JP5334029B2 - 大腸菌症に対する保護のためのトリ用エシェリキア・コリのワクチン - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

（技術分野）
本発明は、イー・コリ感染に対する家禽ワクチンに関する。特に、本発明は、家禽、特にニワトリに有用な変異株イー・コリワクチンに関する。本発明はさらに、壊滅的家禽疾患である、イー・コリにより誘発される大腸菌症に対する、噴霧または飲料水を介するワクチンにおいて有用かつ有効である新規ａｒｏＡ遺伝子欠失イー・コリ微生物免疫原にも関する。

（従来技術）
大腸菌症は、家禽において経済的に重要な一般的全身性疾患であり、世界規模で発生する。エシェリキア・コリ（イー・コリ）感染症は、急性致命的敗血症または亜急性心膜炎および気嚢炎、ならびに肝周辺炎、関節炎、および蜂巣炎としても発症する。細菌感染症のなかでも、大腸菌症は非常に多くの場合、家禽における疾患および死亡の第一の原因である。糞便汚染により鶏舎環境中に多数のイー・コリが保有されている。多数の病原性大腸菌が気道または腸から血流に入る場合に全身性感染症が起こる。菌血症は進行して敗血症や死に至るか、または感染症は漿膜表面、心膜、関節および他の器官まで広がる。
文献は、大腸菌症に関連するイー・コリの血清型Ｏ１、Ｏ２およびＯ７８がニワトリおよびシチメンチョウにおいて見いだされる最も一般的な血清型であることを示唆している。多くの単離された菌株も分類不能であり、特に有毒であると考えられる。

処置法は、素因となる感染症または環境的要因の抑制、および抗生物質の早期使用を含む。残念なことに、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン、セファロチン、ストレプトマイシンおよびエリスロマイシンに対する高頻度の耐性が観察されている。多くの菌株も数種の抗生物質に対して耐性である。アンピシリンおよびクロラムフェニコールに対する広範囲に及ぶ感受性も観察されている。
シチメンチョウにおけるイー・コリＯ７８による感染に関連する大腸菌症に対して使用するために利用できる商業的な生イー・コリワクチンがあるが、ニワトリにおいて使用される安全で有効なイー・コリワクチンはないようである。特に、商業的に入手可能な家禽用の生、弱毒化、変異ａｒｏＡ遺伝子欠失イー・コリワクチンはないようである。例えばエアロゾルスプレーまたは飲料水による集団適用に適した特に有効なイー・コリワクチンもないようである。

従って、本発明の目的は、ニワトリにおける使用に好適な、安全かつ有効な生イー・コリワクチンを提供することである。
本発明のもう一つの目的は、ニワトリにおいて使用される場合に安全かつ有効な、家禽における大腸菌症を予防または改善する方法を提供することである。
イー・コリワクチンが集団適用に好適であることが本発明の特徴である。
生ワクチンが宿主において良好な細胞性免疫および良好な体液性免疫のどちらも提供することが本発明の利点である。

（発明の開示）
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＰＴＡ−５０９４で寄託されている株の識別特性を有する、遺伝子が欠失したエシェリキア・コリ変異体、イー・コリａｒｏＡ−微生物を提供する。
本発明はさらに、免疫原的有効量の前記イー・コリａｒｏＡ−微生物および医薬理学的に許容される担体を含む鳥類ワクチン組成物も提供する。
本発明はさらに、家禽における大腸菌症を予防または改善するための方法であって、前記家禽に免疫原的有効量の前記イー・コリａｒｏＡ−微生物を投与することを含む方法を提供する。

さらに本発明の一部として、大腸菌症に対するニワトリおよび他の家禽用ワクチンであって、薬理学的に許容される担体中に免疫原的有効量のイー・コリａｒｏＡ−欠失変異体を含むワクチンが提供される。
本発明の他の特徴は、以下に記載される詳細な記載からさらに明らかになるであろう。

（発明の詳細な記載）
家禽における鳥類大腸菌症はしばしばエシェリキア・コリ（イー・コリ）血清型Ｏ７８と関連する。感染症は、しばしば、マイコプラズマ病、伝染性気管支炎、ニューカッスル病、出血性腸炎またはシチメンチョウ百日咳などの他の家禽集団疾患と接触またはこれに感染した後に、一般的に気道から発生する。ニワトリにおいて、大腸菌症は一般に３から１０週齢の間のブロイラーに影響を及ぼし、高い罹患率および死亡率を伴う。鳥類大腸菌症の最も重い徴候は、心膜炎、肝周囲炎および気嚢炎を特徴とする敗血症である。蜂巣炎も恐るべき問題である。家禽からのイー・コリの単離株は、アンピシリン、クロラムフェニコール、オキシテトラサイクリン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、ニトロフラン、ナリジクス酸、ポリミキシンＢ、スルファンアミドなどの薬物に対して耐性であることが多い。さらに、現在のところ、ニワトリ用の商業的に入手可能なイー・コリワクチンはない。

