JP5311806B2 - Biosilica production method and biosilica fixed substrate production method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオシリカ（bio-silica）製造法、およびバイオシリカ固定基板の製造法に関し、より詳細には、バイオシリカの製造においてバイオシリカの粒径（粒の大きさ）を制御する方法等に関する。 The present invention relates to a method for producing biosilica, and a method for producing a biosilica fixed substrate, and more particularly, a method for controlling the particle size (particle size) of biosilica in the production of biosilica, etc. About.
生物の歯や骨、貝殻や真珠などは、有機物と無機物とが互いにナノスケールからマクロスケールで融合または複合した構造体である。このような鉱物を生物が作り出す作用をバイオミネラリゼーションと呼ぶ。自然界では、膨大な量のシリカ(SiO2)が生物によって産出・利用されている。その生物の代表例が単細胞の珪藻である。珪藻の細胞壁は多くの植物の細胞壁とは異なり、セルロースではなくシリカを主成分として構成されている。 Biological teeth, bones, shells, pearls, and the like are structures in which organic and inorganic materials are fused or compounded from nanoscale to macroscale. The action that organisms produce such minerals is called biomineralization. In nature, a huge amount of silica (SiO 2 ) is produced and used by living organisms. A typical example of the organism is a single-cell diatom. Unlike many plant cell walls, diatom cell walls are composed primarily of silica, not cellulose.
1999年以降Krogerらにより、海洋性珪藻Cylindrotheca fusiformisの細胞壁をフッ素酸で溶かした溶液から、4kDa〜8kDaのポリペプチドSilaffin-1A1，Silaffin-1A2，Silaffin-1Bが単離され、これらのポリペプチドそれぞれにin vitroにおいて球状バイオシリカ形成能があることが示された(下記の非特許文献１・２)。また、これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列はsilaffin-1と呼ばれる遺伝子上に、Silaffin-1A2とSilaffin-1Bとは１回ずつ、Silaffin-1A1は５回繰り返しコードされていた（図１参照）。 Since 1999, Kroger et al. Isolated 4 kDa to 8 kDa polypeptides Silaffin-1A 1 , Silaffin-1A 2 , and Silaffin-1B from a solution of the cell wall of the marine diatom Cylindrotheca fusiformis dissolved in fluoric acid. It was shown that each peptide has the ability to form spherical biosilica in vitro (Non-patent Documents 1 and 2 below). In addition, the amino acid sequences of these three types of polypeptides were encoded on a gene called silaffin-1, and silaffin-1A 2 and silaffin-1B were encoded once and silaffin-1A 1 was repeated five times (FIG. 1). reference).
Silaffin-1は翻訳後調節により細胞内で分解作用を受け、それぞれの機能リピート単位に断片化されてから機能すると考えられているが、実際に生体内で各機能リピート単位に分かれてから機能しているかどうかは不明であり、リピート構造が保たれたまま機能している可能性も否定できない。いずれにしても、珪酸を顆粒状に凝集させ、球状バイオシリカ形成活性を有するこれらのポリペプチド（以下、総称して「シラフィン」という。）は、他の種類の珪藻にも存在し、珪藻殻形成に関与していると考えられている。 Silaffin-1 is thought to function after being broken down into each functional repeat unit by cell degradation due to post-translational regulation, but it actually functions after being divided into each functional repeat unit in vivo. It is unclear whether it is functioning or not, and the possibility of functioning while the repeat structure is maintained cannot be denied. In any case, these polypeptides that aggregate silicic acid into granules and have spherical biosilica-forming activity (hereinafter collectively referred to as “silafine”) are also present in other types of diatoms. It is thought to be involved in formation.
ところで近年、半導体微細加工技術をはじめとするナノテクノロジー分野では、生体物質の自己組織化機能に注目が集まっている。中でも、自然界の珪藻殻が持つ幾何学的な微細構造が注目されている。上述のように、珪藻由来ペプチドのシラフィンがin vitro系で珪酸を顆粒状に凝集させ、球状バイオシリカ形成活性を有することから、この生体物質の自己組織化機能を細胞外の人工的な環境で良好に再現・コントロールすることで、珪藻殻自己組織化機能を利用した人工バイオミネラリゼーション技術を開発・確立し、さらにこれを半導体微細加工技術に応用することが期待されている。そのため、例えばシラフィンを用いて半導体基板表面にナノスケールのバイオシリカを形成する場合に、基板表面へのシラフィンの吸着を制御することで、基板上にバイオシリカを所望のパターンに形成する技術の開発が求められている。 In recent years, in the nanotechnology field including semiconductor microfabrication technology, attention has been focused on the self-organization function of biological materials. Among them, the geometrical fine structure of the natural diatom shell is attracting attention. As mentioned above, the diatom-derived peptide silafin aggregates silicic acid into granules in an in vitro system and has a spherical biosilica-forming activity. Therefore, the self-organization function of this biological material can be achieved in an artificial environment outside the cell. By reproducing and controlling well, it is expected to develop and establish artificial biomineralization technology using diatom shell self-organization function and to apply it to semiconductor microfabrication technology. Therefore, for example, when nanoscale biosilica is formed on the surface of a semiconductor substrate using silafin, the development of technology to form biosilica in a desired pattern on the substrate by controlling the adsorption of silafine on the substrate surface. Is required.
シラフィンを用いたバイオシリカの製造は、半導体微細加工技術への応用にとどまらず、種々の産業利用が期待されている。その一例が、バイオシリカを酵素などの生体高分子の固定化用担体として利用し、この機能高分子担体をバイオリアクターやバイオセンサー等に利用する技術の開発である。ナノスケールの球状バイオシリカは単位重量あたりの表面積が非常に大きく、このバイオシリカに活性を保持したまま酵素などの機能高分子を固定することで、バイオリアクター等に有用な優れた反応素子の提供が期待できる。そのためには、バイオシリカの粒径（粒の大きさ）を良好に制御し、特にその微細化を図る方法が求められている。もちろん、バイオシリカの微細化は半導体微細加工技術への応用においても重要である。 The production of biosilica using silafine is not limited to application to semiconductor microfabrication technology, but is expected to be used in various industries. One example is the development of a technology that uses biosilica as a carrier for immobilizing biopolymers such as enzymes, and uses this functional polymer carrier for bioreactors, biosensors, and the like. Nanoscale spherical biosilica has an extremely large surface area per unit weight, and by providing functional polymers such as enzymes while retaining activity on this biosilica, it provides excellent reaction elements useful for bioreactors, etc. Can be expected. For this purpose, there is a demand for a method of controlling the particle size (particle size) of biosilica well, and in particular miniaturizing it. Of course, miniaturization of biosilica is also important in application to semiconductor microfabrication technology.
そこで、本発明は、シラフィンを用いたバイオシリカの新規製造法、およびバイオシリカ固定基板の製造法を提供すること、特に、シラフィンを用いたバイオシリカの製造において、バイオシリカの微細化を図るためその粒径を制御する方法を提供すること等をその課題とする。 Accordingly, the present invention provides a novel method for producing biosilica using silafine and a method for producing a biosilica fixed substrate, and in particular, in the production of biosilica using silafine, in order to reduce the size of biosilica. It is an object of the present invention to provide a method for controlling the particle size.
本発明者は、後述のように大腸菌発現系により大量精製した単リピート型シラフィンおよび７回リピート型シラフィンの２種類の組換えシラフィンを用いて種々のバイオシリカ形成条件について検討した結果、バイオシリカの粒径が、使用するシラフィンのリピートユニット濃度および形成時の温度に応じて変化し、これら濃度や温度を調節することで形成されるバイオシリカの粒径を制御しうること等を見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of studying various biosilica formation conditions using the two types of recombinant silafin, a single-repeat silafin and a seven-repeat silafine that were purified in large quantities by an E. coli expression system as described later, The present invention finds that the particle size of the biosilica can be controlled by changing the concentration of the silafine repeat unit used and the temperature at the time of formation, and adjusting the concentration and temperature. It came to complete.
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｊ）の発明を包含するものである。
Ａ） シラフィンを用いてバイオシリカ粒を形成する方法において、使用するシラフィンのリピートユニット濃度、および／又は、形成時の温度を調節することにより、形成するバイオシリカ粒の粒径を制御することを特徴とするバイオシリカの製造法。
Ｂ） 使用するシラフィンのリピートユニット濃度を１０ｎＭ以上１５００ｎＭ以下、および／又は、形成時の温度を４０℃以上８０℃以下の範囲に設定することを特徴とする上記Ａ）記載のバイオシリカ製造法。
Ｃ） 組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記Ａ）又はＢ）記載のバイオシリカ製造法。
Ｄ） 単リピート型又は７回リピート型の組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記Ｃ）記載のバイオシリカ製造法。
Ｅ） ヒスチジンのタグを付加した組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記Ｃ）記載のバイオシリカ製造法。
Ｆ） 所定の結晶面を有する基板上にシラフィンを吸着させて、基板上でシラフィンによりバイオシリカを形成させることを特徴とするバイオシリカ固定基板の製造法。
Ｇ） 基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成した後、シラフィンを選択吸着させ、次いで、シラフィン吸着部にバイオシリカを選択的形成させることを特徴とするパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
Ｈ） 低指数結晶面を有するＧａＡｓ結晶基板をエッチングすることにより、基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させることを特徴とする上記Ｇ）記載のパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
Ｉ） 基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させた後、強制酸化皮膜を形成することを特徴とする上記Ｈ）記載のパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
Ｊ） ７回リピート型の組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記Ｆ）〜Ｉ）のいずれかに記載のバイオシリカ固定基板の製造法。
That is, the present invention includes the following inventions A) to J) as industrially useful inventions.
