本発明は、タバコ由来の構成的およびエチレンまたは老化誘導性配列(ニコチンデメチラーゼのゲノムクローンを含む)を特定し、特徴づけした。また、育種方法における、および所望の形質(例えば、ノルニコチンまたはN'-ニトロソノルニコチン(「NNN」)または両方のレベルの、対照植物に対する改変)を有する植物(例えば、トランスジェニック植物)を作製するための方法における、これらの配列の使用も、本明細書に記載する。
1つの態様においては、本発明は、ニコチンデメチラーゼ遺伝子の発現の低下を伴うタバコ植物を生産するための育種方法に関する。該方法は、(a)変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する第1タバコ植物を準備し、(b)少なくとも1つの表現型形質を含有する第2タバコ植物を準備し、(c)第1タバコ植物と第2タバコ植物とを交配させてF1後代植物を得、(d)変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現のために該F1後代の種子を集め、(e)該種子を発芽させて、ニコチンデメチラーゼ遺伝子の発現の低下を伴うタバコ植物を得る工程を含む。
1つの実施形態においては、本明細書に記載の配列および当技術分野で公知の標準的な方法を用いて、ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現(例えば、転写、転写後もしくは翻訳のレベルまたは酵素活性のレベルにおけるもの)に関する変異体としてタバコ植物を特定する。
この育種方法のもう1つの実施形態においては、第1タバコ植物は、変異(例えば、欠失、置換、点変異、転座、逆位、重複または挿入)を有する内因性ニコチンデメチラーゼ遺伝子を含む。もう1つの実施形態においては、第1タバコ植物は、ヌル変異を有するニコチンデメチラーゼ遺伝子を含み、内因性ニコチンデメチラーゼ遺伝子をサイレンシングする組換え遺伝子を含み、あるいは、酵素活性の低下または改変を伴うニコチンデメチラーゼを含む。更にもう1つの実施形態においては、第1タバコ植物のニコチンデメチラーゼ遺伝子は存在しない。更にもう1つの実施形態においては、第1タバコ植物はトランスジェニック植物である。
本明細書に開示する育種方法において有用な典型的な第1タバコ植物には以下のものが含まれる:Nicotiana africana, Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana arentsii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigelovii, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana exigua, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana gossei, Nicotiana hesperis, Nicotiana ingulba, Nicotiana knightiana, Nicotiana maritima, Nicotiana megalosiphon, Nicotiana miersii, Nicotiana nesophila, Nicotiana noctiflora, Nicotiana nudicaulis, Nicotiana otophora, Nicotiana palmeri, Nicotiana paniculata, Nicotiana petunioides, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nicotiana rosulata, Nicotiana rotundifolia, Nicotiana rustica, Nicotiana setchelli, Nicotiana stocktonii, Nicotiana eastii, Nicotiana suaveolensまたはNicotiana trigonophylla。望ましくは、第1タバコ植物は、Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigelovii, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana gossei, Nicotiana hesperis, Nicotiana knightiana, Nicotiana maritima, Nicotiana megalosiphon, Nicotiana nudicaulis, Nicotiana paniculata, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana suaveolensまたはNicotiana trigonophyllaである。他の第1タバコ植物には、ニコチンエメチラーゼのレベルが低下するよう操作された、Nicotiana tabacum(またはNicotiana rustica)の品種またはそれに関連したトランスジェニック系統が含まれる。他の典型的な第1タバコ植物には、オリエンタル、いぶし(dark)タバコ、火力乾燥(フルーキュアリング)もしくは空気乾燥(エアキュアリング)タバコ、バージニア、またはバーレータバコ植物が含まれる。
前記の育種方法のもう1つの実施形態においては、第2タバコ植物はNicotiana tabacumである。Nicotiana tabacumの典型的な品種には例えば以下のような商業用品種が含まれる:BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, Galpaoタバコ, GL 26H, GL 350, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KT 200, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY 160, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14 x L8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, OXFORD 207, 'Perique'タバコ, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H4, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, SP 168, SP 172, SP 179, SP 210, SP 220, SP G-28, SP G-70, SP H20, SP NF3, TN 86, TN 90, TN 97, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA 309またはVA 359。
更に他の実施形態においては、第2タバコ植物の表現型形質には、耐病性;高い収量;高い等級指標;乾燥性;乾燥の質;機械的収穫性;保持能(holding ability);葉の質;丈、植物成熟度(例えば、早熟、早熟ないし中生、中生、中生ないし晩熟または晩熟);柄のサイズ(例えば、小さい、中等度または大きい柄);または植物当たりの葉数(例えば、少ない(例えば、5〜10枚の葉)、中等度(例えば、11〜15枚の葉)または多い(例えば、16〜21枚)の葉数)が含まれる。更に他の実施形態においては、該方法は更に、雄性不稔花粉受容体(acceptor)、雑種の生産に使用されうる花粉供与体もしくは工程(b)の植物との雄性不稔雑種を自家受粉もしくは受粉(授粉)させること、または工程(e)の発芽種子から得た植物を戻し交配または自家受粉させることを含む。
もう1つの態様においては、本発明は、タバコ植物内へニコチンデメチラーゼ欠損形質を育種するための方法に関する。該方法は、a)変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する第1タバコ植物を第2タバコ植物と交配させ、b)該交配の後代タバコ植物を得、c)後代タバコ植物からDNAサンプルを抽出し、d)該DNAサンプルを、ニコチンデメチラーゼ遺伝子またはその断片にハイブリダイズするマーカー核酸分子と接触させ、e)該変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現形質に関するマーカー補助育種法(marker assisted breeding method)を行う工程を含む。例えば、植物を、ニコチンデメチラーゼの変異体遺伝子発現を有するものとして特定し、所望により、ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現に関して更に試験し、あるいは標準的なアルカロイドプロファイリングまたは免疫ブロット分析を用いて試験する。典型的には、そのようなマーカー補助育種法は、増幅断片長多型、制限断片長多型、ランダム増幅多型提示、一塩基多型、マイクロサテライトマーカー、またはタバコゲノムにおける標的化誘導性局所損傷(targetted induced local lesion)の利用を含む。
更にもう1つの態様においては、本発明は、Nicotiana africana, Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana arentsii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigelovii, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana exigua, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana gossei, Nicotiana hesperis, Nicotiana ingulba, Nicotiana knightiana, Nicotiana maritima, Nicotiana megalosiphon, Nicotiana miersii, Nicotiana nesophila, Nicotiana noctiflora, Nicotiana nudicaulis, Nicotiana otophora, Nicotiana palmeri, Nicotiana paniculata, Nicotiana petunioides, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nicotiana rosulata, Nicotiana rotundifolia, Nicotiana rustica, Nicotiana setchelli, Nicotiana stocktonii, Nicotiana eastii, Nicotiana suaveolensおよびNicotiana trigonophyllaよりなる群から選ばれるタバコ植物のいずれかをそれ自身と交配させることを含む、タバコ種子の生産方法に関する。1つの実施形態においては、該方法は更に、変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物を第2の異なるタバコ植物と交配させることを含む、雑種タバコ種子の生産方法を含む。本発明の更にもう1つの実施形態においては、該交配は、(a)変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物と第2の異なるタバコ植物との交配から得られた種子を植え、(b)該種子からのタバコ植物を成長させて、該植物を開花させ、(c)変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物の花を第2のタバコ植物からの花粉で受粉させ、あるいは第2のタバコ植物の花を、変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物の花からの花粉で受粉させ、(d)該受粉から得られた種子を収穫する工程を含む。
更にもう1つの態様においては、本発明は、(a)変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物またはその成分を準備し、(b)タバコ植物育種技術を用いて育種材料源として該植物または植物成分を使用することを含む、タバコ育種計画においてタバコ植物を開発するための方法に関する。この方法の実施に有用な典型的な植物育種技術には、集団選抜(bulk selection)、戻し交配、自家受粉、移入交雑、系統選抜、純系選抜、半数体/倍加半数体育種または単粒系統法が含まれる。
もう1つの態様においては、本発明は、(a)図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有する第1タバコ植物を準備し、(b)少なくとも1つの表現型形質を含有する第2タバコ植物を準備し、(c)第1タバコ植物を第2タバコ植物と交配させてF1後代植物を得、(d)前記の修飾された属性の該F1後代の種子を集め、(e)該種子を発芽させて、修飾された属性を有するタバコ植物を得る工程を含む、修飾された属性を有するタバコ植物を生産するための育種方法に関する。1つの実施形態においては、第1タバコ植物は、変異を含む、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子を含む。典型的な変異には、欠失、置換、点変異、転座、逆位、重複または挿入が含まれる。
更にもう1つの実施形態においては、前記方法の第1タバコ植物は、ヌル変異を含む、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子を含む。更にもう1つの実施形態においては、第1タバコ植物は、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子の発現をサイレンシングする組換え遺伝子を含む。
所望により、第1タバコ植物は、低下または変化した酵素活性を有するポリペプチドをコードする、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子を含む。更に他の実施形態においては、第1タバコ植物はトランスジェニック植物である。
本明細書に開示する育種方法において有用な典型的な第1タバコ植物には以下のものが含まれる:Nicotiana africana, Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana arentsii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigelovii, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana exigua, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana gossei, Nicotiana hesperis, Nicotiana ingulba, Nicotiana knightiana, Nicotiana maritima, Nicotiana megalosiphon, Nicotiana miersii, Nicotiana nesophila, Nicotiana noctiflora, Nicotiana nudicaulis, Nicotiana otophora, Nicotiana palmeri, Nicotiana paniculata, Nicotiana petunioides, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nicotiana rosulata, Nicotiana rotundifolia, Nicotiana rustica, Nicotiana setchelli, Nicotiana stocktonii, Nicotiana eastii, Nicotiana suaveolensまたはNicotiana trigonophylla。他の第1タバコ植物には、Nicotiana tabacumまたはNicotiana rusticaの品種が含まれる。更に他の第1タバコ植物としては、オリエンタル、いぶし(dark)タバコ、火力乾燥(フルーキュアリング)もしくは空気乾燥(エアキュアリング)タバコ、バージニア、またはバーレータバコ植物が挙げられる。
前記の育種方法のもう1つの実施形態においては、第2タバコ植物はNicotiana tabacumである。Nicotiana tabacumの典型的な品種には例えば以下のような商業用品種が含まれる:BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, Galpaoタバコ, GL 26H, GL 350, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KT 200, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY 160, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14 x L8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, OXFORD 207, 'Perique'タバコ, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H4, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, SP 168, SP 172, SP 179, SP 210, SP 220, SP G-28, SP G-70, SP H20, SP NF3, TN 86, TN 90, TN 97, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA 309またはVA 359。
更に他の実施形態においては、第2タバコ植物の表現型形質には、耐病性;高い収量;高い等級指標;乾燥性;乾燥の質;機械的収穫性;保持能(holding ability);葉の質;丈、植物成熟度(例えば、早熟、早熟ないし中生、中生、中生ないし晩熟または晩熟);柄のサイズ(例えば、小さい、中等度または大きい柄);または植物当たりの葉数(例えば、少ない(例えば、5〜10枚の葉)、中等度(例えば、11〜15枚の葉)または多い(例えば、16〜21枚)の葉数)が含まれる。
更に他の実施形態においては、該方法は、雄性不稔もしくは雄性不稔雑種を工程(b)の植物で受粉させること、または工程(e)の発芽種子から得た植物を戻し交配または受粉させることを含む。もう1つの態様においては、本発明は、タバコ植物内へ属性を育種するための方法に関する。該方法は、a)図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有する第1タバコ植物を、第2タバコ植物と交配させ、b)該交配の後代タバコ植物を得、c)後代タバコ植物からDNAサンプルを抽出し、d)該DNAサンプルを、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列またはそれらの断片よりなる群から選ばれる核酸分子にハイブリダイズするマーカー核酸分子と接触させ、e)修飾された属性に関するマーカー補助育種法を行う工程を含む。典型的には、そのようなマーカー補助育種法は、増幅断片長多型、制限断片長多型、ランダム増幅多型提示、一塩基多型、マイクロサテライトマーカー、またはタバコゲノムにおける標的化誘導性局所損傷(targetted induced local lesion)の利用を含む。
更にもう1つの態様においては、本発明は、Nicotiana africana, Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana arentsii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigelovii, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana exigua, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana gossei, Nicotiana hesperis, Nicotiana ingulba, Nicotiana knightiana, Nicotiana maritima, Nicotiana megalosiphon, Nicotiana miersii, Nicotiana nesophila, Nicotiana noctiflora, Nicotiana nudicaulis, Nicotiana otophora, Nicotiana palmeri, Nicotiana paniculata, Nicotiana petunioides, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nicotiana rosulata, Nicotiana rotundifolia, Nicotiana rustica, Nicotiana setchelli, Nicotiana stocktonii, Nicotiana eastii, Nicotiana suaveolensおよびNicotiana trigonophyllaよりなる群から選ばれるタバコ植物のいずれかを、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有するタバコ植物ないし第2の異なるタバコ植物と交配させることを含む、タバコ種子の生産方法に関する。
更にもう1つの実施形態においては、交配は、(a)修飾された属性を有するタバコ植物と第2の異なるタバコ植物との交配から得られた種子を植え、(b)該種子からのタバコ植物を成長させて、該植物を開花させ、(c)修飾された属性を有するタバコ植物の花を第2のタバコ植物からの花粉で受粉させ、あるいは第2のタバコ植物の花を、修飾された属性を有するタバコ植物の植物からの花粉で受粉させ、(d)該受粉から得られた種子を収穫する工程を含む。
更にもう1つの態様においては、本発明は、(a)図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有するタバコ植物またはその成分を準備し、(b)タバコ植物育種技術を用いて育種材料源として該植物または植物成分を使用することを含む、タバコ育種計画においてタバコ植物を開発するための方法に関する。この方法の実施に有用な典型的な植物育種技術には、集団選抜(bulk selection)、戻し交配、自家受粉、移入交雑、系統選抜、純系選抜、半数体/倍加半数体育種または単粒系統法が含まれる。
関連態様において、本発明は、前記育種方法のいずれかにより生産されたタバコ植物またはその成分に関する。更にもう1つの関連態様においては、本発明は、本明細書に記載の方法に従い育種または生産された植物のいずれかから得られた再生可能なタバコ細胞の組織培養に関する。そのような組織培養は、変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現または修飾された属性を有するタバコ植物の生理学的および形態学的特徴のすべてを発現しうるタバコ植物を再生する。典型的な再生可能な細胞は胚、***細胞、種子、花粉、葉、根、根端または花であり、あるいはそれらに由来するプロトプラストまたはカルスである。
他の関連態様においては、本発明は、(a)前記育種方法のいずれかにより得られたタバコ植物を準備し、(b)該タバコ植物からタバコ製品を製造することを含む、タバコ製品の製造方法に関する。典型的なタバコ製品には、葉または茎またはそれらの両方;無煙タバコ製品;湿性もしくは乾燥かぎタバコ;噛みタバコ;巻きタバコ製品;葉巻製品;シガリーロ;パイプタバコ;またはビーディ(bidi)が含まれる。
本発明の1つの態様は、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列に対して実質的に同一、望ましくは少なくとも70%同一である核酸配列を含む単離された遺伝的マーカーに関する。本発明のこの態様の望ましい実施形態においては、該核酸配列は、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む。他の望ましい実施形態においては、該核酸配列は構成的またはエチレンもしくは老化誘導性である。また、該核酸配列は、望ましくは、図1、図3および4、図10〜158、図160A〜160E、図162〜170ならびに図172-1〜172-19に示すアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする。
本発明の他の望ましい実施形態においては、該核酸配列は異種遺伝子に機能しうる形で連結されている。あるいは、該核酸配列は、誘導性、構成的、病原体もしくは創傷誘導性、環境もしくは発生調節性または細胞もしくは組織特異的プロモーターに機能しうる形で連結されている。
もう1つの態様においては、本発明は、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列を含有し、該核酸配列によりコードされるポリペプチドの発現を導きうる発現ベクターに関する。
本発明の他の態様は、図1、図3および4、図10〜158、図160A〜160E、図162〜170または図172-1〜172-19に示すポリペプチドのアミノ酸配列を含有する実質的に純粋なポリペプチド、ならびに該ポリペプチドを特異的に認識する抗体に関する。
本発明のもう1つの態様は、植物または植物成分において発現される図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す単離された核酸配列を含有する該植物または該植物成分、または図1、図3および4、図10〜158、図160A〜160E、図162〜170ならびに図172-1〜172-19に示すアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードし植物または植物成分において発現される核酸配列を含有する該植物または該植物成分に関する。望ましくは、該植物または植物成分は、Nicotiana種、例えば、表8に示すNicotiana種である。他の望ましい実施形態においては、該植物成分は葉、例えば乾燥したタバコ葉、茎または種子である。望ましい実施形態は、発芽種子からの植物に関する。
もう1つの態様においては、本発明は、植物または植物成分において発現される図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す単離された核酸配列を含有する該植物または該植物成分を含有するタバコ製品に関する。望ましくは、該乾燥タバコ植物または植物成分における内因性遺伝子の発現はサイレンシングされている。他の望ましい実施形態においては、該タバコ製品は無煙タバコ製品、湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコまたはビーディ(bidi)が含まれる。特に、本発明のこの態様のタバコ製品は、いぶし(dark)タバコ、粉砕タバコを含有することが可能であり、あるいは香味成分を含みうる。
本発明のもう1つの態様は、植物細胞における構成的またはエチレン誘導性もしくは老化誘導性タバコポリペプチドの発現または酵素活性を低下させるための方法に関する。この方法は、植物細胞における内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルまたは酵素活性を低下させることを含む。望ましい実施形態においては、該タバコポリペプチドはp450である。他の望ましい実施形態においては、該植物細胞は、Nicotiana種、例えば、表8に示すNicotiana種の1つに由来するものである。
もう1つの望ましい実施形態においては、内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを低下させることは、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列または図1、図3および4、図10〜158、図160A〜160E、図162〜170ならびに図172-1〜172-19に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核酸配列のアンチセンス核酸分子をコードするトランスジーンを該植物細胞において発現させることを含む。もう1つの望ましい実施形態においては、該トランスジーンは、該植物細胞において構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコ核酸またはアミノ酸配列の二本鎖RNA分子をコードする。他の望ましい実施形態においては、該トランスジーンは、例えば、組織特異的、細胞特異的または器官特異的に発現される。また、内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを低下させることは、望ましくは、該植物細胞における該構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドの共抑制(co-suppression)を含む。もう1つの望ましい実施形態においては、内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを低下させることは、該植物細胞においてドミナントネガティブ遺伝子産物を発現させることを含む。望ましくは、内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドは、図1、図3および4、図10〜158、図160A〜160E、図162〜170ならびに図172-1〜172-19に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子内に変異を含む。他の望ましい実施形態においては、発現の低下は、転写レベル、翻訳レベルまたは翻訳後レベルにおいて生じる。
本発明のもう1つの態様は、植物細胞における構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドの発現または酵素活性を上昇させるための方法に関する。この方法は、該植物細胞における内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルまたは酵素活性を上昇させることを含む。本発明のこの態様の望ましい実施形態においては、該植物細胞は、Nicotiana種、例えば、表8に示すNicotiana種に由来する。もう1つの望ましい実施形態においては、構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを上昇させることは、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列または図1、図3および4、図10〜158、図160A〜160E、図162〜170ならびに図172-1〜172-19に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーンを該植物細胞において発現させることを含む。望ましくは、発現の上昇は、転写レベル、翻訳レベルまたは翻訳後レベルで生じる。
本発明のもう1つの態様は、構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドの製造方法に関する。この方法は、(a)図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列を含有する単離された核酸分子で形質転換された細胞を準備し、(b)その単離された核酸分子の発現のための条件下、形質転換細胞を培養し、(c)該構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドを回収する工程を含む。望ましくは、該構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドはp450である。もう1つの望ましい実施形態においては、本発明は、本発明のこの態様の方法に従い製造された組換え構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドに関する。
もう1つの態様においては、本発明は、構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドまたはその断片を単離するための方法に関する。この方法は、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列またはその一部を、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す核酸配列に対して少なくとも70%以上の配列同一性を有する核酸配列の検出をもたらすハイブリダイゼーション条件下、植物細胞からの核酸調製物と接触させ、(b)ハイブリダイズする核酸配列を単離する工程を含む。望ましくは、該構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドはp450である。
本発明のもう1つの態様は、ニコチンデメチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する単離された核酸分子、例えばDNA配列に関する。望ましい実施形態においては、第1の態様のヌクレオチド配列は、例えば、配列番号4もしくは配列番号5のヌクレオチド配列に対して少なくとも70%同一である又は配列番号4のヌクレオチド2010-2949および/もしくは3947-4562を含有する又は配列番号4もしくは配列番号5の配列を含有するヌクレオチド配列を含有するタバコニコチンデメチラーゼのように、タバコニコチンデメチラーゼをコードするヌクレオチド配列と実質的に同一である。本発明の第1の態様の単離された核酸分子は、例えば、植物細胞内で機能的なプロモーターに機能しうる形で連結されており、望ましくは、発現ベクター内に含有されている。他の望ましい実施形態においては、該発現ベクターは細胞、例えば植物細胞内に含有されている。望ましくは、該植物細胞、例えばタバコ植物細胞が植物内に含まれている。もう1つの望ましい実施形態においては、本発明は、異種プロモーター配列に機能しうる形で連結された配列番号4の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子を含む、発現ベクターを含有する植物からの種子、例えばタバコ種子に関する。さらに、本発明は、該発現ベクターを含有する発芽種子に由来する植物、該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、および該葉に由来する製造品に関する。
もう1つの望ましい実施形態においては、該ヌクレオチド配列は、配列番号4および/もしくは配列番号5のヌクレオチド配列の相補体または配列番号4もしくは配列番号5の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含有する。望ましくは、該ヌクレオチド配列は、配列番号3のアミノ酸配列と実質的に同一であるニコチンデメチラーゼをコードする。本発明の第1の態様のもう1つの望ましい実施形態においては、ニコチンデメチラーゼは、配列番号3のニコチンデメチラーゼアミノ酸配列に対して、または該完全長ポリペプチドと比べて変化(例えば低下)した酵素活性を有するニコチンデメチラーゼの断片に対して、少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する。望ましくは、ニコチンデメチラーゼは配列番号3のアミノ酸配列を含む。
もう1つの態様においては、本発明は、配列番号8の配列またはその断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし転写を駆動するプロモーターを含有する単離された核酸分子に関する。望ましくは、該プロモーターは、(i)エチレンでの処理後または老化過程で誘導され、(ii)(a)配列番号4の塩基対1-2009、または(b)配列番号4の塩基対1-2009により定められる配列の200個の連続的塩基対と同一の少なくとも200個の連続的塩基対、または(c)配列番号4の塩基対1-2009に記載されている配列の連続的な20塩基対部分と配列において同一である20塩基対ヌクレオチド部分を含む。
