JP5309092B2 - Nucleic acid analysis device, nucleic acid analysis device, and method of manufacturing nucleic acid analysis device - Google Patents
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Description
本発明は、核酸分析用デバイス,核酸分析装置、及び核酸分析用デバイスの製造方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid analysis device, a nucleic acid analysis device, and a method for manufacturing a nucleic acid analysis device.
核酸分析デバイスとして、DNAやRNAの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。 As a nucleic acid analysis device, a new technique for determining the base sequence of DNA or RNA has been developed.
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のDNA断片又はRNA試料から逆転写反応を行い合成したcDNA断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。 In the currently used method using electrophoresis, a cDNA fragment sample synthesized in advance by reverse transcription reaction from a DNA fragment or RNA sample for sequencing is prepared, and a dideoxy reaction is performed by a well-known Sanger method. After that, electrophoresis is performed, and the molecular weight separation development pattern is measured and analyzed.
これに対し、近年、基板に試料となるDNA断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。 On the other hand, in recent years, a method has been proposed in which a large number of DNA fragments as samples are fixed to a substrate and the sequence information of many fragments is determined in parallel.
非特許文献1では、DNA断片を担時する媒体として微粒子を用い、微粒子上でPCRを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、PCR増幅されたDNA断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
In
また、非特許文献2では、DNA断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でPCRを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応(ライゲーション)を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。 In Non-Patent Document 2, PCR is performed on microparticles using microparticles as a medium carrying DNA fragments. Thereafter, the microparticles are dispersed and fixed on the glass substrate, an enzyme reaction (ligation) is performed on the glass substrate, a fluorescent dye is incorporated, and the sequence information of each fragment is obtained.
さらに、非特許文献3では、平滑基板上に、同一配列を有する多数のDNAプローブを固定しておく。また、DNA試料を切断後、DNAプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各DNA試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料DNA断片を固定化させている。この場合、基板上でDNA伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄,蛍光検出を行い、試料DNAの配列情報を得ている。 Furthermore, in Non-Patent Document 3, a large number of DNA probes having the same sequence are fixed on a smooth substrate. In addition, after cutting the DNA sample, a DNA probe sequence and an adapter sequence of a complementary strand are added to the end of each DNA sample fragment. By hybridizing these on the substrate, the sample DNA fragments are immobilized on the substrate randomly one molecule at a time. In this case, the DNA elongation reaction does not occur on the substrate, and after loading the substrate with the fluorescent dye, the unreacted substrate is washed and the fluorescence is detected to obtain the sequence information of the sample DNA.
以上のように、平滑基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。 As described above, a method for determining the sequence information of a large number of fragments in parallel by fixing a large number of nucleic acid fragment samples on a smooth substrate has been developed and put into practical use.
一方、平滑基板上に核酸断片試料を数多く固定する方法が提案されている。例えば、核酸やタンパク質からなるプローブを表面に固定した微粒子の液滴を固相基板上の任意の反応領域に吐出することで粒子アレイを作る方法が特許文献1に開示されている。また、官能基を表面に導入した金属コロイド粒子を基板上に最密充填的に並べたことを特徴とする光学的分析装置用測定チップが特許文献2に開示されている。これらの方法を組合わせることで、平滑基板上に核酸試料断片をある程度数多く固定することが可能である。すなわち、平滑基板全面に微粒子固定用接着層を設け、その上に、核酸やタンパク質からなるプローブを表面に固定した微粒子を含む液滴を吐出することで基板上にプローブを分散固定することが実現できる。
On the other hand, a method for fixing many nucleic acid fragment samples on a smooth substrate has been proposed. For example,
本願発明者がパラレル解析法のスループット向上について鋭意検討した結果、次のような知見を得るに至った。 As a result of intensive studies on the improvement of the throughput of the parallel analysis method, the present inventors have obtained the following knowledge.