A) In the method of forming biosilica particles using silafine, the particle size of the biosilica particles to be formed is controlled by adjusting the repeat unit concentration of silafine used and / or the temperature during formation. A method for producing biosilica characterized.
B) The process for producing biosilica according to A) above, wherein the repeat unit concentration of silafine used is 10 nM or more and 1500 nM or less, and / or the temperature during formation is set in the range of 40 ° C. or more and 80 ° C. or less.
C) The method for producing biosilica according to A) or B) above, wherein recombinant silafine is used.
D) A method for producing biosilica as described in C) above, wherein the single-repeat or seven-repeat recombinant silafine is used.
E) A method for producing biosilica as described in C) above, wherein a recombinant silafin to which a histidine tag is added is used.
F) A method for producing a biosilica fixed substrate, wherein silafine is adsorbed on a substrate having a predetermined crystal plane, and biosilica is formed on the substrate by silafine.
G) Fabrication of a patterned biosilica fixed substrate, wherein different crystal planes are formed on the substrate surface by patterning, then silafine is selectively adsorbed, and then biosilica is selectively formed in the silafine adsorbing portion. Law.
H) A method for producing a patterned biosilica fixed substrate as described in G) above, wherein a different crystal plane is formed on the substrate surface by patterning by etching a GaAs crystal substrate having a low index crystal plane. .
I) A method for producing a patterned biosilica fixed substrate according to H) above, wherein a forced oxide film is formed after forming different crystal planes on the substrate surface by patterning.
J) A process for producing a biosilica-immobilized substrate according to any one of the above F) to I), wherein 7-repeat recombinant silafine is used.
本発明によれば、使用するシラフィンのリピートユニット濃度等を調節することによってバイオシリカの粒径（粒の大きさ）を良好に制御することができるので、その微細化を図ることができる。また、本発明のバイオシリカ固定基板の製造法により、基板上でバイオシリカを選択的形成させることが可能である。 According to the present invention, since the particle size (particle size) of biosilica can be favorably controlled by adjusting the repeat unit concentration and the like of the silafine used, it is possible to reduce the size. In addition, biosilica can be selectively formed on a substrate by the method for producing a biosilica fixed substrate of the present invention.
以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面においてアミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、例えばアミノ酸については、ＧまたはＧｌｙ：グリシン、ＡまたはＡｌａ：アラニン、ＶまたはＶａｌ：バリン、ＬまたはＬｅｕ：ロイシン、ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン、ＳまたはＳｅｒ：セリン、ＴまたはＴｈｒ：スレオニン、ＣまたはＣｙｓ：システイン、ＭまたはＭｅｔ：メチオニン、ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸、ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸、ＫまたはＬｙｓ：リジン、ＲまたはＡｒｇ：アルギニン、ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン、ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン、ＹまたはＴｙｒ：チロシン、ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン、ＰまたはＰｒｏ：プロリン、ＮまたはＡｓｎ：アスパラギン、ＱまたはＧｌｎ：グルタミンである。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. In the present specification and drawings, when an amino acid or the like is represented by an abbreviation, the notation is based on an abbreviation by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or an abbreviation commonly used in the field. For example, for amino acids, G or Gly: Glycine, A or Ala: alanine, V or Val: valine, L or Leu: leucine, I or Ile: isoleucine, S or Ser: serine, T or Thr: threonine, C or Cys: cysteine, M or Met: methionine, E or Glu: glutamic acid, D or Asp: aspartic acid, K or Lys: lysine, R or Arg: arginine, H or His: histidine, F or Phe: phenylalanine, Y or Tyr: tyrosine, W or Trp: tryptophan , P or Pro: proline, N or Asn: asparagine, Q or Gln: glutamine.
［１］バイオシリカの粒径（粒の大きさ）を制御する方法
上述のように、本発明のバイオシリカ製造法は、シラフィンを用いてバイオシリカ粒を形成する場合に、使用するシラフィンのリピートユニット濃度、および／又は、形成時の温度を調節することにより、形成するバイオシリカ粒の粒径を制御することを特徴とする。
[1] Method for controlling the particle size (particle size) of biosilica As described above, the biosilica production method of the present invention is a repeat of silafine used when biosilica particles are formed using silafine. The particle size of the biosilica particles to be formed is controlled by adjusting the unit concentration and / or the temperature at the time of formation.
シラフィンは、天然シラフィン、合成シラフィンまたは組換えシラフィンの使用が例示され、特に限定されるものではないが、大腸菌などを用いた大量調製が可能なことから組換えシラフィンの使用が好ましい。図１および配列表の配列番号１には、海洋性珪藻Cylindrotheca fusiformis由来天然シラフィン-1（Silaffin-1）の全アミノ酸配列が示される。この一部のポリペプチド（SSKKSGSYSGSKGSK）を化学合成した合成シラフィンには、バイオシリカ形成能（沈積能）が認められている。 The use of natural silafine, synthetic silafine or recombinant silafin is exemplified and is not particularly limited. However, the use of recombinant silafin is preferable because large-scale preparation using Escherichia coli and the like is possible. FIG. 1 and SEQ ID NO: 1 in the sequence listing show the entire amino acid sequence of natural silaffin-1 derived from the marine diatom Cylindrotheca fusiformis. Synthetic silaffins obtained by chemically synthesizing some of these polypeptides (SSKKSGSYSGSKGSK) have a biosilica forming ability (deposition ability).
また、本発明者が大腸菌発現系により大量精製した単リピート型シラフィンおよび７回リピート型シラフィンの２種類の組換えシラフィンの配列が、それぞれ配列番号４と５に示される。このうち単リピート型シラフィンは、シラフィン-1のリピート単位Ｒ７のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加したアミノ酸配列からなる。他方、７回リピート型シラフィンは、シラフィン-1の７つのリピート単位Ｒ１〜Ｒ７のアミノ酸配列（配列番号３）のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加したアミノ酸配列からなる（図１参照）。 In addition, the sequences of two types of recombinant silafine, a single repeat-type silafine and a 7-repeat-type silafin, which were purified in large quantities by the present inventors using an E. coli expression system, are shown in SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively. Among these, single repeat type silafine consists of an amino acid sequence in which methionine is added to the N terminus and leucine, glutamic acid and histidine hexamer are added to the C terminus of the amino acid sequence of the repeat unit R7 (SEQ ID NO: 2) of silafin-1. On the other hand, the 7-repeat type silafine is an amino acid sequence in which methionine is added to the N terminus of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of the 7 repeat units R1 to R7 of silafin-1, and leucine, glutamic acid and histidine hexamer are added to the C terminus. (See FIG. 1).
後述の実施例に示すように、上記の単リピート型シラフィンおよび７回リピート型シラフィンのいずれもバイオシリカ形成活性が確認されているので、これらの組換えシラフィンを本発明に使用することは好ましい。これらの組換えシラフィンは、ニッケルカラムを用いて精製するためにＣ末にヒスチジンのタグを付加しているが、このようにヒスチジンのタグを付加した組換えシラフィンを使用することは以下の点から好ましい。即ち、シラフィンを用いてin vitro系でバイオシリカを形成する場合に、反応溶液中にニッケルイオンを加えることで、組換えシラフィンのヒスチジン側鎖がニッケルイオンと結合し、ニッケルを含有した特殊なバイオシリカの形成が可能である。このように他の原子・分子と結合親和性のある配列タグを付加した組換えシラフィンを使用することは、他の原子・分子を含有した特殊なバイオシリカを形成するのに有用である。 As shown in the below-mentioned Examples, since the biosilica-forming activity of both the single repeat-type silafine and the 7-repeat-type silafin has been confirmed, it is preferable to use these recombinant silafine in the present invention. These recombinant silaffins are tagged with a histidine tag at the C-terminal for purification using a nickel column. The use of recombinant silaffins with a histidine tag in this way is as follows. preferable. In other words, when biosilica is formed in vitro using silafine, the histidine side chain of the recombinant silafin is combined with nickel ions by adding nickel ions to the reaction solution, and a special biomaterial containing nickel is added. Silica can be formed. The use of recombinant silafine to which a sequence tag having binding affinity for other atoms / molecules is added in this way is useful for forming special biosilica containing other atoms / molecules.
