JP5311539B2 - Transformed plant and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、野生型植物と比較して病害抵抗性及び環境ストレス耐性が向上し、かつ、成長が促進している形質転換植物、並びに該形質転換植物の部分若しくは繁殖材料に関する。 The present invention relates to a transformed plant having improved disease resistance and environmental stress tolerance as compared to a wild-type plant and promoting growth, and a part of the transformed plant or a propagation material.
陸生植物は、乾燥、低温、熱、機械的な摂動、創傷及び病原体の感染といった様々な環境ストレスに曝される。これら環境ストレスに植物が曝されると、特定の遺伝子発現といった生化学的、生理学的及び分子的な反応が誘導され、環境ストレスに対する応答性及び順応性を示すことが知られている。このような反応は、植物細胞内における刺激の認識及びシグナル伝達の結果として進行する。 Terrestrial plants are exposed to various environmental stresses such as drought, low temperature, heat, mechanical perturbations, wounds and pathogen infection. It is known that when plants are exposed to these environmental stresses, biochemical, physiological and molecular reactions such as specific gene expression are induced, and they exhibit responsiveness and adaptability to environmental stresses. Such a reaction proceeds as a result of stimulus recognition and signal transduction in plant cells.
植物に病気を引き起こす原因としては、伝染性の生物的病原（病原体）と非伝染性の環境的病原とがあり、植物の感染病の80％以上は、糸状菌（カビ・菌類）によって引き起こされ、残りは細菌、ウイルス、ウイロイド、ファイトプラズマ、リケッチア様微生物、線虫、原虫などが原因である。植物は常にこれら病原体の攻撃にさらされており、独自の生体防御反応により病原体の感染から身を守っている。一例として、Florの唱える遺伝子対遺伝子説によると、植物側の抵抗性遺伝子産物が菌由来のエリシター（非病原性遺伝子産物）を認識し、病原菌に対する一連の抵抗反応を発現すると考えられている。このような反応は、植物細胞内における刺激の認識及びシグナル伝達の結果として進行する。しかしながら、このメカニズムの詳細については未だ解明されていないのが現状である。 Causes that cause diseases in plants include infectious biological pathogens (pathogens) and non-infectious environmental pathogens. More than 80% of plant infectious diseases are caused by filamentous fungi (fungi). The rest is caused by bacteria, viruses, viroids, phytoplasma, rickettsiae microorganisms, nematodes, protozoa, and the like. Plants are constantly under attack by these pathogens and protect themselves from pathogen infections through their own biodefense reactions. As an example, according to the gene-to-gene theory proposed by Flor, it is considered that a resistance gene product on the plant side recognizes an elicitor derived from a fungus (non-pathogenic gene product) and develops a series of resistance reactions against the pathogenic fungus. Such a reaction proceeds as a result of stimulus recognition and signal transduction in plant cells. However, the details of this mechanism have not yet been elucidated.
植物の生産性の向上は、伝統的な、もしくは経験に基づく品種改良による育種や、殺菌剤や殺虫剤を例とする農薬の使用による病虫害の駆除、成長調整剤の使用等により行われてきた。しかし、近年の分子生物学の急速な進展により、今日では遺伝子組み換え植物などの分子育種の手法により、より短い期間での生産性の高い植物の開発が可能となった。例えば、遺伝子組み換えにより、植物の成長促進、植物に対する病虫害抵抗性の付与や環境ストレス耐性の付与、植物の開花時期の調節など、直接的又は間接的に植物の生産性を向上しうる技術の開発がなされてきた。植物への病害抵抗性の付与に関しては、例えば、WRKY45遺伝子をイネで恒常的に発現させることで、病害抵抗性が付与されたことが報告されており（非特許文献１）、また、環境ストレス耐性に関しては、乾燥、高塩、低温のストレス下で正常に生育できるシロイヌナズナの開発が報告されている（非特許文献２）。 Plant productivity has been improved by breeding by breeding based on traditional or experience, extermination of diseases and pests by using agricultural chemicals such as fungicides and insecticides, and the use of growth regulators. . However, due to the rapid progress in molecular biology in recent years, it has become possible to develop highly productive plants in a shorter period of time using molecular breeding techniques such as genetically modified plants. For example, the development of technologies that can improve plant productivity directly or indirectly through genetic modification, such as promoting plant growth, imparting pest resistance resistance to plants, imparting environmental stress resistance, and controlling the flowering time of plants Has been made. With regard to imparting disease resistance to plants, for example, it has been reported that disease resistance was imparted by constantly expressing the WRKY45 gene in rice (Non-patent Document 1), and environmental stress. Regarding tolerance, the development of Arabidopsis thaliana that can normally grow under stress of drought, high salt, and low temperature has been reported (Non-patent Document 2).
しかしながら、病虫害抵抗性や環境ストレス耐性を付与することが、必ずしも植物の生産性の向上につながらない場合もある。例えば、病虫害抵抗性や環境ストレス耐性に関する遺伝子を植物体で恒常的に発現させた場合、植物体の成長が損なわれることが報告されており(非特許文献３)、成長を確保するためには何らかの工夫を要することが記載されている（非特許文献１〜５）。 However, imparting pest damage resistance and environmental stress resistance may not necessarily lead to an improvement in plant productivity. For example, it has been reported that growth of plant bodies is impaired when genes related to pest resistance and environmental stress resistance are constantly expressed in plants (Non-patent Document 3). It is described that some device is required (Non-Patent Documents 1 to 5).
このように、植物の生産性向上のための、植物への病虫害抵抗性や環境ストレス耐性の付与と、植物の成長の促進とは、個別の技術として研究されてきたため、従来、双方の特性を植物に同時に付与するためには、双方の技術を適用する必要があった。しかしながら、この場合でも、それぞれの技術を単独で適用した場合と同様の表現型が、植物において同時に発現しないことも想定されるため、あるいは、育種に要する期間の短縮化のため、１つの技術の適用で、植物への病虫害抵抗性や環境ストレス耐性の付与と植物の成長の促進とを同時に満たすことができる技術の開発が、強く望まれていた。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物における病害抵抗性及び環境ストレス耐性の向上と成長の促進という形質を同時に植物に付与することができる新たな技術を提供することにある。 This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is the new technique which can provide the characteristics of the disease resistance and environmental stress tolerance improvement in a plant, and the promotion of growth simultaneously to a plant. Is to provide.
