JP5311537B2 - AMP deaminase derived from algae - Google Patents
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Description
本発明は、藻類由来のAMPデアミナーゼおよびその利用に関し、特に呈味性の優れた食品開発などへの本酵素の利用に関する。 The present invention relates to algae-derived AMP deaminase and use thereof, and more particularly, to use of the enzyme for developing a food having excellent taste.
海苔の味は、遊離糖類や有機酸の他、アミノ酸および核酸などの成分が関与し、特にグルタミン酸と5'-イノシン酸(イノシン酸)が大きく関わっていることが知られている(非特許文献1及び2)。さらに、多くの海苔が呈味的に飽和量のグルタミン酸量を常に含有していることから、イノシン酸量の高低が呈味性の良否を決定する最も重要な成分であることが明らかにされている(非特許文献3)。 It is known that the taste of seaweed involves components such as free sugars and organic acids, as well as amino acids and nucleic acids, and glutamate and 5'-inosinic acid (inosinic acid) are particularly closely related (non-patent literature). 1 and 2). Furthermore, since many laver always contains a saturating amount of glutamic acid, it is clarified that the level of inosinic acid is the most important ingredient that determines the quality of taste. (Non-patent Document 3).
イノシン酸は獣肉や魚肉のうま味成分として普通に見いだされる物質である一方、植物におけるイノシン酸の存在は極めてまれである。例えば、海産植物である海苔においても、定法である80%エタノール抽出法では、イノシン酸は検出されない。しかし、乾燥海苔や焼き海苔として、それらを温水処理した後、水抽出した場合には、イノシン酸が検出される(非特許文献3)。この場合、イノシン酸検出量は温度依存的であるが、水温が75℃以上では確認されないことから、イノシン酸は酵素的に温水抽出の過程で生成されていると考えられた(非特許文献3)。 While inosinic acid is a substance commonly found as an umami component in animal and fish meat, the presence of inosinic acid in plants is extremely rare. For example, even in seaweed, which is a marine plant, inosinic acid is not detected by the conventional 80% ethanol extraction method. However, inosinic acid is detected when the water is extracted as a dried seaweed or a baked seaweed and then extracted with water (Non-patent Document 3). In this case, the detected amount of inosinic acid is temperature-dependent, but since it was not confirmed when the water temperature was 75 ° C. or higher, it was considered that inosinic acid was generated enzymatically during the hot water extraction process (Non-patent Document 3). ).
このように海苔などの藻類においては、呈味性の重要な要素であるイノシン酸の生合成に関与する酵素の存在は示唆されてはいるものの、いまだ同定されていないのが現状である。 As described above, in algae such as seaweed, although the existence of an enzyme involved in biosynthesis of inosinic acid, which is an important element of taste, has been suggested, it has not yet been identified.
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、藻類におけるイノシン酸の生合成に関与する酵素及びその遺伝子を同定し、単離することにある。さらなる、本発明の目的は、取得した酵素及びその遺伝子を利用して、植物の評価、育種を行い、ひいては呈味性などに優れた有用農作物などの開発を行うことにある。 This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is to identify and isolate the enzyme and its gene which are concerned in the biosynthesis of inosinic acid in algae. A further object of the present invention is to evaluate and breed plants using the obtained enzyme and its gene, and to develop useful crops excellent in taste and the like.
上記したように、海苔においてイノシン酸は、エタノール抽出法を用いることでは検出されないが、乾燥海苔や焼き海苔から温水抽出することによって検出されるようになる。また、イノシン酸の生合成は、AMPデアミナーゼ(AMPD)によりAMP→IMP+NH3という反応で行われる。これら事実から、本発明者らは、海苔を咀嚼した場合、口中において、AMPDの働きによって新たにイノシン酸が生成され、これが海苔の呈味性に影響を与えていると推論するに至った。 As described above, inosinic acid in seaweed is not detected by using the ethanol extraction method, but is detected by hot water extraction from dried or baked seaweed. The biosynthesis of inosinic acid is carried out by the reaction of AMP → IMP + NH 3 with AMP deaminase (AMPD). From these facts, the present inventors have inferred that when nori is chewed, inosinic acid is newly generated in the mouth by the action of AMPD, which affects the taste of nori.
この推論を前提とすると、AMPDの活性や酵素の存在量が海苔の呈味性の指標になる可能性があることから、本発明者らは、まず、海苔のAMPDの同定を試みた。そして、精製条件を種々検討し、創意工夫を行った結果、遂に、活性を保持したAMPDの精製標品を取得することに成功するに至った。さらに、本発明者らは、取得したAMPDの部分アミノ酸配列を決定し、その配列情報を基に作製したプライマーを利用したRACE法を実施するにより、AMPDをコードするDNAの取得にも成功した。さらに、本発明者らは、得られたDNAを基に、AMPDの組換え蛋白質を取得すると共に、その組換え蛋白質を利用してAMPDに対する抗体をも取得するに至った。 Assuming this reasoning, since the activity of AMPD and the abundance of the enzyme may be an indicator of the taste of nori, the present inventors first attempted to identify AMPD in nori. As a result of various investigations on the purification conditions and creative ideas, the inventors finally succeeded in obtaining a purified preparation of AMPD that retains its activity. Furthermore, the present inventors have succeeded in obtaining DNA encoding AMPD by determining the partial amino acid sequence of the acquired AMPD and performing the RACE method using a primer prepared based on the sequence information. Furthermore, the present inventors have obtained a recombinant protein of AMPD based on the obtained DNA, and have also obtained an antibody against AMPD using the recombinant protein.
取得した海苔由来のAMPDの一次構造を分析したところ、これまで報告されていた植物、動物、菌類のAMPDとの相同性が低く、分子系統的な類縁性が高くないことが判明した(図3)。これまでAMPDに関しては、動物や菌類において遺伝子のクローニングが行われているほか、植物ではゲノムプロジェクトによりシロイズナズナとイネで遺伝子が同定されているにとどまり、海苔も含め藻類においては本酵素の取得はなされていなかった。その理由としては、AMPDの研究が、主に核酸代謝研究の一環として行われてきており(非特許文献4)、海苔においては、通常の状態では、イノシン酸が検出されなかったことから、AMPD遺伝子を取得しようという試みがほとんどなされていなかったことや、仮に試みられたとしても、公知のカウンターパート遺伝子との相同性の低さから(後述の表3参照のこと)、その取得が困難であったことが挙げられる。 Analysis of the primary structure of AMPD derived from seaweed was found to have low homology with AMPD of plants, animals, and fungi that had been reported so far, and not to have high molecular systematic affinity (Fig. 3). ). So far, AMPD has been cloned in animals and fungi, and in plants, the gene has only been identified in Shiroizuna and rice by the Genome Project, and this enzyme has not been obtained in algae including laver. It wasn't. The reason for this is that AMPD research has been carried out mainly as part of nucleic acid metabolism research (Non-patent Document 4), and inosinic acid was not detected in normal conditions in laver. Even if there were almost no attempts to acquire a gene, and even if it was attempted, it was difficult to acquire it because of its low homology with known counterpart genes (see Table 3 below). It was mentioned that there was.