上記のようなパラレル解析法のスループットをより一層高めるためには、できるだけ高密度、且つ規則正しく、平滑な基板上に核酸試料を整列させて固定することが望まれる。あらかじめ微粒子に核酸試料を担持させておく方法は、解析するDNA断片数が莫大であることから、試料のハンドリング上非常に有利である。核酸試料を担持させた微粒子を平滑基板上にばらまいて固定させる方法は容易ではあるが、蛍光測定で配列を読み取る段になると、CCDカメラで検出したランダムに存在する微粒子画像から数値データを取得する際、膨大なデータ処理時間がかかってしまう。 In order to further increase the throughput of the parallel analysis method as described above, it is desired to align and fix the nucleic acid sample on a smooth substrate as densely as possible and regularly. The method of supporting the nucleic acid sample on the fine particles in advance is very advantageous in terms of sample handling because the number of DNA fragments to be analyzed is enormous. Although it is easy to disperse and fix microparticles carrying a nucleic acid sample on a smooth substrate, numerical data is obtained from randomly-existing microparticle images detected by a CCD camera when the sequence is read by fluorescence measurement. In this case, a huge amount of data processing time is required.
一方、多数の穴を形成したプレートをあらかじめ用意しておき、その上に核酸試料を担持した微粒子を並べる方法では、一度のアッセイで読むことのできるDNA断片数はプレートの穴径で決まってしまい、高々104断片/スライドガラスであり、スループットの向上には限界がある。 On the other hand, in the method of preparing a plate with a large number of holes in advance and arranging fine particles carrying nucleic acid samples on the plate, the number of DNA fragments that can be read in one assay is determined by the hole diameter of the plate. , At most 10 4 fragments / slide glass, there is a limit to improving the throughput.
また、インクジェットなどの吐出技術でプローブ付きの微粒子を基板上に固定する方法では、制御できる位置分解能から固定できる微粒子間隔は数十ミクロンにならざるを得ず、固定密度は104個/mm2程度が限界である。また、一箇所に微粒子を一個ずつ固定することはできず、個々の固定サイトに固定されるプローブ数を制御することはできない。 Further, in the method of fixing fine particles with a probe on a substrate by an ejection technique such as inkjet, the fine particle interval that can be fixed from the controllable position resolution must be several tens of microns, and the fixed density is 10 4 particles / mm 2. The degree is the limit. Further, it is impossible to fix the fine particles one by one at one place, and the number of probes fixed to each fixing site cannot be controlled.
本発明の目的は、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やDNAプローブを固定した微粒子を基板上に規則正しく固定密度を104個/mm2以上に高く並べ、核酸分析のスループットを向上させることに関する。 An object of the present invention relates to improving the throughput of nucleic acid analysis by regularly arranging fine particles fixed with a nucleic acid synthesizing enzyme or a DNA probe for capturing a nucleic acid sample fragment on a substrate at a high fixing density of 10 4 / mm 2 or more. .
本発明は、核酸合成酵素やDNAプローブなどを微粒子に予め固定しておき、当該微粒子の直径よりも小さな径を持つ、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。 In the present invention, a nucleic acid synthesizing enzyme, a DNA probe or the like is fixed in advance on a fine particle, a metal pad pattern such as gold having a diameter smaller than the diameter of the fine particle is formed on a substrate, the fine particle and the pad Is linked through a chemical bond.
本発明は、核酸合成酵素やDNAプローブなどを微粒子に予め固定しておき、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。プローブを高密度に固定するため及び個々の固定サイトの固定プローブ数を制御するためには、プローブを予め固定した微粒子と、リソグラフィなどの微細加工技術で作製した微小で高密度に配置した接着用パッドの組み合わせが不可欠である。 The present invention relates to fixing a nucleic acid synthesizing enzyme, a DNA probe, or the like to a fine particle in advance, forming a metal pad pattern such as gold on a substrate, and bonding the fine particle and the pad via a chemical bond. In order to fix probes at high density and to control the number of fixed probes at each fixing site, fine particles with probes fixed in advance and for bonding with minute and high density produced by microfabrication technology such as lithography A combination of pads is essential.
本発明により、多種類の核酸断片試料を高密度にかつ規則正しく整列させて基板上に固定できるため、高スループットに核酸試料を分析できる。例えば、1ミクロン間隔で微粒子を固定すれば、106核酸断片/mm2という高密度が容易に達成できる。 According to the present invention, many kinds of nucleic acid fragment samples can be fixedly arranged on a substrate with high density and regular order, so that nucleic acid samples can be analyzed with high throughput. For example, if microparticles are fixed at 1 micron intervals, a high density of 10 6 nucleic acid fragments / mm 2 can be easily achieved.