葉緑体あるいは色素体は、約120〜180kbpの環状二本鎖DNAを独自にもつオルガネラで、そのゲノムは約130の遺伝子をコードしている。高等植物の葉緑体には、二種類の転写装置（RNAポリメラ―ゼ）が存在しており、一つは、葉緑体ゲノムにコードされた真性細菌型RNAポリメラーゼ（Plastid-Encoded Plastid RNA Polymerase）で、もう一つは、核にコードされたファージ型RNAポリメラーゼ（Nuclear-Encoded Plastid RNA Polymerase）である。葉緑体シグマ因子は、葉緑体に複数種存在し、その遺伝子は核ゲノムにコードされている。シロイヌナズナの核ゲノムにはSig A〜Sig F（Sig 1〜Sig 6）と名付けられた6種類の葉緑体シグマ因子の遺伝子が存在している。葉緑体分化や環境応答に伴って異なったシグマ因子群が働き、葉緑体の転写パターンが変化すると考えられている。 The chloroplast or plastid is an organelle that uniquely has a circular double-stranded DNA of about 120 to 180 kbp, and its genome encodes about 130 genes. In the chloroplasts of higher plants, there are two types of transcription devices (RNA polymerases). One is the true bacterial RNA polymerase encoded by the chloroplast genome (Plastid-Encoded Plastid RNA Polymerase). The other is a nuclear-encoded plasmid RNA polymerase (Nuclear-Encoded Plastid RNA Polymerase). There are multiple types of chloroplast sigma factors in chloroplasts, and their genes are encoded in the nuclear genome. The Arabidopsis nuclear genome contains six chloroplast sigma factor genes named Sig A to Sig F (Sig 1 to Sig 6). Different sigma factors are associated with chloroplast differentiation and environmental response, and the chloroplast transcription pattern is thought to change.
一方、バクテリアでは、シグマ因子結合タンパク質と呼ばれる一群の因子が存在し、遺伝子特異的に転写を制御している例が知られている。最近、葉緑体シグマ因子の一つSig Aの領域4（-35認識部位）に特異的に結合するタンパク質がクローニングされ、SIB A（sigma factor binding protein A、またはsigma factor binding protein 1）と命名された（非特許文献６）。葉緑体でも、バクテリアと類似な機構でシグマ因子の機能が制御されている可能性が考えられる。しかしながら、SIB Aは、既知のタンパク質との相同性が低いタンパク質であり、その機能は解明されていない。 On the other hand, in bacteria, a group of factors called sigma factor binding proteins exists, and an example of controlling transcription in a gene-specific manner is known. Recently, a protein that specifically binds to Sig A region 4 (-35 recognition site), one of the chloroplast sigma factors, has been cloned and named SIB A (sigma factor binding protein A or sigma factor binding protein 1). (Non-Patent Document 6). Even in chloroplasts, the function of sigma factors may be controlled by a mechanism similar to bacteria. However, SIB A is a protein having low homology with known proteins, and its function has not been elucidated.
このような状況の下、本発明者らは、植物の病害抵抗性を研究する過程において、シロイヌナズナに病害抵抗性を活性化する処理（サリチル酸処理）を与えたところ、SIB A遺伝子のプロモーター領域が素早く活性化することを見出した（特許文献１）。そこで、本発明者らは、SIB A遺伝子の機能を解明すべく、シロイヌナズナにSIB A遺伝子を導入し、病原細菌トマト斑葉細菌（シュードモナス シリンゲ）を接種したところ、この病原菌に対して、野生型植物と同程度の抵抗性しか示さないばかりか、シロイヌナズナの生育が抑制（矮性化）されてしまった。その一方、シロイヌナズナにおけるSIB A遺伝子を破壊したところ、意外にも、野生型植物よりも顕著に病害抵抗性が向上するとともに、成長が顕著に促進した。トマト斑葉細菌の感染に抵抗するために植物はサリチル酸経路を活性化する必要がある。本発明により、植物ゲノム上の１遺伝子の機能を抑制するだけで、広範囲の病原菌に対して植物への病害抵抗性の付与を可能とするとともに、その成長をも促進させることが可能となった。SIB A遺伝子は、ハクサイやイネにも存在することから、本発明は、様々な植物に適用することが可能である。 Under such circumstances, the present inventors have found that, in the course of studying the disease resistance of the plant, was given a treatment to activate disease resistance in Arabidopsis (salicylic acid treatment), the promoter region of SIB A gene It discovered that it activated quickly (patent document 1). In order to elucidate the function of the SIB A gene, the present inventors introduced the SIB A gene into Arabidopsis thaliana and inoculated with the pathogenic bacterium Tomato leafy bacterium (Pseudomonas syringae). Not only did it show the same level of resistance as plants, but the growth of Arabidopsis thaliana was suppressed (dwarfed). On the other hand, when the SIB A gene in Arabidopsis thaliana was disrupted, surprisingly, disease resistance was significantly improved and growth was significantly promoted compared to wild-type plants. Plants need to activate the salicylic acid pathway to resist infection with tomato spotted bacteria. According to the present invention, by suppressing the function of one gene on the plant genome, it is possible to impart disease resistance to a wide range of pathogenic bacteria and promote its growth. . Since the SIB A gene is also present in Chinese cabbage and rice, the present invention can be applied to various plants.
本発明は、Sig A binding proteinをコードする遺伝子（SIB A遺伝子）の機能の抑制と植物の病害抵抗性及び環境ストレス耐性の向上及び成長の促進との関係の発見に基づくものであり、より詳しくは、以下に記載の発明を包含するものである。 The present invention is based on the discovery of the relationship between the suppression of the function of the gene encoding the Sig A binding protein ( SIB A gene) and the improvement of plant disease resistance and environmental stress resistance and the promotion of growth. Includes the inventions described below.
＜１＞ 内因性のSIB A遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、野生型植物と比較して、病害抵抗性及び環境ストレス耐性が向上し、かつ、成長が促進している形質転換植物の作出方法。
< 1 > Disease resistance and environmental stress tolerance are improved and growth is promoted compared to wild-type plants, which is characterized by artificially suppressing endogenous SIB A gene expression . A method for producing transformed plants.