もちろん、使用する単リピート型シラフィン、７回リピート型シラフィンの各アミノ酸配列は配列番号２〜５に示されるものに限られず、このうち１〜数個のアミノ酸を置換、欠失または付加させたものを使用してもよいし、２〜６回リピート型のシラフィンを使用してもよい。さらに、バイオシリカ形成活性を有する限り、他の珪藻由来のシラフィンや、その合成シラフィン、組換えシラフィンを使用してもよい。 Of course, each amino acid sequence of the single repeat type silafine used and the 7 times repeat type silafine is not limited to those shown in SEQ ID NOs: 2 to 5, and one to several amino acids are substituted, deleted or added. May be used, or repeat type silafine may be used 2 to 6 times. Furthermore, as long as it has biosilica formation activity, you may use the silafine derived from other diatoms, the synthetic silafine, and the recombinant silafine.
また、本発明のバイオシリカ製造法において、バイオシリカの原料となる物質（換言すれば、シラフィンのバイオシリカ形成活性の基質となる物質）は珪酸であるが、具体的な基質・原料として、テトラメトキシシラン（TMOS）、テトラエトキシシラン（TEOS）などのアルコキシシラン（珪酸エステル）を使用することができる。そのほかに基質・原料としてケイ酸ソーダ（水ガラス）やコロイダルシリカ等の使用も考えられ、使用する基質・原料は特に限定されるものではない。 In addition, in the biosilica production method of the present invention, the material that is a raw material for biosilica (in other words, the material that is a substrate for the biosilica formation activity of silafine) is silicic acid. Alkoxysilanes (silicate esters) such as methoxysilane (TMOS) and tetraethoxysilane (TEOS) can be used. In addition, use of sodium silicate (water glass), colloidal silica, or the like as a substrate / raw material is also conceivable, and the substrate / raw material to be used is not particularly limited.
シラフィンによるバイオシリカ形成反応は、シラフィン、基質・原料となる珪酸塩（例えばテトラメトキシシラン（TMOS））、水、リン酸緩衝液のみで速やかに進行する。通常、直径約 500 nm の球状バイオシリカが数珠状あるいは房状に連結した形で形成される。各球状バイオシリカの粒径は、走査型電子顕微鏡（SEM）などを用いることにより測定可能である。 The biosilica formation reaction by silafine proceeds rapidly only with silafine, silicate as a substrate / raw material (for example, tetramethoxysilane (TMOS)), water, and phosphate buffer. Usually, spherical biosilica having a diameter of about 500 nm is formed in a form connected in a bead shape or tuft shape. The particle size of each spherical biosilica can be measured by using a scanning electron microscope (SEM) or the like.
本発明者は、後述のようにシラフィンのリピートユニット濃度、反応温度などが、シラフィンのバイオシリカ形成活性にどのような影響を与えるか、特にバイオシリカの粒径に与える影響を検討した。その結果、シラフィンのリピートユニット濃度はバイオシリカの粒径に影響を与え、シラフィン濃度を低く設定するほどバイオシリカの粒径は小さくなり、特に、シラフィンのリピートユニット濃度を1500 nM以下に設定することで、バイオシリカの粒径を100-200 nm程度またはそれ以下に微細化することができた（図３）。また、シラフィンのリピートユニット濃度を10 nMとした場合でも、バイオシリカ形成活性が認められた（図４）。 As described later, the present inventor examined the influence of the repeat unit concentration of silafine, the reaction temperature, etc. on the biosilica formation activity of silafine, particularly the influence on the particle diameter of biosilica. As a result, the repeat unit concentration of silafine affects the particle size of biosilica, and the lower the silafine concentration, the smaller the particle size of biosilica. In particular, the repeat unit concentration of silafine should be set to 1500 nM or less. Thus, the particle size of biosilica could be reduced to about 100-200 nm or less (FIG. 3). Moreover, even when the repeat unit concentration of silafine was 10 nM, biosilica forming activity was observed (FIG. 4).
さらに、反応温度の影響を検討した結果、広い温度範囲でシラフィンのバイオシリカ形成活性が認められたが、反応温度はバイオシリカの粒径に影響を与え、反応温度を高く設定するほどバイオシリカの粒径は小さくなり、特に、反応温度を４０℃以上に設定することで、バイオシリカの粒径を約300 nm程度またはそれ以下に微細化することができた（図７）。 Furthermore, as a result of examining the influence of the reaction temperature, biosilica formation activity of silafine was observed in a wide temperature range, but the reaction temperature affected the particle size of the biosilica, and the higher the reaction temperature was set, the more the biosilica The particle size became smaller, and in particular, by setting the reaction temperature to 40 ° C. or higher, the particle size of biosilica could be reduced to about 300 nm or less (FIG. 7).
以上の結果から、バイオシリカの微細化を図るために、使用するシラフィンのリピートユニット濃度を１０ｎＭ以上１５００ｎＭ以下とすること、あるいは、反応温度を４０℃以上の範囲に設定することは好ましい。なお、好ましい反応温度の上限は、シラフィンタンパク質の変性温度等を考慮して８０℃程度と考えられる。 From the above results, it is preferable to set the repeat unit concentration of silafine to be 10 nM or more and 1500 nM or less, or to set the reaction temperature in the range of 40 ° C. or more in order to make biosilica finer. The preferable upper limit of the reaction temperature is considered to be about 80 ° C. in consideration of the denaturation temperature of the silafine protein.
また、反応液のｐＨの影響についても検討した結果、6.0≦ｐＨ≦8.0の範囲において、均一な球状バイオシリカの形成が観察されたため、この範囲でバイオシリカ形成反応を行うことが好ましい。なお、反応液のNaCl濃度を段階的に変えることで、イオン強度の影響についてもあわせて検討したが、バイオシリカの粒径に対する影響は認められなかった。 Further, as a result of examining the influence of the pH of the reaction solution, formation of uniform spherical biosilica was observed in the range of 6.0 ≦ pH ≦ 8.0. Therefore, the biosilica formation reaction is preferably performed in this range. In addition, although the influence of the ionic strength was examined by changing the NaCl concentration of the reaction solution stepwise, the influence on the particle size of biosilica was not recognized.
本方法は、シラフィン、珪酸塩、水、リン酸緩衝液といったシンプルな組成で、しかも迅速に微細化したバイオシリカを形成することができる。また、反応溶液中に、酵素等の機能高分子、あるいは低分子等を添加して反応させることで、これらの添加物質を含有したバイオシリカを形成することができる。実際に、酵素β-ガラクトシダーゼを添加して反応を行ったところ、酵素活性を保持したままβ-ガラクトシダーゼをバイオシリカに固定することができ、酵素とバイオシリカとの複合体を作ることに成功した。このようにして得られた複合体は、酵素反応を行うバイオリアクターの反応素子などとして利用することができる。 This method can form a biosilica with a simple composition such as silafine, silicate, water, and phosphate buffer, and rapidly miniaturized. Moreover, biosilica containing these additive substances can be formed by adding a functional polymer such as an enzyme or a low molecule to the reaction solution for reaction. In fact, the enzyme β-galactosidase was added and the reaction was carried out. As a result, β-galactosidase was immobilized on biosilica while retaining the enzyme activity, and the enzyme-biosilica complex was successfully made. . The complex thus obtained can be used as a reaction element of a bioreactor that performs an enzyme reaction.
［２］バイオシリカ固定基板の製造法
本発明のバイオシリカ固定基板の製造法は、（ａ）所定の結晶面を有する基板上にシラフィンを吸着させて、基板上でシラフィンによりバイオシリカを形成させる方法、あるいは、（ｂ）基板表面上に異なった結晶面がパターニングされた状態を創出させた後、シラフィンを選択吸着させ、次いで、シラフィン吸着部にバイオシリカを選択的形成させることを特徴とするパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法である。
[2] Method for Producing Biosilica Fixed Substrate In the method for producing a biosilica fixed substrate of the present invention, (a) silafine is adsorbed on a substrate having a predetermined crystal plane, and biosilica is formed on the substrate by silafine. Or (b) creating a state in which different crystal planes are patterned on the substrate surface, selectively adsorbing silafine, and then selectively forming biosilica in the silafine adsorbing portion. This is a method for producing a patterned biosilica fixed substrate.
上記（ｂ）の方法の好ましい態様の１つとして、低指数結晶面を有するＧａＡｓ（ガリウム砒素）結晶基板をエッチングすることにより、基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させる方法を挙げることができる。ここで、「低指数結晶面」とは、（１００）、（１１０）、（１１１）Ａ、（１１１）Ｂ面等のことである。 One preferred embodiment of the method (b) is a method of forming different crystal planes on the substrate surface by patterning by etching a GaAs (gallium arsenide) crystal substrate having a low index crystal plane. Can do. Here, “low index crystal plane” refers to (100), (110), (111) A, (111) B planes, and the like.
