JP5311998B2 - Periodontal disease preventive or therapeutic composition - Google Patents
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Description
本発明は、歯周病予防または治療用組成物に関する。 The present invention relates to a composition for preventing or treating periodontal disease.
慢性（成人性）歯周炎は、歯肉溝細菌叢を構成する常在菌のうち、主にグラム陰性嫌気性桿菌と呼ばれるグループの細菌群の増殖により、歯周組織に引き起こされる慢性感染症である。加齢とともに罹患率が上昇し、40歳代以降の多くが限局性あるいは広汎性の歯周炎に罹患していると言われている。本疾患の実体は、歯周組織の慢性化膿性炎であるが、その影響は口腔内にとどまらず、最近では虚血性疾患や糖尿病、肥満等との関連が明らかにされつつある。本疾患の予防並びに治療は、歯ブラシによる機械的清掃や、外科的処置に依存する部分が多く、予防/治療手段にさらなる向上が望まれている。 Chronic (adult) periodontitis is a chronic infection caused by periodontal tissue due to the growth of a group of bacteria that are mainly called gram-negative anaerobic bacilli among the resident bacteria that make up the gingival crevicular flora. is there. The prevalence increases with age, and it is said that most people in their 40s and beyond suffer from localized or diffuse periodontitis. The substance of this disease is chronic purulent inflammation of the periodontal tissue, but its influence is not limited to the oral cavity, and recently, its relation to ischemic disease, diabetes, obesity and the like is being clarified. The prevention and treatment of this disease often depends on mechanical cleaning with a toothbrush or a surgical procedure, and further improvement in preventive / therapeutic means is desired.
なお、下記特許文献１には、ビンロウジ（檳榔子）、カンゾウ（甘草）、ニクズク（肉蒄）、およびヤクモソウ（益母草）のうち、少なくとも２種以上の抽出エキス及びマスティック（乳香）の抽出エキスを有効成分とする歯周病予防又は治療用組成物が開示されている。 In Patent Document 1 below, at least two or more kinds of extract extracts and extract extracts of mastic (milky perfume) are selected from among betel palm (licanthus), licorice (licorice), nutmeg (meat candy), and yak mushroom (benuse). A composition for the prevention or treatment of periodontal disease, which contains as an active ingredient, is disclosed.
ポルフィロモナス・ジンジヴァーリス（Porphyromonas gingivalis（PG））は本疾患患者に高頻度かつ特徴的に検出される細菌で、強いタンパク分解活性並びに、骨吸収誘導活性の強い内毒素を持つことから、慢性歯周炎の原因菌の一つと考えられている。歯周ポケットにおける本菌の増減が慢性歯周炎の病態の変化に一致することから、本菌に対する直接的な抗菌性あるいは、歯周病の主症状の一つである骨吸収の阻害作用のある物質は、慢性歯周炎の予防や進行の抑制に有効なことが考えられる。
本発明の目的は、天然由来の成分を有効成分とする、歯周病予防または治療用に有効な薬剤を含む組成物を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a composition containing a drug effective for the prevention or treatment of periodontal disease, which comprises a naturally-derived ingredient as an active ingredient.
本発明者は、鶏血藤と呼ばれる植物が、強い破骨細胞の分化・延命抑制作用、歯周病の原因菌に対する抗菌作用、活性酸素種除去作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventor has found that a plant called chicken blood rat has strong osteoclast differentiation / life-prolonging action, antibacterial action against bacteria causing periodontal disease, and action to remove reactive oxygen species, and completes the present invention. It came to.
すなわち本発明は、以下のとおりである。
１．鶏血藤またはその抽出物を有効成分とする歯周病予防または治療用組成物。
２．洗***漱剤の形態で使用される、前記１に記載の歯周病予防または治療用組成物。
３．歯磨き剤の形態で使用される、前記１に記載の歯周病予防または治療用組成物。
４．パップ剤の形態で使用される、前記１に記載の歯周病予防または治療用組成物。
５．鶏血藤またはその抽出物を有効成分とする破骨細胞の分化・延命抑制剤。
６．鶏血藤またはその抽出物を有効成分とする活性酸素種除去剤。
７．鶏血藤またはその抽出物を有効成分とするインプラント周囲炎（ペリインプラントタイティス）予防または治療用組成物。
That is, the present invention is as follows.
1. A composition for preventing or treating periodontal disease comprising chicken blood or an extract thereof as an active ingredient.
2. 2. The composition for preventing or treating periodontal disease according to 1 above, which is used in the form of a mouth rinse.
3. 2. The composition for preventing or treating periodontal disease according to 1 above, which is used in the form of a dentifrice.
4). 2. The composition for preventing or treating periodontal disease according to 1 above, which is used in the form of a poultice.