意外にも、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に２００３年３月２７日にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５０９４で寄託されているイー・コリａｒｏＡ欠失変異体、イー・コリａｒｏＡ−は、ニワトリにおける鳥類大腸菌症に対する使用に安全かつ有効であることが見いだされた。有利なことに、本発明のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４は、ニワトリに投与された場合、良好な細胞性免疫および体液性免疫応答をもたらし、前記イー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４は容易に製造することができ、集団適用、例えば粗スプレー（ｃｏａｒｓｅ ｓｐｒａｙ）または飲料水により投与することができる。
本明細書および請求の範囲において用いられる場合、イー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４なる用語は、ＡＴＣＣに２００３年３月２７日に寄託され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５０９４を付けられたエシェリキア・コリａｒｏＡ欠失変異微生物を表す。この用語は、本明細書において記載されているのと実質的に同じ方法で調製され、これと実質的に同じ免疫原性を有するイー・コリａｒｏＡ−遺伝子欠失変異体の他の株を包含することも意図される。

本発明のイー・コリａｒｏＡ遺伝子欠失変異株は、当業者らが利用可能な培地および技術を用いて、さらに連続的に継代することができる。連続継代は株をさらに弱毒化して、ワクチン免疫原としてさらに好適にするような働きをすることができる。約１０までの連続継代が本発明に含まれるが、約３〜５が好ましい。
本発明のイー・コリａｒｏＡ欠失変異体は、鳥類大腸菌症の病原において重要であることが証明されている１型線毛および鞭毛などの表面付属物が依然として発現されるという明確な利点を有する（ＬａＲａｇｉｏｎｅ，Ｒ．Ｍ．；Ｓａｙｕｓ，Ａ．Ｒ．；およびＷｏｏｄｗａｒｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２０００，１２４：３５１−３６３およびＬａＲａｇｉｏｎｅ，Ｒ．Ｍ．； Ｃｏｏｌｙ， Ｗ．Ａ．；およびＷｏｏｄｗａｒｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，４９：３２７−３３８）。十分に特徴づけられた遺伝子欠失ワクチンが生ワクチンの候補として好ましく、宿主における安全性と高い有効性の組み合わせの可能性をもたらす。特に望ましいのは、野生型表現型に戻ることができない欠失変異体である。実際に、芳香族アミノ酸の生合成に不足した特定のイー・コリａｒｏＡ−変異体を病原性イー・コリ株において構築して、本発明のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４を産生した。前記イー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４は、野生型イー・コリ攻撃に対してヒヨコにおいて安全かつ有効である。従って、本発明は家禽における鳥類大腸菌症を予防または改善する方法であって、前記家禽に免疫原的に有効量のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４を投与することを含む方法も提供する。

免疫原的に有効な量は、宿主の年齢および大きさ、感染症の重さ、病原体の強さ、投与様式などによって変わり得る。一般に、投与単位あたりの好適な有効量は、約１０^２〜１０^１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）、好ましくは約５．０×１０^２〜５．０×１０^１０ｃｆｕ、さらに好ましくは約３．０×１０^６ｃｆｕ〜６．０×１０^６ｃｆｕであり、さらに一層好ましくは約５．０×１０^６ｃｆｕ〜６．０×１０^６ｃｆｕである。当業者らは１または２投与単位を検討することができる。２投与単位が選択されるならば、孵化後約１日にワクチン投与し、約１週齢〜２週齢で再度ワクチン投与するのが好ましい。投与単位は、望ましくはトリ１羽あたり約０．５〜１ｍＬのワクチンであるが、前記の免疫原的有効量の微生物免疫原を送達するために前記量を最適化することができる。