本発明のバイオシリカ吸着基板の製造法においては、バイオシリカの選択形成、すなわち、選択的固定の観点より、基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させた後、強制酸化皮膜を形成することは好ましい。また、本発明のバイオシリカ吸着基板の製造法において使用するシラフィンとしては、ＧａＡｓ結晶基板との親和性の観点より、７回リピート型の組換えシラフィン、もしくは他の複数回リピート型の組換えシラフィンであることが好ましい。 In the method for producing a biosilica-adsorbing substrate of the present invention, from the viewpoint of selective formation of biosilica, that is, selective fixation, a different crystal plane is formed on the substrate surface by patterning, and then a forced oxide film is formed. It is preferable. In addition, the silafine used in the method for producing a biosilica-adsorbing substrate of the present invention may be a 7-repeat recombinant silafine or other multiple-repeat recombinant silafine from the viewpoint of affinity with a GaAs crystal substrate. It is preferable that
以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明するが、本発明はこれら実施例の記載によって何ら制限されるものではない。 Examples of the present invention will be described below with reference to the drawings. However, the present invention is not limited to the description of these examples.
［実験方法］
［１］バイオシリカの粒径制御に関する実験
［1-1］実験に使用したシラフィン
シラフィンは、大腸菌発現系により大量精製した単リピート型の組換えシラフィン-1および７回リピート型の組換えシラフィン-1の２種類を使用した。（以下、これらを総称して、「組換えシラフィン」あるいは単に「シラフィン」という場合がある。）
[experimental method]
[1] Experiments on particle size control of biosilica [1-1] Silafine used in the experiment Silafine is a single-repeat recombinant silafine-1 and 7-repeat recombinant silafine- Two types of 1 were used. (Hereinafter, these may be collectively referred to as “recombinant silafine” or simply “silafine”).
シラフィンの調製において、宿主大腸菌にはBL21(DE3) (Novagen, EMD Biosciences, Inc., Canada)を使用し、プラスミドベクターにはpET21a (Novagen, EMD Biosciences, Inc., Canada)を使用した。また、ヒスチジンタグを付加し、ニッケルニトリロ酢酸(Ni-NTA)カラムを用いて精製を行った。実験に使用した単リピート型の組換えシラフィンおよび７回リピート型の組換えシラフィンのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４・５に示される。 In the preparation of silafin, BL21 (DE3) (Novagen, EMD Biosciences, Inc., Canada) was used as the host E. coli, and pET21a (Novagen, EMD Biosciences, Inc., Canada) was used as the plasmid vector. In addition, histidine tag was added and purification was performed using a nickel nitriloacetic acid (Ni-NTA) column. The amino acid sequences of the single-repeat recombinant silafine and the seven-repeat recombinant silafin used in the experiment are shown in SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively.
［1-2］各反応条件の検討
シラフィン(リピートユニット)濃度、基質(TMOS)量、ｐＨおよび反応温度の各反応条件について、シラフィンのバイオシリカ形成活性にどのような影響を与えるか、特にここではバイオシリカの粒径に与える影響を検討した。
[1-2] Examination of each reaction condition How does each reaction condition of silafine (repeat unit) concentration, substrate (TMOS) amount, pH and reaction temperature affect the biosilica formation activity of silafine, especially here Then, the influence on the particle size of biosilica was examined.
［1-2-1］シラフィン(リピートユニット)濃度の影響検討
精製・濃縮・Buffer置換したシラフィンのサンプルに対し、Buffer置換に使用した脱imidazole bufferを用いて、観察するシラフィン濃度条件の10倍濃度になるように段階希釈を行った。そして以下の反応溶液を混合し、最後に１M TMOS(テトラメトキシシラン)を添加し、室温でバイオシリカ形成反応を開始した。
800 mM Na2HPO4 (終pH 7.75)
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
[1-2-1] Examination of the effect of silafin (repeat unit) concentration 10 times the concentration of silafine concentration observed using the deimidazole buffer used for buffer substitution for purified, concentrated, and buffer-substituted silafine samples Serial dilution was performed so that Then, the following reaction solutions were mixed, and finally 1M TMOS (tetramethoxysilane) was added to start a biosilica formation reaction at room temperature.
800 mM Na 2 HPO 4 (final pH 7.75)
(Final concentration 80 mM) 10 μL
Recombinant silafin-1 10 μL
70 μL of ultrapure water
1M TMOS (final concentration 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
TMOS添加後5分以降10分以内に13,000 rpm、3分、室温で遠心し、超純水での洗浄操作を、数回(実験時期によって異なる)繰り返した。その後、ガリウム砒素基板（以下、「GaAs基板」という場合がある。）に、得られたバイオシリカを10μL程度スポットし、シリカゲル吸湿剤を敷いた10cmプラスチックシャーレに静置した後、フタをしてパラフィルムで密閉し数時間放置し、バイオシリカを乾燥させた。乾燥後、電子線露光装置 (ELS-3300PLM, Elionix, Tokyo, Japan)の走査型電子顕微鏡(SEM)機能を用いてバイオシリカを観察した。 Centrifuged at 13,000 rpm for 3 minutes at room temperature within 5 to 10 minutes after the addition of TMOS, and the washing operation with ultrapure water was repeated several times (depending on the experimental period). Then, about 10 μL of the obtained biosilica is spotted on a gallium arsenide substrate (hereinafter sometimes referred to as “GaAs substrate”), left on a 10 cm plastic petri dish covered with a silica gel moisture absorbent, and then capped. Sealed with parafilm and allowed to stand for several hours to dry the biosilica. After drying, biosilica was observed using a scanning electron microscope (SEM) function of an electron beam exposure apparatus (ELS-3300PLM, Elionix, Tokyo, Japan).
［1-2-2］基質(TMOS)量の影響検討
１M TMOS溶液調製し、これを段階希釈した。そして以下の反応溶液を混合し、最後にTMOSを添加し、室温でバイオシリカ形成反応を開始した。
800 mM Phosphate (終pH 7.0)
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1(リピートユニット1500 nM) 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM, 50 mM,…) 10 μL
Total 100 μL
この後の操作は［1-2-1］と共通である。
[1-2-2] Examination of influence of substrate (TMOS) amount A 1M TMOS solution was prepared and diluted serially. Then, the following reaction solutions were mixed, and finally TMOS was added to start a biosilica formation reaction at room temperature.
800 mM Phosphate (final pH 7.0)
(Final concentration 80 mM) 10 μL
Recombinant silafin-1 (repeat unit 1500 nM) 10 μL
70 μL of ultrapure water
1M TMOS (final concentration 100 mM, 50 mM,…) 10 μL
Total 100 μL
Subsequent operations are the same as [1-2-1].
［1-2-3］pHの影響検討
TMOSを加える前の反応溶液混合液のpHが目的の値となるように、シラフィンのバイオシリカ形成反応に用いるリン酸溶液のpHを調節し、室温でバイオシリカ形成反応を行った。
800 mM Phosphate
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1(リピートユニット1500 nM) 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
この後の操作は［1-2-1］と共通である。
[1-2-3] Examination of pH effect
The pH of the phosphoric acid solution used for the biosilica formation reaction of silafine was adjusted so that the pH of the reaction solution mixture before adding TMOS would be the target value, and the biosilica formation reaction was performed at room temperature.
800 mM Phosphate
(Final concentration 80 mM) 10 μL
Recombinant silafin-1 (repeat unit 1500 nM) 10 μL
70 μL of ultrapure water
1M TMOS (final concentration 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
Subsequent operations are the same as [1-2-1].
［1-2-4］反応温度の影響検討
TMOS以外の反応溶液を混合した溶液、および１M TMOSをそれぞれ目的の温度環境(例えば0℃なら氷水中、40℃ならサンプルポケットに水を入れておいたヒートブロックを用いる)で３分間プレインキュベートした。プレインキュベート後TMOSを混合液に添加し反応を開始した。反応開始５分後に氷水中に入れ、13,000 rpm、3分、4℃で遠心し、超純水での洗浄操作を、５回繰り返した。
800 mM Phosphate (終pH 7.0)
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1(リピートユニット1500 nM) 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
この後の操作は［1-2-1］と共通である。
[1-2-4] Examination of influence of reaction temperature
Pre-incubate the solution containing the reaction solution other than TMOS and 1M TMOS for 3 minutes in the desired temperature environment (for example, ice water at 0 ° C, or heat block with water in sample pocket at 40 ° C). . After pre-incubation, TMOS was added to the mixture to initiate the reaction. Five minutes after the start of the reaction, it was placed in ice water, centrifuged at 13,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C., and washing with ultrapure water was repeated 5 times.
800 mM Phosphate (final pH 7.0)
(Final concentration 80 mM) 10 μL
Recombinant silafin-1 (repeat unit 1500 nM) 10 μL
70 μL of ultrapure water
1M TMOS (final concentration 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
Subsequent operations are the same as [1-2-1].