本発明により、SIB A遺伝子の機能を抑制するのみで、野生型植物と比較して、病害抵抗性及び環境ストレス耐性が向上し、かつ、成長が促進した植物を作出することが可能となった。これにより、有用植物の生産量を増大させることが期待できる。また、農薬の使用量の削減を可能とし、収穫までの期間を短縮できるため、生産コストの削減も期待できる。 According to the present invention, by suppressing the function of the SIB A gene, it is possible to produce a plant having improved disease resistance and environmental stress resistance and promoted growth compared to a wild type plant. . This can be expected to increase the production of useful plants. In addition, the amount of agricultural chemicals used can be reduced and the period until harvesting can be shortened, so that production costs can also be reduced.
本発明は、内因性のSIB A遺伝子の機能が人為的に抑制されることにより、野生型植物と比較して、病害抵抗性及び環境ストレス耐性が向上し、かつ、成長が促進していることを特徴とする形質転換植物を提供するものである。 In the present invention, since the endogenous SIB A gene function is artificially suppressed, disease resistance and environmental stress tolerance are improved and growth is promoted as compared to wild-type plants. A transformed plant characterized by the above is provided.
本発明において「SIB A遺伝子」とは、シロイヌナズナにおけるSIB A遺伝子、及び、これと同等の機能を有する相同遺伝子を意味する。ここで、「同等の機能」とは、その遺伝子の機能の抑制により、植物の病害抵抗性及び環境ストレス耐性が向上し、かつ、成長が促進する機能を意味する。本発明のSIB A遺伝子には、例えば、シロイヌナズナ由来の遺伝子に対応するハクサイ由来の遺伝子及びイネ由来の遺伝子が含まれる（シロイヌナズナ遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：１に、蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に示した。また、ハクサイ遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号：３に、蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：４に示した。また、イネ遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：５に、蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：６に示した）。さらに、本発明のSIB A遺伝子には、シロイヌナズナのSIB A遺伝子と同等の機能を有するその他の遺伝子、代表的には、(a)配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA、(b)配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、および(c)配列番号２のアミノ酸配列（またはその機能領域のアミノ酸配列）と高い相同性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA、が含まれる。 In the present invention, “ SIB A gene” means SIB A gene in Arabidopsis thaliana and a homologous gene having a function equivalent to this. Here, the “equivalent function” means a function of improving the disease resistance and environmental stress tolerance of a plant and promoting growth by suppressing the function of the gene. The SIB A gene of the present invention includes, for example, a Chinese cabbage-derived gene and a rice-derived gene corresponding to an Arabidopsis-derived gene (the base sequence of the genomic DNA of the Arabidopsis gene is SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein Is shown in SEQ ID NO: 2. In addition, the base sequence of the Chinese cabbage gene cDNA is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 4. The base sequence of the genomic DNA of the rice gene is also shown in the sequence. (No. 5 shows the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 6). Further, the SIB A gene of the present invention has another gene having a function equivalent to that of the Arabidopsis thaliana SIB A gene, typically (a) one or more amino acids are deleted from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, DNA encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence, (b) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1, and (c) sequence DNA encoding a protein containing an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of No. 2 (or the amino acid sequence of its functional region) is included.
ここで「アミノ酸が欠失、置換若しくは付加」され得る領域としては、それをコードする遺伝子が、シロイヌナズナ遺伝子と同等の機能を有する限り、特に限定されない。従って、その機能に重要な領域のアミノ酸において高い相同性があれば、その他の領域のアミノ酸配列は違いが大きいこともあり得、全体としての高い相同性は必ずしも有しなくともよい。一般的には、アミノ酸配列の違いは、70アミノ酸以内、好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましくは30アミノ酸以内（例えば、10アミノ酸以内、5アミノ酸以内）である。また、「ストリンジェントな条件」とは、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃の条件である。例えば、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。また、アミノ酸配列の「相同性」は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Karlin,S. and Altschul,SF., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1990,87,2264-2268., Karlin,S. and Altschul,SF., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993,90,5873-5877.）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul,SF.et al., J Mol Biol, 1990,215,403-410.）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。 Here, the region where “amino acid can be deleted, substituted or added” is not particularly limited as long as the gene encoding it has a function equivalent to that of an Arabidopsis gene. Therefore, if there is high homology in the amino acids in the region important for the function, the amino acid sequences in other regions may differ greatly, and the high homology as a whole is not necessarily required. Generally, the difference in amino acid sequence is within 70 amino acids, preferably within 50 amino acids, more preferably within 30 amino acids (eg, within 10 amino acids, within 5 amino acids). The “stringent conditions” are conditions in which the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and the temperature is 42 to 68 ° C., preferably 42 to 65 ° C. For example, 5 × SSC (83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate), temperature 42 ° C. In addition, the “homology” of the amino acid sequence was determined by the algorithm BLAST (Karlin, S. and Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 2264-2268., Karlin, S. and Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5877.). A program called BLASTX based on the BLAST algorithm has been developed (Altschul, SF. Et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403-410.). Specific methods of these analysis methods are known.
本発明において「SIB A遺伝子の機能が人為的に抑制される」とは、SIB A遺伝子の発現が人為的に抑制される場合のほか、SIB A遺伝子の機能の発現を抑制するその他の人為的な操作も含まれる。このような人為的な操作には、SIB A遺伝子の制御下にある遺伝子の操作が含まれ、例えば、SIB A遺伝子の発現の抑制により、その発現が抑制される遺伝子については、その遺伝子の発現を人為的に抑制すること、SIB A遺伝子の発現の抑制により、その発現が促進される遺伝子については、その遺伝子の発現を人為的に促進することが含まれる。ここで「遺伝子の発現の抑制」又は「遺伝子の発現の促進」とは、遺伝子発現をmRNAレベル又は蛋白質レベルで抑制又は促進すること、あるいは蛋白質の機能を抑制又は促進することを意味する。 In the present invention, “the function of the SIB A gene is artificially suppressed” means that the expression of the SIB A gene is artificially suppressed, as well as other artificial artifacts that suppress the expression of the SIB A gene function. Operations are also included. Such artificial manipulation, include manipulation of genes under the control of SIB A gene, for example, by inhibition of the expression of SIB A gene, the gene whose expression is suppressed, the expression of the gene For genes whose expression is promoted by inhibiting the expression of SIB A gene, artificially promoting the expression of the gene is included. Here, “suppression of gene expression” or “promotion of gene expression” means suppression or promotion of gene expression at the mRNA level or protein level, or suppression or promotion of protein function.
遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば、遺伝子を破壊する方法が挙げられる。具体的には、EMSなどの化学変異剤処理、速中性子線照射、イオンビーム照射、T-DNAの挿入、トランスポゾンの挿入などによる発現抑制対象の遺伝子のコード領域、非コード領域、転写制御領域（プロモーター領域）等に変異又は欠損を導入し、遺伝子破壊変異体を作製する方法があげられる。遺伝子破壊変異体は、例えば、理化学研究所バイオリソースセンターより入手可能なトランスポゾンが挿入された遺伝子ノックアウト変異体や、Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)より入手可能なT-DNAが挿入されたシロイヌナズナ遺伝子ノックアウト変異体等を使用しても良い。その他の遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば、アンチセンスRNAを用いる方法、RNA干渉(RNA interference)を用いる方法が挙げられる。さらに、特定の遺伝子の制御下にある遺伝子の発現を低下させる方法については、特定の遺伝子がコードする蛋白質に対する抗体を用いて、その蛋白質の機能を抑制する方法が挙げられる。例えば、SIB A蛋白質に対する抗体を用いて、SIB A蛋白質のDNA結合活性を低下させることにより、SIB A遺伝子の下流遺伝子の発現を制御することができる。 Examples of a method for suppressing gene expression include a method for disrupting a gene. Specifically, the coding region, non-coding region, and transcriptional control region of the gene to be suppressed by chemical mutagen treatment such as EMS, fast neutron irradiation, ion beam irradiation, T-DNA insertion, transposon insertion, etc. And a method for preparing a gene disruption mutant by introducing a mutation or deletion into a promoter region) or the like. Gene disruption mutants include, for example, gene knockout mutants inserted with transposons available from RIKEN BioResource Center, and Arabidopsis gene knockout mutations inserted with T-DNA available from Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC). A body or the like may be used. Examples of methods for suppressing the expression of other genes include a method using antisense RNA and a method using RNA interference. Furthermore, examples of the method for reducing the expression of a gene under the control of a specific gene include a method for suppressing the function of the protein using an antibody against the protein encoded by the specific gene. For example, using an antibody to SIB A protein, by reducing the DNA binding activity of SIB A protein, can control the expression of the downstream gene of SIB A gene.
mRNAレベルでの遺伝子の発現の抑制又は促進は、例えば、標的遺伝子に特異的なプライマーやプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、定量的PCR、マイクロアレイなどによって、標的遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより評価することができる。蛋白質レベルでの遺伝子の発現の抑制又は促進は、例えば、標的蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング、ELISAなどの免疫学的な方法により、標的蛋白質の質量を測定することにより評価することができる。蛋白質の機能の抑制又は促進は、蛋白質の機能に応じた活性評価系により評価しうるが、本発明においては、植物の病害抵抗性、環境ストレス耐性あるいは成長促進という植物の表現型への影響により間接的に評価することも可能である。 Suppression or promotion of gene expression at the mRNA level is, for example, mRNA transcribed from the target gene by Northern hybridization, RT-PCR, quantitative PCR, microarray, etc. using primers and probes specific to the target gene. It can be evaluated by measuring the amount of. Suppression or promotion of gene expression at the protein level should be evaluated by measuring the mass of the target protein using, for example, an immunological method such as Western blotting or ELISA using an antibody specific to the target protein. Can do. Inhibition or promotion of protein function can be evaluated by an activity evaluation system according to the function of the protein, but in the present invention, due to the effect on plant phenotype, such as plant disease resistance, environmental stress tolerance or growth promotion. Indirect evaluation is also possible.
本発明の形質転換植物においては、mRNAレベルもしくは蛋白質レベル、又は関連遺伝子の発現制御レベルにおいて、野生型植物と比較して、有意にSIB A遺伝子の発現を抑制するか、SIB A遺伝子を欠損させることが好ましい。ここで「有意に抑制する」とは、野生型植物と比較して、好ましくは1/2以下、より好ましくは1/5以下、さらに好ましくは、1/10以下である。 In the transformed plant of the present invention, the SIB A gene expression is significantly suppressed or the SIB A gene is deficient at the mRNA level or protein level, or at the level of expression control of related genes, compared to the wild type plant. It is preferable. Here, “significantly suppress” is preferably 1/2 or less, more preferably 1/5 or less, and still more preferably 1/10 or less, as compared to a wild-type plant.
本発明における植物の形質転換は、形質転換の手法や形質転換を行なう植物の種類等に応じて、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)あるいは植物培養細胞等に対して行なうことができる。形質転換に用いられる植物としては、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。アブラナ科植物としては、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)やハクサイ（Brassica rapa var.glabra）が、ナス科植物としては、例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）が、イネ科植物としては、例えば、トウモロコシ(Zea mays)やイネ(Oryza sativa)が、マメ科植物としては、例えば、ダイズ(Glycine max)が好適である。例えば、イネには相同性遺伝子として、Os01g0808900 Oryza sativa(japonica cultivar-group)が存在する。また、ハクサイにおいては、シロイヌナズナSIB A遺伝子と高い相同性を示すハクサイSIB A遺伝子が本発明者らにより発見されており、ハクサイSIB A遺伝子はシロイヌナズナSIB A遺伝子と同様に、サリチル酸処理に対して高い応答性を示すことを本発明者等は見出している（実施例４）。 According to the transformation of the plant in the present invention, the whole plant body, plant organs (e.g. leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (e.g. Epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc.) or plant cultured cells. Examples of plants used for transformation include plants belonging to the Brassicaceae, Gramineae, Eggplant, Legume, etc., but are not limited to these plants. Examples of the Brassicaceae plants include, for example, Arabidopsis thaliana and Chinese cabbage (Brassica rapa var.glabra), examples of the solanaceous plants include, for example, tobacco (Nicotiana tabacum), and examples of the Gramineae plant include, for example, maize (Zea For example, soybean (Glycine max) is preferable as mays) or rice (Oryza sativa). For example, Os01g0808900 Oryza sativa ( japonica cultivar-group ) exists as a homologous gene in rice. In the Chinese cabbage, Chinese cabbage SIB A gene showing the Arabidopsis SIB A gene is highly homologous have been discovered by the present inventors, cabbage SIB A gene similar to the Arabidopsis SIB A gene, higher than the salicylic acid treatment The present inventors have found that responsiveness is exhibited (Example 4).