本発明者らは、このような状況の下で、藻類において世界で初めてAMPDとその遺伝子の取得に成功すると共に、それらを利用して、植物の評価、育種を行い、ひいては呈味性などに優れた有用農作物などの開発を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 Under these circumstances, the present inventors succeeded in obtaining the world's first AMPD and its gene in algae, and using them, the plant was evaluated and bred, and as a result, the taste was improved. The present inventors have found that it is possible to develop excellent useful agricultural products and the like and have completed the present invention.
本発明は、より具体的には、以下の<1>〜<17>を提供するものである。 More specifically, the present invention provides the following <1> to <17>.
<1> 藻類由来のAMPデアミナーゼをコードする下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域からなるDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
<1> The DNA according to any one of (a) to (d) below, which encodes algae-derived AMP deaminase.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(B) DNA comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(D) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
<2> AMPデアミナーゼが耐熱性である、<1>に記載のDNA。 <2> The DNA according to <1>, wherein the AMP deaminase is thermostable.
<3> <1>または<2>に記載のDNAを含むベクター。 <3> A vector comprising the DNA according to <1> or <2>.
<4> <1>または<2>に記載のDNA、または<3>に記載のベクターが導入された形質転換細胞。 <4> A transformed cell into which the DNA according to <1> or <2> or the vector according to <3> is introduced.
<5> <1>または<2>に記載のDNAによりコードされる蛋白質。 <5> A protein encoded by the DNA according to <1> or <2>.
<6> <4>に記載の形質転換細胞を培養し、培養物または培養上清から<5>に記載の蛋白質を回収する工程を含む、<5>に記載の蛋白質の製造方法。 <6> The method for producing a protein according to <5>, comprising a step of culturing the transformed cell according to <4> and recovering the protein according to <5> from the culture or the culture supernatant.
<7> <5>に記載の蛋白質に結合する抗体。 <7> An antibody that binds to the protein according to <5>.
<8> <1>または<2>に記載のDNA、または<3>に記載のベクターが導入された植物細胞。 <8> A plant cell into which the DNA according to <1> or <2> or the vector according to <3> is introduced.
<9> <8>に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。 <9> A transformed plant comprising the plant cell according to <8>.
<10> <9>に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。 <10> A transformed plant that is a descendant or clone of the transformed plant according to <9>.
<11> <9>または<10>に記載の形質転換植物体の繁殖材料。 <11> A propagation material for a transformed plant according to <9> or <10>.
<12> <9>または<10>に記載の形質転換植物体または<11>に記載の繁殖材料を加工して製造された食品。 <12> A food produced by processing the transformed plant according to <9> or <10> or the propagation material according to <11>.
<13> <5>に記載の蛋白質が添加された食品。 <13> A food to which the protein according to <5> is added.
<14> 藻類における<5>に記載の蛋白質の量を検出することを特徴とする、藻類を評価又は選別する方法。 <14> A method for evaluating or sorting algae, comprising detecting the amount of the protein according to <5> in the algae.
<15> <5>に記載の蛋白質の量を、藻類の呈味性の指標とする、<14>に記載の方法。 <15> The method according to <14>, wherein the amount of the protein according to <5> is used as an indicator of the taste of algae.
<16> <7>に記載の抗体を有効成分とする、<5>に記載の蛋白質の検出試薬。 <16> The protein detection reagent according to <5>, comprising the antibody according to <7> as an active ingredient.
<17> 藻類の呈味性の評価に用いられる、<16>に記載の検出試薬。 <17> The detection reagent according to <16>, which is used for evaluating the taste of algae.
本発明により海苔におけるAMPDとそれをコードする遺伝子が提供された。これにより、従来、官能試験で行われてきた海苔の呈味性の評価が、AMPDの定量化を利用することにより、簡便かつ客観的に行なうことが可能となった。また、このような「呈味性の数値化」を利用して、呈味性の高い海苔株の選別やスクリーニングを効率的に行なうことが可能となった。さらに、海苔の養殖において、得られた生産品の品質を、AMPDを指標に定量化することによって、病気、色落ちによる品質低下の評価を行うことも可能となり、それらに対する対策を迅速に講ずることも可能となった。さらに、本酵素やその遺伝子は、海苔自身や他の農産品などに添加あるいは導入することにより、呈味性の優れた新たな食品などの開発にも大きく貢献することができる。特に、海苔AMPDは、長期保存性や耐熱性に優れ、極めて安定な酵素であることから、様々な食品工学への応用に適しているといえる。 According to the present invention, AMPD in seaweed and a gene encoding it are provided. As a result, it has become possible to simply and objectively evaluate the taste of nori, which has been performed in sensory tests, by using AMPD quantification. In addition, it has become possible to efficiently select and screen nori strains with high taste by using such “quantification of taste”. In addition, by quantifying the quality of the products obtained in nori culture using AMPD as an index, it is possible to evaluate the quality degradation due to illness or discoloration, and promptly take measures against them. Became possible. Furthermore, the present enzyme and its gene can greatly contribute to the development of new foods with excellent taste by adding or introducing them into seaweed itself or other agricultural products. In particular, laver AMPD is excellent in long-term storage and heat resistance, and is an extremely stable enzyme, so it can be said that it is suitable for various food engineering applications.
本発明は、藻類由来のAMPDをコードするDNAを提供する。本発明において「藻類」とは、酸素を発生する光合成をおこなう生物の中からコケ植物、シダ植物、および種子植物を除いたものを意味する(裳華房,バイオディバーシティ・シリーズ 3,藻類の多様性と系統,千原光雄 編)。本発明の藻類としては特に制限はないが、産業上への応用の観点から好ましい藻類としては、海苔、こんぶ、わかめ、ひじき、青海苔、あおさ、もずく、テングサ(寒天)、トサカノリ、ムカデノリ、海ブドウ、アカモクなどの食用とされているものや、クロレラやスピルリナなど健康食品に利用されているものを例示することができる。本発明においては、中でも海苔由来のDNAが最も好ましい。なお、本発明のDNAの一態様である、スサビノリ由来のAMPDをコードするcDNAの塩基配列を配列番号:1に、該DNAがコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:2に示す。スサビノリ由来のAMPDは、乾燥海苔や焼き海苔とした場合でも、失活せず、耐熱性を示す。このようにAMPDが耐熱性を示すことは、例えば、食品などへの加工や保存において有利である。従って、本発明のDNAは、好ましくは、耐熱性のAMPDをコードするものである。ここで「耐熱性」とは、180℃で10秒の熱処理、あるいは60℃で5分の処理をした場合でも、酵素活性が失活しないことを意味する(非特許文献2、Fisheries Science 66: 101-116, 2000.を参照のこと)。 The present invention provides DNA encoding algae-derived AMPD. In the present invention, the term “algae” refers to an organism that performs photosynthesis that generates oxygen, excluding moss plants, fern plants, and seed plants (Ryohanabo, Biodiversity Series 3, Diversity and systems, edited by Mitsuo Chihara). The algae of the present invention are not particularly limited, but preferred algae from the viewpoint of industrial application include nori, kombu, wakame, hijiki, green nori, blue seaweed, mozuku, tengusa (agar), tosakanori, mucadenori, sea grapes Examples thereof include those used for food such as akamoku, and those used for health food such as chlorella and spirulina. In the present invention, DNA derived from laver is most preferable. In addition, the base sequence of cDNA encoding AMPD derived from Susabiori, which is one embodiment of the DNA of the present invention, is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the DNA is shown in SEQ ID NO: 2. Supadinori-derived AMPD does not deactivate even when it is dried or baked, and exhibits heat resistance. It is advantageous for AMPD to exhibit heat resistance in this way, for example, in processing and storage into foods. Therefore, the DNA of the present invention preferably encodes heat-resistant AMPD. Here, “heat resistance” means that the enzyme activity is not inactivated even when heat treatment is performed at 180 ° C. for 10 seconds or treatment at 60 ° C. for 5 minutes (Non-Patent Document 2, Fisheries Science 66: 101-116, 2000.).
