の抗原結合決定基を含み、したがってその標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域は、同じクラスの他の抗体と配列がもっとも異なるためにこのように呼ばれる。可変領域では、3つのループが重鎖および軽鎖の各Vドメインに対して集合し、抗原結合部位を形成する。各ループは相補性決定領域（以下では“CDR”と呼ぶ）と称され、この領域ではアミノ酸配列の変動がもっとも顕著である。合計して6つのCDRが存在し（重鎖および軽鎖に付きそれぞれ3つ）、V_H CDR1、V_H CDR2、V_H CDR3、V_L CDR1、V_L CDR2およびV_L CDR3と称される。CDRの外側の可変領域はフレームワーク（FR）領域と称される。CDRほど多様ではないが、配列変動性はFR領域内でも別個の抗体間で存在する。全般的に、抗体のこの特徴的な構造は、広範囲の抗原に対し特異性を獲得するために、免疫系によって実質的な抗原結合多様性（CDR）が探索されるときに安定な骨組み（FR領域）を提供する。多数の高解像構造が、種々の生物に由来する多様な可変領域フラグメントについて利用可能であり、いくつかのものは抗原と結合しておらず、いくつかは抗原と複合体を形成している。抗体可変領域の配列および構造的特色は、例えばMoreaら（Biophys Chem, 1997, 68:9-16）およびMoreaら（Methods, 2000, 20:267-279）の論文に記載され、さらに抗体の保存された特色は、例えばMaynardら（Annu Rev Biomed Eng, 2000, 2:339-376）の論文に記載されている（いずれも参照によりその全体が本明細書に含まれる）。 Antibodies Antibodies are immunological proteins that bind to specific antigens. In most mammals (including humans and mice), antibodies are constructed from heavy and light chain polypeptides that form a pair. Light and heavy chain variable regions show significant diversity between antibodies, resulting in binding to the target antigen. Each chain is made up of individual immunoglobulin (Ig) domains, so the generic term immunoglobulin is used for such proteins.
Natural antibody structural units typically comprise a tetramer. Each tetramer is typically composed of two identical polypeptide chain pairs, each pair having one “light” chain (typically having a molecular weight of about 25 kDa) and one “heavy” chain (typically Has a molecular weight of about 50-70 kDa). Each of the light and heavy chains is composed of two distinct regions, referred to as the variable region and the constant region. For the IgG class of immunoglobulins, the heavy chain is composed of four immunoglobulin domains, which are linked from the N-terminus to the C-terminus in the order V _H -CH1-CH2-CH3, each of which is a heavy chain variable Domain, heavy chain constant domain 1, heavy chain constant domain 2 and heavy chain constant domain 3 (also referred to as V _H -Cγ1-Cγ2-Cγ3, respectively, heavy chain variable domain, constant gamma 1 domain , Called constant gamma 2 domain and constant gamma 3 domain). An IgG light chain is composed of two immunoglobulin domains, which are linked from the N-terminus to the C-terminus in the order V _L -C _L , which are referred to as the light chain variable domain and the light chain constant domain, respectively. The constant region exhibits lower sequence diversity and is required for binding to a number of natural proteins that trigger important biochemical events.
The variable region of an antibody contains the antigen binding determinants of the molecule, and thus determines the specificity of the antibody for its target antigen. The variable region is so called because it is most different in sequence from other antibodies of the same class. In the variable region, three loops assemble for each heavy and light chain V domain to form the antigen binding site. Each loop is referred to as a complementarity determining region (hereinafter referred to as “CDR”), and the variation of the amino acid sequence is most prominent in this region. There are a total of 6 CDRs (3 each for heavy and light chains), referred to as V _H CDR1, V _H CDR2, V _H CDR3, V _L CDR1, V _L CDR2, and V _L CDR3. The variable region outside the CDRs is called the framework (FR) region. Although not as diverse as CDRs, sequence variability exists between distinct antibodies even within the FR region. Overall, this characteristic structure of antibodies is a stable framework (FR) when substantial immune-binding diversity (CDR) is sought by the immune system to gain specificity for a wide range of antigens. Area). A number of high-resolution structures are available for a variety of variable region fragments from different organisms, some not bound to the antigen and some complexed with the antigen . The sequence and structural features of antibody variable regions are described, for example, in the articles of Morea et al. (Biophys Chem, 1997, 68: 9-16) and Morea et al. (Methods, 2000, 20: 267-279) Features described are described, for example, in the article of Maynard et al. (Annu Rev Biomed Eng, 2000, 2: 339-376), both of which are hereby incorporated by reference in their entirety.

抗体は、定常領域による遺伝的決定にしたがって、クラス（アイソタイプとも称される）に分類される。ヒト定常軽鎖はカッパ（Cκ）およびラムダ（Cλ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はエプシロンに分類され、抗体アイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEと規定する。IgGクラスは、治療目的にもっとも一般的に用いられる。本明細書で用いられる“IgG”は、認知されている免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスはサブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む。マウスでは、このクラスはサブクラスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3を含む。IgMは、IgM1およびIgM2（ただしこれらに限定されない）を含むサブクラスを有する。IgAは、IgA1およびIgA2（ただしこれらに限定されない）を含むいくつかのサブクラスを有する。したがって、本明細書で用いられる“アイソタイプ”は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって規定される任意の免疫グロブリンのクラス又はサブクラスを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgDおよびIgEである。図1は、ヒト軽鎖カッパおよび重鎖ガンマ定常鎖の配列を提供する。図1bおよび1cはヒトIgG定常重鎖のアラインメントを示す。
本発明にとって有用なものはまた、天然のヒトIgGアイソタイプのハイブリッド組成物であるIgGでありえる。エフェクター機能、例えばADCC、ADCP、CDCおよび血中半減期は、異なる抗体クラス（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgGおよびIgMを含む）間で顕著に異なる（Michaelsen et al. 1992, Molecular Immunology, 29(3):319-326、前記文献は参照により完全に本明細書に含まれる）。IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4変種間のエフェクター機能相違の決定因子を解明するために、それら変種が多数の研究によって精査された。例えば以下を参照されたい：Canfield & Morrison, 1991, J Exp Med 173:1483-1491；Chappel et al. 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88(20):9036-9040；Chappel et al. 1993, J Biol Chem, 268:25124-25131；Tao et al. 1991, J Exp Med 173:1025-1028；Tao et al. 1993, J Exp Med 178:661-667；Redpath et al 1998, Human Immunolgy 59:720-727（前記文献はいずれも参照により完全に本明細書に含まれる）。 Antibodies are classified into classes (also called isotypes) according to genetic determination by the constant region. Human constant light chains are classified as kappa (Cκ) and lambda (Cλ) light chains. Heavy chains are classified as mu, delta, gamma, alpha, or epsilon, and define the antibody isotype as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. The IgG class is most commonly used for therapeutic purposes. “IgG” as used herein refers to a polypeptide belonging to the class of antibodies substantially encoded by a recognized immunoglobulin gamma gene. In humans, this class includes subclasses IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. In mice, this class includes subclasses IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. IgM has subclasses including but not limited to IgM1 and IgM2. IgA has several subclasses, including but not limited to IgA1 and IgA2. Thus, as used herein, “isotype” refers to any immunoglobulin class or subclass defined by the chemical and antigenic characteristics of their constant regions. Known human immunoglobulin isotypes are IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD and IgE. FIG. 1 provides the sequences of human light chain kappa and heavy chain gamma constant chains. Figures 1b and 1c show the alignment of human IgG constant heavy chains.
Also useful for the present invention may be IgG, a hybrid composition of natural human IgG isotype. Effector functions such as ADCC, ADCP, CDC and blood half-life are significantly different between different antibody classes, including for example human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG and IgM. Michaelsen et al. 1992, Molecular Immunology, 29 (3): 319-326, which is fully incorporated herein by reference). In order to elucidate the determinants of effector function differences between IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 variants, these variants were reviewed by numerous studies. For example, see: Canfield & Morrison, 1991, J Exp Med 173: 1483-1491; Chappel et al. 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88 (20): 9036-9040; Chappel et al. 1993, J Biol Chem, 268: 25124-25131; Tao et al. 1991, J Exp Med 173: 1025-1028; Tao et al. 1993, J Exp Med 178: 661-667; Redpath et al 1998, Human Immunolgy 59: 720-727 (All of the above references are fully incorporated herein by reference).

USSN 11/256,060（2005年10月21日出願 “IgG Immunoglobulin Variants with Opyimized Effector Function”、前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されているように、他の免疫グロブリンクラスに由来する定常領域を含む抗体、例えば図1のアラインメントに示した抗体でアミノ酸改変を操作することが可能である。そのような操作を実施したハイブリッドIgG組成物は、エフェクター機能特性の改善を提供しえる（前記機改善には、ADCC、食作用、CDCおよび血中半減期の改善が含まれる）。例えば、図1に示すように、IgG1/IgG3ハイブリッド変種は、CH2およびCH3領域内のIgG１の複数箇所を、IgG3のアミノ酸であって、この2つのアイソタイプで異なる箇所の前記アミノ酸で置換することによって構築することができる。したがって、274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435Rおよび436Fから成る群から選択される1つ以上の置換を含むハイブリッド変種IgG抗体を構築することができる（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。そのような変種は、また別のエフェクター機能特性および／または改善されたエフェクター機能特性を提供しえる。
別の例として、IgG2の比較的貧弱なエフェクター機能は、重要なFcγR結合残基を良好なエフェクター機能をもつIgG内の対応するアミノ酸で置換することによって改善されえる。例えば、FcγR結合に関するIgG2およびIgG1間の重要な残基相違にはP233、V234、A235、-236（IgG1に対しIgG2では欠失に該当する）、およびG327が含まれえる。したがって親IgG2における1つ以上のアミノ酸の改変（この場合、これら残基の１つ以上が対応するIgG1アミノ酸で置換される）、P233E、V234L、A235L、-236G（236位でのグリシンの挿入に当てはまる）およびG327Aは、エフェクター機能の増強を提供しえる。IgG1およびIgG2に由来するハイブリッド残基を含む、そのようなIgG（本明細書では“ハイブリッド”と称される）の配列は図1で提供される。 Derived from other immunoglobulin classes as described in USSN 11 / 256,060 (filed Oct. 21, 2005 “IgG Immunoglobulin Variants with Opyimized Effector Function”, which is incorporated herein by reference) Amino acid modifications can be engineered with an antibody containing a constant region, such as the antibody shown in the alignment of FIG. Hybrid IgG compositions that have undergone such manipulations may provide improved effector functional properties (the improvement may include ADCC, phagocytosis, CDC and blood half-life). For example, as shown in FIG. 1, an IgG1 / IgG3 hybrid variant is obtained by substituting a plurality of IgG1 sites in the CH2 and CH3 regions with the amino acids of IgG3 and different sites in these two isotypes. Can be built. Accordingly, a hybrid variant IgG antibody comprising one or more substitutions selected from the group consisting of 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R and 436F can be constructed ( Numbering here follows the EU index). Such variants may provide additional effector functional properties and / or improved effector functional properties.
As another example, the relatively poor effector function of IgG2 can be improved by substituting key FcγR binding residues with the corresponding amino acids in IgG with good effector function. For example, important residue differences between IgG2 and IgG1 for FcγR binding may include P233, V234, A235, -236 (which corresponds to deletion in IgG2 versus IgG1), and G327. Thus modification of one or more amino acids in the parent IgG2 (in which case one or more of these residues are replaced by the corresponding IgG1 amino acid), P233E, V234L, A235L, -236G (for glycine insertion at position 236) And G327A may provide enhanced effector function. The sequence of such an IgG (referred to herein as a “hybrid”) comprising hybrid residues derived from IgG1 and IgG2 is provided in FIG.

当分野では周知のように、免疫グロブリンの多形性がヒトの集団で存在する。Gm多形性はIGHG1、IGHG2およびIGHG3遺伝子によって決定される。前記遺伝子は、ヒトIgG1、IgG2およびIgG3分子のマーカーである、G1m、G2mおよびG3mアロタイプ（ガンマ4鎖にはGmアロタイプは見つかっていない）と呼ばれるアロタイプ抗原決定基をコードする対立遺伝子を有する。マーカーは‘アロタイプ’および‘イソアロタイプ’に分類することができる。これらは、アイソタイプ間の強い相同性に応じて種々の血清学的基準により区別される。アロタイプは、Ig遺伝子の対立遺伝子型によって特定される抗原決定基である。アロタイプは、異なる個体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列においてわずかな相違を示す。ただ1つのアミノ酸の相違でさえアロタイプ決定基を生じることが可能であるが、ただし多くの事例では、生じたいくつかのアミノ酸置換が存在している。アロタイプはサブクラスの対立遺伝子間の配列の相違であり、抗血清は対立遺伝子相違のみを認識する。イソアロタイプは1つのアイソタイプ内の対立遺伝子であり、前記は、1つ以上の他のアイソタイプの非多形性相同領域と共有されるエピトープを生じ、そのために抗血清は関連するアロタイプおよび関連する相同なアイソタイプと反応するであろう（Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol, 65:88-110；Gorman & Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457-66、両文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に含まれる）。 As is well known in the art, immunoglobulin polymorphisms exist in the human population. Gm polymorphism is determined by the IGHG1, IGHG2, and IGHG3 genes. The gene has an allele that encodes an allotype antigenic determinant called G1m, G2m and G3m allotypes (no Gm allotype found in gamma4 chain), which is a marker for human IgG1, IgG2 and IgG3 molecules. Markers can be classified into 'allotypes' and 'isoallotypes'. These are distinguished by various serological criteria depending on the strong homology between isotypes. Allotypes are antigenic determinants identified by the allelic form of the Ig gene. Allotypes show slight differences in the amino acid sequences of heavy or light chains of different individuals. Even a single amino acid difference can result in an allotypic determinant, but in many cases there are several amino acid substitutions that have occurred. Allotypes are sequence differences between subclass alleles, and antisera recognize only allelic differences. Isoallotypes are alleles within one isotype, which give rise to an epitope that is shared with non-polymorphic homologous regions of one or more other isotypes, so that antisera are related allotypes and related homologues (Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol, 65: 88-110; Gorman & Clark, 1990, Semin Immunol 2 (6): 457-66, both references The entirety of which is included herein).

ヒト免疫グロブリンの対立遺伝子型はよく性状が調べられている（WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3:357-362；WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur J Immunol 6, 599-601；E. van Logem, 1986 Allotypic markers, Monogr Allergy 19:4-51、前記文献はいずれも参照により完全に本明細書に含まれる）。さらにまた、他の多形性も性状が調べられている（Kim et al. 2001, J Mol Evol 54:1-9、前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。現時点では、18のGmアロタイプが知られている：G1m（1, 2, 3, 17）またはG1m（a, x, f, z）、G2m（23）またはG2m（n）、G3m（5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28）またはG3m（b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5）（Lefranc et al. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 1990；Lefranc, G et al. 1979, Hum Genet 50:199-211、各文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。固定された組合せで遺伝するアロタイプはGmハプロタイプと呼ばれる。図2は、ヒトIgG1（図2a）およびIgG2（図2b）のガンマ鎖の一般的なハプロタイプであり、位置および対応するアミノ酸置換を示している。本発明の抗体は、任意の免疫グロブリン遺伝子の任意のアロタイプ、イソアロタイプ又はハプロタイプによって実質的にコードされえる。
本発明の抗体は、任意の生物、好ましくは哺乳動物（ヒト、げっ歯類（マウスおよびラットを含むがただしこれらに限定されない）、ウサギ目の動物（ウサギおよび野ウサギを含むがただしこれらに限定されない）、ラクダ科の動物（ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダを含むがただしこれらに限定されない）、および非ヒト霊長類（キツネザル、広鼻猿類（Platyrrhini）（新世界ザル）、狭鼻猿類（Cercopithecoidea）（旧世界ザル）およびヒト上科の動物（テナガザル並びに小類人猿および大類人猿を含む）を含むが、ただしこれらに限定されない）に由来する遺伝子によって実質的にコードされえる。ある実施態様では、本発明の抗体は実質的にヒト由来である。本発明の抗体は、任意の抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされえる。ある実施態様では、本発明の抗体は、IgGクラス抗体（ヒトサブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む）に属する配列を含む。また別の実施態様では、本発明の抗体は、IgA（ヒトサブクラスIgA1およびIgA2を含む）、IgD、IgE、IgG又はIgMクラス抗体に属する配列を含む。本発明の抗体は、2つ以上のタンパク質鎖を含むことができる。すなわち、本発明は、モノマー又はオリゴマー（ホモまたはヘテロオリゴマーを含む）の抗体で利益を見出すことができる。 Human immunoglobulin alleles are well characterized (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and 1976, Eur J Immunol 6, 599-601; E. van Logem, 1986 Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 4-51, all of which are fully incorporated herein by reference) . Furthermore, other polymorphisms have also been investigated (Kim et al. 2001, J Mol Evol 54: 1-9, which is hereby incorporated by reference in its entirety). At present, 18 Gm allotypes are known: G1m (1, 2, 3, 17) or G1m (a, x, f, z), G2m (23) or G2m (n), G3m (5, 6 , 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) or G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc et al. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 1990; Lefranc, G et al. 1979, Hum Genet 50: 199-211. Are hereby incorporated by reference in their entirety). Allotypes inherited in a fixed combination are called Gm haplotypes. FIG. 2 is a common haplotype of the gamma chain of human IgG1 (FIG. 2a) and IgG2 (FIG. 2b) showing the position and corresponding amino acid substitution. An antibody of the invention can be substantially encoded by any allotype, isoallotype or haplotype of any immunoglobulin gene.
The antibodies of the present invention can be any organism, preferably mammals (humans, rodents (including but not limited to mice and rats)), rabbit eyes (including but not limited to rabbits and hares). ), Camelids (including but not limited to camels, llamas, dromedaries), and non-human primates (lemurs, Platyrrhini) (New World monkeys), nasal monkeys (Cercopithecoidea) In some embodiments, the present invention may be substantially encoded by genes derived from (old world monkeys) and human superfamily animals, including but not limited to gibbons and apes and apes. The antibodies of the invention are substantially of human origin, and the antibodies of the present invention can be made substantially by immunoglobulin genes belonging to any antibody class. In one embodiment, an antibody of the invention comprises a sequence belonging to an IgG class antibody (including human subclass IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) In another embodiment, the antibody of the invention comprises , IgA (including human subclasses IgA1 and IgA2), IgD, IgE, IgG or IgM class antibodies.The antibodies of the present invention may comprise two or more protein chains, ie the present invention. Benefits can be found with monomeric or oligomeric antibodies (including homo- and hetero-oligomers).

ある実施態様では、本発明の抗体はヒトIgG配列を土台にし、したがってヒトIgG配列が“基準”配列として用いられ、この基準配列に対して他の配列が比較される。前記他の配列には、他の生物に由来する配列（例えばげっ歯類及び霊長類の配列）とともに他の免疫グロブリンクラス（例えばIgA、IgE、IgGD、IgGMなど）に由来する配列が含まれるがただしこれらに限定されない。本発明の抗体は1つの親抗体との関係で操作されるが、ただし、変種は別の第二の親抗体との関係で操作されるか、又は別の第二の親抗体に“移入”しえることも意図されている。これは、典型的に2つの抗体の配列間における配列相同性又は構造相同性に基づき、第一と第二の抗体間での“同等”又は“一致する”残基の決定および置換によって実施される。相同性を確認するために、本明細書に概略する第一の抗体のアミノ酸配列は第二の抗体の配列と直接比較される。当分野で公知の1つ以上の相同性アラインメントプログラムを用いて（例えば種の間で保存されている残基を用いる）配列でアラインメントを実施し、アラインメントを維持するために（すなわち任意の欠失および挿入による保存残基の排除を回避するために）必要な挿入および欠失を可能にした後、第一の抗体の主要配列中の個々のアミノ酸と等価の残基が規定される。保存残基のアラインメントではそのような残基は100％保存されえる。しかしながら、75％を超えるか又は50％程度という保存残基のアラインメントもまた等価残基の同定のために適切である。等価残基はまた、その構造が決定された抗体の三次構造レベルにおける構造相同性を第一および第二の抗体間で決定することによっても規定することができる。この事例では、等価残基は、親抗体又は前駆体の個々のアミノ酸残基の2つ以上の主要鎖原子の原子配位（Nに対してN、CAに対しCA、Cに対しCおよびOに対しO）が、ある残基に対してアラインメント後に0.13nm以内、好ましくは0.1nm以内であるような残基と規定される。アラインメントは、タンパク質の非水素タンパク質原子の原子配位の最大のオーバーラップを生じるように、最良モデルで配向および位置が決定された後で達成される。どのような等価残基又は対応残基が決定されるかに関係なく、さらに抗体が作製される親抗体の実体に関係なく、言わんとすることは、本発明によって発見された抗体は、前記抗体と顕著な配列相同性又は構造相同性を有する任意の第二の親抗体を操作により得ることができるということである。したがって、例えば、等価残基の決定に上記方法又は他の方法を用いることによって、親抗体がヒトIgG1である変種抗体が作製される場合、前記変種抗体は、ヒトIgG2親抗体、ヒトIgA親抗体、マウスIgG2aもしくはIgG2b親抗体等々において操作することができる。繰り返せば、上記記載のように、親抗体の背景は本発明の抗体を他の親抗体へ移す能力に影響を及ぼさない。例えば、ある抗原エピトープを標的とするヒトIgG1抗体で操作される変種抗体は、別の抗原エピトープを標的とするヒトIgG2へ移すことができる、等々である。 In one embodiment, the antibodies of the invention are based on a human IgG sequence, so that the human IgG sequence is used as a “reference” sequence and other sequences are compared to this reference sequence. Such other sequences include sequences from other immunoglobulin classes (eg, IgA, IgE, IgGD, IgGM, etc.) as well as sequences from other organisms (eg, rodent and primate sequences). However, it is not limited to these. An antibody of the invention is engineered in relation to one parent antibody, provided that the variant is engineered in relation to another second parent antibody, or “imported” to another second parent antibody. It is also intended to be able to. This is typically done by determining and replacing “equivalent” or “matching” residues between the first and second antibody based on sequence or structural homology between the sequences of the two antibodies. The To confirm homology, the amino acid sequence of the first antibody outlined herein is directly compared to the sequence of the second antibody. Perform alignment on sequences using one or more homology alignment programs known in the art (eg, using residues conserved between species) and maintain alignment (ie, any deletions) After allowing the necessary insertions and deletions (and to avoid elimination of conserved residues by insertion), residues equivalent to individual amino acids in the primary sequence of the first antibody are defined. In conserved residue alignments, such residues may be 100% conserved. However, alignment of conserved residues over 75% or as high as 50% is also suitable for identification of equivalent residues. Equivalent residues can also be defined by determining structural homology between the first and second antibodies at the tertiary structure level of the antibody whose structure has been determined. In this case, the equivalent residue is an atomic coordination of two or more main chain atoms of individual amino acid residues of the parent antibody or precursor (N for N, CA for CA, C for C and O O) is defined as a residue such that it is within 0.13 nm, preferably within 0.1 nm after alignment to a residue. Alignment is achieved after orientation and position have been determined with the best model so as to produce the largest overlap of atomic coordination of the non-hydrogen protein atoms of the protein. Regardless of what equivalent or corresponding residues are determined, and regardless of the identity of the parent antibody from which the antibody is made, it should be noted that the antibodies discovered by the present invention are those described above. Any second parent antibody that has significant sequence or structural homology with the antibody can be obtained by manipulation. Thus, for example, when a variant antibody whose parent antibody is human IgG1 is prepared by using the above method or other methods for determining equivalent residues, the variant antibody is a human IgG2 parent antibody, a human IgA parent antibody. , Mouse IgG2a or IgG2b parent antibody, etc. can be manipulated. Again, as described above, the background of the parent antibody does not affect the ability to transfer the antibodies of the invention to other parent antibodies. For example, a variant antibody engineered with a human IgG1 antibody that targets one antigenic epitope can be transferred to a human IgG2 that targets another antigenic epitope, and so on.

免疫グロブリンのIgGクラスでは、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書の“免疫グロブリン（Ig）ドメイン”とは、別個の三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明で重要なものは、定常重鎖のドメイン（定常重鎖（CH）ドメインおよびヒンジを含む）である。IgG抗体の場合、IgGアイソタイプはそれぞれ以下の3つのCH領域を有する。Kabat記載のEUインデックスにしたがい、“CH1”は118−220位に該当し、“CH2”は237−340位に該当し、さらに“CH3”は341−447位に該当する。本明細書の“ヒンジ”または“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”または“免疫グロブリンヒンジ領域”とは、抗体の第一および第二の定常ドメインの間のアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドを意味する。構造的に、IgG CH1ドメインはEU220位で終わり、IgG CH2ドメインはEU237位の残基で開始する。したがってIgGについては、ヒンジは221位（IgG1のD221）から236位（IgG1のG236）を含むと定義される（ここで番号付与はKabat記載のEUインデックスに一致する）。いくつかの実施態様では、例えばFc領域の場合には、下方のヒンジが含まれる（“下方のヒンジ”は一般的に226位または230位が該当する）。本明細書に定義される定常重鎖は、CH1ドメインのN-末端からCH3ドメインのC-末端に該当し、したがって118−447位を含む（ここで番号付与はEUインデックスに一致する）。定常軽鎖はただ1つのドメインを含み、本明細書に定義するように、Cκ又はCλの108−214位に該当する（ここで番号付与はEUインデックスに一致する）。
“抗体”の定義に特に含まれるものは完全長抗体である。本明細書の“完全長抗体”は、抗体の天然の生物学的形態（可変および定常領域を含む）を構成する構造を意味する。例えば、ほとんどの哺乳動物（ヒトおよびマウスを含む）で、IgGクラスの完全長抗体はテトラマーであり、2つの免疫グロブリン鎖を含む2つの同一ペアから成り、各ペアは1つの軽鎖および1つの重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインV_LおよびC_Lを含み、各重鎖は免疫グロブリンドメインV_H、CH1（Cγ1）、CH2（Cγ2）およびCH3（Cγ3）を含む。いくつかの哺乳動物（例えばラクダおよびラマ）では、IgG抗体は2つの重鎖のみから成り、各重鎖はFc領域と結合した可変ドメインを含む。 In the IgG class of immunoglobulins, there are several immunoglobulin domains in the heavy chain. By “immunoglobulin (Ig) domain” herein is meant a region of an immunoglobulin that has a distinct tertiary structure. What is important in the present invention is the domain of the constant heavy chain (including the constant heavy chain (CH) domain and the hinge). In the case of an IgG antibody, each IgG isotype has the following three CH regions. According to Kabat's EU index, “CH1” corresponds to 118th to 220th, “CH2” corresponds to 237th to 340th, and “CH3” corresponds to 341st to 447th. As used herein, “hinge” or “hinge region” or “antibody hinge region” or “immunoglobulin hinge region” refers to a flexible polypeptide comprising amino acids between the first and second constant domains of an antibody. means. Structurally, the IgG CH1 domain ends at EU220 and the IgG CH2 domain begins at the EU237 residue. Thus, for IgG, the hinge is defined to include position 221 (D221 of IgG1) to position 236 (G236 of IgG1) (numbering here corresponds to the EU index described in Kabat). In some embodiments, for example in the case of the Fc region, a lower hinge is included ("lower hinge" generally corresponds to positions 226 or 230). The constant heavy chain as defined herein falls from the N-terminus of the CH1 domain to the C-terminus of the CH3 domain and thus includes positions 118-447 (where the numbering corresponds to the EU index). The constant light chain contains only one domain and corresponds to positions 108-214 of Cκ or Cλ as defined herein (where the numbering corresponds to the EU index).
Specifically included within the definition of “antibody” are full-length antibodies. By “full-length antibody” herein is meant the structure that constitutes the natural biological form of an antibody, including variable and constant regions. For example, in most mammals (including humans and mice), IgG class full-length antibodies are tetramers, consisting of two identical pairs containing two immunoglobulin chains, each pair consisting of one light chain and one With heavy chains, each light chain contains immunoglobulin domains V _L and C _L , and each heavy chain contains immunoglobulin domains V _H , CH1 (Cγ1), CH2 (Cγ2) and CH3 (Cγ3). In some mammals (eg camels and llamas), IgG antibodies consist of only two heavy chains, each heavy chain containing a variable domain associated with an Fc region.

あるいは、抗体は、抗体フラグメント（ただしこれに限定されない）を含む多様な構造であってもよい。抗体フラグメントには、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体、抗体模倣物、キメラ抗体、抗体融合物（時に“抗体コンジュゲート”と称される）、およびそれぞれのフラグメントが含まれるが、ただしこれらに限定されない。具体的な抗体フラグメントには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：（i）VL、VH、CL及びCH1から成るFabフラグメント；（ii）VH及びCH1から成るFdフラグメント；（iii）一本鎖抗体のVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；（iv）dAbフラグメント（ただ1つの可変領域から成る）；（v）単離されたCDR領域；（vi）F(ab')2フラグメント、2つの連結されたFabフラグメントを含む二価フラグメント；（vii）一本鎖Fv分子（scFv）、この場合VHドメイン及びVLドメインは、前記2つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによって連結される；（viii）二重特異的一本鎖Fvダイマー（PCT/US92/09965）；および（ix）“ダイアボディ”または“トリアボディ”、遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異的フラグメント。抗体フラグメントは改変することができる。例えば、VHおよびVLドメインを連結するジスルフィド架橋を取り込むことによって、分子は安定化させることができる。抗体の様式及び構造の例は以下の文献に記載されている：Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136；及びCarter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357及びそれらで引用されている参考文献（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。 Alternatively, the antibody may be a variety of structures, including but not limited to antibody fragments. Antibody fragments include bispecific antibodies, minibodies, domain antibodies, synthetic antibodies, antibody mimetics, chimeric antibodies, antibody fusions (sometimes referred to as “antibody conjugates”), and respective fragments. However, it is not limited to these. Specific antibody fragments include (but are not limited to): (i) a Fab fragment consisting of VL, VH, CL and CH1; (ii) an Fd fragment consisting of VH and CH1; (iii) one Fv fragment consisting of VL and VH domains of chain antibody; (iv) dAb fragment (consisting of only one variable region); (v) isolated CDR region; (vi) F (ab ′) 2 fragment, two A bivalent fragment containing linked Fab fragments; (vii) a single chain Fv molecule (scFv), where the VH and VL domains are linked by a peptide linker that binds the two domains to form an antigen binding site (Viii) bispecific single chain Fv dimers (PCT / US92 / 09965); and (ix) “diabodies” or “triabodies”, multivalent or multispecific fragments constructed by gene fusion . Antibody fragments can be modified. For example, the molecule can be stabilized by incorporating disulfide bridges that link the VH and VL domains. Examples of antibody modes and structures are described in the following literature: Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23 (9): 1126-1136; and Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6: 343-357 and references thereto. References cited (all of which are incorporated herein by reference).

本発明の抗体は、多重特異的抗体、特に二重特異的抗体（ときにはまた“ダイアボディ”と称される）を含むことができる。これらは、2つ（又は3つ以上）の異なる抗原と結合する抗体である。ダイアボディは当分野で公知の多様な方法で製造することができる（例えば化学的に又はハイブリッドハイブリドーマから調製することができる）。ある実施態様では、抗体はミニボディである。ミニボディは、CH3ドメインと結合したscFvを含む最小化された抗体様タンパク質である。いくつかの事例では、scFvはFc領域と結合させることができ、ヒンジ領域のいくらか又は全部を含むことができる。多重特異的抗体の詳細については以下を参照されたい；Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136及びその中の引用文献（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。
ある実施態様では、本発明の抗体は抗体フラグメントである。特に重要なものは、Fc領域、Fc融合物、及び重鎖の定常領域（CH1-ヒンジ-CH2-CH3）を含む抗体である。本発明の抗体はFcフラグメントを含むことができる。本発明のFcフラグメントは、1−90％のFc領域、例えば10−90％、30−90％などを含むことができる。したがって、例えば、本発明のFcフラグメントは、IgG1 Cγ2ドメイン、IgG1 Cγ2ドメイン及びヒンジ、IgG1 Cγ3ドメイン等々を含むことができる。ある実施態様では、本発明のFcフラグメントはさらに、融合パートナー（Fcフラグメントを効率的にFcフラグメント融合物にする）を含むことができる。Fcフラグメントは余分なポリペプチド配列を含んでいても又は含まなくてもよい。 The antibodies of the invention can include multispecific antibodies, particularly bispecific antibodies (sometimes referred to as “diabodies”). These are antibodies that bind to two (or more than two) different antigens. Diabodies can be produced by a variety of methods known in the art (eg, can be prepared chemically or from hybrid hybridomas). In certain embodiments, the antibody is a minibody. Minibodies are minimized antibody-like proteins that contain an scFv bound to a CH3 domain. In some cases, the scFv can be bound to the Fc region and can include some or all of the hinge region. For details of multispecific antibodies see: Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23 (9): 1126-1136 and references cited therein (all of which are hereby incorporated by reference) ).
In certain embodiments, the antibodies of the invention are antibody fragments. Of particular importance are antibodies that contain an Fc region, an Fc fusion, and a heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3). The antibody of the present invention may comprise an Fc fragment. The Fc fragment of the present invention may comprise 1-90% Fc region, such as 10-90%, 30-90% and the like. Thus, for example, an Fc fragment of the invention can comprise an IgG1 Cγ2 domain, an IgG1 Cγ2 domain and hinge, an IgG1 Cγ3 domain, and the like. In certain embodiments, the Fc fragments of the present invention can further comprise a fusion partner (which effectively converts the Fc fragment into an Fc fragment fusion). The Fc fragment may or may not contain extra polypeptide sequence.

キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体
免疫原性は、外来物と認識される物質に対する一連の複雑な応答の結果であり、中和及び非中和抗体の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、マスト細胞活性化、炎症、過敏応答、及びアナフィラキシーを含む。いくつかの因子がタンパク質の免疫原性に寄与することができる。前記因子にはタンパク質配列、投与経路及び頻度、並びに患者集団が含まれるが、ただしこれらに限定されない。免疫原性は、タンパク質治療薬の有効性及び安全性を様々な態様で制限しえる。有効性は、中和抗体の形成によって直接的に低下しえる。中和抗体又は非中和抗体との結合が典型的には血清からの迅速な排除をもたらすので、有効性は間接的にも低下しえる。免疫反応が生じるときには、重篤な副作用及び死亡さえも起こりえる。したがって、ある実施態様では、タンパク質の操作が、本発明の抗体の免疫原性の低下のために用いられる。
いくつかの実施態様では、骨組み成分は異なる種に由来する混合物でありえる。そのような抗体はキメラ抗体および／またはヒト化抗体である。一般的には、“キメラ抗体”および“ヒト化抗体”の両方が、2つ以上の種に由来する領域を組み合わせた抗体に該当する。“キメラ抗体”は、伝統的にはマウス（またはいくつかの事例ではラット）由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を含む（Morrison et al. 1984, Proc Natl Acad Sci USA 81:6851-6855、前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。 Chimeric, humanized and fully human antibody immunogenicity is the result of a series of complex responses to substances recognized as foreign, producing neutralized and non-neutralized antibodies, immune complex formation, complementation. Includes somatic activation, mast cell activation, inflammation, hypersensitivity response, and anaphylaxis. Several factors can contribute to protein immunogenicity. Such factors include, but are not limited to, protein sequence, route and frequency of administration, and patient population. Immunogenicity can limit the effectiveness and safety of protein therapeutics in various ways. Efficacy can be reduced directly by the formation of neutralizing antibodies. Efficacy can also be reduced indirectly, as binding to neutralizing or non-neutralizing antibodies typically results in rapid clearance from serum. Severe side effects and even death can occur when an immune response occurs. Thus, in certain embodiments, protein manipulation is used to reduce the immunogenicity of the antibodies of the invention.
In some embodiments, the framework component can be a mixture derived from different species. Such antibodies are chimeric antibodies and / or humanized antibodies. In general, both “chimeric antibodies” and “humanized antibodies” are antibodies that combine regions from two or more species. “Chimeric antibodies” traditionally comprise variable regions from mice (or rats in some cases) and constant regions from humans (Morrison et al. 1984, Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851-6855, Which is incorporated herein by reference in its entirety).

本明細書で用いられる“ヒト化抗体”とは、ヒトのフレームワーク領域（FR）および非ヒト（通常はマウスまたはラット）由来の1つ以上の相補性決定領域（CDR）を含む抗体を意味する。CDRを提供する非ヒト抗体は“ドナー”と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは“アクセプター”と呼ばれる。ヒト化は、基本的にはドナーCDRをアクセプター（ヒト）のVL及びVHフレームワークに移植することによる（Winter US 5225539、前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。この手法は、“CDR移植”と呼ばれる。選択したアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への“復帰突然変異”が、最初の移植構築物で失われた親和性を回復するためにしばしば要求される（US 5693762、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。ヒト化抗体は、最適にはまた、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含み、したがって典型的にはヒトFc領域を含むであろう。非ヒト抗体をヒト化し再構成する多様な技術及び方法が当分野で周知である（例えば以下を参照されたい：Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)、及びその中に引用された参考文献、前記文献はいずれも参照により完全に本明細書に含まれる）。ヒト化又は非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減少させる他の方法には、例えば以下に記載されている表面を新しく形成する方法が含まれえる：Roguska et al. 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。ある実施態様では、選別に基づく方法を用い、抗体可変領域をヒト化するか、および／またはアフィニティー成熟させる（すなわちその標的抗原に対して可変領域の親和性を増加させる）。他のヒト化の方法には、CDRの一部分のみの移植が含まれえる。前記方法には以下に記載された方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない：USSN 09/810,502；Tan et al. 2002, J Immunol 169:1119-1125；De Pascalis et al. 2002, J Immunol 169:3076-3084（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。構造に基づく方法を、ヒト化及びアフィニティー成熟のために用いることができる。前記は例えばUSSN 10/153,159及び関連出願（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている。
ある種の変型では、抗体の免疫原性は、USSN 11/004,590（"Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof", 2004年12月3日出願、前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載された方法を用いて低下させる。 As used herein, “humanized antibody” means an antibody comprising a human framework region (FR) and one or more complementarity determining regions (CDRs) derived from a non-human (usually mouse or rat). To do. Non-human antibodies that provide CDRs are called “donors” and human immunoglobulins that provide the framework are called “acceptors”. Humanization is basically by transplanting the donor CDRs into the acceptor (human) VL and VH frameworks (Winter US 5225539, which is hereby incorporated by reference in its entirety). This technique is called “CDR transplant”. “Backmutation” of selected acceptor framework residues to the corresponding donor residues is often required to restore the affinity lost in the initial transplant construct (see US 5693762, supra) Included in this specification). A humanized antibody optimally also will comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region, typically that of a human immunoglobulin, and thus typically will comprise a human Fc region. Various techniques and methods for humanizing and reconstituting non-human antibodies are well known in the art (see, eg, Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), and references cited therein, all of which are fully incorporated herein by reference). Other methods of reducing the immunogenicity of a humanized or non-human antibody variable region can include, for example, a method of newly forming the surface described below: Roguska et al. 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 969-973, which is incorporated herein by reference). In certain embodiments, selection-based methods are used to humanize and / or affinity mature the antibody variable region (ie, increase the affinity of the variable region for its target antigen). Other humanization methods can include transplantation of only a portion of a CDR. Such methods include, but are not limited to, the methods described below: USSN 09 / 810,502; Tan et al. 2002, J Immunol 169: 1119-1125; De Pascalis et al. 2002, J Immunol 169 : 3076-3084, which is hereby incorporated by reference. Structure-based methods can be used for humanization and affinity maturation. This is described, for example, in USSN 10 / 153,159 and related applications, which are incorporated herein by reference.
In certain variants, the immunogenicity of an antibody is described in USSN 11 / 004,590 ("Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof", filed December 3, 2004, which is incorporated herein by reference). To be reduced using the method described in (1).

免疫原性を低下させるための改変には、親配列由来の加工ペプチドとMHCタンパク質との結合を低下させる改変が含まれえる。例えば、主要なMHC対立遺伝子型のいずれかと高親和性で結合することが予想される免疫エピトープが消失するか又は数が最少となるように操作してアミノ酸改変を実施できよう。タンパク質配列中のMHC結合エピトープを認定するいくつかの方法が当分野では知られており、本発明の抗体中のエピトープに印をつけるために用いることができる。例えば以下を参照されたい：USSN 09/903,378、USSN 10/754,296、USSN 11/249,692、及びそれらの中に引用されている参考文献（前記文献は全て参照により本明細書に含まれる）。
また別の実施態様では、本発明の抗体は完全にヒト由来、すなわち抗体の配列は完全に又は実質的にヒトの配列である。“完全にヒトの抗体”又は“完全なヒト抗体”は、ヒトの染色体に由来する抗体遺伝子配列を有するヒトの抗体で本明細書に概略する改変を有するものに適用される。完全なヒトの抗体を作製するための多数の方法が当分野では公知である。前記には、トランスジェニックマウスの使用（Bruggemann et al. 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458）、又は選別方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリーの使用（Griffiths et al. 1998, Curr Opin Biotechnol 9：102-108）が含まれる（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）。 Modifications to reduce immunogenicity can include modifications that reduce binding between the parent sequence-derived processed peptide and the MHC protein. For example, an amino acid modification could be performed that is engineered to eliminate or minimize the number of immune epitopes that are expected to bind with high affinity to any of the major MHC allele types. Several methods for identifying MHC binding epitopes in protein sequences are known in the art and can be used to mark epitopes in the antibodies of the invention. See, for example, USSN 09 / 903,378, USSN 10 / 754,296, USSN 11 / 249,692, and references cited therein (all of which are hereby incorporated by reference).
In yet another embodiment, the antibodies of the invention are completely human, i.e., the antibody sequences are fully or substantially human sequences. A “fully human antibody” or “fully human antibody” applies to a human antibody having an antibody gene sequence derived from a human chromosome and having the modifications outlined herein. Numerous methods for producing fully human antibodies are known in the art. These include the use of transgenic mice (Bruggemann et al. 1997, Curr Opin Biotechnol 8: 455-458) or the use of human antibody libraries in combination with selection methods (Griffiths et al. 1998, Curr Opin Biotechnol 9: 102-108) (each of which is hereby incorporated by reference).

CD40を標的とする抗体
本発明の抗体は、CD40と結合する実質的に任意の抗体であることができ、例えば、任意の公知の、または未発見の抗CD40抗体の可変領域（例えばCDR）を含むことができる。本発明の抗体はCD40に対し選択性を示すことができる。その例には、完全長対スプライス変種選択性、細胞表面対可溶形選択性、種々の多形性変種に対する選択性、または標的の特異的構造型に対する選択性が含まれる。本発明の抗体は、CD40の任意のエピトープまたは領域と結合することができ、前記抗原のフラグメント、変異型、スプライス型または異常型に特異的であることができる。本発明で有用でありえる、CD40を標的とする多数の有用な抗体が発見されている。
適切なCD40抗体またはイムノアドヘシンには以下が含まれる：CD40抗体またはイムノアドヘシンS2C6（Paulie et al. 1984, Cancer Immunol Immunother. 17（3）：173-179）、SGN-14（キメラS2C6；US 6,843,989）、CHIR-12.12（US Pub. No. 2007/0218060、2004年11月4日出願）、5D12（US 5,874,082；de M. Boer et al. 1992, J Immunol Methods 152:15-23）、3A8（ATCC cat# HB-12024-hybridoma）、およびG28-5（ATCC cat#HB-9110 hybridoma；E.A. Clark et al. 1988, Eur J Immunol 18:451-457）。
本発明の抗体は多様な製品で有用であることができる。ある実施態様では、本発明の抗体は治療薬、診断薬、または研究試薬である。ある実施態様では、本発明の抗体は治療薬である。あるいは、本発明の抗体は農業的または工業的使用のために利用することができる。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルである抗体組成物で有用であることができる。本発明の抗体は、アゴニスト、アンタゴニストであっても、中和用、阻害用、または刺激用であってもよい。ある実施態様では、本発明の抗体は、標的抗原を保持する標的細胞（例えば癌細胞）を死滅させるために用いられる。また別の実施態様では、本発明の抗体は、標的抗原をブロックするために、拮抗するために、または作動させるために用いられる。また別の実施態様では、本発明の抗体は、標的抗原をブロックし、拮抗し、または作動させて、標的抗原を保持する標的細胞を死滅させるために用いられる。 Antibodies Targeting CD40 The antibodies of the present invention can be virtually any antibody that binds to CD40, eg, any known or undiscovered variable region (eg, CDR) of an anti-CD40 antibody. Can be included. The antibodies of the present invention can exhibit selectivity for CD40. Examples include full length versus splice variant selectivity, cell surface versus soluble form selectivity, selectivity for various polymorphic variants, or selectivity for a specific structural type of target. The antibodies of the invention can bind to any epitope or region of CD40 and can be specific for fragments, mutants, splices or aberrants of the antigen. A number of useful antibodies have been discovered that target CD40 that may be useful in the present invention.
Suitable CD40 antibodies or immunoadhesins include: CD40 antibodies or immunoadhesins S2C6 (Paulie et al. 1984, Cancer Immunol Immunother. 17 (3): 173-179), SGN-14 (chimeric S2C6; US 6,843,989), CHIR-12.12 (US Pub. No. 2007/0218060, filed Nov. 4, 2004), 5D12 (US 5,874,082; de M. Boer et al. 1992, J Immunol Methods 152: 15-23), 3A8 (ATCC cat # HB-12024-hybridoma) and G28-5 (ATCC cat # HB-9110 hybridoma; EA Clark et al. 1988, Eur J Immunol 18: 451-457).
The antibodies of the present invention can be useful in a variety of products. In certain embodiments, the antibodies of the invention are therapeutic agents, diagnostic agents, or research reagents. In certain embodiments, the antibodies of the invention are therapeutic agents. Alternatively, the antibodies of the invention can be utilized for agricultural or industrial use. The antibodies of the invention can be useful in antibody compositions that are monoclonal or polyclonal. The antibodies of the present invention may be agonists, antagonists, neutralizing, inhibiting, or stimulating. In certain embodiments, the antibodies of the invention are used to kill target cells (eg, cancer cells) that carry a target antigen. In yet another embodiment, the antibodies of the invention are used to block, antagonize, or actuate a target antigen. In yet another embodiment, the antibodies of the invention are used to block, antagonize, or actuate a target antigen to kill target cells that retain the target antigen.