植物への遺伝子導入は、用いる遺伝子を発現ベクターに組み入れ、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等を利用して行なうことができる。例えば、エレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理し、遺伝子断片を含む発現ベクターを宿主に導入する。また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の圧力、5〜6cm程度の距離で行う。また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、遺伝子発現を抑制するための遺伝子断片を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、標的遺伝子の発現を抑制するための遺伝子断片を発現ベクターに組み込んで植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のT-DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。 Gene introduction into a plant should be carried out by incorporating the gene to be used into an expression vector and using a conventional transformation method such as electroporation (electroporation), Agrobacterium method, particle gun method, PEG method, etc. Can do. For example, when using the electroporation method, an electroporation device equipped with a pulse controller is used to treat the cells under conditions of voltage 500-1600V, 25-1000μF, 20-30msec, and introduce the expression vector containing the gene fragment into the host. To do. When the particle gun method is used, a plant body, a plant organ, and a plant tissue itself may be used as they are, or may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used. The sample thus prepared can be processed using a gene introduction apparatus (for example, PDS-1000 / He manufactured by Bio-Rad). Treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 1000 to 1800 psi and a distance of about 5 to 6 cm. Moreover, a gene fragment for suppressing gene expression can be introduced into a plant by using a plant virus as a vector. Examples of plant viruses that can be used include cauliflower mosaic virus. That is, first, a virus genome is inserted into a vector derived from E. coli to prepare a recombinant, and then these target genes are inserted into the virus genome. The gene of interest can be introduced into a plant host by excising the viral genome thus modified from the recombinant with a restriction enzyme and inoculating the plant host. In the method using the Agrobacterium Ti plasmid, when a bacterium belonging to the genus Agrobacterium infects a plant, it takes advantage of the property of transferring a part of the plasmid DNA that it has into the plant genome. Then, a gene fragment for suppressing the expression of the target gene is incorporated into an expression vector and introduced into a plant host. Among the bacteria belonging to the genus Agrobacterium, Agrobacterium tumefaciens infects plants to form a tumor called crown gall, and Agrobacterium rhizogenes infects plants. To generate hairy roots. These are because the region called T-DNA region (Transferred DNA) on the plasmid that is present in each bacterium called Ti plasmid or Ri plasmid at the time of infection is transferred into the plant and integrated into the genome of the plant. This is due to If the DNA to be incorporated into the plant genome is inserted into the T-DNA region on the Ti or Ri plasmid, the target DNA is transferred into the plant genome when Agrobacterium bacteria infect the plant host. Can be incorporated.
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。例えば、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、ＬＳ培地、ＭＳ培地などが例示される。 Tumor tissue, shoots, hairy roots, and the like obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and can be used at an appropriate concentration using a conventionally known plant tissue culture method. Of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.). For example, a method is adopted in which callus-like transformed cells are transferred to a medium with different types and concentrations of hormones and cultured to form somatic embryos to obtain complete plants. Examples of the medium to be used include LS medium and MS medium.
このようにして得られた形質転換植物は、野生型植物と比較して、病害抵抗性及び環境ストレス耐性が向上し、かつ、成長が促進している。ここで「病害抵抗性が向上している」とは、野生型植物と比較した場合に、病原体の感染に対して病徴の進行が遅れること、または軽減されることを意味し、例えば、得られた形質転換植物にトマト斑葉細菌（シュードモナス シリンゲ）を接種し、接種３日目の植物体内での細菌の増殖を測定することで評価できる。また、「環境ストレス耐性が向上している」とは、野生型植物と比較した場合に、環境ストレス下で、生長量が多い、または成長速度が速いことを意味し、例えば、高塩濃度下で種子が発芽すること、根の伸長を測定することなどを指標にすることができる。「成長が促進している」とは、野生型植物と比較した場合に、生長量が多い、または成長速度が速いことを意味し、例えば、植物体の重量（生重量または乾重量）が重いこと、植物体当たりの種子・果実の数が多いあるいは総重量が重いこと、葉の枚数が多いことなどを指標にすることができる。 The transformed plant obtained in this way has improved disease resistance and environmental stress resistance and promoted growth compared to wild type plants. Here, “improved disease resistance” means that the progression of the symptom is delayed or reduced with respect to the infection of the pathogen when compared with the wild type plant. The obtained transformed plant can be evaluated by inoculating tomato spotted bacteria (Pseudomonas syringae) and measuring the growth of the bacteria in the plant on the third day of inoculation. In addition, “improvement in environmental stress tolerance” means that the amount of growth is high or the growth rate is high under an environmental stress when compared with a wild type plant. It can be used as an index to germinate seeds, measure root elongation, and the like. “Growth is promoted” means that the amount of growth is high or the growth rate is high when compared with a wild type plant, for example, the weight of the plant body (raw weight or dry weight) is heavy. In other words, the number of seeds / fruits per plant body is large or the total weight is heavy, and the number of leaves is large.
一旦、染色体内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから種子等を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。形質転換植物体から植物種子を得るには、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させればよい。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、それを単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、一定照度下で生育させればよい。 Once a transformed plant into which the DNA of the present invention has been introduced into the chromosome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain seeds from the plant, its progeny or clones, and mass-produce the plant based on them. In order to obtain plant seeds from transformed plants, for example, the transformed plants are collected from the rooting medium, transplanted to pots containing water-containing soil, and grown at a constant temperature to form flowers. And finally seeds may be formed. In order to produce a plant body from seeds, for example, when the seed formed on the transformed plant body has matured, it is isolated and sown in soil containing water, under a constant temperature and a constant illuminance. It can be grown in.
本発明の形質転換植物体あるいはその部分や繁殖材料は、例えば、農作物として食用等に供されうる。従って、本発明には、本発明の形質転換植物体の「部分又は繁殖材料」、例えば、植物器官（例えば種子、葉、花弁、茎、根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞が含まれる。 The transformed plant body of the present invention or a part thereof or a propagation material can be used for food, for example, as an agricultural crop. Accordingly, the present invention includes “parts or propagation materials” of the transformed plant of the present invention, such as plant organs (eg, seeds, leaves, petals, stems, roots, etc.), plant tissues (eg, epidermis, phloem, soft tissue). Tissue, xylem, vascular bundle, etc.) or plant cultured cells.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］シロイヌナズナSIB A遺伝子の過剰発現体およびノックアウト変異体の病害抵抗性の解析
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
[Example 1] Analysis of disease resistance of overexpressed Arabidopsis SIB A gene and knockout mutant
シロイヌナズナSIB A遺伝子（AGIコード：At3g56710)のプロモーター領域にT-DNAが挿入されたシロイヌナズナ遺伝子ノックアウト変異体は、アラビドプシスバイオロジカルリソースセンター（ABRC）から入手したSALK＿127478Cを用いた（図１）。 SALK_127478C obtained from Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) was used as the Arabidopsis gene knockout mutant in which T-DNA was inserted into the promoter region of Arabidopsis SIB A gene (AGI code: At3g56710) (FIG. 1).