本発明のもう1つの態様は、配列番号8の配列に対して50%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有する単離された核酸プロモーターに関する。望ましくは、この単離された核酸プロモーターはエチレンでの処理後または老化過程で誘導され、例えば、配列番号8の配列を含む。あるいは、プロモーターは、異種遺伝子の転写を駆動する又はニコチンデメチラーゼ酵素活性を低下もしくは変化させる(例えば、遺伝子発現をサイレンシングする)、配列番号8から入手可能な断片を含みうる。望ましい実施形態においては、該プロモーター配列は、異種核酸配列に機能しうる形で連結されており、あるいは例えば発現ベクター内に含有されうる。他の望ましい実施形態においては、該発現ベクターは細胞、例えば植物細胞内に含有されている。望ましくは、該植物細胞、例えばタバコ植物細胞が植物内に含まれている。もう1つの望ましい実施形態においては、本発明は、異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号8の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子を含む、発現ベクターを含有する植物からの種子、例えばタバコ種子に関する。さらに、本発明は、本発明のこの態様のプロモーターを含有する発芽種子に由来する植物、該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、および該葉に由来する製造品に関する。
本発明のもう1つの態様は、植物において異種遺伝子を発現させるための方法に関する。これは、(i)異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号8の配列に対して50%以上の配列同一性を有するプロモーター配列を含有するベクターを植物細胞内に導入し、(ii)該細胞から植物を再生させることを含む。また、この方法は、該ベクターを後代へ性的に伝達させることを含むことが可能であり、更に、該後代により産生された種子を集める工程を含むことが可能である。
更にもう1つの態様においては、本発明は、タバコ植物におけるニコチンデメチラーゼの発現を低下させるための方法に関する。この方法は、(i)異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号8の配列または配列番号8から入手可能な断片を含有するベクターをタバコ植物内に導入し、(ii)該タバコ植物において該ベクターを発現させる工程を含む。この方法の望ましい実施形態においては、ニコチンデメチラーゼの発現がサイレンシングされる。他の望ましい実施形態においては、該ベクターはRNA、例えばアンチセンスRNA、またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子を発現する。
もう1つの望ましい態様においては、本発明は、ニコチンデメチラーゼ酵素活性を低下もしくは変化させる(例えば遺伝子発現をサイレンシングする)またはニコチンデメチラーゼ核酸配列の特定のための分子マーカーとして働きうる、配列番号7の配列またはその断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするイントロンを含有する単離された核酸分子に関する。望ましい実施形態においては、該イントロンは、(a)配列番号4の塩基対2950-3946、または(b)配列番号4の塩基対2950-3946により定められる配列の200個の連続的塩基対と同一の少なくとも200個の連続的塩基対、または(c)配列番号4の塩基対2950-3946に記載されている配列の連続的な20塩基対部分と配列において同一である20塩基対ヌクレオチド部分を含む。
本発明のもう1つの望ましい態様は、ニコチンデメチラーゼ酵素活性を低下もしくは変化させる(例えば遺伝子発現をサイレンシングする)またはニコチンデメチラーゼ核酸配列の特定のための分子マーカーとして働きうる、配列番号7の配列またはその断片に対して50%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸イントロンに関する。遺伝子発現をサイレンシングすることは、例えば、相同組換え(例えば、配列番号188の配列またはその断片を使用するもの)、またはニコチンデメチラーゼ活性を有さない遺伝子産物を与える変異を含みうる。特に、該イントロンは配列番号7の配列または配列番号7から入手可能な断片を含みうる。望ましくは、イントロンを含む単離された核酸分子は異種核酸配列に機能しうる形で連結されており、この配列は、望ましくは、発現ベクター内に含有されうる。もう1つの実施形態においては、該発現ベクターは細胞、例えば植物細胞内に含有されている。特に、該細胞はタバコ細胞でありうる。発現ベクター内で異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号7の配列または配列番号7から入手可能な断片を含有する植物細胞植物などの植物、例えばタバコ植物は、本発明のもう1つの望ましい実施形態である。更に、異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号7にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするイントロンを含有する、植物からの種子、例えばタバコ種子も望ましい。更に、本発明は、本発明のこの態様のイントロンを含有する発芽種子に由来する植物、該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、および該緑葉または乾燥葉から製造された製造品に関する。
本発明のもう1つの態様は、植物においてイントロンを発現させるための方法に関する。この方法は、(i)異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号7の配列または配列番号7から入手可能な断片を含有するベクターを植物細胞内に導入し、(ii)該細胞から植物を再生させることを含む。望ましい実施形態においては、この方法は、(iii)該ベクターを後代へ性的に伝達させることを含むことが可能であり、該後代により産生された種子を集める工程を含むことが可能である。該方法は、望ましくは、例えば、発芽種子から植物を再生させること、該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、および該葉に由来する製造品の製造方法を含む。
更にもう1つの態様においては、本発明は、タバコ植物におけるニコチンデメチラーゼの発現を低下させるための方法に関する。この方法は、(i)異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号7の配列または配列番号7から入手可能な断片を含有するベクターをタバコ植物内に導入し、(ii)該タバコ植物において該ベクターを発現させる工程を含む。この方法の望ましい実施形態においては、ニコチンデメチラーゼの発現がサイレンシングされる。他の望ましい実施形態においては、該ベクターはRNA、例えばアンチセンスRNA、またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子を発現する。
もう1つの望ましい態様においては、本発明は、遺伝子の発現パターンを変化させニコチンデメチラーゼ酵素活性を低下もしくは変化させうる(例えば遺伝子発現をサイレンシングする)またはニコチンデメチラーゼ核酸配列の特定のためのマーカーとして使用されうる、配列番号9の配列またはその断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする非翻訳領域を含有する単離された核酸分子に関する。本発明のこの態様の望ましい実施形態においては、該非翻訳領域は、(a)配列番号4の塩基対4563-6347、または(b)配列番号4の塩基対4563-6347により定められる配列の200個の連続的塩基対と同一の少なくとも200個の連続的塩基対、または(c)配列番号4の塩基対4563-6347に記載されている配列の連続的な20塩基対部分と配列において同一である20塩基対ヌクレオチド部分を含む。
本発明のもう1つの望ましい態様は、配列番号9の配列またはその断片に対して50%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有する単離された核酸非翻訳領域に関する。望ましくは、該非翻訳領域は配列番号9の配列を含み、該非翻訳領域は、遺伝子の発現パターンを変化させニコチンデメチラーゼ酵素活性を低下もしくは変化させる(例えば遺伝子発現をサイレンシングする)またはニコチンデメチラーゼ核酸配列の特定のためのマーカーとして使用されうる、配列番号9から入手可能な断片を含む。該非翻訳領域は、望ましくは、異種核酸配列に機能しうる形で連結されており、発現ベクター内に含有されうる。更に、この発現ベクターは、望ましくは、細胞、例えば植物細胞、例えばタバコ細胞内に含有されている。本発明のもう1つの望ましい実施形態は、配列番号9の配列に対して50%以上の配列同一性を有し異種核酸配列に機能しうる形で連結された単離された核酸配列を含むベクターを含有する植物細胞植物などの植物、例えばタバコ植物に関する。
本発明はまた、異種核酸配列に機能しうる形で連結された配列番号9にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする非翻訳領域を含む、植物からの種子、例えばタバコ種子に関する。更に、本発明は、本発明のこの態様の非翻訳領域を含有する発芽種子に由来する植物、該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、および該緑葉または乾燥葉から製造された製造品に関する。
もう1つの態様においては、本発明は、植物において非翻訳領域を発現させるための方法に関する。この方法は、(i)配列番号9の配列に対して50%以上の配列同一性を有し異種核酸配列に機能しうる形で連結された単離された核酸配列を含有するベクターを植物細胞内に導入し、(ii)該細胞から植物を再生させることを含む。また、この方法は、(iii)該ベクターを後代へ性的に伝達させることを含むことが可能であり、望ましくは、該後代により産生された種子を集める追加的工程を含むことが可能である。該方法は、望ましくは、例えば、発芽種子から植物を再生させること、該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、および該緑葉または乾燥葉から製造される製造品の製造方法を含む。
更に、本発明は、タバコ植物におけるニコチンデメチラーゼの発現を低下または変化させるための方法に関する。この方法は、(i)配列番号9の配列に対して50%以上の配列同一性を有し異種核酸配列に機能しうる形で連結された単離された核酸配列を含有するベクターをタバコ植物内に導入し、(ii)該タバコ植物において該ベクターを発現させる工程を含む。望ましくは、ニコチンデメチラーゼの発現がサイレンシングされる。他の望ましい実施形態においては、該ベクターはRNA、例えばアンチセンスRNA、またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子を発現する。
本発明のもう1つの態様は、該単離核酸分子によりコードされるニコチンデメチラーゼの発現を導きうる、ニコチンデメチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を含む発現ベクターに関する。望ましくは、該ベクターは配列番号4または配列番号5の配列を含む。他の望ましい実施形態においては、本発明は、ニコチンを脱メチル化するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を含む、植物または植物成分、例えばタバコ植物または植物成分(例えば、タバコ葉または茎)に関する。
本発明のもう1つの態様は、ニコチンデメチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含有する細胞に関する。望ましくは、この細胞は植物細胞または細菌細胞、例えばAgrobacteriumである。
本発明のもう1つの態様は、植物または植物成分において発現される、ニコチンデメチラーゼをコードする単離された核酸分子を含有する該植物または該植物成分(例えば、タバコ葉または茎)に関する。望ましくは、該植物または植物成分は被子植物、双子葉植物、ナス科植物、またはNicotiana種である。この態様の他の望ましい実施形態は、種子または該植物または植物成分からの細胞、ならびに該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、およびそれらから製造された製造品である。
もう1つの態様においては、本発明は、例えば、配列番号3の配列を含みニコチンを脱メチル化するようなポリペプチドをコードする核酸配列の発現の低下を伴うタバコ植物に関する。ここで、該発現低下(または酵素活性の低下)は該植物内のノルニコチンのレベルを低下させる。望ましい実施形態においては、該タバコ植物はトランスジェニック植物、例えば、該トランスジェニック植物において発現されると内因性タバコニコチンデメチラーゼの遺伝子発現をサイレンシングするトランスジーンを含むものである。
特に、該トランスジェニック植物は、望ましくは、以下のうちの1以上を含む:タバコニコチンデメチラーゼのアンチセンス分子またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子を発現するトランスジーン;トランスジェニック植物において発現されるとタバコニコチンデメチラーゼの発現を共抑制するトランスジーン;ドミナントネガティブ遺伝子産物、例えば、配列番号3のアミノ酸配列の変異形態をコードするトランスジーン;配列番号3のアミノ酸配列をコードする遺伝子内の点変異;タバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子内の欠失;およびタバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子内の挿入。
他の望ましい実施形態においては、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現の低下は転写レベル、翻訳レベルまたは翻訳後レベルで生じる。
本発明のもう1つの態様は、自身のゲノム内に安定に組込まれた組換え発現カセットを含有するタバコ植物に関する。ここで、該カセットは、ニコチンデメチラーゼ活性の低下をもたらしうる。このタバコ植物の種子は、望ましい実施形態における主題である。他の望ましい実施形態は、この植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)およびそれらに由来する製造品を含む。
本発明のもう1つの態様は、植物においてタバコニコチンデメチラーゼを発現させるための方法に関する。この方法は、(i)ニコチンデメチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を含む発現ベクターを植物細胞内に導入し、(ii)該細胞から植物を再生させることを含む。望ましい実施形態においては、この方法は、該ベクターを後代へ性的に伝達させることを含み、望ましくは、該後代により産生された種子を集める追加的工程をも含む。更なる望ましい実施携帯は、該発芽種子に由来する植物、該植物に由来する葉(緑葉または乾燥葉)、および該緑葉または乾燥葉から製造される製造品を含む。
本発明のもう1つの態様は、実質的に純粋なタバコニコチンデメチラーゼに関する。望ましくは、このタバコニコチンデメチラーゼは、配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または配列番号3のアミノ酸配列を含む。望ましい実施形態においては、該タバコニコチンデメチラーゼは、植物細胞内で発現されると、ニコチンをノルニコチンへ変換する。他の望ましい実施形態においては、該タバコニコチンデメチラーゼは、植物細胞内で発現されると、主として葉に局在化し、あるいは該タバコニコチンデメチラーゼはエチレンにより誘導され、または植物の老化過程で発現される。
もう1つの態様においては、本発明は、タバコニコチンデメチラーゼを特異的に認識しそれに結合する実質的に純粋な抗体に関する。望ましくは、該抗体は組換えタバコニコチンデメチラーゼ(例えば、配列番号3の配列またはその断片を含有するもの)を認識し、それに結合する。
本発明のもう1つの態様はタバコニコチンデメチラーゼの製造方法に関する。この方法は、(a)ニコチンを脱メチル化するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する単離された核酸分子で形質転換された細胞を準備し、(b)その単離された核酸分子を発現させるための条件下、該形質転換細胞を培養し、(c)タバコニコチンデメチラーゼを回収する工程を含む。本発明はまた、この方法により製造された組換えタバコニコチンデメチラーゼに関する。
もう1つの態様においては、本発明は、タバコニコチンデメチラーゼまたはその断片を単離するための方法に関する。この方法は、(a)配列番号4、5、7、8または9の核酸配列に対して少なくとも70%またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列に示す核酸配列に対して少なくとも70%以上の配列同一性を有する核酸配列の検出をもたらすハイブリダイゼーション条件下、配列番号4、5、7、8もしくは9またはそれらの一部の核酸分子を植物細胞からの核酸調製物と接触させ、(b)ハイブリダイズする核酸配列を単離する工程を含む。
もう1つの態様においては、本発明は、タバコニコチンデメチラーゼまたはその断片を単離するためのもう1つの方法に関する。この方法は、(a)植物細胞DNAのサンプル準備し、(b)配列番号4、5、7、8または9の配列を有する核酸分子の領域に対して配列同一性を有するオリゴヌクレオチドのペアを準備し、(c)ポリメラーゼ連鎖反応によるDNA増幅に適した条件下、オリゴヌクレオチドのペアを該植物細胞DNAと接触させ、(d)増幅されたタバコニコチンデメチラーゼまたはその断片を単離する工程を含む。この態様の望ましい実施形態においては、植物細胞から調製されたcDNAのサンプルを使用して、該増幅工程を行う。もう1つの望ましい実施形態においては、タバコニコチンデメチラーゼは、配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも70%同一であるポリペプチドをコードする。
本発明のもう1つの態様は、植物または植物成分におけるタバコニコチンデメチラーゼの発現を低下させるための方法に関する。この方法は、(a)植物細胞内で機能的なプロモーターに機能しうる形で連結されたタバコニコチンデメチラーゼをコードするトランスジーンを該植物細胞内に導入して、形質転換植物細胞を得、(b)該形質転換植物細胞から植物または植物成分を再生させる工程を含み、ここで、該タバコニコチンデメチラーゼは該植物または植物成分の細胞において発現され、それにより植物または植物成分におけるタバコニコチンデメチラーゼの発現が低下する。本発明のこの態様の特定の実施形態においては、タバコニコチンデメチラーゼをコードするトランスジーンは組織特異的、細胞特異的または器官特異的に誘導的に発現され又は構成的に発現される。本発明のこの態様のもう1つの実施形態においては、該トランスジーンの発現は内因性タバコニコチンデメチラーゼまたは本明細書に記載の任意の他のポリペプチドの発現を共抑制する。
本発明のもう1つの態様は、植物または植物成分におけるタバコニコチンデメチラーゼまたは本明細書に記載の他の任意のポリペプチドの発現を低下させるためのもう1つの方法に関する。この方法は、(a)植物細胞内で機能的なプロモーターに機能しうる形で連結された、タバコニコチンデメチラーゼのアンチセンスコード配列またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子をコードするトランスジーンを、該植物細胞内に導入して、形質転換植物細胞を得、(b)該形質転換植物細胞から植物または植物成分を再生させる工程を含み、ここで、タバコニコチンデメチラーゼのコード配列のアンチセンスまたはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子は該植物または植物成分の細胞において発現され、それにより、植物または植物成分におけるタバコニコチンデメチラーゼの発現が低下する。望ましくは、タバコニコチンデメチラーゼのアンチセンス配列またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子をコードするトランスジーンは、例えば組織特異的、細胞特異的または器官特異的に誘導的に発現され、あるいは構成的に発現される。他の望ましい実施形態においては、タバコニコチンデメチラーゼのコード配列のアンチセンスまたはRNAiを誘導しうるRNA分子は、配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号62、配列番号188またはそれらの断片の相補体を含有する。
本発明のもう1つの態様は、植物または植物成分におけるタバコニコチンデメチラーゼの発現を低下させるための更にもう1つの方法に関する。この方法は、(a)植物細胞内で機能的なプロモーターに機能しうる形で連結されたタバコニコチンデメチラーゼのドミナントネガティブ遺伝子産物をコードするトランスジーンを該植物細胞内に導入して、形質転換植物細胞を得、(b)該形質転換植物細胞から植物または植物成分を再生させることを含み、ここで、該タバコニコチンデメチラーゼのドミナントネガティブ遺伝子産物は該植物または植物成分の細胞において発現され、それにより、植物または植物成分におけるタバコニコチンデメチラーゼの発現が低下する。本発明のこの態様の特定の実施形態においては、該ドミナントネガティブ遺伝子産物をコードするトランスジーンは、例えば組織特異的、細胞特異的または器官特異的に誘導的に発現され、あるいは構成的に発現される。
本発明のもう1つの態様は、植物細胞におけるタバコニコチンデメチラーゼの発現または酵素活性を低下させるためのもう1つの方法に関する。この方法は、該植物細胞における内因性タバコニコチンデメチラーゼのレベルを低下させることを含む。望ましくは、該植物細胞は双子葉植物、ナス科植物、またはNicotiana種に由来する。この態様の望ましい実施形態においては、内因性タバコニコチンデメチラーゼのレベルを低下させることは、タバコニコチンデメチラーゼのアンチセンス核酸分子またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子をコードするトランスジーンを植物細胞において発現させることを含み、あるいはタバコニコチンデメチラーゼの二本鎖RNA分子をコードするトランスジーンを植物細胞において発現させることを含む。望ましくは、二本鎖RNAは、配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号62、配列番号188の配列またはそれらの断片に対応するRNA配列である。もう1つの実施形態においては、内因性タバコニコチンデメチラーゼのレベルを低下させることは、該植物細胞における内因性タバコニコチンデメチラーゼの共抑制を含み、あるいは該植物細胞においてドミナントネガティブ遺伝子産物を発現させることを含む。特に、該ドミナントネガティブ遺伝子産物は、配列番号3のアミノ酸配列または本明細書に記載の任意の他のアミノ酸配列の変異型をコードする遺伝子を含みうる。
本発明のこの態様の他の望ましい実施形態においては、内因性タバコニコチンデメチラーゼは、配列番号3のアミノ酸配列をコードする遺伝子内に点変異を含む。他の望ましい実施形態においては、内因性タバコニコチンデメチラーゼの発現のレベルを低下させることは、タバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子内の欠失を伴い、またはタバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子内の挿入を伴う。発現の低下は転写レベル、翻訳レベルまたは翻訳後レベルで生じうる。
本発明のもう1つの態様は、細胞におけるタバコニコチンデメチラーゼの発現を変化させる化合物を特定するための方法に関する。この方法は、(a)タバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子を含有する細胞を準備し、(b)該細胞に候補化合物を適用し、(c)該タバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子の発現を測定する工程を含み、ここで、未処理対照サンプルに対する発現における上昇または低下は、該化合物が該タバコニコチンデメチラーゼの発現を変化させることを示す。
この方法の望ましい実施形態においては、項目(a)の遺伝子は、配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するタバコニコチンデメチラーゼをコードする。望ましくは、該化合物は、該タバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子の発現を低下または上昇させる。
もう1つの態様においては、本発明は、細胞におけるタバコニコチンデメチラーゼの活性を変化させる化合物を特定するためのもう1つの方法に関する。この方法は、(a)タバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子を発現する細胞を準備し、(b)該細胞に候補化合物を適用し、(c)該タバコニコチンデメチラーゼの活性を測定する工程を含み、ここで、未処理対照サンプルに対する活性における上昇または低下は、該化合物が該タバコニコチンデメチラーゼの活性を変化させることを示す。本発明のこの態様の望ましい実施形態においては、項目(a)の遺伝子は、配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するタバコニコチンデメチラーゼをコードする。望ましくは、該化合物は、該タバコニコチンデメチラーゼの活性を低下または上昇させる。
本発明のもう1つの態様は、(i)低下したレベルのニコチンデメチラーゼまたは(ii)変化した酵素活性を有するニコチンデメチラーゼおよび低下した量のニトロソアミンを含有する乾燥タバコ植物または植物成分に関する。望ましくは、該植物成分はタバコ葉またはタバコ茎である。望ましい実施形態においては、該ニトロソアミンはノルニコチンであり、ノルニコチンの含量は、望ましくは5 mg/g未満、4.5 mg/g未満、4.0 mg/g未満、3.5 mg/g未満、3.0 mg/g未満、より望ましくは2.5 mg/g未満、2.0 mg/g未満、1.5 mg/g未満、1.0 mg/g未満、より望ましくは750 μg/g未満、500 μg/g未満、250 μg/g未満、100 μg/g未満、より一層望ましくは75 μg/g未満、50 μg/g未満、25 μg/g未満、10 μg/g未満、7.0 μg/g未満、5.0 μg/g未満、4.0 μg/g未満、より一層望ましくは2.0 μg/g未満、1.0 μg/g未満、0.5 μg/g未満、0.4 μg/g未満、0.2 μg/g未満、0.1 μg/g未満、0.05 μg/g未満または0.01 μg/g未満であり、あるいは、ここで、それに含有される全アルカロイド含量に対する二次アルカロイドの比率(%)は90%未満、70%未満、50%未満、30%未満、10%未満、望ましくは5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1.5%未満、1%未満、より望ましくは0.75%未満、0.5%未満、0.25%未満または0.1%未満である。もう1つの望ましい実施形態においては、ニトロソアミンはN'-ニトロソノルニコチン(NNN)であり、N'-NNNの含量は、望ましくは5 mg/g未満、4.5 mg/g未満、4.0 mg/g未満、3.5 mg/g未満、3.0 mg/g未満、より望ましくは2.5 mg/g未満、2.0 mg/g未満、1.5 mg/g未満、1.0 mg/g未満、より望ましくは750 μg/g未満、500 μg/g未満、250 μg/g未満、100 μg/g未満、より一層望ましくは75 μg/g未満、50 μg/g未満、25 μg/g未満、10 μg/g未満、7.0 μg/g未満、5.0 μg/g未満、4.0 μg/g未満、より一層望ましくは2.0 μg/g未満、1.0 μg/g未満、0.5 μg/g未満、0.4 μg/g未満、0.2 μg/g未満、0.1 μg/g未満、0.05 μg/g未満または0.01 μg/g未満であり、あるいは、ここで、それに含有される全アルカロイド含量に対する二次アルカロイドの比率(%)は90%未満、70%未満、50%未満、30%未満、10%未満、望ましくは5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1.5%未満、1%未満、より望ましくは0.75%未満、0.5%未満、0.25%未満または0.1%未満である。本発明のこの態様の更なる望ましい実施形態においては、乾燥タバコ植物または植物成分は、いぶし(dark)タバコ、バーレータバコ。火力乾燥(フルーキュアリング)タバコ、バージニア、空気乾燥(エアキュアリング)タバコまたはオリエンタルタバコが挙げられる。
更に、本発明の乾燥タバコ植物または植物成分は、望ましくは、組換えニコチンデメチラーゼ遺伝子、例えば、配列番号4もしくは配列番号5の配列またはその断片を含有するものを含む。望ましくは、乾燥タバコ植物または植物成分における内因性ニコチンデメチラーゼ遺伝子または本明細書に記載の任意の他の核酸配列の発現がサイレンシングされる。
本発明のもう1つの態様は、(i)発現が低下したニコチンデメチラーゼもしくは本明細書に記載の任意の他のポリペプチドまたは(ii)変化した活性を有するニコチンデメチラーゼもしくは本明細書に記載の別のポリペプチドおよび低下した量のニトロソアミンを含む乾燥タバコ植物または植物成分を含有するタバコ製品に関する。望ましくは、該タバコ製品は無煙タバコ製品、湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコまたはビーディ(bidi)が含まれる。特に、本発明のこの態様のタバコ製品は、いぶし(dark)タバコ、粉砕タバコを含有することが可能であり、あるいは香味成分を含みうる。
本発明はまた、(i)発現が低下したニコチンデメチラーゼまたは(ii)変化(例えば低下)した酵素活性を有するニコチンデメチラーゼおよび低下した量のニトロソアミンを含有するタバコ製品、例えば無煙タバコ製品の製造方法に関する。この方法は、(i)低下したレベルのニコチンデメチラーゼまたは(ii)変化した酵素活性を有するニコチンデメチラーゼおよび低下した量のニトロソアミンを含有する乾燥タバコ植物または植物成分を準備し、該乾燥タバコ植物または植物成分から該タバコ製品を製造することを含む。
定義
「酵素活性」は、脱メチル化、ヒドロキシル化、エポキシ化、N-酸化、スルホ酸化、N-、S-およびO-脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化ならびにアゾ、ニトロ、N-オキシドおよび他のそのような酵素反応性化学基の還元を包含する(これらに限定されるものではない)と意図される。変化した酵素活性(酵素活性の変化)は、対照酵素(例えば、野生型タバコ植物タバコニコチンデメチラーゼ)の活性に対して少なくとも10〜20%、好ましくは少なくとも25〜50%、より好ましくは少なくとも55〜95%またはそれ以上の(例えば、タバコニコチンデメチラーゼの)酵素活性の低下を意味する。酵素(例えば、ニコチンデメチラーゼ)の活性は、当技術分野における標準的な方法を用いて、例えば本明細書に記載の酵母ミクロソームアッセイを用いてアッセイされうる。
「核酸」なる語は、一本鎖もしくは二本鎖形態またはセンスもしくはアンチセンスのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体を意味し、特に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似した様態で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知類似体を含む。特に示さない限り、特定の核酸配列はその相補的配列を含む。「機能しうる形で連結された」、「機能的組合せ」および「機能的順序」なる語は、核酸発現制御配列(例えば、プロモーター、シグナル配列または一連の転写因子結合部位)と第2の核酸配列との間の機能的連結を意味し、この場合、該発現制御配列は、該第2配列に対応する核酸の転写および/または翻訳に影響を及ぼす。望ましくは、機能しうる形で連結された核酸配列は、完全長遺伝子を形成するよう同一遺伝子の他の配列に連結された遺伝子の断片を意味する。
細胞に関して用いられている場合の「組換え」なる語は、細胞が異種核酸を複製し、該核酸を発現し、または異種核酸によりコードされるペプチド、異種ペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、遺伝子または遺伝子断片を、センスもしくはアンチセンス形態で、または該細胞の天然(非組換え)形態においては見出されないRNA干渉(RNAi)を誘導するRNA分子として発現しうる。組換え細胞は、該細胞の天然形態で見出されるが人工的手段により修飾され該細胞内に再導入された遺伝子をも発現しうる。
「構造遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチドまたはその一部をコードするDNAセグメントを含む遺伝子の部分であり、これは、例えば、転写の開始を駆動する5'配列または3'UTRを含まない。あるいは、構造遺伝子は非翻訳可能産物をコードしうる。構造遺伝子は、該細胞内に通常見出されるもの、または該細胞もしくは細胞位置には通常見いだされないもの(それが導入される場合には、それは「異種遺伝子」と称される)でありうる。異種遺伝子は、全体的または部分的に、当技術分野で公知の任意の起源(細菌ゲノムもしくはエピソーム、真核、核もしくはプラスミドDNA、cDNA、ウイルスDNAまたは化学合成DNAを含む)に由来しうる。構造遺伝子は、生物活性もしくはその特性、発現産物の生物活性もしくは化学構造、発現の速度または発現制御の様態に影響を及ぼしうる1以上の修飾を含有しうる。そのような修飾には、1以上のヌクレオチドの変異、挿入、欠失および置換が含まれるが、これらに限定されるものではない。
構造遺伝子は非分断コード配列を構成することが可能であり、あるいはそれは、適当なスプライス部位に隣接した1以上のイントロンを含みうる。構造遺伝子は翻訳可能または非翻訳可能であることが可能であり、アンチセンス、またはRNA干渉(RNAi)を誘導しうるRNA分子を含みうる。構造遺伝子は、複数の起源および複数の遺伝子配列(天然物または合成物であり、ここで、合成物は、化学合成されたDNAを意味する)に由来するセグメントの複合物でありうる。
核酸配列に関して本明細書中で用いる「エキソン」は遺伝子の核酸配列の一部を意味し、ここで、エキソンの核酸配列は遺伝子産物のアミノ酸の少なくとも1つをコードしている。エキソンは、典型的には、イントロンのような非コードDNAセグメントに隣接している。
核酸配列に関して本明細書中で用いる「イントロン」は、コード領域に隣接する遺伝子の非コード領域を意味する。イントロンは、典型的には、RNA分子には転写されるが次いでメッセンジャーRNAまたは他の機能的構造RNAの産生中にRNAスプライシングにより切除される遺伝子の非コード領域である。
核酸配列に関して本明細書中で用いる「3'UTR」は、エキソンの終止コドンに近い非コード核酸配列を意味する。
「由来する」は、起源体(化学的および/または生物学的)から採取、入手、受領、追跡、複製または伝達されることを意味する。誘導体は、起源体の化学的または生物学的操作(置換、付加、挿入、欠失、抽出、単離、変異および複製を含むが、これらに限定されるものではない)により製造されうる。
DNAの配列に関する「化学合成」は、成分ヌクレオチドの一部がin vitroで構築されたことを意味する。DNAの手動化学合成は、十分に確立された方法(Caruthers, Methodology of DNA and RNA Sequencing, (1983), Weissman (編), Praeger Publishers, New York, Chapter 1)を用いて達成されうる。自動化学合成は、多数の商業的に入手可能な装置の1つを使用して行われうる。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithおよびWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズム(GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるもの))のコンピューター化実行、または精査により行われうる。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschulら, 1990)は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxに関する使用のために、National Center for Biological Information (NCBI, Bethesda, Md.)を含むいくつかの入手源から、あるいはインターネット上で入手可能である。それはhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTでアクセスされうる。このプログラムを使用する配列同一性の決定方法はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.htmlにおいて入手可能である。