エフェクター機能を最適化する改変
本発明は改変を含む抗体を目的とし、この場合、前記改変は1つ以上のFcレセプターに対する親和性を改変し、及び／又は1つ以上のエフェクター機能を媒介する抗体の能力を改変する。本発明の改変にはアミノ酸改変及び糖型改変が含まれる。本明細書に開示するFc部分は、本明細書に開示する任意の抗CD40と結合させることができる。
アミノ酸改変：
USSN 11/124,620（2005年5月5日出願、”Optimized Fc Variants”（前記文献は参照により本明細書に含まれる））に記載されているように、重鎖定常領域の221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336および337位におけるアミノ酸改変は、抗体のFcγR結合特性、エフェクター機能及び潜在的臨床特性の改変を可能にする。
特に、1つ以上のヒトFcレセプターとの結合の変化を示す変種は、本明細書に記載するように、以下から成る群から選択される、重鎖定常領域内のアミノ酸改変を含むことができる：221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H,および337N（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。 Modifications that optimize effector function The present invention is directed to antibodies comprising modifications, wherein the modification alters affinity for one or more Fc receptors and / or mediates one or more effector functions Alter the ability of The modifications of the present invention include amino acid modifications and glycotype modifications. The Fc portion disclosed herein can be conjugated to any anti-CD40 disclosed herein.
Amino acid modification :
USSN 11 / 124,620 (filed May 5, 2005, "Optimized Fc Variants", which is incorporated herein by reference), 221, 222, 223 of the heavy chain constant region. , 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290 , 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327 , 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 and 337, amino acid modifications allow modification of FcγR binding properties, effector functions and potential clinical properties of the antibody.
In particular, variants that exhibit altered binding to one or more human Fc receptors can include amino acid modifications within the heavy chain constant region, as described herein, selected from the group consisting of: : 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G , 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y , 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235H, 235I , 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236R, 236S , 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G , 238I, 2 38K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265L 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267P, 267Q, 267P 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294 M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299H, 299G, 299H, 299G 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 3 25F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327H 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334T 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H, and 337H (Numbering here follows the EU index).

USSN 11/090,981（2005年3月24日出願、"Immunoglobulin variants outside the Fc region”、（前記文献は参照により本明細書に含まれる））に記載されたように、重鎖定常領域の118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 147, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235および236位のアミノ酸改変は、抗体のFcγR結合特性、エフェクター機能及び潜在的臨床特性の改変を可能にする。
USSN 11/090,981（2005年3月24日出願、"Immunoglobulin variants outside the Fc region”、（前記文献は参照により本明細書に含まれる））に記載されたように、軽鎖定常領域の108, 109, 110, 111, 112, 114, 116, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 197, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, 212, 213位のアミノ酸改変は、抗体のFcγR結合特性、エフェクター機能及び潜在的臨床特性の改変を可能にする。 USSN 11 / 090,981 (filed Mar. 24, 2005, “Immunoglobulin variants outside the Fc region”, which is hereby incorporated by reference), 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 147, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, Amino acid modifications at positions 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235 and 236 modify the FcγR binding properties, effector functions and potential clinical properties of the antibody. Enable.
USSN 11 / 090,981 (filed Mar. 24, 2005, “Immunoglobulin variants outside the Fc region”, which is hereby incorporated by reference), 109, 110, 111, 112, 114, 116, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 197, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, Amino acid modifications at positions 212 and 213 allow modification of the antibody's FcγR binding properties, effector functions and potential clinical properties.

特に、1つ以上のヒトFcレセプターとの結合の変化を示す変種は、本明細書に記載するように、以下から成る群から選択される重鎖定常領域のアミノ酸改変を含むことができる：118K, 118E, 118Y, 119R, 119E, 119Y, 120R, 120E, 120I, 121E, 121Y, 121H, 122E, 122R, 124K, 124E, 124Y, 126K, 126D, 129L, 129D, 131G, 131T, 132D, 132R, 132L, 133R, 133E, 133L, 135I, 135E, 135K, 136E, 136K, 136I, 137E, 138S, 138R, 138D, 139I, 139E, 139K, 147A, 147E, 148Y, 148K, 150L, 150K, 150E, 151A, 151D, 152L, 152K, 153L, 153D, 155E, 155K, 155I, 157E, 157K, 157Y, 159K, 159D, 159L, 160K, 160E, 160Y, 161D, 162D, 162K, 162Y, 163R, 164R, 164E, 164Y, 165D, 165R, 165Y, 166D, 167A, 168L, 169E, 171G, 171H, 172K, 172L, 172E, 173T, 173D, 174E, 174K, 174Y, 175D, 175L, 176D, 176R, 176L, 177R, 177E, 177Y, 178D, 179K, 179Y, 179E, 180K, 180L, 180E, 183T, 187I, 187K, 187E, 188I, 189D, 189G, 190I, 190K, 190E, 191D, 191R, 191Y, 192N, 192R, 192L, 193F, 193E, 194R, 194D, 195R, 195D, 195Y, 196K, 196D, 196L, 197R, 197E, 197Y, 198L, 199T, 199D, 199K, 201E, 201K, 201L, 203D, 203L, 203K, 205D, 205L, 206A, 206E, 207K, 207D, 208R, 208E, 208Y, 209E, 209K, 209Y, 210L, 210E, 210Y, 211R, 211E, 211Y, 212Q, 212K, 212H, 212L, 212Y, 213N, 213E, 213H, 213L, 213Y, 214N, 214E, 214H, 214L, 214Y, 216N, 216K, 216H, 216L, 216Y, 217D, 217H, 217A, 217V, 217G, 218D, 218E, 218Q, 218T, 218H, 218L, 218Y, 219D, 219E, 219Q, 219K, 219T, 219H, 219L, 219I, 219Y, 205A, 210A, 213A, 214A, 218A, 221K, 221Y, 221E, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221H, 221A, 221V, 221L, 221I, 221F, 221M, 221W, 221P, 221G, 222E, 222Y, 222D, 222N, 222Q, 222R, 222S, 222T, 222H, 222V, 222L, 222I, 222F, 222M, 222W, 222P, 222G, 222A, 223D, 223N, 223Q, 223R, 223S, 223H, 223A, 223V, 223L, 223I, 223F, 223M, 223Y, 223W, 223P, 223G, 223E, 223K, 224D, 224N, 224Q, 224K, 224R, 224S, 224T, 224V, 224L, 224I, 224F, 224M, 224W, 224P, 224G, 224E, 224Y, 224A, 225D, 225N, 225Q, 225R, 225S, 225H, 225A, 225V, 225L, 225I, 225F, 225M, 225Y, 225P, 225G, 225E, 225K, 225W, 226S, 227E, 227K, 227Y, 227G, 227D, 227N, 227Q, 227R, 227S, 227T, 227H, 227A, 227V, 227L, 227I, 227F, 227M, 227W, 228K, 228Y, 228G, 228D, 228N, 228Q, 228R, 228T, 228H, 228A, 228V, 228L, 228I, 228F, 228M, 228W, 229S, 230A, 230E, 230Y, 230G, 230D, 230N, 230Q, 230K, 230R, 230S, 230T, 230H, 230V, 230L, 230I, 230F, 230M, 230W, 231K, 231P, 231D, 231N, 231Q, 231R, 231S, 231T, 231H, 231V, 231L, 231I, 231F, 231M, 231W, 232E, 232K, 232Y, 232G, 232D, 232N, 232Q, 232R, 232S, 232T, 232H, 232A, 232V, 232L, 232I, 232F, 232M, 232W, 233D, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233H, 233A, 233V, 233L, 233I, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234G, 235D, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 235E, 235K, 235R, 235A, 235M, 235W, 235P, 235G, 236D, 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S, 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 236I, 236F, 236M, 236Y, 236Wおよび236P（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。 In particular, a variant that exhibits altered binding to one or more human Fc receptors, as described herein, may comprise an amino acid modification of a heavy chain constant region selected from the group consisting of: 118K , 118E, 118Y, 119R, 119E, 119Y, 120R, 120E, 120I, 121E, 121Y, 121H, 122E, 122R, 124K, 124E, 124Y, 126K, 126D, 129L, 129D, 131G, 131T, 132D, 132R, 132L , 133R, 133E, 133L, 135I, 135E, 135K, 136E, 136K, 136I, 137E, 138S, 138R, 138D, 139I, 139E, 139K, 147A, 147E, 148Y, 148K, 150L, 150K, 150E, 151A, 151D , 152L, 152K, 153L, 153D, 155E, 155K, 155I, 157E, 157K, 157Y, 159K, 159D, 159L, 160K, 160E, 160Y, 161D, 162D, 162K, 162Y, 163R, 164R, 164E, 164Y, 165D , 165R, 165Y, 166D, 167A, 168L, 169E, 171G, 171H, 172K, 172L, 172E, 173T, 173D, 174E, 174K, 174Y, 175D, 175L, 176D, 176R, 176L, 177R, 177E, 177Y , 179K, 179Y, 179E, 180K, 180L, 180E, 183T, 187I, 187K, 187E, 188I, 189D, 189G, 190I, 190K, 190E, 191D, 191R, 191Y, 192N, 192R, 192L, 193F, 193E, 194R , 194D, 1 95R, 195D, 195Y, 196K, 196D, 196L, 197R, 197E, 197Y, 198L, 199T, 199D, 199K, 201E, 201K, 201L, 203D, 203L, 203K, 205D, 205L, 206A, 206E, 207K, 207D, 208R, 208E, 208Y, 209E, 209K, 209Y, 210L, 210E, 210Y, 211R, 211E, 211Y, 212Q, 212K, 212H, 212L, 212Y, 213N, 213E, 213H, 213L, 213Y, 214N, 214E, 214H, 214L, 214Y, 216N, 216K, 216H, 216L, 216Y, 217D, 217H, 217A, 217V, 217G, 218D, 218E, 218Q, 218T, 218H, 218L, 218Y, 219D, 219E, 219Q, 219K, 219T, 219H 219L, 219I, 219Y, 205A, 210A, 213A, 214A, 218A, 221K, 221Y, 221E, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221H, 221A, 221V, 221L, 221I, 221F, 221M, 221W, 221P, 221G, 222E, 222Y, 222D, 222N, 222Q, 222R, 222S, 222T, 222H, 222V, 222L, 222I, 222F, 222M, 222W, 222P, 222G, 222A, 223D, 223N, 223Q, 223R, 223S, 223H, 223A, 223V, 223L, 223I, 223F, 223M, 223Y, 223W, 223P, 223G, 223E, 223K, 224D, 224N, 224Q, 224K, 224R, 224S, 224T, 224V, 224L, 224I, 224F, 224M, 224W 224P, 224G, 224E, 224Y, 224A, 225D, 225N, 225Q, 225R, 225S, 225H, 225A, 225V, 225L, 225I, 225F, 225M, 225Y, 225P, 225G, 225E, 225K, 225W, 226S, 227E, 227K, 227Y, 227G, 227D, 227N, 227Q, 227R, 227S, 227T, 227H, 227A, 227V, 227L, 227I, 227F, 227M, 227W 228K, 228Y, 228G, 228D, 228N, 228Q, 228R, 228T, 228H, 228A, 228V, 228L, 228I, 228F, 228M, 228W, 229S, 230A, 230E, 230Y, 230G, 230D, 230N, 230Q, 230K, 230R, 230S, 230T, 230H, 230V, 230L, 230I, 230F, 230M, 230W, 231K, 231P, 231D, 231N, 231Q, 231R, 231S, 231T, 231H, 231V, 231L, 231I, 231F, 231M, 231W, 232E, 232K, 232Y, 232G, 232D, 232N, 232Q, 232R, 232S, 232T, 232H, 232A, 232V, 232L, 232I, 232F, 232M, 232W, 233D, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233T 233A, 233V, 233L, 233I, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234 235D, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 235E, 235K, 235R, 235A, 235M, 235W, 235P, 235G, 236D, 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 236I, 236F, 236M, 236Y, 236W and 236P (where numbering is E According to the U index).

特に、1つ以上のヒトFcレセプターとの結合の変化を示す変種は、本明細書に記載するように、以下から成る群から選択される軽鎖定常領域のアミノ酸改変を含むことができる：108D, 108I, 108Q, 109D, 109P, 109R, 110E, 110I, 110K, 111E, 111K, 111L, 112E, 112R, 112Y, 114D, 114I, 114K, 116T, 121D, 122R, 122S, 122Y, 123L, 123R, 124E, 125E, 125K, 126D, 126L, 126Q, 127A, 127D, 127K, 128N, 129E, 129I, 129K, 131T, 137K, 137S, 138D, 138K, 138L, 140E, 140H, 140K, 141E, 141K, 142D, 142G, 142L, 143A, 143L, 143R, 145D, 145T, 145Y, 147A, 147E, 147K, 149D, 149Y, 150A, 151I, 151K, 152L, 152R, 152S, 153D, 153H, 153S, 154E, 154R, 154V, 155E, 155I, 155K, 156A, 156D, 156R, 157N, 158D, 158L, 158R, 159E, 159K, 159L, 160K, 160V, 161K, 161L, 162T, 163E, 163K, 163T, 164Q, 165K, 165P, 165Y, 166E, 166M, 166S, 167K, 167L, 168K, 168Q, 168Y, 169D, 169H, 169S, 170I, 170N, 170R, 171A, 171N, 171V, 172E, 172I, 172K, 173K, 173L, 173Q, 174A, 176T, 180E, 180K, 180S, 181K, 182E, 182R, 182T, 183D, 183L, 183P, 184E, 184K, 184Y, 185I, 185Q, 185R, 187K, 187Y, 188E, 188S, 188Y, 189D, 189K, 189Y, 190E, 190L, 190R, 191E, 191R, 191S, 193E, 193K, 193S, 195I, 195K, 195Q, 197E, 197K, 197L, 199E, 199K, 199Y, 200S, 202D, 202R, 202Y, 203D, 203L, 203R, 204T, 205E, 205K, 206E, 206I, 206K, 207A, 207E, 207L, 208E, 208K, 208T, 210A, 210E, 210K, 211A, 211E, 211P, 212E, 212K, 212T, 213L, 213R（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。
本発明でまた用いることができるさらに別の置換には、Fcレセプター親和性、FcγR-媒介エフェクター機能、および／または補体媒介エフェクター機能を調節する他の置換が含まれ、前記置換は以下を含む（ただしこれらに限定されない）：298A, 298T, 326A, 326D, 326E, 326W, 326Y, 333A, 333S, 334Lおよび334A（US 6,737,056；Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604；US 6,528,624；Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572)、247L, 255L, 270E, 392T, 396Lおよび421K（USSN 10/754,922；USSN 10/902,588）ならびに280H, 280Qおよび280Y（USSN 10/370,749）（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）。 In particular, a variant that exhibits altered binding to one or more human Fc receptors, as described herein, can comprise an amino acid modification of a light chain constant region selected from the group consisting of: 108D , 108I, 108Q, 109D, 109P, 109R, 110E, 110I, 110K, 111E, 111K, 111L, 112E, 112R, 112Y, 114D, 114I, 114K, 116T, 121D, 122R, 122S, 122Y, 123L, 123R, 124E , 125E, 125K, 126D, 126L, 126Q, 127A, 127D, 127K, 128N, 129E, 129I, 129K, 131T, 137K, 137S, 138D, 138K, 138L, 140E, 140H, 140K, 141E, 141K, 142D, 142G , 142L, 143A, 143L, 143R, 145D, 145T, 145Y, 147A, 147E, 147K, 149D, 149Y, 150A, 151I, 151K, 152L, 152R, 152S, 153D, 153H, 153S, 154E, 154R, 154V, 155E , 155I, 155K, 156A, 156D, 156R, 157N, 158D, 158L, 158R, 159E, 159K, 159L, 160K, 160V, 161K, 161L, 162T, 163E, 163K, 163T, 164Q, 165K, 165P, 165Y, 166E , 166M, 166S, 167K, 167L, 168K, 168Q, 168Y, 169D, 169H, 169S, 170I, 170N, 170R, 171A, 171N, 171V, 172E, 172I, 172K, 173K, 173L, 173Q, 174A, 176T, 180E , 180K, 1 80S, 181K, 182E, 182R, 182T, 183D, 183L, 183P, 184E, 184K, 184Y, 185I, 185Q, 185R, 187K, 187Y, 188E, 188S, 188Y, 189D, 189K, 189Y, 190E, 190L, 190R, 191E, 191R, 191S, 193E, 193K, 193S, 195I, 195K, 195Q, 197E, 197K, 197L, 199E, 199K, 199Y, 200S, 202D, 202R, 202Y, 203D, 203L, 203R, 204T, 205E, 205K, 206E, 206I, 206K, 207A, 207E, 207L, 208E, 208K, 208T, 210A, 210E, 210K, 211A, 211E, 211P, 212E, 212K, 212T, 213L, 213R (where the numbering is according to the EU index) .
Still other substitutions that can also be used in the present invention include other substitutions that modulate Fc receptor affinity, FcγR-mediated effector function, and / or complement-mediated effector function, said substitutions comprising: (But not limited to): 298A, 298T, 326A, 326D, 326E, 326W, 326Y, 333A, 333S, 334L and 334A (US 6,737,056; Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276 (9): 6591 -6604; US 6,528,624; Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166: 2571-2572), 247L, 255L, 270E, 392T, 396L and 421K (USSN 10 / 754,922; USSN 10 / 902,588) and 280H, 280Q and 280Y (USSN 10 / 370,749) (each of which is hereby incorporated by reference).

他の実施態様では、本発明の抗体は、FcRn結合の変化を示す定常重鎖変種と合わせることができる。これらは、pH特異的態様でFcRn親和性を改変する改変を含む。特に、FcRnとのFc結合が強くなる変種は以下を含む（ただしこれらに限定されない：250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L（Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216；Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356；USSN 11/102621；PCT/US2003/033037；PCT/US2004/011213；USSN 10/822300；USSN 10/687118；PCT/US2004/034440；USSN 10/966673（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A（Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604；USSN 10/982470, US6737056；USSN 11/429793；USSN 11/429786；PCT/US2005/029511；USSN 11/208422（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S（Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180；US7083784；PCT/US97/03321；US6821505；PCT/US01/48432；USSN 11/397328（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279E, 279Q, 279Y, 281の後にSerの挿入、283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y, 311V, 385H, 385N（PCT/US2005/041220；USSN 11/274065；USSN 11/436,266（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、204D, 284E, 285E, 286Dおよび290E（PCT/US2004/037929、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
本発明のいくつかの実施態様では、抗体はアイソタイプ改変を含むことができる。前記改変は、また別のIgGのアミノ酸タイプへの親IgGの改変である。例えば図1に示すように、IgG1/IgG3ハイブリッド変種は、CH2および／またはCH3領域内のIgG1の複数箇所を、2つのアイソタイプで異なる箇所のIgG3由来のアミノ酸で置換することによって構築することができる。したがって、274Q、276K、300F、339T、356E、358M384S、392N、397M、422I、435Rおよび436Fから成る群から選択される1つ以上の置換を含むハイブリッド変種IgG抗体を構築することができる。本発明の他の実施態様では、IgG1/IgG2ハイブリッド変種は、CH2および／またはCH3領域内のIgG2の複数箇所を、2つのアイソタイプで異なる箇所のIgG1由来のアミノ酸で置換することによって構築することができる。したがって、233E、234L、235L、-236G（236位でのグリシンの挿入に該当する）および327Aから成る群から選択される1つ以上の改変を含むハイブリッド変種IgG抗体を構築することができる。 In other embodiments, the antibodies of the invention can be combined with constant heavy chain variants that exhibit altered FcRn binding. These include modifications that modify FcRn affinity in a pH specific manner. In particular, variants that enhance Fc binding to FcRn include (but are not limited to: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q / 428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279 (8 ): 6213-6216; Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176: 346-356; USSN 11/102621; PCT / US2003 / 033037; PCT / US2004 / 011213; USSN 10/822300; USSN 10/687118; PCT / US2004 USSN 10/966673 (each of which is hereby incorporated by reference), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276 (9): 6591-6604; USSN 10/982470, US6737056; USSN 11/429793; USSN 11/429786; PCT / US2005 / 029511; USSN 11/208422 (see above for reference) Included in this specification), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y / 254T / 256E, 433K / 434F / 436H, 308T / 309P / 311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002 , 169: 5171-5180; US7083784; PCT / US97 / 03321; US6821505; PCT / US01 / 48432; USSN 11/397328, each of which is incorporated herein by reference, 257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279E, 279Q, 279Y, 281 followed by Ser insertion, 283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y, 311V, 385H, 385N (PCT / US2005 / 041220; USSN 11/274065; USSN 11 / 436,266 (previously Each of which is incorporated herein by reference), 204D, 284E, 285E, 286D and 290E (PCT / US2004 / 037929, which is incorporated herein by reference).
In some embodiments of the invention, the antibody can include an isotype modification. Said modification is a modification of the parent IgG to another IgG amino acid type. For example, as shown in FIG. 1, an IgG1 / IgG3 hybrid variant can be constructed by substituting multiple isoforms of IgG1 within the CH2 and / or CH3 region with amino acids derived from IgG3 at two different isotypes. . Accordingly, hybrid variant IgG antibodies comprising one or more substitutions selected from the group consisting of 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M384S, 392N, 397M, 422I, 435R and 436F can be constructed. In another embodiment of the invention, the IgG1 / IgG2 hybrid variant can be constructed by substituting multiple portions of IgG2 within the CH2 and / or CH3 region with amino acids derived from IgG1 at two different isotypes. it can. Accordingly, a hybrid variant IgG antibody can be constructed comprising one or more modifications selected from the group consisting of 233E, 234L, 235L, -236G (corresponding to glycine insertion at position 236) and 327A.

エフェクター機能の最適化
本発明は、1つ以上のFcレセプターに対する親和性を改変し、および／または1つ以上のエフェクター機能を媒介する抗体の能力を改変する手段を含む抗体を目的とする。本発明の改変には、アミノ酸改変（例えばエフェクター機能の最適化のための位置的手段、エフェクター機能の最適化のための置換的手段など）および糖型改変（例えば糖型の改変）が含まれる。
アミノ酸改変：
USSN 11/124,620（2005年5月5日出願、”Optimized Fc Variants”（前記文献は参照により本明細書に含まれる））に記載されているように、エフェクター機能を最適化するための位置的手段には、1つ以上の重鎖定常領域の位置（例えば221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336および337位）におけるアミノ酸の改変が含まれ（ただし前記に限定されない）、前記は、抗体のFcγR結合特性、エフェクター機能および潜在的臨床特性の改変を可能にする。
特に、エフェクター機能の最適化のため（1つ以上のヒトFcレセプターとの結合の改変のため）の置換的手段には、1つ以上の重鎖定常領域内位置のアミノ酸の置換（ただしこれに限定されない）、例えば重鎖定常領域内の以下の1つ以上のアミノ酸置換が含まれる：221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H,および337N（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。 Optimization of Effector Function The present invention is directed to antibodies comprising means for altering affinity for one or more Fc receptors and / or altering the ability of the antibody to mediate one or more effector functions. Modifications of the present invention include amino acid modifications (eg, positional means for optimizing effector functions, substitution means for optimizing effector functions, etc.) and glycoform modifications (eg, glycoform modifications). .
Amino acid modification :
Positional for optimizing effector function as described in USSN 11 / 124,620 (filed May 5, 2005, “Optimized Fc Variants”, which is incorporated herein by reference). Means include one or more heavy chain constant region positions (eg 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 and 337) The (but not limited to) allows for modification of the FcγR binding properties, effector functions and potential clinical properties of the antibody.
In particular, substitutional means for optimizing effector function (to modify binding to one or more human Fc receptors) include substitution of amino acids in one or more heavy chain constant regions (but including Including, but not limited to, one or more of the following amino acid substitutions within the heavy chain constant region: 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K , 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K , 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234S, 234R, 234S , 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D236F, 236D, 236E , 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265T 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268D 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269 L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290Y 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 2 93H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294V 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299P 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325L 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337 H, and 337N (where the numbering is according to the EU index).

USSN 11/090,981（2005年3月24日出願、"Immunoglobulin variants outside the Fc region”、（前記文献は参照により本明細書に含まれる））に記載されたように、エフェクター機能の最適化のための位置的手段には、1つ以上の重鎖定常領域内位置（例えば118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 147, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235および236位）におけるアミノ酸の改変が含まれ（ただし前記に限定されない）、前記は、抗体のFcγR結合特性、エフェクター機能および潜在的臨床特性の改変を可能にする。
USSN 11/090,981（2005年3月24日出願、"Immunoglobulin variants outside the Fc region”、（前記文献は参照により本明細書に含まれる））に記載されたように、エフェクター機能の最適化のための位置的手段には、1つ以上の軽鎖定常領域内位置（例えば108, 109, 110, 111, 112, 114, 116, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 197, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, 212, 213位）におけるアミノ酸の改変が含まれ（ただし前記に限定されない）、前記は、抗体のFcγR結合特性、エフェクター機能および潜在的臨床特性の改変を可能にする。 USSN 11 / 090,981 (filed Mar. 24, 2005, "Immunoglobulin variants outside the Fc region", which is incorporated herein by reference) for optimization of effector functions. The positional means include one or more heavy chain constant region positions (eg 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139 , 147, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176 , 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 209 , 210, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235 and 236 Amino acid modifications at (positions) include (but are not limited to), which allow modification of the FcγR binding properties, effector functions and potential clinical properties of the antibody.
USSN 11 / 090,981 (filed Mar. 24, 2005, "Immunoglobulin variants outside the Fc region", which is incorporated herein by reference) for optimization of effector functions. The positional means include one or more light chain constant region positions (eg, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 116, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 , 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 , 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 197, 199 , 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, 212, 213), including but not limited to, FcγR binding properties of the antibody, Allows modification of effector function and potential clinical properties.

特に、1つ以上のヒトFcレセプターとの結合を改変するための置換的手段には、1つ以上の重鎖定常領域内位置のアミノ酸の置換（ただしこれに限定されない）、例えば1つ以上の以下の置換が含まれる：118K, 118E, 118Y, 119R, 119E, 119Y, 120R, 120E, 120I, 121E, 121Y, 121H, 122E, 122R, 124K, 124E, 124Y, 126K, 126D, 129L, 129D, 131G, 131T, 132D, 132R, 132L, 133R, 133E, 133L, 135I, 135E, 135K, 136E, 136K, 136I, 137E, 138S, 138R, 138D, 139I, 139E, 139K, 147A, 147E, 148Y, 148K, 150L, 150K, 150E, 151A, 151D, 152L, 152K, 153L, 153D, 155E, 155K, 155I, 157E, 157K, 157Y, 159K, 159D, 159L, 160K, 160E, 160Y, 161D, 162D, 162K, 162Y, 163R, 164R, 164E, 164Y, 165D, 165R, 165Y, 166D, 167A, 168L, 169E, 171G, 171H, 172K, 172L, 172E, 173T, 173D, 174E, 174K, 174Y, 175D, 175L, 176D, 176R, 176L, 177R, 177E, 177Y, 178D, 179K, 179Y, 179E, 180K, 180L, 180E, 183T, 187I, 187K, 187E, 188I, 189D, 189G, 190I, 190K, 190E, 191D, 191R, 191Y, 192N, 192R, 192L, 193F, 193E, 194R, 194D, 195R, 195D, 195Y, 196K, 196D, 196L, 197R, 197E, 197Y, 198L, 199T, 199D, 199K, 201E, 201K, 201L, 203D, 203L, 203K, 205D, 205L, 206A, 206E, 207K, 207D, 208R, 208E, 208Y, 209E, 209K, 209Y, 210L, 210E, 210Y, 211R, 211E, 211Y, 212Q, 212K, 212H, 212L, 212Y, 213N, 213E, 213H, 213L, 213Y, 214N, 214E, 214H, 214L, 214Y, 216N, 216K, 216H, 216L, 216Y, 217D, 217H, 217A, 217V, 217G, 218D, 218E, 218Q, 218T, 218H, 218L, 218Y, 219D, 219E, 219Q, 219K, 219T, 219H, 219L, 219I, 219Y, 205A, 210A, 213A, 214A, 218A, 221K, 221Y, 221E, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221H, 221A, 221V, 221L, 221I, 221F, 221M, 221W, 221P, 221G, 222E, 222Y, 222D, 222N, 222Q, 222R, 222S, 222T, 222H, 222V, 222L, 222I, 222F, 222M, 222W, 222P, 222G, 222A, 223D, 223N, 223Q, 223R, 223S, 223H, 223A, 223V, 223L, 223I, 223F, 223M, 223Y, 223W, 223P, 223G, 223E, 223K, 224D, 224N, 224Q, 224K, 224R, 224S, 224T, 224V, 224L, 224I, 224F, 224M, 224W, 224P, 224G, 224E, 224Y, 224A, 225D, 225N, 225Q, 225R, 225S, 225H, 225A, 225V, 225L, 225I, 225F, 225M, 225Y, 225P, 225G, 225E, 225K, 225W, 226S, 227E, 227K, 227Y, 227G, 227D, 227N, 227Q, 227R, 227S, 227T, 227H, 227A, 227V, 227L, 227I, 227F, 227M, 227W, 228K, 228Y, 228G, 228D, 228N, 228Q, 228R, 228T, 228H, 228A, 228V, 228L, 228I, 228F, 228M, 228W, 229S, 230A, 230E, 230Y, 230G, 230D, 230N, 230Q, 230K, 230R, 230S, 230T, 230H, 230V, 230L, 230I, 230F, 230M, 230W, 231K, 231P, 231D, 231N, 231Q, 231R, 231S, 231T, 231H, 231V, 231L, 231I, 231F, 231M, 231W, 232E, 232K, 232Y, 232G, 232D, 232N, 232Q, 232R, 232S, 232T, 232H, 232A, 232V, 232L, 232I, 232F, 232M, 232W, 233D, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233H, 233A, 233V, 233L, 233I, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234G, 235D, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 235E, 235K, 235R, 235A, 235M, 235W, 235P, 235G, 236D, 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S, 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 236I, 236F, 236M, 236Y, 236Wおよび236P（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。 In particular, substitutional means for altering binding to one or more human Fc receptors include, but are not limited to, substitution of amino acids in one or more heavy chain constant regions, such as one or more The following substitutions are included: 118K, 118E, 118Y, 119R, 119E, 119Y, 120R, 120E, 120I, 121E, 121Y, 121H, 122E, 122R, 124K, 124E, 124Y, 126K, 126D, 129L, 129D, 131G , 131T, 132D, 132R, 132L, 133R, 133E, 133L, 135I, 135E, 135K, 136E, 136K, 136I, 137E, 138S, 138R, 138D, 139I, 139E, 139K, 147A, 147E, 148Y, 148K, 150L , 150K, 150E, 151A, 151D, 152L, 152K, 153L, 153D, 155E, 155K, 155I, 157E, 157K, 157Y, 159K, 159D, 159L, 160K, 160E, 160Y, 161D, 162D, 162K, 162Y, 163R , 164R, 164E, 164Y, 165D, 165R, 165Y, 166D, 167A, 168L, 169E, 171G, 171H, 172K, 172L, 172E, 173T, 173D, 174E, 174K, 174Y, 175D, 175L, 176D, 176R, 176D, 176R , 177R, 177E, 177Y, 178D, 179K, 179Y, 179E, 180K, 180L, 180E, 183T, 187I, 187K, 187E, 188I, 189D, 189G, 190I, 190K, 190E, 191D, 191R, 191Y, 192N, 192R , 192L, 193F, 193E, 194R, 194D, 195R, 195D, 195Y, 196K, 196D, 196L, 197R, 197E, 197Y, 198L, 199T, 199D, 199K, 201E, 201K, 201L, 203D, 203L, 203K, 205D, 205L, 206A, 206E, 207K, 207D, 208R, 208E, 208Y, 209E, 209K, 209Y, 210L, 210E, 210Y, 211R, 211E, 211Y, 212Q, 212K, 212H, 212L, 212Y, 213N, 213E, 213H, 213L, 213Y, 214N, 214E, 214H, 214L, 214Y, 216N, 216K, 216H, 216L, 216Y, 217D, 217H, 217A, 217V, 217G, 218D, 218E, 218Q, 218T, 218H, 218L, 218Y, 219D, 219E, 219Q, 219K, 219T, 219H, 219L, 219I, 219Y, 205A, 210A, 213A, 214A, 218A, 221K, 221Y, 221E, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221H, 221A, 221V, 221L 221I, 221F, 221M, 221W, 221P, 221G, 222E, 222Y, 222D, 222N, 222Q, 222R, 222S, 222T, 222H, 222V, 222L, 222I, 222F, 222M, 222W, 222P, 222G, 222A, 223D, 223N, 223Q, 223R, 223S, 223H, 223A, 223V, 223L, 223I, 223F, 223M, 223Y, 223W, 223P, 223G, 223E, 223K, 224D, 224N, 224Q, 224K, 224R, 224S, 224T, 224V 224L, 224I, 224F, 224M, 224W, 224P, 224G, 224E, 224Y, 224A, 225D, 225N, 225Q, 225R, 225S, 225H, 225 A, 225V, 225L, 225I, 225F, 225M, 225Y, 225P, 225G, 225E, 225K, 225W, 226S, 227E, 227K, 227Y, 227G, 227D, 227N, 227Q, 227R, 227S, 227T, 227H, 227A, 227H, 227A 227V, 227L, 227I, 227F, 227M, 227W, 228K, 228Y, 228G, 228D, 228N, 228Q, 228R, 228T, 228H, 228A, 228V, 228L, 228I, 228F, 228M, 228W, 229S, 230A, 230E 230Y, 230G, 230D, 230N, 230Q, 230K, 230R, 230S, 230T, 230H, 230V, 230L, 230I, 230F, 230M, 230W, 231K, 231P, 231D, 231N, 231Q, 231R, 231S, 231T, 231H, 231V, 231L, 231I, 231F, 231M, 231W, 232E, 232K, 232Y, 232G, 232D, 232N, 232Q, 232R, 232S, 232T, 232H, 232A, 232V, 232L, 232I, 232F, 232M, 232W, 233 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233H, 233A, 233V, 233L, 233I, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234G, 235D, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 235E, 235K, 235R, 235A, 235M, 235W, 235P, 235G, 236G 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S, 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 236I, 236F, 236M, 236Y, 236W and 236P (numbering here follows the EU index).

特に、1つ以上のヒトFcレセプターとの結合を改変するための置換的手段には、1つ以上の軽鎖定常領域内位置のアミノ酸の置換（ただしこれに限定されない）、例えば軽鎖定常領域内位置の1つ以上の以下のアミノ酸置換が含まれる：108D, 108I, 108Q, 109D, 109P, 109R, 110E, 110I, 110K, 111E, 111K, 111L, 112E, 112R, 112Y, 114D, 114I, 114K, 116T, 121D, 122R, 122S, 122Y, 123L, 123R, 124E, 125E, 125K, 126D, 126L, 126Q, 127A, 127D, 127K, 128N, 129E, 129I, 129K, 131T, 137K, 137S, 138D, 138K, 138L, 140E, 140H, 140K, 141E, 141K, 142D, 142G, 142L, 143A, 143L, 143R, 145D, 145T, 145Y, 147A, 147E, 147K, 149D, 149Y, 150A, 151I, 151K, 152L, 152R, 152S, 153D, 153H, 153S, 154E, 154R, 154V, 155E, 155I, 155K, 156A, 156D, 156R, 157N, 158D, 158L, 158R, 159E, 159K, 159L, 160K, 160V, 161K, 161L, 162T, 163E, 163K, 163T, 164Q, 165K, 165P, 165Y, 166E, 166M, 166S, 167K, 167L, 168K, 168Q, 168Y, 169D, 169H, 169S, 170I, 170N, 170R, 171A, 171N, 171V, 172E, 172I, 172K, 173K, 173L, 173Q, 174A, 176T, 180E, 180K, 180S, 181K, 182E, 182R, 182T, 183D, 183L, 183P, 184E, 184K, 184Y, 185I, 185Q, 185R, 187K, 187Y, 188E, 188S, 188Y, 189D, 189K, 189Y, 190E, 190L, 190R, 191E, 191R, 191S, 193E, 193K, 193S, 195I, 195K, 195Q, 197E, 197K, 197L, 199E, 199K, 199Y, 200S, 202D, 202R, 202Y, 203D, 203L, 203R, 204T, 205E, 205K, 206E, 206I, 206K, 207A, 207E, 207L, 208E, 208K, 208T, 210A, 210E, 210K, 211A, 211E, 211P, 212E, 212K, 212T, 213L, 213R（ここで番号付与はEUインデックスにしたがう）。
本発明でまた用いることができるさらに別の置換的手段には、Fcレセプター親和性、FcγR-媒介エフェクター機能、および／または補体媒介エフェクター機能を調節するための置換的手段、例えば1つ以上の以下のアミノ酸置換が含まれる：298A, 298T, 326A, 326D, 326E, 326W, 326Y, 333A, 333S, 334Lおよび334A（US 6,737,056；Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604；US 6,528,624；Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572)、247L, 255L, 270E, 392T, 396Lおよび421K（USSN 10/754,922；USSN 10/902,588）ならびに280H, 280Qおよび280Y（USSN 10/370,749）（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）。 In particular, substitutional means for altering binding to one or more human Fc receptors include, but are not limited to, substitution of amino acids at positions within one or more light chain constant regions, such as the light chain constant region. One or more of the following amino acid substitutions in the internal position are included: 108D, 108I, 108Q, 109D, 109P, 109R, 110E, 110I, 110K, 111E, 111K, 111L, 112E, 112R, 112Y, 114D, 114I, 114K , 116T, 121D, 122R, 122S, 122Y, 123L, 123R, 124E, 125E, 125K, 126D, 126L, 126Q, 127A, 127D, 127K, 128N, 129E, 129I, 129K, 131T, 137K, 137S, 138D, 138K , 138L, 140E, 140H, 140K, 141E, 141K, 142D, 142G, 142L, 143A, 143L, 143R, 145D, 145T, 145Y, 147A, 147E, 147K, 149D, 149Y, 150A, 151I, 151K, 152L, 152R , 152S, 153D, 153H, 153S, 154E, 154R, 154V, 155E, 155I, 155K, 156A, 156D, 156R, 157N, 158D, 158L, 158R, 159E, 159K, 159L, 160K, 160V, 161K, 161L, 162T , 163E, 163K, 163T, 164Q, 165K, 165P, 165Y, 166E, 166M, 166S, 167K, 167L, 168K, 168Q, 168Y, 169D, 169H, 169S, 170I, 170N, 170R, 171A, 171N, 171V, 172E, 172I, 172K, 173K, 173L, 173Q, 174A, 176T, 180E, 180K, 180S, 181K, 182E, 182R, 182T, 183D, 183L, 183P, 184E, 184K, 184Y, 185I, 185Q, 185R, 187K, 187Y, 188E, 188S, 188Y, 189D, 189K, 189Y, 190E, 190L, 190R, 191E, 191R, 191S, 193E, 193K, 193S, 195I, 195K, 195Q, 197E, 197K, 197L, 199E, 199K, 199Y, 200S, 202D, 202R, 202Y, 203D, 203L, 203R, 204T, 205E, 205K, 206E, 206I, 206K, 207A, 207E, 207L, 208E, 208K, 208T, 210A, 210E, 210K, 211A, 211E, 211P, 212E, 212K, 212T, 213L, 213R (where the numbering is according to the EU index).
Yet another alternative means that can also be used in the present invention includes alternative means for modulating Fc receptor affinity, FcγR-mediated effector function, and / or complement-mediated effector function, such as one or more The following amino acid substitutions are included: 298A, 298T, 326A, 326D, 326E, 326W, 326Y, 333A, 333S, 334L and 334A (US 6,737,056; Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276 (9): 6591 -6604; US 6,528,624; Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166: 2571-2572), 247L, 255L, 270E, 392T, 396L and 421K (USSN 10 / 754,922; USSN 10 / 902,588) and 280H, 280Q and 280Y (USSN 10 / 370,749) (each of which is hereby incorporated by reference).

他の実施態様では、本発明の抗体は、FcRn結合を改変する手段と結合させることができる。例えば、本発明の抗体は定常重鎖変種と結合させることができる。これらは、pH特異的態様でFcRn親和性を改変する手段を含むことができる。特に、FcRnとのFc結合を高める置換的手段には、以下のアミノ酸置換の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L（Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216；Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356；USSN 11/102621；PCT/US2003/033037；PCT/US2004/011213；USSN 10/822300；USSN 10/687118；PCT/US2004/034440；USSN 10/966673（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A（Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604；USSN 10/982470, US6737056；USSN 11/429793；USSN 11/429786；PCT/US2005/029511；USSN 11/208422（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S（Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180；US7083784；PCT/US97/03321；US6821505；PCT/US01/48432；USSN 11/397328（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279E, 279Q, 279Y, 281の後にSerの挿入、283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y, 311V, 385H, 385N（PCT/US2005/041220；USSN 11/274065；USSN 11/436,266（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）、204D, 284E, 285E, 286Dおよび290E（PCT/US2004/037929、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
本発明のいくつかの実施態様では、抗体はアイソタイプ改変のための手段を含むことができる。前記手段は、また別のIgGのアミノ酸タイプへの親IgGにおける改変である。例えば図1に示すように、IgG1/IgG3ハイブリッド変種は、CH2および／またはCH3領域内のIgG1の複数箇所を、2つのアイソタイプで異なる箇所にあるIgG3のアミノ酸で置換する置換的手段によって構築することができる。したがって、1つ以上の置換的手段、例えば274Q、276K、300F、339T、356E、358M384S、392N、397M、422I、435Rおよび436Fを含むハイブリッド変種IgG抗体を構築することができる。本発明の他の実施態様では、IgG1/IgG2ハイブリッド変種は、CH2および／またはCH3領域内のIgG2の複数箇所を、2つのアイソタイプで異なる箇所にあるIgG1のアミノ酸で置換する置換的手段によって構築することができる。したがって、1つ以上の置換的手段、例えば以下のアミノ酸置換の1つ以上を含むハイブリッド変種IgG抗体を構築することができる：233E、234L、235L、-236G（236位でのグリシンの挿入に該当する）および327A。 In other embodiments, the antibodies of the invention can be conjugated to a means of altering FcRn binding. For example, an antibody of the invention can be conjugated to a constant heavy chain variant. These can include means to modify FcRn affinity in a pH specific manner. In particular, substitutional means to enhance Fc binding to FcRn include (but are not limited to) one or more of the following amino acid substitutions: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q / 428L (Hinton et al. , 2004, J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6216; Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176: 346-356; USSN 11/102621; PCT / US2003 / 033037; PCT / US2004 / 011213; USSN USSN 10/687118; PCT / US2004 / 034440; USSN 10/966673, each of which is incorporated herein by reference, 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276 (9): 6591-6604; USSN 10/982470, US6737056; USSN 11/429793; USSN 11/429786; PCT / US2005 / 029511 USSN 11/208422 (each of which is incorporated herein by reference), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y / 254T / 256E, 433K / 434F / 436H, 308T / 30 9P / 311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169: 5171-5180; US7083784; PCT / US97 / 03321; US6821505; PCT / US01 / 48432; USSN 11/397328, each of which is incorporated herein by reference. 257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279E, 279Q, 279Y, 281 followed by Ser insertion, 283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y, 311V, 385H, 385N (PCT / US2005 USSN 11/274065; USSN 11 / 436,266 (each of which is hereby incorporated by reference), 204D, 284E, 285E, 286D and 290E (PCT / US2004 / 037929, which is hereby incorporated by reference) Included in the book).
In some embodiments of the invention, the antibody can include a means for isotype modification. Said means is a modification in the parent IgG to another IgG amino acid type. For example, as shown in FIG. 1, IgG1 / IgG3 hybrid variants are constructed by substitutional means of substituting multiple IgG1 sites in the CH2 and / or CH3 regions with IgG3 amino acids at two different isotypes. Can do. Thus, hybrid variant IgG antibodies can be constructed that include one or more alternative means, such as 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M384S, 392N, 397M, 422I, 435R and 436F. In another embodiment of the invention, the IgG1 / IgG2 hybrid variant is constructed by a substitutional means of substituting multiple IgG2 sites in the CH2 and / or CH3 region with IgG1 amino acids at two different isotypes. be able to. Thus, hybrid variant IgG antibodies can be constructed that contain one or more substitution means, eg, one or more of the following amino acid substitutions: 233E, 234L, 235L, -236G (corresponds to insertion of glycine at position 236) ) And 327A.