本発明のDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって公知の方法を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、藻類からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる)を作製し、これを展開して、本発明のAMPDをコードするDNA(例えば、配列番号:1)を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明のAMPDをコードするDNA(例えば、配列番号:1)に特異的なプライマーを作製し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、藻類から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAPなどのベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。 The DNA of the present invention includes genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA. Genomic DNA and cDNA can be prepared using methods known to those skilled in the art. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from algae, a genomic library (plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used as vectors) is developed, and the AMPD of the present invention is developed. It is possible to prepare by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on a DNA encoding (eg, SEQ ID NO: 1). Moreover, it is also possible to prepare by preparing a primer specific for DNA encoding the AMPD of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1) and performing PCR using this primer. In addition, for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from algae, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, developed, and colony hybridization in the same manner as described above. Alternatively, it can be prepared by performing plaque hybridization or by performing PCR.
本発明は、配列番号:2に記載のスサビノリ由来のAMPDと機能的に同等なタンパク質をコードするDNAをも包含する。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、AMPデアミナーゼ活性を有することを指す。このようなDNAには、例えば、配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、部位特異的変異法が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のAMPDをコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、機能的に同等なタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合(縮重変異)もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内)であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが、その活性維持などの観点から望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(F、Y、W)を挙げることができる(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す)。あるDNAがコードする蛋白質が、AMPデアミナーゼ活性を有するか否かは、例えば、実施例に記載のように、25℃下で、対象となる蛋白質を含む反応液(例えば、対象となる蛋白質、50 mM Tris-HCl、 100 mM CaCl2、 1 mM 2-MEを含む反応液)1 mLに、3 mM 5'-AMPを10μL添加し、265 nmにおける吸光度の経時変化を分光光度計(Shimazdu UV2200)で測定することで評価することができる。また、生成されるAMPD量をHPLCで定量することで活性を評価することも可能である(非特許文献2)。 The present invention also includes a DNA that encodes a protein functionally equivalent to the AMPD derived from Susvinori described in SEQ ID NO: 2. Here, “functionally equivalent” means that the target protein has AMP deaminase activity. Such DNA includes, for example, mutants, derivatives, and the like that encode proteins consisting of amino acid sequences in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Alleles, variants and homologs are included. As a method well known to those skilled in the art for preparing DNA encoding a protein having a modified amino acid sequence, for example, site-directed mutagenesis can be mentioned. In addition, the amino acid sequence of the encoded protein may be mutated in nature due to the mutation of the base sequence. Thus, even if the DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence encoding the natural AMPD, as long as it encodes a functionally equivalent protein Included in the DNA of the present invention. Moreover, even if the base sequence is mutated, it may not be accompanied by amino acid mutation in the protein (degenerate mutation), and such a degenerate mutant is also included in the DNA of the present invention. In such mutants, the number of amino acids to be mutated is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (for example, within 5 amino acids). The amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved from the viewpoint of maintaining its activity. For example, amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T, Y), and a sulfur atom-containing side chain Amino acids (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base-containing side chains (R, K, H), amino acids with aromatic-containing side chains (F, Y, W) can be mentioned (the parentheses indicate single letter amino acids). Whether or not a protein encoded by a certain DNA has AMP deaminase activity is determined, for example, as described in the Examples, at 25 ° C. under a reaction solution containing the target protein (for example, the target protein, 50 10 mL of 3 mM 5'-AMP was added to 1 mL of a reaction solution containing mM Tris-HCl, 100 mM CaCl 2 , and 1 mM 2-ME, and the time course of absorbance at 265 nm was measured using a spectrophotometer (Shimazdu UV2200). It can be evaluated by measuring with. Moreover, it is also possible to evaluate activity by quantifying the amount of AMPD produced | generated by HPLC (nonpatent literature 2).
配列番号:2に記載のAMPDと機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、該AMPD遺伝子の塩基配列(配列番号:1)もしくはその一部をプローブとして、また該AMPD遺伝子(配列番号:1)に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、海苔や他の藻類から、それと高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうる、配列番号:2に記載のAMPDと機能的に同等なタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。 In order to prepare DNA encoding a protein functionally equivalent to the AMPD described in SEQ ID NO: 2, other methods well known to those skilled in the art include hybridization techniques and polymerase chain reaction (PCR) techniques. The method of using is mentioned. That is, for those skilled in the art, the base sequence of the AMPD gene (SEQ ID NO: 1) or a part thereof as a probe, and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the AMPD gene (SEQ ID NO: 1) as a primer, It is usually possible to isolate DNA with high homology from seaweed and other algae. The DNA encoding the protein functionally equivalent to the AMPD described in SEQ ID NO: 2, which can be isolated by the hybridization technique or the PCR technique, is also included in the DNA of the present invention.
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、スサビノリ由来のAMPDのアミノ酸配列(配列番号:2)と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70%以上、特に好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,1990.、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873,1993.)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(J Mol Biol 215: 403,1990.)。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。 In order to isolate such DNA, the hybridization reaction is preferably carried out under stringent conditions. In the present invention, stringent hybridization conditions refer to hybridization conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC or equivalent stringency. Isolation of DNA with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, for example, conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 × SSC. The DNA thus isolated is considered to have high homology with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of AMPD derived from Susvinori at the amino acid level. High homology means a sequence of at least 50% or more, more preferably 70% or more, particularly preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) in the entire amino acid sequence. Refers to the identity of The identity of the amino acid sequence and base sequence was determined using the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990., Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993.) by Carlin and Arthur. Can be determined. Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (J Mol Biol 215: 403, 1990.). When analyzing a base sequence using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. In addition, when an amino acid sequence is analyzed using BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.