［２］バイオシリカ固定基板の製造法に関する実験
［2-1］７回リピート型シラフィン(164.4μM)を用いたバイオシリカ形成とGaAs(100)酸化膜上での固定
７回リピート型シラフィンを用いてバイオシリカの形成を行った。全ての作業は室温にて行っている。反応溶液としては、７回リピート型シラフィン 50μl, 800mMリン酸buffer 50μl, 1M TMOS 50μl, MilliQ水 350μlである。これらの溶液をエッペンチューブ内で反応させ、バイオシリカを形成させた。その後、遠心し、バイオシリカ以外の成分を分離した。形成したバイオシリカをGaAs(100)基板上に固定し、走査型電子顕微鏡（SEM）観察を行った。同時にEDX（energy dispersive X-ray analysis）を用いて組成分析を行った。
[2] Experiment on manufacturing method of biosilica fixed substrate [2-1] Formation of biosilica using 7 times repeat type silafine (164.4μM) and fixation on GaAs (100) oxide film Using 7 times repeat type silafine Biosilica was formed. All work is done at room temperature. As a reaction solution, 7 times repeat type silafine 50 μl, 800 mM phosphate buffer 50 μl, 1 M TMOS 50 μl, MilliQ water 350 μl. These solutions were reacted in an Eppendorf tube to form biosilica. Then, it centrifuged and isolate | separated components other than biosilica. The formed biosilica was fixed on a GaAs (100) substrate and observed with a scanning electron microscope (SEM). At the same time, composition analysis was performed using EDX (energy dispersive X-ray analysis).
［2-2］GaAs基板上での７回リピート型シラフィン(164.4μM)吸着実験
［単一基板上での７回リピート型シラフィン吸着実験］
単リピート型シラフィンよりもルイス塩基として働くアミノ酸を数多く有する７回リピート型シラフィンはGaAs自然酸化膜内の極性に依存して、吸着に選択性を持つ可能性が示唆される。そこで、GaAs(100),(110),(111)A,(111)B,Si(100)基板を用い、７回リピート型シラフィン吸着能を測定した。本発明者は吸着能についてGaAs酸化膜を構成するGa2O3,As2O3に着目しており、そのため、全ての基板に対して、GaAs酸化膜内Ga2O3の局所的な化学的安定化を目的とした過熱水蒸気照射を250℃、60分間行った。また、シラフィンとGaAs基板間の吸着をより顕著に確認できることが期待されるため、基板上へシラフィンを添加後、バイオシリカ形成原料を供給した。
[2-2] Seven-repeat type silafine (164.4μM) adsorption experiment on GaAs substrate [7-repeat type silafine adsorption experiment on single substrate]
It is suggested that the 7-repeat silafine, which has more amino acids acting as Lewis bases than the single-repeat silafine, may have adsorption selectivity depending on the polarity in the GaAs natural oxide film. Therefore, 7 times repeat type silafine adsorption ability was measured using GaAs (100), (110), (111) A, (111) B, Si (100) substrates. The present inventor has paid attention to Ga 2 O 3 and As 2 O 3 constituting the GaAs oxide film with respect to the adsorption ability. Therefore, the local chemistry of Ga 2 O 3 in the GaAs oxide film is applied to all the substrates. Was performed for 60 minutes at 250 ° C. with superheated steam irradiation for the purpose of mechanical stabilization. In addition, since it is expected that adsorption between the silafine and the GaAs substrate can be more remarkably confirmed, a biosilica forming raw material was supplied after adding silafine onto the substrate.
すなわち、７回リピート型シラフィン吸着の極性依存の確認手順として、以下のプロセスを行った。(1)基板上にシラフィンを5μlアプライし、シラフィンを基板表面に吸着させる。(2)バイオシリカ形成の原料（800mMリン酸buffer, MilliQ水, 1M TMOS）5μlをアプライする。(3)MilliQ水による洗浄を行う。この洗浄によってバイオシリカが残存した場合をシラフィン吸着、はく離した場合をシラフィン非吸着とした。 That is, the following process was performed as a procedure for confirming the polarity dependence of 7-time repeat-type silafine adsorption. (1) Apply 5 μl of silafine on the substrate and adsorb the silafine on the substrate surface. (2) Apply 5 μl of raw material for biosilica formation (800 mM phosphate buffer, MilliQ water, 1 M TMOS). (3) Wash with MilliQ water. The case where biosilica remained by this washing was adsorbed with silafine, and the case where it was peeled off was not adsorbed with silafine.
［Ga-rich,As-rich面複合構造基板上での７回リピート型シラフィン(164.4μM)吸着実験］
さらに、同一基板上においてパターニングして形成された異なった結晶面に対する選択吸着、すなわち、結晶面上の酸化膜内の極性の違いによる７回リピート型シラフィンの選択吸着を明らかにすることを目的とし、GaAs(100)基板をウエットエッチング（etchant:H2SO4:H2O2:H2O=1:8:1000）することによって、Ga-rich面およびAs-rich面を持つ構造物を作製した。その後、基板への過熱水蒸気の印加→シラフィン吸着→原料供給→洗浄を行い、SEM観察を行った。作製した基板におけるGa-rich面およびAs-rich面は微細な領域であること、さらに、バイオシリカは球の集合体で存在する可能性が高いことからバイオシリカの重力による沈殿を極力抑える必要性がある。そこで、バイオシリカ形成反応においてシラフィンが過多な条件下（原料供給律速反応）で実験を行った。この反応系では、供給した原料の量に応じたバイオシリカ形成が見込まれるため、極少量のバイオシリカ形成が可能である。そこで、「バイオシリカの沈殿力＜シラフィンの面極性による吸着力」を実現すべく、原料供給量に着目した。(1)シラフィン3μl:原料3μl, (2)シラフィン3μl:原料2μl, (3)シラフィン3μl:原料1μlの3通りの条件下で行った。(1)、(2)、(3)全ての反応は原料供給律速でのバイオシリカ形成である。
[Seven-repeat silafine (164.4μM) adsorption experiment on Ga-rich, As-rich planar composite structure substrate]
Furthermore, the purpose is to clarify the selective adsorption to different crystal planes formed by patterning on the same substrate, that is, the selective adsorption of 7 times repeat type silafin by the difference in polarity in the oxide film on the crystal plane. A structure with Ga-rich and As-rich surfaces can be obtained by wet etching (etchant: H 2 SO 4 : H 2 O 2 : H 2 O = 1: 8: 1000) on a GaAs (100) substrate. Produced. Thereafter, application of superheated steam to the substrate → silafine adsorption → raw material supply → cleaning was performed, and SEM observation was performed. Since the Ga-rich surface and As-rich surface of the fabricated substrate are fine regions, and biosilica is likely to exist as an aggregate of spheres, it is necessary to suppress biosilica precipitation by gravity as much as possible. There is. Therefore, an experiment was conducted under a condition where the silafine is excessive in the biosilica formation reaction (raw material supply rate-limiting reaction). In this reaction system, formation of biosilica according to the amount of the supplied raw material is expected, so that a very small amount of biosilica can be formed. Therefore, attention was paid to the amount of raw material supplied in order to realize “the precipitating power of biosilica <the adsorption power due to the surface polarity of silafine”. (1) Silafine 3 μl: Raw material 3 μl, (2) Silafine 3 μl: Raw material 2 μl, (3) Silafine 3 μl: Raw material 1 μl, three conditions were used. All the reactions (1), (2), and (3) are biosilica formation at a feed rate-determining rate.