実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しているデバイスを開示する。 In an embodiment, the device for nucleic acid analysis in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, comprising an adhesive pad at a fixed position of the fine particles on the substrate, Disclosed is a device in which fine particles and the bonding pad are bonded through a chemical bond.
また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド,核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、微粒子と接着用パッドとが化学結合を介して結合している装置を開示する。 Further, in the examples, a nucleic acid analysis device in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, a nucleotide having a fluorescent dye, and a nucleic acid sample are added to the nucleic acid analysis device. A means for supplying light, a means for irradiating the nucleic acid analysis device with light, and a fluorescent dye incorporated into the nucleic acid chain by a nucleic acid extension reaction caused by the coexistence of nucleotides, nucleic acid synthase, and a nucleic acid sample on the nucleic acid analysis device. A nucleic acid analyzer for obtaining base sequence information of a nucleic acid sample, comprising a bonding pad at a fixed position of the fine particle on a substrate, wherein the fine particle and the bonding pad are An apparatus is disclosed that is coupled via a chemical bond.
また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスの製造方法において、予め前記プローブ分子を固定しておいた前記微粒子を、接着用パッドを備えた基板上に供給することで、前記基板上の所定の位置に前記微粒子を固定することで製造することを特徴とする、核酸分析用デバイスの製造方法を開示する。 In addition, in the example, in the method for manufacturing a nucleic acid analysis device in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, the fine particles on which the probe molecules are fixed in advance, Disclosed is a method for producing a nucleic acid analysis device, which is produced by fixing the fine particles at a predetermined position on the substrate by supplying the substrate on a substrate having an adhesive pad.
また、実施例では、微粒子1個に対して、プローブ分子が一分子固定されていることを開示する。 Further, in the examples, it is disclosed that a single probe molecule is fixed to one fine particle.
また、実施例では、プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを開示する。 Moreover, in an Example, it discloses that a probe molecule is a nucleic acid or a nucleic acid synthase.
また、実施例では、微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを開示する。 In addition, the Examples disclose that the fine particles are made of a material selected from a semiconductor or a metal.
また、実施例では、接着用パッドが、金,チタン,ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを開示する。 In addition, the embodiment discloses that the bonding pad is made of a material selected from gold, titanium, nickel, or aluminum.
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。 The above and other novel features and effects of the present invention will be described below with reference to the drawings. Here, in order to have a complete understanding of the present invention, specific embodiments will be described in detail, but the present invention is not limited to the contents described herein.
本実施例のデバイスの構成を、図1を用いて説明する。平滑基板101の上に接着パッド102が規則正しく、例えば図1に示すように格子状に形成されている。接着パッド102と微粒子103は、線状分子105を介して化学結合により結ばれている。線状分子105の末端の官能基106と、接着パッド102とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基106は、平滑基板101との相互作用が弱く、接着パッド102との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑基板としては、石英ガラス,サファイア,シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド102には、金,チタン,ニッケル,アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基106には、平滑基板101と接着パッド102との組合せを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基,アミノ基,カルボキシル基,リン酸基,アルデヒド基等を用いることができる。線状分子105は、微粒子103と接着パッド102を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして3から20程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子105の末端の官能基107は、微粒子103との接着性をもたらす。また、線状分子105として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基106を有する側鎖と官能基107を持つ側鎖を併せ持つものを用いることができる。
The configuration of the device of this example will be described with reference to FIG. The
微粒子103としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径5nm〜100nmのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が10nm〜20nm程度のCdSe等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。官能基107として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基,アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基107としてビオチンを用いることができる。核酸を捕捉するプローブ分子104には、DNAやRNAの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基107と同様に予め修飾しておき、微粒子103と反応させておく。また、核酸を捕捉するプローブ分子104として核酸合成酵素を用いることもできる。発現タンパク質にアビジンタグを導入する試薬が市販されており、このような試薬を用いてDNAポリメラーゼを合成することにより、例えば、市販のストレプトアビジンで表面が修飾された半導体微粒子表面に容易に核酸合成酵素を固定できる。核酸を捕捉するプローブ分子104として核酸分子の一本鎖を用いた場合には、特定の相補配列を有する核酸試料分子を捕捉することができる。捕捉後に、核酸合成酵素やヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすこともできる。