本発明のDNAは、例えば、組換えタンパク質の調製や、植物の評価、育種、あるいは呈味性などに優れた有用農作物などの開発に利用することが可能である。 The DNA of the present invention can be used, for example, for the preparation of recombinant proteins, the development of useful crops excellent in plant evaluation, breeding, taste and the like.
組換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法(米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法(Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ)、ヒスチジンタグを付加して調製する方法(Novagen社のpETシリーズ)などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組換えタンパク質を上記のマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。また、後述する手法で、本発明のDNAが導入された形質転換植物体を作製し、該植物体から本発明のタンパク質を調製することも可能である。 When preparing a recombinant protein, usually, a protein encoding the protein of the present invention is inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into an appropriate cell, and transformed cells are cultured and expressed. Is purified. The recombinant protein can also be expressed as a fusion protein with another protein for the purpose of facilitating purification or the like. For example, a method for preparing a fusion protein with maltose binding protein using E. coli as a host (vector pMAL series released by New England BioLabs, USA), a method for preparing a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech Vector pGEX series released by the company), a method of preparing by adding a histidine tag (pET series from Novagen), etc. can be used. The host cell is not particularly limited as long as it is a cell suitable for the expression of a recombinant protein. For example, yeast, various animal and plant cells, insect cells and the like can be used in addition to the above-mentioned E. coli. Various methods known to those skilled in the art can be used to introduce a vector into a host cell. For example, an introduction method using calcium ions can be used for introduction into E. coli. The recombinant protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or its culture supernatant by methods known to those skilled in the art. When the recombinant protein is expressed as a fusion protein with the maltose-binding protein or the like, affinity purification can be easily performed. It is also possible to prepare a transformed plant into which the DNA of the present invention has been introduced by the method described later and prepare the protein of the present invention from the plant.
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血餅を除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞(ハイブリドーマ)を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。これらの抗体は、本発明のタンパク質を検出するための研究試薬として用いることができる他、後述するように、例えば、生物品種や食品の呈味性の評価、呈味性の優れた生物品種の育種において、呈味性の指標としてのAMPD蛋白質を検出する目的で用いることもできる。 If the obtained recombinant protein is used, an antibody that binds to the protein can be prepared. For example, a polyclonal antibody can be prepared by immunizing an immunized animal such as a rabbit with the purified protein of the present invention or a partial peptide thereof, collecting blood after a certain period of time, and removing the clot. is there. In addition, the monoclonal antibody is obtained by fusing an antibody-producing cell of an animal immunized with the protein or peptide and a bone tumor cell, and isolating a single clone cell (hybridoma) that produces the target antibody. Can be prepared. The antibody thus obtained can be used for purification and detection of the protein of the present invention. The present invention includes antibodies that bind to the proteins of the present invention. These antibodies can be used as a research reagent for detecting the protein of the present invention, and as described later, for example, evaluation of the taste of biological varieties and foods, In breeding, it can also be used for the purpose of detecting AMPD protein as an indicator of taste.
本発明のDNAを利用して、藻類由来のAMPDを発現させた形質転換植物体を作製する場合には、例えば、本発明のDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。これにより植物やその加工品たる食品における呈味性を改良することが可能である。ベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」(いずれもClontech社製)などが挙げられる。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーターを有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。また、植物体全体で活性化するプロモーターのみならず、必要に応じて、植物の特定の組織に特異的に活性化するプロモーターを用いることも可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。植物の種類に応じて、植物体作出のために、遺伝子導入を行うのに適した植物細胞の形態を選択し、利用すればよい。 When producing a transformed plant body in which algae-derived AMPD is expressed using the DNA of the present invention, for example, the DNA of the present invention is inserted into an appropriate vector and introduced into a plant cell. Then, the transformed plant cell thus obtained is regenerated. As a result, it is possible to improve the taste of a plant or a processed food product. The vector is not particularly limited as long as it contains a promoter sequence that can be transcribed in plant cells and a terminator sequence including a polyadenylation site necessary for the stabilization of the transcript.For example, plasmids `` pBI121 '', `` pBI221 '', Examples include “pBI101” (all manufactured by Clontech). The vector used for the transformation of plant cells is not particularly limited as long as the inserted gene can be expressed in the cells. For example, it is also possible to use a vector having a promoter for performing constitutive gene expression in a plant cell or a vector having a promoter that is inducibly activated by an external stimulus. Moreover, it is possible to use not only a promoter that is activated in the whole plant body but also a promoter that is specifically activated in a specific plant tissue, if necessary. As used herein, “plant cells” include various forms of plant cells, such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and callus. Depending on the type of plant, a plant cell form suitable for gene transfer may be selected and used for plant production.
本発明のタンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、SV40プロモーター、GDPプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。具体的には、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。 Examples of promoters for expressing the protein of the present invention include cauliflower mosaic virus 35S promoter, SV40 promoter, GDP promoter, rice actin promoter, maize ubiquitin promoter, and the like. In addition, promoters for inducible expression are known to be expressed by external factors such as infection and invasion of filamentous fungi, bacteria and viruses, low temperature, high temperature, drying, UV irradiation, and spraying of specific compounds. Promoters and the like. Specifically, for example, rice chitinase gene promoter expressed by infection or invasion of filamentous fungus, bacteria, virus, promoter of tobacco PR protein gene, rice lip19 gene promoter induced by low temperature, high temperature Induced rice “hsp80” and “hsp72” gene promoters, Arabidopsis thaliana “rab16” gene promoters induced by drying, parsley chalcone synthase gene promoters induced by UV irradiation, anaerobic conditions And the promoter of the corn alcohol dehydrogenase gene induced by. The rice chitinase gene promoter and tobacco PR protein gene promoter are also induced by specific compounds such as salicylic acid, and “rab16” is also induced by spraying the plant hormone abscisic acid.
本発明のベクターが導入される植物細胞としては特に制限はなく、例えば、藻類である海苔、こんぶ、わかめ、ひじき、青海苔、あおさ、もずく、テングサ(寒天)、トサカノリ、ムカデノリ、海ブドウ、アカモク、クロレラやスピルリナなどの細胞の他、イネ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの細胞も例示することができる。本発明にかかる植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。 The plant cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited. In addition to cells such as chlorella and spirulina, cells such as rice, Arabidopsis, corn, potato, and tobacco can also be exemplified. The plant cells according to the present invention include cells in plant bodies in addition to cultured cells. Also included are protoplasts, shoot primordia, multi-buds, and hairy roots. For introduction of a vector into a plant cell, various methods known to those skilled in the art such as polyethylene glycol method, electroporation method (electroporation), Agrobacterium-mediated method, particle gun method and the like can be used. Transformed plant cells can regenerate plant bodies by redifferentiation.
