JP5344857B2 - Method for producing filamentous fungal protease - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糸状菌プロテアーゼの生産方法、並びに当該方法の実施に有用な糸状菌用発現ベクターおよび形質転換体に関する。 The present invention relates to a method for producing a filamentous fungal protease, and an expression vector and a transformant useful for the implementation of the method.
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤或いは消炎剤といった様々な用途、分野で利用され、工業用酵素の中で最も生産量が多い。食品工業においても、食品タンパク質からの調味料としてのアミノ酸製造、食品の苦味や雑味の低減、食品へのコクや濃厚感付与のためのペプチド製造、栄養源の高い腸吸収の良いペプチド製造、血圧降下活性などの機能性食品素材としてのペプチド製造、食品に混濁する不要タンパク質の除去などにおいて、プロテアーゼは重大な働きを有する。食品工業で使用されるプロテアーゼは、微生物由来のものが多く、Aspergillus属、Bacillus属、Rhizopus属のものが多い。特に、Aspergillus属の麹菌(Aspergillus oryzae)由来のプロテアーゼは、幅広いpHに対応できるものが多く、また液体培養や固体培養などの培養条件の違いで種々のタイプの分子種を有するプロテアーゼ酵素剤を提供できることから、食品業界で最も汎用されている。 Proteases are used in various applications and fields such as detergents for clothes, cosmetics, bath preparations, food modifiers, digestive aids or anti-inflammatory agents, and are the most produced of industrial enzymes. There are many. Also in the food industry, amino acid production as a seasoning from food protein, reduction of bitterness and miscellaneous taste of food, production of peptide to give richness and richness to food, production of peptide with high intestinal absorption and high nutrient source Proteases have a significant role in the production of peptides as functional food materials such as blood pressure lowering activity and the removal of unwanted proteins turbid in food. Many proteases used in the food industry are derived from microorganisms, and many are from the genus Aspergillus, Bacillus, and Rhizopus. In particular, many proteases derived from Aspergillus oryzae can handle a wide range of pH, and provide protease enzyme agents with various types of molecular species depending on the culture conditions such as liquid culture and solid culture. Because it can, it is most widely used in the food industry.
なかでも血圧降下活性を有する乳たんぱく質由来のVPP, IPPなどのラクトトリペプチドは、麹菌由来のプロテアーゼ酵素剤で有利に生産できることから、機能性食品材料としてのペプチド生産にも麹菌由来のプロテアーゼは非常に有用である(非特許文献1)。 In particular, lactotripeptides such as VPP and IPP derived from milk proteins with blood pressure lowering activity can be produced advantageously by protease enzyme agents derived from Aspergillus oryzae. Proteases derived from Aspergillus oryzae are also very useful in peptide production as functional food materials. (Non-patent Document 1).
ただ、機能性ペプチド製造においては、現状の麹菌由来のプロテアーゼ酵素剤にも弱点がある。より具体的には、かかる酵素剤は、麹菌の培養抽出物を組成とするため、特性が不明な複数のペプチダーゼを含んでおり、このため、食品タンパク質に作用させた場合、目的の機能性ペプチドが過分解され、アミノ酸にまで変換されてしまう。 However, in the production of functional peptides, the present protease enzyme agent derived from Aspergillus has a weak point. More specifically, such an enzyme agent contains a plurality of peptidases whose characteristics are unknown because it is composed of a culture extract of Aspergillus oryzae. Therefore, when acting on food proteins, the target functional peptide Is excessively decomposed and converted to amino acids.
上記課題を解決するために、反応時間、反応pH、反応温度、食品タンパク質と酵素剤の量比、酵素剤の併用など、ケースバイケースで対応せざるを得ないのが現状である。 In order to solve the above problems, the current situation is that the reaction time, reaction pH, reaction temperature, amount ratio of food protein and enzyme agent, combined use of enzyme agent, etc. must be dealt with on a case-by-case basis.
かかる課題を解決するためには、分子種が明らかなプロテアーゼ酵素剤を、安全性が高く古くから清酒や醤油などの醸造食品の製造に利用されてきた糸状菌、特に麹菌により提供できることが望ましいが、未だそのような技術は提供されていないのが現状である。
機能性ペプチドの生産に有用な糸状菌、特に麹菌に由来するプロテアーゼ酵素剤を工業的に生産するためには分子種が明らかなプロテアーゼが生産できるシステムの構築が必要である。そこで本発明は、糸状菌に由来し、分子種が明らかなプロテアーゼを、糸状菌を宿主として生産する方法、特にセルフクローニング法により生産する方法を提供することを目的とする。また本発明は、当該プロテアーゼの生産に用いるための材料、すなわち糸状菌用の発現ベクターおよび形質転換体を提供することを目的とする。 In order to industrially produce a protease enzyme agent derived from filamentous fungi useful for the production of functional peptides, particularly koji mold, it is necessary to construct a system capable of producing a protease with a known molecular species. Therefore, an object of the present invention is to provide a method for producing a protease derived from a filamentous fungus and having a known molecular species using the filamentous fungus as a host, particularly a method for producing by a self-cloning method. Another object of the present invention is to provide a material for producing the protease, that is, an expression vector for a filamentous fungus and a transformant.
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ねた結果、配列番号11〜20のいずれかに記載するアミノ酸配列を有する糸状菌由来のプロテアーゼについて、上記システムの構築が可能であり、これらのプロテアーゼを、糸状菌を宿主とするセルフクローニング法を用いて効率よく、しかも菌体外(培地上清)に生産することができることを確認して、本発明を完成するに至った。 As a result of repeated researches to solve the above problems, the present inventors have been able to construct the above system for a protease derived from a filamentous fungus having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 11 to 20, It was confirmed that the protease can be efficiently produced using a self-cloning method using a filamentous fungus as a host and outside the cell (medium supernatant), and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は下記の実施態様を有する。
(I)糸状菌用発現ベクター
(I-1)糸状菌体内で機能する選択マーカー遺伝子配列、糸状菌体内で機能するプロモーター配列、配列番号1〜10に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるプロテアーゼ遺伝子、および糸状菌体内で機能するターミネーター配列を有する糸状菌用発現ベクター。
(I-2)実質的に糸状菌に由来するヌクレオチドだけからなるセルフクローニングベクターである、(I-1)に記載する糸状菌用発現ベクター。
(I-3)直鎖状であることを特徴とする、(I-1)または(I-2)に記載する糸状菌用発現ベクター。
(I-4)糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である、(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する糸状菌用発現ベクター。
That is, the present invention has the following embodiments.
(I) an expression vector for filamentous fungi (I-1) selected from the group consisting of a selectable marker gene sequence that functions in filamentous fungi, a promoter sequence that functions in filamentous fungi, and the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 10 An expression vector for a filamentous fungus, comprising a protease gene comprising any one of the nucleotide sequences described above and a terminator sequence that functions in the filamentous fungus body.
(I-2) The expression vector for filamentous fungi according to (I-1), which is a self-cloning vector consisting essentially of nucleotides derived from filamentous fungi.
(I-3) The expression vector for filamentous fungi according to (I-1) or (I-2), which is linear.
(I-4) The expression vector for filamentous fungi according to any one of (I-1) to (I-3), wherein the filamentous fungus is a filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus.
(II)形質転換体
(II-1)(I-1)乃至(I-4)のいずれかに記載する糸状菌用発現ベクターで形質転換されてなる糸状菌。
(II-2)アスペルギルス属に属する糸状菌である、(II-1)に記載する糸状菌。
(II) A filamentous fungus transformed with the expression vector for filamentous fungus according to any one of the transformants (II-1) (I-1) to (I-4).
(II-2) The filamentous fungus according to (II-1), which is a filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus.
(III)プロテアーゼの生産方法
(III-1)(II-1)または(II-2)に記載する形質転換された糸状菌を培地で培養し、当該培地から配列番号11〜20に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列からなるプロテアーゼを回収する工程を含む、プロテアーゼの生産方法。
(III) Protease production method (III-1) The transformed filamentous fungus described in (II-1) or (II-2) is cultured in a medium, and described in SEQ ID NOs: 11 to 20 from the medium. A method for producing a protease, comprising the step of recovering a protease comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences.
本発明の糸状菌用発現ベクターおよび生産方法によれば、分子種の明らかな糸状菌由来のプロテアーゼを、糸状菌を宿主として用いて効率よく製造することができる。このため、本発明の方法によれば、分子種の明らかな所望のプロテアーゼを工業的に製造することができる。 According to the expression vector for filamentous fungi and the production method of the present invention, a protease derived from a filamentous fungus with a clear molecular species can be efficiently produced using the filamentous fungus as a host. Therefore, according to the method of the present invention, a desired protease having a clear molecular species can be industrially produced.
また直鎖状の糸状菌用発現ベクターは、(1)構築したプラスミドから1ステップのPCRで取得できるなど、環状の発現ベクターと比べて少ないステップで調製することができること、(2)宿主としてロイシン要求性変異株を使用する場合に、当該変異を直接相補することができること、および(3)形質転換効率が環状の発現ベクターと比べて高いという利点がある。 In addition, linear filamentous fungal expression vectors can be prepared with fewer steps compared to circular expression vectors, such as (1) one-step PCR from the constructed plasmid, and (2) leucine as a host. When using a required mutant, there are advantages that the mutation can be directly complemented and (3) the transformation efficiency is higher than that of a circular expression vector.
本発明が対象とする糸状菌としては、麹菌、及び麹菌が属する糸状不完全菌類を挙げることができる。なかでも好ましくはアスペルギルス属(Aspergillus)、ムコール属(Mucor)、カンジダ属(Candida)、トリコデルマ属(Trichoderma)、およびノイロスポラ属(Neurospora)に属する糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス属(Aspergillus)に属する糸状菌である。アスペルギルス属糸状菌としては、特に制限されないが、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terrus)、およびアスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)などを挙げることができる。なかでも、長年清酒、醤油、味噌、みりんなどの醸造食品に利用されてきた安全な微生物であり、わが国の産業において利用頻度の高い宿主である点で、麹菌アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)が好ましい。 Examples of the filamentous fungi targeted by the present invention include koji molds and incomplete filamentous fungi to which koji molds belong. Among these, preferred are filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, Mucor, Candida, Trichoderma, and Neurospora, and more preferred are Aspergillus. It belongs to the filamentous fungus. The Aspergillus genus fungus is not particularly limited, but Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, saspergillus sperm ), Aspergillus sojae, Aspergillus tamarii, Aspergillus glaucus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergilter rusus And Aspergillus nidulans. Among them, Aspergillus oryzae is preferable because it is a safe microorganism that has been used in brewed foods such as sake, soy sauce, miso, and mirin for many years and is a frequently used host in Japanese industries. .