糖型改変：
多くのポリペプチド（抗体を含む）は、炭水化物部分を含む多様な翻訳後修飾（例えばオリゴ糖によるグリコシル化）を受ける。グリコシル化に影響を与えることができるいくつかの因子が存在する。種、組織及び細胞タイプはいずれも、グリコシル化が生じる態様で重要であることが示された。さらにまた、細胞外環境（例えば血清濃度のような培養条件の変化を介する）は、グリコシル化に直接的に影響することができる（Lifely et al. 1995, Glycobiology 5(8):813-822、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
全ての抗体が、重鎖定常領域内の保存された位置に炭水化物を含む。各抗体アイソタイプはそれぞれ別個の種々のN-結合炭水化物構造を有する。重鎖に結合した炭水化物の他に、30％までのヒトIgGがグリコシル化されたFab領域を有する。IgGは、CH2ドメインのAsn297にただ1つのN-結合二アンテナ性炭水化物を有する。血清由来、又はハイブリドーマもしくは操作細胞のex vivo生成IgGの場合、IgGはAsn297結合炭水化物に関して不均一である（Jeffris et al. 1998, Immunol Rev 163:59-76；Wright et al. 1997, Trends Biotech 15:26-32、前記両文献は参照により本明細書に含まれる）。ヒトIgGの場合、コアのオリゴ糖は通常GlcNAc₂Man₃GlcNAcから成る（外側残基の数は異なる）。
本発明の炭水化物部分は、オリゴ糖の説明に一般的に用いられる命名法を参照して記載されるであろう。この命名法を用いる炭水化物化学の概要は以下で見出される：Hubbard et al. 1981, Ann Rev Biochem 50:555-583（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。この命名法には例えば以下が含まれる：Man（マンノースを表す）；GlcNAc（2-Ｎ-アセチルグルコサミンを表す）；Gal（ガラクトースを表す）；Fuc（フコース）；Glc（グルコースを表す）。シアリン酸は便法表記によって記載され、NeuNAcは5-N-アセチルノイラミン酸を、NeuNGcは5-グリコリルノイラミン酸を表す。
“グリコシル化”という用語は、糖タンパク質へのオリゴ糖（一緒に結合した2つ以上の単純糖（例えば一緒に結合した2から約12の単純糖）を含む）の結合を意味する。オリゴ糖の側鎖は、典型的にはN-又はO-結合を介して糖タンパク質の骨格と結合される。本発明のオリゴ糖は、一般的にはN-結合オリゴ糖としてFc領域のCH2ドメインと結合している。“N-結合グリコシル化”は、糖タンパク質鎖中のアスパラギン残基と炭水化物部分の結合に適用される。当業者は、例えばネズミのIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3の各々は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgGAおよびIgD CH2ドメインと同様に、アミノ酸残基297にただ1つのN-結合グリコシル化部位を有することを理解していよう（Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。 Glycoform modification :
Many polypeptides (including antibodies) are subject to a variety of post-translational modifications (eg, glycosylation with oligosaccharides) including carbohydrate moieties. There are several factors that can affect glycosylation. Species, tissues and cell types have all been shown to be important in the manner in which glycosylation occurs. Furthermore, the extracellular environment (eg through changes in culture conditions such as serum concentration) can directly affect glycosylation (Lifely et al. 1995, Glycobiology 5 (8): 813-822, Which is incorporated herein by reference).
All antibodies contain carbohydrates at conserved positions within the heavy chain constant region. Each antibody isotype has a distinct and different N-linked carbohydrate structure. In addition to carbohydrate attached to the heavy chain, up to 30% human IgG has a Fab region that is glycosylated. IgG has only one N-linked biantennary carbohydrate in Asn297 of the CH2 domain. In the case of serum-derived or ex vivo generated IgG from hybridomas or engineered cells, the IgG is heterogeneous with respect to Asn297-linked carbohydrate (Jeffris et al. 1998, Immunol Rev 163: 59-76; Wright et al. 1997, Trends Biotech 15 : 26-32, both of which are incorporated herein by reference). For human IgG, the core oligosaccharide usually consists of GlcNAc ₂ Man ₃ GlcNAc (the number of outer residues is different).
The carbohydrate moieties of the present invention will be described with reference to nomenclature commonly used in describing oligosaccharides. A summary of carbohydrate chemistry using this nomenclature is found below: Hubbard et al. 1981, Ann Rev Biochem 50: 555-583, which is incorporated herein by reference. This nomenclature includes, for example: Man (representing mannose); GlcNAc (representing 2-N-acetylglucosamine); Gal (representing galactose); Fuc (fucose); Glc (representing glucose). Sialic acid is described by the convenience notation, NeuNAc represents 5-N-acetylneuraminic acid, and NeuNGc represents 5-glycolylneuraminic acid.
The term “glycosylation” refers to the attachment of oligosaccharides (including two or more simple sugars joined together (eg, 2 to about 12 simple sugars joined together)) to a glycoprotein. The oligosaccharide side chains are typically attached to the glycoprotein backbone via N- or O-linkages. The oligosaccharide of the present invention is generally bound to the CH2 domain of the Fc region as an N-linked oligosaccharide. “N-linked glycosylation” applies to the attachment of an asparagine residue and a carbohydrate moiety in a glycoprotein chain. Those skilled in the art, for example, that each of murine IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 has only one N-linked glycosylation site at amino acid residue 297, similar to the human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgGA and IgD CH2 domains. (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, which is incorporated herein by reference).

本明細書の目的のために、“成熟コア炭水化物構造”は、Fc領域に結合したプロセッシングを受けたコア炭水化物構造に適用され、前記は、一般的には、二アンテナ性オリゴ糖に典型的な以下の炭水化物構造GlcNAc(フコース)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)₂から成る。成熟コア炭水化物構造は、糖タンパク質のFc領域、一般的にはFc領域CH2ドメインのAsn297にN-結合を介して結合される。“二分GlcNAc”は、成熟コア炭水化物構造のβ1,4マンノースと結合したGlcNAc残基である。二分GlcNAcは、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII酵素（GnTIII）によって、成熟コア炭水化物構造に酵素的に結合させることができる。CHO細胞は、通常はGnTIIIを発現しないが（Stanley et al. J Biol Chem 261:13370-13378）、操作により発現するようにできる（Umana et al. 1999, Nature Biotech 17:176-180）。
本発明は、改変された糖型又は操作された糖型を含む抗体を意図する。本明細書で用いられる“改変された糖型”又は“操作された糖型”は、タンパク質（例えば抗体）と共有結合した炭水化物組成物を意味し、この場合、前記炭水化物組成物は親タンパク質のそれとは化学的に異なる。操作された糖型は、多様な目的（FcγR-媒介エフェクター機能の増強又は低下を含むが、ただし前記に限定されない）のために有用でありえる。ある実施態様では、本発明の抗体は、Fc領域と共有結合したフコシル化オリゴ糖および／または二分オリゴ糖のレベルを制御するために改変される。
歴史的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）（もっとも一般的に用いられる工業的宿主の１つ）で産生される抗体は、集団中に約2から6％の非フコシル化抗体を含む。しかしながら、YB2/0（ラットミエローマ）及びLec13細胞株（CHO株のレクチン変異体で、不完全なGDP-マンノース4,6デヒドラターゼを有しGDP-フコース又はGDP-糖中間体（α1,6-フコシルトランスフェラーゼの基質）の欠如をもたらす（Ripka et al. 1986））は、78％から98％の非フコシル化種を含む抗体を産生することができる。残念なことに、これらの細胞の抗体収量は極めて少なく、したがってこれらの細胞株は治療用抗体生成物を産業的に製造するためには有用ではない。FUT8遺伝子は、フコシル残基のGDP-フコースからN-グリカンのAsn-結合（N-結合）GlcNAcの6位への移転を触媒する、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする。（Yanagidani et al. 1997, J Biochem 121:626-632）。α1,6-フコシルトランスフェラーゼは、IgG抗体のCH2ドメイン内のAsn297のN-結合二アンテナ性炭水化物にフコースを付加するために必要なただ1つの酵素であることが知られている。 For the purposes of this specification, “mature core carbohydrate structure” applies to processed core carbohydrate structures attached to the Fc region, which are generally typical of biantennary oligosaccharides. It consists of the following carbohydrate structure GlcNAc (fucose) -GlcNAc-Man- (Man-GlcNAc) ₂ . The mature core carbohydrate structure is linked via an N-link to the Fc region of glycoproteins, generally Asn297 in the Fc region CH2 domain. A “bisected GlcNAc” is a GlcNAc residue linked to β1,4 mannose of the mature core carbohydrate structure. The bisecting GlcNAc can be enzymatically linked to the mature core carbohydrate structure by β (1,4) -N-acetylglucosaminyltransferase III enzyme (GnTIII). CHO cells do not normally express GnTIII (Stanley et al. J Biol Chem 261: 13370-13378) but can be expressed by manipulation (Umana et al. 1999, Nature Biotech 17: 176-180).
The present invention contemplates antibodies comprising modified or engineered glycoforms. As used herein, “modified glycoform” or “engineered glycoform” refers to a carbohydrate composition covalently linked to a protein (eg, an antibody), wherein the carbohydrate composition is the parent protein's. It is chemically different. Engineered glycoforms can be useful for a variety of purposes including, but not limited to, enhancing or reducing FcγR-mediated effector functions. In certain embodiments, the antibodies of the invention are modified to control the level of fucosylated and / or bisected oligosaccharides covalently linked to the Fc region.
Historically, antibodies produced in Chinese hamster ovary cells (CHO) (one of the most commonly used industrial hosts) contain about 2 to 6% non-fucosylated antibodies in the population. However, YB2 / 0 (rat myeloma) and Lec13 cell line (CHO strain lectin variant with incomplete GDP-mannose 4,6 dehydratase and GDP-fucose or GDP-sugar intermediate (α1,6-fucosyl) (Ripka et al. 1986)), which results in the lack of a substrate for transferase, can produce antibodies containing 78% to 98% non-fucosylated species. Unfortunately, the antibody yield of these cells is very low and therefore these cell lines are not useful for industrial production of therapeutic antibody products. The FUT8 gene encodes an α1,6-fucosyltransferase enzyme that catalyzes the transfer of fucosyl residues from GDP-fucose to the 6-position of Nn-glycan Asn-linked (N-linked) GlcNAc. (Yanagidani et al. 1997, J Biochem 121: 626-632). α1,6-fucosyltransferase is known to be the only enzyme required to add fucose to the N-linked biantennary carbohydrate of Asn297 in the CH2 domain of IgG antibodies.

改変された糖型を作製する多様な方法が当分野では周知である：（Umana et al. 1999, Nat Biotechnol 17:176-180；Davies et al. 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields et al 2002, J Biol Chem 277:2673-26740；Shinkawa et al. 2003, J Biol Chem 278:3466-3473）；（US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1）；（Yamae-Ohnuki et al. 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(5):614-621）；（Potelligent^TM technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ]；GlycoMAb^TM glycosylation engineering technology [GLYCART biotechnology AG, Zeurich, Switzerland]）、前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。これらの技術は、例えば多様な生物又は細胞株（操作されているにせよ、そうでないにせよ、例えばLec-13 CHO細胞又はラットハイブリドーマYB2/0細胞）でIgGを発現するか、グリコシル化経路に必要な酵素（例えばFUT8[α1,6-フコシルトランスフェラーゼ]および／またはβ1-4-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII [GnTIII]）を調節することによって、またはIgGが発現された後で炭水化物を改変することによって、Fc領域と共有結合されるフコシル化および／または二分オリゴ糖のレベルを制御する。
本発明の抗体の糖型を改変するための他の方法には、酵母（Li et al. 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215）、苔（Nechansky et al. 2007, Mol Immunjol 44(7):1826-8）及び植物（Cox et al. 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7）の糖操作株の使用が含まれる。糖型を改変する方法は以下を含むが、ただしこれらに限定されない：酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）の糖操作株（Li et al. 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215）の使用、苔フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）の糖操作株（酵素β1,2-キシロシルトランスフェラーゼおよび／またはα1,3-フコシルトランスフェラーゼはノックアウトされている（Nechansky et al. 2007, Mol Immunjol 44(7):1826-8））の使用、および水性植物レムナ・マイナー（Lemna minor）での内因性α1,3-フコシルトランスフェラーゼおよび／またはβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ阻害のためにRNA干渉を利用（Cox et al. 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7）。 A variety of methods for making modified glycoforms are well known in the art: (Umana et al. 1999, Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies et al. 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al 2002, J Biol Chem 277: 2673-26740; Shinkawa et al. 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473); (US 6,602,684; USSN 10 / 277,370; USSN 10 / 113,929; PCT WO 00 / 61739A1; PCT WO 01 / 29246A1; PCT WO 02 / 31140A1; PCT WO 02 / 30954A1); (Yamae-Ohnuki et al. 2004, Biotechnology and Bioengineering 87 (5): 614-621); (Potelligent ^TM technology [Biowa, Inc., Princeton GlycoMAb ^™ glycosylation engineering technology [GLYCART biotechnology AG, Zeurich, Switzerland]), all of which are incorporated herein by reference). These techniques can be used to express IgG in a variety of organisms or cell lines (whether engineered or not, such as Lec-13 CHO cells or rat hybridoma YB2 / 0 cells) Modify carbohydrates by modulating required enzymes (eg FUT8 [α1,6-fucosyltransferase] and / or β1-4-N-acetylglucosaminyltransferase III [GnTIII]) or after IgG is expressed Thereby controlling the level of fucosylation and / or bisecting oligosaccharides covalently linked to the Fc region.
Other methods for modifying the glycoforms of the antibodies of the invention include yeast (Li et al. 2006, Nature Biotechnology 24 (2): 210-215), moss (Nechansky et al. 2007, Mol Immunjol 44 ( 7): 1826-8) and the use of sugar engineered strains of plants (Cox et al. 2006, Nat Biotechnol 24 (12): 1591-7). Methods for modifying glycoforms include, but are not limited to: Use of the yeast Pichia pastoris glycoengineered strain (Li et al. 2006, Nature Biotechnology 24 (2): 210-215) , A glycosylated strain of Physcomitrella patens (enzymes β1,2-xylosyltransferase and / or α1,3-fucosyltransferase have been knocked out (Nechansky et al. 2007, Mol Immunjol 44 (7 ): 1826-8)) and use of RNA interference to inhibit endogenous α1,3-fucosyltransferase and / or β1,2-xylosyltransferase in the aquatic plant Lemna minor (Cox et al. 2006, Nat Biotechnol 24 (12): 1591-7).

操作される糖型には典型的には種々の炭水化物又はオリゴ糖が該当し、したがって、例えば抗体は操作糖型を含むことができる。また別には、操作糖型は種々の炭水化物又はオリゴ糖を含む抗体に適用することができる。本明細書に記載される改変糖型の目的のために、“親抗体”とは、フコースが親抗体の成熟コア炭水化物構造と結合している点を除いて、本発明の操作糖型と同じアミノ酸配列及び成熟コア炭水化物構造を有するグリコシル化抗体である。例えば、親糖タンパク質を含む組成物では、親糖タンパク質の約50−100％または約70−100％が、フコースが成熟コア炭水化物構造に結合した前記構造を含む。
本発明は、Fc領域を有するグリコシル化抗体を含む組成物を提供し、この場合、前記組成物中のグリコシル化抗体の約51−100％が、抗体のFc領域に結合した、フコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む。ある実施態様では、組成物中の約80−100％の抗体が、フコースを欠く成熟コア炭水化物を含む。別の実施態様では、組成物中の約90−99％の抗体が成熟コア炭水化物と結合したフコースを欠く。別の実施態様では、組成物中の抗体は、フコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含み、さらに前記に加えて少なくとも1つのアミノ酸改変をFc領域内に含む。別の実施態様では、操作糖型及びアミノ酸改変の組合せが抗体に最適なFcレセプター結合特性を提供する。 The glycoforms that are engineered typically include various carbohydrates or oligosaccharides, and thus, for example, antibodies can include engineered glycoforms. Alternatively, engineered glycoforms can be applied to antibodies containing various carbohydrates or oligosaccharides. For the purposes of the modified glycoforms described herein, “parent antibody” is the same as the engineered glycoform of the present invention, except that fucose is linked to the mature core carbohydrate structure of the parent antibody. A glycosylated antibody having an amino acid sequence and a mature core carbohydrate structure. For example, in a composition comprising a parent glycoprotein, about 50-100% or about 70-100% of the parent glycoprotein comprises said structure with fucose attached to a mature core carbohydrate structure.
The present invention provides a composition comprising a glycosylated antibody having an Fc region, wherein about 51-100% of the glycosylated antibody in said composition is bound to the Fc region of the antibody and matured without fucose Contains a core carbohydrate structure. In certain embodiments, about 80-100% of the antibodies in the composition comprise a mature core carbohydrate that lacks fucose. In another embodiment, about 90-99% of the antibodies in the composition lack fucose bound to mature core carbohydrate. In another embodiment, the antibody in the composition comprises a mature core carbohydrate structure lacking fucose, and further comprises at least one amino acid modification in the Fc region in addition to the foregoing. In another embodiment, the combination of engineered glycoform and amino acid modification provides optimal Fc receptor binding properties for the antibody.

抗体の最適化される特性
本発明は、多数の治療的に関連を有する特性について最適化された変種抗体を提供する。変種抗体は、親抗体と比較して1つ以上のアミノ酸改変または糖型改変を含み、この場合、アミノ酸改変は1つ以上の最適化された特性を提供する。したがって、本発明の抗体は変種抗体である。本発明の抗体は、少なくとも1つのアミノ酸改変または糖型改変のためにその親抗体とアミノ酸配列が異なる。したがって、本発明の変種抗体は、親抗体と比較して少なくとも1つのアミノ酸または糖型改変を有する。あるいは、本発明の変種抗体は、親抗体と比較して2つ以上のアミノ酸改変、例えば約1つから50アミノ酸改変、例えば約1つから10のアミノ酸改変、約1つから約5つのアミノ酸改変などを親抗体と比較して有することができる。したがって、変種抗体の配列及び親抗体の配列は実質的には相同である。例えば、本明細書の変種抗体配列は、親抗体配列と約80％の相同性、例えば少なくとも約90％の相同性、例えば少なくとも約95％の相同性などを有するであろう。
別の実施態様では、本発明の抗体は、親抗体と比較して最適化されたエフェクター機能特性を提供するアミノ酸改変を含む。置換及び最適化エフェクター機能特性は、USSN 10/672,280、PCT US03/30249及びUSSN 10/822,231及びUSSN 60/627,774（2004年11月12日出願、”Optimized Fc Variants”）に記載されている。最適化されえる特性には、FcγRに対する親和性の増強又は低下が含まれるが、ただし前記に限定されない。ある実施態様では、本発明の抗体は、ヒトの賦活性FcγR、例えばFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa、およびFcγRIIIbに対する親和性が増強されるように最適化される。ある実施態様では、本発明の抗体は、ヒトFcγRIIIaに対する親和性が増強されるように最適化される。また別の実施態様では、抗体は、ヒト抑制性レセプターFcγRIIbに対する親和性が低下するように最適化される。これらの実施態様は、ヒトにおける増強された治療特性、例えばエフェクター機能の増強およびより強い抗癌性効力を有する抗体を提供することが予想される。また別の実施態様では、本発明の抗体は、ヒトFcγR（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及びFcγRIIIbを含むが、ただしこれらに限定されない）に対する親和性が低下又は除去されるように最適化される。これらの実施態様は、ヒトでの増強された治療特性、例えばエフェクター機能の低下及び毒性の低下を有する抗体を提供することが予想される。他の実施態様では、本発明の抗体は、1つ以上のFcγRに対する親和性の増強を提供し、しかも1つ以上の他のFcγRに対する親和性の低下を提供する。例えば、本発明の抗体はFcγRIIIaとの結合の増強を有し、しかもFcγRIIbとの結合の低下を有しえる。あるいは、本発明の抗体は、FcγRIIa及びFcγRIとの結合の増強を有し、しかもFcγRIIbとの結合の低下を有しえる。さらに別の実施態様では、本発明の抗体はFcγRIIbに対する親和性の増強を有し、しかも1つ以上の賦活性FcγRに対する親和性の低下を有しえる。 Optimized Properties of Antibodies The present invention provides variant antibodies that are optimized for a number of therapeutically relevant properties. Variant antibodies contain one or more amino acid modifications or glycoform modifications compared to the parent antibody, wherein the amino acid modifications provide one or more optimized properties. Accordingly, the antibodies of the present invention are variant antibodies. An antibody of the present invention differs in amino acid sequence from its parent antibody due to at least one amino acid modification or glycoform modification. Thus, the variant antibodies of the invention have at least one amino acid or glycotype modification compared to the parent antibody. Alternatively, a variant antibody of the invention has two or more amino acid modifications, such as about 1 to 50 amino acid modifications, such as about 1 to 10 amino acid modifications, about 1 to about 5 amino acid modifications compared to the parent antibody. Etc. compared to the parent antibody. Thus, the variant antibody sequence and the parent antibody sequence are substantially homologous. For example, a variant antibody sequence herein will have about 80% homology with the parent antibody sequence, such as at least about 90% homology, such as at least about 95% homology.
In another embodiment, the antibodies of the invention comprise amino acid modifications that provide optimized effector functional properties as compared to the parent antibody. Replacement and optimized effector functional properties are described in USSN 10 / 672,280, PCT US03 / 30249 and USSN 10 / 822,231 and USSN 60 / 627,774 (filed November 12, 2004, “Optimized Fc Variants”). Properties that can be optimized include, but are not limited to, increased or decreased affinity for FcγR. In certain embodiments, the antibodies of the invention are optimized to have enhanced affinity for human stimulating FcγR, eg, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, and FcγRIIIb. In certain embodiments, the antibodies of the invention are optimized to have enhanced affinity for human FcγRIIIa. In yet another embodiment, the antibody is optimized to have a reduced affinity for the human inhibitory receptor FcγRIIb. These embodiments are expected to provide antibodies with enhanced therapeutic properties in humans, such as enhanced effector function and stronger anticancer efficacy. In yet another embodiment, the antibodies of the invention are optimized such that their affinity for human FcγR (including but not limited to FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa and FcγRIIIb) is reduced or eliminated. Is done. These embodiments are expected to provide antibodies with enhanced therapeutic properties in humans, such as reduced effector function and reduced toxicity. In other embodiments, the antibodies of the invention provide enhanced affinity for one or more FcγRs and yet provide reduced affinity for one or more other FcγRs. For example, the antibodies of the present invention may have enhanced binding to FcγRIIIa and may have decreased binding to FcγRIIb. Alternatively, the antibody of the present invention may have enhanced binding to FcγRIIa and FcγRI, and may have decreased binding to FcγRIIb. In yet another embodiment, an antibody of the invention may have increased affinity for FcγRIIb and may have decreased affinity for one or more activated FcγRs.

本発明の改変は、1つ以上のFcγRに対する結合親和性を増強することができる。本明細書で用いられる、親免疫グロブリンよりも“より強い親和性”又は“改善された親和性”又は“増強された親和性”または“より良好な親和性”は、結合アッセイにおける変種及び親ポリペプチドの量が本質的に同じであるときに、Fc変種が親ペプチドよりも有意に高い平衡結合定数（K_a）または低い平衡解離定数（K_d）でFcレセプターと結合することを意味する。例えば、FcγR結合親和性が改善されたFc変種は、親ポリペプチドと比較して約5倍から約1000倍、例えば約10倍から約500倍のFcレセプター結合親和性の改善を示すことができる（この場合Fcレセプター結合親和性は、例えば本明細書の実施例に記載するように決定される）。したがって、本明細書で用いられる、親Fcポリペプチドと比較して “低下した親和性”とは、親ポリペプチドよりも有意に低いK_a または高いK_dでFc変種がFcレセプターと結合することを意味する。
複数の実施態様はヒトFcγRとのFc結合の最適化を含むが、また別の実施態様では、本発明の抗体は、非ヒト生物（げっ歯類および非ヒト霊長類を含むがただしこれらに限定されない）由来のFcγRに対する親和性の増強または低下を示す。非ヒトFcγRとの結合が最適化された抗体は実験で有用でありえる。例えば、ある薬剤候補物質に対して例えば有効性、毒性及び薬物動態のような特性の試験を可能にするマウスモデルが、多様な疾患について利用可能である。当分野で知られているように、癌細胞をマウスに移植又は注射してヒトの癌を模倣することができる（異種移植と称される方法である）。1つ以上のマウスFcγRについて最適化された抗体を含む抗体を試験することによって、前記タンパク質の有効性、その作用メカニズムなどに関して貴重な情報を提供することができる。本発明の抗体はまた、非グリコシル化型における機能性の増強および／または溶解特性について最適化することができる。ある実施態様では、本発明の非グリコシル化抗体は、親抗体の非グリコシル化型よりも強い親和性でFcリガンドと結合する。前記Fcリガンドには、FcRγ、C1q、FcRn、ならびにプロテインA及びGが含まれ（ただしこれらに限定されない）、さらに前記は任意の供給源（ヒト、マウス、ラット、ウサギ又はサルを含むが、ただしこれらに限定されない）に由来することができる。また別の実施態様では、抗体は、親抗体の非グリコシル化型よりも安定であり、および／またはより可溶性であるように最適化される。 Modifications of the present invention can enhance binding affinity for one or more FcγRs. As used herein, “stronger affinity” or “improved affinity” or “enhanced affinity” or “better affinity” than the parent immunoglobulin refers to the variant and parent in the binding assay. Means that the Fc variant binds to the Fc receptor with _a significantly higher equilibrium binding constant (K _a ) or lower equilibrium dissociation constant (K _d ) than the parent peptide when the amount of polypeptide is essentially the same. . For example, an Fc variant with improved FcγR binding affinity can exhibit an Fc receptor binding affinity improvement of about 5 to about 1000 times, such as about 10 to about 500 times, compared to the parent polypeptide. (In this case, the Fc receptor binding affinity is determined, for example, as described in the Examples herein). Thus, as used herein, “reduced affinity” compared to the parent Fc polypeptide means that the Fc variant binds to the Fc receptor with _a significantly lower Ka or higher K _d than the parent polypeptide. Means.
While some embodiments include optimization of Fc binding to human FcγR, in yet another embodiment, antibodies of the invention include, but are not limited to, non-human organisms (including but not limited to rodents and non-human primates). Not) to show an increase or decrease in affinity for FcγR from. Antibodies that are optimized for binding to non-human FcγR may be useful in experiments. For example, mouse models are available for a variety of diseases that allow testing of properties such as efficacy, toxicity and pharmacokinetics for certain drug candidates. As is known in the art, cancer cells can be transplanted or injected into mice to mimic human cancer (a method called xenotransplantation). Testing antibodies, including antibodies optimized for one or more mouse FcγRs, can provide valuable information regarding the effectiveness of the protein, its mechanism of action, and the like. The antibodies of the invention can also be optimized for enhanced functionality and / or solubility properties in the non-glycosylated form. In certain embodiments, the non-glycosylated antibody of the invention binds an Fc ligand with a stronger affinity than the non-glycosylated form of the parent antibody. The Fc ligand includes (but is not limited to) FcRγ, C1q, FcRn, and proteins A and G, and further includes any source (including human, mouse, rat, rabbit or monkey, but It is not limited to these. In yet another embodiment, the antibody is optimized to be more stable and / or more soluble than the non-glycosylated form of the parent antibody.

本発明の抗体は、FcγR以外のFcリガンド（補体タンパク質、FcRn及びFcレセプターホモローグ（FcRH）を含むが、ただしこれらに限定されない）との相互作用を調節する改変を含むことができる。FcRHには、FcRH1、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5、およびFcRH6が含まれる（ただしこれらに限定されない）（Davis et al. 2002, Immunol Reviews 190:123-136、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
ある実施態様では、本発明の抗体のFcリガンド特異性がその治療有用性を決定するであろう。ある抗体の治療目的に対する有用性は、標的抗原のエピトープ又は形態および治療される疾患又は適応症に左右されるであろう。いくつかの標的および適応症にとって、FcγR-媒介エフェクター機能の増強は好ましいかもしれない。前記は、特に抗癌抗体について有利でありえる。したがって、賦活性FcγRに対する親和性の増強および／または抑制性FcγRに対する親和性の低下を提供する抗体を含む抗体を用いることができる。いくつかの標的及び適応症にとっては、種々の賦活性FcγRに対し弁別的な選択性を提供する抗体を利用することはさらに有益でありえる。例えば、いくつかの事例では、FcγRIIa及びFcγRIIIaとの結合増強は望ましいが、FcγRIに対する結合増強は所望されず、一方、他の事例ではFcγRIIaとの結合増強のみが所望されえる。ある種の標的及び適応症にとっては、FcγR-媒介エフェクター機能及び補体媒介エフェクター機能の両方を増強する抗体を利用することが所望されえるが、他の事例では、FcγR-媒介エフェクター機能又は補体媒介エフェクター機能のどちらかを増強する抗体を利用することが有利であるかもしれない。いくつかの標的又は癌適応症にとっては、1つ以上のエフェクター機能を低下させるまたは除去すること、例えばC1q、1つ以上のFcγR、または1つ以上の他のFcリガンドとの結合をノックアウトすることによってエフェクター機能を低下又は停止させることが有益でありえる。他の標的及び適応症にとっては、抑制性FcγRIIbとの結合増強（しかもWTレベルを低下させる）、又は賦活性FcγRとの結合停止を提供する抗体を利用することが所望されえる。前記は、例えば抗体の目標が炎症又は自己免疫疾患を抑制すること、または何らかの態様で免疫系を調節することであるとき特に有用でありえる。 The antibodies of the present invention can include modifications that modulate interactions with Fc ligands other than FcγR, including but not limited to complement proteins, FcRn and Fc receptor homologues (FcRH). FcRH includes, but is not limited to, FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5, and FcRH6 (Davis et al. 2002, Immunol Reviews 190: 123-136, which is hereby incorporated by reference) included).
In certain embodiments, the Fc ligand specificity of an antibody of the invention will determine its therapeutic utility. The usefulness of an antibody for therapeutic purposes will depend on the epitope or form of the target antigen and the disease or indication being treated. For some targets and indications, enhancement of FcγR-mediated effector function may be preferred. The above may be particularly advantageous for anti-cancer antibodies. Thus, antibodies can be used, including antibodies that provide enhanced affinity for activating FcγR and / or reduced affinity for inhibitory FcγR. For some targets and indications, it may be further beneficial to utilize antibodies that provide differential selectivity for various stimulating FcγRs. For example, in some cases, enhanced binding to FcγRIIa and FcγRIIIa is desirable, but enhanced binding to FcγRI is not desired, while in other cases, only enhanced binding to FcγRIIa may be desired. For certain targets and indications, it may be desirable to utilize antibodies that enhance both FcγR-mediated effector function and complement-mediated effector function, while in other cases, FcγR-mediated effector function or complement It may be advantageous to utilize antibodies that enhance either of the mediated effector functions. For some targets or cancer indications, reducing or eliminating one or more effector functions, such as knocking out binding to C1q, one or more FcγRs, or one or more other Fc ligands It may be beneficial to reduce or stop effector function. For other targets and indications, it may be desirable to utilize antibodies that provide enhanced binding to inhibitory FcγRIIb (and reduce WT levels) or termination of binding to stimulating FcγR. This can be particularly useful, for example, when the goal of the antibody is to suppress inflammation or autoimmune disease, or in some way modulate the immune system.

ある疾患の治療のために与えられる抗体のもっとも有益な選択性を決定する重要なパラメーターは、明らかに抗体の背景、すなわち、どのタイプの抗体が用いられているかである。したがって、ある抗体のFcリガンドの選択性又は特異性は、それが、共役融合またはコンジュゲートパートナーにより抗体を含むか否かにしたがって種々の特性を提供するであろう。例えば、毒素、放射性ヌクレオチドまたは他のコンジュゲートは、それらを構成する抗体が1つ以上のFcリガンドとの結合低下又は結合停止を有するならば、正常細胞に対する毒性を低下させることができる。別の例として、炎症又は自己免疫疾患を抑制するためには、賦活性FcγRに対する親和性が増強された抗体を利用すること、例えばこれらのFcγRと結合し、さらにそれらの活性化を妨げることが所望されえる。逆に、FcγRIIb親和性が増強された2つ以上のFc領域を含む抗体は、免疫細胞表面でこのレセプターと同時嵌合し、それによってこれらの細胞の増殖を抑制することができる。一方、いくつかの事例では、抗体は1つの細胞上のその標的抗原と嵌合し、しかも標的抗原とは別個の細胞上のFcγRとも嵌合することができるが、他の事例では、標的抗原と同じ細胞の表面にあるFcγRと嵌合するのが有利であるかもしれない。例えば、抗体が、1つ以上のFcγRを発現している細胞上の抗原を標的とする場合、当該細胞表面のFcγRとの結合が増強又は低下された抗体を利用することは有益でありえう。前記は、例えば、抗体が抗癌剤として用いられ、同じ細胞表面の標的抗原とFcγRとの同時嵌合が、増殖抑制、アポトーシス又は他の抗増殖効果をもたらす細胞内のシグナリング事象を促進する事例であろう。また別には、同じ細胞上の抗原及びFcγRの同時嵌合は、抗体が何らかの態様（この場合、標的抗原とFcγRとの同時嵌合は何らかの増殖又は抗増殖効果を提供する）で免疫系を調節するために用いられているときに有利でありえる。同様に、2つ以上のFc領域を含む抗体は、Fcγ選択性又は特異性を調節して、同じ細胞表面のFcγRと同時嵌合する抗体によって利益を得ることができる。 The key parameter that determines the most beneficial selectivity of an antibody given for the treatment of a disease is clearly the background of the antibody, ie what type of antibody is being used. Thus, the selectivity or specificity of an antibody's Fc ligand will provide various properties depending on whether it comprises an antibody with a conjugated fusion or conjugate partner. For example, toxins, radionucleotides or other conjugates can reduce toxicity to normal cells if the antibodies that comprise them have reduced or stopped binding to one or more Fc ligands. As another example, to suppress inflammation or autoimmune disease, use of antibodies with enhanced affinity for activating FcγR, eg, binding to these FcγRs and further preventing their activation. May be desired. Conversely, an antibody comprising two or more Fc regions with enhanced FcγRIIb affinity can co-fit with this receptor on the immune cell surface, thereby inhibiting the growth of these cells. On the other hand, in some cases, an antibody can mate with its target antigen on one cell and can also mate with FcγR on a cell separate from the target antigen, while in other cases the target antigen It may be advantageous to mate with FcγR on the same cell surface. For example, if an antibody targets an antigen on a cell expressing one or more FcγRs, it may be beneficial to utilize an antibody with enhanced or reduced binding to FcγR on the cell surface. This is the case, for example, where an antibody is used as an anticancer agent and the simultaneous engagement of the same cell surface target antigen with FcγR promotes intracellular signaling events that lead to growth inhibition, apoptosis or other antiproliferative effects. Let's go. Alternatively, co-fitting of antigen and FcγR on the same cell regulates the immune system in such a way that the antibody is in some manner (where co-fitting of target antigen and FcγR provides some proliferation or anti-proliferative effect). Can be advantageous when used to Similarly, antibodies comprising more than one Fc region can benefit from antibodies that modulate Fcγ selectivity or specificity and co-fit with FcγR on the same cell surface.

本発明の抗体のFcリガンド特異性は、特定の抗原エピトープ、適応症、又は患者集団に適合しえる種々のエフェクター機能プロフィールを創出するために調節することができる。図3は、レセプター結合プロフィールのいくつかの実施態様を示す。前記プロフィールには、種々のレセプターとの結合の改善、低下又は影響無しが含まれ、そのような変化はある種の状況で有益でありえる。この図のレセプター結合プロフィールは指定のレセプターの増減の程度によって変化しえよう。さらにまた、指定される結合の変化は、他のレセプター、例えばC1q又はFcRnに対するまた別の追加の結合変化と、例えばC1qとの結合の停止と組み合わせて補体活性化を停止させることによって、又はC1qとの結合増強と組み合わせて補体活性化を高めることによって関連させることができる。他のレセプター結合プロフィールに関する他の実施態様も可能であり、列挙したレセプター結合プロフィールは例示である。
FcγRに種々の多形型が存在することにより、本発明の抗体の治療有用性に強い影響を与えるさらに別のパラメーターが提供される。種々のクラスのFcγRに対するある抗体の特異性及び選択性は、ある疾患の治療のためにある抗原を標的とする抗体の能力に顕著な影響を与えるが、一方、これらレセプターの種々の多形型に対する抗体の特異性又は選択性は、部分的には、どの実験または前臨床実験が試験に適切でありえるか、および最終的にはどの患者集団が治療に応答しえるかまたは応答しえないかを決定することができる。したがって、本発明の抗体のFcリガンド多形性（FcγR、C1q、FcRn及びFcRH多形性を含むが、ただしこれらに限定されない）に対する特異性または選択性を用いて、有効な実験および前臨床実験の選択、臨床試験の設計、患者の選別、用量依存性、および／または臨床試験に関する他の見地の指標とすることができる。 The Fc ligand specificity of the antibodies of the invention can be adjusted to create a variety of effector function profiles that can be tailored to specific antigenic epitopes, indications, or patient populations. FIG. 3 shows some embodiments of receptor binding profiles. The profile includes improved, reduced or no effect on binding to various receptors, and such changes can be beneficial in certain situations. The receptor binding profile in this figure may vary depending on the degree of increase or decrease of the specified receptor. Furthermore, the specified change in binding may be caused by stopping complement activation in combination with another additional binding change for other receptors, such as C1q or FcRn, for example, by stopping binding to C1q, or It can be linked by enhancing complement activation in combination with enhanced binding to C1q. Other embodiments for other receptor binding profiles are possible, and the listed receptor binding profiles are exemplary.
The presence of various polymorphic forms in FcγR provides yet another parameter that has a strong impact on the therapeutic utility of the antibodies of the invention. The specificity and selectivity of certain antibodies for different classes of FcγRs has a significant impact on the ability of antibodies to target certain antigens for the treatment of certain diseases, while the various polymorphic forms of these receptors The specificity or selectivity of an antibody against is, in part, which experiment or preclinical experiment may be appropriate for the study, and ultimately which patient population may or may not respond to treatment. Can be determined. Accordingly, effective and preclinical experiments using the specificity or selectivity for Fc ligand polymorphisms (including but not limited to FcγR, C1q, FcRn and FcRH polymorphisms) of the antibodies of the present invention Selection, clinical trial design, patient selection, dose dependency, and / or other aspects of clinical trials.

他の改変
本発明の抗体は、それ自体エフェクター機能に特異的に関係するものではないが、最適化された特性を提供する1つ以上の改変を含むことができる。前記改変はアミノ酸改変であってもよく、または酵素的もしくは化学的に施される改変であってもよい。おそらくそのような改変は、抗体におけるいくつかの改善、例えばその安定性、可溶性、機能または臨床使用における増強を提供する。本発明は、本発明の抗体に追加的改変を組み合わせることによって実施することができる多様な改善を意図する。
ある実施態様では、本発明の抗体の可変領域をアフィニティー成熟させることができる。換言すれば、アミノ酸改変を抗体のVH及び／又はVLドメインで実施して、抗体とその標的抗原との結合を増強させた。そのようなタイプの改変は、標的抗原との結合および／または解離動態を改善することができる。他の改変には、別の標的に対し標的抗原に対する選択性を提供する改変が含まれる。前記には、非標的細胞で発現される抗原に対し、標的細胞で発現される抗原に対する選択性を改善する改変が含まれる。標的認識特性に対する他の改善は追加の改変によって提供されえる。そのような特性には、固有の動態特性（すなわち結合および解離動態）、別の標的に対し特定の標的に対する選択性、および別の形態に対し標的の特異的形態に対する選択性が含まれえるが、ただしこれらに限定されない。前記の例には、スプライス変種に対する完全長型、可溶型に対する細胞表面型、種々の多形性変種に対する選択性、または標的抗原の特異的立体構造に対する選択性が含まれる。 Other Modifications Antibodies of the invention are not specifically related to effector function per se, but can include one or more modifications that provide optimized properties. The modification may be an amino acid modification, or may be an enzymatic or chemical modification. Perhaps such modification provides some improvement in the antibody, such as its stability, solubility, function or enhancement in clinical use. The present invention contemplates various improvements that can be made by combining additional modifications to the antibodies of the present invention.
In certain embodiments, the variable regions of the antibodies of the invention can be affinity matured. In other words, amino acid modifications were performed on the VH and / or VL domains of the antibody to enhance the binding of the antibody to its target antigen. Such types of modifications can improve the binding and / or dissociation kinetics of the target antigen. Other modifications include modifications that provide selectivity for the target antigen over another target. The foregoing includes modifications that improve selectivity for antigens expressed in target cells relative to antigens expressed in non-target cells. Other improvements to target recognition properties can be provided by additional modifications. Such properties may include intrinsic kinetic properties (ie, binding and dissociation kinetics), selectivity for a particular target over another target, and selectivity for a specific form of the target over another form. However, it is not limited to these. Examples include full length for splice variants, cell surface type for soluble forms, selectivity for various polymorphic variants, or selectivity for specific conformations of the target antigen.

本発明の抗体は、抗体の内部移行の低下または増強を提供する1つ以上の改変を含むことができる。ある実施態様では、本発明の抗体は、1つ以上のFcリガンドとの相互作用により生じる、抗体の細胞内移行を低下させるために、追加の改変を利用または組み合わせることができる。前記の特性は、エフェクター機能を増強し、さらに潜在的に本発明の抗体の免疫原性を低下させると期待できるかもしれない。あるいは、本発明の抗体は、1つ以上のFcリガンドとの相互作用により生じる、抗体の細胞内移行を増強するために、追加の改変を利用または組み合わせることができる。例えば、ある実施態様では、FcγRIとの結合増強を提供する抗体が用いられる（FcγRIは樹状細胞上で発現され、免疫応答の初期に活発である）。前記の手法は、抗体内でまたは結合融合物もしくはコンジュゲートパートナー内で、MHC分子によるFcペプチドフラグメントの認識及び提示を促進する追加の改変と組み合わせることによってさらに増強されよう。これらの手法は、標的抗原のプロセッシングを増強し、それによって標的抗原の抗原性を改善し（Bonnerot and Amigorena, 1999, Immunol Rev 172:279-84、前記文献は参照により本明細書に含まれる）、ヒト免疫系による適応免疫応答及びより強力な細胞殺滅を促進すると期待される。これらの手法は、標的抗原が細胞表面から脱落するときには特に有利でありえる。これらの発想はさらにまた、イディオタイプワクチンによる免疫療法に適用され、この場合、患者のリンパ腫細胞によって産生されるクローン特異的抗体を用いて患者をワクチン免疫する。
ある実施態様では、改変は、本発明の抗体の生物物理学的特性（安定性、可溶性及びオリゴマー状態を含むが、ただしこれらに限定されない）を改善するために実施される。改変は、例えば、抗体内でのより有利な分子内相互作用（例えばより強い安定性を提供するために）を提供する置換、またはより高い溶解性のために露出非極性アミノ酸の極性アミノ酸による置換を含むことができる。本発明の抗体をさらに最適化させるために、さらに別の改変を操作するために利用することができる多数の最適化の目標及び方法が、USSN 10/379,392（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている。本発明の抗体はまた、オリゴマー状態またはサイズを低下させる追加の改変と組み合わせて、腫瘍への侵入を増強するか、又はin vivo除去速度を所望のように高めることができる。 The antibodies of the invention can include one or more modifications that provide a reduction or enhancement of antibody internalization. In certain embodiments, the antibodies of the invention can utilize or combine additional modifications to reduce antibody intracellular translocation resulting from interaction with one or more Fc ligands. The above properties may be expected to enhance effector function and potentially reduce the immunogenicity of the antibodies of the invention. Alternatively, the antibodies of the present invention can utilize or combine additional modifications to enhance the intracellular translocation of the antibody resulting from interaction with one or more Fc ligands. For example, in one embodiment, an antibody is used that provides enhanced binding to FcγRI (FcγRI is expressed on dendritic cells and is active early in the immune response). Said approach will be further enhanced by combining with additional modifications that facilitate the recognition and presentation of Fc peptide fragments by MHC molecules within the antibody or within the binding fusion or conjugate partner. These techniques enhance the processing of the target antigen and thereby improve the antigenicity of the target antigen (Bonnerot and Amigorena, 1999, Immunol Rev 172: 279-84, which is hereby incorporated by reference) It is expected to promote the adaptive immune response and stronger cell killing by the human immune system. These approaches can be particularly advantageous when the target antigen is shed from the cell surface. These ideas also apply to immunotherapy with idiotype vaccines, where the patient is vaccinated with clone-specific antibodies produced by the patient's lymphoma cells.
In certain embodiments, modifications are made to improve the biophysical properties (including but not limited to stability, solubility and oligomeric state) of the antibodies of the invention. Modifications include, for example, substitutions that provide more favorable intramolecular interactions (eg, to provide greater stability) within an antibody, or substitution of exposed nonpolar amino acids with polar amino acids for higher solubility Can be included. Numerous optimization goals and methods that can be utilized to manipulate additional modifications to further optimize the antibodies of the present invention are described in USSN 10 / 379,392, which is incorporated herein by reference. Included). The antibodies of the invention can also be combined with additional modifications to reduce oligomeric state or size to enhance tumor entry or increase the in vivo clearance rate as desired.