本明細書中でアミノ酸配列に関して用いる「実質的なアミノ酸同一性」または「実質的なアミノ酸配列同一性」なる語は、図10〜159、160A〜160E、162〜170および172-1〜172-19に示すタンパク質配列と比較して少なくとも70%の配列同一性、好ましくは80%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは90%のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも99〜100%の配列同一性を有する配列をペプチドが含むという、ポリペプチドの特性を示す。望ましくは、ニコチンデメチラーゼの場合には、配列比較は、翻訳されたペプチドのシトクロムp450モチーフGXRXCX(G/A)(配列番号2265)の後から終止コドン領域までに関して行われる。
本明細書中でアミノ酸配列に関して用いる「実質的な核酸同一性」または「実質的な核酸配列同一性」なる語は、翻訳されたペプチドのシトクロムp450モチーフGXRXCX(G/A)(2265)をコードする領域の後から終止コドンまでの第1核酸に対応する領域にわたって参照グループと比較して少なくとも50%、好ましくは60、65、70または75%の配列同一性、より好ましくは81または91%の核酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも95、99または更には100%の配列同一性を有する配列をポリヌクレオチドが含むという、該ポリヌクレオチド配列の特性を示す。
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。ストリンジェントな条件は配列によって様々であり、状況によって異なるであろう。一般には、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱融解点(Tm)より約5℃〜約22℃、通常は約10℃〜約15℃低い温度となるよう選ばれる。Tmは、標的配列の50%がマッチプローブにハイブリダイズする(一定のイオン強度およびpHにおける)温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がpH7で約0.02モル濃度であり温度が少なくとも約60℃であるものである。例えば標準的なサザンハイブリダイゼーション法においては、ストリンジェントな条件は、6×SSC中、42℃での初期洗浄、およびそれに続く0.2×SSC中、少なくとも約55℃、典型的には約60℃、しばしば約65℃の温度での1回以上の追加的洗浄を含むであろう。
また、本発明の目的においては、ヌクレオチド配列が、実質的に同一のポリペプチドおよび/タンパク質をコードしている場合には、それらのヌクレオチド配列は実質的に同一である。したがって、1つの核酸配列が、第2の核酸配列と実質的に同じポリペプチドをコードしている場合には、それらの核酸配列は、遺伝暗号により許容される縮重(コドンの縮重および遺伝暗号の説明は、Darnellら (1990) Molecular Cell Biology, Second Edition Scientific American Books W. H. Freeman and Company New Yorkを参照されたい)が原因でストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない場合であっても、実質的に同一である。タンパク質の純度または均一性は、当技術分野でよく知られた多数の手段、例えばタンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそれに続く染色後の可視化により示されうる。ある目的には、高い分離能が要求されることがあり、HPLCまたは同様の精製手段が用いられうる。
タバコニコチンデメチラーゼのような特定のポリペプチドに「特異的に結合」または該ポリペプチドを「特異的に認識」する抗体は、等量の任意の他のタンパク質に対してよりも該ポリペプチドに対して高いアフィニティを有する抗体を意味する。望ましい抗体は、図1、図3および4、図10〜158、図160A〜160E、図162〜170ならびに図172-1〜172-19に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体である。例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含有するタバコニコチンデメチラーゼに特異的に結合する抗体は、望ましくは、関連抗原を含む等量の任意の他の抗原より少なくとも2倍、5倍、10倍、30倍または100倍大きい、その抗原に対するアフィニティを有する。抗原(例えば、タバコニコチンデメチラーゼ)に対する抗体の結合は、多数の標準的な方法、例えばウエスタン分析、ELISAまたは共沈法により測定されうる。ポリペプチド(例えば、ニコチンデメチラーゼ)に特異的に結合する抗体も、該ポリペプチドの精製に有用である。
本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、DNAセグメントを細胞内に移入する核酸分子に関して用いられる。ベクターは、DNAを複製するよう作用することが可能であり、宿主細胞内で独立して再生しうる。「ビヒクル」なる語は「ベクター」と互換的に用いられることがある。本明細書中で用いる「発現ベクター」なる語は、特定の宿主生物における機能しうる形で連結されたコード配列の発現に必要な適当な核酸配列および所望のコード配列を含有する組換えDNA分子を意味する。原核生物における発現に必要な核酸配列は、通常、プロモーター、オペレーター(随意的)およびリボソーム結合部位を、しばしば他の配列と共に含む。望ましくは、該プロモーターは、配列番号8の配列または転写を駆動するその断片を含む。配列番号8の配列に対して少なくとも50%、60%、75%、80%、90%、95%または更には99%の配列同一性を有し転写を駆動するプロモーター配列も望ましい。真核細胞はプロモーター、エンハンサーならびに終結およびポリアデニル化シグナル、例えば配列番号9の3'UTR配列を利用することが知られている。いくつかの場合には、植物発現ベクターは、安定な発現のためには、植物由来のイントロン(例えば、配列番号7の配列を有するイントロン)の存在を要することが認められている。したがって、本明細書中で更に詳しく説明するとおり、配列番号7の配列または適当なRNAスプライス部位を有する任意の他のイントロンが使用されうる。望ましいベクターには、図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19または図173-1〜173-294に示す核酸配列が含まれる。
根を有する完全な遺伝子操作植物を再生させるためには、例えばin vitro接種のような任意の技術により、あるいは完全な植物に再生されうる形質転換植物細胞を得るための任意の公知のin vitro組織培養技術により、核酸を植物細胞内に挿入することが可能である。したがって、例えば、植物細胞内への挿入は、病原性または非病原性A tumefaciensによるin vitro接種によるものでありうる。他のそのような組織培養技術も用いられうる。
「植物組織」、「植物成分」または「植物細胞」には、植物の分化および未分化組織が含まれ、限定的なものではないが根、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織および培養内の種々の形態の細胞、例えば単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織が含まれる。植物組織はイン・プランタ(in planta)または器官、組織または細胞培養内のものでありうる。
本明細書中で用いる「植物細胞」は、イン・プランタ(in planta)の植物細胞、ならびに培養内の植物細胞およびプロトプラストを含む。「cDNA」または「相補的DNA」は、一般には、イントロンを含有するプロセシングされていないRNA分子に相補的な又はイントロンを欠くプロセシングされたmRNAに相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖DNA分子を意味する。cDNAはRNA鋳型に対する逆転写酵素の作用により形成される。
本明細書中で用いる「タバコ」は、火力乾燥(フルーキュアリング)、バージニア、バーレー、いぶし(dark)タバコ、オリエンタル、およびNicotiana属の植物の他のタイプの植物を含む。Nicotiana属の種子はNicotiana tabacumの形態で商業的に容易に入手可能である。
「製造品」または「タバコ製品」は、湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコ、ビーディ(bidi)および同様のタバコ由来製品のような製品を含む。
「遺伝子サイレンシング」は、対照植物(例えば、野生型タバコ植物)におけるレベルに対して少なくとも30〜50%、好ましくは少なくとも50〜80%、より好ましくは少なくとも80〜95%またはそれ以上の遺伝子発現(例えば、タバコニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子の発現)のレベルの低下を意味する。そのような発現レベルの低下は、当技術分野で公知の標準的な方法、例えばRNA干渉、三本鎖干渉、リボザイム、相同組換え、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング、アンチセンスおよび共抑制技術、ドミナントネガティブ遺伝子産物の発現、標準的な変異誘発技術を用いる変異遺伝子の生成(例えば、本明細書に記載されているもの)を用いることにより達成されうる。タバコニコチンデメチラーゼポリペプチドまたは転写産物またはそれらの両方のレベルは、限定的なものではないがノーザンブロット法、RNアーゼプロテクションまたは免疫ブロット法を含む任意の標準的な技術によりモニターされる。
アミノ酸配列の「断片」または「一部(部分)」は、図1、3、4、10〜158、160A〜160E、162〜170および172-1〜172-19に示すアミノ酸配列のいずれかの少なくとも例えば20、15、30、50、75、100、250、300、400または500個の連続的アミノ酸を意味する。典型的な望ましい断片は配列番号3の配列のアミノ酸1-313および配列番号3の配列のアミノ酸314-517ならびに配列番号2および63の配列である。また、核酸配列の断片または一部に関しては、望ましい断片は、1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列のいずれかの少なくとも100、250、500、750、1000または1500個の連続的アミノ酸を含む。典型的な望ましい断片は配列番号4の配列の核酸1-2009、2010-2949、2950-3946、3947-4562、4563-6347および4731-6347である。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然でそれに付随するほとんどの成分から分離されたポリペプチドを意味する。しかし、少なくとも8.3pKa/mgタンパク質の酵素活性を有する調製物に伴うミクロソーム画分において見出される他のタンパク質も、実質的に純粋なポリペプチドであるとみなされる。典型的には、該ポリペプチドは、それに天然で付随するタンパク質および天然に存在する有機分子からそれが少なくとも60重量%フリーである場合に実質的に純粋である。好ましくは、該調製物は少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、最も好ましくは少なくとも99重量%の所望のポリペプチドを含有する。実質的に純粋なポリペプチドは、例えば、天然源(例えば、タバコ植物細胞)からの抽出、該ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または該タンパク質の化学合成により得られうる。純度は、任意の適当な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析により測定されうる。
「単離された核酸分子」は、生物のゲノム内の核酸分子の配列に天然で隣接している核酸配列を含有しない核酸配列を意味する。
「形質転換細胞」は、組換えDNA技術によりDNA分子[例えば、タバコニコチンデメチラーゼをコードするDNA分子または本明細書に開示する核酸配列(例えば、1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列)のいずれか]が導入された細胞(またはその祖先)を意味する。
本明細書中で用いる「タバコニコチンデメチラーゼ」または「ニコチンデメチラーゼ」は、配列番号3の配列に実質的と同一であるポリペプチドを意味する。望ましくは、タバコニコチンデメチラーゼは、ニコチン(C10H14N2、3-(1-メチル-2-ピロリジニル)ピリジンとも称される)をノルニコチン(C9H12N2)へ変換しうる。タバコニコチンデメチラーゼの活性は、当技術分野において標準的な方法を用いて、例えば、本明細書に記載されているとおり、酵母発現ミクロソームによる放射性ニコチンの脱メチル化を測定することによりアッセイされうる。
本明細書中で用いる「シトクロムp450」および「p450」は互換的に用いられる。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかであろう。
図面の簡潔な説明
図1は、D35-BG11 (配列番号1)の核酸配列およびその翻訳産物 (配列番号2)である。
図2は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子のゲノム構造の概要図である。
図3は、ゲノムタバコニコチンデメチラーゼ核酸配列 (配列番号4)およびその翻訳産物 (配列番号3)である。
図4は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子のコード領域の核酸配列 (配列番号5)およびその翻訳産物 (配列番号6)である。
図5は、タバコニコチンデメチラーゼゲノム配列内に存在するイントロンの核酸配列 (配列番号7)である。
図6は、タバコデメチラーゼ遺伝子プロモーターの核酸配列 (配列番号8)である。
図7は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子の3’UTRの核酸配列 (配列番号9)である。
図8は、Geno完全長(“FL”)プライマーセットでのタバコ系統のPCR産物を示す電気泳動イメージである。
図9は、実施例17に記載のプライマーセット(1), (2), (3)および(4)でのタバコ系統のPCR産物を示す電気泳動イメージである。該バンドのおおよそのサイズは、FLに関しては3,500ヌクレオチド(nt)、(1)に関しては2,600 nt、(2)に関しては1,400 nt、(3)に関しては600 ntおよび(4)に関しては1,400 ntである。
図10は、D58-BG7の核酸配列(配列番号10)およびD58-BG7のアミノ酸配列(配列番号11) (これはD58-BG7(配列番号10)の翻訳体である)である。
図11は、D58-AB1の核酸配列(配列番号12)およびD58-AB1のアミノ酸配列(配列番号13) (これはD58-AB1(配列番号12)の翻訳体である)である。
図12は、D186-AH4の核酸配列(配列番号14)およびD186-AH4のアミノ酸配列(配列番号15) (これはD186-AH4(配列番号14)の翻訳体である)である。
図13は、D58-BE4の核酸配列(配列番号16)およびD58-BE4のアミノ酸配列(配列番号17) (これはD58-BE4(配列番号16)の翻訳体である)である。
図14は、D56-AH7の核酸配列(配列番号18)およびD56-AH7のアミノ酸配列(配列番号19) (これはD56-AH7(配列番号18)の翻訳体である)である。
図15は、D13a-5の核酸配列(配列番号20)およびD13a-5のアミノ酸配列(配列番号21) (これはD13a-5(配列番号20)の翻訳体である)である。
図16は、D56-AG10の核酸配列(配列番号22)およびD56-AG10のアミノ酸配列(配列番号23) (これはD56-AG10(配列番号22)の翻訳体である)である。
図17は、D35-33の核酸配列(配列番号24)およびD35-33のアミノ酸配列(配列番号25) (これはD35-33(配列番号24)の翻訳体である)である。
図18は、D34-62の核酸配列(配列番号26)およびD34-62のアミノ酸配列(配列番号27) (これはD34-62(配列番号26)の翻訳体である)である。
図19は、D56-AA7の核酸配列(配列番号28)およびD56-AA7のアミノ酸配列(配列番号29) (これはD56-AA7(配列番号28)の翻訳体である)である。
図20は、D56-AE1の核酸配列(配列番号30)およびD56-AE1のアミノ酸配列(配列番号31) (これはD56-AE1(配列番号30)の翻訳体である)である。
図21は、D35-BB7の核酸配列(配列番号32)およびD35-BB7のアミノ酸配列(配列番号33) (これはD35-BB7(配列番号32)の翻訳体である)である。
図22は、D177-BA7の核酸配列(配列番号34)およびD177-BA7のアミノ酸配列(配列番号35) (これはD177-BA7(配列番号34)の翻訳体である)である。
図23は、D56A-AB6の核酸配列(配列番号36)およびD56A-AB6のアミノ酸配列(配列番号37) (これはD56A-AB6(配列番号36)の翻訳体である)である。
図24は、D144-AE2の核酸配列(配列番号38)およびD144-AE2のアミノ酸配列(配列番号39) (これはD144-AE2(配列番号38)の翻訳体である)である。
図25は、D56-AG11の核酸配列(配列番号40)およびD56-AG11のアミノ酸配列(配列番号41) (これはD56-AG11(配列番号40)の翻訳体である)である。
図26は、D179-AA1の核酸配列(配列番号42)およびD179-AA1のアミノ酸配列(配列番号43) (これはD179-AA1(配列番号42)の翻訳体である)である。
図27は、D56-AC7の核酸配列(配列番号44)およびD56-AC7のアミノ酸配列(配列番号45) (これはD56-AC7(配列番号44)の翻訳体である)である。
図28は、D144-AD1の核酸配列(配列番号46)およびD144-AD1のアミノ酸配列(配列番号47) (これはD144-AD1(配列番号46)の翻訳体である)である。
図29は、D144-AB5の核酸配列(配列番号48)およびD144-AB5のアミノ酸配列(配列番号49) (これはD144-AB5(配列番号48)の翻訳体である)である。
図30は、D181-AB5の核酸配列(配列番号50)およびD181-AB5のアミノ酸配列(配列番号51) (これはD181-AB5(配列番号50)の翻訳体である)である。
図31は、D73-AC9の核酸配列(配列番号52)およびD73-AC9のアミノ酸配列(配列番号53) (これはD73-AC9(配列番号52)の翻訳体である)である。
図32は、D56-AC12の核酸配列(配列番号54)およびD56-AC12のアミノ酸配列(配列番号55) (これはD56-AC12(配列番号54)の翻訳体である)である。
図33は、D58-AB9の核酸配列(配列番号56)およびD58-AB9のアミノ酸配列(配列番号57) (これはD58-AB9(配列番号56)の翻訳体である)である。
図34は、D56-AG9の核酸配列(配列番号58)およびD56-AG9のアミノ酸配列(配列番号59) (これはD56-AG9(配列番号58)の翻訳体である)である。
図35は、D56-AG6の核酸配列(配列番号60)およびD56-AG6のアミノ酸配列(配列番号61) (これはD56-AG6(配列番号60)の翻訳体である)である。
図36は、D35-BG11の核酸配列(配列番号62)およびD35-BG11のアミノ酸配列(配列番号63) (これはD35-BG11(配列番号62)の翻訳体である)である。
図37は、D35-42の核酸配列(配列番号64)およびD35-42のアミノ酸配列(配列番号65) (これはD35-42(配列番号64)の翻訳体である)である。
図38は、D35-BA3の核酸配列(配列番号66)およびD35-BA3のアミノ酸配列(配列番号67) (これはD35-BA3(配列番号66)の翻訳体である)である。
図39は、D34-57の核酸配列 (配列番号68)およびD34-57のアミノ酸配列(配列番号69) (これはD34-57(配列番号68)の翻訳体である)である。
図40は、D34-52の核酸配列(配列番号70)およびD34-52のアミノ酸配列(配列番号71) (これはD34-52(配列番号70)の翻訳体である)である。
図41は、D34-25の核酸配列(配列番号72)およびD34-25のアミノ酸配列(配列番号73) (これはD34-25(配列番号72)の翻訳体である)である。
図42は、D56AD10の核酸配列(配列番号74)およびD56AD10のアミノ酸配列(配列番号75) (これはD56AD10(配列番号74)の翻訳体である)である。
図43は、D56-AA11の核酸配列(配列番号76)およびD56-AA11のアミノ酸配列(配列番号77) (これはD56-AA11(配列番号76)の翻訳体である)である。
図44は、D177-BD5の核酸配列(配列番号78)およびD177-BD5のアミノ酸配列(配列番号79) (これはD177-BD5(配列番号78)の翻訳体である)である。
図45は、D56A-AG10の核酸配列(配列番号80)およびD56A-AG10のアミノ酸配列(配列番号81) (これはD56A-AG10(配列番号80)の翻訳体である)である。
図46は、D58-BC5の核酸配列(配列番号82)およびD58-BC5のアミノ酸配列(配列番号83) (これはD58-BC5(配列番号82)の翻訳体である)である。
図47は、D58-AD12の核酸配列(配列番号84)およびD58-AD12のアミノ酸配列(配列番号85) (これはD58-AD12(配列番号84)の翻訳体である)である。
図48は、D56-AC11の核酸配列(配列番号86)およびD56-AC11のアミノ酸配列(配列番号87) (これはD56-AC11(配列番号86)の翻訳体である)である。
図49は、D35-39の核酸配列(配列番号88)およびD35-39のアミノ酸配列(配列番号89) (これはD35-39(配列番号88)の翻訳体である)である。
図50は、D58-BH4の核酸配列(配列番号90)およびD58-BH4のアミノ酸配列(配列番号91) (これはD58-BH4(配列番号90)の翻訳体である)である。
図51は、D177-BD7の核酸配列(配列番号92)およびD177-BD7のアミノ酸配列(配列番号93) (これはD177-BD7(配列番号92)の翻訳体である)である。
図52は、D176-BF2の核酸配列(配列番号94)およびD176-BF2のアミノ酸配列(配列番号95) (これはD176-BF2(配列番号94)の翻訳体である)である。
図53は、D56-AD6の核酸配列(配列番号96)およびD56-AD6のアミノ酸配列(配列番号97) (これはD56-AD6(配列番号96)の翻訳体である)である。
図54は、D73A-AD6の核酸配列(配列番号98)およびD73A-AD6のアミノ酸配列(配列番号99) (これはD73A-AD6(配列番号98)の翻訳体である)である。
図55は、D70A-BA11の核酸配列(配列番号100)およびD70A-BA11のアミノ酸配列(配列番号101) (これはD70A-BA11(配列番号100)の翻訳体である)である。
図56は、D70A-BB5の核酸配列(配列番号102)およびD70A-BB5のアミノ酸配列(配列番号103) (これはD70A-BB5(配列番号102)の翻訳体である)である。
図57は、D70A-AB5の核酸配列(配列番号104)およびD70A-AB5のアミノ酸配列(配列番号105) (これはD70A-AB5(配列番号104)の翻訳体である)である。
図58は、D70A-AA8の核酸配列(配列番号106)およびD70A-AA8のアミノ酸配列(配列番号107) (これはD70A-AA8(配列番号106)の翻訳体である)である。
図59は、D70A-AB8の核酸配列(配列番号108)およびD70A-AB8のアミノ酸配列(配列番号109) (これはD70A-AB8(配列番号108)の翻訳体である)である。
図60は、D70A-BH2の核酸配列(配列番号110)およびD70A-BH2のアミノ酸配列(配列番号111) (これはD70A-BH2(配列番号110)の翻訳体である)である。
図61は、D70A-AA4の核酸配列(配列番号112)およびD70A-AA4のアミノ酸配列(配列番号113) (これはD70A-AA4(配列番号112)の翻訳体である)である。
図62は、D70A-BA1の核酸配列(配列番号114)およびD70A-BA1のアミノ酸配列(配列番号115) (これはD70A-BA1(配列番号114)の翻訳体である)である。
図63は、D70A-BA9の核酸配列(配列番号116)およびD70A-BA9のアミノ酸配列(配列番号117) (これはD70A-BA9(配列番号116)の翻訳体である)である。
図64は、D70A-BD4の核酸配列(配列番号118)およびD70A-BD4のアミノ酸配列(配列番号119) (これはD70A-BD4(配列番号118)の翻訳体である)である。
図65は、D181-AC5の核酸配列(配列番号120)およびD181-AC5のアミノ酸配列(配列番号121) (これはD181-AC5(配列番号120)の翻訳体である)である。
図66は、D144-AH1の核酸配列(配列番号122)およびD144-AH1のアミノ酸配列(配列番号123) (これはD144-AH1(配列番号122)の翻訳体である)である。
図67は、D34-65の核酸配列(配列番号124)およびD34-65のアミノ酸配列(配列番号125) (これはD34-65(配列番号124)の翻訳体である)である。
図68は、D35-BG2の核酸配列(配列番号126)およびD35-BG2のアミノ酸配列(配列番号127) (これはD35-BG2(配列番号126)の翻訳体である)である。
図69は、D73A-AH7の核酸配列(配列番号128)およびD73A-AH7のアミノ酸配列(配列番号129) (これはD73A-AH7(配列番号128)の翻訳体である)である。
図70は、D58-AA1の核酸配列(配列番号130)およびD58-AA1のアミノ酸配列(配列番号131) (これはD58-AA1(配列番号130)の翻訳体である)である。
図71は、D73A-AE10の核酸配列(配列番号132)およびD73A-AE10のアミノ酸配列(配列番号133) (これはD73A-AE10(配列番号132)の翻訳体である)である。
図72は、D56A-AC12の核酸配列(配列番号134)およびD56A-AC12のアミノ酸配列(配列番号135) (これはD56A-AC12(配列番号134)の翻訳体である)である。
図73は、D177-BF7の核酸配列(配列番号136)およびD177-BF7のアミノ酸配列(配列番号137) (これはD177-BF7(配列番号136)の翻訳体である)である。
図74は、D73A-AG3の核酸配列(配列番号138)およびD73A-AG3のアミノ酸配列(配列番号139) (これはD73A-AG3(配列番号138)の翻訳体である)である。
図75は、D70A-AA12の核酸配列(配列番号140)およびD70A-AA12のアミノ酸配列(配列番号141) (これはD70A-AA12(配列番号140)の翻訳体である)である。
図76は、D185-BC1の核酸配列(配列番号142)およびD185-BC1のアミノ酸配列(配列番号143) (これはD185-BC1(配列番号142)の翻訳体である)である。
図77は、D185-BG2の核酸配列(配列番号144)およびD185-BG2のアミノ酸配列(配列番号145) (これはD185-BG2(配列番号144)の翻訳体である)である。
図78は、D185-BE1の核酸配列(配列番号146)およびD185-BE1のアミノ酸配列(配列番号147) (これはD185-BE1(配列番号146)の翻訳体である)である。
図79は、D185-BD2の核酸配列(配列番号148)およびD185-BD2のアミノ酸配列(配列番号149) (これはD185-BD2(配列番号148)の翻訳体である)である。
図80は、D176-BG2の核酸配列(配列番号150)およびD176-BG2のアミノ酸配列(配列番号151) (これはD176-BG2(配列番号150)の翻訳体である)である。
図81は、D185-BD3の核酸配列(配列番号152)およびD185-BD3のアミノ酸配列(配列番号153) (これはD185-BD3(配列番号152)の翻訳体である)である。
図82は、D176-BC3の核酸配列(配列番号154)およびD176-BC3のアミノ酸配列(配列番号155) (これはD176-BC3(配列番号154)の翻訳体である)である。
図83は、D176-BB3の核酸配列(配列番号156)およびD176-BB3のアミノ酸配列(配列番号157) (これはD176-BB3(配列番号156)の翻訳体である)である。
図84は、D89-AB1の核酸配列(配列番号158)およびD89-AB1のアミノ酸配列(配列番号159) (これはD89-AB1(配列番号158)の翻訳体である)である。
図85は、D89-AD2の核酸配列(配列番号160)およびD89-AD2のアミノ酸配列(配列番号161) (これはD89-AD2(配列番号160)の翻訳体である)である。
図86は、D90A-BB3の核酸配列(配列番号162)およびD90A-BB3のアミノ酸配列(配列番号163) (これはD90A-BB3(配列番号162)の翻訳体である)である。
図87は、D95-AG1の核酸配列(配列番号164)およびD95-AG1のアミノ酸配列(配列番号165) (これはD95-AG1(配列番号164)の翻訳体である)である。
図88は、D96-AB6の核酸配列(配列番号166)およびD96-AB6のアミノ酸配列(配列番号167) (これはD96-AB6(配列番号166)の翻訳体である)である。
図89は、D96-AC2の核酸配列(配列番号168)およびD96-AC2のアミノ酸配列(配列番号169) (これはD96-AC2(配列番号168)の翻訳体である)である。
図90は、D98-AA1の核酸配列(配列番号170)およびD98-AA1のアミノ酸配列(配列番号171) (これはD98-AA1(配列番号170)の翻訳体である)である。
図91は、D98-AG1の核酸配列(配列番号172)およびD98-AG1のアミノ酸配列(配列番号173) (これはD98-AG1(配列番号172)の翻訳体である)である。
図92は、D100-BE2の核酸配列(配列番号174)およびD100-BE2のアミノ酸配列(配列番号175) (これはD100-BE2(配列番号174)の翻訳体である)である。
図93は、D100A-AC3の核酸配列(配列番号176)およびD100A-AC3のアミノ酸配列(配列番号177) (これはD100A-AC3(配列番号176)の翻訳体である)である。
図94は、D104A-AE8(69,1755)の核酸配列(配列番号178)およびD104A-AE8(69,1755)のアミノ酸配列(配列番号179) (これはD104A-AE8(69,1755)(配列番号178)の翻訳体である)である。
図95は、D105-AD6の核酸配列(配列番号180)およびD105-AD6のアミノ酸配列(配列番号181) (これはD105-AD6(配列番号180)の翻訳体である)である。
図96は、D109-AH8(14,1697)の核酸配列(配列番号182)およびD109-AH8(14,1697)のアミノ酸配列(配列番号183) (これはD109-AH8(14,1697)(配列番号182)の翻訳体である)である。
図97は、D110-AF12(166,1631)の核酸配列(配列番号184)およびD110-AF12(166,1631)のアミノ酸配列(配列番号185) (これはD110-AF12(166,1631)(配列番号184)の翻訳体である)である。
図98は、D112-AA5の核酸配列(配列番号186)およびD112-AA5のアミノ酸配列(配列番号187) (これはD112-AA5(配列番号186)の翻訳体である)である。
図99は、D120-AH4の核酸配列(配列番号188)およびD120-AH4のアミノ酸配列(配列番号189) (これはD120-AH4(配列番号188)の翻訳体である)である。
図100は、D121-AA8の核酸配列(配列番号190)およびD121-AA8のアミノ酸配列(配列番号191) (これはD121-AA8(配列番号190)の翻訳体である)である。
図101は、D122-AF10の核酸配列(配列番号192)およびD122-AF10のアミノ酸配列(配列番号193) (これはD122-AF10(配列番号192)の翻訳体である)である。
図102は、D128-AB7の核酸配列(配列番号194)およびD128-AB7のアミノ酸配列(配列番号195) (これはD128-AB7(配列番号194)の翻訳体である)である。
図103は、D129-AD10の核酸配列(配列番号196)およびD129-AD10のアミノ酸配列(配列番号197) (これはD129-AD10(配列番号196)の翻訳体である)である。
図104は、D135-AE1の核酸配列(配列番号198)およびD135-AE1のアミノ酸配列(配列番号199) (これはD135-AE1(配列番号198)の翻訳体である)である。
図105は、D141-AD7の核酸配列(配列番号200)およびD141-AD7のアミノ酸配列(配列番号201) (これはD141-AD7(配列番号200)の翻訳体である)である。
図106は、D147-AD3の核酸配列(配列番号202)およびD147-AD3のアミノ酸配列(配列番号203) (これはD147-AD3(配列番号202)の翻訳体である)である。
図107は、D163-AF12の核酸配列(配列番号204)およびD163-AF12のアミノ酸配列(配列番号205) (これはD163-AF12(配列番号204)の翻訳体である)である。
図108は、D163-AG11の核酸配列(配列番号206)およびD163-AG11のアミノ酸配列(配列番号207) (これはD163-AG11(配列番号206)の翻訳体である)である。
図109は、D163-AG12の核酸配列(配列番号208)およびD163-AG12のアミノ酸配列(配列番号209) (これはD163-AG12(配列番号208)の翻訳体である)である。
図110は、D205-BG9の核酸配列(配列番号210)およびD205-BG9のアミノ酸配列(配列番号211) (これはD205-BG9(配列番号210)の翻訳体である)である。
図111は、D207-AA5の核酸配列(配列番号212)およびD207-AA5のアミノ酸配列(配列番号213) (これはD207-AA5(配列番号212)の翻訳体である)である。
図112は、D207-AB4の核酸配列(配列番号214)およびD207-AB4のアミノ酸配列(配列番号215) (これはD207-AB4(配列番号214)の翻訳体である)である。
図113は、D207-AC4の核酸配列(配列番号216)およびD207-AC4のアミノ酸配列(配列番号217) (これはD207-AC4(配列番号216)の翻訳体である)である。
図114は、D209-AA10の核酸配列(配列番号218)およびD209-AA10のアミノ酸配列(配列番号219) (これはD209-AA10(配列番号218)の翻訳体である)である。
図115は、D209-AA12の核酸配列(配列番号220)およびD209-AA12のアミノ酸配列(配列番号221) (これはD209-AA12(配列番号220)の翻訳体である)である。
図116は、D209-AH10の核酸配列(配列番号222)およびD209-AH10のアミノ酸配列(配列番号223) (これはD209-AH10(配列番号222)の翻訳体である)である。
図117は、D87A-AF3の核酸配列(配列番号224)およびD87A-AF3のアミノ酸配列(配列番号225) (これはD87A-AF3(配列番号224)の翻訳体である)である。
図118は、D208-AC8の核酸配列(配列番号226)およびD208-AC8のアミノ酸配列(配列番号227) (これはD208-AC8(配列番号226)の翻訳体である)である。
