JP5308333B2 - L−アスパラギナーゼiiを産生する組換え宿主 - Google Patents
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Description
本発明により調製されたL−アスパラギナーゼII酵素に関する好ましい実用性は、ポリマー複合化酵素の形態である。本発明のL−アスパラギナーゼ−ポリマー複合体は、一般に式(I):
(I)(R)z−NH−(ASN)
に相当し、
式中、
(ASN)は、L−アスパラギナーゼまたはその誘導体もしくは断片を表し;
NH−は、ポリマーへの結合のためにASN、その誘導体または断片に見られるアミノ酸のアミノ基であり;
zは、正の整数、好ましくは約1から約80であり;および
Rは、遊離性または非遊離性の形態でASNに結合される、実質的に非抗原性のポリマー残基である。
R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、同じであっても異なっていてもよく、非抗原性ポリマー残基から独立して選択され;
R3〜9、R12〜21、およびR24(下記を参照)は、同じかまたは異なり、各々独立して水素、C1〜6アルキル類、C3〜12分枝状アルキル類、C3〜8シクロアルキル類、C1〜6置換アルキル類、C3〜8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、C1〜6ヘテロアルキル類、置換C1〜6ヘテロアルキル類、C1〜6アルコキシ、フェノキシおよびC1〜6ヘテロアルコキシ類の中から選択され;
Arは、多置換芳香族炭化水素基または多置換複素環基を形成する芳香族部分であり;
Y1〜11およびY13は、同じであっても異なってもよく、O、SおよびNR24から独立して選択され;
Aは、水素、アルキル基、標的部分、脱離基、官能基、診断剤、および生物活性部分から選択され;
Xは、O、NQ、S、SOまたはSO2であり;式中Qは、H、C1〜8アルキル、C1〜8分枝状アルキル、C1〜8置換アルキル、アリールまたはアラルキルであり;
Zは、標的細胞内に能動的に輸送された部分、疎水性部分、二官能性結合部分およびそれらの組合せから選択され;
L1〜6およびL8は、同じであっても異なってもよく、二官能性結合基から独立して選択され;
a、c、d、f、g、i、j、j’、k、l、n、o、p、qおよびtは、同じであっても異なっていてもよく、独立して0または大部分の態様において正の整数であることが好ましく;
b、e、r、r’、s、h、h’およびmは、同じであっても異なってもよく、独立して0または1であり;
mPEGは、H3CO(−CH2CH2O)u−および
uは、好ましくは約10から約2,300、より好ましくは、約200から約1000の正の整数である。
式中全ての変数は、上記に説明されたものと同じである。
式中Bは、L−アスパラギナーゼIIであり、他の変数の全ては、先に定義されたとおりである。
上記のとおり、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、好ましくは、各々水溶性ポリマー残基であり、それらは、好ましくは、ポリアルキレンオキシド(PAO)類、より好ましくは、mPEGなどのポリエチレングリコール類などの実質的に非抗原性のものである。説明目的のために限定せずに、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23のポリエチレングリコール(PEG)残基部分は:
J−O−(CH2CH2O)u−、
J−O−(CH2CH2O)u−CH2C(O)−O−、
J−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2NR25−、および
J−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2SH−、
の中から選択することができ、
式中:
uは、重合度、すなわち、約10から約2,300であり;
R25は、水素、C1〜6アルキル類、C2〜6アルケニル類、C2〜6アルキニル類、C3〜12分枝状アルキル類、C3〜8シクロアルキル類、C1〜6置換アルキル類、C2〜6置換アルケニル類、C2〜6置換アルキニル類、C3〜8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、C1〜6ヘテロアルキル類、置換C1〜6ヘテロアルキル類、C1〜6アルコキシ、フェノキシおよびC1〜6ヘテロアルコキシの中から選択され、
Jは、キャッピング基、すなわち、ポリマーの末端に見られる基であり、幾つかの態様において、NH2、OH、SH、CO2H、C1〜6アルキル類、好ましくはメチルのいずれか、またはこのような基が当業者により理解される他のPEG末端活性基から選択することができる。
CH3−O−(CH2CH2O)u−、CH3−O−(CH2CH2O)u−CH2C(O)−O−、およびCH3−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2NH−、およびCH3−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2SH−の中から選択され、