［2-3］GaAs(111)A,(111)B酸化膜評価
GaAs酸化膜極性の違いによる７回リピート型シラフィン吸着の優位性が発生するメカニズムを検証するために、異なる表面極性を持つGaAs(111)A,(111)B酸化膜内の組成変調評価を行った。本発明者が着目したのが基板温度に依存したGaAs酸化膜熱脱離過程である。GaAs酸化膜はGa系酸化物およびAs系酸化物で構成されており、真空環境において、基板温度に応じた物質の脱離が確認可能である。GaAs(100)酸化膜脱離過程は、基板温度が100℃付近ではH2Oの脱離、143℃付近ではAsOなどのAs系酸化物の脱離、200℃〜300℃において、As2O3+2GaAs→Ga2O3+2As2(or As4)への置換、さらに、Ga系酸化物の脱離反応は、410℃においてGa2O3+Ga→Ga2Oの反応が起こることによって誘起される。
[2-3] GaAs (111) A, (111) B oxide evaluation
In order to verify the mechanism by which the 7-repeat silafine adsorption predominates due to the difference in GaAs oxide polarity, compositional modulation in GaAs (111) A and (111) B oxides with different surface polarities was evaluated. It was. The inventor has focused on the thermal desorption process of GaAs oxide film depending on the substrate temperature. The GaAs oxide film is composed of a Ga-based oxide and an As-based oxide, and it is possible to confirm the detachment of a substance according to the substrate temperature in a vacuum environment. The GaAs (100) oxide film desorption process consists of desorption of H 2 O when the substrate temperature is around 100 ° C, desorption of As-based oxides such as AsO around 143 ° C, and As 2 O at 200 ° C to 300 ° C. The substitution of 3 + 2GaAs → Ga 2 O 3 + 2As 2 (or As 4 ), and the elimination reaction of Ga-based oxides, should occur at 410 ° C Ga 2 O 3 + Ga → Ga 2 O Induced by
実験は以下の手順で行った。まず、真空チャンバー内に過熱水蒸気を印加した基板をセットし、H2Oなどの不純物を除去することを目的とした真空チャンバー内の予備加熱を行う。次に、酸化膜表面におけるAs系酸化物の脱離のみに着目するために、基板温度を150℃まで上昇させる。なお、200℃付近まで基板温度を上昇してしまうと、As2O3+2GaAs→Ga2O3+2As2(or As4)への置換反応が進行してしまうため、酸化膜表面からの脱離反応のみに特化することができない。そして、この時のチャンバー内の真空度を測定し、GaAs(111)A,(111)B酸化膜の表面組成を検証した。 The experiment was performed according to the following procedure. First, a substrate to which superheated steam is applied is set in a vacuum chamber, and preliminary heating in the vacuum chamber is performed for the purpose of removing impurities such as H 2 O. Next, the substrate temperature is raised to 150 ° C. in order to focus only on the As-based oxide desorption on the oxide film surface. If the substrate temperature is increased to around 200 ° C, the substitution reaction from As 2 O 3 + 2GaAs → Ga 2 O 3 + 2As 2 (or As 4 ) will proceed, so It cannot be specialized only for elimination reaction. Then, the degree of vacuum in the chamber at this time was measured, and the surface composition of the GaAs (111) A, (111) B oxide film was verified.
［実験結果］
［１］バイオシリカの粒径制御に関する実験結果
［1-1］シラフィン(リピートユニット)濃度の影響検討結果
図２は、単リピート型シラフィンを使用し、そのリピートユニット濃度を1400 nM から70000 nMの範囲で変化させて、形成された各バイオシリカのSEM像を示す図である。図３は、同じく単リピート型シラフィンを使用し、そのリピートユニット濃度を100 nM から3000 nMの範囲で変化させて、形成された各バイオシリカのSEM像を示すと共に、以上の結果をもとに、シラフィンのリピートユニット濃度と形成されるバイオシリカの粒径との関係をまとめたグラフを示す。グラフに示すように、シラフィン濃度はバイオシリカの粒径に影響を与え、シラフィン濃度を低く設定するほどバイオシリカの粒径は小さくなり、特に、シラフィンのリピートユニット濃度を1500 nM以下に設定することで、バイオシリカの粒径を100-200 nm程度またはそれ以下に微細化することができた。
[Experimental result]
[1] Experimental results on particle size control of biosilica [1-1] Results of study of influence of silafine (repeat unit) concentration Fig. 2 shows the use of single repeat type silafin, and the repeat unit concentration is 1400 nM to 70000 nM. It is a figure which shows the SEM image of each biosilica formed by changing in the range. Fig. 3 shows the SEM images of each biosilica formed using the same single repeat type silafine and changing the repeat unit concentration in the range of 100 nM to 3000 nM. Based on the above results The graph which put together the relationship between the repeat unit density | concentration of a silafine and the particle size of the biosilica formed is shown. As shown in the graph, the silafine concentration affects the particle size of biosilica, and the lower the silafine concentration, the smaller the biosilica particle size. In particular, the repeat unit concentration of silafine should be set to 1500 nM or less. Thus, the particle size of biosilica could be reduced to about 100-200 nm or less.
上記の結果は、７回リピート型シラフィンを用いた場合にも同様に観察された。図４は、７回リピート型シラフィン(リピートユニット濃度10 nM)を用いて形成させたバイオシリカのSEM像を示す。1000 nMのサンプルの像でも見られた様な概径5〜10 nmのバイオシリカ粒が確認でき、さらにそれらが集合して30〜50 nmの塊が形成されているように見えた。このようにリピートユニット濃度10 nMにおいても微細なバイオシリカ粒を形成することができた。（なお、７回リピート型シラフィンを用いた場合の結果については、図８・９にもその結果が示される。） The above results were similarly observed when using 7 times repeat type silafine. FIG. 4 shows an SEM image of biosilica formed using 7 times repeat type silafine (repeat unit concentration 10 nM). Biosilica particles having an approximate diameter of 5 to 10 nm as seen in a 1000 nM sample image were confirmed, and they appeared to aggregate to form a 30 to 50 nm mass. In this way, fine biosilica particles could be formed even at a repeat unit concentration of 10 nM. (Note that the results of using 7 times repeat type silafin are also shown in FIGS. 8 and 9.)
［1-2］基質(TMOS)量の影響検討結果
図５は、単リピート型シラフィンを使用した場合で、基質(TMOS)量がバイオシリカの粒径に与える影響を検討した結果を示す図であり、各基質(TMOS)量において形成されたバイオシリカのSEM像を示す。基質(TMOS)量を12.5 mM以下にするとバイオシリカを観察できなくなった。基質(TMOS)量を25 mM以上にした場合は、直径約400 nmと約150nmの異なるサイズのバイオシリカが観察された。また、７回リピート型シラフィンを用いた場合にも同様の結果が観察された。
[1-2] Effect of substrate (TMOS) effect study results Figure 5 shows the results of studying the effect of substrate (TMOS) content on biosilica particle size when using single repeat type silafine. Yes, SEM images of biosilica formed at each substrate (TMOS) amount are shown. When the amount of substrate (TMOS) was 12.5 mM or less, biosilica could no longer be observed. When the amount of substrate (TMOS) was 25 mM or more, biosilica of different sizes having a diameter of about 400 nm and about 150 nm were observed. Similar results were also observed when 7-repeat silafine was used.
［1-3］pHの影響検討結果
図６は、単リピート型シラフィンを使用した場合で、反応液のpHがバイオシリカの粒径に与える影響を検討した結果を示す図であり、5.0≦pH≦10.0の範囲の各pHにおいて形成されたバイオシリカのSEM像を示す。6.0≦pH≦8.0の範囲では、均一で球状のバイオシリカの形成が観察された。また、７回リピート型シラフィンを用いた場合にも同様の結果が観察された。
[1-3] Results of Examination of Effect of pH FIG. 6 is a diagram showing the results of studying the effect of the pH of the reaction solution on the particle size of biosilica when single repeat type silafine is used, and 5.0 ≦ pH 2 shows SEM images of biosilica formed at each pH in the range of ≦ 10.0. In the range of 6.0 ≦ pH ≦ 8.0, uniform and spherical biosilica formation was observed. Similar results were also observed when 7-repeat silafine was used.
［1-4］反応温度の影響検討結果
図７は、単リピート型シラフィンを使用した場合で、反応温度がバイオシリカの粒径に与える影響を検討した結果を示す図であり、０℃から６０℃の範囲の各温度において形成されたバイオシリカのSEM像を示す。同図に示すように、広い温度範囲でシラフィンのバイオシリカ形成活性が認められると共に、反応温度はバイオシリカの粒径に影響を与え、反応温度を高く設定するほどバイオシリカの粒径は小さくなり、特に、反応温度を４０℃以上に設定することで、バイオシリカの粒径を約300 nm程度またはそれ以下に微細化することができた。また、７回リピート型シラフィンを用いた場合にも同様の結果が観察された。
[1-4] Results of Examination of Influence of Reaction Temperature FIG. 7 is a diagram showing the results of examination of the influence of reaction temperature on the particle size of biosilica when single repeat type silafine is used. The SEM image of the biosilica formed in each temperature of the range of 0 degreeC is shown. As shown in the figure, the biosilica-forming activity of silafine is recognized over a wide temperature range, and the reaction temperature affects the particle size of the biosilica. The higher the reaction temperature, the smaller the particle size of the biosilica. In particular, by setting the reaction temperature to 40 ° C. or higher, the particle size of biosilica could be reduced to about 300 nm or less. Similar results were also observed when 7-repeat silafine was used.
［２］バイオシリカ固定基板の製造法に関する実験結果
［2-1］バイオシリカ形成とGaAs(100)基板上での固定の確認
図８は、７回リピート型シラフィン(1000 nM)を用いて形成させたバイオシリカのGaAs(100)基板上に固定した状態でのSEM像およびEDX測定結果である。SEM像より、バイオシリカは球構造を最小単位としていることが分かり、その球が集合体として存在している。EDXの結果からは、バイオシリカ形成領域にのみ、Si,Oだけでなく、C,Pのピークも観察されている。つまり、バイオシリカのGaAs(100)基板上への固定はシラフィンの吸着を介しての固定であることが予測される。
[2] Experimental results on manufacturing method of biosilica fixed substrate [2-1] Confirmation of biosilica formation and fixation on GaAs (100) substrate Figure 8 shows formation using 7 times repeat type silafine (1000 nM) 3 shows SEM images and EDX measurement results when the biosilica was fixed on a GaAs (100) substrate. SEM images show that biosilica has a sphere structure as the smallest unit, and the spheres exist as aggregates. From the EDX results, not only Si and O but also C and P peaks are observed only in the biosilica formation region. In other words, it is predicted that the immobilization of biosilica on the GaAs (100) substrate is immobilization via adsorption of silafine.