5. Osteoclast differentiation / life extension inhibitor containing chicken blood rat or extract thereof as an active ingredient.
6). A reactive oxygen species remover comprising chicken blood rat or extract thereof as an active ingredient.
7). A composition for preventing or treating peri-implantitis (peri-implant titis) comprising chicken blood or an extract thereof as an active ingredient.
鶏血藤は、強い破骨細胞の分化・延命抑制作用、歯周病の原因菌に対する抗菌作用、活性酸素種除去作用を有する。したがって本発明によれば歯周病予防または治療用に有効な組成物を提供することができる。
また本発明によれば、鶏血藤またはその抽出物を有効成分とする破骨細胞の分化・延命抑制剤および活性酸素種除去剤を提供することができる。
Chicken blood rat has a strong osteoclast differentiation / proliferation suppressing action, an antibacterial action against periodontal disease causative bacteria, and a reactive oxygen species removing action. Therefore, according to the present invention, a composition effective for preventing or treating periodontal disease can be provided.
Furthermore, according to the present invention, an osteoclast differentiation / proliferation inhibitor and a reactive oxygen species removing agent comprising chicken blood rat or extract thereof as an active ingredient can be provided.
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明でいう鶏血藤は、公知の生薬であり、例えば、マメ科に属する密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）、光葉密花豆（S. harmandii Gagnep）、紅血藤（S. sinensis Chun et T, Chen）、香花崖豆藤（Millettia dielsianaHarms）、豊城崖豆藤（M. nitida Benth. var. hirsutissima Z. Wei）、崖豆藤（M. gentiliana Level）、美麗根崖豆藤（M. speciosa Champ.）、網絡崖豆藤（M. reticulata benth）、常春油麻藤（Mucuna sempervirens Hemsl.）、白花油麻藤（M. birdwoodiana Tutcher）、褐毛藜豆（M. castanea Merr）、巴豆藤（Craspedolobium schochii Harms）、マツブサ科に属する内南五味子（Kadsura interior A.C. Smith）、異型南五味子（K. heteroclita (Roxb.) Craib）、鉄箍散（Schisandra propinqua (Wall.) Baill. var. sinensis Oliv.）を包含する。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The chicken blood rat as used in the present invention is a known herbal medicine, for example, a dense flower bean (Spatholobus suberectus Dunn), a light leaf dense flower bean (S. harmandii Gagnep), and a red blood rat (S. sinensis Chun et T, Chen), Millettia dielsiana Harms, M. nitida Benth. Var. Hirsutissima Z. Wei, M. gentiliana Level, M. gentiliana Level, M. speciosa Champ.), M. reticulata benth, Mucuna sempervirens Hemsl., M. birdwoodiana Tutcher, M. castanea Merr, Mito castanea Merr (Craspedolobium schochii Harms), Kadsura interior AC Smith, K. heteroclita (Roxb.) Craib, Tessan (Schisandra propinqua (Wall.) Baill. Var. Sinensis Oliv .).
本発明では、鶏血藤の乾燥した茎、つる、根をそのまま用いることができ、あるいは、鶏血藤の乾燥した茎、つる、根と、適当な溶媒（例えば水または熱水）とを接触させ、得られた抽出物を用いることもできる。また、抽出物の性状もとくに制限されず、液状、軟稠エキス状、粉末状、顆粒状等のものを用いることができる。 In the present invention, the dried stem, vine and root of chicken blood can be used as they are, or the dried stem, vine and root of chicken blood are contacted with a suitable solvent (for example, water or hot water). The obtained extract can also be used. Further, the properties of the extract are not particularly limited, and liquid, soft extract, powder, granule and the like can be used.
鶏血藤は、下記の実施例でも記載のとおり、強い破骨細胞の分化・延命抑制作用を有する。また鶏血藤は、歯周病の原因菌に対する抗菌作用および活性酸素種除去作用を有する。さらに、鶏血藤は、下記の実施例の記載から自明なように、インプラント周囲炎（ペリインプラントタイティス）（Peri-implantitis）の予防または治療用としても有効である。 Chicken blood rat has a strong osteoclast differentiation / life-prolonging inhibitory effect as described in the following examples. In addition, chicken blood rat has an antibacterial action and a reactive oxygen species removal action against periodontal disease causative bacteria. Furthermore, chicken blood rat is also effective for the prevention or treatment of peri-implantitis (Peri-implantitis), as is apparent from the description of Examples below.