式中uは、正の整数であり、重量平均分子量が、約200Daから約80,000Daになるように選択されるのが好ましい。より好ましくは、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、独立して約2,000Daから約42,000Daの平均分子量を有し、最も好ましくは、約5,000Daから約40,000Daの平均分子量を有する。他の分子量はまた、当業者のニーズに適応させるように考慮されている。
−O−(CH2CH2O)u−
により表され、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、この式の残基を含んでなることが好ましい。ポリマーに関する重合度は、ポリマー鎖における反復単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。
式中:
u’は、好ましくは、総分子量が約5,000から約40,000のポリマー類を提供するために、約4から約455の整数であり;3までの残基の末端部分は、メチルまたは他の低級アルキルによりキャッピングされる。
本発明の多くの態様において、L1〜6およびL8は、ポリマー鎖、例えば、R1〜2、R10〜11、および/またはR22〜23の結合を促進させる結合基である。提供された結合は、直接的か、または当業者に公知のさらなる結合基を介し得る。本発明のこの態様において、L1〜6およびL8は、同じであっても異なってもよく、二官能性およびヘテロ二官能性脂肪族ならびに芳香族−脂肪族基、アミノ酸類など、当業者に周知の多種多様の基から選択することができる。したがって、L1〜6およびL8は、同じであっても異なってもよく:
−[C(=O)]v’(CR32R33)t’−、
−[C(=O)]v’O(CR32R33)t’O−、
−[C(=O)]v’O(CRR32R33)t’NR36−、
−[C(=O)]v’O(CR32R33O)t’NR36−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33)t’−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33)t’O−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33O)t’−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33O)t’(CR34R35)y’−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33O)t’(CR34R35)y’O−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33)t’(CR34R35O)y’−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33)t’(CR34R35O)y’NR36−、
−[C(=O)]v’NR31(CR32R33)t’NR36−、
R31〜R37は、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、C1〜6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換C1〜6アルキルチオ、C1〜6アルキル類、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜19分枝状アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、アリールオキシ、C1〜6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、C2〜6アルカノイル、アリールカルボニル、C2〜6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、C2〜6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、C2〜6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、C2〜6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、C2〜6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシからなる群から独立して選択され、
置換基は、アシル、アミノ、アミド、アミジン、アラアルキル、アリール、アジド、アルキルメルカプト、アリールメルカプト、カルボニル、カルボキシレート、シアノ、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、イミノ、ニトロ、チオカルボニル、チオエステル、チオアセテート、チオホルメート、アルコキシ、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、シリル、スルフヒドリル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、およびスルホニルからなる群より選択され;
(t’)および(y’)は、ゼロまたは正の整数から独立して選択され、好ましくは、1から6であり;および
(v’)は、0または1である。
−C(O)CH2OCH2C(O)−;
−C(O)CH2NHCH2C(O)−;
−C(O)CH2SCH2C(O)−;
−C(O)CH2CH2CH2C(O)−;および
−C(O)CH2CH2C(O)−;