本発明の抗体の他の改変には、固有の構成またはホモダイマーもしくはホモマルチマー分子を可能にする改変を含む。そのような改変には、改変ジスルフィドとともに、共有結合ホモダイマー又はホモマルチマーを生成するメカニズムを提供しえる化学的改変もしくは凝集方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。例えば、そのような分子の操作方法及び組成は以下に記載されている：Kan et al. 2001, J Immunol 166:1320-1326；Stevenson et al. 2002, Recent Results Cancer Res 159:104-12；US 5,681,566；Caron et al. 1992, J Exp Med 176:1191-1195；Shopes, 1992, J Immunol 148(9):2918-22（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。本発明の変種への追加の改変には、固有の構成またはヘテロダイマー、ヘテロマルチマー、二機能性および／または多機能性分子を可能にする改変が含まれる。そのような改変には、CH3ドメインにおける1つ以上のアミノ酸置換が含まれるが、ただし前記に限定されない（前記改変では、置換はホモダイマー形成を低下させ、ヘテロダイマー形成を増加させる）。例えば、そのような分子の操作方法及び組成物は以下に記載されている：Atwell et al. J Mol Biol 270(1):26-35；Carter et al. 2001, J Immunol Methods 248:7-15（前記文献はともに参照により本明細書に含まれる）。追加の改変には、ヒンジ及びCH3ドメイン内の改変が含まれ、前記改変はダイマー形成傾向を低下させる。 Other modifications of the antibodies of the invention include modifications that allow unique configurations or homodimeric or homomultimeric molecules. Such modifications include, but are not limited to, chemical modification or aggregation methods that can provide a mechanism for generating covalently linked homodimers or homomultimers with modified disulfides. For example, methods and composition of such molecules are described below: Kan et al. 2001, J Immunol 166: 1320-1326; Stevenson et al. 2002, Recent Results Cancer Res 159: 104-12; US Caron et al. 1992, J Exp Med 176: 1191-1195; Shopes, 1992, J Immunol 148 (9): 2918-22, both of which are hereby incorporated by reference. Additional modifications to the variants of the present invention include modifications that allow for unique configurations or heterodimers, heteromultimers, bifunctional and / or multifunctional molecules. Such modifications include, but are not limited to, one or more amino acid substitutions in the CH3 domain (wherein the substitution reduces homodimer formation and increases heterodimer formation). For example, methods and compositions for the manipulation of such molecules are described below: Atwell et al. J Mol Biol 270 (1): 26-35; Carter et al. 2001, J Immunol Methods 248: 7-15 (Both of which are hereby incorporated by reference). Additional modifications include modifications within the hinge and CH3 domains that reduce the tendency to dimerize.

更なる実施態様では、本発明の抗体は、タンパク分解部位を除去する改変を含む。これらには、例えば生成物収量を減少させるプロテアーゼ部位とともに投与されたタンパク質をin vivoで分解するプロテアーゼ部位が含まれえる。ある実施態様では、追加の改変は、共有結合分解部位、例えば脱アミド化（すなわちグルタミニル及びアスパラギニル残基の対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化）、酸化及びタンパク加水分解部位を除去するために実施される。除去が特に有用な脱アミド化部位は、脱アミド化傾向が増強されている部位であり、グリシンがその後に続くアスパラギニル及びグルタミル残基（それぞれNG及びQGモチーフ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような事例では、どちらの残基の置換も脱アミド化傾向を顕著に低下させることができる。一般的な酸化部位はメチオニン及びシステイン残基を含む。導入又は除去することができる他の共有結合性改変には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルもしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖の-アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteoins:Structure and Molecular Proteins, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)、前記文献は参照により本明細書に含まれる）、N-末端アミンのアセチル化、および任意のC-末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。追加の改変はまた、翻訳後修飾、例えばN-結合もしくはO-結合グリコシル化およびリン酸化を含むことができるが、ただしこれらに限定されない。
改変にはまた、生物学的製剤の生産に一般的に用いられる宿主または宿主細胞からの発現および／または精製収量を改善する改変が含まれえる。前記宿主細胞には、種々の哺乳動物細胞株（例えばCHO）、酵母細胞株、細菌細胞株、および植物が含まれるが、ただしこれらに限定されない。追加の改変には、重鎖の能力を除去又は低下させて鎖間ジスルフィド結合を形成させる改変が含まれる。追加の改変には、重鎖の能力を除去又は低下させて鎖内ジスルフィド結合を形成させる改変が含まれる。 In a further embodiment, the antibodies of the invention include modifications that remove proteolytic sites. These can include, for example, protease sites that degrade in vivo proteins administered with protease sites that reduce product yield. In some embodiments, additional modifications remove covalent degradation sites, such as deamidation (ie, deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues), oxidation and protein hydrolysis sites. To be implemented. Deamidation sites that are particularly useful for removal are sites with an increased tendency to deamidation, including but not limited to asparaginyl and glutamyl residues (NG and QG motifs, respectively) followed by glycine. Not. In such cases, substitution of either residue can significantly reduce the deamidation tendency. Common oxidation sites include methionine and cysteine residues. Other covalent modifications that can be introduced or removed include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, methylation of -amino groups of lysine, arginine and histidine side chains ( TE Creighton, Proteoins: Structure and Molecular Proteins, WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983), which is hereby incorporated by reference), N-terminal amine acetylation, and Includes amidation of any C-terminal carboxyl group. Additional alterations can also include, but are not limited to, post-translational modifications such as N-linked or O-linked glycosylation and phosphorylation.
Modifications can also include modifications that improve expression and / or purification yield from a host or host cell commonly used in the production of biological products. Such host cells include, but are not limited to, various mammalian cell lines (eg, CHO), yeast cell lines, bacterial cell lines, and plants. Additional modifications include those that remove or reduce the ability of the heavy chain to form interchain disulfide bonds. Additional modifications include those that remove or reduce the ability of the heavy chain to form intrachain disulfide bonds.

本発明の抗体は、例えばSchultzと共同研究者らによって開発された技術（例えば以下の論文に記載された方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない（Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30；Anderson et al. 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71；Zhang et al. 2003, 303(5656):371-3；及びChin et al. 2003, Science 301(5635):964-7、前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる））を用いて取り込まれる非天然アミノ酸の使用を含む改変を含むことができる。いくつかの実施態様では、これらの改変は、上記で考察される種々の機能的、生物物理学的、免疫学的、又は製造に関する特性の操作を可能にする。また別の実施態様では、これらの改変は、他の目的のための追加の化学的改変を可能にする。本明細書ではその他の改変も意図される。例えば、抗体は、多様な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つと結合させることができる。また別のアミノ酸改変は、特異的もしくは非特異的な抗体の化学的または翻訳後改変を可能にするために実施することができる。そのような改変にはPEG化及びグリコシル化が含まれるが、ただしこれらに限定されない。PEG化を可能にするために利用することができる特異的な置換には、効率的で特異的なカップリング反応を用いてPEGまたは他のポリマー部分を結合させることができるように新規なシステイン残基または非天然アミノ酸残基を導入するものが含まれるが、ただし前記に限定されない。特定のグリコシル化部位の導入は、新規なN-X-T/S配列を本発明の抗体に導入することによって達成することができる。 The antibodies of the present invention include, for example, techniques developed by Schultz and co-workers (including, but not limited to, the methods described in the following articles (Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20 ( 12): 625-30; Anderson et al. 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2): 7566-71; Zhang et al. 2003, 303 (5656): 371-3; and Chin et al. 2003, Science 301 (5635): 964-7, all of which are incorporated herein by reference)), and can include modifications that involve the use of unnatural amino acids. In some embodiments, these modifications allow manipulation of the various functional, biophysical, immunological, or manufacturing properties discussed above. In yet another embodiment, these modifications allow for additional chemical modifications for other purposes. Other modifications are also contemplated herein. For example, the antibody can be conjugated to one of a variety of non-proteinaceous polymers such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, polyoxyalkylene, or a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol. Other amino acid modifications can be made to allow for chemical or post-translational modifications of specific or non-specific antibodies. Such modifications include, but are not limited to, PEGylation and glycosylation. Specific substitutions that can be utilized to enable PEGylation include novel cysteine residues so that PEG or other polymer moieties can be attached using an efficient and specific coupling reaction. Examples include, but are not limited to, those that introduce groups or unnatural amino acid residues. Introduction of specific glycosylation sites can be achieved by introducing a novel N-X-T / S sequence into the antibody of the present invention.

抗体の共有結合性改変は本発明の範囲内に含まれ、一般的には（常にというわけではないが）翻訳後修飾として実施される。例えば、いくつかのタイプの抗体共有結合性改変は、選択した側鎖またはN-もしくはC-末端残基と反応することができる有機誘導剤と抗体の特定のアミノ酸を反応させることによって導入される。
いくつかの実施態様では、本発明の抗体の共有結合性改変は、1つ以上の標識の付加を含む。“標識基”という用語は任意の検出可能な標識を意味する。いくつかの実施態様では、標識基は、潜在的な立体性障害を減少させるために種々の長さのスペーサーアームを介して抗体と結合される。タンパク質を標識する種々の方法が当分野で公知であり、本発明の実施に用いることができる。一般的には、標識は、それらが検出されるアッセイに応じて以下のように多様な種類に分類される：同位元素標識、前記は放射性同位元素でも又は重い同位元素でもよい；b）磁性標識（例えば磁性粒子）；c）酸化還元活性部分；d）光学色素；酵素団（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）；e）ビオチニル化基；及びf）二次レポーターによって認識される予め定めたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。いくつかの実施態様では、標識基は、潜在的な立体性障害を減少させるために種々の長さのスペーサーアームを介して抗体と結合される。タンパク質を標識する種々の方法が当分野で公知であり、本発明の実施に用いることができる。具体的な標識には光学色素（発色団、燐光物質及び蛍光発光団（後者が多くの事例で特異的である）を含むが、ただしこれらに限定されない）が含まれる。蛍光発光団は“小分子”蛍光物質またはタンパク質性蛍光物質のどちらでもよい。“蛍光標識”とは、その固有の蛍光特性により検出されえる任意の分子を意味する。 Antibody covalent modifications are included within the scope of the present invention and are generally (but not always) performed as post-translational modifications. For example, some types of antibody covalent modifications are introduced by reacting specific amino acids of the antibody with an organic inducer that can react with selected side chains or N- or C-terminal residues. .
In some embodiments, the covalent modification of the antibody of the invention comprises the addition of one or more labels. The term “labeling group” means any detectable label. In some embodiments, the labeling group is attached to the antibody via spacer arms of various lengths to reduce potential steric hindrance. Various methods for labeling proteins are known in the art and can be used in the practice of the present invention. In general, labels are classified into various types depending on the assay in which they are detected: isotope labels, which may be radioisotopes or heavy isotopes; b) magnetic labels (Eg magnetic particles); c) redox active moiety; d) optical dye; enzyme group (eg horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase); e) biotinylated group; and f) recognized by secondary reporter Predetermined polypeptide epitopes (eg leucine zipper pair sequences, binding sites for secondary antibodies, metal binding domains, epitope tags, etc.). In some embodiments, the labeling group is attached to the antibody via spacer arms of various lengths to reduce potential steric hindrance. Various methods for labeling proteins are known in the art and can be used in the practice of the present invention. Specific labels include optical dyes (including but not limited to chromophores, phosphors and fluorophores, the latter being specific in many cases). The fluorophore can be either a “small molecule” phosphor or a proteinaceous phosphor. “Fluorescent label” means any molecule that can be detected by its inherent fluorescent properties.

抗体コンジュゲートおよび融合物
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体“融合タンパク質”であり、前記は本明細書ではときに“抗体コンジュゲート”と称される。融合パートナー又はコンジュゲートパートナーはタンパク質性でも非タンパク質性でもよく、後者は一般的には抗体およびコンジュゲートパートナーの官能基を利用して生成される。コンジュゲートパートナー及び融合パートナーは、任意の分子（小分子化合物およびポリペプチドを含む）でありえる。例えば、多様な抗体コンジュゲートおよび方法が以下に記載されている：Trail et al. 1999, Curr Opin Immunol 11:584-588（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。可能なコンジュゲートパートナーには、サイトカイン、細胞傷害性薬剤、毒素、放射性同位元素、化学療法剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤、および他の治療活性を有する薬剤が含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、コンジュゲートパートナーは、有料運搬物としてそれ以上のものと考えることができる。換言すれば、コンジュゲートの目標は、抗体による標的細胞（例えば癌細胞又は免疫細胞）へのコンジュゲートパートナーの誘導デリバリーである。したがって、例えば抗体と毒素の結合によって、標的抗原を発現する細胞への前記毒素のデリバリーが誘導される。当業者には理解されるところであるが、実際には融合物とコンジュゲートの概念及び定義はオーバーラップしている。抗体を融合物またはコンジュゲートと呼ぶことによって、本発明のいずれの特定の実施態様への抗体の限定も意図されない。むしろ、これらの用語は、何らかの所望の特性を提供するために、本発明の抗体を遺伝的に、化学的にまたはその他の方法で1つ以上のポリペプチドまたは分子に結合させることができるという広い概念を伝えるためにおおざっぱに用いられる。
適切なコンジュゲートには、下記に記載する標識、薬剤及び細胞傷害性薬剤（細胞傷害薬（例えば化学療法剤）または毒素もしくはそのような毒素の活性フラグメントを含むがただし前記に限定されない）が含まれる（ただしこれらに限定されない）。適切な毒素及びそれらの対応するフラグメントには、ジフテリアA鎖、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン（curcin）、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが含まれる。細胞傷害性薬剤にはまた、放射性同位元素を抗体に結合させることによって、または抗体に共有結合させたキレート剤と放射性核種を結合させることによって生成される放射性化学物質が含まれる。また別の実施態様は、カリキアミシン、アウリスタチン、ゲルダマイシン、メイタンシンならびにデュオカルミシンおよびアナローグを利用する。後者についてはUS 2003/0050331（前記文献は参照により本明細書に含まれる）を参照されたい。 Antibody Conjugates and Fusions In certain embodiments, the antibodies of the present invention are antibody “fusion proteins”, which are sometimes referred to herein as “antibody conjugates”. The fusion partner or conjugate partner may be proteinaceous or non-proteinaceous, the latter generally being generated utilizing the functional groups of the antibody and conjugate partner. Conjugate partners and fusion partners can be any molecule, including small molecule compounds and polypeptides. For example, a variety of antibody conjugates and methods are described below: Trail et al. 1999, Curr Opin Immunol 11: 584-588, which is incorporated herein by reference. Possible conjugate partners include, but are not limited to, cytokines, cytotoxic agents, toxins, radioisotopes, chemotherapeutic agents, anti-angiogenic agents, tyrosine kinase inhibitors, and other therapeutically active agents. It is not limited to. In some embodiments, the conjugate partner can be considered more as a paid vehicle. In other words, the goal of the conjugate is the inductive delivery of the conjugate partner to the target cell (eg, cancer cell or immune cell) by the antibody. Thus, for example, binding of the antibody and toxin induces delivery of the toxin to cells expressing the target antigen. As will be appreciated by those skilled in the art, the concepts and definitions of fusions and conjugates actually overlap. It is not intended that the antibody be limited to any particular embodiment of the invention by referring to the antibody as a fusion or conjugate. Rather, these terms are broad that an antibody of the invention can be genetically, chemically or otherwise conjugated to one or more polypeptides or molecules to provide some desired property. Used roughly to convey the concept.
Suitable conjugates include the labels, agents and cytotoxic agents described below, including but not limited to cytotoxic agents (eg, chemotherapeutic agents) or toxins or active fragments of such toxins. (But not limited to). Suitable toxins and their corresponding fragments include diphtheria A chain, exotoxin A chain, ricin A chain, abrin A chain, curcin, crotin, phenomycin, enomycin and the like. Cytotoxic agents also include radiochemicals that are produced by attaching a radioisotope to an antibody or by attaching a radionuclide to a chelator covalently attached to the antibody. Another embodiment utilizes calikiamycin, auristatin, geldamycin, maytansine and duocarmycin and analogs. For the latter, see US 2003/0050331, which is hereby incorporated by reference.

ある実施態様では、本発明の抗体はサイトカインと融合またはコンジュゲートされる。本明細書で用いられる“サイトカイン”とは、１つの細胞集団によって放出され別の細胞で細胞間媒介物質として作用するタンパク質の一般的用語を意味する。例えば、以下の論文（Penichet et al. 2001, J Immunol Methods 248:91-101、前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されているように、サイトカインは抗体と融合されて、所望される一連の特性を提供することができる。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中ではとりわけ以下が含まれる：成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）および黄体ホルモン（LH）；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン、胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子-アルファおよびベータ；ミューラー管抑制因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；神経増殖因子、例えばNGF-ベータ；血小板増殖因子；形質転換成長因子（TGF）、例えばTGF-アルファ及びTGF-ベータ；インスリン様増殖因子-IおよびII；エリスロポエチン（EPO）；骨誘発因子；インターフェロン、例えばインターフェロン-アルファ、ベータおよびガンマ；コロニー刺激因子（CSF）、例えばマクロファージ-CSF（M-CSF）、顆粒球-マクロファージ-CSH（GM-CSF）、および顆粒球-CSF（G-CSF）；インターロイキン（IL）、例えばIL-1、IL-1アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘍壊死因子、例えばTNF-アルファ又はTNF-ベータ；C5a；および他のポリペプチド因子（LIFおよびkitリガンド（KL）を含む）。本明細書で用いられる、サイトカインという用語には、天然の供給源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、及び天然の配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。 In certain embodiments, the antibodies of the invention are fused or conjugated to cytokines. As used herein, “cytokine” means the general term for a protein that is released by one cell population and acts as an intercellular mediator in another cell. For example, as described in the following article (Penichet et al. 2001, J Immunol Methods 248: 91-101, which is hereby incorporated by reference), the cytokine is fused with the antibody to produce the desired Can provide a set of properties. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and traditional polypeptide hormones. Among the cytokines include among others: growth hormones such as human growth hormone, N-methionyl human growth hormone and bovine growth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; glycoprotein hormones such as follicles Stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH) and luteinizing hormone (LH); liver growth factor; fibroblast growth factor; prolactin, placental lactogen; tumor necrosis factor-alpha and beta; Muellerian tube suppressor; mouse gonadal Stimulating hormone-related peptides; inhibin; activin; vascular endothelial growth factor; integrin; thrombopoietin (TPO); nerve growth factor such as NGF-beta; platelet growth factor; transforming growth factor (TGF) such as TGF-alpha and TGF-beta ; In Phosphorous growth factor-I and II; erythropoietin (EPO); osteoinductive factor; interferon, eg interferon-alpha, beta and gamma; colony stimulating factor (CSF), eg macrophage-CSF (M-CSF), granulocyte-macrophage -CSH (GM-CSF), and granulocyte-CSF (G-CSF); interleukin (IL) such as IL-1, IL-1 alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15; tumor necrosis factors such as TNF-alpha or TNF-beta; C5a; and others Polypeptide factors (including LIF and kit ligand (KL)). As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources or from recombinant cell culture and biologically active equivalents of native sequence cytokines.

また別の実施態様では、本発明の抗体は、毒素（小分子毒素ならびに細菌、菌類、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素（フラグメントおよび／またはその変種を含む）を含むが、ただしこれらに限定されない）と融合されるか、コンジュゲートされるか、または作動できるように連結される。例えば、多様なイムノトキシン及びイムノトキシンに関する方法が以下の論文に記載されている：Thrush et al. 1996, Ann Rev Immunol 14:49-71（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。小分子毒素には、カリキアミシン（calicheamicin）、メイタンシン（maytansine）（US 5,208,020、前記文献は参照により本明細書に含まれる）、トリコテン（trichothene）及びCC1065が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明のある実施態様では、抗体は1つ以上のメイタンシン分子とコンジュゲートされる（抗体1分子に付き約1から約10分子のメイタンシン）。メイタンシンは、例えばMay-SS-Meに変換され、前記はMay-SH3に還元され、さらに改変抗体と反応させて（Chari et al. 1992, Cancer Research 52:127-131、前記文献は参照により本明細書に含まれる）類メイタンシン-抗体コンジュゲートを生成することができる。重要な別のコンジュゲートには、1つ以上のカリキアミシン分子とコンジュゲートされた抗体が含まれる。抗生物質のカリキアミシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖DNAに切れ目を入れることができる。用いることができるカリキアミシンの構造的アナローグにはγ₁ ¹、α₂ ¹、α₃、N-アセチル-γ₁ ¹、PSAG、及びΘ¹ ₁が含まれるが、ただしこれらに限定されない（Hinman et al. 1993, Cancer Research 53:3336-3342；Lode et al. 1998, Cancer Research 58:2925-2928）（US 5,714,586；US 5,712,374；US 5,264,586；US 5,773,001、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。ドラスタチン10アナローグ、例えばアウリスタチンE（AE）及びモノメチルアウリスタチンE（MMAE）は、本発明の抗体のためのコンジュゲートとして利用することができる（Doronina et al. 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84；Francisco et al. 2003 Blood 102（4）:1458-65、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。有用な酵素的に活性な毒素には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、エキソトキシンA鎖、（シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン（modeccin）A鎖、アルファ-サルシン、アリューリテス・フォルディイ（Aleurites fordii）タンパク質、ディアンシン（dianthin）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII及びPAP-S）、モモルディカ・カランチア（momordica charantia）インヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（saponaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが含まれるが、ただしこれらに限定されない（例えばPCT WO 93/21232（前記文献は参照により本明細書に含まれる）を参照されたい）。本発明は、さらに本発明の抗体とヌクレオチド分解活性を有する化合物、例えばリボヌクレアーゼまたはDNAエンドヌクレアーゼ（例えばデオキシリボヌクレアーゼ（Dnase））とのコンジュゲートを意図する。 In yet another embodiment, the antibodies of the invention include toxins (including small molecule toxins and enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, including fragments and / or variants thereof). (But not limited to), conjugated or operably linked. For example, a variety of immunotoxins and methods relating to immunotoxins are described in the following article: Thrush et al. 1996, Ann Rev Immunol 14: 49-71, which is incorporated herein by reference. Small molecule toxins include, but are not limited to, calicheamicin, maytansine (US 5,208,020, which is incorporated herein by reference), trichothene, and CC1065. In one embodiment of the invention, the antibody is conjugated with one or more maytansine molecules (about 1 to about 10 molecules of maytansine per antibody molecule). Maytansine can be converted to, for example, May-SS-Me, which can be reduced to May-SH3, and further reacted with a modified antibody (Chari et al. 1992, Cancer Research 52: 127-131, which is hereby incorporated by reference. Class maytansine-antibody conjugates (included in the specification) can be generated. Another important conjugate includes an antibody conjugated to one or more calikiamycin molecules. The antibiotic calikiamycin family can break double-stranded DNA at sub-picomolar concentrations. The structural analogs of calikiamycin that can be used include, but are not limited to, γ ₁ ¹ , α ₂ ¹ , α ₃ , N-acetyl-γ ₁ ¹ , PSAG, and Θ ¹ ₁ (Hinman et al. 1993, Cancer Research 53: 3336-3342; Lode et al. 1998, Cancer Research 58: 2925-2928) (US 5,714,586; US 5,712,374; US 5,264,586; US 5,773,001, each of which is incorporated herein by reference. ). Dolastatin 10 analogs such as auristatin E (AE) and monomethyl auristatin E (MMAE) can be utilized as conjugates for the antibodies of the invention (Doronina et al. 2003, Nat Biotechnol 21 (7): 778-84; Francisco et al. 2003 Blood 102 (4): 1458-65, which is incorporated herein by reference). Useful enzymatically active toxins include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modexin ( modeccin) A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII and PAP-S), momordica charantia Inhibitors, Kursin, Crotin, Saponaria officinalis inhibitors, including but not limited to gelonin, mitogenin, restrictocin, phenomycin, enomycin and trichothecene (eg, PCT WO 93/21232 ( Which is incorporated herein by reference). The present invention further contemplates conjugates of the antibodies of the present invention with compounds having nucleolytic activity, such as ribonucleases or DNA endonucleases (eg, deoxyribonuclease (Dnase)).

また別の実施態様では、本発明の抗体を放射性同位元素と融合、コンジュゲートまたは作動できるように連結させて放射性結合物を生成することができる。多様な放射性同位元素が抗体の放射性コンジュゲートの製造に利用可能である。前記の例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32およびLuの放射性同位元素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
さらにまた別の実施態様では、本発明の抗体は、腫瘍のプレターゲッティングで利用される“レセプター”（例えばストレプトアビジン）とコンジュゲートさせることができる。この場合、抗体-レセプターコンジュゲートが患者に投与され、続いて、未結合コンジュゲートが血液循環から除去剤を用いて除去され、その後、細胞傷害性薬剤（例えば放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートさせた“リガンド”（例えばアビジン）が投与される。また別の実施態様では、抗体依存酵素媒介プロドラッグ療法（ADEPT）を利用するために、抗体は酵素とコンジュゲートまたは作動できるように連結される。ADEPTは、抗体をプロドラッグ活性化酵素（プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤（例えばPCT WO 81/01145を参照されたい、前記文献は参照により本明細書に含まれる）を活性な抗癌剤に変換することができる）とコンジュゲートまたは作動できるように連結することによって利用することができる（例えばPCT WO 88/07378及びUS 4,975,278を参照されたい、前記文献はともに参照により本明細書に含まれる）。ADEPTに有用なイムノコンジュゲートの酵素成分には、プロドラッグをより活性の強いその細胞傷害型に変換できるようにプロドラッグで作用することができる任意の酵素が含まれる。本発明の方法で有用な酵素には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するために有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するために有用なアリールスルファターゼ；非毒性5-フルオロシトシンを抗癌剤5-フルオロウラシルに変換するために有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、テルモリジン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えばカテプシンBおよびL）、前記はペプチド含有プロドラッグの遊離薬剤への変換に有用である；D-アラニルカルボキシペプチダーゼ、D-アミノ酸置換基を含むプロドラッグの変換に有用である；炭水化物除去酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離薬剤に変換するために有用なベータ-ガラクトシダーゼおよびノイラミノダーゼ；α-ラクタムにより誘導された薬剤を遊離薬剤に変換するために有用なベータ-ラクタマーゼ；およびペニシリナミダーゼ、例えばペニシリンVアミダーゼ又はペニシリンGアミダーゼ（それらのアミン窒素でフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基により誘導された薬剤をそれぞれ遊離薬剤に変換するために有用である）。また別には、酵素活性を有する抗体（“アブザイム”としても知られている）を用いて、本発明のプロドラッグを活性な遊離薬剤に変換することができる（例えば以下を参照されたい：Massey, 1987, Nature 328:457-458、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。抗体-アブザイムコンジュゲートは、前記アブザイムを腫瘍細胞集団にデリバーするために製造することができる。また別の多様なコンジュゲートが本発明の抗体に関して意図される。多様な化学療法剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼインヒビターおよび他の治療薬が下記に記載され、それらを抗体コンジュゲートとして利用することができる。 In another embodiment, an antibody of the invention can be operably linked to, conjugated or actuated with a radioisotope to produce a radioactive conjugate. A variety of radioisotopes are available for the production of antibody radioconjugates. Examples of such include, but are not limited to, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 and Lu.
In yet another embodiment, the antibodies of the invention can be conjugated to “receptors” (eg, streptavidin) utilized in tumor pretargeting. In this case, the antibody-receptor conjugate is administered to the patient, and then the unbound conjugate is removed from the blood circulation with a removal agent and then conjugated with a cytotoxic agent (eg, a radionucleotide). A “ligand” (eg avidin) is administered. In yet another embodiment, to utilize antibody dependent enzyme mediated prodrug therapy (ADEPT), the antibody is conjugated or operatively linked to an enzyme. ADEPT converts antibodies into prodrug activating enzymes (prodrugs (eg, peptidyl chemotherapeutic agents (see, eg, PCT WO 81/01145, which is incorporated herein by reference) to active anticancer agents) (See, eg, PCT WO 88/07378 and US Pat. No. 4,975,278, both of which are incorporated herein by reference). The enzyme components of immunoconjugates useful for ADEPT include any enzyme that can act with a prodrug so that the prodrug can be converted to its more active cytotoxic form. Examples of such enzymes include, but are not limited to: alkalis useful for converting phosphate-containing prodrugs to free drugs Aryl sulfatases useful for converting sulfate-containing prodrugs to free drugs; cytosine deaminases useful for converting non-toxic 5-fluorocytosine to the anticancer agent 5-fluorouracil; proteases such as Serratia protease, thermolysin, subtilisin , Carboxypeptidases and cathepsins (eg cathepsins B and L), which are useful for the conversion of peptide-containing prodrugs into free drugs; D-alanyl carboxypeptidase, useful for the conversion of prodrugs containing D-amino acid substituents Useful for converting carbohydrate-removing enzymes such as glycosylated prodrugs to free drugs; beta-galactosidase and neuraminase; useful for converting alpha-lactam-derived drugs to free drugs And penicillinamidases such as penicillin V amidase or penicillin G amidase (useful for converting drugs derivatized by phenoxyacetyl or phenylacetyl groups at their amine nitrogens, respectively, to free drugs). Can be used to convert prodrugs of the invention into active free drugs using antibodies with enzymatic activity (also known as “abzymes”) (see, eg, Massey, 1987, Nature 328: 457-458, which is incorporated herein by reference.) Antibody-abzyme conjugates can be prepared to deliver the abzyme to a tumor cell population. Another variety of conjugates are contemplated for the antibodies of the present invention. A variety of chemotherapeutic agents, anti-angiogenic agents, tyrosine kinase inhibitors and other therapeutic agents are described below and can be utilized as antibody conjugates.

さらに融合パートナー及びコンジュゲートパートナーとして意図されるものはFcポリペプチドである。したがって、抗体は、2つ以上のFc領域を含むマルチマーFcポリペプチドであってもよい。そのような分子の利点は、ただ1つのタンパク質分子でありながら、Fcレセプターに対し多数の結合部位を提供するということである。ある実施態様では、Fc領域は化学的な操作手法を用いて結合されえる。例えば、Fab及びFcは、ヒンジのシステイン残基で発するチオエーテル結合によって連結され、FabFc₂のような分子を生成することができる。Fc領域は、ジスルフィド操作および／または化学的架橋を用いて連結することができる。ある実施態様では、Fc領域は遺伝的に連結することができる。ある実施態様では、抗体のFc領域は、USSN 11/022,289（12/21/2004出願、”Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites”、前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されているように、抗体のFc領域は遺伝的に連結されて、タンデム連結Fc領域を生じる。タンデム連結Fcポリペプチドは、2つ以上のFc領域、例えば1つから3つ、2つなどのFc領域を含むことができる。もっとも有利な構造的及び機能的特性を有するホモ-又はヘテロ-タンデム連結抗体を得るために、多数の操作構築物を探索することは有益であろう。タンデム連結抗体はホモ-タンデム連結抗体であってもよく、前記は1つのアイソタイプの抗体が同じアイソタイプの別の抗体と遺伝的に融合されている。タンデム連結Fcポリペプチド上には多数のFcγR、C1qおよび／またはFcRn結合部位が存在するので、エフェクター機能および／または薬物動態が増強されえることが予想される。また別の実施態様では、異なるアイソタイプ由来の抗体がタンデム連結される（ヘテロ-タンデム連結抗体と称される）。例えば、FcγR及びFcαRIを標的とする能力ゆえに、FcγR及びFcαRIの両方と結合する抗体は顕著な臨床的改善を提供することができる。 Also contemplated as fusion partners and conjugate partners are Fc polypeptides. Thus, the antibody may be a multimeric Fc polypeptide comprising two or more Fc regions. The advantage of such a molecule is that it provides multiple binding sites for the Fc receptor while being a single protein molecule. In certain embodiments, the Fc regions can be combined using chemical manipulation techniques. For example, Fab and Fc are linked by thioether bonds originating at the hinge cysteine residues, it is possible to produce molecules such as FabFc _2. Fc regions can be linked using disulfide manipulation and / or chemical cross-linking. In certain embodiments, the Fc regions can be genetically linked. In one embodiment, the Fc region of an antibody is described in USSN 11 / 022,289 (12/21/2004 application, “Fc with novel Fc ligand binding sites”, which is incorporated herein by reference). As such, the Fc region of an antibody is genetically linked to produce a tandem linked Fc region. A tandem-linked Fc polypeptide can include two or more Fc regions, eg, 1 to 3, 2 or more Fc regions. In order to obtain homo- or hetero-tandem-linked antibodies with the most advantageous structural and functional properties, it would be beneficial to explore a number of engineering constructs. A tandem-linked antibody may be a homo-tandem-linked antibody, wherein an antibody of one isotype is genetically fused with another antibody of the same isotype. It is expected that effector function and / or pharmacokinetics can be enhanced since there are multiple FcγR, C1q and / or FcRn binding sites on a tandem-linked Fc polypeptide. In another embodiment, antibodies from different isotypes are tandemly linked (referred to as hetero-tandem linked antibodies). For example, because of the ability to target FcγR and FcαRI, antibodies that bind to both FcγR and FcαRI can provide significant clinical improvement.

抗体の他に、研究及び治療にその役割を拡大させつつある抗体様タンパク質はFc融合物である（Chamow et al. 1996, Trends Biotechnol 14:52-60；Ashkenazi et al. 1997 Curr Opin Immunol 9:195-200（前記文献はともに参照により本明細書に含まれる））。“Fc融合物”は本明細書では、従来技術で使用される“イムノアドヘシン”、“Ig融合物”、“Igキメラ”及び“レセプターグロブリン”（時には-が使用される）と同義であるものを指す（Chamow et al. 1996, Trends Biotechnol 14:52-60；Ashkenazi et al. 1997 Curr Opin Immunol 9:195-200）。Fc融合物は、1つ以上のポリペプチドが作動できるようにFcと連結されたタンパク質である。Fc融合物は、抗体のFc領域（および、したがってその有利なエフェクター機能及び薬物動態）を、レセプターの標的結合領域、リガンドまたは他の何らかのタンパク質もしくはタンパク質ドメインと結びつける。後者の役割は標識認識を媒介することであり、したがって前記は、抗体可変領域と機能的に類似する。Fc融合物と抗体との構造的及び機能的重複のために、本発明における抗体に関する考察はFcについてもまた適用される。
実質的にはいずれのタンパク質または小分子もFcと結合させてFc融合物を生成することができる。タンパク質融合パートナーには、任意の抗体の可変領域、レセプターの標的結合領域、粘着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカインまたは何らかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれえるが、ただしこれらに限定されない。小分子融合パートナーには、Fc融合物を治療標的に誘導する任意の治療薬剤が含まれえる。そのような標的は、疾患と関連を有する任意の分子、例えば細胞外レセプターであってもよい。 In addition to antibodies, antibody-like proteins that are expanding their role in research and therapy are Fc fusions (Chamow et al. 1996, Trends Biotechnol 14: 52-60; Ashkenazi et al. 1997 Curr Opin Immunol 9: 195-200 (both of which are incorporated herein by reference). “Fc fusion” as used herein is synonymous with “immunoadhesin”, “Ig fusion”, “Ig chimera” and “receptor globulin” (sometimes-is used) as used in the prior art. (Chamow et al. 1996, Trends Biotechnol 14: 52-60; Ashkenazi et al. 1997 Curr Opin Immunol 9: 195-200). An Fc fusion is a protein linked to Fc so that one or more polypeptides can be activated. Fc fusions link the Fc region of an antibody (and therefore its advantageous effector function and pharmacokinetics) with the target binding region, ligand or some other protein or protein domain of the receptor. The latter role is to mediate label recognition, and thus is functionally similar to antibody variable regions. Due to the structural and functional overlap between Fc fusions and antibodies, the discussion regarding antibodies in the present invention also applies to Fc.
Virtually any protein or small molecule can be bound to Fc to produce an Fc fusion. A protein fusion partner can include, but is not limited to, the variable region of any antibody, the target binding region of a receptor, an adhesion molecule, a ligand, an enzyme, a cytokine, a chemokine, or some other protein or protein domain. Small molecule fusion partners can include any therapeutic agent that directs the Fc fusion to a therapeutic target. Such a target may be any molecule associated with a disease, such as an extracellular receptor.

融合およびコンジュゲートパートナーは、本発明の抗体の任意の領域（N-もしくはC-末端または前記末端の中間のいずれかの残基を含む）と連結することができる。ある実施態様では、融合またはコンジュゲートパートナーは、抗体のN-またはC-末端で、例えばN-末端で連結される。融合またはコンジュゲートパートナーと抗体を共有結合させるために、多様なリンカーを本発明では利用することができる。本明細書の“リンカー”、“リンカー配列”、“スペーサー”、“テザー配列”またはその文法的同等物は、2つの分子をつなぎ、しばしばこの2つの分子を望ましい立体配置に置くために供される分子又は分子群を意味する。リンカーは当分野では公知であり、例えばホモ-またはヘテロ-二官能性リンカーがよく知られている（例えば以下を参照されたい：Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200 (1994)、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。分子を共有結合により一緒に連結するために、多数の手法を用いることができる。これらには、タンパク質またはタンパク質ドメインのN-及びC-末端間のポリペプチド結合、ジスルフィド結合による連結、および化学的架橋剤による連結が含まれるが、ただしこれらに限定されない。この実施態様のある特徴では、リンカーはペプチド結合であり、前記は組換え技術又はペプチド合成によって生成される。リンカーは、可撓性を提供するアミノ酸残基を含むことができる。したがって、リンカーペプチドは、以下のアミノ酸残基を主に含むことができる：Gly、Ser、AlaまたはThr。リンカーペプチドは、2つの分子が所望の活性を保持することができるように、それらが互いに対して正確な立体配置を取りえる態様で2つの分子を結合させるために適切な長さを有するべきである。この目的のために適切な長さは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、50を超える残基は含まれない。ある実施態様では、リンカーは、長さが約1から30アミノ酸であり、長さが1から20アミノ酸のリンカーが好ましい。有用なリンカーには、当業者には理解されるように、グリシン-セリンポリマー（例えば(GS)_n、(GSGGS)_n(GGGGS)_nおよび(GGGS)_nを含み、ここでnは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および他の可撓性リンカーが含まれる。あるいは、多様な非タンパク質性ポリマー（ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーを含む（ただしこれらに限定されない））がリンカーとして有用であり、前記は本発明の抗体を融合またはコンジュゲートパートナーに連結させるために、または本発明の抗体をコンジュゲートに連結させるために有用でありえる。 Fusion and conjugate partners can be linked to any region of the antibody of the invention, including the N- or C-terminus or any residue in between the termini. In certain embodiments, the fusion or conjugate partner is linked at the N- or C-terminus of the antibody, eg, at the N-terminus. A variety of linkers can be utilized in the present invention to covalently link the antibody with the fusion or conjugate partner. The “linker”, “linker sequence”, “spacer”, “tether sequence” or grammatical equivalents herein are used to connect two molecules and often place them in the desired configuration. Molecule or group of molecules. Linkers are known in the art, for example homo- or hetero-bifunctional linkers are well known (see, eg, Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200 ( 1994), which is incorporated herein by reference). A number of techniques can be used to link molecules together covalently. These include, but are not limited to, polypeptide bonds between the N- and C-termini of proteins or protein domains, linkages with disulfide bonds, and linkages with chemical crosslinkers. In one aspect of this embodiment, the linker is a peptide bond, which is generated by recombinant techniques or peptide synthesis. The linker can include amino acid residues that provide flexibility. Thus, the linker peptide can mainly comprise the following amino acid residues: Gly, Ser, Ala or Thr. The linker peptide should have an appropriate length to join the two molecules in such a way that they can assume the correct configuration relative to each other so that the two molecules can retain the desired activity. is there. Suitable lengths for this purpose include at least one amino acid residue and no more than 50 residues. In certain embodiments, the linker is about 1 to 30 amino acids in length, with linkers of 1 to 20 amino acids in length being preferred. Useful linkers include glycine-serine polymers (eg, (GS) _n , (GSGGS) _n (GGGGS) _n and (GGGS) _n , where n is at least 1 as will be appreciated by those skilled in the art. Glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other flexible linkers. Alternatively, a variety of non-proteinaceous polymers (including but not limited to polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, polyoxyalkylene, or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol) are useful as linkers, including It may be useful to link an antibody of the invention to a fusion or conjugate partner, or to link an antibody of the invention to a conjugate.

抗体の作製
本発明は、抗体を作製しさらに実験的に試験する方法を提供する。記載の方法は、いずれの特定の適用又は作動理論に本発明を拘束しようとするものではない。そうではなく、提供の方法は、1つ以上の抗体を製造し、これらを実験的に試験して変種抗体を得ることができることを一般的に例示することを意図する。抗体分子の生物学、発現、精製及びスクリーニングのための一般的方法は以下に記載されている：Antibody Engineering, ed. Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001；及びHayhurst & Georgiou, 2001, Curr OピンChem Biol 5:683-689；Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76；Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。
本発明のある実施態様では、抗体をコードする核酸が作製され、続いて宿主細胞にてクローニングされ、発現され、さらに所望の場合はアッセイされる。したがって、各タンパク質配列をコードする核酸（及び特にDNA）が生成される。これらの実施は周知の方法を用いて行われる。例えば、本発明で用いることができる多様な方法が以下に記載されている：Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)；及びCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)（前記文献はともに参照により本明細書に含まれる）。当業者には理解されるところであるが、多数の配列を含むライブラリーのために正確な配列を作成することは、潜在的に費用がかさみ、多くの時間を要する。本明細書の“ライブラリー”とは任意の形態の変種セットを意味し、前記には核酸またはアミノ酸配列リスト、核酸またはアミノ酸の種々の位置の置換リスト、前記ライブラリー配列をコードする核酸を含む物質ライブラリー、または変種タンパク質（精製形または未精製形）を含む物質ライブラリーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。したがって、本発明のライブラリーを効率的に作製するために用いることができる多様な技術が存在する。本発明で用いることができるそのような方法は、以下に記載または言及されている：US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 10/218,102；PCT WO 01/40091；及びPCT WO 02/25588（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。そのような方法には、遺伝子アッセンブリ方法、PCR系方法および変型PCR使用方法、リガーゼ連鎖反応系方法、オリゴプール方法（例えば合成シャッフリングで用いられる方法）、エラー誘発増幅方法およびランダム変異を有するオリゴを用いる方法、古典的位置特異的変異導入方法、カセット変異導入、ならびに他の増幅および遺伝子合成方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。当分野で公知のように、遺伝子アッセンブリ、変異導入、ベクターサブクローニングなどを目的とする市販の多様なキット及び方法が存在し、そのような市販製品は、抗体をコードする核酸の作製に本発明で有用である。 Production of Antibodies The present invention provides methods for producing and further experimentally testing antibodies. The described method is not intended to constrain the present invention to any particular application or theory of operation. Rather, the provided methods are intended to generally illustrate that one or more antibodies can be produced and tested experimentally to obtain variant antibodies. General methods for biology, expression, purification and screening of antibody molecules are described below: Antibody Engineering, ed. Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; and Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr. O-Pin Chem Biol 5: 683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2: 339-76; Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 Both are incorporated herein by reference).
In certain embodiments of the invention, nucleic acids encoding the antibodies are generated and subsequently cloned and expressed in a host cell and further assayed if desired. Thus, nucleic acids (and in particular DNA) encoding each protein sequence are generated. These implementations are performed using known methods. For example, various methods that can be used in the present invention are described below: Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001); and Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), both of which are hereby incorporated by reference. As will be appreciated by those skilled in the art, creating accurate sequences for a library containing a large number of sequences is potentially expensive and time consuming. As used herein, “library” refers to any form of variant set, including a nucleic acid or amino acid sequence list, a list of substitutions at various positions of nucleic acids or amino acids, and a nucleic acid encoding the library sequence. Substance libraries, or substance libraries containing variant proteins (purified or unpurified forms) are included, but are not limited to these. Thus, there are a variety of techniques that can be used to efficiently create the libraries of the present invention. Such methods that can be used in the present invention are described or referenced below: US 6,403,312; USSN 09 / 782,004; USSN 09 / 927,790; USSN 10 / 218,102; PCT WO 01/40091; and PCT WO 02 / 25588 (all of which are hereby incorporated by reference). Such methods include gene assembly methods, PCR methods and modified PCR methods, ligase chain reaction methods, oligo pool methods (eg, methods used in synthetic shuffling), error-induced amplification methods and oligos with random mutations. Examples include, but are not limited to, methods used, classical position-directed mutagenesis methods, cassette mutagenesis, and other amplification and gene synthesis methods. As known in the art, there are a variety of commercially available kits and methods for gene assembly, mutagenesis, vector subcloning, etc., and such commercial products are used in the present invention for the production of nucleic acids encoding antibodies. Useful.