したがって本発明では、上記鶏血藤またはその抽出物を、歯周病予防または治療用組成物の有効成分として使用できる。本発明の歯周病予防または治療用組成物は、鶏血藤またはその抽出物の細粒を水で希釈して洗***嗽剤（うがい薬）として用いたり、歯磨き剤として使用したり、あるいはパップ剤として口内等の患部に貼り付けて用いることができる。 Therefore, in the present invention, the above chicken blood wisteria or an extract thereof can be used as an active ingredient of a composition for preventing or treating periodontal disease. The composition for preventing or treating periodontal disease of the present invention can be used as a mouthwash (gargle) by diluting chicken blood wisteria or its fine granules with water, or as a dentifrice, or As a poultice, it can be used by sticking to the affected area such as the mouth.
鶏血藤またはその抽出物を経口投与する場合、その投与量は、とくに制限されないが、乾燥物として（抽出物の場合は乾燥粉末として）、例えば成人１日あたり、５ｇ〜２０ｇである。
また、鶏血藤またはその抽出物を洗***嗽剤、歯磨き剤あるいはパップ剤として用いる場合、鶏血藤またはその抽出物の含有量は、例えば２〜８質量％であるのが好ましい。
ヒトの歯肉粘膜上皮はループ状の毛細血管が豊富であり、生体との親和性の高い本発明の組成物は、該上皮から容易に吸収されると考えられる。
In the case of orally administering chicken blood or an extract thereof, the dose is not particularly limited, but is, for example, 5 to 20 g per day as an adult product (as a dry powder in the case of an extract).
Moreover, when using chicken blood rat or its extract as a mouth rinse, a toothpaste, or a poultice, it is preferable that content of chicken blood rat or its extract is 2-8 mass%, for example.
The human gingival mucosal epithelium is rich in looped capillaries, and the composition of the present invention having high affinity with a living body is considered to be easily absorbed from the epithelium.
本発明の歯周病予防または治療用組成物には、上記有効成分以外に、種々の添加剤を含有させることができる。例えば、抗酸化活性成分としては、コエンザイムＱ１０、フェルラ酸、アスタキサンチン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ＢＨＴ、ＢＨＡ、ＮＤＧＡ、没食子酸プロピル、ポリフェノール類（タンニン類）、エリソルビン酸等が挙げられる。その他の薬効成分としては、例えば、アズレンスルホン酸ナトリウム、ε−アミノカプロン酸、アラントイン、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アラントインジヒドロキシアルミニウム、エピジヒドロコレステリン、ジヒドロコレステロール、塩化ナトリウム、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸二アンモニウム、グリチルリチン酸二ナトリウム、グリチルリチン酸三ナトリウム、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、β−グリチルレチン酸、イソプロピルメチルフェノール、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム液、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン液、塩酸クロルヘキシジン、トリクロサン、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、塩酸ピリドキシン、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ−α−トコフェロール、ゼオライト、ピロリン酸二水素ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、無水ピロリン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール１０００、ポリエチレングリコール１５００、ポリエチレングリコール１５４０、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール２００００、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドンＫ２５、ポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドンＫ９０、塩化リゾチーム、銅クロロフィリンナトリウム、ヒノキチオール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ラウロイルサルコシンナトリウム等が挙げられる。
In addition to the above active ingredients, the additive for preventing or treating periodontal disease of the present invention can contain various additives. For example, examples of the antioxidant active ingredient include coenzyme Q10, ferulic acid, astaxanthin, vitamin E, vitamin C, vitamin A, BHT, BHA, NDGA, propyl gallate, polyphenols (tannins), erythorbic acid and the like. Examples of other medicinal ingredients include sodium azulene sulfonate, ε-aminocaproic acid, allantoin, allantochlorohydroxyaluminum, allantoindihydroxyaluminum, epidihydrocholesterin, dihydrocholesterol, sodium chloride, glycyrrhizic acid, diammonium glycyrrhizinate, glycyrrhizin Disodium acid, trisodium glycyrrhizinate, dipotassium glycyrrhizinate, monoammonium glycyrrhizinate, β-glycyrrhetinic acid, isopropylmethylphenol, cetylpyridinium chloride, decalinium chloride, benzalkonium chloride, benzalkonium chloride solution, alkyldiaminoethylglycine hydrochloride Solution, chlorhexidine hydrochloride, triclosan, ascorbic acid, sodium ascorbate , Pyridoxine hydrochloride, dl-α-tocopherol acetate, dl-α-tocopherol nicotinate, zeolite, sodium dihydrogen pyrophosphate, sodium pyrophosphate, anhydrous sodium pyrophosphate, sodium monohydrogen phosphate, trisodium phosphate, polyphosphoric acid Sodium, sodium fluoride, sodium monofluorophosphate,