(1)糸状菌用発現ベクター
本発明の糸状菌用発現ベクターは、糸状菌またはその変異株を宿主として、当該宿主内で配列番号11〜20のいずれかに記載するアミノ酸配列を有する糸状菌プロテアーゼを発現し産生することのできるベクターである。かかるベクターは、上記プロテアーゼをコードする配列番号1〜10のいずれかに記載される塩基配列を有するプロテアーゼ遺伝子に加えて、糸状菌体内で機能するプロモーター配列、糸状菌体内で機能するターミネーター配列、および糸状菌体内で機能し、形質転換体の選択に好適に使用される選択マーカー遺伝子配列を有する。
(1) Expression vector for filamentous fungi The expression vector for filamentous fungi of the present invention is a filamentous fungal protease having the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 11 to 20 in the host using the filamentous fungus or a mutant thereof as a host. Is a vector capable of expressing and producing Such a vector, in addition to the protease gene having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 encoding the protease, a promoter sequence that functions in filamentous fungi, a terminator sequence that functions in filamentous fungi, and It has a selectable marker gene sequence that functions in filamentous fungi and is preferably used for selection of transformants.
(1-1)糸状菌プロテアーゼ
本発明が対象とするプロテアーゼは、配列番号11〜20に記載するいずれかのアミノ酸配列を有する糸状菌由来、特に麹菌由来のプロテアーゼである。これらのプロテアーゼのうち、配列番号11〜13に示すプロテアーゼはアルカリ性プロテアーゼ、配列番号14〜17に示す酸性カルボキシペプチダーゼ、配列番号18に示すプロテアーゼは酸性プロテアーゼ、および配列番号19〜20に示すプロテアーゼは中性プロテアーゼに分類することができる。
(1-1) Filamentous protease The protease targeted by the present invention is a protease derived from a filamentous fungus having any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 20, particularly a koji mold. Among these proteases, the proteases shown in SEQ ID NOs: 11 to 13 are alkaline proteases, the acidic carboxypeptidase shown in SEQ ID NOs: 14 to 17, the protease shown in SEQ ID NO: 18 is an acidic protease, and the proteases shown in SEQ ID NOs: 19 to 20 are medium. It can be classified into sex proteases.
なお、これらの各プロテアーゼのアミノ酸配列とこれらをコードする遺伝子(プロテアーゼ遺伝子)の塩基配列との対応関係を、下表に記載する: The correspondence between the amino acid sequences of these proteases and the base sequences of the genes (protease genes) encoding them is shown in the following table:
(1-2)選択マーカー遺伝子
選択マーカー遺伝子は、糸状菌体内、特にアスペルギルス属糸状菌体内で選択マーカーとして機能するもの、すなわち発現できるものであればよいが、好ましくは糸状菌、特にアスペルギルス属糸状菌に由来する選択マーカー遺伝子である。かかる選択マーカー遺伝子として、例えば、niaD(Biosci.Biotechnol.Biochem.,59,1795-1797(1995))、argB(Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984))、sC(Gene, 84, 329-334, (1989))、ptrA(Biosci Biotechnol Biochem, 64, 1416-1421, (2000))、pyrG(Biochem Biophys Res Commun, 112, 284-289, (1983)),amdS(Gene, 26, 205-221, (1983))、オーレオバシジン耐性遺伝子(Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999))、ベノミル耐性遺伝子(Proc Natl Acad Sci USA, 83, 4869-4873, (1986))、及びハイグロマイシン耐性遺伝子(Gene, 57, 21-26, (1987))から選ばれるマーカー遺伝子を挙げることができる。
(1-2) Selection marker gene The selection marker gene may be any one that functions as a selectable marker in filamentous fungi, particularly Aspergillus sp., That is, can be expressed, but is preferably a filamentous fungus, particularly Aspergillus sp. It is a selectable marker gene derived from bacteria. Examples of such selectable marker genes include niaD (Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1795-1797 (1995)), argB (Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984)), sC (Gene, 84, 329-334, (1989)), ptrA (Biosci Biotechnol Biochem, 64, 1416-1421, (2000)), pyrG (Biochem Biophys Res Commun, 112, 284-289, (1983)), amdS (Gene, 26, 205-221, (1983)), aureobasidin resistance gene (Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999)), benomyl resistance gene (Proc Natl Acad Sci USA, 83, 4869-4873, (1986)) And a marker gene selected from a hygromycin resistance gene (Gene, 57, 21-26, (1987)).
これらの選択マーカー遺伝子は、上記文献に記載された配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、アスペルギルス属糸状菌の染色体DNAを鋳型としてPCRを行う方法、または上記文献に記載された配列に基づいて設計されたプローブを用いてアスペルギルス属糸状菌の染色体DNAライブラリーからハイブリダイゼーションにより取得する方法などにより容易に入手することができる。また、宿主の糸状菌として、例えばロイシン要求性などの栄養要求性変異株を用いる場合、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。例えば、宿主がロイシン要求性変異株である場合、そのロイシン要求性を相補できる選択マーカー遺伝子を用いることができ、かかる遺伝子としてはβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするアスペルギルス・ニジュランス由来の遺伝子ANleu2およびアスペルギルス・オリゼ由来の遺伝子leu2を挙げることができる。なお、これらの場合、宿主として用いる糸状菌は、選定された選択マーカーについての機能的遺伝子を有していない株を用いる必要がある。 These selectable marker genes can be obtained by PCR using primers designed based on the sequences described in the above-mentioned literature and using the chromosome DNA of Aspergillus filamentous fungi as a template, or based on the sequences described in the above-mentioned literature. It can be easily obtained by a method of obtaining from a chromosomal DNA library of Aspergillus filamentous fungi using a designed probe. In addition, when an auxotrophic mutant such as leucine auxotrophy is used as the host filamentous fungus, a wild-type gene that complements the auxotrophy can also be used as a selection marker gene. For example, when the host is a leucine-requiring mutant, a selectable marker gene that can complement the leucine requirement can be used, such as the gene ANleu2 derived from Aspergillus nidulans encoding β-isopropylmalate dehydrogenase and A gene leu2 derived from Aspergillus oryzae can be mentioned. In these cases, it is necessary to use a strain that does not have a functional gene for the selected selection marker as the filamentous fungus used as a host.
(1-3)プロモーター
プロモーターは、糸状菌体内、特にアスペルギルス属糸状菌体内でプロモーターとして機能するものであればよいが、好ましくは糸状菌、特にアスペルギルス属糸状菌に由来するプロモーターである。かかるプロモーターとして具体的には、例えばα−アミラーゼ遺伝子プロモーターamyB(Biosci Biotechnol Biochem,56,1849-1853,(1992)), グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターglaA(Gene,108,145-150,(1992))、α−グルコシダーゼ遺伝子プロモーターagdA(Curr Genet, 30,432-438,(1996))、マンガンSOD遺伝子プロモーターsodM(特開2000-224381号公報)、チロシナーゼ遺伝子プロモーターmelO(特開2001−046078号公報)、グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターglaB(特開2000−245465号公報、特開平11−243965号公報)等が挙げられる。液体培養に特異的な高発現プロモーターとして、好ましくはsodM、およびmelOを挙げることができ、また固体培養に特異的な高発現プロモーターとして、好ましくはglaBを挙げることができる。
(1-3) Promoter The promoter is not particularly limited as long as it functions as a promoter in filamentous fungi, particularly Aspergillus sp., But is preferably a promoter derived from filamentous fungi, particularly Aspergillus sp. Specific examples of such promoters include, for example, α-amylase gene promoter amyB (Biosci Biotechnol Biochem, 56, 1849-1853, (1992)), glucoamylase gene promoter glaA (Gene, 108, 145-150, (1992)), α-glucosidase gene promoter agdA (Curr Genet, 30, 432-438, (1996)), manganese SOD gene promoter sodM (JP 2000-224381), tyrosinase gene promoter melO (JP 2001-046078), Examples include glucoamylase gene promoter glaB (JP 2000-245465 A, JP 11-243965 A). Preferred examples of the high expression promoter specific to liquid culture include sodM and melO. Preferred examples of the high expression promoter specific to solid culture include glaB.
発現ベクターにおけるプロモーターの位置は、糸状菌体内でプロモーターが機能し、所望のプロテアーゼが発現し産生できる位置であれば、特に限定されないが、通常、プロテアーゼ遺伝子配列の上流域に配置される。 The position of the promoter in the expression vector is not particularly limited as long as the promoter functions in the filamentous fungus and can express and produce a desired protease, but is usually located upstream of the protease gene sequence.
(1-4)ターミネーター
ターミネーターは、糸状菌体内、特にアスペルギルス属糸状菌体内でターミネーターとして機能するものであればよいが、好ましくは糸状菌、特にアスペルギルス属糸状菌に由来するターミネーターである。好ましくはアスペルギルス属、より好ましくはアスペルギルス・オリゼに由来する、例えばα−アミラーゼ遺伝子のターミネーター、またはグルコアミラーゼ(glaB)ターミネーター(Gene. 207, 127-134,(1998))等を挙げることができる。
(1-4) Terminator The terminator is not particularly limited as long as it functions as a terminator in filamentous fungi, particularly Aspergillus sp., But is preferably a terminator derived from a filamentous fungus, particularly Aspergillus sp. Preferred examples include the terminator of the α-amylase gene or the glucoamylase (glaB) terminator (Gene. 207, 127-134, (1998)) derived from the genus Aspergillus, more preferably from Aspergillus oryzae.
(1-5)糸状菌用発現ベクター
本発明の糸状菌用発現ベクターは、これらの選択マーカー遺伝子、プロモーター、プロテアーゼ遺伝子、およびターミネーターが、直接連結されてなるものであってもよいが、それらの間に1〜2000塩基程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。但し、これらのヌクレオチドの配列は糸状菌由来、好ましくはアスペルギルス属糸状菌に由来する配列であることが望ましい。例えば、目的とするプロテアーゼが菌体内タンパク質として生産されるものである場合は、目的とするプロテアーゼの遺伝子のオープンリーディングフレームに隣接して、上流に糸状菌、好ましくはアスペルギルス属糸状菌の既知分泌タンパク質の遺伝子を配置してもよく、こうすることにより、目的とするプロテアーゼは、上記分泌タンパク質との融合タンパク質として発現産生され、斯くして産生された融合タンパク質は菌体外に分泌される。また、その他のヌクレオチドとして、通常ベクターが備える制限酵素切断部位などを備えていてもよい。
(1-5) Expression vector for filamentous fungi The expression vector for filamentous fungi of the present invention may be one in which these selection marker genes, promoters, protease genes, and terminators are directly linked. A nucleotide of about 1 to 2000 bases may be sandwiched between them. However, these nucleotide sequences are preferably derived from filamentous fungi, and preferably from Aspergillus spp. For example, when the target protease is produced as an intracellular protein, a known secreted protein of a filamentous fungus, preferably an Aspergillus spp., Adjacent to the open reading frame of the target protease gene The target protease is expressed and produced as a fusion protein with the secretory protein, and the fusion protein thus produced is secreted outside the cells. Further, as other nucleotides, a restriction enzyme cleavage site or the like usually provided in a vector may be provided.