図119は、D215-AB5の核酸配列(配列番号228)およびD215-AB5のアミノ酸配列(配列番号229) (これはD215-AB5(配列番号228)の翻訳体である)である。
図120は、D103-AH3の核酸配列(配列番号230)およびD103-AH3のアミノ酸配列(配列番号231) (これはD103-AH3(配列番号230)の翻訳体である)である。
図121は、D208-AD9の核酸配列(配列番号232)およびD208-AD9のアミノ酸配列(配列番号233) (これはD208-AD9(配列番号232)の翻訳体である)である。
図122は、D237-AD1の核酸配列(配列番号234)およびD237-AD1のアミノ酸配列(配列番号235) (これはD237-AD1(配列番号234)の翻訳体である)である。
図123は、D125-AF11の核酸配列(配列番号236)およびD125-AF11のアミノ酸配列(配列番号237) (これはD125-AF11(配列番号236)の翻訳体である)である。
図124は、D134-AE11の核酸配列(配列番号238)およびD134-AE11のアミノ酸配列(配列番号239) (これはD134-AE11(配列番号238)の翻訳体である)である。
図125は、D209-AH12の核酸配列(配列番号240)およびD209-AH12のアミノ酸配列(配列番号241) (これはD209-AH12(配列番号240)の翻訳体である)である。
図126は、D221-BB8の核酸配列(配列番号242)およびD221-BB8のアミノ酸配列(配列番号243) (これはD221-BB8(配列番号242)の翻訳体である)である。
図127は、D222-BH4の核酸配列(配列番号244)およびD222-BH4のアミノ酸配列(配列番号245) (これはD222-BH4(配列番号244)の翻訳体である)である。
図128は、D224-AF10の核酸配列(配列番号246)およびD224-AF10のアミノ酸配列(配列番号247) (これはD224-AF10(配列番号246)の翻訳体である)である。
図129は、D224-BD11の核酸配列(配列番号248)およびD224-BD11のアミノ酸配列(配列番号249) (これはD224-BD11(配列番号248)の翻訳体である)である。
図130は、D228-AD7の核酸配列(配列番号250)およびD228-AD7のアミノ酸配列(配列番号251) (これはD228-AD7(配列番号250)の翻訳体である)である。
図131は、D228-AH8の核酸配列(配列番号252)およびD228-AH8のアミノ酸配列(配列番号253) (これはD228-AH8(配列番号252)の翻訳体である)である。
図132は、D235-AB1の核酸配列(配列番号254)およびD235-AB1のアミノ酸配列(配列番号255) (これはD235-AB1(配列番号254)の翻訳体である)である。
図133は、D243-AA2の核酸配列(配列番号256)およびD243-AA2のアミノ酸配列(配列番号257) (これはD243-AA2(配列番号256)の翻訳体である)である。
図134は、D244-AD4の核酸配列(配列番号258)およびD244-AD4のアミノ酸配列(配列番号259) (これはD244-AD4(配列番号258)の翻訳体である)である。
図135は、D247-AH1の核酸配列(配列番号260)およびD247-AH1のアミノ酸配列(配列番号261) (これはD247-AH1(配列番号260)の翻訳体である)である。
図136は、D248-AA6の核酸配列(配列番号262)およびD248-AA6のアミノ酸配列(配列番号263) (これはD248-AA6(配列番号262)の翻訳体である)である。
図137は、D249-AE8の核酸配列(配列番号264)およびD249-AE8のアミノ酸配列(配列番号265) (これはD249-AE8(配列番号264)の翻訳体である)である。
図138は、D250-AC11の核酸配列(配列番号266)およびD250-AC11のアミノ酸配列(配列番号267および2298) (これらはD250-AC11(配列番号266)の翻訳体である)である。
図139は、D259-AB9の核酸配列(配列番号268)およびD259-AB9のアミノ酸配列(配列番号269) (これはD259-AB9(配列番号268)の翻訳体である)である。
図140は、D218A-AC2の核酸配列(配列番号270)およびD218A-AC2のアミノ酸配列(配列番号271) (これはD218A-AC2(配列番号270)の翻訳体である)である。
図141は、D210-BD4の核酸配列(配列番号272)およびD210-BD4のアミノ酸配列(配列番号273) (これはD210-BD4(配列番号272)の翻訳体である)である。
図142は、D233-AG7の核酸配列(配列番号274)およびD233-AG7のアミノ酸配列(配列番号275) (これはD233-AG7(配列番号274)の翻訳体である)である。
図143は、D257-AE4の核酸配列(配列番号276)およびD257-AE4のアミノ酸配列(配列番号277) (これはD257-AE4(配列番号276)の翻訳体である)である。
図144は、D268-AE2の核酸配列(配列番号278)およびD268-AE2のアミノ酸配列(配列番号279) (これはD268-AE2(配列番号278)の翻訳体である)である。
図145は、D283-AC1の核酸配列(配列番号280)およびD283-AC1のアミノ酸配列(配列番号281) (これはD283-AC1(配列番号280)の翻訳体である)である。
図146は、D244-AB6の核酸配列(配列番号282)およびD244-AB6のアミノ酸配列(配列番号283) (これはD244-AB6(配列番号282)の翻訳体である)である。
図147は、D205-BE9の核酸配列(配列番号284)およびD205-BE9のアミノ酸配列(配列番号285) (これはD205-BE9(配列番号284)の翻訳体である)である。
図148は、D136-AF4の核酸配列(配列番号286)およびD136-AF4のアミノ酸配列(配列番号287) (これはD136-AF4(配列番号286)の翻訳体である)である。
図149は、D101-BA2の核酸配列(配列番号288)およびD101-BA2のアミノ酸配列(配列番号289) (これはD101-BA2(配列番号288)の翻訳体である)である。
図150は、D130-AA1の核酸配列(配列番号290)およびD130-AA1のアミノ酸配列(配列番号291) (これはD130-AA1(配列番号290)の翻訳体である)である。
図151は、D136-AD5の核酸配列(配列番号292)およびD136-AD5のアミノ酸配列(配列番号293) (これはD136-AD5(配列番号292)の翻訳体である)である。
図152は、D138-AD12の核酸配列(配列番号294)およびD138-AD12のアミノ酸配列(配列番号295) (これはD138-AD12(配列番号294)の翻訳体である)である。
図153は、D216-AG8の核酸配列(配列番号296)およびD216-AG8のアミノ酸配列(配列番号297) (これはD216-AG8(配列番号296)の翻訳体である)である。
図154は、D243-AB3の核酸配列(配列番号298)およびD243-AB3のアミノ酸配列(配列番号299) (これはD243-AB3(配列番号298)の翻訳体である)である。
図155は、D250-AC11の核酸配列(配列番号300)およびD250-AC11のアミノ酸配列(配列番号301および2298) (これらはD250-AC11(配列番号300)の翻訳体である)である。
図156は、D205-AH4の核酸配列(配列番号302)およびD205-AH4のアミノ酸配列(配列番号303) (これはD205-AH4(配列番号302)の翻訳体である)である。
図157は、D267-AF10の核酸配列(配列番号304)およびD267-AF10のアミノ酸配列(配列番号305) (これはD267-AF10(配列番号304)の翻訳体である)である。
図158は、D284-AH5の核酸配列(配列番号306)およびD284-AH5のアミノ酸配列(配列番号307) (これはD284-AH5(配列番号306)の翻訳体である)である。
図159Aは、D58-BG7 (配列番号10), D58-AB1 (配列番号12)およびD58-BE4 (配列番号16)のアライメントならびにD56-AH7 (配列番号18)およびD13a-5 (配列番号20)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Bは、D56-AG10 (配列番号22), D35-33 (配列番号24)およびD34-62 (配列番号26)のアライメントならびにD56-AA7 (配列番号28), D56-AE1 (配列番号30)およびD185-BD3 (配列番号152)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Cは、D56A-AB6 (配列番号36), D35-BB7 (配列番号32), D177-BA7 (配列番号34)およびD144-AE2 (配列番号38)のアライメントならびにD56-AG11 (配列番号40)およびD179-AA1 (配列番号42)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Dは、D56-AC7 (配列番号44)およびD144-AD1 (配列番号46)のアライメントならびにD181-AB5 (配列番号50)およびD73-AC9 (配列番号52)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Eは、核酸配列D58-AB9 (配列番号56), D56-AG9 (配列番号58), D35-BG11 (配列番号62), D34-25 (配列番号72), D35-BA3 (配列番号66), D34-52 (配列番号70), D56-AG6 (配列番号60), D35-42 (配列番号64)およびD34-57 (配列番号68)のアライメントである。該アライメントの配列間の同一性 (%)が該アライメントの下に示されている。
図159Fは、D177-BD7 (配列番号92)およびD177-BD5 (配列番号78)のアライメントならびにD56A-AG10 (配列番号80), D58-AD12 (配列番号84)およびD58-BC5 (配列番号82)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Gは、D56-AD6 (配列番号96), D56-AC11 (配列番号86), D35-39 (配列番号88)およびD58-BH4 (配列番号90)のアライメントならびにD73A-AD6 (配列番号98)およびD70A-BA11 (配列番号100)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Hは、D70A-AB5 (配列番号104)およびD70A-AA8 (配列番号106)のアライメントならびにD70A-AB8 (配列番号108), D70A-BH2 (配列番号110), D70A-AA4 (配列番号112)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Iは、D70A-BA1 (配列番号114)およびD70A-BA9 (配列番号116)のアライメントならびにD144-AH1 (配列番号122), D34-65 (配列番号124)およびD181-AC5 (配列番号120)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Jは、D58-AA1 (配列番号130), D185-BC1 (配列番号142)およびD185-BG2 (配列番号144)のアライメントならびにD177-BF7 (配列番号136), D185-BD2 (配列番号148)およびD185-BE1 (配列番号146)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Kは、核酸配列D70-AA12 (配列番号140)およびD176-BF2 (配列番号94)のアライメントである。該アライメントの配列間の同一性 (%)が該アライメントの下に示されている。
図160Aは、D208-AD9 (配列番号2196), D120-AH4 (配列番号2197), D121-AA8 (配列番号2198), D122-AF10 (配列番号2199), D103-AH3 (配列番号2200), D208-AC8 (配列番号2201)およびD235-AB1 (配列番号2202)の配列アライメント; D244-AD4 (配列番号2203), D244-AB6 (配列番号2204), D285-AA8 (配列番号2205), D285-AB9 (配列番号2206)およびD268-AE2 (配列番号2207)の配列アライメント;ならびにD100A-AC3 (配列番号2208)およびD100A-BE2 (配列番号2209)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Bは、D205-BG9 (配列番号2210), D205-BE9 (配列番号2211)およびD205-AH4 (配列番号2212) の配列アライメント; D259-AB9 (配列番号2213), D257-AE4 (配列番号2214)およびD147-AD3 (配列番号2215) の配列アライメント; D249-AEB (配列番号2216)およびD248-AA6 (配列番号2217) の配列アライメント; D233-AG7 (配列番号2218), D224-BD11 (配列番号2219)およびD224-AF10 (配列番号2220) の配列アライメント;ならびにD105-AD6 (配列番号2221), D215-AB5 (配列番号2222)およびD135-AE1 (配列番号2223)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Cは、D87A-AF3 (配列番号2224)およびD210-BD4 (配列番号2225)の配列アライメント; D89-AB1 (配列番号2226), D89-AD2 (配列番号2227), D163-AG12 (配列番号2228), D163-AG11 (配列番号2229)およびD163-AF12 (配列番号2230) の配列アライメント; D267-AF10 (配列番号2231), D96-AC2 (配列番号2232), D96-AB6 (配列番号2233), D207-AA5 (配列番号2234), D207-AB4 (配列番号2235)およびD207-AC4 (配列番号2236);ならびにD98-AG1 (配列番号2237)およびD98-AA1 (配列番号2238)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Dは、D209-AA10 (配列番号2239), D209-AA12 (配列番号2240), D209-AH10 (配列番号2241), D209-AH12 (配列番号2242)およびD90a-BB3 (配列番号2243) の配列アライメント; D129-AD10 (配列番号2244)およびD104A-AE8 (配列番号2245) の配列アライメント; D228-AH8 (配列番号2246), D228-AD7 (配列番号2247), D250-AC11 (配列番号2248)およびD247-AH1 (配列番号2249)の配列アライメント;ならびにD128-AB7 (配列番号2250), D243-AA2 (配列番号2251)およびD125-AF11 (配列番号2252)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Eは、D284-AH5 (配列番号2253)およびD110-AF12 (配列番号2254)のアミノ酸配列アライメントである。
図161は、PCRによるシトクロムp450 cDNA断片のクローニングを示す概要図である。該クローニングに使用するプライマーは以下のとおりである:DM (配列番号2255), DM4 (配列番号2256), DM12 (配列番号2257), DM13 (配列番号2258), DM17 (配列番号2259), OLIGO d(T) (配列番号2260), T7 (配列番号2261)およびSP6 (配列番号2262)。
図162は、D425-AB10の核酸配列(配列番号367)およびD425-AB10のアミノ酸配列(配列番号368) (これはD425-AB10(配列番号367)の翻訳体である)である。
図163は、D425-AB11の核酸配列(配列番号369)およびD425-AB11のアミノ酸配列(配列番号370) (これはD425-AB11(配列番号369)の翻訳体である)である。
図164は、D425-AC9の核酸配列(配列番号371)およびD425-AC9のアミノ酸配列(配列番号372) (これはD425-AC9(配列番号371)の翻訳体である)である。
図165は、D425-AC10の核酸配列(配列番号373)およびD425-AC10のアミノ酸配列(配列番号374) (これはD425-AC10(配列番号373)の翻訳体である)である。
図166は、D425-AC11の核酸配列(配列番号375)およびD425-AC11のアミノ酸配列(配列番号376) (これはD425-AC11(配列番号375)の翻訳体である)である。
図167は、D425-AG11の核酸配列(配列番号377)およびD425-AG11のアミノ酸配列(配列番号378) (これはD425-AG11(配列番号377)の翻訳体である)である。
図168は、D425-AH7の核酸配列(配列番号379)およびD425-AH7のアミノ酸配列(配列番号380) (これはD425-AH7(配列番号379)の翻訳体である)である。
図169は、D425-AH11の核酸配列(配列番号381)およびD425-AH11のアミノ酸配列(配列番号382) (これはD425-AH11(配列番号381)の翻訳体である)である。
図170は、D427-AA5の核酸配列(配列番号383)およびD427-AA5のアミノ酸配列(配列番号384) (これはD427-AA5(配列番号383)の翻訳体である)である。
図171は、GeneChip (登録商標) マイクロアレイ上のクローンのプローブセット配列 (配列番号385〜配列番号445)である。
図172-1は、D424-AA4 (配列番号446)の核酸配列; D424-AF5 (配列番号447) の核酸配列およびD424-AF5 (配列番号448)のアミノ酸配列(これはD424-AF5 (配列番号447)の翻訳体である); D425-AA11 (配列番号449)の核酸配列およびD425-AA11 (配列番号450および2299)のアミノ酸配列(これらはD425-AA11 (配列番号449)の翻訳体である);ならびにD425-AF11 (配列番号451)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-2は、D425-AF11 (配列番号452)のアミノ酸配列(これはD425-AF11 (配列番号451)の翻訳体である); D425-AH10 (配列番号453)の核酸配列およびD425-AH10 (配列番号454)のアミノ酸配列(これはD425-AH10 (配列番号453)の翻訳体である); D426-AA3 (配列番号455)の核酸配列およびD426-AA3 (配列番号456)のアミノ酸配列(これはD426-AA3 (配列番号455)の翻訳体である);ならびにD426-AG1 (配列番号457)の核酸配列およびD426-AG1 (配列番号458)のアミノ酸配列(これはD426-AG1 (配列番号457)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-3は、D427-AA6 (配列番号459)の核酸配列およびD427-AA6 (配列番号460)のアミノ酸配列(これはD427-AA6 (配列番号459)の翻訳体である); D427-AB6 (配列番号461)の核酸配列およびD427-AB6 (配列番号462)のアミノ酸配列(これはD427-AB6 (配列番号461)の翻訳体である); D428-AC9 (配列番号463)の核酸配列およびのD428-AC9 (配列番号464)アミノ酸配列(これはD428-AC9 (配列番号463)の翻訳体である);ならびにD428-AH10 (配列番号465)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-4は、D428-AH10 (配列番号466)のアミノ酸配列(これはD428-AH10 (配列番号465)の翻訳体である); D429-AA1 (配列番号467)の核酸配列およびD429-AA1 (配列番号468)のアミノ酸配列(これはD429-AA1 (配列番号467)の翻訳体である); D430-AA3 (配列番号469)の核酸配列およびD430-AA3 (配列番号470)のアミノ酸配列(これはD430-AA3 (配列番号469)の翻訳体である);ならびにD431-AE6 (配列番号471)の核酸配列およびD431-AE6 (配列番号472)のアミノ酸配列(これはD431-AE6 (配列番号471)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-5は、D113-AE9 (配列番号473)の核酸配列およびD113-AE9 (配列番号474)のアミノ酸配列(これはD113-AE9 (配列番号473)の翻訳体である);ならびにD114-AE12 (配列番号475)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-6は、D114-AE12 (配列番号476)のアミノ酸配列(これはD114-AE12 (配列番号475)の翻訳体である); D119-AC3 (配列番号477)の核酸配列およびD119-AC3 (配列番号478)のアミノ酸配列(これはD119-AC3 (配列番号477)の翻訳体である);ならびにD132-AA5 (配列番号479)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-7は、D132-AA5 (配列番号480)のアミノ酸配列(これはD132-AA5 (配列番号479)の翻訳体である); D223-BB10 (配列番号481)の核酸配列およびD223-BB10 (配列番号482)のアミノ酸配列(これはD223-BB10 (配列番号481)の翻訳体である);ならびにD245-AA8 (配列番号483)の核酸配列およびD245-AA8 (配列番号484)のアミノ酸配列(これはD245-AA8 (配列番号483)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-8は、D246-AE12 (配列番号485)の核酸配列およびD246-AE12 (配列番号486)のアミノ酸配列(これはD246-AE12 (配列番号485)の翻訳体である);ならびにD279-AD1 (配列番号487)の核酸配列およびD279-AD1 (配列番号488)のアミノ酸配列(これはD279-AD1 (配列番号487)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-9は、D282-AA10 (配列番号489)の核酸配列およびD282-AA10 (配列番号490)のアミノ酸配列(これはD282-AA10 (配列番号489)の翻訳体である);ならびにD295-AA1 (配列番号491)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-10は、D295-AA1 (配列番号492)のアミノ酸配列(これはD295-AA1 (配列番号491)の翻訳体である); D101A-AE2 (配列番号493)の核酸配列およびD101A-AE2 (配列番号494)のアミノ酸配列(これはD101A-AE2 (配列番号493)の翻訳体である);ならびにD108-AA4 (配列番号495)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-11は、D108-AA4 (配列番号496)のアミノ酸配列(これはD108-AA4 (配列番号495)の翻訳体である); D124-AC5(5’) (配列番号497)の核酸配列およびD124-AC5(5’) (配列番号498)のアミノ酸配列(これはD124-AC5(5’) (配列番号497)の翻訳体である); D124-AC5(3’) (配列番号499)の核酸配列およびD124-AC5(3’) (配列番号500)のアミノ酸配列(これはD124-AC5(3’) (配列番号499)の翻訳体である);ならびにD141-AD7 (配列番号501)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-12は、D141-AD7 (配列番号502)のアミノ酸配列, (これはD141-AD7 (配列番号501)の翻訳体である);ならびにD148-AD1 (配列番号503)の核酸配列およびD148-AD1 (配列番号504)のアミノ酸配列(これはD148-AD1 (配列番号503)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-13は、D212-BC11 (配列番号505)の核酸配列およびD212-BC11 (配列番号506)のアミノ酸配列(これはD212-BC11 (配列番号505)の翻訳体である);ならびにD217-AB10 (配列番号507)の核酸配列およびD217-AB10 (配列番号508)のアミノ酸配列(これはD217-AB10 (配列番号507)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-14は、D220-BC6 (配列番号509)の核酸配列およびD220-BC6 (配列番号510)のアミノ酸配列(これはD220-BC6 (配列番号509)の翻訳体である); D225-AG9 (配列番号511)の核酸配列およびD225-AG9 (配列番号512)のアミノ酸配列(これはD225-AG9 (配列番号511)の翻訳体である); D231-AF1 (配列番号513)の核酸配列およびD231-AF1 (配列番号514)のアミノ酸配列(これはD231-AF1 (配列番号513)の翻訳体である);ならびにD232-AH5 (配列番号515)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-15は、D232-AH5 (配列番号516)のアミノ酸配列(これはD232-AH5 (配列番号515)の翻訳体である); D240-BB8 (配列番号517)の核酸配列およびD240-BB8 (配列番号518)のアミノ酸配列(これはD240-BB8 (配列番号517)の翻訳体である); D280-AA6 (配列番号519)の核酸配列およびD280-AA6 (配列番号520)のアミノ酸配列(これはD280-AA6 (配列番号519)の翻訳体である);ならびにD285-AD7 (配列番号521)の核酸配列およびD285-AD7 (配列番号522)のアミノ酸配列(これはD285-AD7 (配列番号521)での翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-16は、D285-AH9 (配列番号523)の核酸配列およびD285-AH9 (配列番号524)のアミノ酸配列(これはD285-AH9 (配列番号523)の翻訳体である); D99-AB3 (配列番号525)の核酸配列およびD99-AB3 (配列番号526)のアミノ酸配列(これはD99-AB3 (配列番号525)の翻訳体である);ならびにD99-AC2 (配列番号527)の核酸配列およびD99-AC2 (配列番号528)のアミノ酸配列(これはD99-AC2 (配列番号527)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-17は、D99-AF11 (配列番号529)の核酸配列およびD99-AF11 (配列番号530)のアミノ酸配列(これはD99-AF11 (配列番号529)の翻訳体である); D99-AH4 (配列番号531)の核酸配列およびD99-AH4 (配列番号532)のアミノ酸配列(これはD99-AH4 (配列番号531)の翻訳体である); D99-AH7 (配列番号533)の核酸配列およびD99-AH7 (配列番号534)のアミノ酸配列(これはD99-AH7 (配列番号533)の翻訳体である); D99-DB4 (配列番号535)の核酸配列およびD99-DB4 (配列番号536)のアミノ酸配列(これはD99-DB4 (配列番号535)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-18は、D99-DG4 (配列番号537)の核酸配列およびD99-DG4 (配列番号538)のアミノ酸配列(これはD99-DG4 (配列番号537)の翻訳体である); D40-2 (配列番号539)の核酸配列およびD40-2 (配列番号540)のアミノ酸配列(これはD40-2 (配列番号539)の翻訳体である); D301-EE11 (配列番号541)の核酸配列およびD301-EE11 (配列番号542)のアミノ酸配列(これはD301-EE11 (配列番号541)の翻訳体である);ならびにD302-AE10 (配列番号543)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-19は、D302-AE10 (配列番号544)のアミノ酸配列(これはD302-AE10 (配列番号543)の翻訳体である); D303-AC6 (配列番号545)の核酸配列およびD303-AC6 (配列番号546)のアミノ酸配列(これはD303-AC6 (配列番号545)の翻訳体である);ならびにD303-AC11 (配列番号547)の核酸配列およびD303-AC11 (配列番号548)のアミノ酸配列(これはD303-AC11 (配列番号547)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図173-1は、40-17 (配列番号549), 40-20 (配列番号550), 40-23 (配列番号551), 40-26 (配列番号552), D40-27 (配列番号553), 40-28 (配列番号554)および40-78 (配列番号555)の核酸配列である。
図173-2は、40-83 (配列番号556), D40-86 (配列番号557), D40-97 (配列番号558), 40-100 (配列番号559), 40-107 (配列番号560), D41-41 (配列番号561)およびD41-60 (配列番号562)の核酸配列である。
図173-3は、D41-65 (配列番号563), D41-67 (配列番号564), D41-69 (配列番号565), D41-99 (配列番号566), D42-AA3 (配列番号567), D42-AA7 (配列番号568)およびD42-AC3 (配列番号569)の核酸配列である。
図173-4は、D42-AC7 (配列番号570), D42-AC8 (配列番号571), D42-AD3 (配列番号572), D42-AD12 (配列番号573), D42-AF3 (配列番号574)およびD42-AH3 (配列番号575)の核酸配列である。
図173-5は、D42-BA2 (配列番号576), D42-BB11 (配列番号577), D42-KC9 (配列番号578), D42-KC10 (配列番号579), D42-LB2 (配列番号580), D42-LC7 (配列番号581), D42-TG7 (配列番号582)およびD42-UG8 (配列番号583)の核酸配列である。
図173-6は、D42-ZB1 (配列番号584), D300-AA7 (配列番号585), D300-AB3 (配列番号586), D300-AB7 (配列番号587), D300-AB10 (配列番号588), D300-AB11 (配列番号589)およびD300-AC2 (配列番号590)の核酸配列である。
図173-7は、D300-AC6 (配列番号591), D300-AC7 (配列番号592), D300-AD4 (配列番号593), D300-AD6 (配列番号594), D300-AD10 (配列番号595), D300-AE3 (配列番号596)およびD300-AE9 (配列番号597)の核酸配列である。
図173-8は、D300-AE11 (配列番号598), D300-AF4 (配列番号599), D300-AF5 (配列番号600), D300-AF7 (配列番号601), D300-AF8 (配列番号602), D300-AF9 (配列番号603)およびD300-AF11 (配列番号604)の核酸配列である。
図173-9は、D300-AG1 (配列番号605), D300-AG2 (配列番号606), D300-AG3 (配列番号607), D300-AG10 (配列番号608), D300-AH6 (配列番号609), D300-AH9 (配列番号610), D300-AH10 (配列番号611)およびD300-AH11 (配列番号612)の核酸配列である。
図173-10は、D300-BA5 (配列番号613), D300-BA6 (配列番号614), D300-BA7 (配列番号615), D300-BA12 (配列番号616), D300-BB6 (配列番号617), D300-BB7 (配列番号618)およびD300-BC1 (配列番号619)の核酸配列である。
図173-11は、D300-BC4 (配列番号620), D300-BC7 (配列番号621), D300-BC8 (配列番号622), D300-BC9 (配列番号623), D300-BD2 (配列番号624), D300-BD7 (配列番号625)およびD300-BE1 (配列番号626)の核酸配列である。
図173-12は、D300-BE2 (配列番号627), D300-BE7 (配列番号628), D300-BE8 (配列番号629), D300-BE9 (配列番号630), D300-BE12 (配列番号631), D300-BF7 (配列番号632), D300-BF11 (配列番号633)およびD300-BG1 (配列番号634)の核酸配列である。
図173-13は、D300-BG2 (配列番号635), D300-BG5 (配列番号636), D300-BH6 (配列番号637), D300-BH9 (配列番号638), D300-CA1 (配列番号639), D300-CA6 (配列番号640)およびD300-CB1 (配列番号641)の核酸配列である。
図173-14は、D300-CB12 (配列番号642), D300-CC2 (配列番号643), D300-CD2 (配列番号644), D300-CD3 (配列番号645), D300-CD4 (配列番号646), D300-CD5 (配列番号647)およびD300-CE3 (配列番号648)の核酸配列である。
図173-15は、D300-CE7 (配列番号649), D300-CF1 (配列番号650), D300-CF2 (配列番号651), D300-CF11 (配列番号652), D300-CG2 (配列番号653), D300-CG7 (配列番号654), D300-CH1 (配列番号655)およびD300-CH3 (配列番号656)の核酸配列である。
図173-16は、D300-CH5 (配列番号657), D300-CH7 (配列番号658), D300-DA1 (配列番号659), D300-DA4 (配列番号660), D300-DB2 (配列番号661), D300-DB4 (配列番号662), D300-DB6 (配列番号663)およびD300-DB7-c (配列番号664)の核酸配列である。
図173-17は、D300-DB8 (配列番号665), D300-DC2 (配列番号666), D300-DC4 (配列番号667), D300-DC7 (配列番号668), D300-DC10 (配列番号669), D300-DC11 (配列番号670)およびD300-DD5 (配列番号671)の核酸配列である。
図173-18は、D300-DD6 (配列番号672), D300-DE2 (配列番号673), D300-DE9 (配列番号674), D300-DE10 (配列番号675), D300-DF5 (配列番号676), D300-DF6 (配列番号677), D300-DF8 (配列番号678)およびD300-DF12 (配列番号679)の核酸配列である。
図173-19は、D300-DG1 (配列番号680), D300-DG3 (配列番号681), D300-DG9 (配列番号682), D300-DG11 (配列番号683), D300-DH10 (配列番号684), D301-AB10 (配列番号685)およびD301-AC5 (配列番号686)の核酸配列である。