湿潤剤としては、濃グリセリン、ソルビット液などが挙げられる。溶剤としては、エタノール、水、オリーブ油、ヤシ油、大豆油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ナタネ油、落花生油、ツバキ油等の食用油などが挙げられる。増粘剤としては、キサンタンガム、カラギーナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ミツロウなどが挙げられる。界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウムなどが挙げられる。香味剤としては、メントール、ペパーミント油、スペアミント油、オレンジ油、レモン油、ユーカリ油、ハッカ油、アカシア油、ウイキョウ油、クエントウ油、カラムス油、ショウノウ油、ニッケイ油、ケイ皮油、ケイ葉油、バラ油、ビャクダン油、チョウジ油、ハーブ油、バナナ油、リンゴ油、サリチル酸メチル、カルボン、アネトール、リモネン等のテルペン類などの香料および調合香料が挙げられる。 Examples of the wetting agent include concentrated glycerin and sorbit liquid. Examples of the solvent include edible oils such as ethanol, water, olive oil, coconut oil, soybean oil, cottonseed oil, corn oil, sesame oil, rapeseed oil, peanut oil, and camellia oil. Examples of the thickener include xanthan gum, carrageenan, sodium carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, beeswax and the like. Examples of the surfactant include sucrose fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, and lauroyl sarcosine sodium. Flavoring agents include menthol, peppermint oil, spearmint oil, orange oil, lemon oil, eucalyptus oil, mint oil, acacia oil, fennel oil, citrus oil, columnus oil, camphor oil, cinnamon oil, cinnamon oil, and coconut leaf oil. Fragrances such as rose oil, sandalwood oil, clove oil, herb oil, banana oil, apple oil, methyl salicylate, terpenes such as carvone, anethole and limonene, and blended fragrances.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
（鶏血藤抽出液の調製）
鶏血藤抽出液は、1Lの水に200g（20％w/v）の鶏血藤を加え95℃で3時間加熱したものを鶏血藤20％抽出液とし、これを適宜PBSで希釈し、以下の実験に供試した。
なお、鶏血藤は密花豆Spatholobus suberectus DUNNの乾燥茎を実験に供した。
(Preparation of chicken blood wisteria extract)
Chicken blood wisteria extract was prepared by adding 200 g (20% w / v) chicken blood wisteria to 1 liter of water and heating at 95 ° C for 3 hours to obtain
Chicken blood wisteria used a dried stem of dense flower beans Spatholobus suberectus DUNN for the experiment.
（実施例１：Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株(PG)感染マウス歯槽骨吸収モデルにおける鶏血藤の骨吸収抑制効果）
6週齢のC57BL/6マウス72匹を、24匹ずつ非感染コントロール群、PG感染コントロール群およびPG感染+鶏血藤投与（実験群）の3群に分け、それぞれにサルファメトキサゾールおよびトリメトプリムを含む飲料水を1週間投与し、口腔常在菌を除菌した。体内の抗菌薬を排出させるため3日間イオン交換水で飼育後、1週間に3回、1回につき約1×109個のPG菌体を含む2.5%カルボキシメチルセルロース溶液0.1ｍｌを、ＰＧ感染コントロール群ならびに実験群に接種した。菌接種の完了と同時に、実験群には8%鶏血藤水抽出液を飲料水として供与し、その他はイオン交換水を飲料水とした。
感染終了後から1週間ごとに6週間にわたり各群から4匹ずつ抽出・屠殺し、右側頭部について当該骨格標本を作製し、上顎歯槽骨の吸収量を実体顕微鏡観察下で行った。左側頭部はギ酸ホルマリンで脱灰後、病理標本を作製し、ヘマトキシリン-エオシン染色あるいは酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を行い、炎症の状態や破骨細胞の出現について検討した。
(Example 1: Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 strain (PG) infected mouse alveolar bone resorption model in chicken blood rat bone resorption inhibitory effect)
72 6-week-old C57BL / 6 mice were divided into 3 groups: 24 non-infected control group, PG infection control group, and PG infection + chicken blood rat administration (experimental group), respectively, sulfamethoxazole and trimethoprim Was administered for 1 week to sterilize oral resident bacteria. PG infection control with 2.5 ml carboxymethylcellulose solution containing approximately 1 × 10 9 PG cells, 3 times a week after breeding with ion-exchanged water for 3 days to drain antibacterial agents in the body Groups and experimental groups were inoculated. Simultaneously with the completion of the inoculation, 8% chicken blood water extract was provided as drinking water to the experimental group, and ion exchange water was used as drinking water for the others.
Four animals from each group were extracted and killed every week for 6 weeks after the end of infection, the skeletal specimen was prepared for the right temporal region, and the amount of maxillary alveolar bone resorption was measured under a stereoscopic microscope. The left temporal region was decalcified with formalin formate, pathological specimens were prepared, and hematoxylin-eosin staining or tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining was performed to examine the state of inflammation and the appearance of osteoclasts.