なお、アスペルギルス属糸状菌の分泌タンパク質としては、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、キシラナーゼ、ガラクトシダーゼ、フラクトフラノシダーゼ、キシロシダーゼ、ペクチンリアーゼ、およびフィターゼなどが知られている。 The secretory proteins of Aspergillus fungi include α-amylase, glucoamylase, α-glucosidase, endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, acid protease, neutral protease, alkaline protease, carboxypeptidase, lipase, Phospholipases, xylanases, galactosidases, fructofuranosidases, xylosidases, pectin lyases, phytases and the like are known.
また本発明には、直鎖状の糸状菌用発現ベクターおよび環状の糸状菌用発現ベクターの両者が含まれるが、(1)構築したプラスミドから1ステップのPCRで取得できるなど、環状の発現ベクターと比べて少ないステップで調製することができること、(2)宿主としてロイシン要求性変異株を使用する場合に、当該変異を直接相補することができること、および(3)形質転換効率が環状の発現ベクターと比べて高いという点から、好ましくは直鎖状の糸状菌用発現ベクターである。 In addition, the present invention includes both linear filamentous fungus expression vectors and circular filamentous fungus expression vectors. (1) A circular expression vector that can be obtained from the constructed plasmid by one-step PCR. (2) When using a leucine-requiring mutant as a host, the mutation can be directly complemented, and (3) an expression vector with a circular transformation efficiency. From the standpoint of being higher than the above, linear expression vectors for filamentous fungi are preferred.
(2)形質転換体
本発明の形質転換体は、前述する本発明の糸状菌用発現ベクターで糸状菌を形質転換したものである。
(2) Transformant The transformant of the present invention is obtained by transforming a filamentous fungus with the aforementioned expression vector for filamentous fungi of the present invention.
宿主は糸状菌であればよいが、高いプロモーター活性を発現させるためには、アスペルギルス属の菌株が好ましく、特にアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terrus)、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)等のアスペルギルス属糸状菌が好ましい。これらの中では、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・グラウカスなどが食品産業において有用な菌種である。高いタンパク質生産能及び醸造微生物としての安全性の点で、特にアスペルギルス・オリゼを宿主とすることが好ましい。なお、宿主として用いる糸状菌は、野生株に限らず、糸状菌に由来するものであれば、その変異株であってもよい。かかる変異株としては、前述する選択マーカーに関する機能的遺伝子を有さないように変異してなる株を挙げることができ、具体的には正常にロイシンの生合成ができないようにロイシン生合成を担う遺伝子が変異または欠失しているロイシン要求性変異株:正常にアルギニンの生合成ができないようにアルギニン生合成を担う遺伝子が変異または欠失しているアルギニン要求性変異株:正常にメチオニンの生合成ができないようにメチオニン生合成を担う遺伝子が変異または欠失しているメチオニン要求性変異株:正常にヒスチジンの生合成ができないようにヒスチジン生合成を担う遺伝子が変異または欠失しているヒスチジン要求性変異株:正常に硝酸が資化できないように硝酸資化性遺伝子が変異または欠失しているniaD変異株:正常に硝酸イオンが資化できないように硝酸イオン資化性遺伝子が欠失しているsC変異株などを挙げることができる。 The host may be a filamentous fungus, but in order to express a high promoter activity, a strain of the genus Aspergillus is preferable, and in particular, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachii (Aspergillus kawachii) ), Aspergillus awamori, Aspergillus saitoi, Aspergillus sojae, Aspergillus tamarii, Aspergillus glaucus, Aspergillus glaucus, Aspergillus glaucus, Aspergillus glaucus, Aspergillus glaucus Aspergillus flavus, Aspergillus terrus, Aspergillus nidulans and other Aspergillus nidulans are preferred. Among these, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachi, Aspergillus awamori, Aspergillus saito, Aspergillus sojae, Aspergillus tamari, Aspergillus glaucus are useful bacterial species in the food industry. From the viewpoint of high protein production ability and safety as a brewing microorganism, it is particularly preferable to use Aspergillus oryzae as a host. The filamentous fungi used as the host are not limited to wild strains, and may be mutants thereof as long as they are derived from filamentous fungi. Examples of such mutant strains include strains that are mutated so as not to have a functional gene related to the selection marker described above, and specifically, are responsible for leucine biosynthesis so that leucine cannot be normally biosynthesized. A leucine-requiring mutant in which a gene is mutated or deleted: an arginine-requiring mutant in which a gene responsible for arginine biosynthesis is mutated or deleted so that arginine biosynthesis cannot be normally performed: normal methionine production A methionine-requiring mutant in which the gene responsible for methionine biosynthesis is mutated or deleted so that synthesis cannot be performed: histidine in which the gene responsible for histidine biosynthesis is mutated or deleted so that histidine biosynthesis cannot be performed normally Requirement mutant: niaD mutant with a nitrate-assimilating gene mutated or deleted so that nitrate cannot normally be assimilated: Normal Etc. sC mutants nitrate ions nitrate ions assimilating gene so as not to assimilate are deleted can be exemplified.
宿主の形質転換方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Cohenらの方法(塩化カルシウム法)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110 (1972))、プロトプラスト法(Mol.Gen.Genet.,168:111 (1979))、コンピテント法(J.Mol.Biol.,56:209 (1971))、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。 The host transformation method is not particularly limited, and can be performed using a conventionally known method. For example, the method of Cohen et al. (Calcium chloride method) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)), protoplast method (Mol. Gen. Genet., 168: 111 (1979)), competent Method (J. Mol. Biol., 56: 209 (1971)), electroporation method and the like.
(3)プロテアーゼの生産方法
本発明のプロテアーゼの生産方法は、前述した本発明の糸状菌の形質転換体を培養する工程と、培養物から目的タンパク質を回収する工程を含む。
(3) Protease Production Method The protease production method of the present invention includes a step of culturing the aforementioned filamentous fungus transformant of the present invention and a step of recovering the target protein from the culture.
培養工程は、固体培地を用いる固体培養、または液体培地を用いる液体培養のいずれでも行うことができる。好ましくは液体培地を用いた液体培養である。 The culturing step can be performed by either solid culture using a solid medium or liquid culture using a liquid medium. Liquid culture using a liquid medium is preferred.
固体培地としては、糸状菌の培養に使用される公知の固体培地を制限なく使用することができる。固体培地とはその固形の支持担体が栄養源を含むか、又は固形の支持担体に栄養源が添加されものであり、そこに糸状菌が生育できる固形培地を指し示す。このような固体培地として主に、フスマ(小麦などの穀物の殻)、デンプン粉末、米・小麦・大豆の生あるいは蒸したもの、更にはメンブレンや多孔質の人工物(例えば園芸に使われるバーミキュライト)等に栄養源を添加したもの等が挙げられる。特にフスマ、蒸した米が好ましい。 As the solid medium, a known solid medium used for culturing filamentous fungi can be used without limitation. The solid medium refers to a solid medium in which the solid support carrier contains a nutrient source or a nutrient source is added to the solid support carrier, on which filamentous fungi can grow. Such solid media mainly include bran (cereal shells such as wheat), starch powder, raw or steamed rice / wheat / soybean, and membranes and porous artifacts (eg vermiculite used in horticulture) ) And the like to which a nutrient source is added. In particular, bran and steamed rice are preferred.
また、液体培地は、糸状菌の培養に使用される公知の液体培地を制限なく使用できる。例えば、用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが挙げられる。また無機もしくは有機窒素源(例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等)が挙げられる。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源[例えば、無機塩(例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム)、ビタミン類(例えば、ビタミンB1)、抗生物質(例えば、アンピシリン、カナマイシン)など]を培地中に添加してもよい。具体的な液体培地としては、例えば、ポテトデキストロース培地(ニッスイ社)、または最少培地(2%グルコース(又はスターチ)、0.3% NaNO3、0.2% KCl、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4、0.002% FeSO4、pH6.0)等を挙げることができる。なお、これらは1.5%程度の寒天を添加することで、固体培地として調製することもできる。 As the liquid medium, a known liquid medium used for culturing filamentous fungi can be used without limitation. For example, the medium to be used includes those containing carbohydrates such as glucose, fructose, glycerol and starch as a carbon source. Further, inorganic or organic nitrogen sources (for example, ammonium sulfate, ammonium chloride, casein hydrolyzate, yeast extract, polypeptone, bactotryptone, beef extract, etc.) can be mentioned. These carbon sources and nitrogen sources do not need to be used in pure form, and those having low purity are advantageous because they are rich in trace amounts of growth factors and inorganic nutrients. Further, if desired, other nutrient sources [eg, inorganic salts (eg, sodium or potassium diphosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride), vitamins (eg, vitamin B1) Antibiotics (eg, ampicillin, kanamycin, etc.) may be added to the medium. Specific liquid media include, for example, potato dextrose medium (Nissui), or minimal medium (2% glucose (or starch), 0.3% NaNO 3 , 0.2% KCl, 0.1% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 , 0.002% FeSO 4 , pH 6.0) and the like. These can also be prepared as a solid medium by adding about 1.5% agar.
形質転換体の培養は、通常pH5.5〜8.5、好ましくはpH6〜8のpH条件;通常25〜42℃、好適には30〜37℃の温度条件で行うことができる。培養時間は、その他の条件によって異なるが、通常2〜7日間程度、好ましくは3〜5日間程度を挙げることができる。 The transformant can be cultured usually at pH 5.5 to 8.5, preferably pH 6 to 8; usually 25 to 42 ° C, preferably 30 to 37 ° C. The culture time varies depending on other conditions, but is usually about 2 to 7 days, preferably about 3 to 5 days.
本発明の方法によれば、実施例で示すように目的とするプロテアーゼ(配列番号1〜10)が菌体外に生成される。このため、プロテアーゼの取得に際しては、培養上清を回収すればよい。また寒天培地などのように固体培地を使用する場合も培養上清としての寒天培地を回収すればよい。さらに、これらの上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティなどの各種クロマトグラフィーに供することにより目的とするプロテアーゼを単離し回収することができる。 According to the method of the present invention, the target protease (SEQ ID NO: 1 to 10) is produced outside the cells as shown in the Examples. For this reason, the culture supernatant may be recovered upon obtaining the protease. Moreover, what is necessary is just to collect | recover the agar medium as a culture supernatant also when using a solid medium like an agar medium. Furthermore, the target protease can be isolated and recovered by subjecting these supernatants to various known chromatographic methods such as ion exchange, hydrophobicity, gel filtration, and affinity.
(4)セルフクローニングベクターおよびセルフクローニング株
本発明において、好ましい糸状菌発現ベクターは、糸状菌に由来する選択マーカー遺伝子、糸状菌に由来するプロモーター、糸状菌に由来するプロテアーゼ遺伝子、および糸状菌に由来するターミネーターを含む、実質的に糸状菌に由来するヌクレオチドだけからなるセルフクローニングベクターである。また本発明において、好ましい形質転換体は、上記セルフクローニングベクターで形質転換してなる糸状菌である。糸状菌のなかでも好ましくは麹菌であり、麹菌のなかでも好ましくはアスペルギルス属に属する麹菌である。
(4) Self-cloning vector and self-cloning strain In the present invention, preferable filamentous fungus expression vectors are derived from a selectable marker gene derived from a filamentous fungus, a promoter derived from a filamentous fungus, a protease gene derived from a filamentous fungus, and a filamentous fungus. And a self-cloning vector consisting essentially of nucleotides derived from filamentous fungi. In the present invention, a preferred transformant is a filamentous fungus obtained by transformation with the above self-cloning vector. Among the filamentous fungi, a koji mold is preferable, and among the koji molds, a koji mold belonging to the genus Aspergillus is preferable.