海苔における形質転換植物の作製技術としては、例えば、海苔プロトプラストに目的遺伝子とプロモーター(例えば、CamV35SプロモーターやSV40プロモーターなど)を組み込んだプラスミドをエレクトロポレーション法により導入し、相同組換えにより形質転換させる手法が公知である(J Appl Phycol 15:1-7,2003.、Aquacult Res, 38:681-688,2007.)また、褐藻類においては、例えば、破砕したマコンブの糸状配偶体細胞片にパーティクルガン法により、目的遺伝子とプロモーター(例えば、SV40プロモーター)を組み込んだプラスミドを導入する方法が知られている(Plant Cell Rep. 21:1211-1216, 2003.)。菌類においては、例えば、アガリスクを用いる手法が確立されている(Mol. Gen. Genet. 250: 252-258,1996.)。プロモーターとしては、例えば、GDPプロモーターを用い、目的遺伝子とプロモーターを組み込んだプラスミドをエレクトロポレーション法により導入することができる。枯草菌においては、例えば、B. subtilisの形質転換技術が確立されており、pHY300PLK(タカラバイオ)などの市販ベクターを利用することも可能である。その他の形質転換植物の作製技術としては、イネであればFujimuraら(Plant Tissue Culture Lett. 2:74,1995.)の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら(Bio/Technology 7:581,1989.)の方法やGorden-Kammら(Plant Cell 2:603,1990.)の方法が挙げられ、ジャガイモであればVisserら(Theor.Appl.Genet 78:594,1989.)の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe(Planta 99:12,1971.)の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら(Plant Cell Reports12:7-11, 1992.)の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら(特開平8-89113号公報)の方法が挙げられる。 As a technique for producing a transformed plant in laver, for example, a plasmid in which a target gene and a promoter (for example, CamV35S promoter, SV40 promoter, etc.) are incorporated into laver protoplasts is introduced by electroporation and transformed by homologous recombination. The technique is well known (J Appl Phycol 15: 1-7,2003., Aquacult Res, 38: 681-688,2007.) In brown algae, for example, particles are found on crushed macombe filamentous gametophyte cell fragments. A method of introducing a plasmid incorporating a target gene and a promoter (for example, SV40 promoter) by a cancer method is known (Plant Cell Rep. 21: 1211-1216, 2003.). In fungi, for example, a method using agarisk has been established (Mol. Gen. Genet. 250: 252-258, 1996.). As the promoter, for example, a GDP promoter is used, and a plasmid incorporating the target gene and the promoter can be introduced by electroporation. In Bacillus subtilis, for example, a transformation technique of B. subtilis has been established, and a commercially available vector such as pHY300PLK (Takara Bio) can be used. Other techniques for producing transformed plants include the method of Fujimura et al. (Plant Tissue Culture Lett. 2:74, 1995.) for rice, and Shillito et al. (Bio / Technology 7: 581, for maize). 1989.) and Gorden-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603, 1990.), and for potatoes, Visser et al. (Theor. Appl. Genet 78: 594, 1989.). In the case of tobacco, the method of Nagata and Takebe (Planta 99: 12,1971.) Can be cited, and in the case of Arabidopsis, the method of Akama et al. (Plant Cell Reports 12: 7-11, 1992.) can be cited. For example, the method of Toi et al.
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど)を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。 Once a transformed plant into which the DNA of the present invention is introduced into the genome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible. The present invention includes plant cells into which the DNA of the present invention has been introduced, plants containing the cells, progeny and clones of the plants, and propagation materials for the plants, their progeny, and clones.
このようにして作出された形質転換植物体やそれを加工した食品においては、本発明のAMPDの作用により、咀嚼した場合、口中において、新たにイノシン酸が生成され、これにより呈味性が改良されうる。また、本発明のAMPDの精製標品を食品に添加することによっても、その食品の呈味性を改良しうる。本発明は、このようにして調製された食品をも提供するものである。 In the transformed plant produced in this way and the food processed from the same, inosinic acid is newly produced in the mouth when chewed by the action of AMPD of the present invention, thereby improving the taste. Can be done. Moreover, the taste of the food can also be improved by adding the purified preparation of AMPD of the present invention to the food. The present invention also provides a food prepared in this manner.
また、本発明は、本発明のAMPDを標的とした藻類の評価・選別の方法をも提供する。本発明のAMPDは、イノシン酸の生成により、呈味性に影響を与えうることから、藻類において内在する本発明のAMPDの量や活性を検出することにより、藻類の品質評価や優良品種の選別を行うことが可能である。従って、本発明の藻類の評価・選別の方法は、藻類におけるAMPDの量や活性を検出することを特徴とする方法である。蛋白質量の検出は、公知の手法、例えば、ELISA法、ウェスタンブロッティング法、ビアコア法などの手法により実施することができ、一方、蛋白質の活性の検出は、上記したAMPのデアミナーゼ活性の検出法により実施することができる。この結果、本発明の蛋白質の量や活性が高いと評価された個体は、通常の個体と比較して、咀嚼した場合、より多くのイノシン酸の生成が期待でき、これにより呈味性が改善されうる。このような個体を選別し、育種することにより、品種改良を行うことも可能である。本発明の蛋白質の量や活性は、このように、藻類の呈味性の指標として利用することができるが、本発明は、これに制限されず、本発明の蛋白質の量や活性が影響を与える、その他の種々の現象・表現型の指標として利用することをも含むものである。 The present invention also provides a method for evaluating and selecting algae targeting the AMPD of the present invention. The AMPD of the present invention can affect the taste by producing inosinic acid. Therefore, by detecting the amount and activity of the AMPD present in the algae, the quality evaluation of the algae and the selection of excellent varieties Can be done. Therefore, the method for evaluating and selecting algae according to the present invention is a method characterized by detecting the amount and activity of AMPD in algae. Protein mass can be detected by known methods such as ELISA, Western blotting, Biacore, etc., while protein activity can be detected by the above-described detection method of AMP deaminase activity. Can be implemented. As a result, individuals evaluated to have a high amount and activity of the protein of the present invention can be expected to produce more inosinic acid when chewed compared to normal individuals, thereby improving taste. Can be done. It is also possible to improve the breed by selecting and breeding such individuals. Thus, the amount and activity of the protein of the present invention can be used as an indicator of the taste of algae, but the present invention is not limited to this, and the amount and activity of the protein of the present invention have an effect. It also includes using it as an indicator of various other phenomena and phenotypes.