図１は、歯槽骨吸収量の経時的変化を示すグラフである。
図２は、破骨細胞出現数の経時的変化を示すグラフである。
図３は、破骨細胞数算定の算定区域を示す図であり、マウス上顎第一臼歯より第三臼歯に隣接する歯槽骨（黒線で囲まれた範囲）に出現した破骨細胞数を算定した。
図４は、マウス歯周組織のTRAP染色像である。
FIG. 1 is a graph showing changes in alveolar bone resorption over time.
FIG. 2 is a graph showing changes over time in the number of osteoclasts.
FIG. 3 is a diagram showing a calculation area for calculating the number of osteoclasts, and calculating the number of osteoclasts that appeared in the alveolar bone adjacent to the third molar from the mouse maxillary first molar (the area surrounded by the black line). did.
FIG. 4 is a TRAP-stained image of mouse periodontal tissue.
図１の結果から、PG感染コントロール群では、非感染コントロール群と比べて経時的に骨の吸収量が増加し、その傾向は実験終了まで継続した。実験群では、骨吸収が非感染コントロール群と同程度まで抑制されたことから、鶏血藤の投与がPG感染による歯槽骨吸収の抑制に有効であることが示された。
また、図２の結果から、第1臼歯近心根から第3臼歯の遠心根を囲む歯槽骨面に認められた破骨細胞（osteoclast）は、PG感染コントロール群に明らかに多く、また実験経過に伴いその数は増加傾向を示したが、実験群は非感染コントロール群と相違はみられなかった。
一方、図４に示す病理標本において、非感染コントロール群、PG感染コントロール群及び実験群のいずれにも臼歯部歯間乳頭の粘膜上皮内と上皮直下にごく僅かの炎症細胞浸潤（好中球とリンパ球）が散見された。しかし、PG感染コントロール群では、非感染コントロール群に比べ歯槽骨面に吸収窩が多く認められ、実験期間の経過に伴い骨量の減少が観察された。実験群の歯槽骨には著しい変化はなく、非感染コントロール群ほぼ同様の所見であった。
From the results shown in FIG. 1, the bone resorption amount increased with time in the PG-infected control group compared to the non-infected control group, and this tendency continued until the end of the experiment. In the experimental group, bone resorption was suppressed to the same extent as in the non-infected control group, indicating that administration of chicken blood was effective in suppressing alveolar bone resorption caused by PG infection.
In addition, the results of Fig. 2 clearly show that osteoclasts (osteoclast) found in the alveolar bone surface surrounding the distal root of the third molar from the first mesial root to the third molar are more numerous in the PG-infected control group. The numbers showed an increasing trend, but the experimental group was not different from the non-infected control group.
On the other hand, in the pathological specimen shown in FIG. 4, in the non-infected control group, the PG infection control group, and the experimental group, very few inflammatory cell infiltrates (neutrophils and neutrophils) exist in the mucosal epithelium of the interdental papilla and directly under the epithelium. Lymphocytes) were found occasionally. However, in the PG-infected control group, more resorption pits were observed on the alveolar bone surface than in the non-infected control group, and a decrease in bone mass was observed as the experimental period progressed. There was no significant change in the alveolar bone of the experimental group, and the findings were similar to the non-infected control group.
（実施例２：ＰＧに対する鶏血藤の抗菌効果）
0.2%、2%もしくは8％鶏血藤抽出液またはPBSの5ｍｌに、OD600＝1に調整したPGのPBS懸濁液の0.05ｍｌを加え、0分、1分、15分または60分放置した。その後、サンプルを10倍希釈し、含まれる生菌数を培養法で計測した。培養は37℃嫌気条件（15%CO2、15%H2、70%N2）下で5日間行なった。結果を図５に示す。
図５の結果から、鶏血藤抽出液にPGを混合し60分間ベンチトップで放置すると、鶏血藤を加えないコントロール対して、鶏血藤0.2％濃度で約55%、2％濃度で約15％、8％濃度で約0.1％のレベルまで生菌数の減少が検出されたことから、鶏血藤は、濃度並びに時間依存的に、PGに対して抗菌効果を示すことが明らかとなった。
(Example 2: Antibacterial effect of chicken blood on PG)
Add 0.05 ml of PBS suspension of PG adjusted to OD 600 = 1 to 5 ml of 0.2%, 2% or 8% chicken blood wisteria extract or PBS and leave for 0 min, 1 min, 15 min or 60 min did. Then, the sample was diluted 10 times, and the number of viable bacteria contained was measured by a culture method. Culturing was carried out for 5 days under anaerobic conditions at 37 ° C. (15% CO 2 , 15% H 2 , 70% N 2 ). The results are shown in FIG.