なお、本発明において「セルフクローニング株」とは、前述するように実質的に宿主糸状菌種と同種の生物由来のヌクレオチドから構成される株をいう。また糸状菌に由来しないヌクレオチドが含まれる場合も、せいぜい1〜10塩基程度、特に6〜10塩基程度である。この程度の大きさの挿入配列は、例えば制限酵素部位を導入するために挿入される場合がある。 In the present invention, the “self-cloning strain” refers to a strain composed substantially of nucleotides derived from the same species as the host filamentous fungus as described above. Moreover, when nucleotides not derived from filamentous fungi are included, it is at most about 1 to 10 bases, particularly about 6 to 10 bases. An insertion sequence of this size may be inserted, for example, to introduce a restriction enzyme site.
宿主の糸状菌としては、マーカー遺伝子、プロモーター、ターミネーター及び発現させるプロテアーゼ遺伝子が由来する糸状菌、好ましくはアスペルギルス属糸状菌と同種の菌株が用いられる。形質転換株が容易に選択できるように、導入するマーカー遺伝子と同一またはそれと同機能の遺伝子が欠失または変異した変異株を用いることが好ましい。この場合は、上記で説明した糸状菌用発現ベクターを用いて上記変異株を形質転換した後、導入されたマーカー遺伝子の発現を指標とすることによって、糸状菌用発現ベクター中の目的プロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選択することができる。 As the host filamentous fungus, a filamentous fungus from which the marker gene, promoter, terminator and protease gene to be expressed are derived, preferably a strain of the same type as the Aspergillus spp. It is preferable to use a mutant strain in which a gene having the same function as or a function of the marker gene to be introduced is deleted or mutated so that a transformant can be easily selected. In this case, after transforming the mutant strain using the filamentous fungus expression vector described above, the target protease gene in the filamentous fungus expression vector is expressed by using the expression of the introduced marker gene as an index. The introduced transformant can be selected.
また、導入するマーカー遺伝子と同一またはそれと同機能の遺伝子が欠失または変異していないアスペルギルス属糸状菌を宿主として用いることもできる。この場合は、目的とするプロテアーゼ遺伝子の発現又はその発現量の増大などを指標とすることによって形質転換体を選択することができる。形質転換方法は、特に限定されず、PEG−カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法を制限なく採用できる。 In addition, Aspergillus filamentous fungi that do not have a deletion or mutation in the same or the same function as the marker gene to be introduced can also be used as a host. In this case, a transformant can be selected by using the expression of the target protease gene or an increase in the expression level as an index. The transformation method is not particularly limited, and a known method such as a PEG-calcium method, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, an electroporation method, a lipofection method, or a microinjection method can be employed without limitation.
斯くして得られるセルフクローニング株は、糸状菌、好ましくはアスペルギルス属糸状菌の染色体DNA中に、前述する本発明の糸状菌用発現ベクターが組み込まれた状態で存在し、大腸菌などの異種生物由来のヌクレオチドは実質的に存在しない。 The self-cloning strain thus obtained is present in a state in which the above-described expression vector for filamentous fungi of the present invention is incorporated in the chromosomal DNA of a filamentous fungus, preferably Aspergillus sp. This nucleotide is substantially absent.
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、一般的な実験方法は、実験書(サムブルックら(Sambrook, J.)のMolecular Cloning:A Laboratory Manual 第3版)に従った。また、下記の実施例において、すべてのPCRは、LA−Taq(宝ホールディングス)を用いて行った。なお、下記実施例において、麹菌(Aspergillus oryzae)として、OSI 1013株を使用した。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these. In addition, the general experiment method followed the experiment book (Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition). In the following examples, all PCRs were performed using LA-Taq (Takara Holdings). In the following Examples, OSI 1013 strain was used as Aspergillus oryzae.
また、下記の実施例において各プロテアーゼに付随して記載されるAO番号は、GOGAN〔nite(独立行政法人製品評価技術基盤機構)のGenome Analysis Centerでシークエンスされた微生物のゲノムデータベース)(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)に基づく番号であり、Aspergillus oryzaeに由来するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。 In addition, in the following examples, the AO number described accompanying each protease is GOGAN [microorganism genome database sequenced at Genome Analysis Center of nite (National Institute of Technology and Evaluation) (http: / /www.bio.nite.go.jp/dogan/Top), which means a gene encoding a protein derived from Aspergillus oryzae.
実施例1 糸状菌用発現ベクターカセットの構築
(1)選択マーカー遺伝子(配列番号21)の調製
麹菌(Aspergillus oryzae)のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRにより増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて選択マーカー遺伝子断片を切り出した。
Example 1 Construction of an Expression Vector Cassette for Filamentous Fungi (1) Preparation of Selection Marker Gene (SEQ ID NO: 21) Amplification was performed by PCR under the following conditions using the genomic DNA of Aspergillus oryzae as a template and the following primers. The obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a selection marker gene fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN).
<プライマー>
プライマー1:5’- gcgtggttta ctagctttag tgctaccaaa-3’(配列番号22)
プライマー2:5’- ccgtacgcggggagtgtgcttaaggcgatg -3’ (配列番号23)
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃ 5分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<Primer>
Primer 1: 5'-gcgtggttta ctagctttag tgctaccaaa-3 '(SEQ ID NO: 22)
Primer 2: 5'-ccgtacgcggggagtgtgcttaaggcgatg-3 '(SEQ ID NO: 23)
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C 5 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(2)ターミネーター(配列番号24)の調製
麹菌(Aspergillus oryzae)のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRにより増幅し。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いてターミネーター断片を切り出した。
(2) Preparation of terminator (SEQ ID NO: 24) Amplification was performed by PCR using Aspergillus oryzae genomic DNA as a template and the following primers. The obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a terminator fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN).
<プライマー>
プライマー3:5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTC-3’(配列番号25)
プライマー4:5’- CTGCAGATCGGCTGAAGTTAGGAGCGGCCATTGTC -3’(配列番号26)
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(1分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<Primer>
Primer 3: 5'-ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTC-3 '(SEQ ID NO: 25)
Primer 4: 5'-CTGCAGATCGGCTGAAGTTAGGAGCGGCCATTGTC-3 '(SEQ ID NO: 26)
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (1 minute) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(3)sodMプロモーター(配列番号27)の調製
麹菌(Aspergillus oryzae)のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRにより増幅し。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いてsodMプロモーター断片を切り出した。
(3) Preparation of sodM promoter (SEQ ID NO: 27) Amplification was carried out by PCR under the following conditions using the following primers with genomic DNA of Aspergillus oryzae as a template. The obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, the obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the sodM promoter fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN).
<プライマー>
プライマー5:5’-CTGCAGTTATGTACTCCGTACTCGGTTGAATTAT-3’(配列番号28)
プライマー6:5’-TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGAGGGTTTTGAG-3’(配列番号29)
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(1分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<Primer>
Primer 5: 5'-CTGCAGTTATGTACTCCGTACTCGGTTGAATTAT-3 '(SEQ ID NO: 28)
Primer 6: 5'-TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGAGGGTTTTGAG-3 '(SEQ ID NO: 29)
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (1 minute) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(4)glaAプロモーター(配列番号30)の調製
麹菌(Aspergillus oryzae)のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRにより増幅し。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いてglaAプロモーター断片を切り出した。
(4) Preparation of glaA promoter (SEQ ID NO: 30) Amplified by PCR under the following conditions using aspergillus oryzae genomic DNA as a template and the following primers. The obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, the obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the glaA promoter fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN).
<プライマー>
プライマー7:5’- GAATTCTGTA GCTGCTCTAT TTCTATTACT -3’(配列番号31)
プライマー8:5’- CTTGCTTCGACTTCGTTTGCTGATGTG -3’(配列番号32)
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(1分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<Primer>
Primer 7: 5'-GAATTCTGTA GCTGCTCTAT TTCTATTACT-3 '(SEQ ID NO: 31)
Primer 8: 5'-CTTGCTTCGACTTCGTTTGCTGATGTG-3 '(SEQ ID NO: 32)
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (1 minute) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(5)糸状菌用発現ベクターカセットの調製
麹菌用発現ベクターを、pUC118(タカラバイオ、日本)を基本プラスミドとして用いて、次のようにして作成した。
(5) Preparation of Expression Vector Cassette for Filamentous Fungi An expression vector for Aspergillus was prepared as follows using pUC118 (Takara Bio, Japan) as a basic plasmid.
pUC118のSmaI部位に、上記で調製した選択マーカー遺伝子(配列番号21)を、Blunting High(東洋紡、日本)により平滑末端化させて、DNA Ligation Kit ver.1(タカラバイオ、日本)によりサブクローニングした。当該プラスミドをpUCL1とした。 The selective marker gene (SEQ ID NO: 21) prepared above was blunt-ended at the SmaI site of pUC118 with Blunting High (Toyobo, Japan) and subcloned with DNA Ligation Kit ver. 1 (Takara Bio, Japan). This plasmid was designated as pUCL1.
次に、このpUCL1に、上記で調製し、Blunting High(東洋紡、日本)により平滑末端化させたターミネーターをサブクローニングした。具体的には、上記pUCL1を鋳型として、プライマー2(配列番号23)とプライマー9(5’- ggggatcctctagagtcgacctgca -3’(配列番号33))を用いて、下記条件でPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、ベクターを調製した。 Next, a terminator prepared as described above and blunt-ended by Blunting High (Toyobo, Japan) was subcloned into pUCL1. Specifically, PCR was performed under the following conditions using primer 2 (SEQ ID NO: 23) and primer 9 (5′-ggggatcctctagagtcgacctgca-3 ′ (SEQ ID NO: 33)) using pUCL1 as a template. The amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target fragment was excised using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) to prepare a vector.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(7分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (7 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
得られたベクターと上記で調製したターミネーター断片を、DNA Ligation Kit ver.1(タカラバイオ、日本)によりサブクローニングし、得られたプラスミドをpUCLT1とした。 The obtained vector and the terminator fragment prepared above were subcloned using DNA Ligation Kit ver. 1 (Takara Bio, Japan), and the resulting plasmid was designated as pUCLT1.
次に、下記の方法を用いてpUCLT1にプロモーター(sodMプロモーター、glaAプロモーター)をサブクローニングした。 Next, a promoter (sodM promoter, glaA promoter) was subcloned into pUCLT1 using the following method.