本発明の抗体は、核酸、例えば発現ベクター（抗体をコードする核酸を含む）で形質転換した宿主細胞を、タンパク質の発現を誘導または引き起こすために適切な条件下で培養することによって製造することができる。発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて変動し、当業者は通常の実験により容易に確定できるであろう。極めて多様な適切な宿主を用いることができる。前記には、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞及び酵母が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明で用いることができる多様な細胞株はATCC(登録商標)細胞株カタログ（アメリカタイプカルチャコレクションから入手できる）に記載されている。
ある実施態様では、抗体は、哺乳動物発現系（発現構築物はウイルス（例えばレトロウイルスまたはアデノウイルス）を用いて哺乳動物細胞に導入される系を含む）で発現される。任意の哺乳動物細胞、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、霊長類細胞などを用いることができる。適切な細胞にはまた公知の研究用細胞（Jurkat T細胞、NIH3T3、CHO、BHK、COS、HEK293、PER C.6、HeLa、Sp2/0、NS0細胞及びその変種が含まれるが、ただしこれらに限定されない）が含まれる。また別の実施態様では、ライブラリータンパク質は細菌細胞で発現される。細菌発現系は当分野では周知であり、大腸菌（Escherichia coli（E. coli））、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、およびストレプトコッカス・リビダンス（St. lividans）が含まれる。また別の実施態様では、抗体は昆虫細胞（例えばSf21/Sf9、Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4）または酵母細胞（例えばS.セレビシアエ（cerevisiae）、ピキア（Pichia）など）で製造される。また別の実施態様では、抗体は、無細胞翻訳系を用いてin vitroで発現される。原核細胞（例えば大腸菌）および真核細胞（例えば麦芽、ウサギ網状赤血球）の両者に由来するin vitro翻訳系が利用可能であり、問題のタンパク質の発現レベル及び機能的特性を基準に選択することができる。例えば、当業者には理解されるところであるが、in vitro翻訳はいくつかのディスプレー技術、例えばリボソームディスプレーのために必要である。さらにまた、抗体は化学的合成方法によって製造することができる。さらにまたトランスジェニック発現系（動物（例えばウシ、ヒツジまたはヤギのミルク、発育鶏卵、完全な昆虫の幼虫）および植物（例えばトウモロコシ、タバコ、アオウキクサなど）の両方を含む）もまた用いることができる。 The antibodies of the present invention can be produced by culturing host cells transformed with a nucleic acid, eg, an expression vector (including a nucleic acid encoding the antibody), under conditions suitable for inducing or causing protein expression. it can. Conditions suitable for expression will vary depending on the choice of expression vector and host cell, and will be readily ascertainable by one skilled in the art by routine experimentation. A great variety of suitable hosts can be used. Such includes, but is not limited to, mammalian cells, bacteria, insect cells and yeast. Various cell lines that can be used in the present invention are described in the ATCC® cell line catalog (available from the American Type Culture Collection).
In certain embodiments, the antibody is expressed in a mammalian expression system (including expression systems that are introduced into mammalian cells using a virus (eg, retrovirus or adenovirus)). Any mammalian cell, such as human, mouse, rat, hamster, primate cell, etc. can be used. Suitable cells also include known research cells (Jurkat T cells, NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2 / 0, NS0 cells and variants thereof, including Including, but not limited to). In yet another embodiment, the library protein is expressed in bacterial cells. Bacterial expression systems are well known in the art and include Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris, and St. lividans. In another embodiment, the antibody is produced in insect cells (eg, Sf21 / Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) or yeast cells (eg, S. cerevisiae, Pichia, etc.). In yet another embodiment, the antibody is expressed in vitro using a cell-free translation system. In vitro translation systems from both prokaryotic cells (eg, E. coli) and eukaryotic cells (eg, malt, rabbit reticulocytes) are available and can be selected based on the expression level and functional characteristics of the protein in question. it can. For example, as will be appreciated by those skilled in the art, in vitro translation is necessary for some display techniques, such as ribosome display. Furthermore, antibodies can be produced by chemical synthesis methods. Furthermore, transgenic expression systems (including both animals (eg, bovine, sheep or goat milk, hen eggs, complete insect larvae) and plants (eg, corn, tobacco, duckweed, etc.) can also be used.

本発明の抗体をコードする核酸を発現ベクターに取り込ませて、タンパク質を発現させることができる。多様な発現ベクターをタンパク質発現のために利用することができる。発現ベクターは、自己複製性染色体外ベクターまたは宿主のゲノムに組み込まれるベクターを含むことができる。発現ベクターは宿主の細胞タイプに適合できるように構築される。したがって、本発明で有用な発現ベクターには、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、及びin vitro系でのタンパク質発現を可能にするベクターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。当分野で知られているように、抗体の発現のために本発明で有用な多様な発現ベクターが、（市場からまたは他の方法で）入手可能である。
発現ベクターは、典型的には、コントロール配列又は調節配列に作動できるように連結されたタンパク質、選別可能マーカー、任意の融合パートナーおよび／または追加のエレメントを含む。本明細書の“作動できるように連結された”とは、核酸が別の核酸配列と機能的な関係に配置されることを意味する。一般的には、これらの発現ベクターは、抗体をコードする核酸と作動できるように連結された転写及び翻訳調節核酸を含み、典型的には当該タンパク質の発現に用いられる宿主細胞にとって適切である。一般的には、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含むことができる。当分野ではまた公知のように、発現ベクターは、典型的には選別遺伝子又はマーカーを含み、発現ベクターを含む形質転換宿主細胞の選別を可能にする。選別遺伝子は当分野では周知であり、使用される宿主細胞により変動するであろう。 A protein can be expressed by incorporating a nucleic acid encoding the antibody of the present invention into an expression vector. A variety of expression vectors can be utilized for protein expression. Expression vectors can include self-replicating extrachromosomal vectors or vectors that integrate into the host genome. Expression vectors are constructed to be compatible with the host cell type. Thus, expression vectors useful in the present invention include, but are not limited to, vectors that allow protein expression in mammalian cells, bacteria, insect cells, yeast, and in vitro systems. As is known in the art, a variety of expression vectors useful in the present invention for expression of antibodies are available (from the market or otherwise).
Expression vectors typically include a protein, a selectable marker, any fusion partner, and / or additional elements operably linked to control or regulatory sequences. As used herein, “operably linked” means that a nucleic acid is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. In general, these expression vectors contain transcriptional and translational regulatory nucleic acids operably linked to the antibody-encoding nucleic acid and are typically appropriate for the host cell used to express the protein. In general, transcriptional and translational regulatory sequences can include promoter sequences, ribosome binding sites, transcriptional start and stop sequences, translational start and stop sequences, and enhancer or activator sequences. As is also known in the art, expression vectors typically contain a selection gene or marker, allowing selection of transformed host cells containing the expression vector. Selection genes are well known in the art and will vary with the host cell used.

抗体は融合パートナーと作動できるように連結され、発現タンパク質の標的への誘導、精製、スクリーニング、ディスプレーなどを可能にすることができる。融合パートナーは、リンカー配列を介して抗体配列と連結させることができる。リンカー配列は、一般的には小数のアミノ酸、典型的には10未満を含むが、ただしより長いリンカーもまた用いることができる。典型的には、リンカー配列は、可撓性で分解に対し耐性を有するように選択される。当業者には理解されるところであるが、多様な配列のいずれもリンカーとして用いることができる。例えば、通常のリンカー配列はアミノ酸配列GGGGSを含む。融合パートナーは、抗体及び結合されている任意の融合パートナーを所望の細胞部位へまたは細胞外培地へ誘導する、標的誘導配列またはシグナル配列であってもよい。当分野で知られているように、ある種のシグナリング配列は、増殖培地中に又は細胞周辺腔（細胞内膜と外膜との間に存在する）に分泌されるタンパク質を標的とすることができる。融合パートナーはまた、精製および／またはスクリーニングを可能にするペプチド又はタンパク質をコードする配列であってもよい。そのような融合パートナーには、ポリヒスチジンタグ（His-タグ）（例えばH₆およびH₁₀、または固定金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）システム（例えばNi²⁺アフィニティーカラム）とともに使用される他のタグ）、GST融合物、MBP融合物、Strep-タグ、細菌酵素BirAのBSPビオチニル化標的配列、および抗体によって標的に誘導されるエピトープタグ（例えばc-mycタグ、flag-タグなど）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。当業者には理解されるところであるが、そのようなタグは、精製に、スクリーニングに、又はその両方で有用でありえる。例えば、抗体はHis-タグを用い、前記をNi²⁺アフィニティーカラムに固定することによって精製され、精製後に続いてこの同じHis-タグを用いて前記抗体をNi²⁺被覆プレートに固定してELISA又は他の結合アッセイを（下記に記載するように）実施することができる。融合パートナーは、抗体をスクリーニングする選別方法の使用を可能にすることができる（下記参照）。多様な選別方法を可能にする融合パートナーは当分野で周知であり、これらのいずれも本発明で有用である。例えば、抗体ライブラリーのメンバーを遺伝子IIIタンパク質と融合することによって、ファージディスプレーを利用することができる（Kay et al. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996；Lowman et al. 1991, Biochemistry 30:10832-10838；Smith, 1985, Science 228:1315-1317、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。融合パートナーは抗体の標識を可能にすることができる。また別には、融合パートナーは発現ベクター上の特異的な配列と結合することができ、融合パートナーおよび結合抗体を、それらをコードする核酸と共有結合または非共有結合により連結させることができる。 The antibody can be operably linked to a fusion partner to allow induction of the expressed protein to the target, purification, screening, display, etc. The fusion partner can be linked to the antibody sequence via a linker sequence. The linker sequence generally contains a small number of amino acids, typically less than 10, although longer linkers can also be used. Typically, the linker sequence is selected to be flexible and resistant to degradation. As will be appreciated by those in the art, any of a variety of sequences can be used as the linker. For example, a typical linker sequence includes the amino acid sequence GGGGS. The fusion partner may be a target-inducing or signal sequence that directs the antibody and any bound fusion partner to the desired cellular site or to the extracellular medium. As is known in the art, certain signaling sequences may target proteins that are secreted into the growth medium or into the periplasmic space (present between the inner and outer membranes). it can. The fusion partner may also be a sequence encoding a peptide or protein that allows purification and / or screening. Such fusion partners include polyhistidine tags (His-tags) (eg H ₆ and H ₁₀ , or other tags used with immobilized metal affinity chromatography (IMAC) systems (eg Ni ²⁺ affinity columns)) , GST fusions, MBP fusions, Strep-tags, BSP biotinylated target sequences of the bacterial enzyme BirA, and epitope tags (eg c-myc tags, flag-tags, etc.) directed to the target by antibodies, However, it is not limited to these. As will be appreciated by those skilled in the art, such tags can be useful for purification, screening, or both. For example, the antibody is purified using a His-tag and immobilized on a Ni ²⁺ affinity column, and after purification, the antibody is then immobilized on a Ni ²⁺ coated plate using this same His-tag. Alternatively, other binding assays can be performed (as described below). Fusion partners can allow the use of sorting methods to screen for antibodies (see below). Fusion partners that enable a variety of sorting methods are well known in the art, any of which are useful in the present invention. For example, phage display can be utilized by fusing a member of an antibody library with a gene III protein (Kay et al. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996 Lowman et al. 1991, Biochemistry 30: 10832-10838; Smith, 1985, Science 228: 1315-1317, which is incorporated herein by reference). The fusion partner can allow labeling of the antibody. Alternatively, the fusion partner can bind to a specific sequence on the expression vector, and the fusion partner and binding antibody can be covalently or non-covalently linked to the nucleic acid encoding them.

外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は当分野では周知であり、用いられる宿主細胞にしたがって変動するであろう。そのような技術にはデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス又はファージ感染、ポリヌクレオチドのリポソーム被包化、および核内へのDNAの直接的マイクロインジェクションが含まれるが、ただしこれらに限定されない。哺乳動物細胞の事例では、トランスフェクションは一過性でも安定性でもよい。
ある実施態様では、抗体は発現後に精製または単離される。タンパク質は、当業者に知られている多様な方法で単離または精製することができる。標準的な精製方法にはクロマトグラフィー技術が含まれる（前記は以下を含むが、ただしこれらに限定されない：イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイジング又はゲルろ過、及び逆相（例えばFPLC及びHPLCのようなシステムを用いて周囲圧又は高圧で実施される））。精製方法にはまた、電気泳動、免疫学的技術、沈殿、透析、およびクロマトフォーカシング技術が含まれる。タンパク質濃縮と組み合わせた限外ろ過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。当分野ではよく知られているように、多様な天然のタンパク質がFcおよび抗体と結合し、これらのタンパク質は抗体の精製のために本発明で有用でありえる。例えば、細菌のプロテインA及びGはFc領域と結合する。同様に、細菌のプロテインLはいくつかの抗体のFab領域と結合し、当然のことながら抗体の標的抗原とも結合する。精製は、しばしば特定の融合パートナーによって可能となりえる。例えば、抗体は、GST融合物が用いられる場合にはグルタチオン樹脂を用いて、His-タグが用いられる場合はNi²⁺アフィニティークロマトグラフィーを用いて、又はflag-タグが用いられる場合は固定抗flag抗体を用いて精製することができる。適切な精製技術における一般的な手引きのためには例えば以下を参照されたい：Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。必要な純度は、スクリーン又は抗体の使用に応じて変動するであろう。いくつかの事例では、精製は不要である。例えばある実施態様では、抗体が分泌される場合は、スクリーニングは培養液から直接実施することができる。当分野では周知のように、いくつかの選別方法はタンパク質の精製を必要としない。したがって、例えば、抗体ライブラリーがファージディスプレーライブラリーを形成する場合、タンパク質の精製は実施しなくてもよい。 Methods for introducing exogenous nucleic acid into host cells are well known in the art and will vary with the host cell used. Such techniques include dextran-mediated transfection, calcium phosphate precipitation, calcium chloride treatment, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, electroporation, viral or phage infection, liposome encapsulation of polynucleotides, and DNA into the nucleus. Direct microinjection is included, but is not limited to these. In the case of mammalian cells, transfection can be transient or stable.
In certain embodiments, the antibody is purified or isolated after expression. Proteins can be isolated or purified by a variety of methods known to those skilled in the art. Standard purification methods include chromatographic techniques (including but not limited to: ion exchange, hydrophobic interaction, affinity, sizing or gel filtration, and reverse phase (eg FPLC and Performed at ambient or high pressure using a system such as HPLC)). Purification methods also include electrophoresis, immunological techniques, precipitation, dialysis, and chromatofocusing techniques. Ultrafiltration and diafiltration techniques combined with protein concentration are also useful. As is well known in the art, a variety of natural proteins bind Fc and antibodies, and these proteins may be useful in the present invention for antibody purification. For example, bacterial proteins A and G bind to the Fc region. Similarly, bacterial protein L binds to the Fab region of some antibodies and, of course, also binds to the antibody target antigen. Purification can often be possible with specific fusion partners. For example, the antibody may be glutathione resin when a GST fusion is used, Ni ²⁺ affinity chromatography when a His-tag is used, or a fixed anti-flag when a flag-tag is used. It can be purified using antibodies. For general guidance on suitable purification techniques, see, for example, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994 (which is hereby incorporated by reference). included). The required purity will vary depending on the use of the screen or antibody. In some cases, no purification is necessary. For example, in one embodiment, if the antibody is secreted, screening can be performed directly from the culture medium. As is well known in the art, some sorting methods do not require protein purification. Thus, for example, if the antibody library forms a phage display library, protein purification may not be performed.

in vitro実験法
抗体は、多様な方法（in vitroアッセイ、in vivoおよび細胞系アッセイが含まれるが、ただしこれらに限定されない）、および選別技術を用いてスクリーニングすることができる。自動化及び高処理スクリーニング技術をスクリーニング方法で用いることができる。スクリーニングでは融合パートナーまたは標識の使用を利用することができる。融合パートナーの使用は上記で考察されている。本明細書の“標識されている”とは、スクリーニングでの検出を可能にするために本発明の抗体に1つ以上の成分、同位元素、または化合物を結合させることを意味する。一般的には、標識は3つのクラスに分類される：a）免疫標識、前記は、抗体によって認識される融合パートナーとして取り込まれたエピトープでありえる；b）同位元素標識、前記は、放射性同位元素でも又は重い同位元素でもよい；およびc）小分子標識、前記には蛍光及び比色定量色素、又は他の標識方法を可能にする分子（例えばビオチン）が含まれえる。標識は化合物の任意の位置に取り込むことができ、さらにタンパク質発現中にin vitro又はin vivoで取り込むことができる。
ある実施態様では、抗体の機能的および／または生物物理学的機能がin vitroアッセイでスクリーニングされる。in vitroアッセイは、問題の特性を広い範囲で動態的にスクリーニングすることを可能にする。スクリーニングすることができる抗体の特性には、安定性、可溶性、およびFcリガンド（例えばFcγR）に対する親和性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。多数の特性を同時にまたは個々にスクリーニングすることができる。アッセイの要件に応じてタンパク質は精製してもしなくてもよい。ある実施態様では、スクリーニングは、抗体と結合することが判明しているかまたは結合すると考えられているタンパク質又は非タンパク質分子と抗体との結合についての定性的又は定量的結合アッセイである。ある実施態様では、スクリーニングは、標的抗原との結合を測定するための結合アッセイである。また別の実施態様では、スクリーニングは、Fcリガンド（FcγRファミリー、新生児レセプターFcRn、補体タンパク質C1q、ならびに細菌性プロテインAおよびGを含むが、ただしこれらに限定されない）と抗体の結合についての結合アッセイである。前記Fcリガンドは、任意の生物、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルなどに由来することができる。結合アッセイは、当分野で公知の多様な方法を用いて実施することができる。前記方法には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：FRET（蛍光共鳴エネルギー移転、Fkuorescence Resonabce Energy Transfer）およびBRET（生物発光共鳴エネルギー移転、Bioluminescence Resonabce Energy Transfer）系アッセイ、アルファスクリーン(商標)（AlphaScreen^TM）（増幅発光近似均質アッセイ、Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay）、シンチレーション近似アッセイ（Scintillation Proximity Assay）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、SPR（表面プラズモン共鳴、またBiacore^TMとしても知られている）、等温定量比色分析法（isothermal titration calorimetry）、弁別的走査比色分析法（differential scanning calorimetry）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（ゲルろ過を含む）。これらの方法および他の方法は、抗体の融合パートナーまたは標識のあるものの利点を利用することができる。アッセイは多様な検出方法（発色標識、蛍光標識、冷光標識又は同位元素標識を含むが、ただしこれらに限定されない）を利用することができる。 In vitro experimental antibodies can be screened using a variety of methods, including but not limited to in vitro assays, in vivo and cell-based assays, and sorting techniques. Automation and high throughput screening techniques can be used in the screening method. Screening can utilize the use of fusion partners or labels. The use of a fusion partner is discussed above. As used herein, “labeled” means that one or more components, isotopes, or compounds are attached to an antibody of the invention to enable detection in screening. In general, labels are divided into three classes: a) immunolabels, which can be epitopes incorporated as fusion partners recognized by antibodies; b) isotope labels, which are radioisotopes Or c) may be heavy isotopes; and c) small molecule labels, including fluorescent and colorimetric dyes, or molecules that allow other labeling methods (eg, biotin). The label can be incorporated at any location on the compound and can be incorporated in vitro or in vivo during protein expression.
In certain embodiments, the functional and / or biophysical function of the antibody is screened in an in vitro assay. In vitro assays allow a wide range of kinetic screens for the properties in question. Properties of antibodies that can be screened include, but are not limited to, stability, solubility, and affinity for Fc ligands (eg, FcγR). Multiple properties can be screened simultaneously or individually. Depending on the assay requirements, the protein may or may not be purified. In certain embodiments, the screening is a qualitative or quantitative binding assay for binding of the antibody to a protein or non-protein molecule that is known or thought to bind to the antibody. In certain embodiments, the screening is a binding assay to measure binding to the target antigen. In yet another embodiment, the screening comprises binding assays for antibody binding to Fc ligands (including but not limited to FcγR family, neonatal receptor FcRn, complement protein C1q, and bacterial proteins A and G). It is. The Fc ligand can be derived from any organism such as humans, mice, rats, rabbits and monkeys. Binding assays can be performed using a variety of methods known in the art. Such methods include (but are not limited to): FRET (Fluorescence Resonabce Energy Transfer) and BRET (Bioluminescence Resonabce Energy Transfer) based assays, AlphaScreen ™. (AlphaScreen ^™ ) (Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay), Scintillation Proximity Assay), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), SPR (Surface Plasmon Resonance, also known as Biacore ^™ ) ), Isothermal titration calorimetry, differential scanning calorimetry, gel electrophoresis and chromatography (including gel filtration). These and other methods can take advantage of certain antibody fusion partners or labels. The assay can utilize a variety of detection methods, including but not limited to chromogenic labels, fluorescent labels, cold light labels or isotope labels.

抗体の生物物理学的特性、例えば安定性および可溶性は当分野で公知の多様な方法を用いてスクリーニングすることができる。タンパク質の安定性は、折りたたまれた状態と展開された状態との間の熱力学的平衡を測定することによって決定することができる。例えば、本発明の抗体は、化学変性剤、熱またはpHを用いて展開させることができ、この遷移は、円偏光二色性分光分析、蛍光分光分析、吸収分光分析、NMR分光分析、比色分析、及びタンパク質分解を含む（ただしこれらに限定されない）方法を用いてモニターすることができる。当業者には理解されるところであるが、折りたたみおよび展開の遷移に関する動力学パラメーターはまたこれらの技術及び他の技術を用いてモニターすることができる。抗体の可溶性及び全体的な構造の完全性は、当分野で公知の広範囲の方法を用いて定量的又は定性的に決定することができる。抗体の生物物理学的特性の性状を決定するために本発明で有用でありえる方法には以下が含まれる：ゲル電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィー）、ペプチドマッピング、オリゴ糖マッピング、質量分析、紫外線吸収分光分析、蛍光分光分析、円偏光二色性分光分析、等温定量比色分析法、弁別的走査比色分析法、超遠心分析法、振動光散乱、タンパク質分解、および架橋、濁度測定、ろ過遅延アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光色素結合アッセイ、タンパク質染色アッセイ、顕微鏡検査、ならびにELISAまたは他の結合アッセイによる凝集物の検出。X-線結晶学技術およびNMR分光分析を利用する構造解析もまた有用でありえる。ある実施態様では、安定性および／または可溶性は、ある一定時間後のタンパク質溶液の量を決定することによって測定できる。このアッセイでは、タンパク質は何らかの激烈な条件、例えば上昇温度、低pH、または変性剤の存在に暴露されてもされなくてもよい。典型的には、機能は、安定であり溶解性でありおよび／または十分に折りたたまれた或いは構造を有するタンパク質を要求するので、上述の機能アッセイおよび結合アッセイはまたそのような測定を実施するための方法を提供する。例えば、抗体を含む溶液は、標的抗原と結合するその能力についてアッセイされ、続いて一定時間以上上昇温度に暴露され、続いて抗原結合能力について再度アッセイされる。展開タンパク質および凝集タンパク質は抗原と結合することができないと予想されるので、残存活性の量は抗体の安定性及び可溶性の測定値を提供する。 The biophysical properties of antibodies, such as stability and solubility, can be screened using a variety of methods known in the art. Protein stability can be determined by measuring the thermodynamic equilibrium between the folded and unfolded states. For example, the antibodies of the invention can be developed using chemical denaturants, heat or pH, and this transition can be achieved by circular dichroism spectroscopy, fluorescence spectroscopy, absorption spectroscopy, NMR spectroscopy, colorimetry. Analysis and methods can be monitored using methods including but not limited to proteolysis. As will be appreciated by those skilled in the art, the kinetic parameters for folding and unfolding transitions can also be monitored using these and other techniques. Antibody solubility and overall structural integrity can be determined quantitatively or qualitatively using a wide range of methods known in the art. Methods that can be useful in the present invention to determine the properties of the biophysical properties of antibodies include the following: gel electrophoresis, isoelectric focusing, capillary electrophoresis, chromatography (eg, size exclusion chromatography). , Ion exchange chromatography, and reversed-phase high-performance liquid chromatography), peptide mapping, oligosaccharide mapping, mass spectrometry, ultraviolet absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, circular dichroism spectroscopy, isothermal quantitative colorimetry, discrimination Scanning colorimetry, ultracentrifugation, vibrational light scattering, proteolysis and cross-linking, turbidity measurement, filtration delay assay, immunological assay, fluorochrome binding assay, protein staining assay, microscopy, and ELISA or Detection of aggregates by other binding assays. Structural analysis utilizing X-ray crystallography techniques and NMR spectroscopy can also be useful. In certain embodiments, stability and / or solubility can be measured by determining the amount of protein solution after a certain time. In this assay, the protein may or may not be exposed to any extreme conditions such as elevated temperature, low pH, or the presence of denaturing agents. Since the function typically requires a protein that is stable and soluble and / or well folded or structured, the functional and binding assays described above are also for performing such measurements. Provide a way. For example, a solution containing an antibody is assayed for its ability to bind to a target antigen, subsequently exposed to elevated temperature for a period of time and subsequently re-assayed for antigen-binding ability. The amount of residual activity provides a measure of the stability and solubility of the antibody, since developing and aggregated proteins are expected to be unable to bind to the antigen.

ある実施態様では、ライブラリーは1つ以上の細胞系アッセイ又はin vitroアッセイを用いてスクリーニングされる。そのようなアッセイの場合、典型的には、抗体（精製または未精製）を外因的に添加して、細胞がライブラリーに属する個々の変種又は変種群に暴露されようにする。これらのアッセイは、典型的には（常にというわけではないが）、抗体が抗原と結合し何らかの生化学的事象（例えば細胞溶解、食作用、リガンド／レセプター結合阻害、増殖および／または***の阻害、アポトーシスなどのようなエフェクター機能）を仲介する能力に関する生物学を基準にしている。そのようなアッセイは、しばしば細胞の抗体に対する応答、例えば細胞の生存、細胞の死、細胞の食作用、細胞溶解、細胞形態の変化、または転写活性化（例えば天然の遺伝子またはレポーター遺伝子の細胞内発現）をモニターすることを必要とする。例えば、そのようなアッセイは、ADCC、ADCPまたはCDCを誘引する抗体の能力を測定することができる。いくつかのアッセイの場合、追加の細胞又は成分（すなわち標的細胞に加えて）を添加する必要があるかもしれない。前記は例えば、血清補体、またはエフェクター細胞、例えば抹消血単球（PBMC）、NK細胞、マクロファージなどである。そのような追加の細胞は、任意の生物、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、サルなどに由来することができる。架橋またはモノマー抗体は、抗体の標的抗原を発現するある種の細胞株のアポトーシスを引き起こすか、またはそれらは、アッセイに添加された免疫細胞による標的細胞の攻撃を媒介することができる。細胞の死または生存率をモニターする方法は当分野では公知であり、色素、発蛍光団、免疫化学的、細胞化学的および放射性試薬の使用が含まれる。例えば、カスパーゼアッセイまたはアネキシン-フルオロコンジュゲートはアポトーシスの測定を可能にし、さらに、放射性物質取り込みもしくは放出（例えばクロム-51放出アッセイ）または蛍光色素（例えばアラマーブルー）の代謝性還元は、細胞増殖、***、または活性化の追跡を可能にすることができる。ある実施態様では、DELFIA(商標)EuTDA系細胞傷害アッセイ（Perkin Elmer, MA）が用いられる。また別には、死滅又は損傷した標的細胞を、1つ以上の天然の細胞内タンパク質、例えばラクテートデヒドロゲナーゼの遊離の測定によってモニターすることができる。転写活性化もまた、細胞系アッセイで機能をアッセイするための方法として供することができる。この事例では、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされえる天然の遺伝子又はタンパク質についてアッセイすることによって応答をモニターすることができる。例えば、ある種のインターロイキンの遊離を測定するか、また別には、データの読み出しはルシフェラーゼまたはGFPレポーター構築物によることができる。細胞系アッセイはまた、抗体の存在に対する応答として形態学的変化の測定を含むことができる。そのようなアッセイのための細胞タイプは原核細胞でも真核細胞でもよく、さらに当分野で公知の多様な細胞株を利用してもよい。また別には、抗体をコードする核酸で形質転換した、または前記核酸をトランスフェクトした細胞を用いて、細胞系スクリーニングが実施される。
in vitroアッセイには結合アッセイ、ADCC、CDC、食作用、細胞傷害性、***、アポトーシス、壊死、細胞周期停止、過酸化物／オゾン放出、エフェクター細胞の走化性、エフェクター機能抗体の減少によるそのようなアッセイの阻害（活性の範囲は例えば100ｘを超える改善又は100ｘを超える低下）、レセプター活性化とそのようなレセプタープロフィルから予想されるアッセイの結果との融合が含まれるが、ただしこれらに限定されない。 In certain embodiments, the library is screened using one or more cell-based assays or in vitro assays. For such assays, antibodies (purified or unpurified) are typically added exogenously so that the cells are exposed to individual variants or groups of variants belonging to the library. These assays typically (but not always) inhibit the binding of an antibody to an antigen and any biochemical event (eg, cell lysis, phagocytosis, ligand / receptor binding inhibition, proliferation and / or division). Biology on ability to mediate effector functions such as apoptosis, etc.). Such assays often involve the response of cells to antibodies, such as cell survival, cell death, cell phagocytosis, cell lysis, changes in cell morphology, or transcriptional activation (eg, the intracellular or native gene or reporter gene). Need to be monitored). For example, such assays can measure the ability of an antibody to attract ADCC, ADCP or CDC. For some assays it may be necessary to add additional cells or components (ie in addition to the target cells). These are, for example, serum complement, or effector cells, such as peripheral blood monocytes (PBMC), NK cells, macrophages and the like. Such additional cells can be derived from any organism, such as humans, mice, rats, rabbits, monkeys and the like. Cross-linked or monomeric antibodies cause apoptosis of certain cell lines that express the target antigen of the antibody, or they can mediate attack of the target cell by immune cells added to the assay. Methods for monitoring cell death or viability are known in the art and include the use of dyes, fluorophores, immunochemical, cytochemical and radioactive reagents. For example, caspase assays or annexin-fluoroconjugates allow measurement of apoptosis, and further, metabolic uptake or release of radioactive material (eg chromium-51 release assay) or metabolic reduction of fluorescent dyes (eg alamar blue) Can enable tracking of division, or activation. In one embodiment, the DELFIA ™ EuTDA-based cytotoxicity assay (Perkin Elmer, MA) is used. Alternatively, dead or damaged target cells can be monitored by measuring the release of one or more natural intracellular proteins, such as lactate dehydrogenase. Transcriptional activation can also serve as a method for assaying function in cell-based assays. In this case, the response can be monitored by assaying for a natural gene or protein that can be up-regulated or down-regulated. For example, the release of certain interleukins can be measured, or alternatively, data readout can be by luciferase or GFP reporter constructs. Cell line assays can also include measurement of morphological changes as a response to the presence of antibodies. The cell type for such assays may be prokaryotic or eukaryotic, and various cell lines known in the art may be utilized. Alternatively, cell line screening is performed using cells that have been transformed with, or transfected with, the nucleic acid encoding the antibody.
In vitro assays include binding assays, ADCC, CDC, phagocytosis, cytotoxicity, division, apoptosis, necrosis, cell cycle arrest, peroxide / ozone release, effector cell chemotaxis, effector functional antibody reduction Inhibition of such assays (range of activity eg greater than 100x or lower than 100x), fusion of receptor activation with the expected assay results from such receptor profiles, including but not limited to Not.

in vivo実験法
本発明の抗体の生物学的特性は細胞、組織及び生物体全体での実験で特徴を決定することができる。当分野で知られているように、薬剤はしばしば動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルを含むが、ただしこれらに限定されない）で試験し、疾患または疾患モデルに対する治療に対して薬剤の有効性を測定するか、または薬剤の薬理動態、毒性及び他の特性を測定する。前記動物は疾患モデルと呼ぶことができる。本発明の抗体に関して、候補ポリペプチドのヒトでの有効性について潜在能力を判定するために動物モデルを用いるときは固有の問題が生じる。これは、少なくとも部分的には、ヒトFcレセプターに対する親和性に対して特異的な影響を有する抗体が、オルソロガスな動物のレセプターに関して同様な親和性作用を持たないかもしれないという事実による。これらの問題は、本物のオルソローグの正確な割り当てに付随する避けがたい曖昧さ（Mechetina et al. Immunogenetics, 2002 54:463-468、前記文献は参照により本明細書に含まれる）、およびいくつかのオルソローグは当該動物に単に存在しないという事実（例えばヒトはFcγRIIaを保有するが、マウスはこれをもたない）によってさらに難しくなりえる。治療薬はしばしばマウス（ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよびトランスジェニックマウス（ノックイン及びノックアウトを含む）を含むが、ただしこれらに限定されない）で試験される。例えば、抗癌剤として意図される本発明の抗体はマウス癌モデル（例えばゼノグラフトマウス）で試験することができる。この方法では、腫瘍または腫瘍細胞株がマウスに移植または注射され、続いてこのマウスを当該治療薬で処置して、癌増殖および転移を低下または阻害する抗体の能力を決定する。また別のアプローチはSCIDネズミモデルの使用である。このアプローチでは、免疫不全マウスに適切な一連のヒトFcRを有するヒト抹消血リンパ球（PBL）を注射して、マウスに準機能的ヒト免疫系を付与し、続いて、注射されたヒト腫瘍細胞を標的とする抗体またはFc-ポリペプチドを注射する。そのようなモデルでは、所望の抗原（例えばSkOV3卵巣癌細胞上のher2/neu）を標的とするFc-ポリペプチドは、マウスの体内でヒトPBLと相互作用して、殺腫瘍エフェクター機能を発揮する。そのような実験は、治療薬として用いられるべき前記抗体の潜在能力を決定するために有意義なデータを提供することができる。任意の生物、例えば哺乳動物を試験に用いることができる。例えばヒトとの遺伝的類似性のために、サルは適切な治療モデルであり、したがって本発明の抗体の有効性、毒性、薬理学、または他の特性の試験に用いることができる。本発明の抗体のヒトでの試験は、医薬としての認可のために最終的に必要であり、したがってこれらの実験ももちろん意図されている。本発明の抗体は、したがってそれらの治療有効性、毒性、薬理学および／または他の臨床特性を決定するためにヒトで試験することができる。 In Vivo Experimental Methods The biological properties of the antibodies of the invention can be characterized by experiments on cells, tissues and whole organisms. As is known in the art, drugs are often tested in animals (including but not limited to mice, rats, rabbits, dogs, cats, pigs and monkeys) for the treatment of diseases or disease models. Measure the effectiveness of the drug or measure the pharmacokinetics, toxicity and other properties of the drug. The animal can be referred to as a disease model. With the antibodies of the present invention, inherent problems arise when using animal models to determine the potential of candidate polypeptides for human effectiveness. This is due, at least in part, to the fact that antibodies that have a specific effect on affinity for human Fc receptors may not have similar affinity effects on orthologous animal receptors. These problems are unavoidable ambiguities associated with the correct assignment of genuine orthologues (Mechetina et al. Immunogenetics, 2002 54: 463-468, which is hereby incorporated by reference), and some This fact can be made more difficult by the fact that the orthologues are simply not present in the animal (eg, humans carry FcγRIIa, but mice do not have this). Therapeutic agents are often tested in mice (including but not limited to nude mice, SCID mice, xenograft mice and transgenic mice, including knock-in and knock-out). For example, an antibody of the invention intended as an anticancer agent can be tested in a mouse cancer model (eg, xenograft mouse). In this method, a tumor or tumor cell line is transplanted or injected into a mouse, which is subsequently treated with the therapeutic agent to determine the ability of the antibody to reduce or inhibit cancer growth and metastasis. Another approach is to use the SCID mouse model. In this approach, immunodeficient mice are injected with human peripheral blood lymphocytes (PBL) with a suitable set of human FcRs to confer a semi-functional human immune system to the mice, followed by injected human tumor cells An antibody or Fc-polypeptide targeted to is injected. In such models, Fc-polypeptides that target the desired antigen (eg, her2 / neu on SkOV3 ovarian cancer cells) interact with human PBL in the mouse body to exert tumoricidal effector functions. . Such experiments can provide meaningful data to determine the potential of the antibody to be used as a therapeutic agent. Any organism, such as a mammal, can be used for the test. For example, due to genetic similarity with humans, monkeys are an appropriate therapeutic model and can therefore be used to test the efficacy, toxicity, pharmacology, or other properties of the antibodies of the invention. Human testing of the antibodies of the present invention is ultimately necessary for pharmaceutical approval and therefore these experiments are of course contemplated. The antibodies of the present invention can therefore be tested in humans to determine their therapeutic efficacy, toxicity, pharmacology and / or other clinical properties.

本発明の抗体は、動物モデルまたはヒトにおいて優れた性能をFc含有治療薬に付与することができる。本明細書に記載したように、そのような抗体のレセプター結合プロフィールは、例えば細胞傷害性薬剤の潜在能力を高めるために、または特定のエフェクター機能もしくはエフェクター細胞を標的にして薬剤作用の選択性を改善するために選択することができる。さらにまた、いくつかのまたは全てのエフェクター機能を低下させ、それによってそのようなFc含有薬剤の副作用または毒性を低下させることができるレセプター結合プロフィールを選択することができる。例えば、FcγRIIIa、FcγRIおよびFcγRIIaとの結合が低下した抗体を選択して、大半の細胞媒介エフェクター機能を排除することが可能であり、またはC1qとの結合が低下した抗体を選択して、補体媒介エフェクター機能を制限することができる。いくつかの状況では、そのようなエフェクター機能は、潜在的な毒性作用を有することが判明しており、したがって、それらを排除することはFc-保有薬剤の安全性を高め、そのような安全性の改善は動物モデルでその性状を調べることができる。いくつかの状況では、そのようなエフェクター機能は、所望の治療活性を橋渡しすることが判明しており、したがってそれらを増強することは、Fc-保有薬剤の活性または潜在能力を高め、そのような活性または潜在能力の改善は動物モデルでその性状を調べることができる。
最適化抗体は、多様な正常位腫瘍モデルで試験することができる。臨床的に関連を有するこれらの動物モデルは、膵臓癌、前立腺癌および乳癌のような攻撃性の癌の病理生理学及び治療の研究で重要である。免疫枯渇マウス（無胸腺ヌードマウスまたはSCIDを含むが、ただしこれらに限定されない）は、ヒト腫瘍細胞またはドナー患者のフラグメントの器官内（例えば膵臓、前立腺又は乳腺）注射部位から拡散した局所性及び全身性腫瘍の評点にしばしば用いられる。 The antibodies of the present invention can confer excellent performance to Fc-containing therapeutics in animal models or humans. As described herein, the receptor binding profile of such antibodies can be used to increase the potency of cytotoxic drugs, for example, or to target specific effector functions or effector cells to select drug effects. You can choose to improve. Furthermore, receptor binding profiles can be selected that can reduce some or all effector functions, thereby reducing the side effects or toxicity of such Fc-containing agents. For example, antibodies with reduced binding to FcγRIIIa, FcγRI and FcγRIIa can be selected to eliminate most cell-mediated effector functions, or antibodies with reduced binding to C1q can be selected to complement Mediator effector functions can be limited. In some situations, such effector functions have been found to have potential toxic effects, thus eliminating them increases the safety of Fc-bearing drugs and such safety The improvement can be investigated in animal models. In some situations, such effector functions have been found to bridge the desired therapeutic activity, thus enhancing them increases the activity or potential of Fc-bearing drugs, such as Improvements in activity or potential can be characterized in animal models.
Optimized antibodies can be tested in a variety of orthotopic tumor models. These animal models that are clinically relevant are important in the study of pathophysiology and treatment of aggressive cancers such as pancreatic cancer, prostate cancer and breast cancer. Immune-depleted mice (including but not limited to athymic nude mice or SCID) are localized and whole body diffused from the site of injection of human tumor cells or donor patient fragments (eg pancreas, prostate or mammary gland) Often used to grade sexual tumors.

いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、多様なヒト疾患の臨床的に関連を有する動物モデルで有効性について評価することができる。多くの事例で、関連モデルには特定の腫瘍抗原のためのトランスジェニック動物が含まれる。
関連するトランスジェニックモデル（例えばヒトFcレセプター（例えばガンマ鎖を含むCD16、FcγR1、RIIa/b及び他のもの）を発現するもの）を用いて、抗体及びFc-融合物をそれらの有効性について判定及び試験することができよう。マウスまたは他のげっ歯類で直接又は間接的にエフェクター機能を橋渡しするヒト遺伝子の導入による抗体の評価は、腫瘍の毒性または他の疾患（例えば自己免疫障害及びRA）における有効性の生理学的研究を可能にすることができよう。ヒトFcレセプター（例えばFcγRIIIa）は多形性（例えば158位のVまたはFの多形性）を有し、これは、ヒトの固有又は混合多形性をげっ歯類へ導入することを可能にすることができよう。しかしながら、多形性特異的FcRを必要とする種々の実験はこのセクションに限定されず、本明細書を通して個々に詳述するように、FcRに関する全ての考察及び適用を概括的に包含する。本発明の抗体は、そのようなトランスジェニックモデルで、Fc含有薬剤に対して優れた活性を付与することができ、特にヒトFcγRIIIa媒介活性に対して最適化された結合プロフィールを有する変種はトランスジェニックCD16マウスで優れた活性を示すことができる。他のヒトFcレセプター、例えばFcγRIIa、FcγRIなどについてトランスジェニックなマウスで同様な有効性の改善が、対応するレセプターに対して最適化された結合プロフィールを有する抗体について観察されえる。多数のヒトレセプターに対してトランスジェニックなマウスは、対応する多数のレセプターに対して最適化された結合プロフィールを有する抗体について、例えば図3に概略するように活性の改善を示すことができよう。 In some embodiments, the antibodies of the invention can be evaluated for efficacy in clinically relevant animal models of various human diseases. In many cases, relevant models include transgenic animals for specific tumor antigens.
Relevant transgenic models (eg those expressing human Fc receptors (eg CD16, FcγR1, RIIa / b and others containing gamma chains)) determine antibodies and Fc-fusions for their effectiveness And could be tested. Evaluation of antibodies by introduction of human genes that directly or indirectly bridge effector functions in mice or other rodents is a physiological study of efficacy in tumor toxicity or other diseases such as autoimmune disorders and RA Could be possible. Human Fc receptors (eg FcγRIIIa) have polymorphisms (eg V or F polymorphisms at position 158), which allow the introduction of human native or mixed polymorphisms into rodents I can do it. However, the various experiments that require polymorphism-specific FcR are not limited to this section and generally encompass all considerations and applications relating to FcR, as detailed in detail throughout this specification. The antibodies of the present invention can confer excellent activity against Fc-containing drugs in such transgenic models, particularly variants with a binding profile optimized for human FcγRIIIa-mediated activity are transgenic. CD16 mice can show excellent activity. Similar improvement in efficacy in mice transgenic for other human Fc receptors such as FcγRIIa, FcγRI, etc. can be observed for antibodies with binding profiles optimized for the corresponding receptors. Mice transgenic for multiple human receptors could show improved activity for antibodies with binding profiles optimized for the corresponding multiple receptors, for example as outlined in FIG.