As the
また、プローブ分子104として核酸合成酵素を用いた場合には、非特定の核酸試料分子を捕捉できる。この場合も、ヌクレオチドを供給することにより基板上で核酸伸長反応を起こすことができる。
In addition, when a nucleic acid synthase is used as the
一つの微粒子103に固定するプローブ分子104は、一分子であることが好ましい。一つの微粒子103に一分子のプローブ分子104を固定するためには、微粒子103の粒径が小さいほど好ましい。一つの核酸捕捉プローブ分子が微粒子表面に固定されると、微粒子上の電荷の状態が変化して、他の未固定の核酸捕捉プローブ分子の固定反応を阻害する効果が生じる。微粒子サイズが小さくなると、この効果が大きくなるからである。発明者らが鋭意検討した結果、微粒子サイズとして約20nm以下が好ましいことが判明している。また、微粒子103とプローブ分子104との結合反応を液相で行い、かつ、微粒子103に対してプローブ分子104の濃度を約1/10以下に下げて反応させることで、微粒子103の直径が1μm程度であっても、一つの微粒子103に固定するプローブ分子104を一分子とすることができる。一方、微粒子103のサイズが大きくなるに従い、プローブ分子104の固定密度が低下してしまう。簡便な蛍光検出でプローブを識別する場合回折限界を考慮するとプローブ間が1μm程度離れていることが好ましい。したがって、微粒子103のサイズは1μm以下であることが適している。
The
接着パッド102を平滑基板101上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると500nm以上が好ましい。
As a method for forming the
接着パッド102を平滑基板101上に形成した後、微粒子103と接着パッド102を結ぶ線状分子105を供給し、接着パッド102上に線状分子105を固定する。この際、平滑基板101上での非特異的吸着を防止する目的で、線状分子105を供給する前に、平滑基板101との接着力の強い材料を平滑基板101上に反応させる方法が有効である。例えば、シランカップリング剤等が利用できる。
After the
次に、予めプローブ分子104を表面に固定させた微粒子103を基板上に供給して、微粒子103を接着パッド102上に固定させることにより、核酸分析用デバイスを作製する。
Next, the
接着パッド102上に微粒子103を固定させる際、一つの接着パッド102に複数個の微粒子103が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着パッド102には、1個の微粒子103を固定させねばならない。そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着パッド102の直径dが微粒子103の直径Dに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッド102に1個の微粒子103を固定できることを見出した。接着パッド102に比べて同等以上の大きさの微粒子103が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子に覆い隠されてしまい、別の微粒子と反応できなくなってしまうものと説明される。
When the
1個の微粒子103にプローブ分子104を一分子固定するには、微粒子103の直径Dが20nm以下であることが好ましいことから、接着パッド102の直径dは20nm以下であることが好ましい。さらに、鋭意検討を続けた結果、微粒子103がその表面に電荷を有する場合には、微粒子間に静電的な反発力が働くため、接着パッド102の直径dが微粒子103の直径Dに比べて大きい場合にも接着パッドあたりの固定微粒子数が1個になることが判明した。したがって、微粒子103の表面電荷が小さく静電反発力が弱い場合には、接着パッド102の直径dが微粒子103の直径Dに比べて小さいことが好ましく、微粒子103の表面電荷が大きく静電反発力が強い場合には、接着パッド102の直径dは必ずしも微粒子103の直径Dよりも小さくなくても良いことが明らかとなった。
In order to immobilize one molecule of the
本実施例の核酸分析デバイスから核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度や簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、核酸分析デバイスに対して核酸試料を供給し、プローブ分子104に核酸試料を捕捉させる。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、プローブ分子104がDNAプローブである場合には、核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、ヌクレオチドの一種類を供給,未反応ヌクレオチドの洗浄,蛍光観察,違う種類のヌクレオチドの供給、以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後に蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いることにより、連続的な反応を起こし、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。一方、4種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
Several methods are conceivable for detecting information on a nucleic acid sample from the nucleic acid analysis device of this example, but a method using a fluorescence detection method is preferred from the viewpoint of sensitivity and simplicity. First, a nucleic acid sample is supplied to the nucleic acid analysis device, and the
微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金,銀,白金,アルミニウム等の直径が100nm程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光を増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、Nanotechnology,2007,vol.18,pp 044017−044021.(非特許文献4)に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定することができ、信号/ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子104として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。
By using fine particles having a diameter of about 100 nm or less, such as gold, silver, platinum, and aluminum, that can excite localized plasmons in the visible region, fluorescence can be enhanced and observed. The phenomenon of fluorescence enhancement by surface plasmon of gold fine particles is reported, for example, in Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-040221. The fluorescence of the fluorescent dye attached to the nucleotide can be enhanced and measured, and the signal / noise can be increased. In particular, when a nucleic acid synthase is used as the
微粒子として、半導体微粒子を用いた場合には、半導体微粒子を外部光源の光で励起しておき、取り込まれたヌクレオチドに付随する蛍光色素にその励起エネルギーを移動させることにより、個々の蛍光色素の蛍光を観察することもできる。この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。 When semiconductor fine particles are used as the fine particles, the semiconductor fine particles are excited with light from an external light source, and the excitation energy is transferred to the fluorescent dyes associated with the incorporated nucleotides. Can also be observed. In this case, the excitation light source may excite only the semiconductor fine particles, which is preferable in that one kind of light source may be used.