(a)sodMプロモーターのサブクローニング
pUCLT1に、上記で調製したsodMプロモーター(配列番号27)をサブクローニングした。具体的には、上記pUCLT1を鋳型として、プライマー2(配列番号23)とプライマー3(配列番号25)を用いてPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、ベクターを調製した。
(A) Subcloning of sodM promoter
The sodM promoter (SEQ ID NO: 27) prepared above was subcloned into pUCLT1. Specifically, PCR was performed using primer 2 (SEQ ID NO: 23) and primer 3 (SEQ ID NO: 25) using pUCLT1 as a template, and the obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and QIAquick Gel Extraction The target fragment was excised using a kit (QIAGEN) to prepare a vector.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(8分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (8 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
上記ベクターとsodMプロモーターを、DNA Ligation Kit ver.1(タカラバイオ、日本)によりサブクローニングし、得られたプラスミドをpUCLTS1とした。 The above vector and sodM promoter were subcloned with DNA Ligation Kit ver. 1 (Takara Bio, Japan), and the resulting plasmid was designated as pUCLTS1.
(b)glaAプロモーターのサブクローニング
pUCLT1に、上記で調製したglaAプロモーター(配列番号30)をサブクローニングした。具体的には、上記pUCLT1を鋳型として、プライマー2(配列番号23)とプライマー3(配列番号25)を用いてPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、ベクターを調製した。
(B) Subcloning of glaA promoter
The glaA promoter (SEQ ID NO: 30) prepared above was subcloned into pUCLT1. Specifically, PCR was performed using primer 2 (SEQ ID NO: 23) and primer 3 (SEQ ID NO: 25) using pUCLT1 as a template, and the obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and QIAquick Gel Extraction The target fragment was excised using a kit (QIAGEN) to prepare a vector.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃ (30秒)、72℃(8分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (8 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
上記ベクターとglaAプロモーターを、DNA Ligation Kit ver.1(タカラバイオ、日本)によりサブクローニングし、得られたプラスミドをpUCLTA1とした。 The above vector and the glaA promoter were subcloned using DNA Ligation Kit ver. 1 (Takara Bio, Japan), and the resulting plasmid was designated as pUCLTA1.
実施例2 糸状菌用発現ベクターの調製およびセルフクローニングによるアルカリ性プロテアーゼの発現産生
麹菌(Aspergillus oryzae)のアルカリ性プロテアーゼ(AO090003001036)(便宜上、これを「プロテアーゼ1」とする)を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ、産生させた。
Example 2 Preparation of an expression vector for filamentous fungi and expression of alkaline protease by self-cloning Self-cloning using Aspergillus oryzae alkaline protease (AO090003001036) (for convenience, this is referred to as “protease 1”) It was expressed and produced by the method.
(1)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の調製
アルカリ性プロテアーゼのアミノ酸配列を配列番号11に、それをコードするアルカリプロテアーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号1に示す。このアルカリ性プロテアーゼ遺伝子は、下記の方法によって調製した。
(1) Preparation of alkaline protease gene The amino acid sequence of alkaline protease is shown in SEQ ID NO: 11, and the base sequence of the alkaline protease gene encoding it is shown in SEQ ID NO: 1. This alkaline protease gene was prepared by the following method.
麹菌(Aspergillus oryzae)のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて、配列番号1に記載する塩基配列からなる断片を切り出し、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を調製した。 PCR was carried out using Aspergillus oryzae genomic DNA as a template using the following primers, and the resulting PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), SEQ ID NO: 1 A fragment consisting of the base sequence described in (1) was excised to prepare an alkaline protease gene.
<プライマー>
プライマー10:5’- ATGCAGTCCATCAAGCGTACCTTGCTCCTCCTCGG-3’(配列番号34)
プライマー11:5’- TTAAGCGTTACCGTTGTAGGCAAGCAGGTT -3’ (配列番号35)
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(2分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<Primer>
Primer 10: 5′-ATGCAGTCCATCAAGCGTACCTTGCTCCTCCTCGG-3 ′ (SEQ ID NO: 34)
Primer 11: 5'-TTAAGCGTTACCGTTGTAGGCAAGCAGGTT-3 '(SEQ ID NO: 35)
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (2 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(2)糸状菌用発現ベクターの調製
(2-1)プラスミドベクター
まず上記pUCLT1を鋳型として、プライマー3(配列番号25)とプライマー6(配列番号29)を用いてPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、これをベクターとした。
(2) Preparation of Expression Vector for Filamentous Fungi (2-1) Plasmid Vector First, PCR was performed using the above pUCLT1 as a template and using primer 3 (SEQ ID NO: 25) and primer 6 (SEQ ID NO: 29), and the resulting PCR The amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, the target fragment was excised using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and this was used as a vector.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(9分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (9 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
得られたベクターと上記で調製したアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を、DNA Ligation Kit ver.1(タカラバイオ、日本)によりサブクローニングした。当該プラスミドをプラスミドベクター(IE-232)とした。 The obtained vector and the alkaline protease gene prepared above were subcloned with DNA Ligation Kit ver. 1 (Takara Bio, Japan). The plasmid was designated as a plasmid vector (IE-232).
(2-2)セルフクローニングベクター
上記で得られたプラスミドベクター(IE-232)を鋳型として、プライマー1(配列番号22)とプライマー4(配列番号26)を用いてPCRを行い、得られたPCR増幅産物をQIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて精製し、これをセルフクローニングベクターとした。
(2-2) Self-cloning vector Using the plasmid vector (IE-232) obtained above as a template, PCR was performed using primer 1 (SEQ ID NO: 22) and primer 4 (SEQ ID NO: 26), and the resulting PCR The amplification product was purified using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and this was used as a self-cloning vector.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(9分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (9 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(3)形質転換体の調製
定法であるPEG−カルシウム法(Mol Gen Genet,218,99-104,(1989))に従って、上記で調製したプラスミドベクター(IE-232)またはセルフクローニングベクター(IE-232)をそれぞれ用いて、ロイシン要求性変異麹菌株を形質転換した。なお、当該ロイシン要求性変異麹菌株は、麹菌(Aspergillus oryzae)のロイシンをコードする遺伝子を変異させて正常なロイシンが合成できないようにした菌株であり、ロイシン要求性を相補する選択マーカー遺伝子が組み込まれなければ、通常、ロイシンを含まない培地では増殖することができない。当該ロイシン要求性変異麹菌株は、Aspergillus oryzae leu-5として、茨城県つくば市東1−1−1つくばセンター中央第6に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている(寄託番号FERM P-20079)。
(3) Preparation of transformant The plasmid vector (IE-232) or self-cloning vector (IE-) prepared above according to the standard method PEG-calcium method (Mol Gen Genet, 218, 99-104, (1989)) 232) were used to transform leucine-requiring mutant strains. The leucine-requiring mutant gonococcal strain is a strain obtained by mutating a gene encoding leucine of Aspergillus oryzae so that normal leucine cannot be synthesized, and a selection marker gene that complements leucine-requiring requirement is incorporated. Otherwise, it usually cannot grow on media without leucine. The leucine-requiring mutant strain is deposited as Aspergillus oryzae leu-5 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, which has an address at Tsukuba Center Center 6-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture. (Deposit number FERM P-20079).
次いで形質転換処理した菌株を、硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス(Czapek-Dox)培地(2%グルコース、0.1%リン酸1水素2カリウム、0.05%塩化カリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.001%硫酸鉄、0.3%硝酸ナトリウム)で培養し、かかる培地で生育できる菌株を選択することにより、プラスミドベクター(IE-232)およびセルフクローニングベクター(IE-232)それぞれについて形質転換体を複数個得た。 The transformed strain was then transformed into a Czapek-Dox medium (2% glucose, 0.1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% potassium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.001) using nitric acid as the single nitrogen source. Multiple transformants for each plasmid vector (IE-232) and self-cloning vector (IE-232) by selecting strains that can grow on this medium. It was.
(3-1)形質転換効率
形質転換効率は、プラスミドベクター(IE-232)が1±0.5/μg-DNAであったのに対して、セルフクローニングベクターは、8.6±3.4/μg-DNAであった。このことから、セルフクローニングベクター(IE-232)を用いると、形質転換効率が、そうでないベクターに比して約8倍も上昇することが確認された。
(3-1) Transformation efficiency The transformation efficiency of plasmid vector (IE-232) was 1 ± 0.5 / μg-DNA, while that of self-cloning vector was 8.6 ± 3.4. / Μg-DNA. From this, it was confirmed that when a self-cloning vector (IE-232) was used, the transformation efficiency was increased by about 8 times compared to a vector that was not.
(3-2)遺伝子導入の有無
サザン解析にて、遺伝子導入の有無を調べた。
(3-2) Presence or absence of gene transfer Presence or absence of gene transfer was examined by Southern analysis.
セルフクローニングベクター(IE-232)とプラスミドベクター(IE-232)による各形質転換体のゲノムDNAを定法により調製し、これをEcoRIで消化し、アガロース電気泳動に供して、Hybond N+メンブレン(アマシャムファルマシア)に転写した。次いで選択マーカー遺伝子(配列番号21)をプローブ(leuAプローブ)にして、Gene Image kit(アマシャムファルマシア)にてサザン解析を行なった。 Genomic DNA of each transformant using a self-cloning vector (IE-232) and a plasmid vector (IE-232) was prepared by a conventional method, digested with EcoRI, subjected to agarose electrophoresis, and Hybond N + membrane (Amersham Pharmacia). ). Next, Southern analysis was performed with Gene Image kit (Amersham Pharmacia) using the selection marker gene (SEQ ID NO: 21) as a probe (leuA probe).
結果を図1に示す。図1からわかるように、宿主株(Host strain)と比較して、プラスミドベクター(IE-232)の形質転換体は1コピー、セルフクローニングベクター(IE-232)の形質転換体は1〜3コピーの遺伝子導入が認められた。このことから、麹菌(Aspergillus oryzae)に由来する遺伝子のみからなるセルフクローニングベクターを用いて麹菌に遺伝子を導入することが可能であることが確認された。 The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, 1 copy of the transformant of the plasmid vector (IE-232) and 1 to 3 copies of the transformant of the self-cloning vector (IE-232) compared to the host strain (Host strain). Gene transfer was observed. From this, it was confirmed that a gene can be introduced into Aspergillus using a self-cloning vector consisting only of a gene derived from Aspergillus oryzae.
(3-3)大腸菌由来配列の有無
次に、サザン解析を用いて、得られた形質転換体に大腸菌に由来する配列が存在するか否かを確認した。
(3-3) Presence / absence of E. coli-derived sequences Next, Southern analysis was used to confirm whether the obtained transformants had E. coli-derived sequences.
まずセルフクローニングベクター(IE-232)とプラスミドベクター(IE-232)による各形質転換体のゲノムDNAをEcoRI消化し、アガロース電気泳動に供して、Hybond N+メンブレン(アマシャムファルマシア)に転写した。次いで、pUC118遺伝子(タカラバイオ、日本)をプローブ(pUCプローブ)にして、Gene Image kit(アマシャムファルマシア)にてサザン解析を行なった。 First, genomic DNA of each transformant using a self-cloning vector (IE-232) and a plasmid vector (IE-232) was digested with EcoRI, subjected to agarose electrophoresis, and transferred to a Hybond N + membrane (Amersham Pharmacia). Next, Southern analysis was performed with Gene Image kit (Amersham Pharmacia) using the pUC118 gene (Takara Bio, Japan) as a probe (pUC probe).