本発明における使用に好適な家禽としては、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、チャボ、ウズラ、キジ、ハトなどが挙げられ、好ましくは商業的に重要な鳥類、例えばニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウ、さらに好ましくはニワトリおよびシチメンチョウ、特に好ましくはニワトリである。
本発明のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４は、任意の通常の手段、好ましくは養鶏業の経済的に実現可能な手段、例えばスプレーまたは飲料水からの集団適用により投与することができる。呼吸器粘膜の天然の病原菌であるイー・コリが、スプレー（好ましくはエアロゾル）経路により適用することができ、依然として安全かつ有効であることは全く予想外である。このような致死性が強い病原体、特に細菌に対するワクチンは注射または他の経路によってのみ提供すべきであると通常考えられる。本発明のａｒｏＡ−変異株は、スプレー投与に関して安全である。実際、イー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４は液体担体と混合され、スプレーまたは飲料水添加剤として投与される。従って、本発明はさらに、免疫原的に有効量のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４および薬理学的に許容される担体を含む鳥類ワクチン組成物を提供する。

本発明のワクチン組成物における使用に好適な薬理学的に許容される担体は、獣医学的医薬組成物に好適な任意の通常の液体担体、好ましくは組織または細胞培養液に好適な緩衝塩類溶液、例えば無菌リン酸塩緩衝塩溶液、さらに好ましくは蒸留水であってよい。他の好適な培地はエマルジョンを含むことができる。本発明のワクチンは当業者によりアジュバントを添加することができる。ワクチンを飲料水から投与する場合、脱脂粉乳を担体として利用できる。脱脂粉乳はワクチンを安定化させ、おそらくは生存能力に影響を及ぼし得るある微量ミネラルの作用を中和するようである。
活性成分としてのイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４微生物に加えて、本発明のワクチン組成物はさらに他の活性成分、例えば、鳥類白血病、細網内皮症、感染性気管支炎、伝染性ファブリーキウス嚢病、ニューカッスル病、トリアデノウイルス病、トリレオウイルス病、鷄痘、伝染性咽頭気管炎、トリインフルエンザ、伝染性コリーザ、家禽チフス、コクシジウム症、家禽コレラなどに対するトリ免疫原性抗病原性化合物を含有することもできる。

本発明の１つの実施形態において、本発明のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４微生物は、公知技術、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９７４， ２５２：２５２−２５４ ｏｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７８，１２０：１１０９−１１１３に記載されているものを用いてリポソーム中に組み入れることができる。本発明のもう一つの実施形態において、本発明のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４微生物は、適当な生物学的化合物、例えばポリサッカライド、ペプチド、蛋白質など、またはその組み合わせと、当業者に利用可能なプロトコルを用いて接合させることができる。
本明細書に記載されている実施形態による本発明のワクチンは、血清型Ｏ１、Ｏ２およびＯ７８、ならびに特に有毒な未分類の血清型を包含するあらゆる血清型のイー・コリ大腸菌症に対して有効であると考えられる。本明細書に記載されるワクチンは、敗血症、心膜炎、気嚢炎、肝周囲炎、関節炎、および特に蜂巣炎に対して有効である。後者はしばしば大腸菌症を伴うが、それ自体深刻な問題であり得る。

本発明をさらによく理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は単に例示的であり、本発明の範囲またはその基礎をなす原則を制限すると理解すべきではない。実際、本明細書に記載されるもの以外の本発明の様々な修正は、以下に記載される実施例および上述のものから当業者には明らかになるであろう。このような修正も添付の請求の範囲内の含まれることを意図される。

実施例１
ａｒｏＡ遺伝子欠失イー・コリ変異体の構築
Ｉ）受容者
親生物は、獣医研究所（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）（ＶＬＡ）（Ａｄｄｌｅｓｔｏｎｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、イギリス）に提出された鳥類大腸菌症の臨床例から単離されたイー・コリの鳥単離株であり、１９９５年にＶＬＡで血清型決定された。親株を１日齢のＳＰＦヒヨコにおいてコロニー化、侵襲、持続性および病原性について、その抗生物質感受性パターンについてのインビトロキャラクタライゼーションにより選択した。形質転換されたドナー（ＰＮＧ１０１を有するイー・コリＫ１２ Ｓ１７λｐｉｒと１００ｂｐ欠失を有するａｒｏＡ）と野生型親株（野生型イー・コリ単離株ＥＣ３４１９５）間の接合により受容株を生成させた。
ＩＩ）欠失のキャラクタライゼーション
一般的な芳香族生合成経路の酵素である３−ホスホエノールピルビルシキメート−５−ホスフェートシンセターゼをエンコードするａｒｏＡ遺伝子は、ｓｅｒＣ−ａｒｏＡオペロンにおいてｓｅｒＣに対して隣接し、プロモーター遠位に位置する。受容者においてａｒｏＡ遺伝子の機能が欠失していると、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ｐ−アミノベンゾエート（ＰＡＢＡ）および２，３−ジヒドロキシベンゾエートを包含する芳香族代謝物が必要となる。脊椎動物組織において見いだされない代謝物であるＰＡＢＡが必要とされる結果、インビボ成長が弱化する。