図173-20は、D301-AC7 (配列番号687), D301-AC9 (配列番号688), D301-AD1 (配列番号689), D301-AD2 (配列番号690), D301-AE4c (配列番号691), D301-AF12 (配列番号692), D301-AH6 (配列番号693)およびD301-AH12 (配列番号694)の核酸配列である。
図173-21は、D301-BB8 (配列番号695), D301-BB9 (配列番号696), D301-BC1 (配列番号697), D301-BC8 (配列番号698), D301-BD1 (配列番号699), D301-BD2 (配列番号700)およびD301-BF3 (配列番号701)の核酸配列である。
図173-22は、D301-DA4 (配列番号702), D301-DA8 (配列番号703), D301-DB5 (配列番号704), D301-DC6 (配列番号705), D301-DD4 (配列番号706), D301-DG1 (配列番号707), D301-DG4c (配列番号708)およびD301-EA5 (配列番号709)の核酸配列である。
図173-23は、D301-EA6 (配列番号710), D301-EA7 (配列番号711), D301-EC9 (配列番号712), D301-EC10 (配列番号713), D301-ED5 (配列番号714), D301-ED7 (配列番号715)およびD301-EE7 (配列番号716)の核酸配列である。
図173-24は、D301-EF2 (配列番号717), D301-EF5 (配列番号718), D301-EF10 (配列番号719), D301-EG12 (配列番号720), D302-AB8 (配列番号721), D302-AB9 (配列番号722), D302-AB12 (配列番号723)およびD302-AC1 (配列番号724)の核酸配列である。
図173-25は、D302-AC5 (配列番号725), D302-AC6 (配列番号726), D302-AC7 (配列番号727), D302-AC12 (配列番号728), D302-AD4 (配列番号729), D302-AD7 (配列番号730)およびD302-AE7 (配列番号731)の核酸配列である。
図173-26は、D302-AF6 (配列番号732), D302-AF8 (配列番号733), D302-AG2 (配列番号734), D302-AH10 (配列番号735), D302-BA2 (配列番号736), D302-BA6 (配列番号737), D302-BC3 (配列番号738)およびD302-BC6 (配列番号739)の核酸配列である。
図173-27は、D302-BC9 (配列番号740), D302-BD3 (配列番号741), D302-BD7 (配列番号742), D302-BD9 (配列番号743), D302-BE1 (配列番号744)およびD302-BE2 (配列番号745)の核酸配列である。
図173-28は、D302-BE6 (配列番号746), D302-BE7 (配列番号747), D302-BF1 (配列番号748), D302-BF5 (配列番号749), D302-BG1 (配列番号750), D302-bg3 (配列番号751)およびD302-BG7 (配列番号752)の核酸配列である。
図173-29は、D302-Bg9 (配列番号753), D302-BH1 (配列番号754), D302-bh9 (配列番号755), D302-CA5 (配列番号756), D302-CB7 (配列番号757), D302-CC1 (配列番号758), D302-CC3 (配列番号759)およびD302-CD2 (配列番号760)の核酸配列である。
図173-30は、D302-CE3 (配列番号761), D302-CE9 (配列番号762), D302-CF2 (配列番号763), D302-CF5 (配列番号764), D302-CF6 (配列番号765), D302-CH1 (配列番号766)およびD302-CH4 (配列番号767)の核酸配列である。
図173-31は、D302-CH5 (配列番号768), D302-CH6 (配列番号769), D302-DA2 (配列番号770), D302-DA5 (配列番号771), D302-DA9 (配列番号772), D302-DC4 (配列番号773)およびD302-DC7 (配列番号774)の核酸配列である。
図173-32は、D302-DC8 (配列番号775), D302-DC11 (配列番号776), D302-DD3 (配列番号777), D302-DF5 (配列番号778), D302-DF7 (配列番号779), D302-DG9 (配列番号780)およびD302-DH8 (配列番号781)の核酸配列である。
図173-33は、D303-AA9 (配列番号782), D303-AA10 (配列番号783), D303-AB11 (配列番号784), D303-AC4 (配列番号785), D303-AD3 (配列番号786), D303-AD11 (配列番号787), D303-AE1 (配列番号788)およびD303-ae2 (配列番号789)の核酸配列である。
図173-34は、D303-ae6 (配列番号790), D303-AF5 (配列番号791), D303-AF12 (配列番号792), D303-AG1 (配列番号793), D303-AG8 (配列番号794), D303-AG9 (配列番号795), D303-AH5 (配列番号796)およびD303-BA1 (配列番号797)の核酸配列である。
図173-35は、D303-BA5 (配列番号798), D303-BB6 (配列番号799), D303-BC1 (配列番号800), D303-BC2 (配列番号801), D303-BC8 (配列番号802), D303-BC11 (配列番号803), D303-bd2 (配列番号804)およびD303-BD6 (配列番号805)の核酸配列である。
図173-36は、D303-BD9 (配列番号806), D303-BE3 (配列番号807), D303-BE4 (配列番号808), D303-BE7 (配列番号809), D303-BF1 (配列番号810), D303-BF6 (配列番号811), D303-BG2 (配列番号812)およびD303-BG11 (配列番号813)の核酸配列である。
図173-37は、D303-BH1 (配列番号814), D303-BH6 (配列番号815), D414-AG2 (配列番号816), D35-33 (配列番号817), D35-34 (配列番号818)およびD35-35 (配列番号819)の核酸配列である。
図173-38は、D35-41 (配列番号820), D35-43 (配列番号821), D35-51 (配列番号822)およびD35-AC4 (配列番号823)の核酸配列である。
図173-39は、D35-AC12 (配列番号824), D35-AE2 (配列番号825), D35-AE6 (配列番号826), D35-AF1 (配列番号827), D35-AF3 (配列番号828)およびD35-AG3 (配列番号829)の核酸配列である。
図173-40は、D35-BA5 (配列番号830), D35-BA12 (配列番号831), D35-BB1 (配列番号832), D35-BB3 (配列番号833)およびD35-BB10 (配列番号834)の核酸配列である。
図173-41は、D35-BB12 (配列番号835), D55-AA8 (配列番号836), D55-AB1 (配列番号837), D55-AB5 (配列番号838)およびD55-AB6 (配列番号839)の核酸配列である。
図173-42は、D55-AB7 (配列番号840), D55-AB10 (配列番号841), D55-AA2 (配列番号842), D55-AC2 (配列番号843)およびD55-AC5 (配列番号844)の核酸配列である。
図173-43は、D55-AC7 (配列番号845), D55-BA7 (配列番号846), D55-BA8 (配列番号847), D55-BA10 (配列番号848), D55-BA11 (配列番号849)およびD55-BB9 (配列番号850)の核酸配列である。
図173-44は、D55-BB10 (配列番号851), D55-BB12 (配列番号852), D55-BC4 (配列番号853), D55-BC5 (配列番号854), D55-AA6 (配列番号855)およびD56-AE5 (配列番号856)の核酸配列である。
図173-45は、D56-AA2 (配列番号857), D56-AA4 (配列番号858), D56-AA8 (配列番号859), D56-AA9 (配列番号860), D56-AB1 (配列番号861)およびD56-AB7 (配列番号862)の核酸配列である。
図173-46は、D56-AB9 (配列番号863), D56-AC9 (配列番号864), D56-AD3 (配列番号865), D56-AG8 (配列番号866)およびD56-AH1 (配列番号867)の核酸配列である。
図173-47は、D56-AH10 (配列番号868), D56-AE2 (配列番号869), D57-AB2 (配列番号870), D57-AB5 (配列番号871)およびD57-AB6 (配列番号872)の核酸配列である。
図173-48は、D57-AB8 (配列番号873), D57-AB11 (配列番号874), D57-AB12 (配列番号875), D57-AC1 (配列番号876), D57-AC4 (配列番号877)およびD57-AC12 (配列番号878)の核酸配列である。
図173-49は、D57-AD5 (配列番号879), D57-AD8 (配列番号880), D57-AD9 (配列番号881), D57-AE1 (配列番号882), D57-AE2 (配列番号883)およびD57-AE7 (配列番号884)の核酸配列である。
図173-50は、D57-AF2 (配列番号885), D57-AE12 (配列番号886), D57-AF3 (配列番号887), D57-AF5 (配列番号888)およびD57-AF9 (配列番号889)の核酸配列である。
図173-51は、D57-AG5 (配列番号890), D57-AG7 (配列番号891), D57-AG11 (配列番号892)およびD57-AH10 (配列番号893)の核酸配列である。
図173-52は、D58-AA3 (配列番号894), D58-AA5 (配列番号895), D58-AB3 (配列番号896), D58-AB5 (配列番号897)およびD58-AC1 (配列番号898)の核酸配列である。
図173-53は、D58-AC9 (配列番号899), D58-AC11 (配列番号900), D58-AD2 (配列番号901)およびD58-AD5 (配列番号902)の核酸配列である。
図173-54は、D58-AD7 (配列番号903), D58-AD8 (配列番号904), D58-AD10 (配列番号905), D58-AE1 (配列番号906)およびD58-AE2 (配列番号907)の核酸配列である。
図173-55は、D58-AE5 (配列番号908), D58-AE9 (配列番号909), D58-AE10 (配列番号910), D58-AE11 (配列番号911)およびD58-AF3 (配列番号912)の核酸配列である。
図173-56は、D58-AF6 (配列番号913), D58-AH4 (配列番号914), D58-AH7 (配列番号915), D58-AH9 (配列番号916)およびD58-AH10 (配列番号917)の核酸配列である。
図173-57は、D58-BA5 (配列番号918), D58-BA7 (配列番号919), D58-BB7 (配列番号920), D58-BC5 (配列番号921), D58-BD3 (配列番号922)およびD58-BD7 (配列番号923)の核酸配列である。
図173-58は、D58-BD8 (配列番号924), D58-BD10 (配列番号925), D58-BE2 (配列番号926), D58-BE11 (配列番号927)およびD58-BF1 (配列番号928)の核酸配列である。
図173-59は、D58-BF2 (配列番号929), D58-BG3 (配列番号930), D58-BG5 (配列番号931), D58-BG8 (配列番号932), D58-BG10 (配列番号933)およびD58-BG12 (配列番号934)の核酸配列である。
図173-60は、D58-BH10 (配列番号935), D58-BH8 (配列番号936), D58-BH2 (配列番号937), D60-AA1 (配列番号938), D60-AA2 (配列番号939)およびD60-AA3 (配列番号940)の核酸配列である。
図173-61は、D60-AA5 (配列番号941), D60-AA6 (配列番号942), D60-AA7 (配列番号943), D60-AA8 (配列番号944), D60-AA10 (配列番号945)およびD60-AA11 (配列番号946)の核酸配列である。
図173-62は、D60-AA12 (配列番号947), D60-AB3 (配列番号948), D60-AB5 (配列番号949), D60-AB6 (配列番号950), D60-AB7 (配列番号951)およびD60-AB8 (配列番号952)の核酸配列である。
図173-63は、D60-AB11 (配列番号953), D60-AC3 (配列番号954), D60-AC5 (配列番号955), D60-AC7 (配列番号956), D60-AC8 (配列番号957)およびD60-AC11 (配列番号958)の核酸配列である。
図173-64は、D60-AC12 (配列番号959), D60-AD3 (配列番号960), D60-AD4 (配列番号961), D60-AD5 (配列番号962), D60-AD7 (配列番号963)およびD60-AE1 (配列番号964)の核酸配列である。
図173-65は、D60-AE4 (配列番号965), D60-AE6 (配列番号966), D60-AE8 (配列番号967), D60-AE12 (配列番号968), D60-AF5 (配列番号969)およびD60-AF8 (配列番号970)の核酸配列である。
図173-66は、D60-AF11 (配列番号971), D60-AG1 (配列番号972), D60-AG10 (配列番号973), D60-AG12 (配列番号974), D60-AH1 (配列番号975)およびD60-AH5 (配列番号976)の核酸配列である。
図173-67は、D60-AH6 (配列番号977), D60-AH9 (配列番号978), D60-AH10 (配列番号979), D60-AH11 (配列番号980)およびD63-AA12 (配列番号981)の核酸配列である。
図173-68は、D64-4 (配列番号982), D64-AB4 (配列番号983), D64-AB10 (配列番号984), D65-AA6 (配列番号985)およびD65-AA7 (配列番号986)の核酸配列である。
図173-69は、D65-AA9 (配列番号987), D65-AB4 (配列番号988), D65-AB5 (配列番号989), D65-AB8 (配列番号990), D65-AB9 (配列番号991)およびD65-AB11 (配列番号992)の核酸配列である。
図173-70は、D65-AC1 (配列番号993), D65-AC6 (配列番号994), D65-AC10 (配列番号995), D65-AC11 (配列番号996), D65-AD3 (配列番号997)およびD65-AE1 (配列番号998)の核酸配列である。
図173-71は、D65-AE2 (配列番号999), D65-AE10 (配列番号1000), D65-AE11 (配列番号1001), D65-AE12 (配列番号1002), D65-AF1 (配列番号1003)およびD65-AF5 (配列番号1004)の核酸配列である。
図173-72は、D65-AF7 (配列番号1005), D65-AG11 (配列番号1006), D65-CE1 (配列番号1007), D65-CE2 (配列番号1008), D65-CE7 (配列番号1009)およびD65-CE9 (配列番号1010)の核酸配列である。
図173-73は、D65-CE12 (配列番号1011), D65-CF3 (配列番号1012), D65-CF10 (配列番号1013), D65-CF12 (配列番号1014), D65-CG2 (配列番号1015), D65-CG5 (配列番号1016)およびD65-CH3 (配列番号1017)の核酸配列である。
図173-74は、D65-CH4 (配列番号1018), D65-CH6 (配列番号1019), D65-CH8 (配列番号1020), D65-CH9 (配列番号1021), D65-CH11 (配列番号1022)およびD65-CH12 (配列番号1023)の核酸配列である。
図173-75は、D66-AA4 (配列番号1024), D66-AA5 (配列番号1025), D66-AA6 (配列番号1026), D66-AA9 (配列番号1027)およびD66-AB5 (配列番号1028)の核酸配列である。
図173-76は、D66-AB1 (配列番号1029), D66-AB7 (配列番号1030), D66-AC1 (配列番号1031), D66-AC2 (配列番号1032)およびD66-AC4 (配列番号1033)の核酸配列である。
図173-77は、D66-AC7 (配列番号1034), D66-AD1 (配列番号1035), D66-AD3 (配列番号1036)およびD66-AD6 (配列番号1037)の核酸配列である。
図173-78は、D66-AD8 (配列番号1038), D66-AE1 (配列番号1039), D66-AE3 (配列番号1040), D66-AE6 (配列番号1041), D66-AE8 (配列番号1042)およびD66-AF3 (配列番号2263)の核酸配列である。
図173-79は、D66-AF5 (配列番号1043), D66-AF8 (配列番号1044), D66-AF9 (配列番号1045)およびD66-AG1 (配列番号1046)の核酸配列である。
図173-80は、D66-AG4 (配列番号1047), D66-AG5 (配列番号1048), D66-AH4 (配列番号1049), D66-AH5 (配列番号1050), D66-AH7 (配列番号1051)およびD66-AH8 (配列番号1052)の核酸配列である。
図173-81は、D66-AH9 (配列番号1053), D66-BA3 (配列番号1054), D66-BA8 (配列番号1055)およびD66-BB1 (配列番号1056)の核酸配列である。
図173-82は、D66-BB2 (配列番号1057), D66-BB3 (配列番号1058), D66-BB5 (配列番号1059)およびD66-BB7 (配列番号1060)の核酸配列である。
図173-83は、D66-BB9 (配列番号1061), D66-BB10 (配列番号1062), D66-BC6 (配列番号1063), D66-BD1 (配列番号1064)およびD66-BD2 (配列番号1065)の核酸配列である。
図173-84は、D66-BD9 (配列番号1066), D67-AA2 (配列番号1067), D67-AA3 (配列番号1068), D67-AB1 (配列番号1069)およびD67-AC5 (配列番号1070)の核酸配列である。
図173-85は、D67-AD1 (配列番号1071), D67-AD4 (配列番号1072), D67-AD6 (配列番号1073), D67-AE2 (配列番号1074)およびD67-AE6 (配列番号1075)の核酸配列である。
図173-86は、D67-AF6 (配列番号1076), D67-AG1 (配列番号1077), D67-AG3 (配列番号1078), D67-AG5 (配列番号1079)およびD67-AG6 (配列番号1080)の核酸配列である。
図173-87は、D69-AA5 (配列番号1081), D69-AB1 (配列番号1082), D69-AB8 (配列番号1083), D69-AB9 (配列番号1084)およびD69-AC4 (配列番号1085)の核酸配列である。
図173-88は、D70A-AB10 (配列番号1086), D70A-AC2 (配列番号1087), D70A-AC3 (配列番号1088), D70A-AD3 (配列番号1089), D70A-AD5 (配列番号1090)およびD70A-AD6 (配列番号1091)の核酸配列である。
図173-89は、D70A-AD11 (配列番号1092), D70A-AE10 (配列番号1093), D70A-AF6 (配列番号1094), D70A-AF8 (配列番号1095), D70A-AF10 (配列番号1096), D70A-AH5 (配列番号1097)およびD70A-AH8 (配列番号1098)の核酸配列である。
図173-90は、D70A-BA3 (配列番号1099), D70A-BA6 (配列番号1100), D70A-BA10 (配列番号1101), D70A-BB8 (配列番号1102)およびD70A-BB11 (配列番号1103)の核酸配列である。
図173-91は、D70A-BC7 (配列番号1104), D70A-BD8 (配列番号1105), D70A-BE1 (配列番号1106), D70A-BE5 (配列番号1107), D70A-BE6 (配列番号1108)およびD70A-BE8 (配列番号1109)の核酸配列である。
図173-92は、D70A-BF2 (配列番号1110), D70A-BF3 (配列番号1111), D70A-BF10 (配列番号1112), D70A-BG9 (配列番号1113), D70A-BH8 (配列番号1114)およびD70-AE2 (配列番号1115)の核酸配列である。
図173-93は、D70-AE6 (配列番号1116), D70-AF3 (配列番号1117), D70-AG10 (配列番号1118), D70-AH7 (配列番号1119), D70-BE6 (配列番号1120)およびD70-BE7 (配列番号1121)の核酸配列である。
図173-94は、D70A-BC12 (配列番号1122), D72-AB2 (配列番号1123), D72-AB6 (配列番号1124), D73A-AA12 (配列番号1125)およびD73A-AB4 (配列番号1126)の核酸配列である。
図173-95は、D73A-AB9 (配列番号1127), D73A-AB11 (配列番号1128), D73A-AC1 (配列番号1129), D73A-AC3 (配列番号1130)およびD73A-AC8 (配列番号1131)の核酸配列である。
図173-96は、D73A-AD3 (配列番号1132), D73A-AE1 (配列番号1133), D73A-AE3 (配列番号1134), D73A-AE4 (配列番号1135), D73A-AE5 (配列番号1136)およびD73A-AE9 (配列番号1137)の核酸配列である。
図173-97は、D73A-AE10 (配列番号1138), D73A-AF3 (配列番号1139), D73A-AF4 (配列番号1140), D73A-AF7 (配列番号1141), D73A-AF8 (配列番号1142)およびD73A-AG11 (配列番号1143)の核酸配列である。
図173-98は、D73A-AH1 (配列番号1144), D73A-AH5 (配列番号1145), D73A-AH9 (配列番号1146), D73A-AH12 (配列番号1147), D73A-BA9 (配列番号1148)およびD73A-BB3 (配列番号1149)の核酸配列である。
図173-99は、D73A-BB9 (配列番号1150), D73A-BE1 (配列番号1151), D73A-BF3 (配列番号1152), D73A-BG1 (配列番号1153)およびD73A-BG3 (配列番号1154)の核酸配列である。
図173-100は、D73A-BG5 (配列番号1155), D73A-BH1 (配列番号1156), D73-AC1 (配列番号1157), D73-AD8 (配列番号1158)およびD73-AD12 (配列番号1159)の核酸配列である。
図173-101は、D80-AB2 (配列番号1160), D81-AA5 (配列番号1161), D81-AB4 (配列番号1162), D81-AB6 (配列番号1163)およびD81-AC5 (配列番号1164)の核酸配列である。
図173-102は、D82-AA8 (配列番号1165), D82-AC9 (配列番号1166), D82-AH9 (配列番号1167)およびD83-AD10 (配列番号1168)の核酸配列である。
図173-103は、D83-AG10 (配列番号1169), D84-AD3 (配列番号1170), D84-AE1 (配列番号1171), D84-AF4 (配列番号1172), D84-AG1 (配列番号1173)およびD87-AA1 (配列番号1174)の核酸配列である。
図173-104は、D87-AA3 (配列番号1175), D87A-AA1 (配列番号1176), D87A-AB1 (配列番号1177), D87A-AB3 (配列番号1178), D87A-AC1 (配列番号1179)およびD87A-AC3 (配列番号1180)の核酸配列である。
図173-105は、D87A-AF2 (配列番号1181), D87A-AG1 (配列番号1182), D87A-AH1 (配列番号1183), D87A-AH3 (配列番号1184), D87-AB2 (配列番号1185)およびD88-AA10 (配列番号1186)の核酸配列である。
図173-106は、D88-AB3 (配列番号1187), D88-AB6 (配列番号1188), D88-AB7 (配列番号1189), D88-AB8 (配列番号1190), D88-AC5 (配列番号1191)およびD88-AC9 (配列番号1192)の核酸配列である。
図173-107は、D88-AD8 (配列番号1193), D88-AE5 (配列番号1194), D88-AE6 (配列番号1195), D88-AE8 (配列番号1196)およびD91-AA4 (配列番号1197)の核酸配列である。
図173-108は、D92-AD9 (配列番号1198), D92-AE9 (配列番号1199), D92-AF8 (配列番号1200), D92-AG10 (配列番号1201), D92-AH9 (配列番号1202)およびD93-AA1 (配列番号1203)の核酸配列である。
図173-109は、D93-AA2 (配列番号1204), D93-AB1 (配列番号1205), D93-AC3 (配列番号1206), D93-AC4 (配列番号1207)およびD93-AD1 (配列番号1208)の核酸配列である。
図173-110は、D93-AE3 (配列番号1209), D93-AE4 (配列番号1210), D93-AF3 (配列番号1211), D93-AG1 (配列番号1212), D93-AH2 (配列番号1213)およびD93-AH3 (配列番号1214)の核酸配列である。
図173-111は、D93-AH4 (配列番号1215), D93-BA10 (配列番号1216), D93-BA12 (配列番号1217), D93-BD11 (配列番号1218), D93-BE11 (配列番号1219)およびD93-BF12 (配列番号1220)の核酸配列である。
図173-112は、D94-AA2 (配列番号1221), D94-AA3 (配列番号1222), D94-AB1 (配列番号1223), D94-AB2 (配列番号1224)およびD94-AC3 (配列番号1225)の核酸配列である。
図173-113は、D94-AD1 (配列番号1226), D94-AE1 (配列番号1227), D94-AE3 (配列番号1228), D94-AG2 (配列番号1229)およびD94-AH1 (配列番号1230)の核酸配列である。
図173-114は、D94-AH2 (配列番号1231), D94-AH3 (配列番号1232), D95-AC1 (配列番号1233), D95-AD2 (配列番号1234), D96-AA3 (配列番号1235)およびD96-AA4 (配列番号1236)の核酸配列である。
図173-115は、D96-AA7 (配列番号1237), D96-AB7 (配列番号2264), D96-AC5 (配列番号1238), D96-AC6 (配列番号1239)およびD96-AD6 (配列番号1240)の核酸配列である。
図173-116は、D96-AE6 (配列番号1241), D96-AG3 (配列番号1242), D96-AH8 (配列番号1243), D97-AA1 (配列番号1244), D97-AB1 (配列番号1245)およびD97-AB3 (配列番号1246)の核酸配列である。
図173-117は、D97-AD1 (配列番号1247), D97-AD2 (配列番号1248), D97-AD4 (配列番号1249), D97-AE1 (配列番号1250)およびD97-AE2 (配列番号1251)の核酸配列である。
図173-118は、D97-AE4 (配列番号1252), D97-AF3 (配列番号1253), D97-AG2 (配列番号1254), D97-AG3 (配列番号1255)およびD97-AH1 (配列番号1256)の核酸配列である。
図173-119は、D97-AH2 (配列番号1257), D97-AH4 (配列番号1258), D98-AB2 (配列番号1259), D98-AE3 (配列番号1260)およびD98-AF1 (配列番号1261の核酸配列)である。
図173-120は、D98-AH2 (配列番号1262), D99-AC5 (配列番号1263), D99-AC8 (配列番号1264), D99-AD2 (配列番号1265), D99-AD3 (配列番号1266)およびD99-AD4 (配列番号1267)の核酸配列である。
図173-121は、D99-AD6 (配列番号1268), D99-AE1 (配列番号1269), D99-AE5 (配列番号1270), D99-AE6 (配列番号1271), D99-AE7 (配列番号1272)およびD99-AE8 (配列番号1273)の核酸配列である。
図173-122は、D99-AF1 (配列番号1274), D99-AF5 (配列番号1275), D99-AF7 (配列番号1276), D99-AG2 (配列番号1277), D99-AG4 (配列番号1278), D99-AG7 (配列番号1279)およびD99-AH2 (配列番号1280)の核酸配列である。
図173-123は、D99-AH10 (配列番号1281), D99-DA3 (配列番号1282), D99-DB5 (配列番号1283), D99-DC2 (配列番号1284)およびD99-DC3 (配列番号1285)の核酸配列である。
図173-124は、D99-DD5 (配列番号1286), D99-DG4 (配列番号1287), D100A-AA4 (配列番号1288)およびD101-BG2 (配列番号1289)の核酸配列である。
図173-125は、D101A-AC2 (配列番号1290), D101A-AD1 (配列番号1291), D101A-AD2 (配列番号1292), D101A-AE1 (配列番号1293)およびD101A-AF1 (配列番号1294)の核酸配列である。
図173-126は、D101C-AA1 (配列番号1295), D101C-AB1 (配列番号1296), D101C-AC1 (配列番号1297), D101C-AD3 (配列番号1298)およびD101C-BD12 (配列番号1299)の核酸配列である。
図173-127は、D101C-BE12 (配列番号1300), D101C-BF12 (配列番号1301), D101C-BG12 (配列番号1302)およびD101D-AB6 (配列番号1303)の核酸配列である。
図173-128は、D101D-AC5 (配列番号1304), D101D-AG5 (配列番号1305), D101D-AG6 (配列番号1306), D101D-AH4 (配列番号1307)およびD101D-AH6 (配列番号1308)の核酸配列である。
図173-129は、D101D-BB11 (配列番号1309), D101D-BD11 (配列番号1310), D107-AA3 (配列番号1311), D107-AB2 (配列番号1312), D107-AC2 (配列番号1313)およびD107-AC3 (配列番号1314)の核酸配列である。
図173-130は、D107-AD2 (配列番号1315), D107-AD3 (配列番号1316), D107-AF1 (配列番号1317), D107-AH1 (配列番号1318), D108-AA6 (配列番号1319)およびD108-AB4 (配列番号1320)の核酸配列である。
図173-131は、D108-AB5 (配列番号1321), D108-AC6 (配列番号1322), D108-AD6 (配列番号1323), D108-AF6 (配列番号1324), D109-AA7 (配列番号1325)およびD109-AA8 (配列番号1326)の核酸配列である。
図173-132は、D109-AA9 (配列番号1327), D109-AB8 (配列番号1328), D109-AC7 (配列番号1329), D109-AC8 (配列番号1330), D109-AC9 (配列番号1331)およびD109-AE7 (配列番号1332)の核酸配列である。
図173-133は、D109-AF9 (配列番号1333), D109-AH7 (配列番号1334), D110-AB11 (配列番号1335), D110-AF10 (配列番号1336), D111-AA2 (配列番号1337)およびD111-AB1 (配列番号1338)の核酸配列である。
図173-134は、D111-AB3 (配列番号1339), D111-AC3 (配列番号1340), D111-AD1 (配列番号1341), D111-AF1 (配列番号1342)およびD111-AG3 (配列番号1343)の核酸配列である。
図173-135は、D111-AH1 (配列番号1344), D111-AH2 (配列番号1345), D112-AD6 (配列番号1346), D112-AE6 (配列番号1347)およびD112-AF5 (配列番号1348)の核酸配列である。
図173-136は、D112-AG5 (配列番号1349), D112-AH4 (配列番号1350), D113-AA9 (配列番号1351), D113A-AC3 (配列番号1352)およびD113A-AD1 (配列番号1353)の核酸配列である。
図173-137は、D113A-AD3 (配列番号1354), D113A-AF3 (配列番号1355), D113A-AG2 (配列番号1356), D113A-AH2 (配列番号1357), D113-AB9 (配列番号1358)およびD113-AC7 (配列番号1359)の核酸配列である。
図173-138は、D113-AD8 (配列番号1360), D113-AD9 (配列番号1361), D113-AE7 (配列番号1362), D113-AF8 (配列番号1363)およびD113-AF9 (配列番号1364)の核酸配列である。
図173-139は、D113-AG7 (配列番号1365), D113-AG9 (配列番号1366), D114-AE10 (配列番号1367), D114-AF11 (配列番号1368)およびD115-AA6 (配列番号1369)の核酸配列である。
図173-140は、D133-AA7 (配列番号1370), D133-AE8 (配列番号1371), D133-AF9 (配列番号1372), D133-AG8 (配列番号1373), D138-AD10 (配列番号1374)およびD139-AD1 (配列番号1375)の核酸配列である。
図173-141は、D140-AA4 (配列番号1376), D140-AD4 (配列番号1377), D140-AF4 (配列番号1378), D141-AA7 (配列番号1379), D141-AB7 (配列番号1380)およびD142-AB11 (配列番号1381)の核酸配列である。
図173-142は、D142-AC10 (配列番号1382), D142-AE10 (配列番号1383), D142-AE11 (配列番号1384), D142-AF10 (配列番号1385), D144-AA1 (配列番号1386)およびD144A-AA9 (配列番号1387)の核酸配列である。
図173-143は、D144A-AB12 (配列番号1388), D144A-AC9 (配列番号1389), D144A-AC10 (配列番号1390), D144A-AD12 (配列番号1391), D144A-AE12 (配列番号1392)およびD144A-AF11 (配列番号1393)の核酸配列である。