一方、シロイヌナズナSIB A遺伝子の過剰発現体は、以下の如く作製した。理化学研究所のバイオリソースセンターから入手したシロイヌナズナSIB A遺伝子の完全長cDNA(RAFL04-16-M08)を発現ベクターpBE2113SFのSfiIサイトにサブクローニングすることで、シロイヌナズナSIB A遺伝子をカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの下流に連結した。作製した発現ベクターをアグロバクテリウム法(Clough,S.J. and Bent,A.F. (1998) Plant J. 16:735-743)により、Col-0に導入し、形質転換植物を作出した。具体的には、選抜マーカーであるカナマイシンを含む寒天培地（ムラシゲ・スクーグ培地）で選抜を繰り返し、カナマイシン入りの培地で全ての種子が生育できる段階で（即ち、形質が分離しなくなった世代になった後）、定量的RT-PCR（Quantitative real-time PCR、QRT-PCR）によって、導入遺伝子の発現量を確認し、形質転換植物の作出を確認した。 On the other hand, an overexpressing body of Arabidopsis thaliana SIB A gene was prepared as follows. By subcloning the Arabidopsis thaliana SIB A gene full-length cDNA (RAFL04-16-M08) obtained from the RIKEN BioResource Center into the SfiI site of the expression vector pBE2113SF, the Arabidopsis thaliana SIB A gene is placed downstream of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Connected. The produced expression vector was introduced into Col-0 by the Agrobacterium method (Clough, SJ and Bent, AF (1998) Plant J. 16: 735-743) to produce a transformed plant. Specifically, the selection is repeated on an agar medium (Murashige-Skoog medium) containing the selection marker kanamycin, and at the stage where all seeds can grow on the medium containing kanamycin (that is, the generation is such that the character is no longer separated). After that, the expression level of the transgene was confirmed by quantitative RT-PCR (Quantitative real-time PCR, QRT-PCR), and the production of the transformed plant was confirmed.
なお、SIB A遺伝子の発現を測定するためのQRT-PCRは次のように行なった。10μｇの全RNAをRNase-free DNase(Takara社)で処理した。マニュアル(Invitrogen社)に従い、このRNA2μｇを用いて、oligo dTプライマー(15mer)とSuperscript II逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成した。QRT-PCRは、SYBR Green PCR Master Mix(Takara社)を用いて行った。具体的には、一本鎖cDNAを鋳型とし、1xSYBR Green I PCR Master Mixと、それぞれ200ｎＭのセンス及びアンチセンスプライマーからなるQRT-PCR混合物に対し、MJ Opticon(BIO-Rad Laboratories社)を用いて、変性反応を95℃で10秒を行った後、「95℃で5秒、65℃で20秒」の一連の反応を40サイクル行った。また、CBP20遺伝子(At5g44200)を用いて、標準化を行った。SIB A遺伝子の発現測定には、センスプライマーとして5’-GACGACCACAACCTTTCTCCA-3’、アンチセンスプライマーとして5’-CGCATTCAACGGCTCATAAC-3’)を用い、CBP20遺伝子の発現測定には、センスプライマーとして5’-CCTTGTGGCTTTTGTTTCGTC-3’、アンチセンスプライマーとして5’-TGTTTCGTCCTGTTCTACTC-3’)を用いた。 In addition, QRT-PCR for measuring the expression of SIB A gene was performed as follows. 10 μg of total RNA was treated with RNase-free DNase (Takara). In accordance with the manual (Invitrogen), single-stranded cDNA was synthesized using oligo dT primer (15mer) and Superscript II reverse transcriptase using 2 μg of this RNA. QRT-PCR was performed using SYBR Green PCR Master Mix (Takara). Specifically, MJ Opticon (BIO-Rad Laboratories) is used for QRT-PCR mixture consisting of 1xSYBR Green I PCR Master Mix and 200 nM sense and antisense primers, respectively, using single-stranded cDNA as a template. The denaturation reaction was carried out at 95 ° C. for 10 seconds, followed by 40 cycles of a series of reactions of “95 ° C. for 5 seconds and 65 ° C. for 20 seconds”. In addition, standardization was performed using the CBP20 gene (At5g44200). 5′-GACGACCACAACCTTTCTCCA-3 ′ as the sense primer and 5′-CGCATTCAACGGCTCATAAC-3 ′) as the sense primer for the expression measurement of the SIB A gene, and 5′-CCTTGTGGCTTTTGTTTCGTC as the sense primer for the expression measurement of the CBP20 gene. -3 ′, 5′-TGTTTCGTCCTGTTCTACTC-3 ′) was used as an antisense primer.
植物病原菌に対する抵抗性は、シロイヌナズナにも感染することが知られているトマト斑葉細菌（シュードモナス シリンゲ）を用いて調べた。トマト斑葉細菌をカナマイシン(25 μg/ml)及びリファンピシン(25μg/ml)を添加したKing's液体培地中で一晩振とう培養した。菌懸濁液を1×105(cfu)/mlに調製し、この菌液を播種後７週間栽培したシロイヌナズナ（22℃、8時間の明期/16時間の暗期のサイクル）のロゼット葉の裏側に、針がない1mlシリンジを押しつけて圧力をかけ、菌液を葉中へ注入することで病原菌を接種した。接種後３日目に接種葉をコルクポーラーでくりぬいて、10mM MgSO4液中で破砕し、菌懸濁液を固形培地に均一に蒔いて2日後に出現したコロニー数をカウントすることで、葉面積当たりの菌の増殖を測定した。 Resistance to phytopathogenic fungi was examined using tomato spotted bacteria (Pseudomonas syringae), which is known to infect Arabidopsis thaliana. Tomato spotted bacteria were cultured overnight in King's liquid medium supplemented with kanamycin (25 μg / ml) and rifampicin (25 μg / ml). Rosette leaves of Arabidopsis thaliana (22 ° C, 8-hour light / 16-hour dark cycle), prepared at 1 x 10 5 (cfu) / ml and cultivated for 7 weeks after sowing A 1 ml syringe without a needle was pressed against the back of the tube to apply pressure, and the bacterial solution was injected into the leaves to inoculate the pathogen. On the third day after inoculation, the inoculated leaves were cut with a cork polar, crushed in 10 mM MgSO 4 solution, and the bacterial suspension was evenly spread on a solid medium, and the number of colonies that appeared two days later was counted. The growth of bacteria per area was measured.