このような評価・選別において本発明の蛋白質を検出するためには、本発明の蛋白質に結合する抗体を利用すると簡便である。即ち、本発明の抗体は、藻類の呈味性などの指標として、本発明の蛋白質を検出するための試薬として利用することができる。検出試薬として、本発明の抗体を利用する場合には、必要に応じて、抗体には、検出可能な種々の標識がなされていてもよい。 In order to detect the protein of the present invention in such evaluation and selection, it is convenient to use an antibody that binds to the protein of the present invention. That is, the antibody of the present invention can be used as a reagent for detecting the protein of the present invention as an indicator of algae taste. When the antibody of the present invention is used as a detection reagent, various detectable labels may be provided on the antibody as necessary.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
なお、実施例に用いる試料のスサビノリ(Porphyra yezoensis)は、山本海苔研究所((株)山本海苔店)より提供を受けた。精製に用いた藻体は採集後、氷冷状態で輸送し、実験に使用するまで-80℃で保存した。クローニングに用いた試料は、採集後、直ちに液体窒素で凍結し、その後-80℃フリーザーに移し、使用するまで保存した。また、本実施例における基本的な実験手法は次の通りである。 In addition, the sample Sabbinori (Porphyra yezoensis) used for an Example was provided from the Yamamoto Nori Institute (Yamamoto Nori store). Algae bodies used for purification were collected, transported in an ice-cooled state, and stored at −80 ° C. until used for experiments. Samples used for cloning were immediately frozen in liquid nitrogen after collection, then transferred to a -80 ° C freezer and stored until use. The basic experimental method in the present embodiment is as follows.
RNA抽出における、全ての操作はRNaseフリーで行い、使用した器具および試薬もRNaseフリーの処理を行った。藻体3gを液体窒素下で破砕し、45mLのAptバッファー(100 mM Tris-HCl pH=8.0、 1.5 M NaCl、 20 mM EDTA、 20 mM DTT、 2% CTAB、 Apt et al 1995)を添加し110 rpm x 15 min振とうした後、等量のクロロフォルムを添加し、voltexミキサーで撹拌した。遠心後(5000g x 30 min、 4℃)、上層を回収し1/3溶の95%エタノールを加え、遠心(5000g x 30 min、 4℃)した。得られた試料に等量のクロロフォルムを加え、激しく撹拌後、遠心により2相に分離させ、上層を回収した。この操作を上層から紅色がなくなるまで4度繰り返した。得られた試料に0.5溶の9M LiClおよび0.01溶の2-MEを加え撹拌し、-20℃で一晩保管した後、遠心し(20000g x 30 min)沈殿を得た。その後試料はRNA抽出キット(RNAgents Total RNA Isolation System、Promega)およびmRNA精製キット(PolyATtract mRNA Isolation Systems、Promega)を用い、添付のマニュアルに従い純化・精製した。 All operations in RNA extraction were performed without RNase, and the equipment and reagents used were also treated with RNase. 3 g of algal cells are crushed under liquid nitrogen, and 45 mL of Apt buffer (100 mM Tris-HCl pH = 8.0, 1.5 M NaCl, 20 mM EDTA, 20 mM DTT, 2% CTAB, Apt et al 1995) is added. After shaking at rpm x 15 min, an equal amount of chloroform was added and stirred with a voltex mixer. After centrifugation (5000 g × 30 min, 4 ° C.), the upper layer was recovered, 1 / 3-dissolved 95% ethanol was added, and the mixture was centrifuged (5000 g × 30 min, 4 ° C.). An equal amount of chloroform was added to the obtained sample, vigorously stirred, and then separated into two phases by centrifugation, and the upper layer was recovered. This operation was repeated four times until no red color disappeared from the upper layer. To the obtained sample, 0.5 M of 9M LiCl and 0.01 M of 2-ME were added, stirred, and stored overnight at −20 ° C., followed by centrifugation (20000 g × 30 min) to obtain a precipitate. Thereafter, the sample was purified and purified using an RNA extraction kit (RNAgents Total RNA Isolation System, Promega) and an mRNA purification kit (PolyATtract mRNA Isolation Systems, Promega) according to the attached manual.
大腸菌の培養は、基本的にはLB培地を用い37℃でオバーナイトで培養し、実験によってはアンピシリン(50μg/mL)添加下で培養した。また寒天培養する場合は1.5%アガーを含む培地で行った。ライゲーションはTakara Ligation Kit V2.1 (タカラバイオ)を用いて行った。大腸菌からのプラスミドの抽出・精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン)もしくはミニプレップ法により定法に従い行った。アガロースゲル電気泳動は泳動槽にミューピッド-2(アドバンス)、ゲルに1.0 %アガロース、泳動バッファーにTAEを用い定法に従い行った。泳動後のゲルは0.1 mg/Lのエチジウムブロマイド水溶液で染色し、バンドをUVライトで可視化した。アガロースゲルからの核酸の抽出はSuprec-EZ (タカラバイオ)を用いた。コロニー選別はブルーホワイトセレクションもしくはコロニーダイレクトPCR法により定法に従って行った。 The Escherichia coli was basically cultured in LB medium at 37 ° C. with amberite, and in some experiments, added with ampicillin (50 μg / mL). Agar culture was performed in a medium containing 1.5% agar. Ligation was performed using Takara Ligation Kit V2.1 (Takara Bio). Extraction and purification of the plasmid from Escherichia coli was performed according to a standard method using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) or the miniprep method. Agarose gel electrophoresis was performed according to a conventional method using mupid-2 (advance) in the electrophoresis tank, 1.0% agarose in the gel, and TAE in the electrophoresis buffer. The gel after electrophoresis was stained with 0.1 mg / L ethidium bromide aqueous solution, and the band was visualized with UV light. Nucleic acid was extracted from the agarose gel using Suprec-EZ (Takara Bio). Colony selection was performed according to a standard method using blue-white selection or colony direct PCR.
<実施例1> AMPDの精製
全ての操作は4℃もしくは氷冷して行った。遠心分離は、12000gX10 minで行った。100gの藻体に200 mLのバッファーA(50 mM Tris-HCl pH 7.5、 1 mM 2-メルカプトエタノール、 20 mM CaCl2)を加え自動乳鉢で破砕した後、ナイロンガーゼで残渣を除き、遠心分離(12、000 gX10 min)を行い上精を粗抽出液とした。粗抽出液を、45%-80%飽和の硫酸アンモニウムによって塩析後、沈殿を150 mLの抽出バッファーで溶解した。これをバッファーAに対して透析し、20%ポリエチレングリコール/15%硫酸アンモニウム処理(Phycol Res 53: 164-168,2005.)で生じた上精を回収後、バッファーAに対して再び透析した。その後、バッファーB(50 mM Tris-HCl pH 7.5、 1 mM 2-メルカプトエタノール、 20 mM CaCl2、 10% ソルビトール)で平衡化した Blue Sepharose CL6Bカラム(2cm x 5 cm、 GEヘルスケア)に供し、バッファーBで洗浄後、2 M NaClを含むバッファーBで溶出した.活性のあるフラクションを回収し、バッファーBに対して透析した後、MonoQ HR5/5 (GEヘルスケア)を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。カラムは前もってバッファーBで平衡化し、試料の添加後に同バッファーで洗浄し、250 mM NaClを含むバッファーBを用いてグラディエント溶出した。活性のあるフラクションを回収し、バッファーBで平衡化したSuperdex HRカラム(GEヘルスケア)に添加し、バッファーBで溶出した後、活性画分を回収し、精製標品を得た(表1)。
<Example 1> Purification of AMPD All operations were carried out at 4 ° C or on ice. Centrifugation was performed at 12000 g × 10 min. After adding 200 mL of buffer A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM 2-mercaptoethanol, 20 mM CaCl 2 ) to 100 g of algae, crush it in an automatic mortar, remove the residue with nylon gauze, and centrifuge ( 12,000 g × 10 min) was performed to obtain a fine extract as a crude extract. The crude extract was salted out with 45% -80% saturated ammonium sulfate, and then the precipitate was dissolved in 150 mL of extraction buffer. This was dialyzed against buffer A, and the supernatant resulting from the treatment with 20% polyethylene glycol / 15% ammonium sulfate (Phycol Res 53: 164-168, 2005.) was recovered and dialyzed again against buffer A. After that, it was applied to a Blue Sepharose CL6B column (2 cm x 5 cm, GE Healthcare) equilibrated with buffer B (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM 2-mercaptoethanol, 20 mM CaCl 2 , 10% sorbitol) After washing with buffer B, elution was performed with buffer B containing 2 M NaCl. Active fractions were collected and dialyzed against buffer B, followed by cation exchange chromatography using MonoQ HR5 / 5 (GE Healthcare). The column was pre-equilibrated with buffer B, washed with the same buffer after sample addition, and gradient elution was performed with buffer B containing 250 mM NaCl. Active fractions were collected and added to a Superdex HR column (GE Healthcare) equilibrated with buffer B. After elution with buffer B, active fractions were collected to obtain purified samples (Table 1). .