図９は、７回リピート型シラフィン(10 nM)を用いて形成させたバイオシリカのSEM像およびEDX測定結果である。SEM像より、原料である珪酸塩のゲル化が確認できる。さらに、EDXの結果から、ゲル化した領域からSi,Oだけでなく、C,Pのピークも観察されていることが分かる。通常、原料律速のバイオシリカ形成時は原料供給量に応じたバイオシリカのサイズが得られることが分かっている。つまり、シラフィンのバイオシリカ形成機能を上回る原料の供給が行われたため、原料である珪酸塩のゲル化が促進したと考えられる。 FIG. 9 shows SEM images and EDX measurement results of biosilica formed using 7-repeat type silafine (10 nM). From the SEM image, the gelation of the silicate as the raw material can be confirmed. Furthermore, from the results of EDX, it can be seen that not only Si and O but also peaks of C and P are observed from the gelled region. Usually, it is known that the size of biosilica corresponding to the amount of raw material supply can be obtained when forming raw material-limited biosilica. That is, it is considered that gelation of the silicate, which is a raw material, was promoted because the supply of the raw material exceeding the biosilica forming function of silafine was performed.
以上のことから、７回リピート型シラフィンによるバイオシリカ形成において、供給した原料を全てバイオシリカ形成に作用させるためには、原料の供給量＜シラフィンのバイオシリカ形成量という条件下で行うことが望ましい。 From the above, in the biosilica formation by the 7 times repeat type silafin, it is desirable to carry out under the condition of the amount of raw material supply <the amount of silafine biosilica formation in order to make all the supplied raw materials act on the biosilica formation. .
［2-2］GaAs基板上での７回リピート型シラフィン吸着実験結果
以前の報告(Sandra R.Whaley,D.S.English,Evelyn L.Hu,Paul F.Barbara,Angela M.Belcher, NATURE, vol.405, 8 June 2000)より、ルイス塩基（電子対供与体）として働くアミノ酸を多く要しているペプチドほど、GaAs基板との吸着力が強いとの記述がある。つまり、GaAs基板はルイス酸（電子対受容体）として働いている。さらに、半導体表面の面極性が吸着の選択性を発現させることに言及している。具体的には、GaAs(100),GaAs(111)Aと比較して、GaAs(111)B,Si(100)にはペプチドが吸着しにくいという結果である。しかし、この報告では、GaAs基板表面全体に対してのペプチド吸着の議論が行われているが、水溶液中の実験において必ず形成されるGaAs酸化膜の影響を示唆しているものの、その効果が考慮されていない。そこで、本発明者はシラフィンのアミノ酸配列および極性半導体であるGaAs表面の酸化膜層に着目した。つまり、GaAs酸化膜層を介してのシラフィン吸着に特化した。
[2-2] Results of 7-repeat silafine adsorption experiments on GaAs substrates Previous reports (Sandra R. Whaley, DSEnglish, Evelyn L. Hu, Paul F. Barbara, Angela M. Belcher, NATURE, vol. 405, 8 June 2000) describes that peptides that require more amino acids that act as Lewis bases (electron-pair donors) have stronger adsorption power to GaAs substrates. In other words, the GaAs substrate works as a Lewis acid (electron pair acceptor). Furthermore, it is mentioned that the surface polarity of the semiconductor surface develops adsorption selectivity. Specifically, as compared with GaAs (100) and GaAs (111) A, the result is that the peptide is less likely to be adsorbed on GaAs (111) B and Si (100). However, although this report discusses peptide adsorption on the entire surface of a GaAs substrate, it suggests the effect of a GaAs oxide film that must be formed in an experiment in an aqueous solution. It has not been. Therefore, the present inventor paid attention to the amino acid sequence of silafine and the oxide film layer on the GaAs surface which is a polar semiconductor. In other words, we specialize in the adsorption of silafine through the GaAs oxide layer.
図１０は、７回リピート型シラフィンを構成するアミノ酸配列(「Sil」で始まる上から３つの配列)および上記論文で扱われていたペプチドを構成するアミノ酸配列(G1-3)を示したものである。７回リピート型シラフィンはsil-1Bとsil-1A2が1つずつ、さらに、sil-1A1が５つ連なったアミノ酸配列を持つ。図中の中性アミノ酸（Neutral amino acids）、酸性アミノ酸（Acidic amino acids）および塩基性アミノ酸（Basic amino acids）（つまり、非極性(疎水性)アミノ酸（Non-polar (hydrophobic) amino acids）以外のアミノ酸）は、ルイス塩基として働くアミノ酸である。つまり、シラフィンはルイス塩基として働くアミノ酸を多く含み、GaAs基板との親和性が強いペプチドであると考えられる。 FIG. 10 shows the amino acid sequences constituting the 7-repeat silafine (three sequences from the top starting with “Sil”) and the amino acid sequences (G1-3) constituting the peptides treated in the above paper. is there. Seven-repeat silaffin has an amino acid sequence consisting of one sil-1B and one sil-1A2, and five consecutive sil-1A1s. Other than neutral amino acids, acidic amino acids, and basic amino acids (that is, non-polar (hydrophobic) amino acids) Amino acid) is an amino acid that acts as a Lewis base. In other words, silafine is thought to be a peptide that contains many amino acids that act as Lewis bases and has a strong affinity for GaAs substrates.
［単一基板上での７回リピート型シラフィン吸着実験結果］
過熱水蒸気を印加することによって得られた酸化膜を有する単一面基板を用いて７回リピート型シラフィン吸着実験を行った。その結果、GaAs(111)A＞(100)＞(110)の順に吸着力に差が確認され、(111)BおよびSiにおいては吸着しなかった。ルイス塩基として働く７回リピート型シラフィンが表面極性の異なるGaAs酸化膜に対して吸着能が異なるということは、GaAs酸化膜表面における極性が異なるためと予測される。すなわち、バイオシリカ固定基板の製造においては、GaAs(111)A、(100)、(110)の結晶面を有する基板が望ましい。
[Results of 7-repeat silafin adsorption experiments on a single substrate]
Using a single-sided substrate having an oxide film obtained by applying superheated steam, a repeat type silafine adsorption experiment was conducted seven times. As a result, a difference in adsorption force was confirmed in the order of GaAs (111) A>(100)> (110), and (111) B and Si did not adsorb. The fact that the 7-repeat silafine acting as a Lewis base has different adsorptive capacities for GaAs oxide films having different surface polarities is presumed to be due to the different polarities on the GaAs oxide film surfaces. That is, in the production of a biosilica fixed substrate, a substrate having a crystal plane of GaAs (111) A, (100), (110) is desirable.
［Ga-rich,As-rich面複合構造基板上での７回リピート型シラフィン吸着実験結果］
さらに、極性の違いによる７回リピート型シラフィン吸着性の違いを利用してパターニングされたバイオシリカ固定基板を製造するため、表面極性が異なる(111)A面(Ga-rich面)および(111)B面(As-rich面)を同一基板上に作製し、この複合構造の酸化膜に対して過熱水蒸気を印加後、７回リピート型シラフィンをGaAs酸化膜に選択的に吸着させた。本実験はμmオーダーの微細構造物上で行っているため、「バイオシリカの沈殿力＜シラフィンの面極性による吸着力」を実現する必要性がある。そのため、原料供給律速反応の条件下で、バイオシリカ形成量をコントロールした。図１１はシラフィン3μl:原料1μlの条件の時に得られたSEM像である。バイオシリカ球の集合体の直径は約100nmである。原料律速の反応によって、バイオシリカ球集合体のサイズコントロールおよび低密度化を図ることによって、重力を軽減し、バイオシリカの沈殿を抑制した。洗浄過程において超音波を繰り返したのにもかかわらず、バイオシリカの剥離が確認されなかった。つまり、バイオシリカがGaAs(111)A面酸化膜表面に吸着されたシラフィンを介して固定されていることが分かる。したがって、バイオシリカの固定はGaAs酸化膜の極性に依存したものであると考えられる。本実験からも、Ga-rich面における酸化膜に対して７回リピート型シラフィンの吸着が確認され、As-rich面においては吸着が確認されなかった。
[Results of 7-repeat silafine adsorption experiments on Ga-rich and As-rich composite substrates]
Furthermore, in order to produce a biosilica immobilization substrate patterned using the difference in 7-repeat type silafine adsorption due to the difference in polarity, the (111) A surface (Ga-rich surface) and (111) with different surface polarities are produced. B surface (As-rich surface) was fabricated on the same substrate, and superheated steam was applied to the oxide film of this composite structure, and then 7 times repeat type silafine was selectively adsorbed to the GaAs oxide film. Since this experiment was conducted on a micro structure on the order of μm, it is necessary to realize “precipitation power of biosilica <adsorption power due to surface polarity of silafin”. Therefore, the amount of biosilica formed was controlled under the conditions of the raw material supply rate-limiting reaction. FIG. 11 is an SEM image obtained under the condition of 3 μl of silafine: 1 μl of raw material. The diameter of the aggregate of biosilica spheres is about 100 nm. Gravity was reduced and biosilica precipitation was suppressed by controlling the size and reducing the density of the biosilica sphere aggregate by a raw material-controlled reaction. Despite repeated ultrasonic waves during the cleaning process, no biosilica peeling was confirmed. In other words, it can be seen that biosilica is fixed through silafine adsorbed on the surface of the GaAs (111) A-surface oxide film. Therefore, it is considered that the fixation of biosilica depends on the polarity of the GaAs oxide film. Also from this experiment, the adsorption of the repeat-type silafine was confirmed 7 times to the oxide film on the Ga-rich surface, and the adsorption was not confirmed on the As-rich surface.