微粒子として、高分子材料からなる微粒子を用いた場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十nmから数μmまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定するプローブ分子104の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、プローブ分子104を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。
When fine particles made of a polymer material are used as the fine particles, the particle sizes of the fine particles can be made uniform, and the size of the particle size can be selected widely from several tens of nm to several μm. Further, it is preferable in that the functional group possessed by the polymer material is subjected to surface modification on the scaffold, so that the introduction amount of the functional group for the fixing reaction of the
核酸分析デバイスの製造方法の一例を、図2を用いて説明する。平滑な支持基体201上に電子線用ポジ型レジスト202をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板,サファイア基板,シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやZEP−520A(日本ゼオン社製)を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径15nmのスルーホールを形成する。スルーホールは並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、1μm程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ,歩留まりの高さ、及び並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。
An example of a method for producing a nucleic acid analysis device will be described with reference to FIG. An electron beam positive resist 202 is applied on a
例えば、1μmピッチで反応サイト(微粒子)を構成した場合、スルーホール形成領域を1mm×1mmとすると、100万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着用パッド203を構成する材料、例えば、金,チタン,ニッケル,アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板,サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金,アルミ,ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着用パッド203に線状分子204を反応させる。接着用パッド203が金,チタン,アルミ,ニッケルの場合には、線状分子末端の官能基205としては、各々、スルホヒドニル基,リン酸基,リン酸基,チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の反対側の官能基206には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を接着用パッドと反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着用パッドを形成した以外の平滑基板表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチドに対する吸着防止を実現するには負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子207でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液(pH5〜pH6程度)で処理することにより、エポキシ基を開環させOH基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。
For example, when reaction sites (fine particles) are formed with a pitch of 1 μm, 1 million reaction sites can be formed if the through-hole formation region is 1 mm × 1 mm. After forming the through hole, a material constituting the bonding pad 203, for example, gold, titanium, nickel, aluminum, is formed by sputtering. When a glass substrate or sapphire substrate is used as the smooth support base and gold, aluminum, or nickel is used as the bonding pad material, titanium or chrome is used to reinforce the bonding between the substrate material and the bonding pad material. It is preferable to put a thin film. Next, the
微粒子208表面には、予めアビジン209を修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン−スクシンイミド(Pierce社製NHS−Biotin)を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン−スクシンイミド(Pierce社製NHS−Biotin)を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させる。これにより、金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。微粒子として、半導体微粒子を用いる場合には、市販の微粒子を用いることができる。例えば、直径が15〜20nmである製品名「Qdot(R)ストレプトアビジン標識」(インビトロジェン社製)を利用することができる。核酸捕捉プローブ210としてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、容易に微粒子上に固定できる。核酸捕捉プローブ210として核酸合成酵素を用いる場合には、予め、RTS AviTag E. coliビオチン化キット(ロッシュアプライドサイエンス社製)を用いて発現系を組み、核酸合成酵素を作ることにより、容易に、核酸合成酵素を微粒子上に固定できる。
核酸捕捉プローブを固定した微粒子を接着用パッドと反応させることにより、本実施例の核酸分析デバイスを製造することができる。 The nucleic acid analysis device of this example can be manufactured by reacting the fine particles on which the nucleic acid capture probe is immobilized with the bonding pad.