なお、酵素活性は、25℃下で50 mM Tris-HCl、100 mM CaCl2、 1 mM 2-MEを含む反応液1 mLに、3 mM 5'-AMPを10μL添加し、265 nmにおける吸光度の経時変化を分光光度計(Shimazdu UV2200)で測定することで行った。 The enzyme activity was determined by adding 10 μL of 3 mM 5′-AMP to 1 mL of a reaction solution containing 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl 2 and 1 mM 2-ME at 25 ° C., and measuring the absorbance at 265 nm. The time course was measured by measuring with a spectrophotometer (Shimazdu UV2200).
<実施例2> AMPDをコードするcDNAの単離と構造解析
精製標品をSDS-PAGE(%T=10%)に供した後、分離されたタンパク質を亜鉛染色により可視化し、当該バンドを切り出し、SDS-PAGEの泳動バッファーを用いて抽出した(Jpn. J. Phycol. 52 (Supplement): 95-100,2004)。得られた試料を限外ろ過により濃縮後(ミリポア、Centricon YM-10)、試料70μgにリシルエンドペプチターゼ20 ngを加え、37℃で13 hインキュベートし、SDS-PAGE (%T=15%)により断片を分離した後、PVDF膜に転写した(J. Biol. Chem. 280: 18462-18468,2004.)。転写されたタンパク質断片はCBBにより可視化し、当該のバンドを切り出し、エドマン分解によりそのN末端アミノ酸配列を分析した(model 477A、 Applied Biosystem、Caloglossa continua (Ceramiales、Rhodophyta). Mar. Biotechnol. 3: 493-500,2001.)。その結果を図1に示す。
<Example 2> Isolation and structural analysis of cDNA encoding AMPD After the purified sample was subjected to SDS-PAGE (% T = 10%), the separated protein was visualized by zinc staining, and the band was excised. Extraction was performed using an electrophoresis buffer for SDS-PAGE (Jpn. J. Phycol. 52 (Supplement): 95-100, 2004). After concentration of the obtained sample by ultrafiltration (Millipore, Centricon YM-10), add 20 ng of lysyl endopeptidase to 70 μg of the sample, incubate at 37 ° C for 13 h, and SDS-PAGE (% T = 15%) The fragments were separated by the method described above and transferred to a PVDF membrane (J. Biol. Chem. 280: 18462-18468, 2004.). The transcribed protein fragment was visualized by CBB, the band was cut out, and its N-terminal amino acid sequence was analyzed by Edman degradation (model 477A, Applied Biosystem, Caloglossa continua (Ceramiales, Rhodophyta). Mar. Biotechnol. 3: 493 -500,2001.). The result is shown in FIG.
この内部アミノ酸配列をデーターベース(Porphyra yezoensis EST index、かずさDNA研究所)で検索し、得られた部分的核酸配列を利用して、RACE法によりcDNAの全長配列を取得した。RACE法は、具体的には、5'-RACEおよび3'-RACEの試料として精製したmRNAを、特異的プライマーとして5'-RACE用にプライマーR1、3'-RACE用にプライマーleftを使用して(表2、図2)、それぞれSMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)およびRNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1 (タカラバイオ)を用いて行った。 This internal amino acid sequence was searched with a database (Porphyra yezoensis EST index, Kazusa DNA Laboratory), and the obtained partial nucleic acid sequence was used to obtain the full-length cDNA sequence by the RACE method. Specifically, the RACE method uses mRNA purified as 5'-RACE and 3'-RACE samples, primer R1 for 5'-RACE and primer left for 3'-RACE as specific primers. (Table 2, FIG. 2), each was performed using SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) and RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1 (Takara Bio).
これにより増幅した遺伝子断片を、pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems (プロメガ)を用いてpGEM-T Easyベクターに導入することで、クローニングを行った。シーケンシングは、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)および、DNA sequencer model 310もしくはmodel 3130 (Applied Biosystems)を用いて行った。 The gene fragment thus amplified was cloned by introducing it into a pGEM-T Easy vector using pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems (Promega). Sequencing was performed using BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and DNA sequencer model 310 or model 3130 (Applied Biosystems).
その結果、スサビノリのAMPD遺伝子は、522アミノ酸数アミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが判明した。決定されたスサビノリのAMPDをコードするcDNAの塩基配列を配列番号:1に、該cDNAがコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:2に示す。スサビノリのAMPDと公知のAMPD(ヒト、酵母、シロイヌナズナ、イネ)とを比較したところ、その類似性は低かった(表3)。 As a result, it was found that the Suprabinori AMPD gene encodes a protein consisting of 522 amino acids. The determined nucleotide sequence of cDNA encoding Susvinori AMPD is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 2. When the Suprabinori AMPD was compared with known AMPDs (human, yeast, Arabidopsis thaliana, rice), the similarity was low (Table 3).