ヒト患者における治療用候補抗体の潜在的有効性を調べるために動物モデルを用いることに付随する問題及び曖昧さのために、本発明のいくつかの変種ポリペプチドはヒトにおける潜在的な有効性の評価のための代用品として有用でありえる。そのような代用分子は、対応する候補ヒト抗体のFcRおよび／または補体生物学を動物の系で模倣しえよう。この類似性は、おそらく特異的抗体と動物対ヒトレセプターとの間の相対的な結合親和性によって表されるであろう。例えば、ヒトFcγRIIIaに対して親和性が増強された抗体のヒトでの潜在的な有効性を判定するためにマウスモデルを用いようとする場合、適切な代用変種はマウスFcγRIII-2（マウスCD16-2）に対して増強された親和性を有するであろう。あるいは、抑制性ヒトFcγRIIbに対して親和性が低下した抗体のヒトでの潜在的な有効性を判定するためにマウスモデルを用いようとする場合、適切な代用変種はマウスFcγRIIに対して低下した親和性を有するであろう。代用抗体はヒト抗体、動物抗体又はその両抗体の関係において作製しえるということもまた明記されるべきである。
ある実施態様では、抗体の試験は霊長類（例えばカニクイザル（cynomolgus）モデル）での有効性調査を含み、標的抗原を保有する特異的標的細胞の枯渇の判定を促進することができる。さらに別の霊長類モデルには、自己免疫、移植及び癌の治療研究におけるリーザスマンキー（rhesus monkey）とFcポリペプチドのモデルが含まれるが、ただし前記に限定されない。
毒性試験は、標準的な薬理学的プロフィールでは判定できないかまたは薬剤の反復投与後にのみ生じる抗体または融合物関連作用を決定するために実施される。ほとんどの毒性試験が2つの種（げっ歯類及び非げっ歯類）で実施され、新規な治療物質が人間に導入される前に、予想しえない一切の副作用が見落とされていないことを担保する。一般的には、これらのモデルは、多様な毒性（遺伝的毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖/発生毒性及び発癌性を含む）を測定することができる。前述のパラメーターに含まれるものは、食物消費の標準的測定、体重、抗体生成、臨床化学、ならびに標準的器官/組織の肉眼的及び顕微鏡的検査（例えば心臓毒性）である。また別の測定パラメーターは、もしあるとすれば、注射部位の外傷及び中和抗体測定である。伝統的には、モノクローナル抗体治療薬（裸であれコンジュゲートであれ）は、正常組織との交差反応性、免疫原性／抗体産生、コンジュゲートまたはリンカーの毒性、および放射性標識されたものの“バイスタンダー”毒性について評価される。それにもかかわらず、そのような調査は、個々の問題に注意を向けるために個々の特性を明瞭にし、ICH S6（上記にも記した、生物工学製品についての安全性試験）に規定された指針に従う必要がある。したがって、一般的指針は、生成物の性状を十分に明らかにすること、前記生成物についての不純物／夾雑物を除去すること、被検物質は開発を通して比較可能であること、GLPを順守することである。 Due to the problems and ambiguities associated with using animal models to investigate the potential effectiveness of therapeutic candidate antibodies in human patients, some variant polypeptides of the present invention have potential efficacy in humans. Can be useful as a substitute for evaluation. Such surrogate molecules could mimic the FcR and / or complement biology of the corresponding candidate human antibody in animal systems. This similarity is probably represented by the relative binding affinity between the specific antibody and the animal versus human receptor. For example, if a mouse model is to be used to determine the potential effectiveness of an antibody with enhanced affinity for human FcγRIIIa in humans, a suitable surrogate variant would be mouse FcγRIII-2 (mouse CD16- It will have an enhanced affinity for 2). Alternatively, when attempting to use a mouse model to determine the potential human efficacy of an antibody with reduced affinity for inhibitory human FcγRIIb, the appropriate surrogate variant was reduced for mouse FcγRII Will have affinity. It should also be specified that surrogate antibodies can be made in the context of human antibodies, animal antibodies, or both.
In certain embodiments, antibody testing can include efficacy studies in primates (eg, the cynomolgus model) to facilitate the determination of depletion of specific target cells carrying the target antigen. Yet other primate models include, but are not limited to, rhesus monkey and Fc polypeptide models in autoimmunity, transplantation and cancer treatment studies.
Toxicity studies are performed to determine antibody or fusion-related effects that cannot be determined by standard pharmacological profiles or that occur only after repeated administration of the drug. Most toxicity studies are conducted in two species (rodents and non-rodents) to ensure that no unexpected side effects have been overlooked before new therapeutics are introduced into humans To do. In general, these models can measure a variety of toxicities including genetic toxicity, chronic toxicity, immunogenicity, reproductive / developmental toxicity and carcinogenicity. Included in the aforementioned parameters are standard measurements of food consumption, body weight, antibody production, clinical chemistry, and gross and microscopic examination of standard organs / tissues (eg cardiotoxicity). Another measurement parameter, if present, is injection site trauma and neutralizing antibody measurement. Traditionally, monoclonal antibody therapeutics (whether naked or conjugated) have been cross-reactive with normal tissue, immunogenic / antibody production, conjugate or linker toxicity, and radiolabeled Evaluated for “stander” toxicity. Nevertheless, such investigations clarify the individual characteristics in order to draw attention to individual problems and guide the guidelines in ICH S6 (also described above, safety testing for biotechnological products). Need to follow. Therefore, the general guidelines are to fully characterize the product, to remove impurities / contaminants in the product, to ensure that the test substance is comparable throughout development, and to comply with GLP It is.

本発明の抗体の薬物動態（PK）は多様な動物系で調べることができ、もっとも適切なものは非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、アカゲザル）である。6000倍（0.05−300mg/kg）の用量範囲で静脈内／皮下の１回又は反復投与により半減期（数日又は数週間）について、血中濃度および除去とともに定常状態での分布容積を用いて判定することができ、さらに全身的吸収レベルを測定することができる。そのような測定パラメーターの例には、一般的には最大観察血中濃度（Cmax）、Cmax到達時間（Tmax）、0時間から無限大までの血中濃度-時間曲線下の面積[AUC(0-inf)]、及び見かけの除去半減期（T1/2）が含まれる。さらに別の測定パラメーターには、静脈内投与後に得られる濃度-時間データ及び生体利用性の区画分析が含まれよう。カニクイザルを用いる薬理学／毒物学試験の例は、リツキサン（Rituxan）及びゼヴァリン（Zevalin）について確立された（前記では、CD20に対するモノクローナル抗体は交差反応性を有する）。生体内分布、線量測定（放射能標識抗体について）、及びPK試験はまたげっ歯類モデルで実施することができる。そのような試験では、全投与用量における耐性、局所組織に対する毒性、げっ歯類異種移植動物モデルに対する優先的局在、標的細胞（例えばCD20陽性細胞）の枯渇が判定されよう。
本発明の抗体は、動物系又はヒトでFc-含有治療薬に優れた薬物動態を付与することができる。例えば、FcRnとの結合増加は、Fc-含有薬剤の半減期及び暴露を延長しえる。あるいは、FcRnとの結合低下は、暴露の短縮が望ましい場合（例えばそのような薬剤が副作用を有するとき）は、Fc-含有薬剤の半減期及び暴露を短縮しえる。
一連のFcレセプターは、種々の組織におけると同様に多様な免疫細胞タイプ上で弁別的に発現されることは当分野では公知である。Fcレセプターの弁別的な組織分布は、本発明の抗体の薬力学（PD）特性及び薬物動態（PK）特性に最終的に強い影響を及ぼしえる。なぜならば、本発明の抗体は一連のFcレセプターに対して種々の親和性を有するので、PD及び／又はPK特性についてこれらポリペプチドをさらにスクリーニングすることは、PD、PK及び各候補ポリペプチドによって付与される治療有効性の最適なバランスを特定するために極めて有用でありえる。
薬力学試験には、特定の腫瘍細胞への誘導又はシグナリングメカニズムの封鎖、標的抗原発現細胞又はシグナルの枯渇の測定などが含まれえるが、ただしこれらに限定されない。本発明の抗体は特定のエフェクター細胞集団を標的とすることができ、それによってFc-含有薬剤にある種の活性を補充させて、潜在能力を改善させるか又は特に有益な生理学的区画内への侵入を促進することができる。例えば、好中球の活性及び局在化は、FcγRIIIbを標的とする抗体によって誘導しえる。そのような薬物動態効果は動物モデルまたはヒトで示すことができる。 The pharmacokinetics (PK) of the antibodies of the present invention can be examined in a variety of animal systems, the most appropriate being non-human primates (eg, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys). Using steady-state volume of distribution with blood concentration and removal for half-life (days or weeks) by single or repeated intravenous / subcutaneous administration in a dose range of 6000 times (0.05-300 mg / kg) And systemic absorption levels can be measured. Examples of such measurement parameters generally include maximum observed blood concentration (Cmax), Cmax arrival time (Tmax), area under the blood concentration-time curve from 0 to infinity [AUC (0 -inf)], and apparent elimination half-life (T1 / 2). Yet other measurement parameters may include concentration-time data obtained after intravenous administration and compartmental analysis of bioavailability. Examples of pharmacology / toxicology studies using cynomolgus monkeys have been established for Rituxan and Zevalin (wherein monoclonal antibodies against CD20 are cross-reactive). Biodistribution, dosimetry (for radiolabeled antibodies), and PK testing can also be performed in rodent models. Such studies will determine tolerance at all doses, toxicity to local tissues, preferential localization to rodent xenograft animal models, and depletion of target cells (eg, CD20 positive cells).
The antibodies of the present invention can confer excellent pharmacokinetics to Fc-containing therapeutics in animal systems or humans. For example, increased binding to FcRn can extend the half-life and exposure of Fc-containing drugs. Alternatively, reduced binding to FcRn can reduce the half-life and exposure of Fc-containing drugs when shorter exposure is desired (eg, when such drugs have side effects).
A series of Fc receptors are known in the art to be differentially expressed on a variety of immune cell types as well as in various tissues. The differential tissue distribution of Fc receptors can ultimately have a strong impact on the pharmacodynamic (PD) and pharmacokinetic (PK) properties of the antibodies of the invention. Because the antibodies of the present invention have different affinities for a range of Fc receptors, further screening of these polypeptides for PD and / or PK properties is conferred by PD, PK and each candidate polypeptide. Can be extremely useful in identifying the optimal balance of therapeutic efficacy being delivered.
Pharmacodynamic studies can include, but are not limited to, induction into specific tumor cells or blocking signaling mechanisms, measurement of target antigen expressing cells or signal depletion, and the like. The antibodies of the invention can target specific effector cell populations, thereby recruiting certain activities to Fc-containing agents to improve their potential or to enter into a particularly beneficial physiological compartment. Invasion can be promoted. For example, neutrophil activity and localization can be induced by antibodies targeting FcγRIIIb. Such pharmacokinetic effects can be demonstrated in animal models or humans.

臨床での使用
本発明の抗体は種々の治療目的に用いることができる。当業者には理解されるところであるが、本発明の抗体は、抗体などを利用する任意の治療目的に用いることができる。ある実施態様では、抗体は、癌、自己免疫および炎症疾患、ならびに感染症を含む（ただしこれらに限定されない）疾患を治療するために患者に投与される。
本発明の目的のための“患者”にはヒト及び他の動物の両方、例えば哺乳動物、例えばヒトが含まれる。したがって、本発明の抗体は、ヒトの治療および獣医学的利用の両方で用いられる。本発明における“治療”または“治療する”という用語は、治療的処置とともに疾患または障害の予防的又は抑制的手段を含むことを意味する。したがって、例えば、疾患の開始前に抗体の投与が成功すれば、疾患の治療をもたらす。別の例として、疾患の症状の出現後に疾患の症状と戦うために最適化抗体の投与が成功すれば、疾患の治療を構成する。“治療”または“治療する”という用語はまた、疾患の出現後に疾患を根絶するために最適化抗体を投与することを含む。症状の開始後または症状の進行後の薬剤の投与が成功し、症状の軽減およびかなりの疾患の緩和があれば、疾患の治療を構成する。“治療の必要がある”という用語には、すでに疾患または障害を有するだけでなく、疾患または障害を示す傾向がある哺乳動物（疾患又は障害が予防されるべき哺乳動物を含む）が含まれる。
ある実施態様では、本発明の抗体は、タンパク質または他の分子の不適切な発現を含む疾患を有する患者に投与される。本発明では、これは異常なタンパク質を特徴とする疾患または障害を含むことを意味し、前記は、例えば存在するタンパク質の量の変化、タンパク質の局在、翻訳後改変、立体配置の状態、変異体の存在または病原性タンパク質などによるものである。同様に、前記疾患または障害は、分子（多糖類およびガングリオシドを含むが、ただしこれらに限定されない）の変化を特徴としえる。過剰は、任意の原因（分子レベルでの過剰発現、作用部位における長期的もしくは蓄積された出現、または正常と比較して活性が高められたタンパク質を含むが、ただしこれらに限定されない）によって生じえる。この定義に含まれるものは、タンパク質の減少を特徴とする疾患及び障害である。この減少は、任意の原因（分子レベルでの発現低下、作用部位における出現の短縮もしくは減少、タンパク質の変異型または正常と比較してタンパク質の活性の低下を含むが、ただしこれらに限定されない）により生じえる。そのようなタンパク質の過剰又は減少は、タンパク質の正常な発現、外観、または活性と比較して測定でき、前記の測定は、本発明の抗体の開発及び／又は臨床試験で重要な役割を果たすことができる。 Clinical Use The antibodies of the present invention can be used for various therapeutic purposes. As will be appreciated by those skilled in the art, the antibodies of the present invention can be used for any therapeutic purpose utilizing antibodies and the like. In certain embodiments, the antibody is administered to a patient to treat diseases including, but not limited to, cancer, autoimmune and inflammatory diseases, and infectious diseases.
“Patient” for the purposes of the present invention includes both humans and other animals, eg, mammals, eg, humans. Thus, the antibodies of the invention are used in both human therapy and veterinary applications. The term “treatment” or “treat” in the present invention is meant to include prophylactic or suppressive measures of the disease or disorder together with therapeutic treatment. Thus, for example, successful administration of an antibody prior to the onset of disease results in treatment of the disease. As another example, treatment of a disease constitutes a successful administration of an optimized antibody to combat the disease symptoms after the appearance of the disease symptoms. The term “treatment” or “treating” also includes administering optimized antibodies to eradicate the disease after the appearance of the disease. A successful treatment of the drug after the onset of symptoms or after the progression of symptoms, with the relief of symptoms and significant relief of the disease constitutes treatment of the disease. The term “in need of treatment” includes mammals (including mammals whose disease or disorder is to be prevented) that not only already have the disease or disorder but also tend to exhibit the disease or disorder.
In certain embodiments, the antibodies of the invention are administered to a patient having a disease that includes inappropriate expression of a protein or other molecule. In the present invention, this means that it includes a disease or disorder characterized by an abnormal protein, which includes, for example, changes in the amount of protein present, protein localization, post-translational modification, configurational state, mutation This is due to the presence of the body or pathogenic proteins. Similarly, the disease or disorder can be characterized by changes in molecules, including but not limited to polysaccharides and gangliosides. Excess can be caused by any cause, including but not limited to overexpression at the molecular level, long-term or accumulated appearance at the site of action, or a protein with increased activity compared to normal. . Included in this definition are diseases and disorders characterized by protein loss. This reduction can be due to any cause (including but not limited to reduced expression at the molecular level, reduced or reduced appearance at the site of action, protein variants or reduced protein activity compared to normal). Can occur. Such protein excess or reduction can be measured relative to the normal expression, appearance, or activity of the protein, and said measurement plays an important role in the development and / or clinical trials of the antibodies of the invention. Can do.

本明細書の“癌”および“癌性”とは、典型的には規律のない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態に該当し、または前記の記述である。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経線維腫、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、および白血病又はリンパ系悪性疾患が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
そのような癌のより具体的な例には、血液学的悪性疾患、例えば非ホジキンリンパ腫（NHL）が含まれる。NHL癌には、バーキットリンパ腫（BL）、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病（SLL/CLL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、濾胞性リンパ腫（FL）、びまん性大型B細胞リンパ腫（DLCL）、辺縁帯（marginal zone）リンパ腫（MZL）、毛状細胞白血病（HCL）およびリンパ形質細胞性白血病（LPL）、粘膜結合リンパ系組織（MALT）の結節外辺縁帯B細胞リンパ腫、縦隔大細胞リンパ腫、血管内大細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、前駆B細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、前駆T細胞およびNK細胞リンパ腫（前駆T細胞リンパ芽球性リンパ腫、NK芽細胞性リンパ腫）、成熟TおよびNK細胞の腫瘍（抹消T細胞リンパ腫および白血病（PTL）を含む）、成人T細胞白血病／T細胞リンパ腫および大型顆粒性リンパ球性白血病、T細胞慢性リンパ球性白血病／前リンパ球性白血病、T細胞大型顆粒性リンパ球性白血病、攻撃性NK細胞白血病、結節外T-／NK細胞リンパ腫、腸症型T細胞リンパ腫、肝脾臓性T細胞リンパ腫、無構造性大細胞リンパ腫（ALCL）、血管中心性および血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、及び皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の抗体によって治療しえる他の癌には、ホジキンリンパ腫、リンパ球前駆細胞の腫瘍（B細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（B-ALL）及びT細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（T-ALL）を含む）、胸腺腫、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性ミエローマ（MM）、骨髄性新形成、例えば急性骨髄性白血病（AML）（成熟を伴うAML、分化を示さないAMLを含む）、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病、脊髄形成異常症候群、および慢性骨髄増殖性障害（MDS）（慢性骨髄性白血病（CML）を含む）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の抗体によって治療しえる他の癌には、中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、上衣細胞腫及び網膜芽細胞腫；頭部及び首の固形腫瘍（例えば鼻咽頭癌、唾液腺癌および食道癌）、肺の腫瘍（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、消化系の腫瘍（例えば胃癌（胃腸の癌を含む）、胆管または胆道の癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌および肛門癌）、生殖系の腫瘍（例えば精巣、陰茎若しくは前立腺の癌、子宮、膣、外陰、子宮頸、卵巣及び内膜の癌）、皮膚の腫瘍（例えばメラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線性角化症）、肝臓の腫瘍（例えば肝癌、肝性癌、肝細胞癌及びヘパトーマ）、骨の腫瘍（例えば破骨細胞腫および骨破壊性骨癌）、さらに別の組織及び器官の腫瘍（例えば膵臓癌、膀胱癌、腎臓の癌、甲状腺癌、乳癌、腹膜の癌およびカポジ肉腫）、および血管系の腫瘍（例えば血管肉腫および血管周囲細胞腫）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。 As used herein, “cancer” and “cancerous” refer to, or are described above, the physiological conditions in mammals that are typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma (including liposarcoma), neuroendocrine tumors, mesothelioma, neurofibroma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma, and leukemia or lymphoid malignancies Is included, but is not limited to these.
More specific examples of such cancers include hematological malignancies such as non-Hodgkin lymphoma (NHL). NHL cancers include Burkitt lymphoma (BL), small lymphocytic / chronic lymphocytic leukemia (SLL / CLL), mantle cell lymphoma (MCL), follicular lymphoma (FL), diffuse large B-cell lymphoma ( DLCL), marginal zone lymphoma (MZL), hairy cell leukemia (HCL) and lymphoplasmic leukemia (LPL), mucosal connective lymphoid tissue (MALT) nodal marginal zone B cell lymphoma, Mediastinal large cell lymphoma, intravascular large cell lymphoma, primary effusion lymphoma, progenitor B cell lymphoblastic leukemia / lymphoma, progenitor T cell and NK cell lymphoma (precursor T cell lymphoblastic lymphoma, NK blast lymphoma) ), Mature T and NK cell tumors (including peripheral T cell lymphoma and leukemia (PTL)), adult T cell leukemia / T cell lymphoma and large granular lymphocytic leukemia, T cell chronic lymphocytic leukemia / prolymph Leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, aggressive NK cell leukemia, extranodal T- / NK cell lymphoma, enteropathic T-cell lymphoma, hepatosplenic T-cell lymphoma, unstructured large cell lymphoma (ALCL) ), Angiocentric and vascular immunoblastic T-cell lymphoma, mycosis fungoides / Sezary syndrome, and cutaneous T-cell lymphoma (CTCL), but are not limited to these. Other cancers that can be treated with the antibodies of the invention include Hodgkin lymphoma, lymphocyte progenitor tumors (B-cell acute lymphoblastic leukemia / lymphoma (B-ALL) and T-cell acute lymphoblastic leukemia / lymphoma) (Including T-ALL), thymoma, Langerhans cell histiocytosis, multiple myeloma (MM), myeloid neoplasia such as acute myeloid leukemia (AML) (AML with maturation, AML with no differentiation) ), Acute promyelocytic leukemia, acute myelomonocytic leukemia, and acute monocytic leukemia, myelodysplastic syndrome, and chronic myeloproliferative disorder (MDS) (including chronic myelogenous leukemia (CML)) Including, but not limited to. Other cancers that can be treated by the antibodies of the present invention include tumors of the central nervous system such as glioma, glioblastoma, neuroblastoma, astrocytoma, medulloblastoma, ependymoma and retina Blastoma; solid tumors of the head and neck (eg nasopharyngeal cancer, salivary gland cancer and esophageal cancer), lung tumors (eg small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma), Digestive system tumors (eg gastric cancer (including gastrointestinal cancer), bile duct or biliary tract cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer and anal cancer), reproductive system tumors (eg testicular, penile or prostate cancer, uterus) , Vagina, vulva, cervical, ovarian and intimal cancer), skin tumors (eg melanoma, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, actinic keratosis), liver tumors (eg liver cancer, liver cancer, liver Cell carcinoma and hepatoma), bone tumors (eg osteoclastoma and osteoclast bone cancer), and Tissue and organ tumors such as pancreatic cancer, bladder cancer, kidney cancer, thyroid cancer, breast cancer, peritoneal cancer and Kaposi's sarcoma, and vascular tumors such as angiosarcoma and perivascular cell tumors However, it is not limited to these.

本発明の抗CD40抗体によって治療できる適応症には、全ての非ホジキンリンパ腫（NHL）、特に難治性／抵抗性NHL、慢性リンパ球性白血病（CLL）、B細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（B-ALL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、および多発性ミエローマ（MM）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
自己免疫は、液性及び／又は細胞媒介性免疫メカニズムを含む自己寛容の崩壊から生じる。中枢性及び／又は抹消性寛容における機能不全の結果の中でとりわけ重要なものは、自己反応性B細胞およびT細胞の生存ならびに活性化である。いくつかの自己免疫疾患は、Bおよび／またはTリンパ球の両者の過剰な活性化と定義される。これらの細胞の活性化は、共同作用、抗原嵌合、及び相互作用リンパ球の同時刺激シグナルで要求される。したがって、B細胞および／またはT細胞の抗体媒介枯渇、抑制、抗増殖、および／または遮断は、自己免疫疾患処置の治療的アプローチである。
本明細書の“自己免疫疾患”には以下が含まれる：アロジェニック小島移植拒絶、円形脱毛症、強直性脊髄炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、抗好中球細胞質自己抗体（ANCA）、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性じんま疹、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、カストルマン症候群、セリアックスプルース-皮膚炎（celiac spruce-dermatitis）、慢性疲労性免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷血球凝集素病、クローン病、皮膚筋炎、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、第VIII因子欠乏症、線維筋痛-線維筋症（fibromyalgia-fibromyositis）、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギラン-バレー症候群、グッドパスチャー症候群、対宿主性移植片病（GVHD）、橋本甲状腺炎、血友病A、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA神経障害、IgM多発性神経障害、免疫介在血小板減少症、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、真性糖尿病1型、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎（polychrondritis）、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー病、ライター症候群、慢性関節リウマチ（RA）、サルコイドーシス、皮膚硬化症、シェーグレン症候群、固形臓器移植片拒絶、スティッフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性血栓性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎（例えば疱疹状皮膚炎型血管炎（dermatitis herpetiformis vasculitis））、白斑、およびヴェグナー肉芽腫症。 Indications that can be treated with the anti-CD40 antibodies of the present invention include all non-Hodgkin lymphomas (NHL), particularly refractory / resistant NHL, chronic lymphocytic leukemia (CLL), B-cell acute lymphoblastic leukemia / lymphoma (B-ALL), mantle cell lymphoma (MCL), and multiple myeloma (MM).
Autoimmunity results from the breakdown of self tolerance, including humoral and / or cell-mediated immune mechanisms. Of particular importance among the consequences of dysfunction in central and / or peripheral tolerance is the survival and activation of autoreactive B cells and T cells. Some autoimmune diseases are defined as excessive activation of both B and / or T lymphocytes. Activation of these cells is required by synergism, antigen fitting, and costimulatory signals of interacting lymphocytes. Thus, antibody-mediated depletion, suppression, anti-proliferation, and / or blockade of B cells and / or T cells is a therapeutic approach for autoimmune disease treatment.
“Autoimmune diseases” herein include: allogeneic islet transplant rejection, alopecia areata, ankylosing myelitis, antiphospholipid syndrome, autoimmune Addison disease, antineutrophil cytoplasmic autoantibodies (ANCA) ), Autoimmune diseases of the adrenal gland, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune hepatitis, autoimmune myocarditis, autoimmune neutropenia, autoimmune ovitis and testitis, autoimmune thrombocytopenia , Autoimmune urticaria, Behcet's disease, bullous pemphigoid, cardiomyopathy, castorman syndrome, celiac spruce-dermatitis, chronic fatigue immunodeficiency syndrome, multiple chronic inflammatory demyelination Neuropathy, Churg-Strauss syndrome, scar pemphigoid, CREST syndrome, cold hemagglutinin disease, Crohn's disease, dermatomyositis, discoid lupus, essential mixed cryoglobulinemia, factor VIII deficiency, line Fibromyalgia-fibromyositis, glomerulonephritis, Graves' disease, Guillain-Barre syndrome, Goodpascher syndrome, graft-versus-host disease (GVHD), Hashimoto's thyroiditis, hemophilia A, idiopathic lung Fibrosis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), IgA neuropathy, IgM polyneuropathy, immune-mediated thrombocytopenia, juvenile arthritis, Kawasaki disease, lichen planus, lupus erythematosus, Meniere's disease, mixed type Connective tissue disease, multiple sclerosis, diabetes mellitus type 1, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, pernicious anemia, polyartritis nodosa, polychrondritis, polyadrenal syndrome, rheumatic multiple disease Myalgia, polymyositis and dermatomyositis, primary agammaglobulinemia, primary biliary cirrhosis, psoriasis, psoriatic arthritis, Raynaud's disease, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis (RA), sarcoidosis, dermatosclerosis, Sjog Syndrome, solid organ transplant rejection, stiff man syndrome, systemic lupus erythematosus, Takayas arteritis, temporal arteritis / giant cell arteritis, thrombocytopenic thrombotic purpura, ulcerative colitis, uveitis Vasculitis (eg, dermatitis herpetiformis vasculitis), vitiligo, and Wegner granulomatosis.

本明細書の“炎症性疾患”には、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性敗血症性関節炎、アジュバント関節炎、若年性特発性関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性血管炎、アレルギー、喘息、アテローム硬化症、慢性細菌感染もしくはウイルス感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、冠状動脈疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、急性及び遅延型過敏反応に付随する炎症、腫瘍、抹消神経損傷もしくは脱髄に付随する炎症、組織の外傷（例えば火傷及び虚血）に付随する炎症、脊髄炎による炎症、多臓器損傷症候群、肺線維症、敗血症および敗血症性ショック、スティーブンス-ジョンソン症候群、未確定関節症（arthropy）、及び未確定脊髄関節症が含まれる。
本明細書の“感染性疾患”には病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、原虫及び寄生虫よって引き起こされる疾患が含まれる。感染性疾患は以下を含むウイルスによって引き起こされえる：アデノウイルス、サイトメガロウイルス、デング、エプスタイン-バール、ハンタ、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、単純ヘルペスI型、単純ヘルペスII型、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、インフルエンザ、麻疹、流行性耳下腺炎、パポーバウイルス、ポリオ、呼吸器系合胞体ウイルス（RSV）、リンダーペスト、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹、SARSウイルス、天然痘、ウイルス性脊髄炎など。感染性疾患はまた以下を含む細菌によって引き起こされえる：炭疽菌（Bacillus antracis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア、大腸菌（E. coli）、レジオネラ、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、マイコバクテリウム・リケッチア（Mycobacterium rickttsia）、マイコプラズマ・ネシセリア（Mycoplasma nesisseria）、ペルツシス（Pertussis）、緑濃菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎連鎖球菌（S. pneumonia）、連鎖球菌属（Streptococcus）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ペスト菌（Yersinia pestis）など。感染性疾患はまた例えば以下の真菌によって引き起こされえる：アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）、ブラストマイセス・デルマチチディス（Blastomyces dermatitidis）、鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラツム（Histoplasma capsulatum）、ペニシリウム・マルネフェイ（Penicillium marneffei）など。感染性疾患はまた、原虫及び寄生虫、例えばクラミジア、コクジディオア（kokzidioa）、リーシュマニア、マラリア、リケッチア、トリパノソーマなどによって引き起こされえる。
さらにまた、本発明の抗体は、また別の症状（心臓の症状、例えばうっ血性心不全（CHF）、心筋炎および心筋の他の症状；皮膚の症状、例えばロセシア（rosecea）、ざ瘡、湿疹；骨および歯の症状、例えば骨減少、骨粗しょう症、パジェット病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、歯周病、不使用による骨減少症、骨軟化症、単発性線維性形成異常、骨転移、骨痛管理、液性悪性高カルシウム血症、歯周再形成、脊髄損傷及び骨折；代謝性症状、例えばゴシェ病；内分泌性の症状、例えばクッシング症候群；及び神経学的症状を含むが、ただしこれらに限定されない）の予防又は治療に用いることができる。 “Inflammatory disease” in this specification includes acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute septic arthritis, adjuvant arthritis, juvenile idiopathic arthritis, allergic encephalomyelitis, allergic rhinitis, allergic vasculitis, allergy Accompanying asthma, atherosclerosis, chronic inflammation due to chronic bacterial or viral infection, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), coronary artery disease, encephalitis, inflammatory bowel disease, inflammatory osteolysis, acute and delayed hypersensitivity reactions Inflammation, tumor, inflammation associated with peripheral nerve injury or demyelination, inflammation associated with tissue trauma (eg, burns and ischemia), inflammation due to myelitis, multiple organ injury syndrome, pulmonary fibrosis, sepsis and septic shock , Stevens-Johnson syndrome, arthropy, and ambiguous myeloarthropathy.
As used herein, “infectious disease” includes diseases caused by pathogens such as viruses, bacteria, fungi, protozoa and parasites. Infectious diseases can be caused by viruses including: adenovirus, cytomegalovirus, dengue, Epstein-Barr, hunter, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, herpes simplex I, herpes simplex II, Human immunodeficiency virus (HIV), human papillomavirus (HPV), influenza, measles, mumps, papovavirus, polio, respiratory syncytial virus (RSV), Linder plague, rhinovirus, rotavirus, rubella, SARS virus, smallpox, viral myelitis, etc. Infectious diseases can also be caused by bacteria including: Bacillus antracis, Borrelia burgdorferi, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum ( Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Diphtheria, E. coli, Legionella, Helicobacter pylori, Mycobacterium rickttsia, Mycoplasma nesisseria, Pertus ), Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumonia (S. pneumonia), Streptococcus, Staphylococcus, Vibrio cholerae, Yersinia pestis and the like. Infectious diseases can also be caused by, for example, the following fungi: Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Criccidioides immitis -Neoformans (Cryptococcus neoformans), Histoplasma capsulatum, Penicillium marneffei, etc. Infectious diseases can also be caused by protozoa and parasites such as Chlamydia, kokzidioa, leishmania, malaria, rickettsia, trypanosoma and the like.
Furthermore, the antibodies of the present invention may also have other symptoms (cardiac symptoms such as congestive heart failure (CHF), myocarditis and other symptoms of myocardium; skin symptoms such as rosecea, acne, eczema; Bone and dental symptoms such as bone loss, osteoporosis, Paget's disease, Langerhans cell histiocytosis, periodontal disease, osteopenia due to non-use, osteomalacia, single fibrosis, bone metastasis, bone Pain management, humoral malignant hypercalcemia, periodontal remodeling, spinal cord injury and fractures; metabolic symptoms such as Gossy disease; endocrine symptoms such as Cushing's syndrome; and neurological symptoms (It is not limited) and can be used for prevention or treatment.

本発明の抗体と相互作用しえる多数のレセプターが、ヒトの集団において多形性を示す。ある患者または患者集団について、本発明の抗体の有効性は、特定のタンパク質多形性の存在または欠如によって影響されえる。例えば、FcγRIIIAは158位において多形性を示し、この位置は一般的にはV（高親和性）又はF（低親和性）である。V/Vホモ接合遺伝子型をもつ患者は、抗CD20抗体Rituxan(登録商標)（リツキシマブ）による治療により良好な臨床応答を示すことが観察されているが、これは、おそらくこれらの患者はより強いNK応答を示すためであろう（Dall'Ozzo et al (2004) Cancer Res 64:4664-9、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。また別の多形性にはFcγRIIA R131またはH131が含まれ（ただしこれらに限定されない）、そのような多形性は、当該多形性に応じてFc結合及びその後に続く生物学的活性を増加または低下させることが知られている。本発明の抗体は、特定のレセプター多形性型、例えばFcγRIIIA 158Vと結合するか、又はレセプターの特定の位置の多形性の全て（例えばFcγRIIIAの158V及び158Fの両方）と等価の親和性で結合することができる。ある実施態様では、異なる多形性を有する患者で観察される弁別的な有効性を排除するために、本発明の抗体は、抗体内で用いられる可能性がある多形性と等価の結合性を有することができる。そのような特性は、治療応答でより強い一定性を提供し、不応答患者集団を減少させることができる。レセプター多形性に対して同一の結合を示すそのようなFc変種は、生物学的活性、例えばADCC、CDC又は循環半減期を高め、また別には対応するFcレセプターとの結合の調整を介して活性を低下させることができる。ある実施態様では、本発明の抗体は、あるレセプターの多形性の1つとより高いまたは低い親和性で結合し、結合における既存の相違を強調するかまたは当該相違を無効にする。そのような特性は、そのような多形性を有する患者集団に関し有効性について特に調整された治療薬の創出を可能にすることができる。例えば、抑制性レセプター（例えばFcγRIIB）についてより強い親和性を有する多形性を保有する患者集団は、そのような多形性レセプター型との結合が低下した抗体を含む薬剤を投与され、より有効な薬剤が創薬される。 A number of receptors capable of interacting with the antibodies of the invention exhibit polymorphism in the human population. For a patient or patient population, the effectiveness of an antibody of the invention can be affected by the presence or absence of a particular protein polymorphism. For example, FcγRIIIA exhibits polymorphism at position 158, which is generally V (high affinity) or F (low affinity). Patients with V / V homozygous genotypes have been observed to show a better clinical response to treatment with the anti-CD20 antibody Rituxan® (rituximab), which is probably stronger for these patients This would be to indicate a NK response (Dall'Ozzo et al (2004) Cancer Res 64: 4664-9, which is hereby incorporated by reference). Other polymorphisms include (but are not limited to) FcγRIIA R131 or H131, and such polymorphisms increase Fc binding and subsequent biological activity depending on the polymorphism. Or it is known to reduce. The antibodies of the invention bind to a particular receptor polymorphic form, such as FcγRIIIA 158V, or with an affinity equivalent to all of the polymorphisms at a particular position of the receptor (eg, both 158V and 158F of FcγRIIIA). Can be combined. In certain embodiments, in order to eliminate the discriminatory efficacy observed in patients with different polymorphisms, the antibodies of the present invention may have binding properties equivalent to polymorphisms that may be used within the antibodies. Can have. Such characteristics can provide stronger consistency in the treatment response and reduce the non-responsive patient population. Such Fc variants that show identical binding to receptor polymorphisms increase biological activity, such as ADCC, CDC or circulating half-life, and alternatively through modulation of binding to the corresponding Fc receptor. The activity can be reduced. In certain embodiments, an antibody of the invention binds with a higher or lower affinity to one of the polymorphisms of a receptor, highlighting or negating an existing difference in binding. Such characteristics can allow for the creation of therapeutics specifically tailored for efficacy with respect to patient populations having such polymorphisms. For example, a population of patients with a polymorphism that has a stronger affinity for an inhibitory receptor (eg, FcγRIIB) is administered a drug containing an antibody with reduced binding to such polymorphic receptor type and is more effective New drugs are discovered.

ある実施態様では、本発明の抗体の有効性を予測するために、患者は1つ以上の多形性についてスクリーニングされる。この情報を用いて、例えば臨床試験に組み入れたりもしくは排除したりするために患者を選別し、認可後には適切な投薬量及び治療選択に関して医師及び患者に指標を提供することができる。例えば、FcγRIIIA 158Fについてホモ接合またはヘテロ接合の患者では、抗体薬、例えば抗CD20 mAb Rituxan(商標)は最低限の有効性しか示さない（Carton 2002 Blood 99:754-758；Weng 2003 J Clin Oncol 21:3940-3947、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。そのような患者は本発明の抗体に対してはるかに良好な臨床応答を示しえる。ある実施態様では、患者の遺伝子型が従来用いられている1つ以上の抗体治療薬と比較したとき本発明の抗体に対して極めて良好に応答しそうであることを示す場合には、本発明の抗体のための臨床試験に彼らを含めるように選別される。別の実施態様では、適切な投薬量及び治療方針がそのような遺伝子型情報を用いて決定される。別の実施態様では、患者は、彼らの多形性遺伝子型を基にして、臨床試験への組み入れ又は認可後の治療の受け入れのために選別される。この場合、そうした治療法は、そのような集団に対して特に有効であるように操作した抗体を含むか、あるいは、そうした治療法は、異なる多形性型に対して弁別的活性を発揮しない抗体を含む。
本発明に含まれるものは、本発明の抗体に対して好ましい臨床応答を示す蓋然性が高い患者、又は従来用いられている1つ以上の抗体治療薬に対して本発明の抗体で治療したときはるかに良好な応答を示す蓋然性が高い患者を特定するための診断試験である。当分野で公知のヒトのFcγR多形性を決定するための多数の方法のいずれも用いることができる。
さらにまた、本発明は、臨床サンプル、例えば血液及び組織サンプルで実施される予後試験を含む。そのような試験は、エフェクター機能活性（ADCC、CDC、食作用およびオプソニン化を含むが、ただしこれらに限定されない）について、または癌細胞もしくは他の病原性細胞の殺滅について（そのメカニズムにかかわりなく）アッセイすることができる。ある実施態様では、ADCCアッセイ（例えば以前に記載したようなもの）を用いて、本発明のある抗体の有効性を特定の患者について予測する。そのような情報を用いて、臨床試験に組み入れるための又は排除するための患者を識別するか、または適切な投薬量および治療方針に関する決定を提供することができる。そのような情報はまた、そのようなアッセイで優れた活性を示す具体的な抗体を含む医薬の選択に用いることができる。 In certain embodiments, patients are screened for one or more polymorphisms to predict the effectiveness of the antibodies of the invention. This information can be used, for example, to screen patients for inclusion or exclusion in clinical trials and to provide physicians and patients with indications regarding appropriate dosages and treatment choices after approval. For example, in patients homozygous or heterozygous for FcγRIIIA 158F, antibody drugs such as anti-CD20 mAb Rituxan ™ show minimal efficacy (Carton 2002 Blood 99: 754-758; Weng 2003 J Clin Oncol 21 : 3940-3947, each of which is incorporated herein by reference). Such patients can show a much better clinical response to the antibodies of the invention. In certain embodiments, if the patient's genotype indicates that it is likely to respond very well to the antibodies of the invention when compared to one or more conventionally used antibody therapeutics, Screened to include them in clinical trials for antibodies. In another embodiment, the appropriate dosage and treatment strategy is determined using such genotype information. In another embodiment, patients are screened for inclusion in clinical trials or acceptance of treatment after approval based on their polymorphic genotype. In this case, such therapies include antibodies that have been engineered to be particularly effective against such populations, or such therapies do not exert differential activity against different polymorphic forms. including.
Included in the present invention is a patient with a high probability of exhibiting a favorable clinical response to the antibody of the present invention, or much more when treated with the antibody of the present invention against one or more conventionally used antibody therapeutics. It is a diagnostic test for identifying patients with a high probability of showing a good response. Any of a number of methods for determining human FcγR polymorphisms known in the art can be used.
Furthermore, the present invention includes prognostic tests performed on clinical samples such as blood and tissue samples. Such tests are for effector functional activity (including but not limited to ADCC, CDC, phagocytosis and opsonization) or for killing cancer cells or other pathogenic cells, regardless of the mechanism. ) Can be assayed. In certain embodiments, an ADCC assay (eg, as previously described) is used to predict the effectiveness of an antibody of the invention for a particular patient. Such information can be used to identify patients for inclusion or exclusion in clinical trials or to provide decisions regarding appropriate dosages and treatment strategies. Such information can also be used in the selection of medicaments containing specific antibodies that exhibit superior activity in such assays.

処方
本発明の抗体及び1つ以上の治療的に活性な薬剤が処方されている医薬組成物が意図される。本発明の抗体の処方物は、所望の純度を有する前記抗体を医薬的に許容できる任意の担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で保存のために調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, A. Osol Ed., 1980、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。許容可能な担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる投薬量および濃度で受容者に無毒であり、緩衝剤（例えばリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメチオニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えばメチルもしくはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤（例えばEDTA）；糖（例えばシュクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；甘味料および他の香料：充填剤（例えば微晶質セルロース、ラクトース、トウモロコシおよび他のデンプン）；結合剤；添加剤；着色剤；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；金属複合体（例えばZn-タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えばTWEEN^TM、PLURONICS^TMまたはポリエチレングリコール（PEG））を含む。ある実施態様では、本発明の抗体を含む医薬組成物は水溶性の形態であってもよく、例えば医薬的に許容される塩として提供される（前記は酸および塩基付加塩の両方を含むことを意味する）。“医薬的に許容できる酸付加塩”とは、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、さらに、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）及び有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸など）で形成される生物学的にも他の意味においても望ましい塩が該当する。“医薬的に許容できる塩基付加塩”には、無機塩基から誘導される塩、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などが含まれる。特に有用なものは、アンモニウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩である。医薬的に許容できる有機の無毒な塩基から誘導される塩には、第一、第二及び第三アミン、置換されたアミン（天然に存在する置換アミンを含む）、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミン）が含まれる。in vivo投与に用いられる処方物は無菌的であるべきである。前記は無菌的なろ過膜によるろ過又は他の方法によって容易に達成することができる。 Formulation A pharmaceutical composition is contemplated wherein an antibody of the invention and one or more therapeutically active agents are formulated. The antibody formulation of the present invention can be stored in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution by mixing the antibody having the desired purity with any pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer. (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, A. Osol Ed., 1980, which is incorporated herein by reference). Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used, buffers (eg phosphates, citrates, acetates and other organic acids); Oxidizing agents (including ascorbic acid and methionine); preservatives (eg octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethionium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl or benzyl alcohol, alkyl parabens (eg methyl or propylparaben) Catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; protein (eg serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymer (eg polyvinylpyrrolidone) Amino acids (eg glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose or dextrin); chelating agents (eg EDTA); sugars (eg sucrose, mannitol, Trehalose or sorbitol); sweeteners and other flavors: fillers (eg microcrystalline cellulose, lactose, corn and other starches); binders; additives; colorants; salt-forming counterions (eg sodium); Body (eg, Zn-protein complex); and / or non-ionic surfactant (eg, TWEEN ^™ , PLURONICS ^™ or polyethylene glycol (PEG)). In certain embodiments, a pharmaceutical composition comprising an antibody of the invention may be in a water-soluble form, for example provided as a pharmaceutically acceptable salt (which includes both acid and base addition salts). Means). “Pharmaceutically acceptable acid addition salts” retain the biological effectiveness of the free base, and also include inorganic acids (eg, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, etc.) and organic acids ( For example, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, oxalic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p -Toluenesulfonic acid, salicylic acid, etc.) which are biologically and in other ways desirable salts. “Pharmaceutically acceptable base addition salts” include salts derived from inorganic bases, such as sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum salts and the like. Particularly useful are the ammonium, sodium, calcium and magnesium salts. Salts derived from pharmaceutically acceptable organic non-toxic bases include primary, secondary and tertiary amines, substituted amines (including naturally occurring substituted amines), cyclic amines and basic ions. Exchange resins such as isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine and ethanolamine are included. Formulations used for in vivo administration should be sterile. This can be easily accomplished by filtration through sterile filtration membranes or other methods.