本実施例では、プローブ分子を一分子だけ固定した核酸分析デバイスの製造方法の一例を、特に、微粒子一個につき一分子のプローブ分子を固定する方法を図3を用いて説明する。本実施例ではプローブ分子として核酸を用いた場合について記載するが、核酸合成酵素などの他のプローブ分子の場合にも同様に行うことができる。微粒子301の表面に核酸試料分子304を捕捉するための結合サイト302を結合させておく。例えば、結合サイトとしてストレプトアビジンを用いることができ、市販のストレプトアビジンコート微粒子(インビトロジェン社製)を微粒子として用いることができる。核酸試料分子304には予め、結合サイト303を修飾しておく。結合サイト303には微粒子301表面の結合サイト302と容易に結合するものを選択する。例えば、結合サイト302として前記のストレプトアビジンを用いた場合には結合サイト303としてビオチンを用いる。結合サイト303を末端修飾したプライマーを用い、核酸試料をテンプレートとしたPCR反応産物を合成することで核酸試料分子304の末端に結合サイト303を結合することは容易にできる。次に、微粒子301と核酸試料分子304を反応させることで、核酸試料分子304を微粒子301に捕捉する。微粒子301一個につき一分子の核酸試料分子304を固定するには、単位体積中の核酸試料分子304の分子数を微粒子301の個数よりも小さくすることが好ましい。微粒子301よりも核酸試料分子304が過剰にあると微粒子301一個当たりの捕捉核酸試料分子数が一分子よりも多くなる可能性が高いからである。発明者らが検討した結果では、微粒子301の数を核酸試料分子304の数よりも10倍多くして反応させると、凡そ90%の微粒子301には核酸試料分子304は捕捉されず、約9%の微粒子301には核酸試料分子304が一分子捕捉されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果と良く一致している。したがって、核酸試料分子304を捕捉した微粒子301のみを捕集すれば、捕集した微粒子301のうち90%以上は核酸試料分子304を一分子のみ捕捉した微粒子301となる。捕集方法として、例えば、磁気微粒子307に核酸試料分子304を結合させて磁石で捕集することができる。核酸試料分子304の末端配列と相補な配列を持ち末端に結合サイト306が修飾されたオリゴヌクレオチド305を用意し、結合サイト306と結合する結合サイト308を予め、磁気微粒子307の表面にコートしておく。核酸試料分子304をPCRで増幅する際に用いたプライマー配列を利用してオリゴヌクレオチド305の配列を決めることができる。こうして作製した磁気微粒子307を用いることで核酸試料分子304を一分子を捕捉した微粒子301を90%以上と高い割合で分離、収集することができる。磁気微粒子307から核酸捕捉微粒子301を単離するには、例えば、核酸試料分子304とオリゴヌクレオチド305の二本鎖を分離するディネイチャー処理(高温処理)を用いることができる。単離した核酸捕捉微粒子301は実施例1に記載した方法を用いることで、平滑基板上の所定の配置に固定することができ、本実施例の核酸試料分子304を一分子だけ固定した核酸分析デバイスを製造することができる。
In the present embodiment, an example of a method for producing a nucleic acid analysis device in which only one molecule of a probe molecule is immobilized, particularly a method of immobilizing one molecule of a probe molecule per fine particle will be described with reference to FIG. In this example, the case where a nucleic acid is used as a probe molecule is described, but the same can be applied to other probe molecules such as a nucleic acid synthase. A
さらに、核酸試料分子を一分子だけ捕捉した微粒子の割合を高めるには、電気泳動法を用いることが有効である。すなわち、微粒子に捕捉された核酸の分子数により、微粒子上の電荷量が異なることを利用し、核酸を捕捉したままの状態で微粒子をゲル、例えばアガロース中を泳動させることで、電荷量すなわち捕捉された核酸分子数の違いにより泳動パターンを分離させる。核酸が捕捉されない微粒子は移動距離がもっとも短く、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子が次に移動距離の短いところにバンドを形成する。したがって、このバンドを切り出すことで、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子を純度高く、得ることができる。 Furthermore, it is effective to use an electrophoresis method in order to increase the proportion of fine particles that have captured only one molecule of nucleic acid sample molecules. That is, by utilizing the fact that the amount of charge on the microparticle varies depending on the number of molecules of nucleic acid captured by the microparticle, the microparticle is migrated in a gel, such as agarose, while the nucleic acid is still captured, so Electrophoretic patterns are separated based on the number of nucleic acid molecules. The fine particles in which the nucleic acid is not captured have the shortest movement distance, and the fine particles in which only one nucleic acid molecule is captured form a band at the next short movement distance. Therefore, by cutting out this band, fine particles in which only one nucleic acid molecule is captured can be obtained with high purity.