ＩＩＩ）ａｒｏＡ欠失イー・コリ変異体の構築
ａ）前記の家禽イー・コリＯ７８単離株から得られるａｒｏＡ遺伝子の５’および３’末端について約６５０ｂｐ２つの別個のＰＣＲ産物を増幅するために、ＳｒｆＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位および停止コドンを組み入れたＰＣＲプライマーを設計する。
ｂ）両ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩで２時間消化し、電気泳動を１時間１００ボルトで行い、バンドを切除し、ＳｅｐｈａＧｌａｓ ｂａｎｄｐｒｅｐキットを用いて各バンドを精製する。
ｃ）等体積のそれぞれの精製されたＰＣＲ産物を混合し、ｐＣＲ２．１中に結紮する。
ｄ）ａｒｏＡを有する結紮されたプラスミドをＤＨ５αマキシコンピテント細胞に形質転換し、制限酵素マッピングおよびＰＣＲによりクローニングを確認する。
ｅ）ｐＣＲ２．１から欠失した完全ａｒｏＡ遺伝子をＥｃｏｒＶおよびＳｐｅＩで切除し、次いで精製し、前消化された（ＳｐｅＩ）自殺ベクター（ｓｕｉｃｉｄｅ ｖｅｃｔｏｒ）（ＳａｃＢ、ｐＫＮＧ１０１）中に結紮し、コンピテントイー・コリＫ１２Ｓ１７λｐｉｒに形質転換し、制限酵素マッピングおよびＰＣＲによりクローニングを確認する。
ｆ）ドナー（ｐＫＮＧ１０１を有するイー・コリＳ１７λｐｉｒと１００ｂｐ欠失を有するａｒｏＡ）および野生型イー・コリ単離株間で接合を行う。
ｇ）４８時間３７℃でインキュベーションした後に出現するコロニーを、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンおよび芳香族アミノ酸（それぞれ２０ｍｇ／ｌのＤＬトリプトファン、ＤＬフェニルアラニンおよびＤＬチロシン）で補足された最小培地上で二次培養する。各コロニーをＰＣＲにより試験する。野生型ＰＣＲ産物および数百ｂｐ小さな変異ＰＣＲ産物を産生するコロニーをさらなる研究のために確保する。
ｈ）シングルクロスオーバーを、１０％シュークロースで補足されたＬＢ−Ｇブロス中、３７℃で穏やかに撹拌しながら１６時間培養する。一夜培養物の連続希釈物を１０％シュークロースで補足されたＬＢ−Ｇプレート上にプレートし、３７℃で１６時間インキュベートする。
ｉ）１０％シュークロースＬＢ−Ｇプレート上で成長するコロニーをＬＢ−Ｇ、ＬＢ−Ｇ＋ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンおよび最小培地のそれぞれで二次培養し、３７℃で１６時間インキュベートする。ＬＢ−Ｇプレート上でのみ成長するコロニー（ダブルクロスオーバー）を５％ヒツジ血液寒天上で二次培養し、４℃で維持する。

ＩＶ）中間クローニングベクター
自殺ベクター（ＳａｃＢ、ＰＮＧ１０１）は中間クローニングベクターであった。ドナー（ＰＮＧ１０１を有するＳ１７と１００ｂｐ欠失を有するａｒｏＡ）および野生型イー・コリ単離株間で接合を行った。

実施例２
マスターシードの調製
イー・コリａｒｏＡ−株（実施例１において構築）をトリプシン大豆寒天プレート上で１回成長させ、トリプシン大豆ブロス中で３回継代する。培養物をガラスバイアル中に分配し、密封し、凍結乾燥する。