このため、blastサーチでは、塩基配列では有意に類似する遺伝子は見つからなかった。タンパク質配列においても全体的に類似する遺伝子は見つからなかったが、配列の終盤部分においてのみ、Pseudoalteromonasのアデノシンデアミナーゼに、相似の配列がサーチされた(Expect = 3e-24、 Identities = 52/135 (38%)、 Positives = 79/135 (58%))。この部分は保存領域としてアデノシンデアミナーゼ(ADA(cd01320、 pfam、eularyota、 4e-29))の他、アデノシン/AMPデアミナーゼ(ADA_AMPD(cd00443、 pfam、 eukaryota、 2e-28))および、 AMPデアミナーゼ(AMPD(cd01319、 pfam、 eukaryota、2e-12))と類似性が示された。しかし、植物、動物、菌類で明らかになっているAMPD間での分子系統解析をMEGA4 (Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599,2007.)を用いて行ったところ、本タンパク質はそれらとは類縁性が高くないことが分かった(図3)。さらには、AMPDのモチーフ配列である [SA]-[LIVM]-[NGS]-[STA]-D-D-Pの最後のアミノ酸(P)が、本タンパク質では「E」に変化していることから、新規の型のAMPDであると考えられた。 For this reason, in the blast search, a gene significantly similar in nucleotide sequence was not found. Although no similar gene was found in the protein sequence as a whole, a similar sequence was searched for Pseudoalteromonas adenosine deaminase only in the end of the sequence (Expect = 3e-24, Identities = 52/135 (38 %), Positives = 79/135 (58%)). In addition to adenosine deaminase (ADA (cd01320, pfam, eularyota, 4e-29)), this part includes adenosine / AMP deaminase (ADA_AMPD (cd00443, pfam, eukaryota, 2e-28)) and AMP deaminase (AMPD (AMP Similar to cd01319, pfam, eukaryota, 2e-12)). However, when molecular phylogenetic analysis between AMPDs, which has been clarified in plants, animals, and fungi, was performed using MEGA4 (Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599, 2007.), this protein was related to them. It was found that the properties were not high (FIG. 3). Furthermore, since the last amino acid (P) of [SA]-[LIVM]-[NGS]-[STA] -DDP, which is the motif sequence of AMPD, is changed to "E" in this protein, It was considered to be a type of AMPD.
<実施例3> 組換え蛋白質と抗体の作製
AMPDの25番目のアミノ酸から最終アミノ酸までに相当する遺伝子を、3'-RACE用に逆転写したDNAを鋳型として5'-末端にBam HI切断領域を3'-末端にXba I切断領域を付加したプライマー(それぞれプライマーleft_Bamおよびプライマーright_Xba(表4)を用いて増幅し、pGEM-T Easyベクターを用いての増幅を経て、最終的にpCold IIベクター(タカラバイオ)に組み込んだ後、マニュアルに従い組換えタンパク質の発現を行った。
<Example 3> Production of recombinant protein and antibody
A gene corresponding to the 25th amino acid to the last amino acid of AMPD is reverse-transcribed for 3'-RACE, and a Bam HI cleavage region is added to the 5'-end and an Xba I cleavage region is added to the 3'-end. After amplification using the primer left_Bam and primer right_Xba (Table 4), amplification using the pGEM-T Easy vector, and finally integration into the pCold II vector (Takara Bio), Expression of the replacement protein was performed.
発現したタンパク質はNi-NTA Spin Kit(キアゲン)により精製した。精製した蛋白質は、ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(AE-6500型、アトー)を用い、定法に従い、SDS-PAGEを行い、泳動後のゲルを、CBBもしくは亜鉛染色により染色し、タンパク質のバンドを可視化した(Jpn. J. Phycol. 52 (Supplement): 95-100,2004.)。その結果、アミノ酸配列から推定された分子量の位置にバンドが検出された(図4)。 The expressed protein was purified by Ni-NTA Spin Kit (Qiagen). Purified protein is subjected to SDS-PAGE using a Rapidas mini slab electrophoresis tank (AE-6500, Ato) according to a conventional method, and the gel after electrophoresis is stained by CBB or zinc staining to visualize the protein band. (Jpn. J. Phycol. 52 (Supplement): 95-100, 2004.). As a result, a band was detected at the position of the molecular weight estimated from the amino acid sequence (FIG. 4).
抗体作製は、抗原となるタンパク質をSDS-PAGE後、CBB染色を行い当該バンドを切り出すことで純化し、マウスの皮下に注入することで行った。初期免疫としては抗原をアジュバントコンプリートと混和したが、その後はアジュバントインコンプリートと混和し注入を行った。注入は一週間間隔で、合計8回行った。血液は採取後、室温で1hインキュベートした後、遠心(12000g x 15 min)し、上精を血清として回収した。 Antibody production was performed by SDS-PAGE of the protein serving as an antigen, followed by CBB staining, purification by cutting out the band, and injection into the mouse subcutaneously. For the initial immunization, the antigen was mixed with the adjuvant complete, and thereafter the mixture was mixed with the adjuvant incomplete and injected. Infusions were performed a total of 8 times at weekly intervals. The blood was collected, incubated at room temperature for 1 h, centrifuged (12000 g × 15 min), and the supernatant was collected as serum.
これにより得られた抗体と組換え蛋白質との反応性をウェスタンブロッティングにより確認した。具体的には、タンパク質をSDS-PAGE後、ミニトランスブロットセル(バイオラッド)を用いてPVDF膜に転写して行った。
免疫染色は二次抗体にアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、AP発色キット(バイオラッド)で発色することで行った。その結果、得られた抗体は、組換え蛋白質に特異的に結合していた(図4)。
The reactivity between the antibody thus obtained and the recombinant protein was confirmed by Western blotting. Specifically, the protein was transferred to a PVDF membrane using SDS-PAGE followed by mini-trans blot cell (BioRad).
Immunostaining was performed by using an alkaline phosphatase-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody and coloring with an AP color development kit (BioRad). As a result, the obtained antibody was specifically bound to the recombinant protein (FIG. 4).
従来、海苔の呈味は官能試験で行われてきたが、AMPDの定量化を利用することにより、「呈味その数値化(定量化)」が可能になり、(1)呈味性の高い海苔株の選別やスクリーニングを容易に行うためのツールとして利用可能となる、(2)海苔の養殖において、得られた生産品の品質を定量化することによって、病気、色落ちによる品質低下の定量的評価などを可能とし、それらに対する対策を迅速に講ずることに利用可能であるなど、産業的価値は非常に高い。また、本酵素の遺伝子を海苔自身や他の農産品に導入し、呈味性の優れた食品を開発することにもつながる。さらには、海苔AMPDは長期の保存や焼海苔でも活性が保持されるなど極めて安定な酵素であることから、様々な食品工学への応用も可能であると考えられる。 Traditionally, the taste of seaweed has been performed by sensory tests, but by using the quantification of AMPD, it is possible to “quantify the taste (quantification)”, and (1) high taste. Can be used as a tool for easy selection and screening of nori strains. (2) In cultivating nori, quantifying the quality of the product obtained, quantifying deterioration in quality due to disease or discoloration The industrial value is very high, such as being able to make an evaluation and taking measures quickly. It also leads to the development of foods with excellent taste by introducing the gene of this enzyme into seaweed itself and other agricultural products. Furthermore, laver AMPD is an extremely stable enzyme that retains its activity even during long-term storage and baked laver. Therefore, it can be applied to various food engineering.
Claims (17)
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列の1〜1569位からなるDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
The DNA according to any one of (a) to ( c ) below, which encodes algae-derived AMP deaminase.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(B) DNA consisting of positions 1 to 1569 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
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