図173-144は、D144A-AF12 (配列番号1394), D144A-AG11 (配列番号1395), D144A-AH9 (配列番号1396), D144A-AH11 (配列番号1397)およびD144-AE4 (配列番号1398)の核酸配列である。
図173-145は、D144-AH3 (配列番号1399), D145-AA8 (配列番号1400), D145-AC10 (配列番号1401), D145-AD7 (配列番号1402), D145-AD9 (配列番号1403)およびD145-AD10 (配列番号1404)の核酸配列である。
図173-146は、D145-AE7 (配列番号1405), D145-AF7 (配列番号1406), D145-AF8 (配列番号1407), D145-AG8 (配列番号1408), D145-AG9 (配列番号1409)およびD145-AG10 (配列番号1410)の核酸配列である。
図173-147は、D145-AH9 (配列番号1411), D146-BB2 (配列番号1412), D146-BC1 (配列番号1413), D146-BD1 (配列番号1414)およびD146-BD2 (配列番号1415)の核酸配列である。
図173-148は、配列D146-BF2 (配列番号1416), D147-AE2 (配列番号1417), D150-AA2 (配列番号1418), D150-AC2 (配列番号1419)およびD150-AD1 (配列番号1420)の核酸である。
図173-149は、D151-AA1 (配列番号1421), D152-AA2 (配列番号1422), D152-AB2 (配列番号1423), D152-AC1 (配列番号1424), D152-AD2 (配列番号1425)およびD152-AG2 (配列番号1426)の核酸配列である。
図173-150は、D152-AH2 (配列番号1427), D153-AA7 (配列番号1428), D153-AB2 (配列番号1429), D153-AF2 (配列番号1430), D153-AF7 (配列番号1431)およびD153-AF9 (配列番号1432)の核酸配列である。
図173-151は、の核酸配列D153-AG6 (配列番号1433), D153-AG7 (配列番号1434), D153-AG9 (配列番号1435), D153-AH6 (配列番号1436)およびD153-AH9 (配列番号1437)である。
図173-152は、D154-AC2 (配列番号1438), D154-AE9 (配列番号1439), D155-AB1 (配列番号1440), D155-AC1 (配列番号1441)およびD155-AC2 (配列番号1442)の核酸配列である。
図173-153は、D155-AE1 (配列番号1443), D155-AE2 (配列番号1444), D155-AF1 (配列番号1445), D155-AF2 (配列番号1446)およびD155-AH2 (配列番号1447)の核酸配列である。
図173-154は、D156-AB1 (配列番号1448), D156-AC3 (配列番号1449), D156-AC4 (配列番号1450), D156-AD3 (配列番号1451)およびD156-AF2 (配列番号1452)の核酸配列である。
図173-155は、D156-AF4 (配列番号1453), D156-AG1 (配列番号1454), D156-AG2 (配列番号1455), D156-AG4 (配列番号1456)およびD156-AH1 (配列番号1457)の核酸配列である。
図173-156は、D157-AG4 (配列番号1458), D158-AB8 (配列番号1459), D158-AD5 (配列番号1460), D158-AD6 (配列番号1461)およびD158-AD8 (配列番号1462)の核酸配列である。
図173-157は、D158-AE8 (配列番号1463), D159-AD2 (配列番号1464), D160-AB4 (配列番号1465), D160-AC4 (配列番号1466)およびD160-AE4 (配列番号1467)の核酸配列である。
図173-158は、D160-AF4 (配列番号1468), D160-AH4 (配列番号1469), D161-AE5 (配列番号1470), D161-AH5 (配列番号1471), D164-AB1 (配列番号1472)およびD164-AB3 (配列番号1473)の核酸配列である。
図173-159は、D164-AC1 (配列番号1474), D164-AC2 (配列番号1475), D164-AC5 (配列番号1476), D164-AE1 (配列番号1477)およびD164-AF1 (配列番号1478)の核酸配列である。
図173-160は、D165-AH8 (配列番号1479), D177-BB7 (配列番号1480), D178-AA6 (配列番号1481), D178-AD5 (配列番号1482)およびD180-AA9 (配列番号1483)の核酸配列である。
図173-161は、D181-AB6 (配列番号1484), D181-AC6 (配列番号1485), D181-AD7 (配列番号1486), D181-AG7 (配列番号1487)およびD181-AH6 (配列番号1488)の核酸配列である。
図173-162は、D182-AA1 (配列番号1489), D182-AA2 (配列番号1490), D182-AA4 (配列番号1491), D182-AB2 (配列番号1492)およびD182-AC2 (配列番号1493)の核酸配列である。
図173-163は、D182-AC4 (配列番号1494), D182-AD1 (配列番号1495), D182-AD3 (配列番号1496), D182-AF1 (配列番号1497)およびD182-AF4 (配列番号1498)の核酸配列である。
図173-164は、D182-AG1 (配列番号1499), D183-AC8 (配列番号1500), D185-AB10 (配列番号1501), D185-AC10 (配列番号1502), D185-AF10 (配列番号1503)およびD185-BA1 (配列番号1504)の核酸配列である。
図173-165は、D185-BB3 (配列番号1505), D186-AA3 (配列番号1506), D186-AB4 (配列番号1507), D186-AC2 (配列番号1508), D186-AC3 (配列番号1509)およびD186-AD2 (配列番号1510)の核酸配列である。
図173-166は、D186-AD3 (配列番号1511), D186-AE3 (配列番号1512), D187-AB2 (配列番号1513), D187-AB3 (配列番号1514), D187-AC4 (配列番号1515), D187-AE4 (配列番号1516)およびD187-AF4 (配列番号1517)の核酸配列である。
図173-167は、D187-AG1 (配列番号1518), D187-AG2 (配列番号1519), D187-AG3 (配列番号1520), D187-AH2 (配列番号1521), D184-AA1 (配列番号1522)およびD188-AC7 (配列番号1523)の核酸配列である。
図173-168は、D188-AC8 (配列番号1524), D188-AD8 (配列番号1525), D188-AE8 (配列番号1526), D188-AF6 (配列番号1527), D188-AG5 (配列番号1528)およびD188-AG7 (配列番号1529)の核酸配列である。
図173-169は、D188-AH7 (配列番号1530), D189-AA12 (配列番号1531), D189-AB10 (配列番号1532), D189-AE9 (配列番号1533), D189-AE12 (配列番号1534)およびD189-AF12 (配列番号1535)の核酸配列である。
図173-170は、D189-AG10 (配列番号1536), D190-BA6 (配列番号1537), D190-BD6 (配列番号1538), D190-BF6 (配列番号1539), D190-BG6 (配列番号1540)およびD190-BH6 (配列番号1541)の核酸配列である。
図173-171は、D191-BC5 (配列番号1542), D191-BD5 (配列番号1543), D191-BF5 (配列番号1544), D191-BG5 (配列番号1545)およびD194-AA1 (配列番号1546)の核酸配列である。
図173-172は、D194-AA2 (配列番号1547), D194-AB1 (配列番号1548), D194-AB2 (配列番号1549), D194-AC1 (配列番号1550)およびD194-AC2 (配列番号1551)の核酸配列である。
図173-173は、D194-AD1 (配列番号1552), D194-AD2 (配列番号1553), D194-AD3 (配列番号1554), D194-AE1 (配列番号1555)およびD194-AE2 (配列番号1556)の核酸配列である。
図173-174は、D194-AE3 (配列番号1557), D194-AF1 (配列番号1558), D194-AF2 (配列番号1559), D194-AG2 (配列番号1560)およびD194-AG3 (配列番号1561)の核酸配列である。
図173-175は、D194-AH1 (配列番号1562), D194-AH2 (配列番号1563), D194-AH3 (配列番号1564), D195-AB6 (配列番号1565), D195-AD5 (配列番号1566)およびD195-AE4 (配列番号1567)の核酸配列である。
図173-176は、D195-AE5 (配列番号1568), D195-AG5 (配列番号1569), D195-AH5 (配列番号1570), D196-AD7 (配列番号1571)およびD196-AF7 (配列番号1572)の核酸配列である。
図173-177は、D196-AG7 (配列番号1573), D197-AE8 (配列番号1574), D198-AB9 (配列番号1575), D198-AC9 (配列番号1576)およびD198-AF9 (配列番号1577)の核酸配列である。
図173-178は、D199-AA10 (配列番号1578), D199-AB10 (配列番号1579), D199-AD10 (配列番号1580), D199-AF10 (配列番号1581)およびD199-AG10 (配列番号1582)の核酸配列である。
図173-179は、D200-AB11 (配列番号1583), D200-AC11 (配列番号1584), D200-AD11 (配列番号1585), D200-AE11 (配列番号1586)およびD200-AG11 (配列番号1587)の核酸配列である。
図173-180は、D200-AH11 (配列番号1588), D201-AD12 (配列番号1589), D201-AE12 (配列番号1590), D201-AF12 (配列番号1591), D201-AG12 (配列番号1592)およびD203-BE11 (配列番号1593)の核酸配列である。
図173-181は、D203-BF11 (配列番号1594), D204-AA1 (配列番号1595), D204-AA2 (配列番号1596), D204-AA4 (配列番号1597)およびD204-AB1 (配列番号1598)の核酸配列である。
図173-182は、D204-AB3 (配列番号1599), D204-AC1 (配列番号1600), D204-AC2 (配列番号1601), D204-AC4 (配列番号1602)およびD204-AD1 (配列番号1603)の核酸配列である。
図173-183は、D204-AD2 (配列番号1604), D204-AD3 (配列番号1605), D204-AD4 (配列番号1606), D204-AE3 (配列番号1607)およびD204-AE4 (配列番号1608)の核酸配列である。
図173-184は、D204-AF1 (配列番号1609), D204-AF3 (配列番号1610), D204-AF4 (配列番号1611), D204-AG1 (配列番号1612)およびD204-AG2 (配列番号1613)の核酸配列である。
図173-185は、D204-AG3 (配列番号1614), D203-BA11 (配列番号1615), D204-AG4 (配列番号1616), D204-AH2 (配列番号1617)およびD204-AH1 (配列番号1618)の核酸配列である。
図173-186は、D204-AH3 (配列番号1619), D205-BC9 (配列番号1620), D205-BD9 (配列番号1621), D206-CB3 (配列番号1622), D206-CE3 (配列番号1623)およびD206-CF3 (配列番号1624)の核酸配列である。
図173-187は、D206-CG1 (配列番号1625), D206-CH1 (配列番号1626), D210-BF4 (配列番号1627)およびD210-BF6 (配列番号1628)の核酸配列である。
図173-188は、D210-BH6 (配列番号1629), D211-BA9 (配列番号1630), D211-BB8 (配列番号1631), D211-BB9 (配列番号1632), D211-BC9 (配列番号1633)およびD211-BD8 (配列番号1634)の核酸配列である。
図173-189は、D211-BD9 (配列番号1635), D211-BE7 (配列番号1636), D211-BE8 (配列番号1637)およびD211-BF8 (配列番号1638)の核酸配列である。
図173-190は、D211-BF9 (配列番号1639), D211-BG8 (配列番号1640), D211-BH7 (配列番号1641), D212-BB11 (配列番号1642)およびD212-BB12 (配列番号1643)の核酸配列である。
図173-191は、D212-BD10 (配列番号1644), D212-BD11 (配列番号1645), D212-BE10 (配列番号1646), D212-BE11 (配列番号1647), D212-BF10 (配列番号1648)およびD212-BF11 (配列番号1649)の核酸配列である。
図173-192は、D213-BD1 (配列番号1650), D213-BF2 (配列番号1651), D214-AA1 (配列番号1652), D214-AA3 (配列番号1653)およびD214-AC1 (配列番号1654)の核酸配列である。
図173-193は、D214-AE1 (配列番号1655), D214-AE3 (配列番号1656), D214-AG1 (配列番号1657), D214-AH2 (配列番号1658)およびD214-AH3 (配列番号1659)の核酸配列である。
図173-194は、D216-AB7 (配列番号1660), D216-AC8 (配列番号1661), D216-AH9 (配列番号1662), D219-BA1 (配列番号1663), D219-BB1 (配列番号1664)およびD219-BB2 (配列番号1665)の核酸配列である。
図173-195は、D219-BC1 (配列番号1666), D219-BD1 (配列番号1667), D219-BD2 (配列番号1668), D219-BE1 (配列番号1669), D219-BE2 (配列番号1670)およびD219-BF2 (配列番号1671)の核酸配列である。
図173-196は、D219-BH1 (配列番号1672), D220-BF6 (配列番号1673), D220-BD6 (配列番号1674), D223-BC11 (配列番号1675)およびD221-BC7 (配列番号1676)の核酸配列である。
図173-197は、D227-AE3 (配列番号1677), D223-BB10 (配列番号1678), D221-BF9 (配列番号1679), D229-AD2 (配列番号1680), D229-AE2 (配列番号1681), D229-AF2 (配列番号1682)およびD229-AG1 (配列番号1683)の核酸配列である。
図173-198は、D229-AH1 (配列番号1684), D230-AB1 (配列番号1685), D230-AC1 (配列番号1686), D230-AC2 (配列番号1687), D230-AF2 (配列番号1688)およびD230-AG1 (配列番号1689)の核酸配列である。
図173-199は、D230-AG2 (配列番号1690), D231-AA1 (配列番号1691), D231-AA2 (配列番号1692), D231-AA3 (配列番号1693), D231-AC1 (配列番号1694)およびD231-AC2 (配列番号1695)の核酸配列である。
図173-200は、D231-AD2 (配列番号1696), D231-AE1 (配列番号1697), D231-AG2 (配列番号1698), D231-AH1 (配列番号1699), D231-AH2 (配列番号1700)およびD231-AH3 (配列番号1701)の核酸配列である。
図173-201は、D232-AD4 (配列番号1702), D232-AE5 (配列番号1703), D232-AE6 (配列番号1704)およびD232-AF5 (配列番号1705)の核酸配列である。
図173-202は、D233-AA7 (配列番号1706), D233-AA8 (配列番号1707), D233-AB7 (配列番号1708), D233-AC7 (配列番号1709)およびD233-AC8 (配列番号1710)の核酸配列である。
図173-203は、D233-AH9 (配列番号1711), D234-AA11 (配列番号1712), D234-AC11 (配列番号1713), D234-AD11 (配列番号1714), D238-AA2 (配列番号1715)およびD239-BC3 (配列番号1716)の核酸配列である。
図173-204は、D239-BD4 (配列番号1717), D239-BD6 (配列番号1718), D239-BE4 (配列番号1719), D240-BB7 (配列番号1720)およびD241-BC9 (配列番号1721)の核酸配列である。
図173-205は、D241-BE9 (配列番号1722), D242-BA11 (配列番号1723), D242-BB11 (配列番号1724), D242-BB12 (配列番号1725), D242-BC12 (配列番号1726)およびD242-BF12 (配列番号1727)の核酸配列である。
図173-206は、D242-BG12 (配列番号1728), D242-BH11 (配列番号1729), D244-AA5 (配列番号1730), D244-AA6 (配列番号1731), D244-AF6 (配列番号1732)およびD245-AE7 (配列番号1733)の核酸配列である。
図173-207は、D245-AE8 (配列番号1734), D245-AF7 (配列番号1735), D246-AA12 (配列番号1736), D248-AG4 (配列番号1737)およびD249-AG9 (配列番号1738)の核酸配列である。
図173-208は、D250-AE10 (配列番号1739), D251-AF2 (配列番号1740), D251-AG2 (配列番号1741), D252-AA5 (配列番号1742)およびD252-AB5 (配列番号1743)の核酸配列である。
図173-209は、D252-AC5 (配列番号1744), D252-AD5 (配列番号1745), D252-AF4 (配列番号1746), D252-AF5 (配列番号1747), D252-AG5 (配列番号1748)およびD254-AE2 (配列番号1749)の核酸配列である。
図173-210は、D254-AG2 (配列番号1750), D255-AA5 (配列番号1751), D255-AA6 (配列番号1752), D255-AD5 (配列番号1753)およびD255-AD6 (配列番号1754)の核酸配列である。
図173-211は、D255-AF5 (配列番号1755), D255-AG5 (配列番号1756), D256-AA10 (配列番号1757)およびD256-AB10 (配列番号1758)の核酸配列である。
図173-212は、D256-AC10 (配列番号1759), D256-AE10 (配列番号1760), D256-AF9 (配列番号1761), D256-AF10 (配列番号1762)およびD256-AG10 (配列番号1763)の核酸配列である。
図173-213は、D256-AH10 (配列番号1764), D258-AC5 (配列番号1765), D263-AE12 (配列番号1766), D263-AF12 (配列番号1767)およびD263-AH12 (配列番号1768)の核酸配列である。
図173-214は、D264-AA1 (配列番号1769), D264-AA2 (配列番号1770), D264-AA3 (配列番号1771), D264-AB2 (配列番号1772)およびD264-AC3 (配列番号1773)の核酸配列である。
図173-215は、D264-AD3 (配列番号1774), D264-AE1 (配列番号1775), D264-AE2 (配列番号1776)およびD264-AE3 (配列番号1777)の核酸配列である。
図173-216は、D264-AF2 (配列番号1778), D264-AG2 (配列番号1779), D264-AH2 (配列番号1780)およびD265-AA4 (配列番号1781)の核酸配列である。
図173-217は、D265-AA6 (配列番号1782), D265-AC5 (配列番号1783), D265-AC6 (配列番号1784)およびD265-AD4 (配列番号1785)の核酸配列である。
図173-218は、D265-AD5 (配列番号1786), D266-AB7 (配列番号1787), D266-AB8 (配列番号1788), D266-AC9 (配列番号1789)およびD266-AD7 (配列番号1790)の核酸配列である。
図173-219は、D267-AD10 (配列番号1791), D268-AA2 (配列番号1792), D268-AC3 (配列番号1793), D268-AD1 (配列番号1794)およびD268-AD2 (配列番号1795)の核酸配列である。
図173-220は、D268-AD3 (配列番号1796), D268-AE3 (配列番号1797), D268-AG2 (配列番号1798)およびD268-AG3 (配列番号1799)の核酸配列である。
図173-221は、D269-AA5 (配列番号1800), D269-AD4 (配列番号1801), D269-AE4 (配列番号1802), D269-AF5 (配列番号1803), D269-AF6 (配列番号1804)およびD270-AA8 (配列番号1805)の核酸配列である。
図173-222は、D270-AB9 (配列番号1806), D270-AD8 (配列番号1807), D270-AD9 (配列番号1808), D270-AE9 (配列番号1809)およびD270-AF8 (配列番号1810)の核酸配列である。
図173-223は、D271-AG11 (配列番号1811), D271-AH11 (配列番号1812), D276-AD5 (配列番号1813)およびD276-AG6 (配列番号1814)の核酸配列である。
図173-224は、D276-AH4 (配列番号1815), D276-AH6 (配列番号1816), D277-AE8 (配列番号1817), D277-AF9 (配列番号1818)およびD277-AH9 (配列番号1819)の核酸配列である。
図173-225は、D278-AF10 (配列番号1820), D279-AA3 (配列番号1821), D279-AB2 (配列番号1822), D279-AC1 (配列番号1823)およびD279-AD2 (配列番号1824)の核酸配列である。
図173-226は、D279-AE1 (配列番号1825), D279-AE3 (配列番号1826), D279-AG3 (配列番号1827), D279-BA1 (配列番号1828)およびD279-BA2 (配列番号1829)の核酸配列である。
図173-227は、D279-BB3 (配列番号1830), D279-BC2 (配列番号1831), D279-BD2 (配列番号1832), D279-BE2 (配列番号1833)およびD279-BF3 (配列番号1834)の核酸配列である。
図173-228は、D279-BG1 (配列番号1835), D279-BH3 (配列番号1836), D280-AB5 (配列番号1837), D280-AB6 (配列番号1838)およびD280-AC4 (配列番号1839)の核酸配列である。
図173-229は、D280-AC6 (配列番号1840), D280-AD4 (配列番号1841), D280-AD5 (配列番号1842), D280-AD6 (配列番号1843)およびD280-AE4 (配列番号1844)の核酸配列である。
図173-230は、D280-AE5 (配列番号1845), D280-AE6 (配列番号1846), D280-AF5 (配列番号1847), D280-AF6 (配列番号1848)およびD280-AG4 (配列番号1849)の核酸配列である。
図173-231は、D280-AG5 (配列番号1850), D280-AG6 (配列番号1851), D280-AH4 (配列番号1852), D280-AH5 (配列番号1853)およびD280-BC4 (配列番号1854)の核酸配列である。
図173-232は、D280-BD4 (配列番号1855), D280-BE4 (配列番号1856), D280-BE6 (配列番号1857)およびD280-BF4 (配列番号1858)の核酸配列である。
図173-233は、D280-BG4 (配列番号1859), D280-BH4 (配列番号1860), D280-BH6 (配列番号1861), D281-AA8 (配列番号1862)およびD281-AD7 (配列番号1863)の核酸配列である。
図173-234は、D281-AD8 (配列番号1864), D281-AE7 (配列番号1865), D281-AE8 (配列番号1866), D281-AE9 (配列番号1867), D281-AG7 (配列番号1868)およびD282-AB10 (配列番号1869)の核酸配列である。
図173-235はD282-AB11 (配列番号1870), D282-AD10 (配列番号1871), D282-AH11 (配列番号1872), D282-BA10 (配列番号1873), D282-BB10 (配列番号1874)およびD282-BD10 (配列番号1875)、の核酸配列である。
図173-236は、D288-AB3 (配列番号1876), D289-AA4 (配列番号1877), D289-AA6 (配列番号1878), D289-AB4 (配列番号1879)およびD289-AB6 (配列番号1880)の核酸配列である。
図173-237は、D289-AD4 (配列番号1881), D289-AE4 (配列番号1882), D289-AE6 (配列番号1883), D289-AF4 (配列番号1884)およびD289-AF6 (配列番号1885)の核酸配列である。
図173-238は、D289-AG4 (配列番号1886), D289-AG6 (配列番号1887), D289-AH4 (配列番号1888), D289-AH6 (配列番号1889)およびD290-AA7 (配列番号1890)の核酸配列である。
図173-239は、D290-AA8 (配列番号1891), D290-AA9 (配列番号1892), D290-AB7 (配列番号1893), D290-AB9 (配列番号1894)およびD290-AC8 (配列番号1895)の核酸配列である。
図173-240は、D290-AC9 (配列番号1896), D290-AD7 (配列番号1897), D290-AD8 (配列番号1898), D290-AD9 (配列番号1899)およびD291-AA12 (配列番号1900)の核酸配列である。
図173-241は、D291-AB10 (配列番号1901), D291-AB11 (配列番号1902), D291-AC12 (配列番号1903), D291-AD11 (配列番号1904)およびD291-AD12 (配列番号1905)の核酸配列である。
図173-242は、D291-AE10 (配列番号1906), D291-AE12 (配列番号1907), D291-AF10 (配列番号1908), D291-AF12 (配列番号1909)およびD291-AG11 (配列番号1910)の核酸配列である。
図173-243は、D291-AG12 (配列番号1911), D291-AH11 (配列番号1912), D292-AA2 (配列番号1913), D292-AA3 (配列番号1914), D292-AB2 (配列番号1915)およびD292-AC2 (配列番号1916)の核酸配列である。
図173-244は、D292-AD1 (配列番号1917), D292-AD2 (配列番号1918), D292-AE1 (配列番号1919), D292-AE2 (配列番号1920), D292-AF1 (配列番号1921), D292-AF3 (配列番号1922)およびD292-AH3 (配列番号1923)の核酸配列である。
図173-245は、D291-AA10 (配列番号1924), D294-AB7 (配列番号1925), D294-AB8 (配列番号1926), D294-AB9 (配列番号1927)およびD294-AC7 (配列番号1928)の核酸配列である。
図173-246は、D294-AC8 (配列番号1929), D294-AE9 (配列番号1930), D294-AG8 (配列番号1931), D294-AH7 (配列番号1932)およびD295-AA3 (配列番号1933)の核酸配列である。
図173-247は、D295-AB1 (配列番号1934), D295-AB2 (配列番号1935), D295-AC2 (配列番号1936), D295-AC3 (配列番号1937)およびD295-AD1 (配列番号1938)の核酸配列である。
図173-248は、D295-AD2 (配列番号1939), D295-AE3 (配列番号1940), D295-AF1 (配列番号1941), D295-AF2 (配列番号1942)およびD295-AG3 (配列番号1943)の核酸配列である。
図173-249は、D295-AH1 (配列番号1944), D296-AA6 (配列番号1945), D296-AE5 (配列番号1946), D296-AF5 (配列番号1947)およびD296-AG4 (配列番号1948)の核酸配列である。
図173-250は、D296-AG5 (配列番号1949), D297-AA7 (配列番号1950), D297-AA8 (配列番号1951), D297-AB7 (配列番号1952)およびD297-AE7 (配列番号1953)の核酸配列である。
図173-251は、D297-AF7 (配列番号1954), D298-AA10 (配列番号1955), D298-AB11 (配列番号1956), D298-AF11 (配列番号1957)およびD298-AG12 (配列番号1958)の核酸配列である。
図173-252は、D35-40 (配列番号1959), D35-AC6 (配列番号1960), D35-BB2 (配列番号1961), D55-AB9 (配列番号1962)およびD55-BB1 (配列番号1963)の核酸配列である。
図173-253は、D55-BB2 (配列番号1964), D55-BB3 (配列番号1965), D55-BB7 (配列番号1966), D56-AA1 (配列番号1967), D56-AE4 (配列番号1968)およびD56-AE9 (配列番号1969)の核酸配列である。
図173-254は、D56-AD1 (配列番号1970), D56-AG12 (配列番号1971), D56-AH11 (配列番号1972), D57-AA5 (配列番号1973)およびD57-AA7 (配列番号1974)の核酸配列である。
図173-255は、D57-AB10 (配列番号1975), D57-AC2 (配列番号1976), D57-AC3 (配列番号1977), D57-AC6 (配列番号1978), D57-AC9 (配列番号1979)およびD57-AC11 (配列番号1980)の核酸配列である。
図173-256は、D57-AD3 (配列番号1981), D57-AE4 (配列番号1982), D57-AE6 (配列番号1983), D57-AE9 (配列番号1984)およびD57-AF4 (配列番号1985)の核酸配列である。
図173-257は、D57-AF11 (配列番号1986), D57-AG3 (配列番号1987), D57-AH11 (配列番号1988), D58-AB2 (配列番号1989), D58-AC8 (配列番号1990)およびD58-AG9 (配列番号1991)の核酸配列である。
図173-258は、D58-BA9 (配列番号1992), D58-BB9 (配列番号1993), D58-BC1 (配列番号1994), D58-BC10 (配列番号1995), D58-BC11 (配列番号1996)およびD58-BD4 (配列番号1997)の核酸配列である。
図173-259は、D58-BE8 (配列番号1998), D58-BF4 (配列番号1999), D60-AB4 (配列番号2000), D60-AC4 (配列番号2001), D60-AD11 (配列番号2002)およびD60-AF9 (配列番号2003)の核酸配列である。
図173-260は、D65-AB6 (配列番号2004), D65-AC3 (配列番号2005), D65-AC9 (配列番号2006), D65-AC12 (配列番号2007), D65-AE3 (配列番号2008)およびD65-AG1 (配列番号2009)の核酸配列である。
図173-261は、D65-CE10 (配列番号2010), D65-CE11 (配列番号2011), D65-CF11 (配列番号2012), D65-CH5 (配列番号2013), D66-AA1 (配列番号2014)およびD66-AA3 (配列番号2015)の核酸配列である。
図173-262は、D66-AE5 (配列番号2016), D66-AF1 (配列番号2017), D66-AG2 (配列番号2018), D66-AG6 (配列番号2019)およびD66-AH3 (配列番号2020)の核酸配列である。
図173-263は、D66-BA11 (配列番号2021), D66-BD6 (配列番号2022), D66-BD8 (配列番号2023), D67-AA5 (配列番号2024), D67-AD3 (配列番号2025)およびD67-AE1 (配列番号2026)の核酸配列である。
図173-264は、D67-AE4 (配列番号2027), D67-AG4 (配列番号2028), D68-AF3 (配列番号2029), D70A-AE1 (配列番号2030), D70A-AG7 (配列番号2031)およびD70A-BC6 (配列番号2032)の核酸配列である。
図173-265は、D70A-BF7 (配列番号2033), D70A-BF8 (配列番号2034), D70A-BH1 (配列番号2035), D70A-BH3 (配列番号2036)およびD73A-AA1 (配列番号2037)の核酸配列である。
図173-266は、D73A-AA3 (配列番号2038), D73A-AA5 (配列番号2039), D73A-AA6 (配列番号2040), D73A-AA8 (配列番号2041), D73A-AA9 (配列番号2042)およびD73A-AB1 (配列番号2043)の核酸配列である。
図173-267は、D73A-AB3 (配列番号2044), D73A-AB5 (配列番号2045), D73A-AB10 (配列番号2046), D73A-AC2 (配列番号2047)およびD73A-AC5 (配列番号2048)の核酸配列である。
図173-268は、D73A-AC11 (配列番号2049), D73A-AC12 (配列番号2050), D73A-AD7 (配列番号2051), D73A-AD10 (配列番号2052), D73A-AE6 (配列番号2053)およびD73A-AE7 (配列番号2054)の核酸配列である。
図173-269は、D73A-AE8 (配列番号2055), D73A-AE12 (配列番号2056), D73A-AF5 (配列番号2057), D73A-AF6 (配列番号2058), D73A-AF12 (配列番号2059)およびD73A-AG4 (配列番号2060)の核酸配列である。