実施例３
１回ワクチン接種した後の鳥類大腸菌症に対するニワトリにおけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性の評価
この評価において、９６羽のＳＰＦホワイトレグホンニワトリをそれぞれ３２羽の３群に分ける。トリを厳選し、任意に割り当てられたアイソレーター中に入れる。各試験群をそれぞれ１６羽ずつ入れた２つのアイソレーター中に収容する。
Ａ群は、１日齢で、手持ちの噴霧器を用いた粗スプレーによりワクチン投与する。１日齢で、Ａ群のトリを小さな容器中で一団にし、測定した用量が投与されるまでトリの頭にワクチンをスプレーする。実施例２のイー・コリａｒｏＡ微生物を無菌リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で５．０×１０^６ｃｆｕ／用量（１ｍＬ／羽）の力価に希釈する。
６週齢で、Ａ群およびＢ群（非ワクチン接種）を１．０ｍＬ用量の１．０×１０^９ｃｆｕイー・コリＯ７８で気管内（ＩＴ）攻撃する。

Ｃ群はワクチンを投与せず、攻撃もしていない（負の対照群）。実験が完了するまでワクチン接種したトリおよび対照トリを別のアイソレーター中で飼育する。
全てのトリを獣医学的処置のもと、餌および水を自由に摂取可能にする。トリを攻撃後７日間毎日観察する。攻撃後７日の期間の最後で、全ての生存しているトリを解剖し、大腸菌症に典型的な病変の存在について調べる。死亡したトリおよび肝周囲炎、心膜炎、気嚢炎、蜂巣炎、または関節炎などの肉眼で見ることができる病変を示すトリは大腸菌症について陽性と見なされる。

結果を表Ｉに示す。

表Ｉ中のデータからわかるように、本発明のイー・コリａｒｏＡ−ワクチンは、前記ワクチンが１日齢で投与される場合に、安全で、イー・コリＯ７８により引き起こされるニワトリにおける大腸菌症の予防に有効である。

実施例４
２回ワクチン投与した後の鳥類大腸菌症に対するニワトリにおけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性の評価
この評価において、９６羽のＳＰＦホワイトレグホンニワトリをそれぞれ３２羽ずつ３群に分ける。トリを厳選し、任意に割り当てられたアイソレーター中に入れる。各試験群を２つのアイソレーター中に収容し、それぞれには１６羽のトリを入れる。
Ａ群（ワクチン接種）に、実施例Ｂにおいて記載されるように粗スプレーにより１日齢でワクチン投与し、飲料水経路により１週間で再びワクチン投与する。１週齢で、トリから飲料水を３時間取り上げる。実施例２のイー・コリａｒｏＡワクチンを測定された量の冷蒸留水で希釈し、混合して、最終力価５．０×１０^６ｃｆｕにする。蒸留水の測定された量は、１時間に消費されるようにあらかじめ決められた量である。

６週齢で、Ａ群（ワクチン投与）およびＢ群（非ワクチン投与）を、１．０ｍＬ用量の１．０×１０^９ｃｆｕのイー・コリＯ７８で気管内（ＩＴ）攻撃する。
Ｃ群はワクチン投与せず、攻撃していない（負の対照群）。実験が完了するまで、ワクチン接種したトリおよび対照トリを別のアイソレーター中で飼育する。
全てのトリを獣医学的処置のもと、餌および水を自由に摂取可能にする。トリを攻撃後７日間毎日観察する。攻撃後７日の期間の最後で、全ての生存しているトリを解剖し、大腸菌症に典型的な病変の存在について調べる。死亡したトリおよび肝周囲炎、心膜炎、気嚢炎、蜂巣炎、または関節炎などの肉眼で見ることができる病変を示すトリは大腸菌症について陽性と見なされる。

結果を表ＩＩに示す。

表ＩＩ中のデータからわかるように、本発明のイー・コリａｒｏＡ−ワクチンは、前記ワクチンが１日齢で粗スプレーにより投与され、１週齢で飲料水から再び投与される場合に、安全で、イー・コリＯ７８により引き起こされるニワトリにおける大腸菌症の予防に有効である。

実施例５
２回ワクチン投与後の鳥類大腸菌症（血清型Ｏ７８）に対するニワトリにおけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの効力のさらなる評価
この実験は、毒性イー・コリ血清型Ｏ７８で気管内攻撃した後のニワトリにおける大腸菌症の予防におけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの効力を調べた。試験群＃１（３２羽）中の各トリに１日齢で粗スプレーにより、また１週齢で飲料水中で再びイー・コリａｒｏＡ−ワクチンの１羽量でワクチン投与した。試験群＃２（３２羽）中のトリは非ワクチン投与・攻撃対照としての役割を果たした。試験群＃３（３２羽）中のトリは、ワクチン投与をせず、攻撃をしなかった。＃１群および＃２群におけるトリは全て、１．５×１０^９ｃｆｕ／用量のイー・コリＯ７８で６週齢で気管内攻撃した。攻撃後７日に、生存しているトリを全て解剖し、大腸菌症に典型的な肉眼で見ることができる病変（肝周囲炎、心膜炎、気嚢炎、蜂巣炎、または関節炎）の存在について調べた。
ＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの投与に起因する好ましくない反応（死亡または他の臨床的徴候）は無く、集団適用についての安全性が示された。