の中から選択されることが好ましい。
1.脱離基または活性化基
Aが活性化基である態様において、好適な部分としては、限定はしないが、N−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、N−ヒドロキシフタルイミジル、p−ニトロフェノキシル、イミダゾリル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、チアゾリジニルチオン、O−アシル尿素、ペンタフルオロフェノキシル、2,4,6−トリクロロフェノキシルなどの基または当業者に明白である他の好適な脱離基が挙げられる。
Aはまた、官能基であり得る。このような官能基の非限定例としては、アミン含有スペーサーを介してビシン部分に結合できるマレイミジル、ビニル、スルホン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、メルカプト、ヒドラジド、カルバゾールなどの残基が挙げられる。ビシン部分に結合したら、ポリペプチドのシステイン残基、アミノ酸またはペプチドスペーサーなどの標的に、ビシン−ポリマーを結合させるために官能基(例えば、マレイミド)を使用することができる。
Aがアルキル基である式(I)の態様において、好適な基の非限定リストは、C1〜6アルキル類、C2〜6アルケニル類、C2〜6アルキニル類、C3〜19分枝状アルキル類、C3〜8シクロアルキル類、C1〜6置換アルキル類、C2〜6置換アルケニル類、C2〜6置換アルキニル類、C3〜8置換シクロアルキル類、アラルキル類、C1〜6ヘテロアルキル類、および置換C1〜6ヘテロアルキル類からなる。
本発明の一態様において、Zは、L7がL1〜6を定義する基の中から選択される二官能性リンカーであり、Y12が、Y1を定義するものと同じ基の中から選択されるL7−C(=Y12)である。本発明のこの態様において、Z基は、L−アスパラギナーゼとポリマー送達系の残部との間の結合として役立つ。本発明の他の態様において、Zは、標的細胞、疎水性部分、およびそれらの組合せに能動輸送される部分である。存在する場合のZ’は、標的細胞、疎水性部分、およびそれらの組合せに能動輸送される部分である二官能性リンカーとして役立ち得る。
例示目的のために、好適な複合化反応は、L−アスパラギナーゼと、上記の好適に活性化されたポリマー系とを反応させることを含む。この反応は、pHが約6.5〜8.5の範囲内でPBS緩衝系の使用などを含む、タンパク質修飾の当業者に周知の条件を用いて実施されることが好ましい。大部分の場合、過剰の活性化ポリマーをL−アスパラギナーゼと反応させることが考慮されている。
式中BはL−アスパラギナーゼである。
式中BはL−アスパラギナーゼである。
式中BはL−アスパラギナーゼである。
mPEGの分子量は、約10,000から約40,000である。
mPEGの分子量は、上記と同じである。
本明細書に記載されたDNA、ベクターおよび宿主細胞により産生されたL−アスパラギナーゼは、「Elspar」(メルク社)および「Oncaspar」(エンゾン・ファーマシューティカルズ社(Enzon Pharmaceuticals,Inc.))に関して当該技術分野に公知の方法および適応症の全てに有用である。したがって、本発明のL−アスパラギナーゼII酵素は、ポリアルキレンオキシドが複合化されていても、またはタンパク質が複合化されていなくても、このような治療に反応する疾患または障害または他の病態などを治療するために有効な量で、それを必要とする患者に投与される。当業者は、「Elspar」および「Oncaspar」の公知の性質から外挿された好適な量、投与経路および投与計画を認識するであろう。
L−アスパラギンアミドヒドロラーゼ、タイプEC−2、EC3.5.1.1:大腸菌−L−アスパラギナーゼIIタンパク質の配列決定
メルク社および協和発酵工業株式会社からそれぞれ市販されているL−アスパラギナーゼII酵素のアミノ酸配列を得るために、これらのタンパク質をタンパク質配列分析に供し、公表された大腸菌K−12 ansBの遺伝子配列(GenBank登録番号M34277)と比較した。
組換えL−アスパラギナーゼIIを発現する大腸菌株EN538の構築
大腸菌K−12 ansBのL−アスパラギナーゼIIをコードする遺伝子を、以下のとおり、実施例1の表1により示された残基置換によりL−アスパラギナーゼIIを発現するよう構成した。大腸菌K−12 ansBの326の成熟アミノ酸配列L−アスパラギナーゼIIは、ジェニングス MP(Jennings MP)およびビーチャム IR(Beecham IR)により報告された(1990年、J Bacteriol 172:1491−1498頁;GeneBank番号M34277)978塩基対セグメントにコードされる。次に成熟タンパク質より前の22のアミノ酸シグナルペプチドを含むansB遺伝子が、従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって別の大腸菌K−12株(GX1210;ジェネックス社(Genex Corporation)から入手)からクローン化された。具体的には、オリゴヌクレオチド
5’−TACTGAATTCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCA−3’(配列番号4)および