本明細書で開示される抗体はまたイムノリポソームとして処方することができる。リポソームは、治療薬剤の哺乳動物へのデリバリーに有用な、種々のタイプの脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む小胞である。抗体を含むリポソームは、当分野で公知であり、例えば以下に記載されている方法によって調製される：Epstein et al. 1985, Proc Natl Acad Sci USA 82:3688；Hwang et al. 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77:4030；US 4,485,045；US 4,544,545；およびPCT WO 97/38731（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。循環時間が延長されたリポソームはUS 5,013,556（前記文献は参照により本明細書に含まれる）で開示されている。リポソームの成分は、一般的には、生物学的な膜の脂質配置と類似する二重層構造内に配置される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは所定のポアサイズを有するフィルターから押出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。化学療法剤または他の治療的に活性を有する薬剤が、場合によってリポソーム内に収納される（Gabizon et al. 1989, J National Cancer Inst 81:1484、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
抗体及び他の治療的に活性な薬剤はまた、コアサヴェーション技術、界面重合（例えばヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン-マイクロカプセル、またはポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルを用いる）、コロイド薬剤デリバリー系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、およびマクロエマルジョンを含む（ただしこれらに限定されない）方法によって調製されたマイクロカプセル中に取り込むこともできる。そのような技術は以下に記載されている（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, A. Osol Ed., 1980、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、固体の疎水性ポリマーの半透マトリックスが含まれる（前記マトリックスは成形された物品（例えばフィルム又はマイクロカプセル）の形状を有する）。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）、またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（US 3,773,919、前記文献は参照により本明細書に含まれる）、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(商標)（前記は乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドを含む注射可能なマイクロスフェアである）、ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸、及びProLease(登録商標)（Alkermesから市販されている）（前記はポリ-DL-ラクチド-コグリコリド（PLG）のマトリックス中に取り込まれた所望の生物活性分子を含むマイクロスフェア使用デリバリー系である）が含まれる。 The antibodies disclosed herein can also be formulated as immunoliposomes. Liposomes are vesicles containing various types of lipids, phospholipids and / or surfactants that are useful for delivery of therapeutic agents to mammals. Liposomes containing antibodies are known in the art and are prepared, for example, by the methods described below: Epstein et al. 1985, Proc Natl Acad Sci USA 82: 3688; Hwang et al. 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77: 4030; US 4,485,045; US 4,544,545; and PCT WO 97/38731, each of which is hereby incorporated by reference. Liposomes with extended circulation time are disclosed in US 5,013,556, which is hereby incorporated by reference. The components of the liposome are generally arranged in a bilayer structure similar to the lipid arrangement of biological membranes. Particularly useful liposomes can be generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposomes are extruded from a filter having a predetermined pore size to obtain liposomes having a desired diameter. Chemotherapeutic agents or other therapeutically active agents are optionally encapsulated in liposomes (Gabizon et al. 1989, J National Cancer Inst 81: 1484, which is incorporated herein by reference). .
Antibodies and other therapeutically active agents may also include core-savory techniques, interfacial polymerization (eg, using hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules, or poly- (methyl methacrylate) microcapsules), colloidal drug delivery systems (eg, liposomes). , Albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules), and microcapsules prepared by methods including but not limited to macroemulsions. Such techniques are described below (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, A. Osol Ed., 1980, which is hereby incorporated by reference). Sustained release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained release preparations include a semi-permeable matrix of a solid hydrophobic polymer (the matrix having the shape of a molded article (eg film or microcapsule)). Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate), or poly (vinyl alcohol)), polylactide (US 3,773,919, which is incorporated herein by reference), L-glutamic acid and gamma ethyl-L-glutamate copolymer, non-degradable ethylene vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymer, such as Lupron Depot ™ (previously injectable microparticles containing lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) Spheres), poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid, and ProLease® (commercially available from Alkermes) (previously incorporated into a matrix of poly-DL-lactide-coglycolide (PLG)) A microsphere-based delivery system containing the desired biologically active molecule).

投与
本発明の抗体を含む医薬組成物（例えば無菌的水溶液）の投与は多様な方法で実施することができ、前記方法には、経口、皮下、静脈内、鼻内、耳内、経皮、局所的（例えばゲル、軟膏、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、非経口的、直腸、又は眼窩内投与が含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの事例では、例えば創傷、炎症などの治療のためには、抗体は溶液またはスプレーとして直接適用される。当分野で公知のように、医薬組成物はしたがって導入態様に応じて処方されえる。
皮下投与は、患者が前記医薬組成物を自己投与することができるので、いくつかの環境では所望しえる。多くのタンパク質治療薬は、皮下投与のために許容されえる最大体積で治療的に有効な用量の処方物を含むことを可能にするほど十分に強力ではない。この問題は、アルギニン-HCl、ヒスチジンおよびポリソルベートを含むタンパク質処方物を使用することによって部分的に解決することができる（WO 04091658を参照されたい、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。本発明の抗体は、性能の増加、血清半減期の改善又は可溶性の増強のために、皮下投与により適している。
当分野で公知のように、タンパク質治療薬はしばしば静脈内輸液又はボーラスによりデリバーされる。本発明の抗体もまたそのような方法でデリバーすることができる。例えば、投与は、輸液ビヒクルとして0.9％の塩化ナトリウムとともに静脈内輸液により実施できる。
肺デリバリーは、吸入器またはネブライザーおよびエーロゾル化剤を含む処方物を用いて実施することができる。例えば、Aradigmから市販されているAERx(登録商標)吸入可能技術、またはNektar Therapeuticsから市販されているInhance^TM肺デリバリー系を用いることができる。本発明の抗体は肺内デリバリーにいっそう馴染みやすい。FcRnは肺に存在し、肺から血流への輸送を促進できる（例えば以下を参照されたい：WO 04004798；Bitonti et al. 2004, Proc Natl Acad Sci 101:9763-8、前記文献はともに参照により本明細書に含まれる）。したがって、肺内でより効率的にFcRnと結合する抗体、又は血流中でより効率的に遊離される抗体は、肺内投与後に生体利用性が改善されえる。本発明の抗体はまた、例えば可溶性の改善または等電点の改変のために、肺内投与にいっそう馴染みやすい。
さらにまた、本発明の抗体は、例えば胃のpHにおける安定性の改善およびタンパク分解に対する耐性の向上のために、経口投与にいっそう適合しやすい。さらにまた、FcRnは成人の腸の上皮で発現されているようであり（Dickinson et al. 1999, J Clin Invest 104:903-11、前記文献は参照により本明細書に含まれる）、したがって、FcRn相互作用プロフィールが改善された本発明の抗体は、経口投与後の生体利用性の増強が示すことができる。抗体の橋渡しによるFcRnの輸送もまた他の粘膜（例えば胃腸、呼吸器及び生殖管の粘膜）で生じえる（Yoshida et al. 2004, Immunity 20:769-83、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
さらにまた、当分野で多数のデリバリー系が公知であり、本発明の抗体の投与に用いることができる。前記の例には、リポソーム内被包化、ミクロ粒子、ミクロスフェアー（例えばPLA/PGAミクロスフェアー）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。また別には、多孔質性、無孔性、またはゼラチン様物質（膜又は線維を含む）の移植を利用してもよい。徐放系は、ポリマー物質またはマトリックス、例えばポリエステル、ヒドロゲル、ポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド、L-グルタミン酸とエチル-L-グルタメートのコポリマー、エチレンビニルアセテート、乳酸-グリコール酸コポリマー（例えばLupron Depot(商標)）、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含むことができる。本発明の抗体をコードする核酸を、例えばレトロウイルス感染、直接注射、または脂質、細胞表面レセプターもしくは他のトランスフェクション剤による被覆によって投与することもまた可能である。全ての事例で、所望の作用場所で又はその近くで抗体を放出するために、制御放出系を用いることができる。 Administration Administration of a pharmaceutical composition (eg, a sterile aqueous solution) comprising an antibody of the present invention can be carried out in a variety of ways, including oral, subcutaneous, intravenous, intranasal, otic, transdermal, This includes, but is not limited to, topical (eg, gel, ointment, lotion, cream, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonary, intravaginal, parenteral, rectal, or intraorbital administration. In some cases, for example for the treatment of wounds, inflammation, etc., the antibody is applied directly as a solution or spray. As is known in the art, pharmaceutical compositions can therefore be formulated depending on the mode of introduction.
Subcutaneous administration may be desirable in some circumstances because the patient can self-administer the pharmaceutical composition. Many protein therapeutics are not powerful enough to allow for the inclusion of therapeutically effective dose formulations at the maximum volume acceptable for subcutaneous administration. This problem can be partially solved by using protein formulations comprising arginine-HCl, histidine and polysorbate (see WO 04091658, which is hereby incorporated by reference). The antibodies of the present invention are more suitable for subcutaneous administration for increased performance, improved serum half-life or enhanced solubility.
As is known in the art, protein therapeutics are often delivered by intravenous fluids or boluses. The antibodies of the present invention can also be delivered by such methods. For example, administration can be performed by intravenous infusion with 0.9% sodium chloride as an infusion vehicle.
Pulmonary delivery can be performed using a formulation comprising an inhaler or nebulizer and an aerosolizing agent. For example, AERx® inhalable technology commercially available from Aradigm, or Inhance ^™ pulmonary delivery system commercially available from Nektar Therapeutics can be used. The antibodies of the present invention are more amenable to intrapulmonary delivery. FcRn is present in the lung and can facilitate transport from the lung to the bloodstream (see, eg, WO 04004798; Bitonti et al. 2004, Proc Natl Acad Sci 101: 9763-8, both of which are incorporated by reference) Included herein). Thus, antibodies that bind FcRn more efficiently in the lung or that are more efficiently released in the bloodstream can improve bioavailability after intrapulmonary administration. The antibodies of the invention are also more amenable to intrapulmonary administration, eg, to improve solubility or alter isoelectric point.
Furthermore, the antibodies of the present invention are more amenable to oral administration, eg, for improved stability at gastric pH and increased resistance to proteolysis. Furthermore, FcRn appears to be expressed in the intestinal epithelium of adults (Dickinson et al. 1999, J Clin Invest 104: 903-11, which is incorporated herein by reference), and thus FcRn Antibodies of the invention with improved interaction profiles can show enhanced bioavailability after oral administration. Transport of FcRn via antibody bridging can also occur in other mucosa (eg, gastrointestinal, respiratory and genital mucosa) (Yoshida et al. 2004, Immunity 20: 769-83, which is hereby incorporated by reference). included).
Furthermore, many delivery systems are known in the art and can be used to administer the antibodies of the invention. Examples of such include, but are not limited to, encapsulation in liposomes, microparticles, microspheres (eg PLA / PGA microspheres) and the like. Alternatively, transplantation of porous, nonporous, or gelatinous materials (including membranes or fibers) may be utilized. Sustained release systems include polymeric substances or matrices such as polyesters, hydrogels, poly (vinyl alcohol), polylactide, copolymers of L-glutamic acid and ethyl-L-glutamate, ethylene vinyl acetate, lactic acid-glycolic acid copolymers (eg Lupron Depot ™ )), And poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid. It is also possible to administer nucleic acids encoding the antibodies of the invention, for example by retroviral infection, direct injection, or coating with lipids, cell surface receptors or other transfection agents. In all cases, a controlled release system can be used to release the antibody at or near the desired site of action.

投薬
投与用量及び投与頻度は、ある実施態様では、治療的または予防的に有効であるように選択される。当分野で公知のように、タンパク質分解、全身対局所デリバリー、および新規なプロテアーゼ合成に対する調整とともに、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤相互作用、および症状の重篤度の調整が必要であり、日常的な実験を用いて当業者は確認できよう。
治療的に活性な抗体の処方物中の濃度は約0.1から100重量％で変動しえる。ある実施態様では、抗体の濃度は0.003μMから1.0Mの範囲である。患者を処置するためには、本発明の抗体の治療的に有効な用量を投与することができる。本明細書の“治療的に有効な用量”とは、投与が目的とする効果を生じる用量を意味する。正確な用量は処置の目的に左右され、公知の技術を用いて当業者は確認できよう。投薬量の範囲は0.0001から100mg/kg体重またはそれ以上であり、例えば0.1、1、10、または50mg/kg体重でありえるが、例えば1から10mg/kgである。
いくつかの実施態様では、1回分用量の抗体が用いられる。他の実施態様では、数倍分用量の抗体が投与される。投与と投与の間の経過時間は1時間未満、約1時間、約1−2時間、約2−3時間、約3−4時間、約6時間、約12時間、約24時間、約48時間、約2−4日間、約4−6日間、約1週間、約2週間、または2週間を超える。
他の実施態様では、本発明の抗体は、規則的な投与方式で、持続的輸液又は長い休止期のない頻繁な投与によって投与される。そのようなメトロノミックな投与は、休止期のない一定の間隔での投与を含むことができる。典型的には、そのような方式は、長期的な低用量投与、または長期間の、例えば1−2日間、1−2週間、1−2ヶ月間もしくは6ヶ月またはそれ以上の持続的輸液を含む。より低い用量を使用することによって副作用および休止期の必要性が最小限になる。
ある種の実施態様では、本発明の抗体および1つ以上の他の予防用又は治療用薬剤は周期的に患者に投与される。周期的療法は、第一の薬剤をある時点で、第二の薬剤を第二の時点で投与、場合によって追加の薬剤を追加の時点で投与、場合によって休止期、続いてこの一連の投与の1回以上の繰り返しを含む。繰り返しの回数は典型的には2−10回である。周期的療法は1つ以上の薬剤に対する耐性の発達を低下させ、副作用を最小限にし、または治療有効性を改善することができる。 Dosage dosage and frequency of administration are, in some embodiments, selected to be therapeutically or prophylactically effective. As known in the art, age, weight, general health, sex, diet, administration time, drug interaction, and severity of symptoms, along with adjustments for proteolysis, systemic versus local delivery, and novel protease synthesis The degree of adjustment is necessary and can be confirmed by one skilled in the art using routine experimentation.
The concentration of therapeutically active antibody in the formulation can vary from about 0.1 to 100% by weight. In certain embodiments, the concentration of antibody ranges from 0.003 μM to 1.0M. In order to treat a patient, a therapeutically effective dose of an antibody of the invention can be administered. As used herein, “therapeutically effective dose” means a dose at which administration produces the intended effect. The exact dose will depend on the purpose of the treatment, and will be ascertainable by one skilled in the art using known techniques. The dosage range is 0.0001 to 100 mg / kg body weight or more, for example 0.1, 1, 10, or 50 mg / kg body weight, for example 1 to 10 mg / kg.
In some embodiments, a single dose of antibody is used. In other embodiments, several doses of antibody are administered. Elapsed time between administrations is less than 1 hour, about 1 hour, about 1-2 hours, about 2-3 hours, about 3-4 hours, about 6 hours, about 12 hours, about 24 hours, about 48 hours , About 2-4 days, about 4-6 days, about 1 week, about 2 weeks, or over 2 weeks.
In other embodiments, the antibodies of the invention are administered in a regular mode of administration by continuous infusion or frequent administration without long rest periods. Such metronomic administration can include regular intervals without a resting phase. Typically, such regimes involve long-term, low-dose administration, or long-term continuous infusions such as 1-2 days, 1-2 weeks, 1-2 months or 6 months or longer. Including. Using lower doses minimizes side effects and the need for resting.
In certain embodiments, the antibodies of the invention and one or more other prophylactic or therapeutic agents are periodically administered to a patient. Cyclic therapy involves the administration of a first drug at one point, a second drug at a second time point, optionally an additional drug at an additional time point, optionally at rest, followed by this series of doses. Including one or more repetitions. The number of repetitions is typically 2-10 times. Periodic therapy can reduce the development of resistance to one or more drugs, minimize side effects, or improve therapeutic efficacy.

併用療法
本発明の抗体は、1つ以上の他の治療方針又は治療薬と同時に与えることができる。前記追加の治療方針又は治療薬は、抗体の有効性又は安全性の改善のために用いることができる。さらにまた、追加の治療方針又は治療薬は、本抗体の作用を変化させるのではなく、むしろ当該疾患又は共存症の治療のために用いることができる。例えば、本発明の抗体は、化学療法、放射線療法又は化学療法と放射線療法の両方法と合わせて投与することができる。本発明の抗体は、1つ以上の他の予防薬又は治療薬と併用して投与することができる。前記併用される薬剤には、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管形成剤、心臓保護薬、免疫刺激剤、免疫抑制剤、血液学的細胞の増殖を促進する薬剤、血管形成阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）阻害剤、また別の抗体、FcγRIIb若しくは他のFcレセプター阻害剤、又は他の治療薬が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
“〜と併用して”及び“同時投与”は、前記予防薬又は治療薬の投与が厳密に同じときに投与される場合に限定されない。そうではなくて、本発明の抗体及び他の薬剤が一緒に作用して、本発明の抗体のみ又は他の薬剤のみによる治療に比して利益の増加を提供することができるように、それらが一続きでおよびある時間間隔内に投与されることを意味する。ある実施態様では、抗体と他の薬剤は累積的に作用し、例えばそれらは相乗的に作用する。そのような分子は、意図した目的のために有効である量で一緒に適切に存在する。技量を有する医療従事者は、経験的にまたは当該薬剤の薬物動態学および作用態様を考慮することによって、各治療薬の適切な用量を適切な投与タイミング及び投与方法とともに決定することができる。
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体又はFcを含む1つ以上の追加の分子とともに投与される。本発明の抗体は、同じ疾患又は別の共存症の治療に有効性を示す1つ以上の他の抗体と同時投与することができる。例えば、あるタイプの癌で過剰発現される2つの抗原、又は自己免疫若しくは感染症の発症に介在する2つの抗原を認識する2つの抗体を投与することができる。 Combination Therapy The antibodies of the present invention can be given contemporaneously with one or more other therapeutic strategies or agents. The additional therapeutic strategy or therapeutic agent can be used to improve antibody efficacy or safety. Furthermore, additional therapeutic strategies or drugs can be used for the treatment of the disease or comorbidity rather than altering the action of the antibody. For example, the antibodies of the invention can be administered in combination with chemotherapy, radiation therapy, or both chemotherapy and radiation therapy methods. The antibodies of the invention can be administered in combination with one or more other prophylactic or therapeutic agents. The drugs used in combination include cytotoxic drugs, chemotherapeutic agents, cytokines, growth inhibitors, antihormonal agents, kinase inhibitors, antiangiogenic agents, cardioprotective agents, immunostimulatory agents, immunosuppressive agents, hematology Agents that promote the growth of healthy cells, angiogenesis inhibitors, protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors, and other antibodies, FcγRIIb or other Fc receptor inhibitors, or other therapeutic agents It is not limited.
“In combination with” and “simultaneous administration” are not limited to when the prophylactic or therapeutic agents are administered at exactly the same time. Rather, they can work together to provide an increased benefit compared to treatment with the antibody of the invention alone or with other agents alone. It is meant to be administered in series and within a certain time interval. In certain embodiments, the antibody and the other agent act cumulatively, eg, they act synergistically. Such molecules are suitably present together in amounts that are effective for the purpose intended. Skilled medical personnel can determine the appropriate dose of each therapeutic agent along with the appropriate timing and method of administration, either empirically or by considering the pharmacokinetics and mode of action of the drug.
In certain embodiments, the antibodies of the invention are administered with one or more additional molecules comprising antibodies or Fc. The antibodies of the invention can be co-administered with one or more other antibodies that are effective in treating the same disease or another comorbidity. For example, two antibodies that recognize two antigens that are overexpressed in one type of cancer or two antigens that mediate the development of autoimmunity or infection can be administered.

同時投与することができる抗癌抗体の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：抗17-1A細胞表面抗原抗体、例えばPanorex^TM（エドレコロマブ）；抗-4-1BB抗体；抗-4Dc抗体；抗-A33抗体、例えばA33およびCDP-833；抗-α4β1インテグリン抗体、例えばナタリズマブ；抗-α4β7インテグリン抗体、例えばLDP-02；抗-αVβ1インテグリン抗体、例えばF-200、M-200およびSJ-749；抗-αVβ3インテグリン抗体、例えばアブシクシマブ、CNTO-95、Mab-17E6およびVitaxin^TM；抗補体因子5(C5)抗体、例えば5G1.1；抗-CA125抗体、例えばOvaRex(商標)（オレゴヴォマブ）；抗-CD3抗体、例えばNuvion(商標)（ヴィシリズマブ）およびレキソマブ；抗-CD4抗体、例えばIDEC-151、MDX-CD4、OKT4A；抗-CD6抗体、例えばオンコリシンBおよびオンコリシンCD6；抗-CD7抗体、例えばHB2；抗-CD19抗体、例えばB43、MT-103、およびオンコリシンB；抗-CD20抗体、例えば2H7、2H7.v16、2H7.v114、2H7.v115、Bexxar(商標)（トシツモマブ、I-131標識抗-CD20）、Rituxan(商標)（リツキシマブ）、およびZevalin(商標)（イブリツモマブチウキセタン（Ibritumab tiuxetan）、Y-90標識抗-CD20）；抗-CD22抗体、例えばLymphocide^TM（エプラツズマブ、Y-90標識抗-CD22）；抗-CD23抗体、例えばIDEC-152；抗-CD25抗体、例えばバシリキシマブおよびZenapax(商標)（ダクリズマブ）；抗-CD30抗体、例えばAC10、MDX-060およびSGN-30；抗-CD33抗体、例えばMylotarg(商標)（ゲムツズマブオゾガミシン）、オンコリシンMおよびスマートM195；抗-CD38抗体；抗-CD40抗体、例えばSGN-40およびトラリズマブ；抗-CD40L抗体、例えば5c8、Antova^TMおよびIDEC-131；抗-CD44抗体、例えばビヴァツズマブ；抗-CD46抗体；抗-CD402抗体、例えばCampath(商標)（アレムツマブ）；抗-CD405抗体、例えばSC-1；抗-CD406抗体、例えばhuN901-DM1；抗-CD64抗体、例えばMDX-33；抗-CD66e抗体、例えばXR-303；抗-CD74抗体、例えばIMMU-110；抗-CD80抗体、例えばガリキシマブおよびIDEC-114；抗-CD89抗体、例えばMDX-214；抗-CD123抗体；抗-CD138抗体、例えばB-B4-DM1；抗-CD146抗体、例えばAA-98；抗-CD148抗体；抗-CEA抗体、例えばcT84.66、ラベツズマブ、およびPentacea^TM；抗-CTLA-4抗体、例えばMDX-101；抗-CXCR4抗体；抗-EGFR抗体、例えばABX-EGF、Erbitux(商標)（セツキシマブ）、IMC-C225およびMerck Mab 425；抗-EpCAM抗体、例えばクルセル（Crucell）の抗-EpCAM、ING-1およびIS-IL-2；抗-エフリンB2/EphB4抗体；抗-Her2抗体、例えばHerceptin(商標)、MdX-210；抗-FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）抗体、例えばシブロツズマブ；抗フェリチン抗体、例えばNXT-211；抗-FGF-1抗体；抗-FGF-3抗体；抗-FGF-8抗体；抗-FGFR抗体、抗-フィブリン抗体；抗-G250抗体、例えばWX-G250およびRencarex(商標)；抗-GD2ガングリオシド抗体、例えばEMD-273063およびTriGem；抗-GD3ガングリオシド抗体、例えばBEC2、KW-2871およびミツモマブ；抗-gpIIb/IIIa抗体、例えばReoPro；抗-ヘパリナーゼ抗体；抗-Her2/ErbB2抗体、例えばHerceptin(商標)（トラスツズマブ）、MDX-210およびペルツズマブ；抗-HLA抗体、例えばオンコリム(商標)、スマート1D10；抗-HM1.24抗体；抗-ICAM抗体、例えばICM3；抗-IgAレセプター抗体；抗-IGF-1抗体、例えばCP-751871およびEM-164；抗IGF-1R抗体、例えばIMC-A12；抗-IL-6抗体、例えばCNTO-328およびエルシリモマブ；抗-IL-15抗体、例えばHuMax^TM-IL15；抗-KDR抗体；抗-ラミニン5抗体；抗-ルイスY抗原抗体、例えばHu3S193およびIGN-311；抗-MCAM抗体；抗Muc1抗体、例えばBravaRexおよびTriAb；抗NCAM抗体、例えばERIC-1およびICRT；抗-PEM抗原抗体、例えばTheragynおよびTherex；抗-PSA抗体；抗-PSCA抗体、例えばIG8；抗-Ptk抗体；抗-PTN抗体；抗-RANKL抗体、例えばAMG-162；抗-RLIP76抗体；抗-SK-1抗原抗体、例えばMonopharmC；抗-STEAP抗体；抗-TAG72抗体、例えばCC49-SCAおよびMDX-220；抗-TGF-β抗体、例えばCAT-152；抗-TNF-α抗体、例えばCDP571、CDP870、D2E7、Humira(商標)（アダリムマブ）、およびRemicade(商標)（インフリキシマブ）；抗-TRAIL-R1およびTRAIL-R2抗体；抗-VE-カドヘリン-2-抗体；および抗-VLA-4抗体、例えばAntegren^TM。さらにまた、抗イディオタイプ抗体（GD3エピトープ抗体（BEC2）およびgp72エピトープ抗体（105AD7）を含むが、ただしこれらに限定されない）を用いることができる。さらにまた、二特異性抗体（抗CD3/CD20抗体（Bi20）を含むがただしこれに限定されない）を用いることができる。 Examples of anti-cancer antibodies that can be co-administered include (but are not limited to): anti-17-1A cell surface antigen antibodies such as Panorex ^™ (Edrecolomab); anti-4-1BB antibodies; Anti-A33 antibodies such as A33 and CDP-833; anti-α4β1 integrin antibodies such as natalizumab; anti-α4β7 integrin antibodies such as LDP-02; anti-αVβ1 integrin antibodies such as F-200, M-200 and SJ-749; anti-αVβ3 integrin antibodies such as abciximab, CNTO-95, Mab-17E6 and Vitaxin ^™ ; anti-complement factor 5 (C5) antibodies such as 5G1.1; anti-CA125 antibodies such as OvaRex ™ ( Anti-CD3 antibodies such as Nuvion ™ (viscilizumab) and lexomab; anti-CD4 antibodies such as IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A; anti-CD6 antibodies such as oncolicin B and oncolicin CD6; anti-CD7 Antibodies, eg HB2; anti-CD19 antibodies, eg B43, MT-103, and oncolicin B; anti-CD20 antibodies such as 2H7, 2H7.v16, 2H7.v114, 2H7.v115, Bexxar ™ (tositumomab, I-131 labeled anti-CD20), Rituxan ™ ) (Rituximab), and Zevalin ™ (Ibritumab tiuxetan, Y-90 labeled anti-CD20); anti-CD22 antibodies, such as Lymphocide ^™ (epratuzumab, Y-90 labeled anti-CD22); Anti-CD23 antibodies such as IDEC-152; anti-CD25 antibodies such as basiliximab and Zenapax ™ (daclizumab); anti-CD30 antibodies such as AC10, MDX-060 and SGN-30; anti-CD33 antibodies such as Mylotarg ( Trademark) (gemtuzumab ozogamicin), oncolicin M and smart M195; anti-CD38 antibodies; anti-CD40 antibodies such as SGN-40 and tralizumab; anti-CD40L antibodies such as 5c8, Antova ^™ and IDEC-131; An anti-CD44 antibody, such as bivacuzumab; an anti-CD46 antibody; an anti-CD402 antibody, such as Campath Anti-CD405 antibodies such as SC-1; anti-CD406 antibodies such as huN901-DM1; anti-CD64 antibodies such as MDX-33; anti-CD66e antibodies such as XR-303; anti-CD74 antibodies; For example IMMU-110; anti-CD80 antibodies such as galiximab and IDEC-114; anti-CD89 antibodies such as MDX-214; anti-CD123 antibodies; anti-CD138 antibodies such as B-B4-DM1; anti-CD146 antibodies such as Anti-CD148 antibody; anti-CEA antibodies such as cT84.66, ravetuzumab, and Pentacea ^™ ; anti-CTLA-4 antibody such as MDX-101; anti-CXCR4 antibody; anti-EGFR antibody such as ABX- EGF, Erbitux ™ (cetuximab), IMC-C225 and Merck Mab 425; anti-EpCAM antibodies, eg Crucell anti-EpCAM, ING-1 and IS-IL-2; anti-Ephrin B2 / EphB4 antibodies Anti-Her2 antibodies, eg Herceptin ™, MdX-210; anti-FAP (fibroblast activating protein) antibodies, eg sibrotuzumab; anti-ferritin antibodies, eg NXT-211; anti-FGF-1 anti Anti-FGF-3 antibody; anti-FGF-8 antibody; anti-FGFR antibody, anti-fibrin antibody; anti-G250 antibodies such as WX-G250 and Rencarex ™; anti-GD2 ganglioside antibodies such as EMD- 273063 and TriGem; anti-GD3 ganglioside antibodies, such as BEC2, KW-2871, and mitumomab; anti-gpIIb / IIIa antibodies, such as ReoPro; anti-heparinase antibodies; anti-Her2 / ErbB2 antibodies, such as Herceptin ™ (trastuzumab), MDX-210 and pertuzumab; anti-HLA antibodies such as Oncolim ™, Smart 1D10; anti-HM1.24 antibodies; anti-ICAM antibodies such as ICM3; anti-IgA receptor antibodies; anti-IGF-1 antibodies such as CP -751871 and EM-164; anti-IGF-1R antibodies, such as IMC-A12; anti-IL-6 antibodies, such as CNTO-328 and ersilimomab; anti-IL-15 antibodies, such as HuMax ^™ -IL15; anti-KDR antibodies; Anti-Laminin 5 antibody; anti-Lewis Y antigen antibody such as Hu3S193 and IGN-311; anti-MCAM antibody; anti-Muc1 antibody such as Anti-NCAM antibodies such as ERIC-1 and ICRT; anti-PEM antigen antibodies such as Theragyn and Therex; anti-PSA antibodies; anti-PSCA antibodies such as IG8; anti-Ptk antibodies; anti-PTN antibodies; -RANKL antibodies, eg AMG-162; anti-RLIP76 antibodies; anti-SK-1 antigen antibodies, eg MonophermC; anti-STEAP antibodies; anti-TAG72 antibodies, eg CC49-SCA and MDX-220; anti-TGF-β antibodies Anti-TNF-α antibodies such as CDP571, CDP870, D2E7, Humira ™ (adalimumab), and Remicade ™ (infliximab); anti-TRAIL-R1 and TRAIL-R2 antibodies; VE-cadherin-2-antibody; and anti-VLA-4 antibody, such as Antegren ^™ . Furthermore, anti-idiotypic antibodies (including but not limited to GD3 epitope antibody (BEC2) and gp72 epitope antibody (105AD7)) can be used. Furthermore, bispecific antibodies (including but not limited to anti-CD3 / CD20 antibodies (Bi20)) can be used.

自己免疫又は炎症性疾患、移植片拒絶、GVHDなどを治療するために同時投与することができる抗体の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：抗-α4β7インテグリン抗体（例えばLDP-02）、抗-ベータ2インテグリン抗体（例えばLDP-01）、抗-補体（C5）抗体（例えば5G1.1）、抗-CD2抗体（例えばBTI-322、MEDI-507）、抗-CD3抗体（例えばOKT3、SMART抗-CD3）、抗-CD4抗体（例えばIDEC-151、MDX-CD4、OKT4A）、抗-CD11a抗体、抗-CD14抗体（例えばIC14）、抗-CD18抗体、抗-CD23抗体（例えばIDEC152）、抗-CD25抗体（例えばZenapax）、抗CD40L抗体（例えば5c8、Antova、IDEC-131）、抗-CD64抗体（例えばMDX-33）、抗-CD80抗体（例えばIDEC-114）、抗-CD147抗体（例えばABX-CBL）、抗-E-セレクチン抗体（例えばCDP850）、抗-gpIIb/IIIa抗体（例えばReoPro/Abcixima）、抗-ICAM-3抗体（例えばICM3）、抗-ICE抗体（例えばVX-740）、抗-FcγR1抗体（例えばMDX-33）、抗-IgE抗体（例えばrhuMab-E25）、抗-IL-4抗体（例えばSB-240683）、抗-IL-5抗体（例えばSB-240563、SCH55700）、抗-IL-8抗体（例えばABX-IL8）、抗-インターフェロンガンマ抗体、および抗-TNFa抗体（例えばCDP571、CDP870、D2E7、インフリキシマブ、MAK-195F）、抗-VLA-4抗体（例えばAntegren）。自己免疫又は炎症性疾患、移植片拒絶、GVHDなどを治療するために同時投与することができる他のFc含有分子の例にはp75TNFレセプター/Fc融合物、Enbrel(商標)（エタネルセプト）およびレゲネロン（Regeneron）のIL-1トラップが含まれる（ただしこれらに限定されない）。
感染症を治療するために同時投与することができる抗体の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：抗-炭疽抗体（例えばABthrax）、抗-CMV抗体（例えばCytoGamおよびセヴィルマブ）、抗-クリプトスポリジウム抗体（例えばCryptoGAM、Sporidin-G）、抗-ヘリコバクター抗体（例えばPyloran）、抗-肝炎B抗体（例えばHepeX-B、Nabi-HB）、抗-HIV抗体（例えばHRG-214）、抗-RSV抗体（例えばフェルヴィズマブ、HNK-20、パリヴィズマブ、RespiGam）、および抗-スタフィロコッカス抗体（例えばAurexis、Aurograb、BSYX-A110およびSE-Mab）。 Examples of antibodies that can be co-administered to treat autoimmune or inflammatory diseases, graft rejection, GVHD, etc. include (but are not limited to): anti-α4β7 integrin antibodies (eg, LDP- 02), anti-beta2 integrin antibody (eg LDP-01), anti-complement (C5) antibody (eg 5G1.1), anti-CD2 antibody (eg BTI-322, MEDI-507), anti-CD3 antibody (Eg OKT3, SMART anti-CD3), anti-CD4 antibodies (eg IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A), anti-CD11a antibodies, anti-CD14 antibodies (eg IC14), anti-CD18 antibodies, anti-CD23 antibodies (Eg IDEC152), anti-CD25 antibody (eg Zenapax), anti-CD40L antibody (eg 5c8, Antova, IDEC-131), anti-CD64 antibody (eg MDX-33), anti-CD80 antibody (eg IDEC-114), Anti-CD147 antibody (eg ABX-CBL), anti-E-selectin antibody (eg CDP850), anti-gpIIb / IIIa antibody (eg ReoPro / Abcixima), anti-ICAM-3 antibody (eg ICM3), -ICE antibody (eg VX-740), anti-FcγR1 antibody (eg MDX-33), anti-IgE antibody (eg rhuMab-E25), anti-IL-4 antibody (eg SB-240683), anti-IL-5 Antibodies (eg SB-240563, SCH55700), anti-IL-8 antibodies (eg ABX-IL8), anti-interferon gamma antibodies, and anti-TNFa antibodies (eg CDP571, CDP870, D2E7, infliximab, MAK-195F), anti -VLA-4 antibody (eg Antegren). Examples of other Fc-containing molecules that can be co-administered to treat autoimmune or inflammatory diseases, graft rejection, GVHD, etc. include p75TNF receptor / Fc fusions, Enbrel ™ (etanercept) and regenelone ( Regeneron) IL-1 traps (but not limited to).
Examples of antibodies that can be co-administered to treat an infection include (but are not limited to): anti-anthrax antibodies (eg, ABthrax), anti-CMV antibodies (eg, CytoGam and sevirumab), Anti-cryptospodium antibodies (eg CryptoGAM, Sporidin-G), anti-helicobacter antibodies (eg Pyloran), anti-hepatitis B antibodies (eg HepeX-B, Nabi-HB), anti-HIV antibodies (eg HRG-214), Anti-RSV antibodies (eg Fervisumab, HNK-20, Palivizumab, RespiGam), and anti-staphylococcus antibodies (eg Aurexis, Aurograb, BSYX-A110 and SE-Mab).

また別には、本発明の抗体は、1つ以上のFcレセプターとの結合について競合する1つ以上の分子と同時投与することができる。例えば、抑制性レセプターFcγRIIbの阻害剤を同時投与することによってエフェクター機能を高めることができる。同様に、賦活性レセプター（例えばFcγRIIIa）の阻害剤の同時投与は望ましくないエフェクター機能を最小限にすることができる。Fcレセプター阻害剤には、FcγRIIb、FcγRIIIa又は他のFcレセプターとの結合に対する競合的阻害物質として作用するように操作されたFc分子とともに、他の免疫グロブリン、および特にIVIg（静脈内免疫グロブリン）と称される治療が含まれるが、ただし前記に限定されない。ある実施態様では、抗体を投与する前に阻害物質を投与して作用させる。連続的投与の効果を達成するまた別の方法は、Fcレセプター阻害剤の迅速放出剤形を提供し、続いて本発明の抗体の徐放性処方物を提供するものであろう。迅速放出および制御放出処方物は別々に投与するか、または１つのユニット剤形に合体させることができよう。FcγRIIb阻害剤の投与はまた、望ましくない免疫応答、例えば、血友病患者への第VIII因子の投与に続く抗-第VIII因子抗体応答の制限のために用いることができる。
ある実施態様では、本発明の抗体は化学療法剤とともに投与される。本明細書で用いられる“化学療法剤”とは、癌の治療で有用な化合物を意味する。化学療法剤の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN^TM）；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗-副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；抗-アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリヴォマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クェラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストンおよびトレミフェン（Fareston）を含む；抗代謝薬、例えばメトトレキセートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸アナローグ、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボクォン、メツレドーパおよびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスルアミドおよびトリメチルオロメラミンを含む）；葉酸補充物質、例えばフロリン酸（frolinic acid）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノヴェムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；白金アナローグ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；タンパク質、例えばアルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼ；プリンアナローグ、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナローグ、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、5-FU；タキサン、例えばパクリタキセル（TAXOL(商標)、Bristol-Meyers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）およびドセタキセル（TAXOTER(商標)、Rhone-Polenc Rorer, Antony, France）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000；チミジレートシンターゼ阻害剤（例えばTomudex）；以下を含むまた別の化学療法剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；ドフォファミン；デメコルシン；ジアジクォン；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；エルフォルミチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK(商標)；ラゾキサン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸（tenuazonic acid）；トリアジクォン；2,2',2”-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ヴィンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ara-C”）；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；エトポシド（VP-16）；イフォスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ヴィンクリスチン；ヴィノレルビン；ナヴェルビン；ノヴァントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；CPT-11；レチン酸；エスペラミシン；カペシタビン。上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸または誘導体もまた用いることができる。 Alternatively, the antibodies of the invention can be co-administered with one or more molecules that compete for binding to one or more Fc receptors. For example, effector function can be enhanced by co-administering an inhibitor of the inhibitory receptor FcγRIIb. Similarly, co-administration of inhibitors of stimulatory receptors (eg FcγRIIIa) can minimize undesirable effector functions. Fc receptor inhibitors include Fc molecules engineered to act as competitive inhibitors for binding to FcγRIIb, FcγRIIIa or other Fc receptors, as well as other immunoglobulins, and particularly IVIg (intravenous immunoglobulin) Treatments referred to but are not limited to those described above. In certain embodiments, the inhibitor is administered and allowed to act before the antibody is administered. Another way of achieving the effect of continuous administration would be to provide a rapid release dosage form of the Fc receptor inhibitor followed by a sustained release formulation of the antibody of the invention. The rapid release and controlled release formulations could be administered separately or combined into a single unit dosage form. Administration of FcγRIIb inhibitors can also be used to limit unwanted immune responses, eg, anti-factor VIII antibody responses following administration of factor VIII to hemophilia patients.
In certain embodiments, the antibodies of the invention are administered with a chemotherapeutic agent. As used herein, “chemotherapeutic agent” means a compound useful in the treatment of cancer. Examples of chemotherapeutic agents include (but are not limited to): alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN ^™ ); alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and pipersulfan; androgens, For example, carsterone, drmostanolone propionate, epithiostanol, mepithiostan, test lactone; anti-adrenal drugs such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; anti-androgens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide and goserelin; Antibiotics such as aclacinomycin, actinomycin, ausramycin, azaserine, bleomycin, cactinomycin, calicheamicin, carabicin, caminomycin, cardinophylline, chromo Mycin, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marceromycin, mitomycin, mycophenolic acid, nogaramycin, olivomycin, pepromycin, podophylomycin , Puromycin, queramicin, rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidine, ubenimex, dinostatin, zorubicin; antiestrogens such as tamoxifen, raloxifene, aromatase inhibitor 4 (5) -imidazole, 4-hydroxy tamoxifen, trioxyphene LY117018, including onapristone and toremifene (Fareston); antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5 -FU); folic acid analogs such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; aziridines such as benzodopa, carboquan, metuledopa and ureadopa; ethyleneimine and methylamelamine (altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophor Sulamide and trimethyl olomelamine); folic acid supplements such as frolinic acid; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornafazine, chlorophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechloretamine, mechloretamine oxide Hydrochloride, melphalan, novelmbitine, phenesterine, prednisomine, trophosphamide, uracil mustard; nitro Sourea such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; proteins such as arginine deiminase and asparaginase; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thioamipurine Pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluridine, enositabine, furoxyuridine, 5-FU; taxanes such as paclitaxel (TAXOL ™, Bristol-Meyers Squibb Oncology, Princeton, And docetaxel (TAXOTER ™, Rhone-Polenc Rorer, Antony, France); topoisomerase inhibitor RFS2000; Rate synthase inhibitors (eg Tomudex); other chemotherapeutic agents including: acegraton; aldophosphamide glycosides; aminolevulinic acid; amsacrine; vestlabcil; bisantrene; edatraxate; dofofamine; demecorsin; DMFO); erformitin; ellipticine acetate; etoglucide; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidamine; mitguazone; mitoxantrone; mopidamol; nitracrine; pentostatin; phenameto; pirarubicin; podophyllic acid; 2-ethylhydrazide; PSK ™; Razoxan; Schizofuran; Spirogermanium; Tenuazonic acid; Triadiquone; 2,2 ', 2 "-Trichlorotriethyla;Urethane;Vindesine;Dacarbazine;Mannomustine;Mitobronitol;Mittracitol;Piperobroman;Gasitocin; Arabinoside (“Ara-C”); Cyclophosphamide; Thiotepa; Chlorambucil; Gemcitabine; 6-thioguanine; Mercaptopurine; Methotrexate; -16); Ifosfamide; Mitomycin C; Mitoxantrone; Vincristine; Vinorelbine; Navelbine; Novantrone; Teniposide; Daunomycin; Aminopterin; Xeroda; Ibandronate; CPT-11; Retinic acid; Esperamicin; Any of the above pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives can also be used.