イー・コリＯ７８の毒性株は、７日の攻撃後期間中、ワクチン投与されていない、攻撃された対照（＃２群）において２８．１％の死亡率（３２羽中９羽死亡）を引き起こした。ＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンを投与されたトリにおいてイー・コリＯ７８の毒性株により引き起こされた死亡率は、７日の攻撃後期間中０％（３２羽中０羽死亡）であった。
大腸菌症の割合を、ワクチン投与し、攻撃されたトリとワクチン投与されていない攻撃された対照のトリ間で統計的に分析した。ワクチン投与され、攻撃されたトリとワクチン投与されていない攻撃されたトリ間に有意な差（ｐ＜０．０００１）があり、大腸菌症に典型的な肉眼で見られる病変があった。予防率は７２．４％（９５％ＣＩ５３．７、８３．６）であった。
この実験に基づくと、３．２×１０^６ｃｆｕ／用量の力価のＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンは、粗スプレーにより１日齢で投与され、１週齢で飲料水中で再び投与された場合に、安全であり、イー・コリＯ７８により引き起こされるニワトリにおける大腸菌症の予防に有効であると結論づけられた。

実施例６
１回ワクチン投与した後の鳥類大腸菌症（血清型Ｏ７８）に対するニワトリにおけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性のさらなる評価
この実験で、イー・コリＯ７８の毒性株で気管内攻撃した後のニワトリにおける大腸菌症の予防におけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性を調べた。試験群＃１（３２羽）における各トリを粗スプレーにより１日齢で１羽量のイー・コリａｒｏＡ−ワクチンで予防接種した。試験群＃２のトリ（３２羽）は非ワクチン投与・攻撃対照としての役割を果たした。試験群＃３のトリ（３２羽）はワクチン投与されず、攻撃もされなかった。＃１群および＃２群のトリは全て６週齢で１．５×１０^９ｃｆｕ／用量のイー・コリＯ７８で気管内攻撃された。攻撃後７日に、全ての生存しているトリを解剖し、大腸菌症に典型的な肉眼で見ることができる病変（肝周囲炎、心膜炎、気嚢炎、蜂巣炎、または関節炎）の存在について調べた。

ＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの投与に起因する好ましくない反応（死亡または他の臨床的徴候）は無く、集団適用についての安全性が示された。
イー・コリＯ７８の毒性株は、７日の攻撃後期間中、非ワクチン投与・攻撃対照において２８．１％の死亡率（３２羽中９羽死亡）を引き起こした。ＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチン投与されたトリにおいてイー・コリＯ７８の毒性株により引き起こされた死亡率は、７日の攻撃後期間中０％（３２羽中０羽死亡）であった。
大腸菌症の割合を、ワクチン投与し、攻撃されたトリとワクチン投与されていない攻撃された対照のトリ間で統計的に分析した。ワクチン投与され攻撃されたトリとワクチン投与されていない攻撃されたトリ間に有意な差（ｐ＜０．０００１）があり、大腸菌症に典型的な肉眼で見られる病変があった。予防率は７６．５％（９５％ＣＩ５７．９、８６．９）であった。
この実験に基づくと、３．２×１０^６ｃｆｕ／用量を含有するＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンは、粗スプレーにより１日齢で投与された場合に、安全であり、イー・コリＯ７８により引き起こされるニワトリにおける大腸菌症の予防に有効であると結論づけられた。

実施例７
２回ワクチン投与した後の鳥類大腸菌症（毒性血清型未分類）に対するニワトリにおけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性のさらなる評価
この実験で、未分類の毒性イー・コリで気管内攻撃した後のニワトリにおける大腸菌症の予防におけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性を調べた。試験群＃１（３２羽）における各トリを粗スプレーにより１日齢で、また１週齢で飲料水中で再び１羽量のイー・コリａｒｏＡ−ワクチンで予防接種した。試験群＃２のトリ（３２羽）は非ワクチン投与・攻撃対照としての役割を果たした。試験群＃３のトリ（３２羽）はワクチン投与されず、攻撃もされなかった。＃１群および＃２群のトリは全て６週齢で２．５×１０^１０ｃｆｕ／用量の毒性イー・コリＯ７８で気管内攻撃された。攻撃後７日に、全ての生存しているトリを解剖し、大腸菌症に典型的な肉眼で見ることができる病変（肝周囲炎、心膜炎、気嚢炎、蜂巣炎、または関節炎）の存在について調べた。

ＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの投与に起因する好ましくない反応（死亡または他の臨床的徴候）は無く、集団適用についての安全性が示された。
毒性イー・コリは、７日の攻撃後期間中、非ワクチン投与・攻撃対照またはＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチン投与されたトリにおいて死亡を引き起こさなかった。
大腸菌症の割合を、ワクチン投与した攻撃されたトリとワクチン投与されていない攻撃された対照のトリ間で統計的に分析した。ワクチン投与とワクチン投与されていない攻撃されたトリ間に有意な差（ｐ＜０．０００１）があり、大腸菌症に典型的な肉眼で見られる病変があった。予防率は８７．１％（９５％ＣＩ６１．９、９５．６）であった。
この実験に基づくと、３．２×１０^６ｃｆｕ／用量の力価のＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンは、粗スプレーにより１日齢で投与され、１週齢で飲料水中で再び投与された場合に、安全であり、毒性イー・コリにより引き起こされるニワトリにおける大腸菌症の予防に有効であると結論づけられた。

実施例８
１回ワクチン投与した後の鳥類大腸菌症（毒性血清型未分類）に対するニワトリにおけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性の評価
この実験で、未分類の毒性イー・コリで気管内攻撃した後のニワトリにおける大腸菌症の予防におけるイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの有効性を調べた。試験群＃１（３２羽）における各トリを、粗スプレーにより１日齢で、１羽量のイー・コリａｒｏＡ−ワクチンで予防接種した。試験群＃２のトリ（３２羽）は非ワクチン投与・攻撃対照としての役割を果たした。試験群＃３のトリはワクチン投与されず、攻撃もされなかった。＃１群および＃２群のトリは全て６週齢で２．５×１０^１０ｃｆｕ／用量の毒性イー・コリで気管内攻撃された。攻撃後７日に、全ての生存しているトリを解剖し、大腸菌症に典型的な肉眼で見ることができる病変（肝周囲炎、心膜炎、気嚢炎、蜂巣炎、または関節炎）の存在について調べた。

ＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンの投与に起因する好ましくない反応（死亡または他の臨床的徴候）は無く、集団適用についての安全性が示された。
毒性イー・コリは、７日の攻撃後期間中、非ワクチン投与・攻撃対照またはＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチン投与されたトリにおいて死亡を引き起こさなかった。
大腸菌症の割合を、ワクチン投与した攻撃されたトリとワクチン投与されていない攻撃された対照のトリ間で統計的に分析した。ワクチン投与とワクチン投与されていない攻撃されたトリ間に有意な差（ｐ＜０．０００１）があり、大腸菌症に典型的な肉眼で見られる病変があった。予防率は６６．６％（９５％ＣＩ３９．８、８１．５）であった。
この実験に基づくと、３．２×１０^６ｃｆｕ／用量の力価のＦＤＡＨイー・コリａｒｏＡ−生ワクチンは、粗スプレーにより１日齢で投与された場合に、安全であり、毒性イー・コリにより引き起こされるニワトリにおける大腸菌症の予防に有効であると結論づけられた。

実施例９
比較実験Ａ
この実験において、本発明のワクチンを、イー・コリの無毒温度感受性変異体を含有する生細菌ワクチンであり、イー・コリ血清型Ｏ７８による感染症に関連する大腸菌症の予防を助けるためにシチメンチョウにおける使用が推奨される市販のＧＡＲＡＶＡＸ−Ｔワクチン（競合他社の製品）と比較した。
試験群＃１における各トリ（各３０羽）に、粗スプレーにより１日齢で、また２週齢で飲料水中で再び、１羽量の本発明の一実施形態のイー・コリａｒｏＡ−ワクチンを投与した（継代レベルＸ＋５；５．０×１０^６ｃｆｕ／１ｍＬ用量）。試験群＃２におけるトリ（３０羽）にそれぞれ粗スプレーにより１日齢で、また２週齢で飲料水中で再び、１羽量のＧＡＲＡＶＡＸ−Ｔワクチンを推奨されるラベルの指示に従って投与した。試験群＃３のトリ（３０羽）は非ワクチン投与・攻撃対照としての役割を果たした。試験群＃４のトリ（３０羽）はワクチン投与せず、攻撃もしなかった。＃１、＃２および＃３群のトリはすべて６週齢で目標用量の５×１０^９ｃｆｕ／用量（１．０ｍＬ／用量）の毒性イー・コリＯ７８で気管内攻撃した。攻撃後７日に、死亡したトリの数を記録し、全ての生存しているトリを解剖し、大腸菌症に典型的な肉眼で見ることができる病変を調べた。