From the results shown in FIG. 5, when PG was mixed with chicken blood rat extract and left on the bench top for 60 minutes, the control without adding chicken blood was about 55% for chicken blood and about 2% for 2%. A decrease in the number of viable bacteria was detected up to a level of about 0.1% at 15% and 8% concentrations, and it became clear that chicken blood rat showed an antibacterial effect on PG depending on the concentration and time. It was.
（実施例３：鶏血藤の破骨細胞の分化抑制効果）
骨髄由来の単球・マクロファージ等の破骨細胞の前駆細胞はMacrophage-Colony Stimulating Factor（M-CSF）の存在下でReceptor activator of NF-κB ligand （RANKL）の刺激により破骨細胞に分化することが知られている。マウス骨髄細胞も、M-CSF添加培地でRANKLのドナーであるMC3T3-G2/PA6細胞と共培養することで破骨細胞に分化する。そこで、破骨細胞の分化過程における鶏血藤の影響を検討する目的でマウス破骨細胞形成系に各種濃度の鶏血藤抽出液を添加し、破骨細胞の形成誘導に対する鶏血藤の影響を検討した。
(Example 3: Effect of inhibiting osteoclast differentiation of chicken blood rat)
Bone marrow-derived monocytes / macrophages and other osteoclast progenitors are differentiated into osteoclasts in the presence of Macrophage-Colony Stimulating Factor (M-CSF) upon stimulation with the receptor activator of NF-κB ligand (RANKL). It has been known. Mouse bone marrow cells also differentiate into osteoclasts by co-culturing with MC3T3-G2 / PA6 cells, which are donors of RANKL, in a medium supplemented with M-CSF. Therefore, in order to investigate the influence of chicken blood on the osteoclast differentiation process, various concentrations of chicken blood extract were added to the mouse osteoclast-forming system, and the influence of chicken blood on the induction of osteoclast formation. It was investigated.
C57BL/6マウス大腿骨より採取した骨髄細胞と破骨細胞分化支持能を持つMC3T3-G2/PA6細胞を各種濃度の鶏血藤抽出液を含むビタミンD3およびデキサメサゾンを添加した10%仔牛血清添加α-Minimum essential medium（α-MEM）で7日間培養した。培養終了後、サンプルを破骨細胞マーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（TRAP）で染色し、TRAP陽性で3核以上の細胞を成熟破骨細胞としてカウントし、鶏血藤添加しなかったコントロール群と各種濃度の鶏血藤を加えた実験群に観察された成熟破骨細胞数をstudent-t検定で比較した。 結果を図６に示す。
図６の結果から、培地中に鶏血藤抽出液を添加しなかったコントロール群に比べ、鶏血藤抽出液0.1%および0.01%添加群では破骨細胞数がそれぞれ約100%および50%に減少し（ｐ＜0.01）、有意な発育抑制が検出された。以上の結果は、鶏血藤抽出液は、M-CSFとRANKL依存的な骨髄細胞から破骨細胞への分化を阻害することを示している。なお、前記鶏血藤抽出液のパーセントは、培地中の鶏血藤濃度である。
Bone marrow cells collected from C57BL / 6 mouse femur and MC3T3-G2 / PA6 cells with osteoclast differentiation supporting ability supplemented with 10% calf serum containing vitamin D3 and dexamethasone containing various concentrations of chicken blood -Cultured for 7 days in Minimum essential medium (α-MEM). After completion of the culture, the sample was stained with tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), an osteoclast marker, TRAP-positive cells with 3 or more nuclei were counted as mature osteoclasts, and the control group was not added with chicken blood. The number of mature osteoclasts observed in the experimental groups with various concentrations of chicken blood was added by the student-t test. The results are shown in FIG.
From the results shown in FIG. 6, the number of osteoclasts was increased to about 100% and 50% in the group with 0.1% and 0.01% chicken blood extract compared to the control group to which no chicken blood extract was added to the medium, respectively. Decreased (p <0.01) and significant growth inhibition was detected. These results indicate that chicken blood rat extract inhibits differentiation from bone marrow cells to osteoclasts dependent on M-CSF and RANKL. In addition, the percentage of the said chicken blood rat extract is the chicken blood rat density | concentration in a culture medium.
