JP5306901B2 - 血液型判定方法およびそのための赤血球固相化容器 - Google Patents
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Description
赤血球を結合させるためのバインダー物質を斜面を有する底面に固相化した容器に、(i)検体赤血球と抗体試薬の組み合わせまたは(ii)赤血球試薬と抗体検体の組み合わせを添加する工程と、
凝集の有無を判定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
(i)検体赤血球と抗体試薬の組み合わせを添加する場合、検体赤血球を前記容器に添加してその底面に固相化し、その後、検体赤血球と抗体試薬の組み合わせを添加することを特徴とし、
(ii)赤血球試薬と抗体検体の組み合わせを添加する場合、赤血球試薬を前記容器に添加してその底面に固相化し、その後、赤血球試薬と抗体検体の組み合わせを添加することを特徴とする方法。
本発明の赤血球固相化容器は、検体赤血球または赤血球試薬が、バインダー物質を介して、斜面を有する底面に固相化されている。このように斜面を有する容器底面に赤血球を固相化することにより、本発明の容器では、凝集物が斜面に広がった陽性像を形成し、容器の最深部に非凝集物が沈降した陰性像を形成する。
本発明の血液型判定方法は、
赤血球を結合させるためのバインダー物質を斜面を有する底面に固相化した容器に、(i)検体赤血球と抗体試薬の組み合わせまたは(ii)赤血球試薬と抗体検体の組み合わせを添加する工程と、
凝集の有無を判定する工程と
を含む。
本発明の方法を行うためには、まず、「赤血球を結合させるためのバインダー物質を斜面を有する底面に固相化した容器」を調製する。この容器およびその作製の仕方については、上述の説明を参照することができる。
本発明において凝集反応は、公知の血液型判定の手法に従って行うことができるが、一般に、赤血球は、0.5〜1.5%濃度の赤血球含有液を25μl/容器の量で添加することができ、抗体は、特に濃度で示されない市販の抗血清試薬または検体の血清を25〜100μl/容器の量で添加することができる。
(i)検体赤血球と抗体試薬の組み合わせを添加する場合、バインダー物質を固相化した容器に検体赤血球を添加してその底面に固相化し、その後、検体赤血球と抗体試薬の組み合わせを添加し、
(ii)赤血球試薬と抗体検体の組み合わせを添加する場合、バインダー物質を固相化した容器に赤血球試薬を添加してその底面に固相化し、その後、赤血球試薬と抗体検体の組み合わせを添加する。
凝集反応の有無は、容器上方または下方から目視またはCCDカメラ等で確認することができる。上述のとおり、陽性像は、赤血球の凝集物が容器底面全体に広がったパターンを示し、陰性像は、容器底面の最深部に赤血球の非凝集物が沈降したパターンを示す。
バインダー物質として、以下に記載の各種レクチンや抗体を使用して、ヒト赤血球を固相化した。
1−1.レクチン(バインダー物質)
WGA(コムギ胚芽レクチン)は、豊年株式会社製を使用した。APP(エゾボウフウ)、CSA(エニシダレクチン)、DSA(チョウセンアサガオレクチン)、VFA(ソラマメレクチン)、LCH−A(レンズ豆レクチン)、LCH−B、ECA(ディゴマメレクチン)、PNA(ピーナツレクチン)、H(ハリエニシダレクチン)はいずれも、EYラボラトリーズの製品を使用した。
マウス抗グリコフォリンモノクローナル抗体は、Chemicon社を使用した。
抗ウサギIgG、抗マウスIgG、抗マウスIgG+IgMは、Jackson社製を使用した。
Ortho社の市販血球試薬アファーマジェンを使用した。
Maxisorp(Nalgen-Nunc)U底プレートを使用した。
2−1.レクチン(バインダー物質)の固相化
レクチンは、小麦胚芽レクチンを10μg/mLになるように炭酸バッファーpH9.6で希釈し、Maxisorp(Nalgen-Nunc)U底プレートに50μL/wellずつ分注した。冷蔵庫でOverNightインキュベートし、その後、生理食塩液で3回洗浄し、水切りして、30℃の乾燥機で風乾30分間実施した。後、シリカゲルと共にアルミパックを行った。
マウス抗Bモノクローナル抗体は、BioRad社のAffiGel の添付文書に従って、「Ortho社の抗B抗体」から精製を行った。
「ウサギ抗マウスIgG+IgM(H&L)」を10μg/mLになるように炭酸バッファーpH9.6で希釈し、Maxisorp(Nalgen-Nunc)U底プレートに50μL/wellずつ分注した。冷蔵庫でOverNightインキュベートし、生理食塩液で3回洗浄し、市販抗血清(Ortho社の抗B抗体)を生理食塩液で2倍希釈したものを50μL/well分注して、30分間インキュベートした。精製水で2回洗浄し、水切りして、30℃の乾燥機で風乾 30分間実施した。後、シリカゲルと共にアルミパックを行った。
WGA(コムギ胚芽レクチン)固相化プレート(上記2−1で作成)に、試薬赤血球1滴(3% 50μL/well)を分注して、10分間放置後、生理食塩液で3回洗浄して、血球結合を観察した。
・抗B抗体固相化プレートへの赤血球の固相化
抗B抗体固相化プレート(上記2−2で作成)あるいは、抗マウスIgG+IgM抗体を介して、抗B抗体を結合したプレート(上記2−3で作成)に、試薬赤血球1滴(3% 50μL/well)を分注して、10分間放置後、生理食塩液で3回洗浄して、血球結合を観察した。
抗マウスIgG+IgM抗体を介して抗A, 抗H抗体を固相化したプレート(上記2−3で作成)に、試薬赤血球1滴(3% 50μL/well)を分注して、10分間放置後、生理食塩液で3回洗浄して、血球結合を観察した。
本実施例では、バインダー物質として、WGA(小麦胚芽レクチン)を使用し、種々の形状の容器を使用して、陽性/陰性パターンを確認した。
Claims (4)
- 血液型判定方法であって、
赤血球を結合させるためのバインダー物質を斜面を有する底面に固相化した容器に、(i)検体赤血球または(ii)赤血球試薬を添加して、被覆率30〜100%で固相化する工程と、
(i)検体赤血球が固相化された容器には検体赤血球と抗体試薬の組み合わせを添加し、(ii)赤血球試薬が固相化された容器には赤血球試薬と抗体検体の組み合わせを添加する工程と、
凝集の有無を判定する工程と
を含み、
前記容器が、前記斜面が全体にわたって均一な傾斜角度を有し、前記斜面の水平面からの角度が30〜52.5°であるV底容器であることを特徴とする方法。 - 前記斜面の水平面からの角度が30〜45°であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 検体赤血球または赤血球試薬が、バインダー物質を介して、斜面を有する底面に被覆率30〜100%で固相化されている赤血球固相化容器であって、前記斜面が全体にわたって均一な傾斜角度を有し、前記斜面の水平面からの角度が30〜52.5°であるV底容器である、赤血球固相化容器。
- 前記斜面の水平面からの角度が30〜45°であることを特徴とする請求項3に記載の赤血球固相化容器。
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