トマト斑葉細菌（シュードモナス シリンゲ）を接種した植物（野生株、過剰発現体、遺伝子破壊体）の感受度（病原細菌の増殖）の結果を図２に示した。野生株と過剰発現体１〜３に対して、遺伝子破壊体(Δsib A)は菌の増殖が1/5〜1/10に抑制された。SIB
A遺伝子が植物にトマト斑葉細菌に対する抵抗性を付与する因子であることが証明された。なお、図２において、「０ｄ」は接種直後の結果、「３ｄ」は３日後の結果を示す。
FIG. 2 shows the results of the sensitivity (proliferation of pathogenic bacteria) of plants (wild strains, overexpressors, gene disruptants) inoculated with tomato spotted bacteria (Pseudomonas syringae). In contrast to the wild strain and the overexpressing bodies 1 to 3, the gene disrupted body (Δsib A) was inhibited by 1/5 to 1/10. SIB
It has been proved that the A gene is a factor conferring resistance to tomato leafy bacteria. In FIG. 2, “0d” indicates the result immediately after inoculation, and “3d” indicates the result after 3 days.
［実施例２］シロイヌナズナSIB A遺伝子の過剰発現体およびノックアウト変異体の生育促進効果の評価
植物材料として、土（ダイオ化成社製プロフェッショナル用培土 さし木、さし芽用No.2）に播種し、24時間の明暗サイクルを明時間8時間及び暗時間16時間として、22℃で6週間栽培した野生型、遺伝子破壊体(Δsib
A)の大きさを図３に示した。過剰発現体は野生型に比べて矮小化するが、遺伝子破壊体は葉が大きく、生育の促進が認められた。
[Example 2] Evaluation of growth-promoting effect of Arabidopsis thaliana SIB A gene overexpression and knockout mutant As plant material, seeded on soil (No. 2 for cultivated cuttings and cuttings for professional use by Daio Kasei Co., Ltd.) Wild-type, gene-disrupted plants (Δsib) grown for 6 weeks at 22 ° C with a 24-hour light / dark cycle of 8 hours light and 16 hours dark
The size of A) is shown in FIG. The overexpressing body was dwarfed compared to the wild type, but the gene-disrupted body had large leaves and the promotion of growth was observed.
さらに、播種後28日目のSIB A遺伝子発現の抑制による植物体の成長への影響を調べた。野生型シロイヌナズナ(Col-0)にT-DNAを挿入することによりSIB A遺伝子の発現を抑えた遺伝子破壊体(SALK＿127478C、Δsib A)を用いた。遺伝子破壊体の種子を培養土に播種し、22〜24℃にて、12時間明期−12時間暗期で栽培し、播種後28日目の地上部の生重量と乾重量を測定した。また、Δsib Aでの結果が「SIB A遺伝子へのT-DNA挿入によるもの」であり、「T-DNA挿入」という手法による影響ではないことを示すために、Δsib Aと同じ手法で作製され、かつSIB A遺伝子には影響を与えていない形質転換体(ベクターのみを導入、pBE)を作製し、これをCol-0およびΔsib Aと同条件下で栽培し、地上部の生重量と乾重量を測定した。エラーバーは標準偏差を示している。乾重量は、生重量を測定した植物体を60℃の乾熱機で18時間乾燥し、測定を行った。その結果、Δsib Aの生重量および乾重量はそれぞれ、Col-0の1.34倍と1.30倍、pBEの1.50倍と1.62倍になっていた（図４Ａおよび図４Ｂ）。また、生重量と乾重量から水分含有量と水分含有率を算出した結果、水分含有量および水分含有率はそれぞれ、Col-0の1.34倍と1.00倍、pBEの1.50倍と0.99倍になっていた（図４Ｃおよび図４Ｄ）。これらのことから、SIB A遺伝子の発現を抑えることにより、成長が促進していることが判明した。また、水分含有率の結果から、Δsib Aの成長促進は、異常な吸水力の増加によるものではないことが判明した。 Furthermore, the influence on the growth of the plant by suppression of SIB A gene expression on the 28th day after sowing was examined. A gene disruptant (SALK — 127478C, Δsib A) in which expression of the SIB A gene was suppressed by inserting T-DNA into wild-type Arabidopsis thaliana (Col-0) was used. The seeds of the gene-disrupted plants were sown in culture soil, cultivated at 22-24 ° C. for 12 hours in the light period to 12 hours in the dark period, and the fresh weight and dry weight of the above-ground part on the 28th day after sowing were measured. In addition, in order to show that the result for Δsib A is “by T-DNA insertion into the SIB A gene” and not the effect of the “T-DNA insertion” method, it was prepared by the same method as Δsib A. In addition, a transformant (introducing a vector alone, pBE) that does not affect the SIB A gene was prepared and cultivated under the same conditions as Col-0 and Δsib A. The weight was measured. Error bars indicate standard deviation. The dry weight was measured by drying a plant body whose raw weight was measured with a 60 ° C. heat dryer for 18 hours. As a result, the raw weight and dry weight of Δsib A were 1.34 times and 1.30 times that of Col-0 and 1.50 times and 1.62 times that of pBE, respectively (FIGS. 4A and 4B). In addition, as a result of calculating the moisture content and moisture content from raw weight and dry weight, the moisture content and moisture content were 1.34 times and 1.00 times that of Col-0 and 1.50 times and 0.99 times that of pBE, respectively. (FIGS. 4C and 4D). From these results, it was found that growth was promoted by suppressing the expression of the SIB A gene. From the results of the moisture content, it was found that the growth promotion of Δsib A was not due to an abnormal increase in water absorption.
［実施例３］シロイヌナズナSIB A遺伝子のノックアウト変異体の塩耐性評価
SIB A遺伝子のノックアウト変異体の塩耐性を評価するために、塩を含む培地上で種子を発芽させ、発芽率を測定した。
[Example 3] Evaluation of salt tolerance of knockout mutant of Arabidopsis SIB A gene
In order to evaluate the salt tolerance of the knockout mutant of the SIB A gene, seeds were germinated on a medium containing salt, and the germination rate was measured.