（実施例４：RANKLの破骨細胞延命作用に対する鶏血藤の抑制効果）
Receptor activator of NF-κB ligand （RANKL）やMacrophage-Colony Stimulating Factor（M-CSF）は破骨細胞の分化に必須であり、また破骨細胞の生存を延長することが知られている。破骨細胞をRANKL添加培地で培養すると、未添加培地と比べた場合に比べその寿命が大幅に延長する。一方、RANKL未添加培地中の破骨細胞は急速に死滅する。そこで、RANKLによる成熟破骨細胞生存に対する鶏血藤の影響を検討した。
(Example 4: Inhibitory effect of chicken blood on the osteoclast life-prolonging effect of RANKL)
Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) and Macrophage-Colony Stimulating Factor (M-CSF) are essential for osteoclast differentiation and are known to prolong osteoclast survival. When osteoclasts are cultured in a medium supplemented with RANKL, their lifespan is greatly extended compared to a medium supplemented with no RANKL. On the other hand, osteoclasts in the medium without RANKL die rapidly. Therefore, the effect of chicken blood on the survival of mature osteoclasts by RANKL was examined.
C57BL/6マウス骨髄細胞とMC3T3-G2/PA6細胞をビタミンD3(1x10-8M)、プロスタグランジンE2(1x10-7M)および10％仔牛血清を含むα-Mimimum Essential Medium (MEM)で培養、形成された破骨細胞を分離した。
その後、破骨細胞を、次の３種類の培地で４８時間培養した。
１．RANKL未添加α-MEM培地
２．RANKL(200μg/ml)、M-CSF（100μg/ml）添加α-MEM
３．RANKL(200μg/ml)、M-CSF（100μg/ml）および各種濃度の鶏血藤抽出液の添加α-MEM
培養後、成熟破骨細胞マーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（TRAP）の染色を行った。TRAP陽性で3核以上の細胞を生存破骨細胞としてカウントし、観察された破骨細胞数をstudent-t検定で比較した。結果を図７に示す。
図７の結果から、鶏血藤抽出液を最終濃度0.１%、0.01%、および0.001%濃度で培地に添加した実験群では、RANKL添加により寿命が延長した陽性コントロール群に比べ生存する破骨細胞数がそれぞれ約30%、40%および80%と有意に減少した（p<0.01）。これは、培養過程で細胞が死滅したことを示すものである。
C57BL / 6 mouse bone marrow cells and MC3T3-G2 / PA6 cells vitamin D3 (1x10 -8 M), prostaglandin E2 (1x10 - 7M) and cultured in α-Mimimum Essential Medium (MEM) containing 10% calf serum, The formed osteoclasts were isolated.
Thereafter, osteoclasts were cultured in the following three media for 48 hours.
1. 1. RANKL-free α-MEM medium Α-MEM with RANKL (200μg / ml) and M-CSF (100μg / ml)
3. Addition of RANKL (200 μg / ml), M-CSF (100 μg / ml) and various concentrations of chicken blood wisteria extract α-MEM
After the culture, staining with tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), which is a mature osteoclast marker, was performed. TRAP-positive cells with 3 or more nuclei were counted as viable osteoclasts, and the number of observed osteoclasts was compared by student-t test. The results are shown in FIG.
From the results shown in FIG. 7, the experimental group in which chicken blood wisteria extract was added to the medium at final concentrations of 0.1%, 0.01%, and 0.001% concentrations survived compared to the positive control group in which the life span was extended by the addition of RANKL. The number of bone cells was significantly reduced to about 30%, 40% and 80%, respectively (p <0.01). This indicates that cells were killed during the culture process.
（実施例５：鶏血藤の活性酸素種除去効果）
電子スピン共鳴（ESR）法によるフリーラジカル検出：
ヒドロキシルラジカルはフェントン反応（FeSO4にH2O2添加）を用いて発生させ、また、スーパーオキサイドラジカルはhypoxanthineにXanthine oxidase添加して発生させた。発生した各フリーラジカルはラジカル補足試薬DMPOで補足した後、電子スピン共鳴（ESR）装置（JES-RE 3X X-band、日本電子）を用いて検出した（対照群）。フリーラジカル消去活性実験は、このラジカル発生系に各種生薬、またはスーパーオキサイドディスムターゼ（SOD）およびdeferoxamine（DFX）を加え、補足されたラジカルのESRシグナル強度を比較検討した。
サンプル調製法と手技：
ESRによるヒドロキシルラジカルの検出は、リン酸緩衝液（PBS, pH7.0）185μl内に10-4M FeSO4 25μl、8.8M DMPO(5.5-Dimethyl-1-Pyrriline-N-Oxide、同人化学)を15μl加えた混合液に、10-4M H2O2 (和光)25μl加えて反応させ、1分後にESRフラットセルに130μl吸引、ESRレゾネーター内に装着して測定開始した。