5’−ACAGTAAGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCTG−3’(配列番号5)が、パーキンエルマー(Perkin Elmer)Gene Amp9600サーモサイクラー、Taqポリメラーゼ、および標準試薬を用いて、30秒94℃、30秒40℃、1分72℃を25サイクルのサイクリングパラメータで、プライマーとして使用された。
Val27Alaの変換に関して5’−CAACTTTACCCGCTGTGTAGTTAG−3’(配列番号6);
Asn64Aspの変換に関して5’−CAGCCAGACATCATCGTTCATGTC−3’(配列番号7);
Ser252Thrの変換に関して5’−GTCGAACACAGTTTTATACAGGTTGC−3’(配列番号8);
Thr263Asnの変換に関して5’−CTGCAGTACCGTTTTTCGCGGCGG−3’(配列番号9)
であった。4つの変換の全ては、単一バッチ中で行われ、DNA配列決定は、修飾ansB遺伝子配列[本明細書においてansB*遺伝子(配列番号2)と称される]を確認した。
組換えL−アスパラギナーゼIIの発現およびその酵素の部分的特性化
株EN538を、カナマイシン(15μg/ml)と共にLB培地中37℃で培養した。約0.8のOD600の時点でIPTG(1mM)を培養物に加え、遺伝子発現の誘導を、2時間、3時間または4時間のいずれかで進行させた。培養物のSDS−PAGE分析により、高レベル発現の34.6kDaのansB*ポリペプチドを確認した。抗大腸菌アスパラギナーゼIIウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法により、SDS−PAGE上で主に誘導されたタンパク質バンドがL−アスパラギナーゼIIであることを確認した。
pEN537プラスミドおよび大腸菌BLR染色体からのL−アスパラギナーゼII(ansBおよびansB*遺伝子)のタンパク質コード配列
大腸菌BLR(DE3)[ノバゲン社;カタログ番号69208−3から入手]から、染色体DNAを調製した。カナマイシン(15μg/ml)を有するLB培地中、37℃で増殖させたBLRの2mlの培養物を、微量遠心管中2分間遠心分離し、細胞ペレットを0.5mlのSTET緩衝液中で再懸濁した。フェノール/クロロホルム(0.5ml)を加えてボルテックスし、室温で5分間遠心分離した。上澄液を集めて、50μlの3M酢酸ナトリウムおよび1mlのエタノールと混合した。氷上で10分間インキュベートした後、DNAを遠心分離によりペレットにし、100μlの水中で再懸濁した。PCRをサンプルに対して実施し、染色体ansB遺伝子を単離した。PCR反応混合物は、5μlの10×高フィデリティーPCR緩衝液、5μlの10mM dNTP混合物、1μlの50mM MgSO4、0.5μl(50pmol)のオリゴヌクレオチド
5’−GATCCATATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCAC−3’(配列番号11)、
0.5μl(50pmol)のオリゴヌクレオチド
5’−GTACGGATCCTCATTAGTACTGATTGAAGATC−3’(配列番号12)、
1μlのBLR DNA、36μlの蒸留水、および1μlの白金Taq高フィデリティーポリメラーゼを含有した。インビトロゲン社から入手した市販のTOPOクローニングシステムを用いてクローン化し、製造元により記載されたとおり実施した。
細胞および培養培地からの精製
以下の処理は、ハームス(Harms)ら、1991年、Protein Expression and Purification 2:144−150頁から適合させた。
大スケールL−アスパラギナーゼIIの調製のために、細胞をバッチ培養(10リットル)中で増殖させ、上記の浸透圧性ショックに供する。培養容量1リットル当り50〜100mlのスフェロブラスト緩衝液および30〜40mlの水を使用する。以下のプロトコルは、2リットルの培養物から得られたペリプラズム抽出物から開始する。全てのステップを5〜10℃で実施する。
100mlの上澄液に、29.5gの固形硫酸アンモニウムを加えて50%飽和を得る。2時間後、沈殿物を遠心分離により除去し、ペレットを廃棄する。上澄液を、硫酸アンモニウムにより90%飽和(100mlに対して27.2g)にする。ペレットを一晩放置後、遠心分離によりこれを集め、数ミリリットルの25mMのピペラジン−HCl緩衝液、pH5.5に溶解し、同じ緩衝液に対して透析する。この同じ処理をまた、残りの細胞培養物にも適用して分泌L−アスパラギナーゼIIを回収する。
1×30cmカラムのポリ緩衝液交換器PBE94を、200mlの上記のピペラジン−HCl緩衝液(開始緩衝液)により平衡にした。サンプル溶液(10ml)を適用した後、カラムを、30ml/時間の流速で200mlの溶出用緩衝液(Polybuffer 74、H2Oで10倍希釈し、HClによりpH4.0に調整)により溶出する。2mlのフラクションを集め、20μlのサンプルの適切な希釈後、L−アスパラギナーゼII活性に関してアッセイする。アスパラギナーゼ含有フラクションをプールし、飽和硫酸アンモニウム溶液に対して透析する。酵素ペレットを90%の飽和硫酸アンモニウムで洗浄し、この媒体中懸濁液として保存する。
細胞および培養培地からの精製