培地は直径9cmの丸型シャーレに、0mM、50mM、100mM、150mM、200mMのNaClを含む25mlの寒天培地（1/2MS、和光純薬工業社製ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(Murashige and Skoog Plant Salt Mixture)、1/2 B5ビタミン、pH5.7、ショ糖濃度1.0％、寒天1％）を入れ準備した。SIB A遺伝子のノックアウト変異体(Δsib A)、ベクターコントロール(pBE)、野生型(Col-0)の種子を滅菌後に各系統につき32粒を播種した。次いで、シャーレを植物培養装置に静置（22℃、24時間明下）し、播種5日後と9日後に発芽率を測定した。 The medium is a round petri dish with a diameter of 9 cm and 25 ml of agar medium (1/2 MS, mixed salt for Murashige and Skoog Plant (Murashige and Skoog Plant, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 0 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM and 200 mM NaCl. Salt Mixture), 1/2 B5 vitamin, pH 5.7, sucrose concentration 1.0%, agar 1%). After sterilizing SIB A gene knockout mutant (Δsib A), vector control (pBE), and wild type (Col-0) seeds, 32 seeds were sown for each line. Next, the petri dish was allowed to stand in a plant culture apparatus (22 ° C., lighted for 24 hours), and the germination rate was measured 5 and 9 days after sowing.
結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。SIB A遺伝子のノックアウト変異体は高塩濃度下でも野生型よりも高い発芽率を示し、野生型よりも塩に対する耐性が明らかに高いという評価結果が得られた。 The results are shown in FIGS. 5A and 5B. The knockout mutant of the SIB A gene showed higher germination rate than the wild type even under high salt concentration, and the evaluation result that the tolerance to salt was clearly higher than the wild type was obtained.
［実施例４］ハクサイSIB A遺伝子のサリチル酸応答性の解析
植物材料として、土（ダイオ化成社製プロフェッショナル用培土 さし木、さし芽用No.2）に播種し、24時間の明暗サイクルを明時間12時間及び暗時間12時間として22℃で16日間栽培したハクサイを用いた。また、薬剤処理は、ほぼ同時刻（午前9時〜午前10時の間）に開始した。TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を使用して、全RNAを、このハクサイから抽出した。サリチル酸処理は5mMのサリチル酸溶液を噴霧する条件で行った。ジャスモン酸処理は100μMのジャスモン酸メチル溶液を噴霧する条件とした。エチレン処理（エテフォン処理）は1mMのエテフォン溶液を噴霧する条件とした。薬剤処理後、2、5、10、24時間後にサンプリングを行い、全RNAを抽出した。実施例１に示した定量的RT-PCR法により、ハクサイSIB A遺伝子の発現量を測定した。ハクサイの場合の標準化に用いる遺伝子はBrAct2遺伝子とした。ハクサイSIB A遺伝子の発現測定には、センスプライマーとして5’-CCACCACAAGCTTAGATCAGAGAA-3’、アンチセンスプライマーとして5’-CACTTTGATGTGTTTGTCGGTTG-3’を用い、ハクサイBrAct2遺伝子の発現測定には、センスプライマーとして5’-ACCCAAAGGCCAACAGAGAG-3’、アンチセンスプライマーとして5’-CTGGCGTAAAGGGAGAGAACA-3’を用いた。
[Example 4] Analysis of salicylic acid responsiveness of Chinese cabbage SIB A gene Plant material was sown in soil (No. 2 for cultivated sapling and cutting buds by Daio Kasei Co., Ltd.), and light-dark cycle of 24 hours Chinese cabbage cultivated for 16 days at 22 ° C. for 12 hours and dark time of 12 hours was used. Moreover, the chemical | medical agent process started at the substantially same time (between 9 am and 10 am). Total RNA was extracted from this Chinese cabbage using TRIZOL Reagent (Invitrogen). The salicylic acid treatment was performed under the condition of spraying a 5 mM salicylic acid solution. The jasmonic acid treatment was performed under the condition of spraying a 100 μM methyl jasmonate solution. The ethylene treatment (ethephon treatment) was carried out under the condition that a 1 mM ethephon solution was sprayed. Sampling was performed 2, 5, 10, 24 hours after drug treatment, and total RNA was extracted. The expression level of Chinese cabbage SIB A gene was measured by the quantitative RT-PCR method shown in Example 1. The gene used for standardization in Chinese cabbage was the BrAct2 gene. For the expression measurement of Chinese cabbage SIB A gene, 5'-CCACCACAAGCTTAGATCAGAGAA-3 'is used as a sense primer, 5'-CACTTTGATGTGTTTGTCGGTTG-3' is used as an antisense primer, and 5 '- ACCCAAAGGCCAACAGAGAG-3 ′ and 5′-CTGGCGTAAAGGGAGAGAACA-3 ′ were used as antisense primers.
以上の結果、ハクサイSIB A遺伝子は、シロイヌナズナSIB A遺伝子の発現と同様に、サリチル酸処理（ＳＡ）により速やかに発現応答し、エチレン処理（ＥＴ）及びジャスモン酸処理（ＪＡ）にはほとんど応答しなかった（図６）。ハクサイSIB A遺伝子は、シロイヌナズナSIB A遺伝子と全く同じ遺伝子発現パターンを示すことが明らかとなった。このことから、ハクサイSIB A遺伝子はシロイヌナズナSIB A遺伝子と同様の機能を有すると考えられ、ハクサイにおいてもSIB A遺伝子の発現を抑制することで、病害抵抗性及び環境ストレス耐性を向上させ、さらに、成長を促進することができると考えられる。 As a result, the Chinese cabbage SIB A gene, like the expression of Arabidopsis SIB A gene, rapidly responds to salicylic acid treatment (SA) and hardly responds to ethylene treatment (ET) and jasmonic acid treatment (JA). (FIG. 6). It became clear that Chinese cabbage SIB A gene shows the same gene expression pattern as Arabidopsis thaliana SIB A gene. From this, the Chinese cabbage SIB A gene is considered to have the same function as the Arabidopsis SIB A gene, and in the Chinese cabbage, by suppressing the expression of the SIB A gene, disease resistance and environmental stress tolerance are improved. It is thought that growth can be promoted.
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