［2-3］GaA(111)A,(111)B酸化膜評価結果
最後にGaAs酸化膜とシラフィンとの吸着メカニズムを議論するため、表面極性が異なる面上に形成された酸化膜表面の組成を検証した。そこで、本発明者は、真空環境におけるGaAs酸化膜の熱脱離過程に着目した。GaAs酸化膜はGa系酸化物およびAs系酸化物で構成されている。そして、GaAs(100)基板温度を上昇させることによって、酸化膜の熱脱離過程を観察した場合、先に述べたように基板温度が100℃付近ではH2Oの脱離、143℃付近ではAsOなどのAs系酸化物の脱離、さらに、Ga系酸化物に関しての脱離は410℃付近においてGa2O3+Ga→Ga2Oの反応が起こることによって誘起されることが知られている。
[2-3] Evaluation results of GaA (111) A, (111) B oxide films Finally, in order to discuss the adsorption mechanism between GaAs oxide films and silafine, the composition of the oxide film surfaces formed on surfaces with different surface polarities Verified. Therefore, the present inventor has focused on the thermal desorption process of the GaAs oxide film in a vacuum environment. The GaAs oxide film is composed of a Ga-based oxide and an As-based oxide. When the thermal desorption process of the oxide film is observed by increasing the temperature of the GaAs (100) substrate, as described above, desorption of H 2 O occurs when the substrate temperature is around 100 ° C, and near 143 ° C. It is known that desorption of As-based oxides such as AsO, and desorption of Ga-based oxides is triggered by the reaction Ga 2 O 3 + Ga → Ga 2 O around 410 ° C. Yes.
図１２は酸化膜に過熱水蒸気を印加したGaAs(111)A,(111)B基板を150℃まで加熱した時の、真空チャンバー内の圧力変化を示したものである。基板を150℃に過熱したのにもかかわらず、過熱水蒸気を印加した(111)B酸化膜は(111)A酸化膜と比較して、As系酸化物の脱離が極端に少ない傾向が確認できる。つまり、過熱水蒸気を印加することによって、(111)B酸化膜表面がGa系酸化物で覆われていることが考察される。それに対して(111)A酸化膜はAs系酸化物の脱離が進行していることが考えられる。つまり、(111)A酸化膜と(111)B酸化膜の一番異なる点は、酸化膜表面のGa酸化物の密度(As酸化物の密度)である。 FIG. 12 shows a change in pressure in the vacuum chamber when a GaAs (111) A, (111) B substrate with superheated steam applied to the oxide film is heated to 150.degree. Despite the fact that the substrate was heated to 150 ° C, the (111) B oxide film to which superheated steam was applied was found to tend to have extremely less As-based oxide desorption compared to the (111) A oxide film. it can. That is, it is considered that the surface of the (111) B oxide film is covered with the Ga-based oxide by applying superheated water vapor. On the other hand, the (111) A oxide film is thought to be desorbing As-based oxides. That is, the most different point between the (111) A oxide film and the (111) B oxide film is the density of Ga oxide (As oxide density) on the oxide film surface.
本発明者は、このGa照射実験から、ルイス塩基として働くアミノ酸を数多く含むシラフィンとの吸着に際して、GaAs基板酸化膜側では、酸化膜表面のAs系酸化物がルイス酸として機能しているというシラフィン,GaAs基板間の吸着メカニズムを推定する。 Based on this Ga irradiation experiment, the present inventor has found that, on the GaAs substrate oxide film side, an As-based oxide on the oxide film surface functions as a Lewis acid when adsorbed with silafine containing many amino acids that function as Lewis bases. Therefore, the adsorption mechanism between GaAs substrates is estimated.
以上の実験結果より、シラフィンとGaAs酸化膜内As系酸化物間において、ルイス塩基,ルイス酸による吸着反応が起こっていることが確認された。つまり、Ga系酸化物には吸着しにくいということである。したがって、酸化膜表面のGa系酸化物の密度という観点から、シラフィンは(111)A酸化膜に対して(111)B酸化膜に吸着しにくいということを議論した。この吸着法は、シラフィンの特性、GaAs面極性というそれぞれの特性を存分に発揮した吸着メカニズムである。本実験は、半導体微細化技術として、基板表面上に異なった結晶面をパターニングした後、シラフィンを選択吸着させ、次いで、シラフィン吸着部にバイオシリカを選択的形成させることを特徴とするパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法を実証するものであり、生体物質の自己組織化機能を応用した“bottom-up型”微細化技術への足がかりとして期待される。 From the above experimental results, it was confirmed that an adsorption reaction by Lewis base and Lewis acid occurred between silafine and As-based oxide in GaAs oxide film. That is, it is difficult to adsorb to the Ga-based oxide. Therefore, from the viewpoint of the density of Ga-based oxides on the oxide film surface, it was discussed that silafine is less likely to be adsorbed to the (111) B oxide film than the (111) A oxide film. This adsorption method is an adsorption mechanism that fully exhibits the characteristics of silafine and GaAs plane polarity. In this experiment, as a semiconductor miniaturization technique, after patterning different crystal planes on the substrate surface, silafine is selectively adsorbed and then biosilica is selectively formed in the silafine adsorbing part. It demonstrates the manufacturing method of the biosilica fixed substrate, and is expected as a foothold to the “bottom-up” miniaturization technology applying the self-organization function of biological materials.
以上のように、本発明は、シラフィンを用いたバイオシリカの新規製造法、およびバイオシリカ固定基板製造法を提供するものであり、前述したとおり、半導体微細加工技術への利用のほか、酵素反応を行うバイオリアクターや抗原を検出するバイオセンサー等において、製造したバイオシリカを酵素タンパク質等の担体として利用しうるなど、産業上種々の利用可能性を有するものである。 As described above, the present invention provides a novel method for producing biosilica using silafine, and a method for producing a biosilica fixed substrate. As described above, in addition to use in semiconductor microfabrication technology, enzyme reaction In the bioreactor that performs the above, the biosensor that detects the antigen, etc., the manufactured biosilica can be used as a carrier for enzyme proteins and the like, and thus has various industrial applicability.
［配列番号１］海洋性珪藻Cylindrotheca fusiformis由来シラフィン-1の全アミノ酸配列
［配列番号２］単リピート型シラフィン-1のアミノ酸配列
［配列番号３］７回リピート型シラフィン-1のアミノ酸配列
［配列番号４］単リピート型シラフィン-1のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加した組換えシラフィン-1のアミノ酸配列
［配列番号５］７回リピート型シラフィン-1のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加した組換えシラフィン-1のアミノ酸配列
[SEQ ID NO: 1] Complete amino acid sequence of silafine-1 derived from the marine diatom Cylindrotheca fusiformis [SEQ ID NO: 2] Amino acid sequence of single repeat silafine-1 [SEQ ID NO: 3] Amino acid sequence of 7-repeat silafine-1 [SEQ ID NO: 4] Amino acid sequence of recombinant silaffin-1 with methionine added to the N-terminus of singly repeated silafin-1 and leucine, glutamic acid and histidine hexamer added to the C-terminus [SEQ ID NO: 5] N of 7-repeat silaffin-1 Amino acid sequence of recombinant silaffin-1 with methionine at the end and leucine, glutamic acid and histidine hexamer at the C end
Claims (4)
使用するシラフィンのリピートユニット濃度を１０ｎＭ以上１５００ｎＭ以下に、および／又は、
形成時の温度を４０℃以上８０℃以下の範囲に
調節することにより、形成するバイオシリカ粒の粒径を３００ｎｍ以下に制御することを特徴とするバイオシリカの製造法。 In the method of forming biosilica grains using silafin,
The repeat unit concentration of silafine used is 10 nM or more and 1500 nM or less , and / or
A method for producing biosilica, characterized by controlling the particle size of biosilica particles to be formed to 300 nm or less by adjusting the temperature during formation to a range of 40C or more and 80C or less .
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