化学療法剤又は他の細胞傷害性薬剤はプロドラッグとして投与することができる。本明細書で用いられる“プロドラッグ”とは、医薬的に活性な物質の前駆体又は誘導型であって、親薬剤と比較して腫瘍細胞にとって細胞傷害性が低く、より活性な親の形態に酵素的に活性化又は変換されるものを意味する。例えば以下を参照されたい：Wilman, “Prpdrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery；およびBorchardt et al. (ed): 247-267, Humana Press, 1985（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。本発明に関して有用でありえるプロドラッグには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ-ラクタム含有プロドラッグ、場合によって置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合によって置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性な細胞傷害性遊離薬剤に変換されえる5-フルオロシトシン及び他の5-フルオロウリジンプロドラッグ。本発明の抗体とともに使用するためにプロドラッグ型に誘導することができる細胞傷害性薬剤の例には、上述の任意の化学療法剤が含まれる（ただしこれらに限定されない）。
本発明の抗体と一緒に投与するために他の多様な治療薬が有用でありえる。ある実施態様では、前記抗体は抗血管形成薬剤と一緒に投与される。本明細書で用いられる“抗血管形成薬剤”とは、血管の発育を阻止またはある程度妨げる化合物を意味する。例えば、抗血管形成因子は、血管形成促進に必要な増殖因子又は増殖因子レセプターと結合する小分子またはタンパク質、例えば抗体、Fc融合物またはサイトカインである。本明細書のそのような抗血管形成因子は、血管内皮増殖因子（VEGF）と結合する抗体である。VEGFを介してシグナリングを阻害する他の因子もまた用いることができ、例えばVEGFまたはVEGF-Rの発現レベルを低下させるRNA系治療薬、VEGF-トキシン融合物、リジェネロン（Regeneron）のVEGF-トラップ及びVEGF-Rと結合する抗体である。また別の実施態様では、抗体は適応免疫応答を誘発または増強する治療薬、例えばCTLA-4を標的とする抗体とともに投与される。また別の抗血管形成薬剤には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アンギオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）、アンチスロンビンIII、アンギオザイム、ABT-627、Bay 12-9566、ベネフィン、ベヴァシズマブ、ビスホスフォネート、BMS-275291、軟骨由来インヒビター（CDI）、CAI、CD409補体フラグメント、CEP-7055、Col 3、コムブレタスタチンA-4、エンドスタチン（コラーゲンXVIIIフラグメント）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、フィブロネクチンフラグメント、グリ-ベータ（gro-beta）、ハロフギノン、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖類フラグメント、HMV833、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、IM-862、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン誘発性タンパク質10（IP-10）、インターロイキン-12、クリングル5（プラスミノーゲンフラグメント）、マリマスタート、メタロプロテイナーゼ阻害剤（例えばTIMP）、2-メソディエストラジオール、MMI270（CGS27023A）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（PAI）、血小板因子-4（PF4）、プリノマスタート、プロラクチン16kDaフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（PRP）、PTK787/ZK222594、レチノイド、ソリマスタート、スクアラミン、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、テトラヒドロコルチゾール-S、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン-1（TSP-1）、TNP-470、形質転換増殖因子ベータ（TGF-β）、ヴァスキュロスタチン、ヴァゾスタチン（カルレチクリンフラグメント）、ZS6126およびZD6474。 Chemotherapeutic agents or other cytotoxic agents can be administered as prodrugs. As used herein, a “prodrug” is a precursor or derivative of a pharmaceutically active substance that is less cytotoxic to tumor cells than the parent drug and is the more active parent form Means that is enzymatically activated or converted. See, for example, Wilman, “Prpdrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery; and Borchardt et al. (Ed): 247-267, Humana Press, 1985 (all of which are referenced by reference). Included herein). Prodrugs that may be useful in connection with the present invention include (but are not limited to): phosphate-containing prodrugs, thiophosphate-containing prodrugs, sulfate-containing prodrugs, peptide-containing prodrugs, D-amino acid modified prodrugs, Glycosylated prodrugs, beta-lactam containing prodrugs, optionally substituted phenoxyacetamide containing prodrugs or optionally substituted phenylacetamide containing prodrugs, 5-fluorocytosine that can be converted to a more active cytotoxic free drug And other 5-fluorouridine prodrugs. Examples of cytotoxic agents that can be derivatized into a prodrug form for use with the antibodies of the present invention include (but are not limited to) any of the chemotherapeutic agents described above.
A variety of other therapeutic agents may be useful for administration with the antibodies of the invention. In certain embodiments, the antibody is administered with an anti-angiogenic agent. As used herein, “anti-angiogenic agent” means a compound that inhibits or prevents some of the growth of blood vessels. For example, an anti-angiogenic factor is a small molecule or protein that binds to a growth factor or growth factor receptor necessary to promote angiogenesis, such as an antibody, Fc fusion or cytokine. Such anti-angiogenic factors herein are antibodies that bind to vascular endothelial growth factor (VEGF). Other factors that inhibit signaling through VEGF can also be used, such as RNA-based therapeutics that reduce the expression level of VEGF or VEGF-R, VEGF-toxin fusions, VEGF-traps of Regeneron and It is an antibody that binds to VEGF-R. In yet another embodiment, the antibody is administered with a therapeutic agent that elicits or enhances an adaptive immune response, such as an antibody that targets CTLA-4. Other anti-angiogenic agents include (but are not limited to): angiostatin (plasminogen fragment), antithrombin III, angiozyme, ABT-627, Bay 12-9566, benefin, bevacizumab , Bisphosphonate, BMS-275291, cartilage-derived inhibitor (CDI), CAI, CD409 complement fragment, CEP-7055, Col 3, combretastatin A-4, endostatin (collagen XVIII fragment), farnesyltransferase inhibitor , Fibronectin fragment, gli-beta, halofuginone, heparinase, heparin hexasaccharide fragment, HMV833, human chorionic gonadotropin (hCG), IM-862, interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interferon-inducible protein 10 (IP-10 ), Interleukin-12, kringle 5 (plasminogen fragment), marimastat, metalloproteinase inhibitor (eg TIMP), 2-mesodiestradiol, MMI270 (CGS27023A), plasminogen activator inhibitor (PAI), Platelet factor-4 (PF4), purinomastert, prolactin 16 kDa fragment, proliferin-related protein (PRP), PTK787 / ZK222594, retinoid, solimasterate, squalamine, SS3304, SU5416, SU6668, SU11248, tetrahydrocortisol-S, tetrathio Molybdate, thalidomide, thrombospondin-1 (TSP-1), TNP-470, transforming growth factor beta (TGF-β), vasculostatin, vasostatin (calreticulin fragment), ZS6126 and ZD6474.

ある実施態様では、抗体はチロシンキナーゼ阻害剤とともに投与される。本明細書で用いられる“チロシンキナーゼ阻害剤”とは、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。そのような阻害剤の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：キナゾリン、例えばPD153035、4-(3-クロロアニリノ)キナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ピロロピリニジン、例えばCGP59326、CGP60261およびCGP62706；ピラゾロピリミジン、4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ(2,3-d)ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン,4,5-ビス(4-フルオロアニリノ)フタリミド）；チロフォスチン含有ニトロチオフェン成分；PD-0183805（Warner-Lambert）；アンチセンス分子（例えばErbB-コード核酸と結合するもの）；キノキサリン（US 5,804,396）；トリフォスチン（US 5,804,396）；ZD6474（Astra Zeneca）；PTK-787（Novartis/Scering A G）；pan-ErbB阻害剤、例えばC1-1033（Pfizer）；アフィニタク（ISIS3521；Isis/Lilly）；イマチニブメシレート（STI571、Gleevec(商標)；Novartis）；PKI 166（Novartis）；GW2016（Glaxo SmithKline）；C1-1033（Pfizer）；EKB-569（Wyeth）；セマキシニブ（Sugen）；ZD6474（AstraZeneca）；PTK-787（Novartis/Scering A G）；INC-1C11（Imclone）；又は以下の特許公開公報のいずれかに記載されたもの：US 5,804,396；PCT WO99/09016（American Cyanamid）；PCT WO98/43960（American Cyanamid）；PCT WO97/38983（Warner-Lambert）；PCT WO99/06378（Warner-Lambert）；PCT WO99/06396（Warner-Lambert）；PCT WO96/30347（Pfizer, Inc）；PCT WO96/33978（AstraZeneca）；PCT WO963397（AstraZeneca）；PCT WO96/33980（AstraZeneca）、ゲフィチニブ（IRESSA^TM、ZD1839、AstraZeneca）、およびOSI-774（TarcevaTM、OSI Pharmaceuticals/Genentech）（前記特許文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。 In certain embodiments, the antibody is administered with a tyrosine kinase inhibitor. As used herein, “tyrosine kinase inhibitor” means a molecule that inhibits to some extent the tyrosine kinase activity of a tyrosine kinase. Examples of such inhibitors include (but are not limited to): quinazolines such as PD153035, 4- (3-chloroanilino) quinazoline; pyridopyrimidines; pyrimidopyrimidines; pyrrolopyrinidines such as CGP59326, CGP60261 and CGP62706; pyrazolopyrimidine, 4- (phenylamino) -7H-pyrrolo (2,3-d) pyrimidine; curcumin (diferloylmethane, 4,5-bis (4-fluoroanilino) phthalimido); nitrophostin-containing nitro Thiophene component; PD-0183805 (Warner-Lambert); antisense molecules (eg, those that bind to ErbB-encoding nucleic acids); quinoxaline (US 5,804,396); triphostin (US 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 ( Novartis / Scering AG); pan-ErbB inhibitors such as C1-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis / Lilly); Imatinib mesylate (STI571, Gleevec ™); N ovartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); C1-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis / Scering AG); INC -1C11 (Imclone); or any of the following patent publications: US 5,804,396; PCT WO99 / 09016 (American Cyanamid); PCT WO98 / 43960 (American Cyanamid); PCT WO97 / 38983 (Warner-Lambert) PCT WO99 / 06378 (Warner-Lambert); PCT WO99 / 06396 (Warner-Lambert); PCT WO96 / 30347 (Pfizer, Inc); PCT WO96 / 33978 (AstraZeneca); PCT WO963397 (AstraZeneca); PCT WO96 / 33980 (AstraZeneca), gefitinib (IRESSA ^™ , ZD1839, AstraZeneca), and OSI-774 (Tarceva ™, OSI Pharmaceuticals / Genentech), each of which is hereby incorporated by reference.

別の実施態様では、抗体は1つ以上の免疫調節剤とともに投与される。そのような薬剤は、1つ以上のサイトカインを増加もしくは低下させ、自己抗原提示をアップレギュレートもしくはダウンレギュレートさせ、MHC抗原を覆い隠し、または1つ以上のタイプの免疫細胞の増殖、分化、遊走もしくは活性化を促進させることができる。免疫調節薬剤には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）、例えばアスピリン、イブプロフェド、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトララク、オキサプロジン、ナブメントン、スリンダク、トルメンチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェンおよびナブメトン；ステロイド（例えばグルココルチコイド、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、メチルプレドニソロン、プレドニソン、プレドニソロン、トリムチノロン、アズルフィジンアイコサノイド、例えばプロスタグランジン、スロンボキサンおよびロイコトリエン；前記の他に局所用ステロイド（例えばアンスラリン、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテン）；サイトカイン、例えばTGFb、IFNa、IFNb、IFNg、IL-2、IL-4、IL-10；サイトカイン、ケモカイン、またはレセプターアンタゴニスト（以下を含む：抗体、可溶性レセプターおよびレセプター-Fc融合物（前記は以下に対抗するものである：BAFF、B7、CCR2、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD14、CD15、CD17、CD18、CD20、CD23、CD28、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD402、CD64、CD80、CD86、CD147、CD152、補体因子（C5, D）CTLA4、エオタキシン、Fas、ICAM、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNAR、IgE、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5R、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12、IL-13、IL-13R1、IL-15、IL-18R、IL-23、インテグリン、LFA-1、LFA-3、MHC、セレクチン、TGFβ、TNFα、TNFβ、TNF-R1、T細胞レセプター）、（前記にはEnbrel(商標)（エタネルセプト）、Humira(商標)（アダリブマブ）及びRemicada(商標)（インフリキシマブ）が含まれる）；不均質抗リンパ球グロブリン；他の免疫調節分子、例えば2-アミノ-6-アリール-5置換ピリミジン、MHC結合ペプチドおよびMHCフラグメントに対する抗イディオタイプ抗体、アザチオプリン、ブレクィナール、ブロモクリプチン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、D-ペニシラミン、デオキシスペルグアリン、FK506、グルタルアルデヒド、金、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、マロノニトリロアミド（例えばレフルノミド）、メトトレキセート、ミノサイクリン、ミゾリビン、マイコフェノレートモフェチル、ラパマイシンおよびスルファササジン。 In another embodiment, the antibody is administered with one or more immunomodulatory agents. Such agents increase or decrease one or more cytokines, up- or down-regulate autoantigen presentation, mask MHC antigens, or proliferation, differentiation of one or more types of immune cells, Migration or activation can be promoted. Immunomodulatory drugs include (but are not limited to): non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as aspirin, ibuprofed, celecoxib, diclofenac, etodolac, fenoprofen, indomethacin, ketralac, oxaprozin, nabutmenton, Sulindac, tormentin, rofecoxib, naproxen, ketoprofen and nabmetone; steroids (eg glucocorticoid, dexamethasone, cortisone, hydroxycortisone, methylprednisolone, prednisone, prednisolone, trimtinolone, azulphidin eicosanoids such as prostaglandin, thromboxane and thromboxane; In addition to the above, topical steroids such as anthralin, calcipotriene, clobetasol and Tazarotene); cytokines such as TGFb, IFNa, IFNb, IFNg, IL-2, IL-4, IL-10; cytokines, chemokines, or receptor antagonists (including: antibodies, soluble receptors and receptor-Fc fusions (as described above) Counteracts: BAFF, B7, CCR2, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD14, CD15, CD17, CD18, CD20, CD23, CD28, CD40, CD40L, CD44 , CD45, CD402, CD64, CD80, CD86, CD147, CD152, complement factor (C5, D) CTLA4, eotaxin, Fas, ICAM, ICOS, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNAR, IgE, IL-1, IL-2 , IL-2R, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-15, IL-18R, IL-23, integrin , LFA-1, LFA-3, MHC, selectin, TGFβ, TNFα, TNFβ, TNF-R1, T cell receptor) (including Enbrel ™ (etanercept), Humira ™ (adalibumab) and Remicada ( Trademark) (Inflix Heterogeneous anti-lymphocyte globulin; anti-idiotype antibodies to other immunomodulatory molecules such as 2-amino-6-aryl-5-substituted pyrimidines, MHC-binding peptides and MHC fragments, azathioprine, brechinal, bromocriptine , Cyclophosphamide, cyclosporin A, D-penicillamine, deoxyspergualin, FK506, glutaraldehyde, gold, hydroxychloroquine, leflunomide, malonontriloamide (eg leflunomide), methotrexate, minocycline, mizoribine, mycophenolate mofetil, rapamycin And sulfasasazine.

また別の実施態様では、本発明の抗体はサイトカインとともに投与される。本明細書で用いられる“サイトカイン”とは、1つの細胞集団によって遊離されるタンパク質であって、細胞間調整物質として別の細胞に作用するタンパク質の一般的用語を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものはとりわけ以下のものである：増殖ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；タイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体ホルモン（LH）；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子-アルファ及び-ベータ；ミューラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子：インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；神経増殖因子、例えばNGF-ベータ；血小板増殖因子；形質転換増殖因子（TGF）、例えばTGF-アルファおよびTGF-ベータ；インスリン様増殖因子-Iおよび-II；エリスロポエチン（EPO）；骨誘発因子；インターフェロン、例えばインターフェロン-アルファ、ベータおよびガンマ；コロニー刺激因子（CSF）、例えばマクロファージ-CSF（M-CSF）；顆粒球-マクロファージ-CSF（GM-CSF）；および顆粒球-CSF（G-CSF）；インターロイキン（IL）、例えばIL-1、IL-アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5R、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘍壊死因子、例えばTNF-アルファまたはTNF-ベータ；および他のポリペプチド因子（LIF及びkitリガンド（KL）を含む）。本明細書で用いられる、サイトカインという用語には、天然の供給源由来および組換え細胞培養由来タンパク質、ならびに天然の配列のサイトカインと生物学的に活性な等価物が含まれる。
ある実施態様では、免疫系の細胞を刺激するサイトカイン又は他の物質が本発明の抗体と同時投与される。そのような治療態様は所望のエフェクター機能を増強することができる。例えば、NK細胞を刺激する物質（IL-2が含まれるが、ただしこれに限定されない）を同時投与することができる。別の実施態様では、マクロファージを刺激する物質（C5a、ホルミルペプチド、例えばN-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（Beigier-Bompadre et al. 2003, Scand J Immunol 57:221-8、前記文献は参照により本明細書に含まれる）を含むが、ただしこれらに限定されない）を同時投与することができる。さらにまた、好中球を刺激する物質（G-CSF、GM-CSFなどを含むが、ただしこれらに限定されない）を投与することができる。さらにまた、そのような免疫刺激性サイトカインの移動を促進する物質を用いることができる。さらにまた、別の物質（インターフェロンガンマ、IL-3およびIL-7が含まれるが、ただしこれらに限定されない）は、1つ以上のエフェクター機能を促進することができる。
また別の実施態様では、エフェクター細胞機能を阻害するサイトカイン又は他の物質が、本発明の抗体と同時投与される。そのような治療態様は、望ましくないエフェクター機能を制限することができる。 In yet another embodiment, the antibody of the invention is administered with a cytokine. As used herein, “cytokine” refers to the general term for a protein that is released by one cell population and acts on another cell as an intercellular regulator. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and conventional polypeptide hormones. Cytokines include, among others, growth hormones such as human growth hormone, N-methionyl human growth hormone, and bovine growth hormone; parathyroid hormone; tylosin; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; glycoprotein Hormones such as follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH), and luteinizing hormone (LH); liver growth factor; fibroblast growth factor; prolactin; placental lactogen; tumor necrosis factor-alpha and -beta; Inhibin; Activin; Vascular endothelial growth factor: Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nerve growth factor such as NGF-beta; Platelet growth factor; Transforming growth factor (TGF) such as TGF-alpha And TGF- Insulin-like growth factors-I and -II; erythropoietin (EPO); osteoinductive factors; interferons such as interferon-alpha, beta and gamma; colony stimulating factors (CSF) such as macrophage-CSF (M-CSF); Granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF); and granulocyte-CSF (G-CSF); interleukin (IL) such as IL-1, IL-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15; tumor necrosis factor, such as TNF-alpha or TNF-beta; and Other polypeptide factors (including LIF and kit ligand (KL)). As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources and recombinant cell culture, as well as biologically active equivalents of native sequence cytokines.
In certain embodiments, cytokines or other substances that stimulate cells of the immune system are co-administered with the antibodies of the invention. Such therapeutic embodiments can enhance the desired effector function. For example, substances that stimulate NK cells (including but not limited to IL-2) can be co-administered. In another embodiment, substances that stimulate macrophages (C5a, formyl peptides such as N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (Beigier-Bompadre et al. 2003, Scand J Immunol 57: 221-8, which is incorporated by reference) Included), but not limited thereto, can be co-administered. Furthermore, substances that stimulate neutrophils (including but not limited to G-CSF, GM-CSF, etc.) can be administered. Furthermore, substances that promote the migration of such immunostimulatory cytokines can be used. Furthermore, another substance (including but not limited to interferon gamma, IL-3 and IL-7) can promote one or more effector functions.
In yet another embodiment, a cytokine or other substance that inhibits effector cell function is co-administered with an antibody of the invention. Such therapeutic aspects can limit undesirable effector functions.

さらに別の実施態様では、抗体は、以下を含む（ただしこれらに限定されない）１つ以上の抗生物質と一緒に投与される：アミノグリコシド系抗生物質（例えばアプラマイシン、アルベカシン、バムベルマイシン、ブチロシン、ディベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクトリノマイシン）、アミノシクリトール（例えばスプリクチノマイシン（sprctinomycin））、アムフェニコール系抗生物質（例えばアジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフルニコール（florfrnicol）およびチアムフェミコール（thiamphemicol））、アンサマイシン系抗生物質（例えばリファミドおよびリファンピン）、カルバペネム（例えばイミペネム、メロペネム、パニペネム）；セファロスポリン（例えばセファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピローム、セフプロジル、セフロキシン、セフィキシム、セファレキシン、セフラジン）、セファマイシン（セフブペラゾン、セフォキシチン、セフミノクス、セフメタゾールおよびセフォテタン）；リンコサミド（例えばクリンダマイシン、リンコマイシン）；マクロライド（例えばアジスロマイシン、ブレフェルディンA、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トブラマイシン）、モノバクタム（例えばアズトレオナム、カルモナムおよびチゲルノナム）；ムピロシン；オキサセフェム（例えばフロモキセフ、ラタモキセフおよびモキサラクタム）；ペニシリン（例えばアムディノシリン、アムディノシリンピヴォキシル、アモキシシリン、バカムピシリン、ベキスジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナメシリン、ペネサメートヒドロアイオダイド（penethamate hydriodide）、ペニシリンo-ベネサミン、ペニシリンO、ペニシリンV、ペニシリンVベンゾエート、ペニシリンVヒドラバミン、ペニメピシクリンおよびフェンシヒシクリンカリウム）；ポリペプチド（例えばバシトラシン、コリスチン、ポリミキシンB、テイコプラニン、ヴァンコマイシン）；キノロン（アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フェロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリン酸（oxolinic acid）、ペフロキサシン、ピペミジン酸（pipemidic acid）、ロソキサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロヴァフロキサシン）；リファムピン；ストレプトグラミン（例えばクィヌプリスチン、ダルフォプリスチン）；スルフォンアミド（スルファニルアミド、スルファメトキサゾール）；テトラシクレン（クロロテトラシクリン、デメクロシクリンヒドロクロリド、デメチルクロロテトラシクリン、ドキシシクリン、デュラマイシン、ミノシクリン、ネオマイシン、オキシテトラシクリン、ストレプトマイシン、テトラシクリン、ヴァンコマイシン）。 In yet another embodiment, the antibody is administered with one or more antibiotics, including but not limited to: aminoglycoside antibiotics (eg, apramycin, arbekacin, bumbermycin, butyrosine, Debekacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, netilmicin, paromomycin, ribostamycin, sisomycin, spectrinomycin), aminocyclitol (for example sprctinomycin), amphenicol antibiotics (for example, azidamphenicol, Chloramphenicol, florfrnicol and thiamphemicol), ansamycin antibiotics (eg rifamid and rifampin), carbapenem (eg imipenem, meropenem) Cephalosporin (e.g., cefachlor, cefadroxyl, cefamandol, cefatridine, cefazedon, cefozopran, cefpimazole, cefpiramide, cefpirom, cefprozil, cefuroxin, cefixime, cephalexin, cefradine), cephamycin (cefupipecin, cefoxepetamethine, cefupipetin And lincosamide (eg clindamycin, lincomycin); macrolides (eg azithromycin, brefeldin A, clarithromycin, erythromycin, roxithromycin, tobramycin), monobactams (eg aztreonam, carmonam and tigernonam); mupirocin Oxacephem (eg flomoxef, latamoxef) And moxalactam); penicillins (eg, amdinosillin, amdinocillin pivoxil, amoxicillin, bacampicillin, bexidylpenicillic acid, benzylpenicillin sodium, epicillin, fenbenicillin, floxacillin, penamecillin, penesamate hydroiodide ), Penicillin o-benesamine, penicillin O, penicillin V, penicillin V benzoate, penicillin V hydrabamine, penimepicrin and fensicycline potassium); polypeptides (eg, bacitracin, colistin, polymyxin B, teicoplanin, vancomycin); quinolone (amifloxacin) , Sinoxacin, ciprofloxacin, enoxacin, enrofloxacin, feroxacin, flumequin, gatiflo Sacin, gemifloxacin, grepafloxacin, lomefloxacin, moxifloxacin, nalidixic acid, norfloxacin, ofloxacin, oxolinic acid, pefloxacin, pipemidic acid, roxoxacin, rufloxacin, sparfloxacin, temafloxacin, Rifamupine; streptogramin (eg, quinupristin, darfopristin); sulfonamide (sulfanilamide, sulfamethoxazole); tetracyclene (chlorotetracycline, demeclocycline hydrochloride, de Methyl chlorotetracycline, doxycycline, duramycin, minocycline, neomycin, oxytetracycline, streptomycin, tetracycline Klin, vancomycin).

抗真菌剤、例えばアンホテリシンB、シクロピロクス、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ニコナゾール、ニスタチン、テルビナフィン、テルコナゾールおよびチオコナゾールもまた用いることができる。
抗ウイルス剤（プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤および他のもの（I型インターフェロン、ウイルス融合阻害剤及びノイラミニダーゼ阻害剤を含む）を含む）もまた用いることができる。抗ウイルス剤の例にはアシクロヴィル、アデフォヴィル、アマンタジン、アムプレナヴィル、クレヴァンジン、エンフヴィルチド、エンテカヴィル、フォスカルネット、ガングシクロヴェル、ヨードキシウリジン、インジナヴィル、ロピナヴィル、プレコナリル、リバヴィリン、リマンタジン、リトナヴィル、サクィナヴィル、トリフリジン、ヴィダラビン、およびジドヴウリジンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明の抗体は他の治療方針と組み合わせることができる。例えば、ある実施態様では、本発明の抗体で治療されるべき患者はまた放射線療法を受けることができる。放射線療法は、当分野で一般的に用いられ、当業者に公知のプロトコルにしたがって実施することができる。そのような療法には、セシウム、イリジウム、ヨウ素またはコバルト照射が含まれるが、ただしこれらに限定されない。放射線療法は全身照射であっても、身体内もしくは身体上の特定の部位または組織（例えば肺、膀胱または前立腺）に局部的に誘導されてもよい。典型的には、放射線療法は、約1から2週間の期間にわたってパルス照射される。しかしながら、放射線療法は、より長期間にわたって実施してもよい。例えば、放射線療法は、頭部及び頸部の癌を有する患者に約6から7週間実施することができる。場合によって、放射線療法は、1回分線量として又は複数回分の連続線量として実施することができる。技量を有する医療従事者は、本明細書で有用な放射線療法の適切な線量を経験的に決定することができる。本発明の別の実施態様にしたがえば、本発明の抗体及び1つ以上の他の抗癌療法を用いて、ex vivoで癌細胞を治療することができる。そのようなex vivo治療は骨髄移植、及び特に自家骨髄移植で有用でありえる。例えば、抗体及び1つ以上の他の抗癌療法（例えば上記に記載したもの）による癌細胞を含む細胞または組織の処置を利用して、レシピエント患者への移植前に癌細胞を除去又は実質的に除去することができる。
本発明の抗体をさらに他の治療技術、例えば外科手術又は光線療法と組み合わせて利用することももちろん意図されている。 Antifungal agents such as amphotericin B, ciclopirox, clotrimazole, econazole, fluconazole, flucytosine, itraconazole, ketoconazole, niconazole, nystatin, terbinafine, terconazole and thioconazole can also be used.
Antiviral agents (including protease inhibitors, reverse transcriptase inhibitors and others, including type I interferons, viral fusion inhibitors and neuraminidase inhibitors) can also be used. Examples of antiviral agents are Acyclovir, Adefovir, Amantadine, Amprenavir, Clevandine, Enfuvirtide, Entecavir, Foscarnet, Gangcyclovel, Iodoxyuridine, Indinaville, Lopinavir, Preconaril, Ribavirin, Rimantadine, Ritonavir, Saquinavir, These include, but are not limited to, trifuridine, vidarabine, and zidovuridine.
The antibodies of the invention can be combined with other therapeutic strategies. For example, in certain embodiments, a patient to be treated with an antibody of the invention can also receive radiation therapy. Radiation therapy is commonly used in the art and can be performed according to protocols known to those skilled in the art. Such therapies include, but are not limited to, cesium, iridium, iodine or cobalt irradiation. Radiation therapy may be whole body irradiation or may be directed locally to a specific site or tissue in or on the body (eg lung, bladder or prostate). Typically, radiation therapy is pulsed over a period of about 1 to 2 weeks. However, radiation therapy may be performed over a longer period. For example, radiation therapy can be administered to patients with head and neck cancer for about 6 to 7 weeks. In some cases, radiation therapy can be performed as a single dose or as multiple continuous doses. A skilled medical practitioner can empirically determine the appropriate dose of radiation therapy useful herein. According to another embodiment of the invention, the antibodies of the invention and one or more other anti-cancer therapies can be used to treat cancer cells ex vivo. Such ex vivo treatment can be useful in bone marrow transplantation, and particularly autologous bone marrow transplantation. For example, treatment of cells or tissues containing cancer cells with antibodies and one or more other anti-cancer therapies (eg, those described above) may be used to remove or substantially eliminate cancer cells prior to transplantation into a recipient patient. Can be removed.
It is of course also contemplated to utilize the antibodies of the present invention in combination with other therapeutic techniques such as surgery or phototherapy.

本発明の例示のために実施例が下記で提供される、これらの実施例は、いずれか特定の適用又は作用理論に本発明を拘束しようとするものではない。
免疫グロブリンの定常領域を示すために、位置は、Kabat記載のEUインデックスにしたがって番号付与されている（Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda）。
実施例1：エフェクター機能を増強するアミノ酸改変を有する抗CD40抗体
本発明の抗CD40抗体は、抗癌療法のための臨床候補薬として意図される。CD40を標的とする抗体のエフェクター機能の改善の可能性を精査するために、抗CD40抗体の変種型を操作した。
図5は、本実験で使用される、抗CD40のS2C6（S. Paulie, 1984, Cancer Immunol Immunother, 17:173-179）、G28-5（E.A. Clark et al. 1988, Eur J Immunol, 18:451-457）、および5D12（M. de Boer et al. 1992, J Immunol Methods, 152:15-23）（前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）のいくつかの重鎖および軽鎖可変領域配列を提供する。マウス親キメラ重鎖および軽鎖はH0およびL0とそれぞれ標識されている。遺伝子合成技術を用いてネズミWT抗体VHおよびVLの遺伝子（それぞれH0およびL0と称する）を構築し、完全長の軽鎖カッパ（Cκ）および重鎖IgG1定常領域を含む哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1Zeo（Invitrogen）にサブクローニングした。変種S239D/I332E（エフェクター機能増強抗CD40）を、pcDNA3.1Zeoベクター中のハイブリッドIgG1/IgG2（図1）抗体のFc領域にQuikChange変異導入技術（Stratagene）を用いて構築した。全配列の配列決定を実施して、当該配列の正確さを確認した。重鎖遺伝子（VH-CH1-CH2-CH3）（野生型または変種）を含むプラスミドを、軽鎖遺伝子（VL-CL_k）を含むプラスミドとともに293細胞にトランスフェクトした。トランスフェションの5日後に培養液を採取し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー（Pierce, Cat#20334）を用いて抗体を上清から精製した。
CD40発現細胞に対してエフェクター機能を媒介する抗体変種の能力を判定するために、エフェクター機能増強抗CD40抗体を細胞使用ADCCアッセイで試験した。ヒト抹消血単球（PBMC）をリューコパックから単離してエフェクター細胞として用い、さらにCD40陽性癌細胞を標的細胞として用いた。標的細胞を20,000細胞/ウェルで播種し、トリプリケートで指定の細胞により処理した。フィコール（Ficoll）グラディエントを用いて単離したPBMCを標的細胞に対して過剰に添加して混合培養し、4時間後に細胞傷害検出キットを製造業者の指示にしたがって用いLDH活性について処理した。図6は、WT IgG1、エフェクター機能増強抗CD40抗体（ハイブリッドS239D/I332E）、および／またはエフェクター機能増強リツキシマブ（ハイブリッドS239D/I332E）を、細胞株Daudi（バーキットリンパ腫）、Raji（バーキットリンパ腫）、およびRPMI8226（多発性ミエローマ）で抗体S2C6（図6a）、5D12（図6b）、およびG28-5（図6c）について比較したADCCアッセイの結果を示している。これらのグラフは、それらのEC50（それぞれの対応する潜在能力を反映する）だけでなく、飽和濃度の抗体によって達成されるADCCの最大レベル（それぞれの対応する有効性を反映する）においても当該抗体は異なっていることを示している。これら2つの用語、潜在能力および有効性は、所望の臨床特性を指すために時には曖昧に用いられるが、本実験の状況下ではしかしながらそれらは固有の量として表示され、したがってここで明確に定義される。本実験の状況下で用いられる“潜在能力”とは、抗体のEC50を意味する。本実験の状況下で用いられる“有効性”とは、飽和レベルでの抗体のありえる最大のエフェクター機能を意味する。潜在能力および有効性の相当な増強が、WT Fc領域を有する抗体と比較してエフェクター機能が増強されたFc変種抗体で観察される。エフェクター機能が増強された3つの抗体の全てが、多発性ミエローマ細胞株RPMI8226でADCCを提示し、S2C6がもっとも有効性を示し、この抗体が多発性ミエローマのための有効な治療選択肢であるえることを示唆した。 Examples are provided below to illustrate the present invention and these examples are not intended to constrain the present invention to any particular application or theory of action.
Positions are numbered according to the EU index as described in Kabat (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda).
Example 1: Anti-CD40 antibody with amino acid modification that enhances effector function The anti-CD40 antibody of the present invention is intended as a clinical candidate for anti-cancer therapy. In order to investigate the possible improvement in effector function of antibodies targeting CD40, variants of anti-CD40 antibodies were engineered.
FIG. 5 shows anti-CD40 S2C6 (S. Paulie, 1984, Cancer Immunol Immunother, 17: 173-179), G28-5 (EA Clark et al. 1988, Eur J Immunol, 18: 451-457), and several heavy and light chains of 5D12 (M. de Boer et al. 1992, J Immunol Methods, 152: 15-23, each of which is hereby incorporated by reference). Provide variable region sequences. Mouse parental chimeric heavy and light chains are labeled H0 and L0, respectively. A mammalian expression vector pcDNA3.1Zeo containing the full-length light chain kappa (Cκ) and heavy chain IgG1 constant regions using gene synthesis techniques to construct the genes for murine WT antibodies VH and VL (referred to as H0 and L0, respectively) Subcloned into (Invitrogen). Variant S239D / I332E (effector function enhanced anti-CD40) was constructed using the QuikChange mutagenesis technique (Stratagene) in the Fc region of the hybrid IgG1 / IgG2 (FIG. 1) antibody in the pcDNA3.1Zeo vector. All sequences were sequenced to confirm the accuracy of the sequence. A plasmid containing the heavy chain gene (VH-CH1-CH2-CH3) (wild type or variant) was transfected into 293 cells along with a plasmid containing the light chain gene (VL-CL _k ). Five days after transfection, the culture medium was collected, and the antibody was purified from the supernatant using protein A affinity chromatography (Pierce, Cat # 20334).
To determine the ability of antibody variants to mediate effector function on CD40 expressing cells, effector function enhanced anti-CD40 antibodies were tested in a cell-based ADCC assay. Human peripheral blood monocytes (PBMC) were isolated from Leucopack and used as effector cells, and CD40 positive cancer cells were used as target cells. Target cells were seeded at 20,000 cells / well and treated with designated cells in triplicate. PBMCs isolated using Ficoll gradient were added in excess to the target cells, mixed and cultured, and treated for LDH activity 4 hours later using a cytotoxicity detection kit according to the manufacturer's instructions. FIG. 6 shows WT IgG1, effector function-enhanced anti-CD40 antibody (hybrid S239D / I332E), and / or effector function-enhanced rituximab (hybrid S239D / I332E), cell lines Daudi (Burkitt lymphoma), Raji (Burkitt lymphoma) , And RPMI8226 (multiple myeloma) show the results of ADCC assays compared for antibodies S2C6 (FIG. 6a), 5D12 (FIG. 6b), and G28-5 (FIG. 6c). These graphs show not only their EC50 (reflecting their corresponding potential) but also the maximum level of ADCC achieved by saturating antibodies (reflecting their corresponding efficacy) Indicates that they are different. These two terms, potential and efficacy, are sometimes used ambiguously to refer to the desired clinical characteristics, but in the context of this experiment, however, they appear as unique quantities and are therefore clearly defined here. The “Potency” as used in the context of this experiment means the EC50 of the antibody. “Efficacy” as used in the context of this experiment means the maximum possible effector function of the antibody at the saturation level. A considerable increase in potential and efficacy is observed with Fc variant antibodies with enhanced effector function compared to antibodies with WT Fc regions. All three antibodies with enhanced effector function present ADCC in the multiple myeloma cell line RPMI8226, S2C6 is most effective, and this antibody is an effective treatment option for multiple myeloma Suggested.

実施例2：抗CD40抗体S2C6を用いる血小板活性化アッセイ
抗CD40抗体S2C6が何らかの血小板活性化作用を有するか否かを決定するために、血小板活性化アッセイを実施した。血小板は、クエン酸ナトリウム中への静脈穿刺によって採血した新鮮血を低速（100ｘg）で15分遠心し、麦わら色の上部相を血小板濃縮血漿（PRP）として取り出すことによって入手した。このPRPをさらに700ｘgで2.5分遠心し、ペレットを確保し、PBS（CaCl₂およびMgCl₂を含まない）中の10mMのEDTA、1%FBSで2回洗浄した。血小板ペレットを、PRP体積の1.5ｘのEDTA/FBS/PBSに再懸濁し実験に使用した。5ｘモル過剰の架橋抗体とともに、96ウェルのマイクロタイタープレートで、50μL体積にてEDTA/FBS/PBSで抗体の段階希釈を実施した。IV.3抗体（マウス抗ヒトIgG FcgRIIa特異的抗体）のためには、ヤギ抗マウスIgG Fc特異的抗体を架橋に用い、他の全ての抗体については、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ビオチニル化抗体を架橋に用いた。希釈抗体ウェルに、調製しておいた洗浄血小板の50μLを添加した。サンプルを37℃で35分インキュベートし、SDSキット（ATP-Lite, PerkinElmer）非存在下でATP依存発光を惹起させた。血小板活性化アッセイの結果は図7に示されている。この結果は、S2C6 IgG1もエフェクター機能増強S2C6も、10000ng/mL未満の濃度では血小板を活性化しないが、陽性コントロール抗体のIV.3は全ての濃度で明瞭に血小板活性化を媒介することを示している。 Example 2: Platelet activation assay using anti-CD40 antibody S2C6 To determine whether anti-CD40 antibody S2C6 has any platelet activation effect, a platelet activation assay was performed. Platelets were obtained by centrifuging fresh blood collected by venipuncture into sodium citrate at low speed (100 × g) for 15 minutes and removing the straw colored upper phase as platelet-rich plasma (PRP). The PRP was further centrifuged at 700 × g for 2.5 minutes to ensure a pellet and washed twice with 10 mM EDTA, 1% FBS in PBS (without CaCl ₂ and MgCl ₂ ). The platelet pellet was resuspended in PRP volume 1.5x EDTA / FBS / PBS and used for experiments. Serial dilutions of antibodies were performed in EDTA / FBS / PBS in a 50 μL volume in 96-well microtiter plates with a 5 × molar excess of cross-linked antibody. For IV.3 antibody (mouse anti-human IgG FcgRIIa specific antibody), goat anti-mouse IgG Fc specific antibody is used for cross-linking, and for all other antibodies, goat anti-human IgG Fc specific biotinylated antibody Was used for crosslinking. To the diluted antibody well, 50 μL of the prepared washed platelet was added. Samples were incubated at 37 ° C. for 35 minutes to induce ATP-dependent luminescence in the absence of SDS kit (ATP-Lite, PerkinElmer). The results of the platelet activation assay are shown in FIG. The results indicate that neither S2C6 IgG1 nor effector enhanced S2C6 activates platelets at concentrations below 10000 ng / mL, whereas the positive control antibody IV.3 clearly mediates platelet activation at all concentrations. ing.

実施例3：バーキットリンパ腫細胞株HS-Sultanでの抗CD40抗体の抗増殖アッセイ
in vitroでの抗増殖作用を観察するために、多くの抗体が架橋（通常は二次抗体によって得られる）を必要とする。これらの抗体の対応するin vivo作用は、エフェクター細胞表面に発現されたFcレセプターによって橋渡しされる架橋に依存すると言われている。この実験では、キメラ抗体S2C6および5D12の抗増殖作用は、バーキットリンパ腫細胞株HS-Sultanを用いてアッセイした（図8）。HS-Sultan細胞は、ピルビン酸ナトリウムおよびHEPESを含む10%FBS/RPMI1640で維持した。HEPESおよびピルビン酸ナトリウムを含む2%FBS/RPMI1640の50μL中で、10ｘモル過剰の架橋抗体とともに96ウェルのマイクロタイタープレートにて抗体の段階希釈を調製した。いくつかの事例では、表示のように追加の因子を固定濃度で添加した。用いた架橋抗体は、ヒトまたはマウスの抗体についてそれぞれヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ビオチニル化抗体およびヤギ抗マウスIgG Fc特異的抗体であった。HS-Sultan細胞をペレットにし、さらにHEPESおよびピルビン酸ナトリウムを含む2%FBS/RPMI1640に100,000細胞/mLで再懸濁させ、50μLを調製しておいた抗体希釈に添加した。37℃で4日後に、ATP依存発光生存率アッセイキット（Cell TiterGlo, Promega Corp.）を用いて、生細胞中に存在するATPの量を検出した。CD40リガンドを含むまたは含まないヒトIgGおよび細胞単独をコントロールとして用いた。S2C6および5D12の両方がHS-Sultan細胞株で抗増殖作用を示した。
エフェクター機能を増強するための特定の改変（例えば置換239Dおよび332E）を用いることは、抗CD40抗体がこれら特定の改変に束縛されることを意味しない。“エフェクター機能を最適化する改変”という表題の項で述べたように、多数の改変（アミノ酸改変および糖型改変を含む）が、抗CD40抗体についてそれらのエフェクター機能特性を改善するために意図される。
引用した全ての参考文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
例示のために本発明の特定の実施態様を上記に記載したが、添付の特許請求の範囲に記載した本発明の範囲から逸脱することなく、詳細に関して多数の変型を実施しえることは当業者には理解されよう。 Example 3: Anti-proliferation assay of anti-CD40 antibody in Burkitt lymphoma cell line HS-Sultan
Many antibodies require cross-linking (usually obtained by secondary antibodies) to observe anti-proliferative effects in vitro. The corresponding in vivo action of these antibodies is said to depend on the cross-links bridged by Fc receptors expressed on the effector cell surface. In this experiment, the antiproliferative effects of the chimeric antibodies S2C6 and 5D12 were assayed using the Burkitt lymphoma cell line HS-Sultan (FIG. 8). HS-Sultan cells were maintained in 10% FBS / RPMI1640 containing sodium pyruvate and HEPES. Serial dilutions of antibodies were prepared in 96-well microtiter plates in 50 μL of 2% FBS / RPMI1640 containing HEPES and sodium pyruvate with a 10 × molar excess of cross-linked antibody. In some cases, additional factors were added at fixed concentrations as indicated. The cross-linked antibodies used were goat anti-human IgG Fc specific biotinylated antibody and goat anti-mouse IgG Fc specific antibody for human or mouse antibodies, respectively. HS-Sultan cells were pelleted and further resuspended in 2% FBS / RPMI1640 containing HEPES and sodium pyruvate at 100,000 cells / mL and 50 μL was added to the prepared antibody dilution. After 4 days at 37 ° C., the amount of ATP present in the living cells was detected using an ATP-dependent luminescence viability assay kit (Cell TiterGlo, Promega Corp.). Human IgG and cells alone with or without CD40 ligand were used as controls. Both S2C6 and 5D12 showed antiproliferative effects in the HS-Sultan cell line.
Using specific modifications to enhance effector function (eg, substitutions 239D and 332E) does not imply that anti-CD40 antibodies are bound by these specific modifications. As noted in the section entitled “Modifications that optimize effector function”, a number of modifications (including amino acid modifications and glycoform modifications) are intended to improve their effector functional properties for anti-CD40 antibodies. The
All references cited are incorporated herein by reference in their entirety.
While specific embodiments of the present invention have been described above for purposes of illustration, it will be apparent to those skilled in the art that many variations can be made in the details without departing from the scope of the invention as set forth in the appended claims. Will be understood.

Claims

重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む重鎖並びに軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含む軽鎖、および配列番号:6を含む親の抗CD40抗体に比してアミノ酸改変332Eおよび239Dを重鎖定常領域に含む、CD40と結合する抗体であって、
前記重鎖可変領域が、V_H CDR1、V_H CDR2およびV_H CDR3を含み、
前記V_H CDR1が、配列番号:16のアミノ酸配列、配列番号:22のアミノ酸配列、および配列番号:28のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記V_H CDR2が、配列番号:17のアミノ酸配列、配列番号:23のアミノ酸配列、および配列番号:29に示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記V_H CDR3が、配列番号:18のアミノ酸配列、配列番号:24に示すアミノ酸配列、および配列番号:30に示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域が、V_L CDR1、V_L CDR2およびV_L CDR3を含み、
前記V_L CDR1が、配列番号:19のアミノ酸配列、配列番号:25に示すアミノ酸配列、および配列番号:31のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記V_L CDR2が、配列番号:20のアミノ酸配列、配列番号:26のアミノ酸配列、および配列番号:32のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記V_L CDR3が、配列番号:21のアミノ酸配列、配列番号:27のアミノ酸配列、および配列番号:33のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
配列番号:16が選ばれる場合には配列番号:17、18、19、20および21も選ばれ、
配列番号:22が選ばれる場合には配列番号:23、24、25、26および27も選ばれ、
配列番号:28が選ばれる場合には配列番号:29、30、31、32および33も選ばれ、
前記軽鎖はさらに配列番号:1の軽鎖定常領域を含み、
さらに
前記抗体が、親抗体と比較したとき、増強された親和性でFcγRIIIaレセプターと結合するか、または増強されたADCCエフェクター機能を有する、前記CD40と結合する抗体。 Amino acid modifications 332E and 239D compared to a parent anti-CD40 antibody comprising a heavy chain comprising a heavy chain variable region and a heavy chain constant region and a light chain comprising a light chain variable region and a light chain constant region, and SEQ ID NO: 6 An antibody that binds to CD40, contained in the heavy chain constant region,
The heavy chain variable region comprises V _H CDR1, V _H CDR2 and V _H CDR3;
The V _H CDR1 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
The V _H CDR2 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29;
The V _H CDR3 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30;
The light chain variable region comprises V _L CDR1, V _L CDR2 and V _L CDR3;
The V _L CDR1 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31;
The V _L CDR2 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32;
The V _L CDR3 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33;
When SEQ ID NO: 16 is selected, SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, and 21 are also selected,
When SEQ ID NO: 22 is selected, SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26 and 27 are also selected,
When SEQ ID NO: 28 is selected, SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32 and 33 are also selected,
The light chain further comprises a light chain constant region of SEQ ID NO: 1;
Further, the antibody that binds to the CD40, wherein the antibody binds to the FcγRIIIa receptor with enhanced affinity when compared to the parent antibody or has enhanced ADCC effector function.

V_H CDR1が配列番号:16を含み、V_H CDR2が配列番号:17を含み、V_H CDR3が配列番号:18を含み、V_L CDR1が配列番号:19を含み、V_L CDR2が配列番号:20を含み、V_L CDR3が配列番号:21を含む、請求項１に記載の抗体。 V _H CDR1 contains SEQ ID NO: 16, V _H CDR2 contains SEQ ID NO: 17, V _H CDR3 contains SEQ ID NO: 18, V _L CDR1 contains SEQ ID NO: 19, V _L CDR2 contains SEQ ID NO: The antibody of claim 1, wherein the antibody comprises: 20 and the V _L CDR3 comprises SEQ ID NO: 21.

請求項１または２に記載の抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸。 A nucleic acid encoding the light chain or heavy chain of the antibody according to claim 1 or 2.