図173-270は、D73A-AG6 (配列番号2061), D73A-AG10 (配列番号2062), D73A-AH2 (配列番号2063), D73A-AH3 (配列番号2064)およびD73A-AH10 (配列番号2065)の核酸配列である。
図173-271は、D93-AD3 (配列番号2066), D97-AD3 (配列番号2067), D97-AE3 (配列番号2068), D97-AF1 (配列番号2069)およびD113-AH8 (配列番号2070)の核酸配列である。
図173-272は、D114-AA10 (配列番号2071), D114-AC11 (配列番号2072), D131-AD1 (配列番号2073), D133-AD7 (配列番号2074)およびD139-AD2 (配列番号2075)の核酸配列である。
図173-273は、D139-AF2 (配列番号2076), D144A-AB10 (配列番号2077), D144A-AE9 (配列番号2078), D144A-AG12 (配列番号2079), D145-AC7 (配列番号2080)およびD145-AH7 (配列番号2081)の核酸配列である。
図173-274は、D150-AA3 (配列番号2082), D150-AG3 (配列番号2083), D151-AG3 (配列番号2084), D153-AA8 (配列番号2085), D153-AB7 (配列番号2086)およびD153-AC9 (配列番号2087)の核酸配列である。
図173-275は、D153-AF8 (配列番号2088), D155-AA2 (配列番号2089), D155-AG2 (配列番号2090), D156-AH3 (配列番号2091), D159-AA2 (配列番号2092)およびD164-AD1 (配列番号2093)の核酸配列である。
図173-276は、D181-AG6 (配列番号2094), D182-AB1 (配列番号2095), D182-AF2 (配列番号2096), D185-AE10 (配列番号2097), D186-AH3 (配列番号2098)およびD188-AC6 (配列番号2099)の核酸配列である。
図173-277は、D188-AF5 (配列番号2100), D189-AD12 (配列番号2101), D258-AG6 (配列番号2102), D194-AA3 (配列番号2103), D194-AB3 (配列番号2104), D198-AD9 (配列番号2105)およびD198-AE9 (配列番号2106)の核酸配列である。
図173-278は、D203-BB11 (配列番号2107), D203-BC11 (配列番号2108), D204-AA3 (配列番号2109), D204-AF2 (配列番号2110), D206-CB1 (配列番号2111)およびD214-AB1 (配列番号2112)の核酸配列である。
図173-279は、D214-AF2 (配列番号2113), D216-AA7 (配列番号2114), D216-AD7 (配列番号2115), D219-BA2 (配列番号2116), D219-BF1 (配列番号2117)およびD229-AB2 (配列番号2118)の核酸配列である。
図173-280は、D230-AD2 (配列番号2119), D230-AE2 (配列番号2120), D234-AE12 (配列番号2121), D241-BG10 (配列番号2122), D249-AA9 (配列番号2123)およびD255-AC5 (配列番号2124)の核酸配列である。
図173-281は、D270-AE7 (配列番号2125), D270-AE8 (配列番号2126), D276-AH5 (配列番号2127), D279-AA2 (配列番号2128)およびD279-AB3 (配列番号2129)の核酸配列である。
図173-282は、D279-AC2 (配列番号2130), D279-AC3 (配列番号2131), D279-AD3 (配列番号2132)およびD279-AE2 (配列番号2133)の核酸配列である。
図173-283は、D279-AG2 (配列番号2134), D279-AH3 (配列番号2135), D280-BF6 (配列番号2136), D281-AB8 (配列番号2137)およびD281-AC7 (配列番号2138)の核酸配列である。
図173-284は、D282-AG10 (配列番号2139), D288-AC2 (配列番号2140), D289-AC6 (配列番号2141), D290-AB8 (配列番号2142)およびD291-AD10 (配列番号2143)の核酸配列である。
図173-285は、D291-AE11 (配列番号2144), D291-AH12 (配列番号2145), D292-AB3 (配列番号2146), D292-AD3 (配列番号2147), D292-AE3 (配列番号2148)およびD294-AE7 (配列番号2149)の核酸配列である。
図173-286は、D419-AH11 (配列番号2150), D295-AE2 (配列番号2151), D295-AG2 (配列番号2152), D295-AH2 (配列番号2153), D295-AH3 (配列番号2154)およびD296-AD4 (配列番号2155)の核酸配列である。
図173-287は、D296-AF4 (配列番号2156), D296-AG6 (配列番号2157), D297-AD7 (配列番号2158), D297-AG7 (配列番号2159)およびD298-AD11 (配列番号2160)の核酸配列である。
図173-288は、D418-AH9 (配列番号2161), D418-AG10 (配列番号2162), D416-AA6 (配列番号2163), D414-AA2 (配列番号2164)およびD269-AD5 (配列番号2165)の核酸配列である。
図173-289は、D268-AE1 (配列番号2166), D258-AF6 (配列番号2167), D256-AG9 (配列番号2168), D255-AH6 (配列番号2169)およびD255-AE5 (配列番号2170)の核酸配列である。
図173-290は、D419-AE11 (配列番号2171), D142-AA10 (配列番号2172), D140-AH4 (配列番号2173), D66-AF7 (配列番号2174)およびD66-AA7 (配列番号2175)の核酸配列である。
図173-291は、D65-AF9 (配列番号2176), D65-AB3 (配列番号2177), D65-AB2 (配列番号2178), D144A-AA12 (配列番号2179)およびD64-7 (配列番号2180)の核酸配列である。
図173-292は、D109-BF9 (配列番号2181), D109-BG9 (配列番号2182), D118-AA11 (配列番号2183), D142-AB11(5’) (配列番号2184)およびD142-AE10(5’) (配列番号2185)の核酸配列である。
図173-293は、D207-AH5 (配列番号2186), D231-AA1(5’) (配列番号2187), D232-AD4(5’) (配列番号2188), D232-AE6(5’) (配列番号2189)およびD288-AA3 (配列番号2190)の核酸配列である。
図173-294は、D289-AE6 (配列番号2191), D290-AC7 (配列番号2192), D58-AA2 (配列番号2193)の核酸配列である。
図1は、D35-BG11 (配列番号1)の核酸配列およびその翻訳産物 (配列番号2)である。
図2は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子のゲノム構造の概要図である。
図3は、ゲノムタバコニコチンデメチラーゼ核酸配列 (配列番号4)およびその翻訳産物 (配列番号3)である。
図3は、ゲノムタバコニコチンデメチラーゼ核酸配列 (配列番号4)およびその翻訳産物 (配列番号3)である。
図3は、ゲノムタバコニコチンデメチラーゼ核酸配列 (配列番号4)およびその翻訳産物 (配列番号3)である。
図4は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子のコード領域の核酸配列 (配列番号5)およびその翻訳産物 (配列番号6)である。
図5は、タバコニコチンデメチラーゼゲノム配列内に存在するイントロンの核酸配列 (配列番号7)である。
図6は、タバコデメチラーゼ遺伝子プロモーターの核酸配列 (配列番号8)である。
図7は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子の3’UTRの核酸配列 (配列番号9)である。
図8は、Geno完全長(“FL”)プライマーセットでのタバコ系統のPCR産物を示す電気泳動イメージである。
図9は、実施例17に記載のプライマーセット(1), (2), (3)および(4)でのタバコ系統のPCR産物を示す電気泳動イメージである。該バンドのおおよそのサイズは、FLに関しては3,500ヌクレオチド(nt)、(1)に関しては2,600 nt、(2)に関しては1,400 nt、(3)に関しては600 ntおよび(4)に関しては1,400 ntである。
図10は、D58-BG7の核酸配列(配列番号10)およびD58-BG7のアミノ酸配列(配列番号11) (これはD58-BG7(配列番号10)の翻訳体である)である。
図11は、D58-AB1の核酸配列(配列番号12)およびD58-AB1のアミノ酸配列(配列番号13) (これはD58-AB1(配列番号12)の翻訳体である)である。
図12は、D186-AH4の核酸配列(配列番号14)およびD186-AH4のアミノ酸配列(配列番号15) (これはD186-AH4(配列番号14)の翻訳体である)である。
図13は、D58-BE4の核酸配列(配列番号16)およびD58-BE4のアミノ酸配列(配列番号17) (これはD58-BE4(配列番号16)の翻訳体である)である。
図14は、D56-AH7の核酸配列(配列番号18)およびD56-AH7のアミノ酸配列(配列番号19) (これはD56-AH7(配列番号18)の翻訳体である)である。
図15は、D13a-5の核酸配列(配列番号20)およびD13a-5のアミノ酸配列(配列番号21) (これはD13a-5(配列番号20)の翻訳体である)である。
図16は、D56-AG10の核酸配列(配列番号22)およびD56-AG10のアミノ酸配列(配列番号23) (これはD56-AG10(配列番号22)の翻訳体である)である。
図17は、D35-33の核酸配列(配列番号24)およびD35-33のアミノ酸配列(配列番号25) (これはD35-33(配列番号24)の翻訳体である)である。
図18は、D34-62の核酸配列(配列番号26)およびD34-62のアミノ酸配列(配列番号27) (これはD34-62(配列番号26)の翻訳体である)である。
図19は、D56-AA7の核酸配列(配列番号28)およびD56-AA7のアミノ酸配列(配列番号29) (これはD56-AA7(配列番号28)の翻訳体である)である。
図20は、D56-AE1の核酸配列(配列番号30)およびD56-AE1のアミノ酸配列(配列番号31) (これはD56-AE1(配列番号30)の翻訳体である)である。
図21は、D35-BB7の核酸配列(配列番号32)およびD35-BB7のアミノ酸配列(配列番号33) (これはD35-BB7(配列番号32)の翻訳体である)である。
図22は、D177-BA7の核酸配列(配列番号34)およびD177-BA7のアミノ酸配列(配列番号35) (これはD177-BA7(配列番号34)の翻訳体である)である。
図23は、D56A-AB6の核酸配列(配列番号36)およびD56A-AB6のアミノ酸配列(配列番号37) (これはD56A-AB6(配列番号36)の翻訳体である)である。
図24は、D144-AE2の核酸配列(配列番号38)およびD144-AE2のアミノ酸配列(配列番号39) (これはD144-AE2(配列番号38)の翻訳体である)である。
図25は、D56-AG11の核酸配列(配列番号40)およびD56-AG11のアミノ酸配列(配列番号41) (これはD56-AG11(配列番号40)の翻訳体である)である。
図26は、D179-AA1の核酸配列(配列番号42)およびD179-AA1のアミノ酸配列(配列番号43) (これはD179-AA1(配列番号42)の翻訳体である)である。
図27は、D56-AC7の核酸配列(配列番号44)およびD56-AC7のアミノ酸配列(配列番号45) (これはD56-AC7(配列番号44)の翻訳体である)である。
図28は、D144-AD1の核酸配列(配列番号46)およびD144-AD1のアミノ酸配列(配列番号47) (これはD144-AD1(配列番号46)の翻訳体である)である。
図29は、D144-AB5の核酸配列(配列番号48)およびD144-AB5のアミノ酸配列(配列番号49) (これはD144-AB5(配列番号48)の翻訳体である)である。
図30は、D181-AB5の核酸配列(配列番号50)およびD181-AB5のアミノ酸配列(配列番号51) (これはD181-AB5(配列番号50)の翻訳体である)である。
図31は、D73-AC9の核酸配列(配列番号52)およびD73-AC9のアミノ酸配列(配列番号53) (これはD73-AC9(配列番号52)の翻訳体である)である。
図32は、D56-AC12の核酸配列(配列番号54)およびD56-AC12のアミノ酸配列(配列番号55) (これはD56-AC12(配列番号54)の翻訳体である)である。
図33は、D58-AB9の核酸配列(配列番号56)およびD58-AB9のアミノ酸配列(配列番号57) (これはD58-AB9(配列番号56)の翻訳体である)である。
図34は、D56-AG9の核酸配列(配列番号58)およびD56-AG9のアミノ酸配列(配列番号59) (これはD56-AG9(配列番号58)の翻訳体である)である。
図35は、D56-AG6の核酸配列(配列番号60)およびD56-AG6のアミノ酸配列(配列番号61) (これはD56-AG6(配列番号60)の翻訳体である)である。
図36は、D35-BG11の核酸配列(配列番号62)およびD35-BG11のアミノ酸配列(配列番号63) (これはD35-BG11(配列番号62)の翻訳体である)である。
図37は、D35-42の核酸配列(配列番号64)およびD35-42のアミノ酸配列(配列番号65) (これはD35-42(配列番号64)の翻訳体である)である。
図38は、D35-BA3の核酸配列(配列番号66)およびD35-BA3のアミノ酸配列(配列番号67) (これはD35-BA3(配列番号66)の翻訳体である)である。
図39は、D34-57の核酸配列 (配列番号68)およびD34-57のアミノ酸配列(配列番号69) (これはD34-57(配列番号68)の翻訳体である)である。
図40は、D34-52の核酸配列(配列番号70)およびD34-52のアミノ酸配列(配列番号71) (これはD34-52(配列番号70)の翻訳体である)である。
図41は、D34-25の核酸配列(配列番号72)およびD34-25のアミノ酸配列(配列番号73) (これはD34-25(配列番号72)の翻訳体である)である。
図42は、D56AD10の核酸配列(配列番号74)およびD56AD10のアミノ酸配列(配列番号75) (これはD56AD10(配列番号74)の翻訳体である)である。
図43は、D56-AA11の核酸配列(配列番号76)およびD56-AA11のアミノ酸配列(配列番号77) (これはD56-AA11(配列番号76)の翻訳体である)である。
図44は、D177-BD5の核酸配列(配列番号78)およびD177-BD5のアミノ酸配列(配列番号79) (これはD177-BD5(配列番号78)の翻訳体である)である。
図45は、D56A-AG10の核酸配列(配列番号80)およびD56A-AG10のアミノ酸配列(配列番号81) (これはD56A-AG10(配列番号80)の翻訳体である)である。
図46は、D58-BC5の核酸配列(配列番号82)およびD58-BC5のアミノ酸配列(配列番号83) (これはD58-BC5(配列番号82)の翻訳体である)である。
図47は、D58-AD12の核酸配列(配列番号84)およびD58-AD12のアミノ酸配列(配列番号85) (これはD58-AD12(配列番号84)の翻訳体である)である。
図48は、D56-AC11の核酸配列(配列番号86)およびD56-AC11のアミノ酸配列(配列番号87) (これはD56-AC11(配列番号86)の翻訳体である)である。
図49は、D35-39の核酸配列(配列番号88)およびD35-39のアミノ酸配列(配列番号89) (これはD35-39(配列番号88)の翻訳体である)である。
図50は、D58-BH4の核酸配列(配列番号90)およびD58-BH4のアミノ酸配列(配列番号91) (これはD58-BH4(配列番号90)の翻訳体である)である。
図51は、D177-BD7の核酸配列(配列番号92)およびD177-BD7のアミノ酸配列(配列番号93) (これはD177-BD7(配列番号92)の翻訳体である)である。
図52は、D176-BF2の核酸配列(配列番号94)およびD176-BF2のアミノ酸配列(配列番号95) (これはD176-BF2(配列番号94)の翻訳体である)である。
図53は、D56-AD6の核酸配列(配列番号96)およびD56-AD6のアミノ酸配列(配列番号97) (これはD56-AD6(配列番号96)の翻訳体である)である。
図54は、D73A-AD6の核酸配列(配列番号98)およびD73A-AD6のアミノ酸配列(配列番号99) (これはD73A-AD6(配列番号98)の翻訳体である)である。
図55は、D70A-BA11の核酸配列(配列番号100)およびD70A-BA11のアミノ酸配列(配列番号101) (これはD70A-BA11(配列番号100)の翻訳体である)である。
図56は、D70A-BB5の核酸配列(配列番号102)およびD70A-BB5のアミノ酸配列(配列番号103) (これはD70A-BB5(配列番号102)の翻訳体である)である。
図57は、D70A-AB5の核酸配列(配列番号104)およびD70A-AB5のアミノ酸配列(配列番号105) (これはD70A-AB5(配列番号104)の翻訳体である)である。
図58は、D70A-AA8の核酸配列(配列番号106)およびD70A-AA8のアミノ酸配列(配列番号107) (これはD70A-AA8(配列番号106)の翻訳体である)である。
図59は、D70A-AB8の核酸配列(配列番号108)およびD70A-AB8のアミノ酸配列(配列番号109) (これはD70A-AB8(配列番号108)の翻訳体である)である。
図60は、D70A-BH2の核酸配列(配列番号110)およびD70A-BH2のアミノ酸配列(配列番号111) (これはD70A-BH2(配列番号110)の翻訳体である)である。
図61は、D70A-AA4の核酸配列(配列番号112)およびD70A-AA4のアミノ酸配列(配列番号113) (これはD70A-AA4(配列番号112)の翻訳体である)である。
図62は、D70A-BA1の核酸配列(配列番号114)およびD70A-BA1のアミノ酸配列(配列番号115) (これはD70A-BA1(配列番号114)の翻訳体である)である。
図63は、D70A-BA9の核酸配列(配列番号116)およびD70A-BA9のアミノ酸配列(配列番号117) (これはD70A-BA9(配列番号116)の翻訳体である)である。
図64は、D70A-BD4の核酸配列(配列番号118)およびD70A-BD4のアミノ酸配列(配列番号119) (これはD70A-BD4(配列番号118)の翻訳体である)である。
図65は、D181-AC5の核酸配列(配列番号120)およびD181-AC5のアミノ酸配列(配列番号121) (これはD181-AC5(配列番号120)の翻訳体である)である。
図66は、D144-AH1の核酸配列(配列番号122)およびD144-AH1のアミノ酸配列(配列番号123) (これはD144-AH1(配列番号122)の翻訳体である)である。
図67は、D34-65の核酸配列(配列番号124)およびD34-65のアミノ酸配列(配列番号125) (これはD34-65(配列番号124)の翻訳体である)である。
図68は、D35-BG2の核酸配列(配列番号126)およびD35-BG2のアミノ酸配列(配列番号127) (これはD35-BG2(配列番号126)の翻訳体である)である。
図69は、D73A-AH7の核酸配列(配列番号128)およびD73A-AH7のアミノ酸配列(配列番号129) (これはD73A-AH7(配列番号128)の翻訳体である)である。
図70は、D58-AA1の核酸配列(配列番号130)およびD58-AA1のアミノ酸配列(配列番号131) (これはD58-AA1(配列番号130)の翻訳体である)である。
図71は、D73A-AE10の核酸配列(配列番号132)およびD73A-AE10のアミノ酸配列(配列番号133) (これはD73A-AE10(配列番号132)の翻訳体である)である。
図72は、D56A-AC12の核酸配列(配列番号134)およびD56A-AC12のアミノ酸配列(配列番号135) (これはD56A-AC12(配列番号134)の翻訳体である)である。
図73は、D177-BF7の核酸配列(配列番号136)およびD177-BF7のアミノ酸配列(配列番号137) (これはD177-BF7(配列番号136)の翻訳体である)である。
図74は、D73A-AG3の核酸配列(配列番号138)およびD73A-AG3のアミノ酸配列(配列番号139) (これはD73A-AG3(配列番号138)の翻訳体である)である。
図75は、D70A-AA12の核酸配列(配列番号140)およびD70A-AA12のアミノ酸配列(配列番号141) (これはD70A-AA12(配列番号140)の翻訳体である)である。
図76は、D185-BC1の核酸配列(配列番号142)およびD185-BC1のアミノ酸配列(配列番号143) (これはD185-BC1(配列番号142)の翻訳体である)である。
図77は、D185-BG2の核酸配列(配列番号144)およびD185-BG2のアミノ酸配列(配列番号145) (これはD185-BG2(配列番号144)の翻訳体である)である。
図78は、D185-BE1の核酸配列(配列番号146)およびD185-BE1のアミノ酸配列(配列番号147) (これはD185-BE1(配列番号146)の翻訳体である)である。
図79は、D185-BD2の核酸配列(配列番号148)およびD185-BD2のアミノ酸配列(配列番号149) (これはD185-BD2(配列番号148)の翻訳体である)である。
図80は、D176-BG2の核酸配列(配列番号150)およびD176-BG2のアミノ酸配列(配列番号151) (これはD176-BG2(配列番号150)の翻訳体である)である。
図81は、D185-BD3の核酸配列(配列番号152)およびD185-BD3のアミノ酸配列(配列番号153) (これはD185-BD3(配列番号152)の翻訳体である)である。
図82は、D176-BC3の核酸配列(配列番号154)およびD176-BC3のアミノ酸配列(配列番号155) (これはD176-BC3(配列番号154)の翻訳体である)である。
図83は、D176-BB3の核酸配列(配列番号156)およびD176-BB3のアミノ酸配列(配列番号157) (これはD176-BB3(配列番号156)の翻訳体である)である。
図84は、D89-AB1の核酸配列(配列番号158)およびD89-AB1のアミノ酸配列(配列番号159) (これはD89-AB1(配列番号158)の翻訳体である)である。
図85は、D89-AD2の核酸配列(配列番号160)およびD89-AD2のアミノ酸配列(配列番号161) (これはD89-AD2(配列番号160)の翻訳体である)である。
図86は、D90A-BB3の核酸配列(配列番号162)およびD90A-BB3のアミノ酸配列(配列番号163) (これはD90A-BB3(配列番号162)の翻訳体である)である。
図87は、D95-AG1の核酸配列(配列番号164)およびD95-AG1のアミノ酸配列(配列番号165) (これはD95-AG1(配列番号164)の翻訳体である)である。
図88は、D96-AB6の核酸配列(配列番号166)およびD96-AB6のアミノ酸配列(配列番号167) (これはD96-AB6(配列番号166)の翻訳体である)である。
図89は、D96-AC2の核酸配列(配列番号168)およびD96-AC2のアミノ酸配列(配列番号169) (これはD96-AC2(配列番号168)の翻訳体である)である。
図90は、D98-AA1の核酸配列(配列番号170)およびD98-AA1のアミノ酸配列(配列番号171) (これはD98-AA1(配列番号170)の翻訳体である)である。
図91は、D98-AG1の核酸配列(配列番号172)およびD98-AG1のアミノ酸配列(配列番号173) (これはD98-AG1(配列番号172)の翻訳体である)である。
図92は、D100-BE2の核酸配列(配列番号174)およびD100-BE2のアミノ酸配列(配列番号175) (これはD100-BE2(配列番号174)の翻訳体である)である。
図93は、D100A-AC3の核酸配列(配列番号176)およびD100A-AC3のアミノ酸配列(配列番号177) (これはD100A-AC3(配列番号176)の翻訳体である)である。
図94は、D104A-AE8(69,1755)の核酸配列(配列番号178)およびD104A-AE8(69,1755)のアミノ酸配列(配列番号179) (これはD104A-AE8(69,1755)(配列番号178)の翻訳体である)である。
図95は、D105-AD6の核酸配列(配列番号180)およびD105-AD6のアミノ酸配列(配列番号181) (これはD105-AD6(配列番号180)の翻訳体である)である。
図96は、D109-AH8(14,1697)の核酸配列(配列番号182)およびD109-AH8(14,1697)のアミノ酸配列(配列番号183) (これはD109-AH8(14,1697)(配列番号182)の翻訳体である)である。
図97は、D110-AF12(166,1631)の核酸配列(配列番号184)およびD110-AF12(166,1631)のアミノ酸配列(配列番号185) (これはD110-AF12(166,1631)(配列番号184)の翻訳体である)である。
図98は、D112-AA5の核酸配列(配列番号186)およびD112-AA5のアミノ酸配列(配列番号187) (これはD112-AA5(配列番号186)の翻訳体である)である。
図99は、D120-AH4の核酸配列(配列番号188)およびD120-AH4のアミノ酸配列(配列番号189) (これはD120-AH4(配列番号188)の翻訳体である)である。
図100は、D121-AA8の核酸配列(配列番号190)およびD121-AA8のアミノ酸配列(配列番号191) (これはD121-AA8(配列番号190)の翻訳体である)である。
図101は、D122-AF10の核酸配列(配列番号192)およびD122-AF10のアミノ酸配列(配列番号193) (これはD122-AF10(配列番号192)の翻訳体である)である。
図102は、D128-AB7の核酸配列(配列番号194)およびD128-AB7のアミノ酸配列(配列番号195) (これはD128-AB7(配列番号194)の翻訳体である)である。
図103は、D129-AD10の核酸配列(配列番号196)およびD129-AD10のアミノ酸配列(配列番号197) (これはD129-AD10(配列番号196)の翻訳体である)である。
図104は、D135-AE1の核酸配列(配列番号198)およびD135-AE1のアミノ酸配列(配列番号199) (これはD135-AE1(配列番号198)の翻訳体である)である。
図105は、D141-AD7の核酸配列(配列番号200)およびD141-AD7のアミノ酸配列(配列番号201) (これはD141-AD7(配列番号200)の翻訳体である)である。
図106は、D147-AD3の核酸配列(配列番号202)およびD147-AD3のアミノ酸配列(配列番号203) (これはD147-AD3(配列番号202)の翻訳体である)である。
図107は、D163-AF12の核酸配列(配列番号204)およびD163-AF12のアミノ酸配列(配列番号205) (これはD163-AF12(配列番号204)の翻訳体である)である。
図108は、D163-AG11の核酸配列(配列番号206)およびD163-AG11のアミノ酸配列(配列番号207) (これはD163-AG11(配列番号206)の翻訳体である)である。
図109は、D163-AG12の核酸配列(配列番号208)およびD163-AG12のアミノ酸配列(配列番号209) (これはD163-AG12(配列番号208)の翻訳体である)である。
図110は、D205-BG9の核酸配列(配列番号210)およびD205-BG9のアミノ酸配列(配列番号211) (これはD205-BG9(配列番号210)の翻訳体である)である。
図111は、D207-AA5の核酸配列(配列番号212)およびD207-AA5のアミノ酸配列(配列番号213) (これはD207-AA5(配列番号212)の翻訳体である)である。
図112は、D207-AB4の核酸配列(配列番号214)およびD207-AB4のアミノ酸配列(配列番号215) (これはD207-AB4(配列番号214)の翻訳体である)である。
図113は、D207-AC4の核酸配列(配列番号216)およびD207-AC4のアミノ酸配列(配列番号217) (これはD207-AC4(配列番号216)の翻訳体である)である。
図114は、D209-AA10の核酸配列(配列番号218)およびD209-AA10のアミノ酸配列(配列番号219) (これはD209-AA10(配列番号218)の翻訳体である)である。
図115は、D209-AA12の核酸配列(配列番号220)およびD209-AA12のアミノ酸配列(配列番号221) (これはD209-AA12(配列番号220)の翻訳体である)である。
図116は、D209-AH10の核酸配列(配列番号222)およびD209-AH10のアミノ酸配列(配列番号223) (これはD209-AH10(配列番号222)の翻訳体である)である。
図117は、D87A-AF3の核酸配列(配列番号224)およびD87A-AF3のアミノ酸配列(配列番号225) (これはD87A-AF3(配列番号224)の翻訳体である)である。
図118は、D208-AC8の核酸配列(配列番号226)およびD208-AC8のアミノ酸配列(配列番号227) (これはD208-AC8(配列番号226)の翻訳体である)である。
図119は、D215-AB5の核酸配列(配列番号228)およびD215-AB5のアミノ酸配列(配列番号229) (これはD215-AB5(配列番号228)の翻訳体である)である。
図120は、D103-AH3の核酸配列(配列番号230)およびD103-AH3のアミノ酸配列(配列番号231) (これはD103-AH3(配列番号230)の翻訳体である)である。
図121は、D208-AD9の核酸配列(配列番号232)およびD208-AD9のアミノ酸配列(配列番号233) (これはD208-AD9(配列番号232)の翻訳体である)である。
図122は、D237-AD1の核酸配列(配列番号234)およびD237-AD1のアミノ酸配列(配列番号235) (これはD237-AD1(配列番号234)の翻訳体である)である。
図123は、D125-AF11の核酸配列(配列番号236)およびD125-AF11のアミノ酸配列(配列番号237) (これはD125-AF11(配列番号236)の翻訳体である)である。
図124は、D134-AE11の核酸配列(配列番号238)およびD134-AE11のアミノ酸配列(配列番号239) (これはD134-AE11(配列番号238)の翻訳体である)である。
図125は、D209-AH12の核酸配列(配列番号240)およびD209-AH12のアミノ酸配列(配列番号241) (これはD209-AH12(配列番号240)の翻訳体である)である。
図126は、D221-BB8の核酸配列(配列番号242)およびD221-BB8のアミノ酸配列(配列番号243) (これはD221-BB8(配列番号242)の翻訳体である)である。
図127は、D222-BH4の核酸配列(配列番号244)およびD222-BH4のアミノ酸配列(配列番号245) (これはD222-BH4(配列番号244)の翻訳体である)である。
図128は、D224-AF10の核酸配列(配列番号246)およびD224-AF10のアミノ酸配列(配列番号247) (これはD224-AF10(配列番号246)の翻訳体である)である。
図129は、D224-BD11の核酸配列(配列番号248)およびD224-BD11のアミノ酸配列(配列番号249) (これはD224-BD11(配列番号248)の翻訳体である)である。
図130は、D228-AD7の核酸配列(配列番号250)およびD228-AD7のアミノ酸配列(配列番号251) (これはD228-AD7(配列番号250)の翻訳体である)である。
図131は、D228-AH8の核酸配列(配列番号252)およびD228-AH8のアミノ酸配列(配列番号253) (これはD228-AH8(配列番号252)の翻訳体である)である。
図132は、D235-AB1の核酸配列(配列番号254)およびD235-AB1のアミノ酸配列(配列番号255) (これはD235-AB1(配列番号254)の翻訳体である)である。
図133は、D243-AA2の核酸配列(配列番号256)およびD243-AA2のアミノ酸配列(配列番号257) (これはD243-AA2(配列番号256)の翻訳体である)である。
図134は、D244-AD4の核酸配列(配列番号258)およびD244-AD4のアミノ酸配列(配列番号259) (これはD244-AD4(配列番号258)の翻訳体である)である。
図135は、D247-AH1の核酸配列(配列番号260)およびD247-AH1のアミノ酸配列(配列番号261) (これはD247-AH1(配列番号260)の翻訳体である)である。
図136は、D248-AA6の核酸配列(配列番号262)およびD248-AA6のアミノ酸配列(配列番号263) (これはD248-AA6(配列番号262)の翻訳体である)である。
図137は、D249-AE8の核酸配列(配列番号264)およびD249-AE8のアミノ酸配列(配列番号265) (これはD249-AE8(配列番号264)の翻訳体である)である。
図138は、D250-AC11の核酸配列(配列番号266)およびD250-AC11のアミノ酸配列(配列番号267) (これはD250-AC11(配列番号266)の翻訳体である)である。
図139は、D259-AB9の核酸配列(配列番号268)およびD259-AB9のアミノ酸配列(配列番号269) (これはD259-AB9(配列番号268)の翻訳体である)である。
図140は、D218A-AC2の核酸配列(配列番号270)およびD218A-AC2のアミノ酸配列(配列番号271) (これはD218A-AC2(配列番号270)の翻訳体である)である。
図141は、D210-BD4の核酸配列(配列番号272)およびD210-BD4のアミノ酸配列(配列番号273) (これはD210-BD4(配列番号272)の翻訳体である)である。
図142は、D233-AG7の核酸配列(配列番号274)およびD233-AG7のアミノ酸配列(配列番号275) (これはD233-AG7(配列番号274)の翻訳体である)である。
図143は、D257-AE4の核酸配列(配列番号276)およびD257-AE4のアミノ酸配列(配列番号277) (これはD257-AE4(配列番号276)の翻訳体である)である。
図144は、D268-AE2の核酸配列(配列番号278)およびD268-AE2のアミノ酸配列(配列番号279) (これはD268-AE2(配列番号278)の翻訳体である)である。
図145は、D283-AC1の核酸配列(配列番号280)およびD283-AC1のアミノ酸配列(配列番号281) (これはD283-AC1(配列番号280)の翻訳体である)である。
図146は、D244-AB6の核酸配列(配列番号282)およびD244-AB6のアミノ酸配列(配列番号283) (これはD244-AB6(配列番号282)の翻訳体である)である。
図147は、D205-BE9の核酸配列(配列番号284)およびD205-BE9のアミノ酸配列(配列番号285) (これはD205-BE9(配列番号284)の翻訳体である)である。
図148は、D136-AF4の核酸配列(配列番号286)およびD136-AF4のアミノ酸配列(配列番号287) (これはD136-AF4(配列番号286)の翻訳体である)である。
図149は、D101-BA2の核酸配列(配列番号288)およびD101-BA2のアミノ酸配列(配列番号289) (これはD101-BA2(配列番号288)の翻訳体である)である。