本実施例では、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図4を参照しながら説明する。 In the present embodiment, an example of a preferable configuration of a nucleic acid analyzer using a nucleic acid analysis device will be described with reference to FIG.
本実施例の核酸分析装置は、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド,核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド,核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート401と検出窓402と溶液交換用口である注入口403と排出口404から構成される反応チャンバに前記のデバイス405を設置する。なお、カバープレート401と検出窓402の材質として、PDMS(Polydimethylsiloxane)を使用する。また、検出窓402の厚さは0.17mmとする。YAGレーザ光源(波長532nm,出力20mW)407およびYAGレーザ光源(波長355nm,出力20mW)408から発振するレーザ光409および410を、レーザ光409のみをλ/4板411によって円偏光し、ダイクロイックミラー412(410nm以下を反射)によって、前記2つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ413によって集光し、その後、プリズム414を介してデバイス405へ臨界角以上で照射する。
The nucleic acid analyzer of the present embodiment includes means for supplying a nucleotide having a fluorescent dye, a nucleic acid synthase, and a nucleic acid sample to the nucleic acid analysis device, means for irradiating the nucleic acid analysis device with light, and on the nucleic acid analysis device. And a luminescence detection means for measuring the fluorescence of the fluorescent dye incorporated into the nucleic acid chain by the nucleic acid extension reaction caused by the coexistence of the nucleotide, the nucleic acid synthase, and the nucleic acid sample. More specifically, the
以下、微粒子として直径50nm程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。この場合、レーザ照射により、デバイス405表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したDNAプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓402を介して出射される。また、検出窓402より出射される蛍光は、対物レンズ415(×60,NA1.35,作動距離0.15mm)により平行光束とされ、光学フィルタ416により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ417により2次元CCDカメラ418上に結像される。
Hereinafter, the case where gold fine particles having a diameter of about 50 nm are used as fine particles will be described as an example. In this case, localized surface plasmons are generated in the gold fine particles existing on the surface of the
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640(非特許文献5)に開示されているような、リボースの3′OHの位置に3′−O−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの5位の位置にあるいはプリンの7位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射(例えば波長355nm)あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの3′OHの位置に3′−O−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射(例えば波長355nm)で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。 In the case of the sequential reaction method, the nucleotide with a fluorescent dye is 3′-positioned at the 3′OH position of ribose as disclosed in PNAS 2006, vol. 103, pp 19635-19640 (Non-patent Document 5). An O-allyl group can be used as a protecting group, and the O-allyl group linked to a fluorescent dye via the allyl group at the 5-position of pyrimidine or at the 7-position of purine can be used. Since the allyl group is cleaved by light irradiation (for example, a wavelength of 355 nm) or contact with palladium, the quenching of the dye and the control of the extension reaction can be simultaneously achieved. Even in the sequential reaction, it is not necessary to remove unreacted nucleotides by washing. Furthermore, since no washing step is required, the extension reaction can be measured in real time. In this case, it is not necessary to add a 3′-O-allyl group as a protecting group at the 3′OH position of ribose in the nucleotide, and the dye is formed via a functional group that can be cleaved by light irradiation (for example, wavelength 355 nm). Nucleotides linked to can be used.
微粒子として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてQdot(R)565 conjugate(インビトロジェン社製)を用いると、YAGレーザ光源(波長532nm,出力20mW)407で十分に励起できる。この励起エネルギーは532nmの光では励起されないアレクサ633(インビトロジェン社製)へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、DNAプローブに捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するので、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。 Even when semiconductor fine particles are used as the fine particles, the above-described example of the nucleic acid analyzer can be applied. For example, when Qdot (R) 565 conjugate (manufactured by Invitrogen) is used as the semiconductor fine particles, it can be sufficiently excited with a YAG laser light source (wavelength 532 nm, output 20 mW) 407. This excitation energy emits fluorescence by moving to Alexa 633 (manufactured by Invitrogen), which is not excited by light of 532 nm. In other words, dyes associated with unreacted nucleotides are not excited, and are only captured by DNA probes and close to the semiconductor fine particles to emit light, so that the captured nucleotides can be identified by fluorescence measurement. Is possible.