結果を図2に示す。図2からわかるように、プラスミドベクター(IE-232)の形質転換体では大腸菌由来の配列が認められたのに対して、セルフクローニングベクター(IE-232)の形質転換体では大腸菌由来の配列は認められなかった。このことから、当該形質転換体は、麹菌が、麹菌に由来する遺伝子のみで形質転換されてなるセルフクローニング株であることが確認された。 The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, the plasmid vector (IE-232) transformant showed E. coli-derived sequences, whereas the self-cloning vector (IE-232) transformant showed E. coli-derived sequences. I was not able to admit. From this, it was confirmed that the said transformant is a self-cloning strain | stump | stock by which a koji mold is transformed only with the gene derived from a koji mold.
(4)アルカリ性プロテアーゼの産生
上記で調製した各形質転換体を、ポテトデキストロース培地で胞子形成させ、30℃で3日間、GPY液体培地(2%グルコース、1%ペプトン、0.5%酵母エキス、0.1%リン酸1水素2カリウム、0.05%塩化カリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.001%硫酸鉄、0.3%硝酸ナトリウム)で培養した。次いで、培養上清100μlを濃縮乾燥して、SDS−PAGEに供した。また、対照試験として、実施例1で作成したプラスミドpUCLTS1を用いて、麹菌ロイシン要求性変異株を形質転換した株を用いて同様に培養し、SDS−PAGEに供した。
(4) Production of alkaline protease Each of the transformants prepared above was sporulated in a potato dextrose medium, and at 30 ° C. for 3 days, a GPY liquid medium (2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.1% The cells were cultured in 1 potassium dihydrogen phosphate, 0.05% potassium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.001% iron sulfate, and 0.3% sodium nitrate). Next, 100 μl of the culture supernatant was concentrated and dried and subjected to SDS-PAGE. In addition, as a control test, the plasmid pUCLTS1 prepared in Example 1 was used and cultured in the same manner using a strain obtained by transforming a Neisseria gonorrhoeae leucine-requiring mutant, and subjected to SDS-PAGE.
結果を図3に示す。 The results are shown in FIG.
図3に示すように、セルフクローニング株(IE-232)では、対照株では認められないアルカリ性プロテアーゼのバンド(図中、→で示す)が大量に検出された。また、一部のセルフクローニング株では、プラスミドベクターの形質転換体によるアルカリ性プロテアーゼの生産量を上回るものもあった。 As shown in FIG. 3, in the self-cloning strain (IE-232), a large amount of alkaline protease bands (indicated by → in the figure) that were not observed in the control strain were detected. Some of the self-cloning strains exceeded the production of alkaline protease by the plasmid vector transformant.
次いで、培養上清について、プロテアーゼ活性を測定した。 Next, protease activity was measured for the culture supernatant.
プロテアーゼ活性の測定は、50mMトリス緩衝液(pH8.0)に溶解した1.25%アゾカゼイン溶液400μlと培養上清100μlを混合し、37℃で1時間反応した後、1mlの10%トリクロロ酢酸を加え、激しく混合した後、19000xgで5分間遠心分離を行い、上清の吸光度(335nm)を測定した。ブランク値として、培養上清100μlに、1mlの10%トリクロロ酢酸を加え、さらに50mMトリス緩衝液(pH8.0)に溶解した1.25%アゾカゼイン溶液400μlを加え、激しく混合した後、19000xgで5分間遠心分離を行い、上清の吸光度(335nm)を測定した値を用いた。 The protease activity was measured by mixing 400 μl of a 1.25% azocasein solution dissolved in 50 mM Tris buffer (pH 8.0) and 100 μl of culture supernatant, reacting at 37 ° C. for 1 hour, and then adding 1 ml of 10% trichloroacetic acid. After vigorous mixing, the mixture was centrifuged at 19000 × g for 5 minutes, and the absorbance (335 nm) of the supernatant was measured. As a blank value, add 1 ml of 10% trichloroacetic acid to 100 μl of culture supernatant, add 400 μl of 1.25% azocasein solution dissolved in 50 mM Tris buffer (pH 8.0), mix vigorously and then centrifuge at 19000 × g for 5 minutes. After separation, the value obtained by measuring the absorbance (335 nm) of the supernatant was used.
ブランク値を差し引いた対照株の吸光度(OD335)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株の吸光度(OD335)は、最大で2.87であった。このことから、当該セルフクローニング株(IE-232)が、アルカリ性プロテアーゼを発現産生し、菌体外(培地上清)に分泌する菌株であることが確認された。 The absorbance of the control strain minus the blank value (OD335) was not detected, whereas the absorbance of the self-cloning strain minus the blank value (OD335) was 2.87 at maximum. From this, it was confirmed that the self-cloning strain (IE-232) is a strain that expresses and produces alkaline protease and secretes it outside the cell body (medium supernatant).
実施例3 sodMプロモーターを用いた糸状菌用発現ベクターの調製、および種々のプロテアーゼ遺伝子のセルフクローニング発現
麹菌に由来するプロテアーゼ6種類(プロテアーゼ2〜7)を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ産生させた(sodMプロモーター使用)。
Example 3 Preparation of an expression vector for filamentous fungi using sodM promoter and self-cloning expression of various protease genes Six types of proteases (proteases 2 to 7) derived from koji molds were expressed by a self-cloning method using koji molds. Produced (using sodM promoter).
(1)プロテアーゼ遺伝子の調製
表2に示す6種類のプロテアーゼの遺伝子を、麹菌(Aspergillus oryzae)ゲノムDNAを鋳型に、同表に示す各2本のプライマーを用いて、次のPCR条件で増幅して調製した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、プロテアーゼ遺伝子とした。
(1) Preparation of protease genes Six types of protease genes shown in Table 2 were amplified under the following PCR conditions using Aspergillus oryzae genomic DNA as a template and two primers shown in the table. Prepared. The obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) to obtain a protease gene.
<PCR条件>
・96℃ (5分)を1サイクル
・96℃ (20秒)、 60℃ (30秒)、 72℃ (2分)を30サイクル
・72℃ (7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (2 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(2)糸状菌用発現ベクターの調製
(2-1)プラスミドベクター
まずpUCLTS1を鋳型として、プライマー3(配列番号25)とプライマー6(配列番号29)を用いて下記条件でPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、これをベクターとした。
(2) Preparation of an expression vector for filamentous fungi (2-1) Plasmid vector First, pUCLTS1 was used as a template, and PCR was performed using primer 3 (SEQ ID NO: 25) and primer 6 (SEQ ID NO: 29) under the following conditions. The PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, the target fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and this was used as a vector.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(9分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (9 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
斯くして調製したベクターと上記で調製した各プロテアーゼ遺伝子を、DNA Ligation Kit ver.1(タカラバイオ、日本)によりサブクローニングし、各プロテアーゼ遺伝子を組み込んだ6種類のプラスミド(プラスミドベクター)を作成した。なお、以下、これらのプラスミドベクターを各プロテアーゼに対応して下記のように称する。 The vector thus prepared and each of the protease genes prepared above were subcloned using DNA Ligation Kit ver. 1 (Takara Bio, Japan) to prepare six types of plasmids (plasmid vectors) incorporating the respective protease genes. Hereinafter, these plasmid vectors are referred to as follows corresponding to each protease.
(2-2)セルフクローニングベクター
上記6種類のプラスミド(IE233、IE292、IE338、IE339、IE340、IE341)をそれぞれ鋳型として、プライマー1(配列番号22)とプライマー4(配列番号26)を用いて、下記条件でPCRを行って、麹菌の遺伝子部分のみ増幅した。得られたPCR増幅産物を、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて精製し、これをセルフクローニングベクター(IE233、IE292、IE338、IE339、IE340、IE341)とした。
(2-2) Self-cloning vector Using the above six types of plasmids (IE233, IE292, IE338, IE339, IE340, IE341) as templates, respectively, using primer 1 (SEQ ID NO: 22) and primer 4 (SEQ ID NO: 26), PCR was performed under the following conditions to amplify only the gonococcal gene portion. The obtained PCR amplification product was purified using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and this was used as a self-cloning vector (IE233, IE292, IE338, IE339, IE340, IE341).
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(9分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (9 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(3)形質転換体の調製
定法であるPEG−カルシウム法に従って、上記で調製した各セルフクローニングベクターを用いてロイシン要求性変異麹菌株(Aspergillus oryzae leu-5(寄託番号:FERM P-20079))を形質転換した。これを、硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス(Czapek-Dox)培地で培養し、この培地で生育できる菌株を選択することにより、各セルフクローニングベクターにつきそれぞれ10個の形質転換体を取得した。これらすべての形質転換体についてサザン解析を行い、いずれもが大腸菌由来の遺伝子が含まれないセルフクローニング株であることを確認した。
(3) Preparation of transformant According to the standard method of PEG-calcium, leucine-requiring mutant strains (Aspergillus oryzae leu-5 (deposit number: FERM P-20079)) using each of the self-cloning vectors prepared above Was transformed. This is cultured in a Czapek-Dox medium containing nitric acid as a single nitrogen source, and 10 transformants are obtained for each self-cloning vector by selecting strains that can grow on this medium. did. All these transformants were subjected to Southern analysis, and all were confirmed to be self-cloning strains that do not contain E. coli-derived genes.
(4)プロテアーゼの産生
上記で調製した各形質転換体を、ポテトデキストロース培地で胞子形成させ、30℃で3日間、GPY液体培地(2%グルコース、1%ペプトン、0.5%酵母エキス、0.1%リン酸1水素2カリウム、0.05%塩化カリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.001%硫酸鉄、0.3%硝酸ナトリウム)で培養した。次いで、その培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した。また、対照試験として、実施例1で作成したpUCLTS1を用いて、麹菌ロイシン要求性変異株を形質転換した株を用いて同様に培養し、培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した(対照株)。その結果、対照株は、菌体外(培養上清)にプロテアーゼは確認できなかったのに対して、形質転換体(セルフクローニング株)はいずれも菌体外(培養上清)にプロテアーゼが生成していることが明確に確認できた。
(4) Protease production Each of the transformants prepared above was sporulated in a potato dextrose medium, and at 30 ° C. for 3 days, a GPY liquid medium (2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.1% phosphorus) 1 potassium hydrogen acid, 0.05% potassium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.001% iron sulfate, 0.3% sodium nitrate). Next, 100 μl of the culture supernatant was concentrated and dried and subjected to SDS-PAGE. As a control test, pUCLTS1 prepared in Example 1 was used to culture in the same manner using a strain obtained by transforming a gonococcal leucine-requiring mutant, 100 μl of the culture supernatant was concentrated and dried, and then subjected to SDS-PAGE. Provided (control strain). As a result, no protease was confirmed outside the cell (culture supernatant) in the control strain, whereas protease was produced outside the cell (culture supernatant) in any of the transformants (self-cloning strain). I was able to confirm clearly.