結果を以下の表ＩＩＩに示す。特定の気嚢炎および全体的な大腸菌症の病変を有するニワトリのパーセンテージを定量化した：

実施例１０
比較実験Ｂ
この実験において、本発明のワクチンを、イー・コリの無毒温度感受性変異体を含有する生細菌ワクチンであり、イー・コリ血清型Ｏ７８による感染症に関連する大腸菌症の予防を助けるためにシチメンチョウにおける使用が推奨される市販のＧＡＲＡＶＡＸ−Ｔ（競合他社の製品）と比較した。
試験群＃１における各トリ（各３１羽）に、粗スプレーにより１日齢で、また２週齢で飲料水中で再び、１羽量の本発明の一実施形態のイー・コリａｒｏＡ−ワクチンを投与した（継代レベルＸ＋５；５．０×１０^６ｃｆｕ／１ｍＬ用量）。試験群＃２におけるトリ（２９羽）にそれぞれ粗スプレーにより１日齢で、また２週齢で飲料水中で再び、１羽量のＧＡＲＡＶＡＸ−Ｔワクチンを推奨されるラベルの指示に従って投与した。試験群＃３のトリ（３１羽）は非ワクチン投与・攻撃対照としての役割を果たした。試験群＃４のトリ（３０羽）はワクチン投与せず、攻撃もしなかった；これらのうち死亡したものはいなかった。＃１、＃２および＃３群のトリはすべて６週齢で目標用量の５×１０^９ｃｆｕ／用量（１．０ｍＬ／用量）の毒性イー・コリ６２４（血清型未分類）で気管内攻撃した。攻撃後７日に、死亡したトリの数を記録し、全ての生存しているトリを解剖し、大腸菌症に典型的な肉眼で見ることができる病変を調べた。

結果を以下の表ＩＶに示す。特定の蜂巣炎を有するニワトリのパーセンテージを定量化した：

Claims (17)

1. アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＰＴＡ−５０９４で寄託されているイー・コリａｒｏＡ−株。
2. 免疫原的有効量のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４株および薬理学的に許容される担体を含むワクチン組成物。
3. 担体が組織または細胞培養液において使用するに好適な平衡化塩溶液である請求項２記載の組成物。
4. 担体が蒸留水である請求項２記載の組成物。
5. 免疫原的有効量が５．０×１０^２ｃｆｕ〜５．０×１０^１０ｃｆｕをもたらすために十分な量である請求項２記載の組成物。
6. 有効量が５．０×１０^６ｃｆｕ〜６．０×１０^６ｃｆｕである請求項５記載の組成物。
7. 家禽における大腸菌症を予防または改善する方法であって、該家禽に免疫原的有効量のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４株を投与することを含む方法。
8. 家禽がニワトリ；アヒル；ガチョウ；シチメンチョウ；チャボ；ウズラ；キジ；およびハトからなる群から選択される請求項７記載の方法。
9. イー・コリが集団適用により投与される請求項７記載の方法。
10. 有効量が５．０×１０^２ｃｆｕ〜１０^１０ｃｆｕである請求項７記載の方法。
11. 家禽がニワトリまたはシチメンチョウである請求項８記載の方法。
12. イー・コリがスプレー適用により投与される請求項９記載の方法。
13. イー・コリが飲料水中で投与される請求項９記載の方法。
14. 家禽がニワトリである請求項１１記載の方法。
15. 有効量が５．０×１０^６ｃｆｕ〜６．０×１０^６ｃｆｕである請求項１４記載の方法。
16. 家禽における蜂巣炎を予防または改善する方法であって、該家禽に免疫原的有効量のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４株を投与することを含む方法。
17. 免疫原的有効量のイー・コリａｒｏＡ−ＰＴＡ−５０９４株および薬理学的に許容される担体を含むワクチン組成物であって、該ワクチンがエアゾルスプレーまたは飲料水による集団適用に関して安全かつ有効であり、さらに該免疫原的有効量が３．０×１０^６ｃｆｕ〜６．０×１０^６ｃｆｕをもたらすために十分な量であるワクチン組成物。