上記のとおり大腸菌株EN538の培養物を、発酵槽中25℃から37℃でカナマイシンの存在下、培養培地中で増殖させる[例えば、フィルプラ,D.(Filpula,D.)、マクガイア,J.(McGuire,J.)、およびウィットロウ,M.(Whitlow,M.)(1996年)「Production of single−chain Fv monomers and multimers,In Antibody Engineering:A Practical Approach」(J.マッカファーティ(J.McCafferty)、H.フーゲンブーム(H.Hoogenboom)、およびD.J.キスウェル(D.J.Chiswell)編;オックスフォード大学プレス、オックスフォード、英国))253−268頁]。OD660が20から200の時点で、IPTGを0.1〜1mMの最終濃度まで加え、さらに1〜12時間増殖を継続した。遠心分離により細胞を回収し、マントン−ガウリン(Manton−Gaulin)細胞ホモジナイザーを通過させた。細胞溶解液を6℃で30分間24,300gで遠心分離し、上澄液を集め、限外ろ過/ダイアフィルトレーションに供し、導電度を3mSに調整する。溶解液のpHを、25%酢酸により4.1に調整し、5mM酢酸ナトリウム、25mMのNaCl、pH4.1の緩衝液によりダイアフィルトレーションする。
細胞および培養培地からの精製
実施例6に記載されたとおり、増殖、誘導、およびホモジナイズされた大腸菌株EN538の培養物を、20mM酢酸ナトリウム、40mM NaCl、pH4.6に対して、A280が0.1未満、導電度が5mSになるまで、2.9L/分の流速、16psiで50kDaのMicrogonホローファイバーで8つの産物容量を用いてダイアフィルトレーションする。0.22μm膜を用いて産物をろ過する。
特許手続きの目的のために、微生物の寄託に関して国際認識に対するブダペスト条約の要件を満たす条件下、以下の生物学的材料の培養物は、以下の国際寄託機関に寄託されている:
American Type Culture Collection(ATCC)
(米国20110−2209、バージニア州、マナッサス(Manassas)、University Boulevard10801所在)
国際寄託登録
生物/ベクター:大腸菌/EN538
ATCC番号 :PTA7490
寄託日 :2006年4月11日
Claims (16)
- 大腸菌の染色体、および組換え染色体外ベクターの少なくとも1つのコピーを含む、大腸菌L−アスパラギナーゼII酵素を産生するための組換え大腸菌宿主細胞であって、
前記組換え染色体外ベクターが、L−アスパラギナーゼII酵素のサブユニットをコードし、
前記宿主細胞の染色体もまた、L−アスパラギナーゼII酵素の同じサブユニットをコードし、
前記コードされているL−アスパラギナーゼII酵素のサブユニットが、配列番号1の配列を含んでなり、
前記宿主染色体が、L−アスパラギナーゼIIの他のいずれのイソ型もコードしないことを特徴とする、組換え大腸菌宿主細胞。 - 前記染色体外ベクターが、プラスミドであることを特徴とする請求項1記載の組換え大腸菌宿主細胞。
- 前記組換え染色体外ベクターが、好適なプロモーターに機能的に連結されているL−アスパラギナーゼII酵素のサブユニットをコードするDNA分子を含むことを特徴とする、請求項1記載の組換え大腸菌宿主細胞。
- 前記プロモーターが、T7、araB、PR/PL、phoA、trc、およびtrpプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする請求項3記載の組換え大腸菌宿主細胞。
- 前記組換え染色体外ベクターが、オペレーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、転写ターミネーター、抗生物質選択マーカー、複製の起点、およびレプレッサーの制御コピーをさらに含んでなることを特徴とする、請求項3記載の組換え大腸菌宿主細胞。
- 前記L−アスパラギナーゼII酵素のサブユニットをコードするDNA分子が、配列番号2の配列を含んでなることを特徴とする、請求項3記載の組換え大腸菌宿主細胞。
- 前記染色体が、配列番号3のDNA分子を含んでなることを特徴とする、請求項3記載の組換え大腸菌宿主細胞。
- 配列番号1のL−アスパラギナーゼII酵素のサブユニットをコードする、配列番号2および配列番号3の核酸分子からなる群より選択される単離された核酸分子。
- 配列番号2である請求項8記載の核酸を含んでなる、染色体外ベクター。
- プラスミドであることを特徴とする請求項9記載の染色体外ベクター。
- 配列番号2の核酸分子が、好適なプロモーターに機能的に連結されていることを特徴とする、請求項9記載の染色体外ベクター。
- 前記プロモーターが、T7、araB、PR/PL、phoA、trcおよびtrpプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする、請求項12記載の染色体外ベクター。
- 請求項11記載のプラスミドを含む、EN538と指定されかつATCC番号PTA7490として寄託されている大腸菌宿主細胞。
- 他のL−アスパラギナーゼII異性体を実質的に含まない、組換えL−アスパラギナーゼII酵素の産生方法であって、
請求項14記載の宿主細胞を培養し、
産生されたL−アスパラギナーゼII酵素を単離する、
各工程を有してなる方法。 - L−アスパラギナーゼII酵素のサブユニットをコードする、配列番号2を含んでなる単離されたDNA分子。
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