ヒドロキシルラジカル消去活性実験は、リン酸緩衝液（PBS, pH7.0）135μl、生薬ないしdeferoxamine (NOVARTIS) 25μl、10-4M FeSO4 25μl、8.8M DMPO (5.5-Dimethyl-1-Pyrriline-N-Oxide、同人化学)を15μl加えた混合液に、10-4M H2O2 (和光)25μl加えて反応させ、1分後にESRフラットセルに130μl吸引、ESRレゾネーター内に装着して測定開始した。
ESRによるスーパーオキサイドラジカルの検出は、リン酸緩衝液（PBS, pH7.0）135μl内に0.01U/1ml Xanthine oxidase(Roche) 25μl、0.2mM DTPA(SIGMA) 25μl、 8.8M DMPO (5.5-Dimethyl-1-Pyrriline-N-Oxide、同人化学)を15μl加えた混合液に、10-5M hypoxanthine（SIGMA)を25μl加えて反応させ、1分後にESRフラットセルに130μl吸引、ESRレゾネーター内に装着して測定開始した。
スーパーオキサイドラジカル消去活性実験におけるフリーラジカルの検出は、リン酸緩衝液（PBS, pH7.0）135μl内に0.01U/1ml Xanthine oxidase、25μl、0.2mM DTPA(SIGMA) 25μl、各種生薬ないしSOD25μl、8.8M DMPO (5.5-Dimethyl-1-Pyrriline-N-Oxide、同人化学)を15μl加えた混合液に、10-5M hypoxanthine（SIGMA)を25μl加えて反応させ、1分後にESRフラットセルに130μl吸引、ESRレゾネーター内に装着して測定開始した。
ESR装置の測定条件：
磁場変調幅；0.063 mT、掃引幅；5 mT、掃引時間；1 min、時定数；0.03 sec、マイクロ波出力；8 mW、磁場；335.5±5 ｍT、受信感度；7.9×10に設定した。
結果を図８〜図１１に示す。
図８〜図１１の結果から、鶏血藤は著しく強力な活性酸素種除去効果を示すことが分かる。なお抑制率とは、対照群に対する活性酸素種の除去割合である。
(Example 5: Reactive oxygen species removal effect of chicken blood rat)
Free radical detection by electron spin resonance (ESR) method:
Hydroxyl radicals were generated using the Fenton reaction (FeSO 4 with H 2 O 2 added), and superoxide radicals were generated by adding xanthine oxidase to hypoxanthine. Each generated free radical was captured with a radical scavenging reagent DMPO, and then detected using an electron spin resonance (ESR) apparatus (JES-RE 3X X-band, JEOL) (control group). In the free radical scavenging activity experiment, various herbal medicines or superoxide dismutase (SOD) and deferoxamine (DFX) were added to this radical generating system, and the ESR signal intensity of the supplemented radical was compared and examined.
Sample preparation methods and procedures:
For detection of hydroxyl radicals by ESR, 25 µl of 10 -4 M FeSO 4 and 8.8 M DMPO (5.5-Dimethyl-1-Pyrriline-N-Oxide, Doujinshi) in 185 µl of phosphate buffer (PBS, pH 7.0) 15 μl of the mixed solution was added and reacted with 25 μl of 10 −4 MH 2 O 2 (Wako), and after 1 minute, 130 μl was sucked into the ESR flat cell and mounted in the ESR resonator to start the measurement.
Hydroxyl radical scavenging activity experiments were carried out using phosphate buffer (PBS, pH 7.0) 135 μl, crude drug or deferoxamine (NOVARTIS) 25 μl, 10 −4
Detection of superoxide radicals by ESR was carried out by using 0.01U / 1ml Xanthine oxidase (Roche) 25μl, 0.2mM DTPA (SIGMA) 25μl, 8.8M DMPO (5.5-Dimethyl-) in 135μl phosphate buffer (PBS, pH7.0). 25 μl of 10 -5 M hypoxanthine (SIGMA) was added to the mixed solution containing 15 μl of 1-Pyrriline-N-Oxide (Dojinshi), and after 1 minute, 130 μl was aspirated into the ESR flat cell and mounted in the ESR resonator. The measurement was started.
In the superoxide radical scavenging activity experiment, free radicals were detected in 0.01 U / 1 ml Xanthine oxidase, 25 μl, 0.2 mM DTPA (SIGMA) 25 μl, various crude drugs or
Measurement conditions for ESR equipment:
Magnetic field modulation width: 0.063 mT, sweep width: 5 mT, sweep time: 1 min, time constant: 0.03 sec, microwave output: 8 mW, magnetic field: 335.5 ± 5 mT, reception sensitivity: 7.9 × 10
The results are shown in FIGS.
From the results of FIGS. 8 to 11, it can be seen that chicken blood rat exhibits a remarkably strong reactive oxygen species removing effect. The suppression rate is the removal rate of active oxygen species relative to the control group.
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