各セルフクローニング株(IE233、IE292、IE338、IE339、IE340、IE341)のプロテアーゼの産生およびプロテアーゼ活性を測定した結果は下記の通りである。 The results of measuring the protease production and protease activity of each self-cloning strain (IE233, IE292, IE338, IE339, IE340, IE341) are as follows.
(4-1)セルフクローニング株(IE-233)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を、対照株の結果と併せて図4に示す。図4に示すように、セルフクローニング株(IE-233)では、対照株にないプロテアーゼのバンドが大量に検出された。
(4-1) Self-cloning strain (IE-233)
(a) Protease Production FIG. 4 shows the result of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE together with the result of the control strain. As shown in FIG. 4, in the self-cloning strain (IE-233), a large amount of protease bands not found in the control strain were detected.
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清についてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、50mMトリス緩衝液(pH7.0)に溶解した1.25%アゾカゼイン溶液400μlと、培養上清100μlを混合し、37℃で1時間反応させた後、1mlの10%トリクロロ酢酸を加え、激しく混合した。次いで19000xgで5分間遠心分離を行い、上清の吸光度(335nm)を測定した。ブランク値として、培養上清100μlに、1mlの10%トリクロロ酢酸を加え、さらに50mMトリス緩衝液(pH7.0)に溶解した1.25%アゾカゼイン溶液400μlを加え、激しく混合した後、19000xgで5分間遠心分離を行い、上清の吸光度(335nm)を測定した値を用いた。ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD335)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株の培養上清の吸光度(OD335)は、最大で3.42であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured for the culture supernatant. The measurement was performed by mixing 400 μl of a 1.25% azocasein solution dissolved in 50 mM Tris buffer (pH 7.0) and 100 μl of culture supernatant, reacting at 37 ° C. for 1 hour, and then adding 1 ml of 10% trichloroacetic acid. Mixed. Subsequently, centrifugation was performed at 19000 × g for 5 minutes, and the absorbance (335 nm) of the supernatant was measured. As a blank value, add 1 ml of 10% trichloroacetic acid to 100 μl of culture supernatant, add 400 μl of 1.25% azocasein solution dissolved in 50 mM Tris buffer (pH 7.0), mix vigorously, and then centrifuge at 19000 × g for 5 minutes. After separation, the value obtained by measuring the absorbance (335 nm) of the supernatant was used. The absorbance (OD335) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance (OD335) of the culture supernatant of the self-cloning strain minus the blank value was 3.42 at the maximum. Met.
(4-2)セルフクローニング株(IE-292)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を、対照株の結果と併せて図5に示す。図5に示すように、セルフクローニング株(IE-292)では、対照株にないプロテアーゼのバンドが大量に検出された。
(4-2) Self-cloning strain (IE-292)
(a) Protease production FIG. 5 shows the result of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE together with the result of the control strain. As shown in FIG. 5, in the self-cloning strain (IE-292), a large amount of protease bands not found in the control strain were detected.
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清についてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、50mMトリス緩衝液(pH7.0)に代えて50mM酢酸緩衝液(pH5.0)を使用する以外は、上記セルフクローニング株(IE-233)と同様に行った。その結果、ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD335)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株の培養上清の吸光度(OD335)は、最大で1.22であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured for the culture supernatant. Measurement was performed in the same manner as the self-cloning strain (IE-233) except that 50 mM acetate buffer (pH 5.0) was used instead of 50 mM Tris buffer (pH 7.0). As a result, the absorbance (OD335) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance (OD335) of the culture supernatant of the self-cloning strain minus the blank value was The maximum was 1.22.
(4-3)セルフクローニング株(IE-338)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を図6に示す。図6に示すように、セルフクローニング株(IE-338)ではバンドが大量に検出された。一方、対照株では対応するバンドは検出されなかった(結果示さず)。
(4-3) Self-cloning strain (IE-338)
(a) Protease production FIG. 6 shows the results of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE. As shown in FIG. 6, a large amount of bands were detected in the self-cloning strain (IE-338). On the other hand, no corresponding band was detected in the control strain (results not shown).
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清についてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、キッコーマン醸造分析キットである「酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット」を用いて行った。この原理は、基質のカルボベンゾキシ-L-チロシルL-アラニンが酸性カルボキシペプチダーゼによって分解されると、L-アラニンを生じる。生成したL-アラニンは、NAD+の存在下でアラニンデヒドロゲナーゼを添加することによって特異的に分解され、NADHが生成する。そこで生成したNADHをテトラゾリウム塩、PMSで発色させ、吸光度(460nm)で定量するというものである。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured for the culture supernatant. The measurement was performed using an “acid carboxypeptidase measurement kit” which is a Kikkoman brewing analysis kit. This principle yields L-alanine when the substrate carbobenzoxy-L-tyrosyl L-alanine is degraded by acid carboxypeptidase. The produced L-alanine is specifically decomposed by adding alanine dehydrogenase in the presence of NAD + to produce NADH. Therefore, the generated NADH is colored with a tetrazolium salt, PMS, and quantified by absorbance (460 nm).
培養上清100μlについてプロテアーゼ活性を測定した。ブランク値として、基質のカルボベンゾキシ-L-チロシルL-アラニンとの反応前に反応停止液を添加して、同様に測定した値を使用した。ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD460)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株(IE-338)の吸光度(OD460)は、最大で0.69であった。 Protease activity was measured on 100 μl of culture supernatant. As a blank value, a value measured in the same manner after adding a reaction stop solution before the reaction with the substrate carbobenzoxy-L-tyrosyl L-alanine was used. The absorbance (OD460) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance (OD460) of the self-cloning strain (IE-338) minus the blank value was the maximum. It was 0.69.
(4-4)セルフクローニング株(IE-339)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を図6に示す。図6に示すように、セルフクローニング株(IE-339)ではバンドが大量に検出された。一方、対照株では対応するバンドは検出されなかった(結果示さず)。
(4-4) Self-cloning strain (IE-339)
(a) Protease production FIG. 6 shows the results of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE. As shown in FIG. 6, a large amount of bands were detected in the self-cloning strain (IE-339). On the other hand, no corresponding band was detected in the control strain (results not shown).
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清100μlについてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、キッコーマン醸造分析キットである「酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット」を用いて、セルフクローニング株(IE-338)と同様にして行った。ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD460)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株(IE-339)の吸光度(OD460)は、最大で0.89であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured on 100 μl of culture supernatant. The measurement was performed in the same manner as the self-cloning strain (IE-338) using an “acid carboxypeptidase measurement kit” which is a Kikkoman brewing analysis kit. The absorbance (OD460) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance (OD460) of the self-cloning strain (IE-339) minus the blank value was the maximum. 0.89.
(4-5)セルフクローニング株(IE-340)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を図6に示す。図6に示すように、セルフクローニング株(IE-340)ではバンドが大量に検出された。一方、対照株では対応するバンドは検出されなかった(結果示さず)。
(4-5) Self-cloning strain (IE-340)
(a) Protease production FIG. 6 shows the results of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE. As shown in FIG. 6, a large amount of bands were detected in the self-cloning strain (IE-340). On the other hand, no corresponding band was detected in the control strain (results not shown).
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清100μlについてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、キッコーマン醸造分析キットである「酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット」を用いて、セルフクローニング株(IE-338)と同様にして行った。ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD460)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株(IE340)の吸光度(OD460)は、最大で0.89であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured on 100 μl of culture supernatant. The measurement was performed in the same manner as the self-cloning strain (IE-338) using an “acid carboxypeptidase measurement kit” which is a Kikkoman brewing analysis kit. The absorbance (OD460) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance (OD460) of the self-cloning strain (IE340) minus the blank value was 0.89 at maximum. there were.
(4-6)セルフクローニング株(IE-341)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を図6に示す。図6に示すように、セルフクローニング株(IE-341)ではバンドが大量に検出された。一方、対照株では対応するバンドは検出されなかった(結果示さず)。
(4-6) Self-cloning strain (IE-341)
(a) Protease production FIG. 6 shows the results of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE. As shown in FIG. 6, a large amount of bands were detected in the self-cloning strain (IE-341). On the other hand, no corresponding band was detected in the control strain (results not shown).
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清100μlについてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、キッコーマン醸造分析キットである「酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット」を用いて、セルフクローニング株(IE-338)と同様にして行った。ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD460)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株(IE341)の吸光度(OD460)は、最大で0.76であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured on 100 μl of culture supernatant. The measurement was performed in the same manner as the self-cloning strain (IE-338) using an “acid carboxypeptidase measurement kit” which is a Kikkoman brewing analysis kit. The absorbance (OD460) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance (OD460) of the self-cloning strain (IE341) minus the blank value was 0.76 at maximum. there were.
実施例4 glaA プロモーターを用いた糸状菌用発現ベクターの調製、および種々のプロテアーゼ遺伝子のセルフクローニング発現
麹菌に由来するプロテアーゼ3種類(プロテアーゼ8〜10)を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ産生させた(glaAプロモーター(配列番号30)使用)。
Example 4 Preparation of an expression vector for filamentous fungi using glaA promoter and self-cloning expression of various protease genes Three types of proteases derived from Aspergillus (proteases 8 to 10) were expressed by a self-cloning method using Aspergillus. Produced (using glaA promoter (SEQ ID NO: 30)).
(1)プロテアーゼ遺伝子の調製
表4に示す3種類のプロテアーゼの遺伝子を、麹菌(Aspergillus oryzae)ゲノムDNAを鋳型に、同表に示す各2本のプライマーを用いて、次のPCR条件で増幅して調製した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、プロテアーゼ遺伝子とした。
(1) Preparation of protease gene The three types of protease genes shown in Table 4 were amplified under the following PCR conditions using Aspergillus oryzae genomic DNA as a template and two primers shown in the table. Prepared. The obtained PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) to obtain a protease gene.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(2分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (2 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(2)糸状菌用発現ベクターの調製
(2-1)プラスミドベクター
まずpUCLTA1を鋳型として、プライマー3(配列番号25)とプライマー8(配列番号32)を用いて下記条件でPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて目的断片を切り出し、これをベクターとした。
(2) Preparation of an expression vector for filamentous fungi (2-1) Plasmid vector First, pUCLTA1 was used as a template, and PCR was performed using primer 3 (SEQ ID NO: 25) and primer 8 (SEQ ID NO: 32) under the following conditions. The PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, the target fragment was excised using a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and this was used as a vector.
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(9分)を30サイクル
・72℃ (7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (9 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
斯くして調製したベクターと上記で調製した各プロテアーゼ遺伝子を、DNA Ligation Kit ver.1(タカラバイオ、日本)によりサブクローニングし、各プロテアーゼ遺伝子を組み込んだ3種類のプラスミド(プラスミドベクター)を作成した。なお、以下、これらのプラスミドベクターを各プロテアーゼに対応して下記のように称する。 The vector thus prepared and each of the protease genes prepared above were subcloned using DNA Ligation Kit ver. 1 (Takara Bio, Japan) to prepare three types of plasmids (plasmid vectors) incorporating the respective protease genes. Hereinafter, these plasmid vectors are referred to as follows corresponding to each protease.