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることにより、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化,デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。 As described above, by assembling a nucleic acid analysis device using the nucleic acid analysis device of this example, the analysis time can be shortened and the device and the analysis device can be simplified without the need for a washing step. In addition, it becomes possible to measure the elongation reaction of bases in real time, and the throughput can be greatly improved as compared with the prior art.
101 平滑基板
102 接着パッド
103,208,301 微粒子
104 プローブ分子
105,204 線状分子
106,107,205,206 線状分子末端の官能基
201 平滑な支持基体
202 電子線用ポジ型レジスト
203 接着用パッド
207 非特異吸着防止用分子
209 アビジン
210 核酸捕捉プローブ
302,303,306,308 結合サイト
304 核酸試料分子
305 オリゴヌクレオチド
307 磁気微粒子
401 カバープレート
402 検出窓
403 注入口
404 排出口
405 デバイス
406 流路
407,408 YAGレーザ光源
409,410 レーザ光
411 λ/4板
412 ダイクロイックミラー
413 レンズ
414 プリズム
415 対物レンズ
416 光学フィルタ
417 結像レンズ
418 2次元CCDカメラ
DESCRIPTION OF
Claims (12)
前記微粒子は表面に電荷を帯びており、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径と同等あるいは前記微粒子の直径以上の大きさであるデバイス。 A nucleic acid analysis device in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate,
The fine particles have a charge on the surface, and are provided with an adhesive pad at a fixed position of the fine particles on the substrate, and the fine particles and the adhesive pad are bonded via a chemical bond. A device having a diameter equal to or larger than the diameter of the fine particles.
前記微粒子1個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とするデバイス。 In the device for nucleic acid analysis according to claim 1 Symbol placement,
A device in which one molecule of the probe molecule is fixed to one fine particle.
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とするデバイス。 In the device for nucleic acid analysis according to claim 1 Symbol placement,
A device wherein the probe molecule is a nucleic acid or a nucleic acid synthase.
前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とするデバイス。 In the device for nucleic acid analysis according to claim 1 Symbol placement,
The device, wherein the fine particles are made of a material selected from a semiconductor and a metal.
前記微粒子が、高分子材料からなることを特徴とするデバイス。 In the device for nucleic acid analysis according to claim 1 Symbol placement,
The device, wherein the fine particles are made of a polymer material.
前記接着用パッドが、金,チタン,ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とするデバイス。 In the device for nucleic acid analysis according to claim 1 Symbol placement,
The device, wherein the bonding pad is made of a material selected from gold, titanium, nickel, or aluminum.
前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド,前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
前記微粒子は表面に電荷を帯びており、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径以上の大きさである核酸分析装置。 A nucleic acid analyzing device in which fine particles having nucleic acid molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate;
Means for supplying a nucleotide having a fluorescent dye and a nucleic acid sample to the nucleic acid analysis device;
Means for irradiating the nucleic acid analysis device with light;
Luminescence detection means for measuring fluorescence of a fluorescent dye incorporated into a nucleic acid chain by a nucleic acid extension reaction caused by the nucleotide, the nucleic acid synthase, and the nucleic acid sample coexisting on the nucleic acid analysis device,
A nucleic acid analyzer for obtaining base sequence information of the nucleic acid sample,
The fine particles have a charge on the surface, and are provided with an adhesive pad at a fixed position of the fine particles on the substrate, and the fine particles and the adhesive pad are bonded via a chemical bond. A nucleic acid analyzer having a diameter equal to or larger than the diameter of the microparticle.
前記微粒子1個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 7 , wherein
A nucleic acid analyzer, wherein one molecule of the probe molecule is fixed to one particle.
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 7 , wherein
A nucleic acid analyzer, wherein the probe molecule is a nucleic acid or a nucleic acid synthase.
前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 7 , wherein
The nucleic acid analyzer, wherein the fine particles are made of a material selected from a semiconductor or a metal.
前記微粒子が、高分子材料からなることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 7 , wherein
The nucleic acid analyzer characterized in that the fine particles are made of a polymer material.
前記接着用パッドが、金,チタン,ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 7 , wherein
The nucleic acid analyzer according to claim 1, wherein the bonding pad is made of a material selected from gold, titanium, nickel, or aluminum.
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