(2-2)セルフクローニングベクター
上記3種類のプラスミド(IE326、IE327、IE328)をそれぞれ鋳型として、プライマー1(配列番号22)とプライマー4(プライマー26)を用いて、下記条件でPCRを行って、麹菌の遺伝子部分のみ増幅した。得られたPCR増幅産物を、QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN)を用いて精製し、これをセルフクローニングベクター(IE-326、IE-327、IE-328)とした。
(2-2) Self-cloning vector Using the above three types of plasmids (IE326, IE327, IE328) as templates, PCR was performed using primer 1 (SEQ ID NO: 22) and primer 4 (primer 26) under the following conditions. Only the gene part of Aspergillus was amplified. The obtained PCR amplification product was purified using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and this was used as a self-cloning vector (IE-326, IE-327, IE-328).
<PCR条件>
・96℃(5分)を1サイクル
・96℃(20秒)、60℃(30秒)、72℃(9分)を30サイクル
・72℃(7分)を1サイクル。
<PCR conditions>
• 96 ° C (5 minutes) for 1 cycle • 96 ° C (20 seconds), 60 ° C (30 seconds), 72 ° C (9 minutes) for 30 cycles • 72 ° C (7 minutes) for 1 cycle.
(3)形質転換体の調製
定法であるPEG−カルシウム法に従って、上記で調製した各セルフクローニングベクターを用いてロイシン要求性変異麹菌株(Aspergillus oryzae leu-5(寄託番号:FERM P-20079))を形質転換した。これを、硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス(Czapek-Dox)培地で培養し、この培地で生育できる菌株を選択することにより、各セルフクローニングベクターにつきそれぞれ10個の形質転換体を取得した。これらすべての形質転換体についてサザン解析を行い、いずれもが大腸菌由来の遺伝子が含まれないセルフクローニング株であることを確認した。
(3) Preparation of transformant According to the standard method of PEG-calcium, leucine-requiring mutant strains (Aspergillus oryzae leu-5 (deposit number: FERM P-20079)) using each of the self-cloning vectors prepared above Was transformed. This is cultured in a Czapek-Dox medium containing nitric acid as a single nitrogen source, and 10 transformants are obtained for each self-cloning vector by selecting strains that can grow on this medium. did. All these transformants were subjected to Southern analysis, and all were confirmed to be self-cloning strains that do not contain E. coli-derived genes.
(4)プロテアーゼの産生
上記で調製した各形質転換体を、ポテトデキストロース培地で胞子形成させ、30℃で3日間、GPY液体培地(2%グルコース、1%ペプトン、0.5%酵母エキス、0.1%リン酸1水素2カリウム、0.05%塩化カリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.001%硫酸鉄、0.3%硝酸ナトリウム)で培養した。次いで、その培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した。また、対照試験として、実施例1で作成したpUCLTS1を用いて、麹菌ロイシン要求性変異株を形質転換した株を用いて同様に培養し、培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した(対照株)。その結果、対照株は、菌体外(培養上清)にプロテアーゼは確認できなかったのに対して、形質転換体(セルフクローニング株)はいずれも菌体外(培養上清)にプロテアーゼが生成していることが明確に確認できた。
(4) Protease production Each of the transformants prepared above was sporulated in a potato dextrose medium, and at 30 ° C. for 3 days, a GPY liquid medium (2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.1% phosphorus) 1 potassium hydrogen acid, 0.05% potassium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.001% iron sulfate, 0.3% sodium nitrate). Next, 100 μl of the culture supernatant was concentrated and dried and subjected to SDS-PAGE. As a control test, pUCLTS1 prepared in Example 1 was used to culture in the same manner using a strain obtained by transforming a gonococcal leucine-requiring mutant, 100 μl of the culture supernatant was concentrated and dried, and then subjected to SDS-PAGE. Provided (control strain). As a result, no protease was confirmed outside the cell (culture supernatant) in the control strain, whereas protease was produced outside the cell (culture supernatant) in any of the transformants (self-cloning strain). I was able to confirm clearly.
各セルフクローニング株(IE-326、IE-327、IE-328)のプロテアーゼの産生およびプロテアーゼ活性を測定した結果は下記の通りである。 The results of measuring protease production and protease activity of each self-cloning strain (IE-326, IE-327, IE-328) are as follows.
(4-1)セルフクローニング株(IE-326)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を、対照株の結果と併せて図7に示す。図7に示すように、セルフクローニング株(IE-326)では、対照株にないプロテアーゼのバンドが大量に検出された。
(4-1) Self-cloning strain (IE-326)
(a) Protease Production FIG. 7 shows the result of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE together with the result of the control strain. As shown in FIG. 7, in the self-cloning strain (IE-326), a large amount of protease bands not found in the control strain were detected.
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清についてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、50mM酢酸緩衝液(pH3.0)に溶解した1.25%アゾカゼイン溶液400μlと、培養上清100μlを混合し、37℃で1時間反応させた後、1mlの10%トリクロロ酢酸を加え、激しく混合した。次いで19000xgで5分間遠心分離を行い、上清の吸光度(335nm)を測定した。ブランク値として、培養上清100μlに、1mlの10%トリクロロ酢酸を加え、さらに50mM酢酸緩衝液(pH3.0)に溶解した1.25%アゾカゼイン溶液400μlを加え、激しく混合した後、19000xgで5分間遠心分離を行い、上清の吸光度(335nm)を測定した値を用いた。ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD335)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株(IE-326)の培養上清の吸光度(OD335)は、最大で0.84であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured for the culture supernatant. The measurement was performed by mixing 400 μl of a 1.25% azocasein solution dissolved in 50 mM acetate buffer (pH 3.0) and 100 μl of culture supernatant, reacting at 37 ° C. for 1 hour, and then adding 1 ml of 10% trichloroacetic acid. Mixed. Subsequently, centrifugation was performed at 19000 × g for 5 minutes, and the absorbance (335 nm) of the supernatant was measured. As blank values, add 1 ml of 10% trichloroacetic acid to 100 μl of culture supernatant, add 400 μl of 1.25% azocasein solution dissolved in 50 mM acetate buffer (pH 3.0), mix vigorously, and then centrifuge at 19000 × g for 5 minutes. After separation, the value obtained by measuring the absorbance (335 nm) of the supernatant was used. The absorbance (OD335) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance of the culture supernatant of the self-cloning strain (IE-326) minus the blank value (OD335) The maximum was 0.84.
(4-2)セルフクローニング株(IE-327)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を、対照株の結果と併せて図7に示す。図7に示すように、セルフクローニング株(IE-327)では、対照株にないプロテアーゼのバンドが大量に検出された。
(4-2) Self-cloning strain (IE-327)
(a) Protease Production FIG. 7 shows the result of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE together with the result of the control strain. As shown in FIG. 7, in the self-cloning strain (IE-327), a large amount of protease bands not found in the control strain were detected.
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清についてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、50mM酢酸緩衝液(pH3.0)に代えて50mMトリス緩衝液(pH7.0)を使用する以外は、上記セルフクローニング株(IE-326)と同様に行った。その結果、ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD335)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株(IE-327)の培養上清の吸光度(OD335)は、最大で0.45であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured for the culture supernatant. The measurement was performed in the same manner as the above self-cloning strain (IE-326) except that 50 mM Tris buffer (pH 7.0) was used instead of 50 mM acetate buffer (pH 3.0). As a result, the absorbance (OD335) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance of the culture supernatant of the self-cloning strain (IE-327) minus the blank value. (OD335) was 0.45 at the maximum.
(4-3)セルフクローニング株(IE-328)
(a) プロテアーゼの産生
上記方法で培養して得られた培養上清100μlを濃縮乾燥させて、SDS−PAGEに供した結果を図7に示す。図7に示すように、セルフクローニング株(IE-328)では、対照株にないプロテアーゼのバンドが大量に検出された。
(4-3) Self-cloning strain (IE-328)
(a) Protease production FIG. 7 shows the results of concentrating and drying 100 μl of the culture supernatant obtained by culturing by the above method and subjecting it to SDS-PAGE. As shown in FIG. 7, in the self-cloning strain (IE-328), a large amount of protease bands not found in the control strain were detected.
(b) プロテアーゼ活性の測定
培養上清についてプロテアーゼ活性を測定した。測定は、上記セルフクローニング株(IE-327)と同様に、50mM酢酸緩衝液(pH3.0)に代えて50mMトリス緩衝液(pH7.0)を使用する以外は、上記セルフクローニング株(IE-326)と同様の方法で行った。その結果、ブランク値を差し引いた対照株の培養上清の吸光度(OD335)は、非検出であったのに対して、ブランク値を差し引いたセルフクローニング株(IE-328)の培養上清の吸光度(OD335)は、最大で0.63であった。
(b) Measurement of protease activity Protease activity was measured for the culture supernatant. Similar to the self-cloning strain (IE-327), the measurement was performed using the self-cloning strain (IE-327) except that 50 mM Tris buffer (pH 7.0) was used instead of 50 mM acetate buffer (pH 3.0). 326). As a result, the absorbance (OD335) of the culture supernatant of the control strain minus the blank value was not detected, whereas the absorbance of the culture supernatant of the self-cloning strain (IE-328) minus the blank value. (OD335) was 0.63 at the maximum.
配列番号22、23、25、26、28、29、および31〜53は、実施例においてPCR増幅に使用したプラーマー1〜29の塩基配列を示す。
配列番号24は、ターミネーターの塩基配列、配列番号27はsodMプロモーターの塩基配列、および配列番号30はglaAプロモーターの塩基配列をそれぞれ示す。
SEQ ID NOs: 22, 23, 25, 26, 28, 29, and 31 to 53 show the nucleotide sequences of the primers 1 to 29 used for PCR amplification in the examples.
SEQ ID NO: 24 shows the base sequence of the terminator, SEQ ID NO: 27 shows the base sequence of the sodM promoter, and SEQ ID NO: 30 shows the base sequence of the glaA promoter.
Claims (3)
実質的に糸状菌に由来するヌクレオチドだけからなるセルフクローニングベクターであり且つ直鎖状であることを特徴とする、糸状菌用発現ベクター。 A selectable marker gene sequence derived from Aspergillus oryzae , (1) any one selected from the group consisting of a promoter sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and a base sequence set forth in SEQ ID NOS: 1-7 A protease gene consisting of a base sequence or (2) consisting of any one base sequence selected from the group consisting of a promoter sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 30 and a base sequence set forth in SEQ ID NOs: 8-10 An expression vector for a filamentous fungus having a protease gene and a terminator sequence derived from Aspergillus oryzae ,
An expression vector for filamentous fungi, which is a self-cloning vector consisting essentially of nucleotides derived from filamentous fungi and is linear.
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