図150は、D130-AA1の核酸配列(配列番号290)およびD130-AA1のアミノ酸配列(配列番号291) (これはD130-AA1(配列番号290)の翻訳体である)である。
図151は、D136-AD5の核酸配列(配列番号292)およびD136-AD5のアミノ酸配列(配列番号293) (これはD136-AD5(配列番号292)の翻訳体である)である。
図152は、D138-AD12の核酸配列(配列番号294)およびD138-AD12のアミノ酸配列(配列番号295) (これはD138-AD12(配列番号294)の翻訳体である)である。
図153は、D216-AG8の核酸配列(配列番号296)およびD216-AG8のアミノ酸配列(配列番号297) (これはD216-AG8(配列番号296)の翻訳体である)である。
図154は、D243-AB3の核酸配列(配列番号298)およびD243-AB3のアミノ酸配列(配列番号299) (これはD243-AB3(配列番号298)の翻訳体である)である。
図155は、D250-AC11の核酸配列(配列番号300)およびD250-AC11のアミノ酸配列(配列番号301) (これはD250-AC11(配列番号300)の翻訳体である)である。
図156は、D205-AH4の核酸配列(配列番号302)およびD205-AH4のアミノ酸配列(配列番号303) (これはD205-AH4(配列番号302)の翻訳体である)である。
図157は、D267-AF10の核酸配列(配列番号304)およびD267-AF10のアミノ酸配列(配列番号305) (これはD267-AF10(配列番号304)の翻訳体である)である。
図158は、D284-AH5の核酸配列(配列番号306)およびD284-AH5のアミノ酸配列(配列番号307) (これはD284-AH5(配列番号306)の翻訳体である)である。
図159Aは、D58-BG7 (配列番号10), D58-AB1 (配列番号12)およびD58-BE4 (配列番号16)のアライメントならびにD56-AH7 (配列番号18)およびD13a-5 (配列番号20)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Bは、D56-AG10 (配列番号22), D35-33 (配列番号24)およびD34-62 (配列番号26)のアライメントならびにD56-AA7 (配列番号28), D56-AE1 (配列番号30)およびD185-BD3 (配列番号152)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Cは、D56A-AB6 (配列番号36), D35-BB7 (配列番号32), D177-BA7 (配列番号34)およびD144-AE2 (配列番号38)のアライメントならびにD56-AG11 (配列番号40)およびD179-AA1 (配列番号42)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Dは、D56-AC7 (配列番号44)およびD144-AD1 (配列番号46)のアライメントならびにD181-AB5 (配列番号50)およびD73-AC9 (配列番号52)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Eは、核酸配列D58-AB9 (配列番号56), D56-AG9 (配列番号58), D35-BG11 (配列番号62), D34-25 (配列番号72), D35-BA3 (配列番号66), D34-52 (配列番号70), D56-AG6 (配列番号60), D35-42 (配列番号64)およびD34-57 (配列番号68)のアライメントである。該アライメントの配列間の同一性 (%)が該アライメントの下に示されている。
図159Fは、D177-BD7 (配列番号92)およびD177-BD5 (配列番号78)のアライメントならびにD56A-AG10 (配列番号80), D58-AD12 (配列番号84)およびD58-BC5 (配列番号82)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Gは、D56-AD6 (配列番号96), D56-AC11 (配列番号86), D35-39 (配列番号88)およびD58-BH4 (配列番号90)のアライメントならびにD73A-AD6 (配列番号98)およびD70A-BA11 (配列番号100)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Hは、D70A-AB5 (配列番号104)およびD70A-AA8 (配列番号106)のアライメントならびにD70A-AB8 (配列番号108), D70A-BH2 (配列番号110), D70A-AA4 (配列番号112)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Iは、D70A-BA1 (配列番号114)およびD70A-BA9 (配列番号116)のアライメントならびにD144-AH1 (配列番号122), D34-65 (配列番号124)およびD181-AC5 (配列番号120)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Jは、D58-AA1 (配列番号130), D185-BC1 (配列番号142)およびD185-BG2 (配列番号144)のアライメントならびにD177-BF7 (配列番号136), D185-BD2 (配列番号148)およびD185-BE1 (配列番号146)のアライメントよりなる核酸配列アライメントのセットである。各アライメントの配列間の同一性 (%)がそれぞれのアライメントの下に示されている。
図159Kは、核酸配列D70-AA12 (配列番号140)およびD176-BF2 (配列番号94)のアライメントである。該アライメントの配列間の同一性 (%)が該アライメントの下に示されている。
図160Aは、D208-AD9 (配列番号2196), D120-AH4 (配列番号2197), D121-AA8 (配列番号2198), D122-AF10 (配列番号2199), D103-AH3 (配列番号2200), D208-AC8 (配列番号2201)およびD235-AB1 (配列番号2202)の配列アライメント; D244-AD4 (配列番号2203), D244-AB6 (配列番号2204), D285-AA8 (配列番号2205), D285-AB9 (配列番号2206)およびD268-AE2 (配列番号2207)の配列アライメント;ならびにD100A-AC3 (配列番号2208)およびD100A-BE2 (配列番号2209)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Bは、D205-BG9 (配列番号2210), D205-BE9 (配列番号2211)およびD205-AH4 (配列番号2212) の配列アライメント; D259-AB9 (配列番号2213), D257-AE4 (配列番号2214)およびD147-AD3 (配列番号2215) の配列アライメント; D249-AEB (配列番号2216)およびD248-AA6 (配列番号2217) の配列アライメント; D233-AG7 (配列番号2218), D224-BD11 (配列番号2219)およびD224-AF10 (配列番号2220) の配列アライメント;ならびにD105-AD6 (配列番号2221), D215-AB5 (配列番号2222)およびD135-AE1 (配列番号2223)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Cは、D87A-AF3 (配列番号2224)およびD210-BD4 (配列番号2225)の配列アライメント; D89-AB1 (配列番号2226), D89-AD2 (配列番号2227), D163-AG12 (配列番号2228), D163-AG11 (配列番号2229)およびD163-AF12 (配列番号2230) の配列アライメント; D267-AF10 (配列番号2231), D96-AC2 (配列番号2232), D96-AB6 (配列番号2233), D207-AA5 (配列番号2234), D207-AB4 (配列番号2235)およびD207-AC4 (配列番号2236);ならびにD98-AG1 (配列番号2237)およびD98-AA1 (配列番号2238)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Dは、D209-AA10 (配列番号2239), D209-AA12 (配列番号2240), D209-AH10 (配列番号2241), D209-AH12 (配列番号2242)およびD90a-BB3 (配列番号2243) の配列アライメント; D129-AD10 (配列番号2244)およびD104A-AE8 (配列番号2245) の配列アライメント; D228-AH8 (配列番号2246), D228-AD7 (配列番号2247), D250-AC11 (配列番号2248)およびD247-AH1 (配列番号2249)の配列アライメント;ならびにD128-AB7 (配列番号2250), D243-AA2 (配列番号2251)およびD125-AF11 (配列番号2252)の配列アライメントよりなるアミノ酸配列アライメントのセットである。
図160Eは、D284-AH5 (配列番号2253)およびD110-AF12 (配列番号2254)のアミノ酸配列アライメントである。
図161は、PCRによるシトクロムp450 cDNA断片のクローニングを示す概要図である。該クローニングに使用するプライマーは以下のとおりである:DM (配列番号2255), DM4 (配列番号2256), DM12 (配列番号2257), DM13 (配列番号2258), DM17 (配列番号2259), OLIGO d(T) (配列番号2260), T7 (配列番号2261)およびSP6 (配列番号2262)。
図162は、D425-AB10の核酸配列(配列番号367)およびD425-AB10のアミノ酸配列(配列番号368) (これはD425-AB10(配列番号367)の翻訳体である)である。
図163は、D425-AB11の核酸配列(配列番号369)およびD425-AB11のアミノ酸配列(配列番号370) (これはD425-AB11(配列番号369)の翻訳体である)である。
図164は、D425-AC9の核酸配列(配列番号371)およびD425-AC9のアミノ酸配列(配列番号372) (これはD425-AC9(配列番号371)の翻訳体である)である。
図165は、D425-AC10の核酸配列(配列番号373)およびD425-AC10のアミノ酸配列(配列番号374) (これはD425-AC10(配列番号373)の翻訳体である)である。
図166は、D425-AC11の核酸配列(配列番号375)およびD425-AC11のアミノ酸配列(配列番号376) (これはD425-AC11(配列番号375)の翻訳体である)である。
図167は、D425-AG11の核酸配列(配列番号377)およびD425-AG11のアミノ酸配列(配列番号378) (これはD425-AG11(配列番号377)の翻訳体である)である。
図168は、D425-AH7の核酸配列(配列番号379)およびD425-AH7のアミノ酸配列(配列番号380) (これはD425-AH7(配列番号379)の翻訳体である)である。
図169は、D425-AH11の核酸配列(配列番号381)およびD425-AH11のアミノ酸配列(配列番号382) (これはD425-AH11(配列番号381)の翻訳体である)である。
図170は、D427-AA5の核酸配列(配列番号383)およびD427-AA5のアミノ酸配列(配列番号384) (これはD427-AA5(配列番号383)の翻訳体である)である。
図171は、GeneChip (登録商標) マイクロアレイ上のクローンのプローブセット配列 (配列番号385〜配列番号445)である。
図171は、GeneChip (登録商標) マイクロアレイ上のクローンのプローブセット配列 (配列番号385〜配列番号445)である。
図171は、GeneChip (登録商標) マイクロアレイ上のクローンのプローブセット配列 (配列番号385〜配列番号445)である。
図172-1は、D424-AA4 (配列番号446)の核酸配列; D424-AF5 (配列番号447) の核酸配列およびD424-AF5 (配列番号448)のアミノ酸配列(これはD424-AF5 (配列番号447)の翻訳体である); D425-AA11 (配列番号449)の核酸配列およびD425-AA11 (配列番号450)のアミノ酸配列(これはD425-AA11 (配列番号449)の翻訳体である);ならびにD425-AF11 (配列番号451)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-2は、D425-AF11 (配列番号452)のアミノ酸配列(これはD425-AF11 (配列番号451)の翻訳体である); D425-AH10 (配列番号453)の核酸配列およびD425-AH10 (配列番号454)のアミノ酸配列(これはD425-AH10 (配列番号453)の翻訳体である); D426-AA3 (配列番号455)の核酸配列およびD426-AA3 (配列番号456)のアミノ酸配列(これはD426-AA3 (配列番号455)の翻訳体である);ならびにD426-AG1 (配列番号457)の核酸配列およびD426-AG1 (配列番号458)のアミノ酸配列(これはD426-AG1 (配列番号457)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-3は、D427-AA6 (配列番号459)の核酸配列およびD427-AA6 (配列番号460)のアミノ酸配列(これはD427-AA6 (配列番号459)の翻訳体である); D427-AB6 (配列番号461)の核酸配列およびD427-AB6 (配列番号462)のアミノ酸配列(これはD427-AB6 (配列番号461)の翻訳体である); D428-AC9 (配列番号463)の核酸配列およびのD428-AC9 (配列番号464)アミノ酸配列(これはD428-AC9 (配列番号463)の翻訳体である);ならびにD428-AH10 (配列番号465)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-4は、D428-AH10 (配列番号466)のアミノ酸配列(これはD428-AH10 (配列番号465)の翻訳体である); D429-AA1 (配列番号467)の核酸配列およびD429-AA1 (配列番号468)のアミノ酸配列(これはD429-AA1 (配列番号467)の翻訳体である); D430-AA3 (配列番号469)の核酸配列およびD430-AA3 (配列番号470)のアミノ酸配列(これはD430-AA3 (配列番号469)の翻訳体である);ならびにD431-AE6 (配列番号471)の核酸配列およびD431-AE6 (配列番号472)のアミノ酸配列(これはD431-AE6 (配列番号471)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-5は、D113-AE9 (配列番号473)の核酸配列およびD113-AE9 (配列番号474)のアミノ酸配列(これはD113-AE9 (配列番号473)の翻訳体である);ならびにD114-AE12 (配列番号475)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-6は、D114-AE12 (配列番号476)のアミノ酸配列(これはD114-AE12 (配列番号475)の翻訳体である); D119-AC3 (配列番号477)の核酸配列およびD119-AC3 (配列番号478)のアミノ酸配列(これはD119-AC3 (配列番号477)の翻訳体である);ならびにD132-AA5 (配列番号479)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-7は、D132-AA5 (配列番号480)のアミノ酸配列(これはD132-AA5 (配列番号479)の翻訳体である); D223-BB10 (配列番号481)の核酸配列およびD223-BB10 (配列番号482)のアミノ酸配列(これはD223-BB10 (配列番号481)の翻訳体である);ならびにD245-AA8 (配列番号483)の核酸配列およびD245-AA8 (配列番号484)のアミノ酸配列(これはD245-AA8 (配列番号483)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-8は、D246-AE12 (配列番号485)の核酸配列およびD246-AE12 (配列番号486)のアミノ酸配列(これはD246-AE12 (配列番号485)の翻訳体である);ならびにD279-AD1 (配列番号487)の核酸配列およびD279-AD1 (配列番号488)のアミノ酸配列(これはD279-AD1 (配列番号487)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-9は、D282-AA10 (配列番号489)の核酸配列およびD282-AA10 (配列番号490)のアミノ酸配列(これはD282-AA10 (配列番号489)の翻訳体である);ならびにD295-AA1 (配列番号491)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-10は、D295-AA1 (配列番号492)のアミノ酸配列(これはD295-AA1 (配列番号491)の翻訳体である); D101A-AE2 (配列番号493)の核酸配列およびD101A-AE2 (配列番号494)のアミノ酸配列(これはD101A-AE2 (配列番号493)の翻訳体である);ならびにD108-AA4 (配列番号495)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-11は、D108-AA4 (配列番号496)のアミノ酸配列(これはD108-AA4 (配列番号495)の翻訳体である); D124-AC5(5’) (配列番号497)の核酸配列およびD124-AC5(5’) (配列番号498)のアミノ酸配列(これはD124-AC5(5’) (配列番号497)の翻訳体である); D124-AC5(3’) (配列番号499)の核酸配列およびD124-AC5(3’) (配列番号500)のアミノ酸配列(これはD124-AC5(3’) (配列番号499)の翻訳体である);ならびにD141-AD7 (配列番号501)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-12は、D141-AD7 (配列番号502)のアミノ酸配列, (これはD141-AD7 (配列番号501)の翻訳体である);ならびにD148-AD1 (配列番号503)の核酸配列およびD148-AD1 (配列番号504)のアミノ酸配列(これはD148-AD1 (配列番号503)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-13は、D212-BC11 (配列番号505)の核酸配列およびD212-BC11 (配列番号506)のアミノ酸配列(これはD212-BC11 (配列番号505)の翻訳体である);ならびにD217-AB10 (配列番号507)の核酸配列およびD217-AB10 (配列番号508)のアミノ酸配列(これはD217-AB10 (配列番号507)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-14は、D220-BC6 (配列番号509)の核酸配列およびD220-BC6 (配列番号510)のアミノ酸配列(これはD220-BC6 (配列番号509)の翻訳体である); D225-AG9 (配列番号511)の核酸配列およびD225-AG9 (配列番号512)のアミノ酸配列(これはD225-AG9 (配列番号511)の翻訳体である); D231-AF1 (配列番号513)の核酸配列およびD231-AF1 (配列番号514)のアミノ酸配列(これはD231-AF1 (配列番号513)の翻訳体である);ならびにD232-AH5 (配列番号515)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-15は、D232-AH5 (配列番号516)のアミノ酸配列(これはD232-AH5 (配列番号515)の翻訳体である); D240-BB8 (配列番号517)の核酸配列およびD240-BB8 (配列番号518)のアミノ酸配列(これはD240-BB8 (配列番号517)の翻訳体である); D280-AA6 (配列番号519)の核酸配列およびD280-AA6 (配列番号520)のアミノ酸配列(これはD280-AA6 (配列番号519)の翻訳体である);ならびにD285-AD7 (配列番号521)の核酸配列およびD285-AD7 (配列番号522)のアミノ酸配列(これはD285-AD7 (配列番号521)での翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-16は、D285-AH9 (配列番号523)の核酸配列およびD285-AH9 (配列番号524)のアミノ酸配列(これはD285-AH9 (配列番号523)の翻訳体である); D99-AB3 (配列番号525)の核酸配列およびD99-AB3 (配列番号526)のアミノ酸配列(これはD99-AB3 (配列番号525)の翻訳体である);ならびにD99-AC2 (配列番号527)の核酸配列およびD99-AC2 (配列番号528)のアミノ酸配列(これはD99-AC2 (配列番号527)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-17は、D99-AF11 (配列番号529)の核酸配列およびD99-AF11 (配列番号530)のアミノ酸配列(これはD99-AF11 (配列番号529)の翻訳体である); D99-AH4 (配列番号531)の核酸配列およびD99-AH4 (配列番号532)のアミノ酸配列(これはD99-AH4 (配列番号531)の翻訳体である); D99-AH7 (配列番号533)の核酸配列およびD99-AH7 (配列番号534)のアミノ酸配列(これはD99-AH7 (配列番号533)の翻訳体である); D99-DB4 (配列番号535)の核酸配列およびD99-DB4 (配列番号536)のアミノ酸配列(これはD99-DB4 (配列番号535)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-18は、D99-DG4 (配列番号537)の核酸配列およびD99-DG4 (配列番号538)のアミノ酸配列(これはD99-DG4 (配列番号537)の翻訳体である); D40-2 (配列番号539)の核酸配列およびD40-2 (配列番号540)のアミノ酸配列(これはD40-2 (配列番号539)の翻訳体である); D301-EE11 (配列番号541)の核酸配列およびD301-EE11 (配列番号542)のアミノ酸配列(これはD301-EE11 (配列番号541)の翻訳体である);ならびにD302-AE10 (配列番号543)の核酸配列よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図172-19は、D302-AE10 (配列番号544)のアミノ酸配列(これはD302-AE10 (配列番号543)の翻訳体である); D303-AC6 (配列番号545)の核酸配列およびD303-AC6 (配列番号546)のアミノ酸配列(これはD303-AC6 (配列番号545)の翻訳体である);ならびにD303-AC11 (配列番号547)の核酸配列およびD303-AC11 (配列番号548)のアミノ酸配列(これはD303-AC11 (配列番号547)の翻訳体である)よりなる核酸およびアミノ酸配列群である。
図173-1は、40-17 (配列番号549), 40-20 (配列番号550), 40-23 (配列番号551), 40-26 (配列番号552), D40-27 (配列番号553), 40-28 (配列番号554)および40-78 (配列番号555)の核酸配列である。
図173-2は、40-83 (配列番号556), D40-86 (配列番号557), D40-97 (配列番号558), 40-100 (配列番号559), 40-107 (配列番号560), D41-41 (配列番号561)およびD41-60 (配列番号562)の核酸配列である。
図173-3は、D41-65 (配列番号563), D41-67 (配列番号564), D41-69 (配列番号565), D41-99 (配列番号566), D42-AA3 (配列番号567), D42-AA7 (配列番号568)およびD42-AC3 (配列番号569)の核酸配列である。
図173-4は、D42-AC7 (配列番号570), D42-AC8 (配列番号571), D42-AD3 (配列番号572), D42-AD12 (配列番号573), D42-AF3 (配列番号574)およびD42-AH3 (配列番号575)の核酸配列である。
図173-5は、D42-BA2 (配列番号576), D42-BB11 (配列番号577), D42-KC9 (配列番号578), D42-KC10 (配列番号579), D42-LB2 (配列番号580), D42-LC7 (配列番号581), D42-TG7 (配列番号582)およびD42-UG8 (配列番号583)の核酸配列である。
図173-6は、D42-ZB1 (配列番号584), D300-AA7 (配列番号585), D300-AB3 (配列番号586), D300-AB7 (配列番号587), D300-AB10 (配列番号588), D300-AB11 (配列番号589)およびD300-AC2 (配列番号590)の核酸配列である。
図173-7は、D300-AC6 (配列番号591), D300-AC7 (配列番号592), D300-AD4 (配列番号593), D300-AD6 (配列番号594), D300-AD10 (配列番号595), D300-AE3 (配列番号596)およびD300-AE9 (配列番号597)の核酸配列である。
図173-8は、D300-AE11 (配列番号598), D300-AF4 (配列番号599), D300-AF5 (配列番号600), D300-AF7 (配列番号601), D300-AF8 (配列番号602), D300-AF9 (配列番号603)およびD300-AF11 (配列番号604)の核酸配列である。
図173-9は、D300-AG1 (配列番号605), D300-AG2 (配列番号606), D300-AG3 (配列番号607), D300-AG10 (配列番号608), D300-AH6 (配列番号609), D300-AH9 (配列番号610), D300-AH10 (配列番号611)およびD300-AH11 (配列番号612)の核酸配列である。
図173-10は、D300-BA5 (配列番号613), D300-BA6 (配列番号614), D300-BA7 (配列番号615), D300-BA12 (配列番号616), D300-BB6 (配列番号617), D300-BB7 (配列番号618)およびD300-BC1 (配列番号619)の核酸配列である。
図173-11は、D300-BC4 (配列番号620), D300-BC7 (配列番号621), D300-BC8 (配列番号622), D300-BC9 (配列番号623), D300-BD2 (配列番号624), D300-BD7 (配列番号625)およびD300-BE1 (配列番号626)の核酸配列である。
図173-12は、D300-BE2 (配列番号627), D300-BE7 (配列番号628), D300-BE8 (配列番号629), D300-BE9 (配列番号630), D300-BE12 (配列番号631), D300-BF7 (配列番号632), D300-BF11 (配列番号633)およびD300-BG1 (配列番号634)の核酸配列である。
図173-13は、D300-BG2 (配列番号635), D300-BG5 (配列番号636), D300-BH6 (配列番号637), D300-BH9 (配列番号638), D300-CA1 (配列番号639), D300-CA6 (配列番号640)およびD300-CB1 (配列番号641)の核酸配列である。
図173-14は、D300-CB12 (配列番号642), D300-CC2 (配列番号643), D300-CD2 (配列番号644), D300-CD3 (配列番号645), D300-CD4 (配列番号646), D300-CD5 (配列番号647)およびD300-CE3 (配列番号648)の核酸配列である。
図173-15は、D300-CE7 (配列番号649), D300-CF1 (配列番号650), D300-CF2 (配列番号651), D300-CF11 (配列番号652), D300-CG2 (配列番号653), D300-CG7 (配列番号654), D300-CH1 (配列番号655)およびD300-CH3 (配列番号656)の核酸配列である。
図173-16は、D300-CH5 (配列番号657), D300-CH7 (配列番号658), D300-DA1 (配列番号659), D300-DA4 (配列番号660), D300-DB2 (配列番号661), D300-DB4 (配列番号662), D300-DB6 (配列番号663)およびD300-DB7-c (配列番号664)の核酸配列である。
図173-17は、D300-DB8 (配列番号665), D300-DC2 (配列番号666), D300-DC4 (配列番号667), D300-DC7 (配列番号668), D300-DC10 (配列番号669), D300-DC11 (配列番号670)およびD300-DD5 (配列番号671)の核酸配列である。
図173-18は、D300-DD6 (配列番号672), D300-DE2 (配列番号673), D300-DE9 (配列番号674), D300-DE10 (配列番号675), D300-DF5 (配列番号676), D300-DF6 (配列番号677), D300-DF8 (配列番号678)およびD300-DF12 (配列番号679)の核酸配列である。
図173-19は、D300-DG1 (配列番号680), D300-DG3 (配列番号681), D300-DG9 (配列番号682), D300-DG11 (配列番号683), D300-DH10 (配列番号684), D301-AB10 (配列番号685)およびD301-AC5 (配列番号686)の核酸配列である。
図173-20は、D301-AC7 (配列番号687), D301-AC9 (配列番号688), D301-AD1 (配列番号689), D301-AD2 (配列番号690), D301-AE4c (配列番号691), D301-AF12 (配列番号692), D301-AH6 (配列番号693)およびD301-AH12 (配列番号694)の核酸配列である。
図173-21は、D301-BB8 (配列番号695), D301-BB9 (配列番号696), D301-BC1 (配列番号697), D301-BC8 (配列番号698), D301-BD1 (配列番号699), D301-BD2 (配列番号700)およびD301-BF3 (配列番号701)の核酸配列である。
図173-22は、D301-DA4 (配列番号702), D301-DA8 (配列番号703), D301-DB5 (配列番号704), D301-DC6 (配列番号705), D301-DD4 (配列番号706), D301-DG1 (配列番号707), D301-DG4c (配列番号708)およびD301-EA5 (配列番号709)の核酸配列である。
図173-23は、D301-EA6 (配列番号710), D301-EA7 (配列番号711), D301-EC9 (配列番号712), D301-EC10 (配列番号713), D301-ED5 (配列番号714), D301-ED7 (配列番号715)およびD301-EE7 (配列番号716)の核酸配列である。
図173-24は、D301-EF2 (配列番号717), D301-EF5 (配列番号718), D301-EF10 (配列番号719), D301-EG12 (配列番号720), D302-AB8 (配列番号721), D302-AB9 (配列番号722), D302-AB12 (配列番号723)およびD302-AC1 (配列番号724)の核酸配列である。
図173-25は、D302-AC5 (配列番号725), D302-AC6 (配列番号726), D302-AC7 (配列番号727), D302-AC12 (配列番号728), D302-AD4 (配列番号729), D302-AD7 (配列番号730)およびD302-AE7 (配列番号731)の核酸配列である。
図173-26は、D302-AF6 (配列番号732), D302-AF8 (配列番号733), D302-AG2 (配列番号734), D302-AH10 (配列番号735), D302-BA2 (配列番号736), D302-BA6 (配列番号737), D302-BC3 (配列番号738)およびD302-BC6 (配列番号739)の核酸配列である。
図173-27は、D302-BC9 (配列番号740), D302-BD3 (配列番号741), D302-BD7 (配列番号742), D302-BD9 (配列番号743), D302-BE1 (配列番号744)およびD302-BE2 (配列番号745)の核酸配列である。
図173-28は、D302-BE6 (配列番号746), D302-BE7 (配列番号747), D302-BF1 (配列番号748), D302-BF5 (配列番号749), D302-BG1 (配列番号750), D302-bg3 (配列番号751)およびD302-BG7 (配列番号752)の核酸配列である。
図173-29は、D302-Bg9 (配列番号753), D302-BH1 (配列番号754), D302-bh9 (配列番号755), D302-CA5 (配列番号756), D302-CB7 (配列番号757), D302-CC1 (配列番号758), D302-CC3 (配列番号759)およびD302-CD2 (配列番号760)の核酸配列である。
図173-30は、D302-CE3 (配列番号761), D302-CE9 (配列番号762), D302-CF2 (配列番号763), D302-CF5 (配列番号764), D302-CF6 (配列番号765), D302-CH1 (配列番号766)およびD302-CH4 (配列番号767)の核酸配列である。
図173-31は、D302-CH5 (配列番号768), D302-CH6 (配列番号769), D302-DA2 (配列番号770), D302-DA5 (配列番号771), D302-DA9 (配列番号772), D302-DC4 (配列番号773)およびD302-DC7 (配列番号774)の核酸配列である。
図173-32は、D302-DC8 (配列番号775), D302-DC11 (配列番号776), D302-DD3 (配列番号777), D302-DF5 (配列番号778), D302-DF7 (配列番号779), D302-DG9 (配列番号780)およびD302-DH8 (配列番号781)の核酸配列である。
図173-33は、D303-AA9 (配列番号782), D303-AA10 (配列番号783), D303-AB11 (配列番号784), D303-AC4 (配列番号785), D303-AD3 (配列番号786), D303-AD11 (配列番号787), D303-AE1 (配列番号788)およびD303-ae2 (配列番号789)の核酸配列である。
図173-34は、D303-ae6 (配列番号790), D303-AF5 (配列番号791), D303-AF12 (配列番号792), D303-AG1 (配列番号793), D303-AG8 (配列番号794), D303-AG9 (配列番号795), D303-AH5 (配列番号796)およびD303-BA1 (配列番号797)の核酸配列である。
図173-35は、D303-BA5 (配列番号798), D303-BB6 (配列番号799), D303-BC1 (配列番号800), D303-BC2 (配列番号801), D303-BC8 (配列番号802), D303-BC11 (配列番号803), D303-bd2 (配列番号804)およびD303-BD6 (配列番号805)の核酸配列である。
図173-36は、D303-BD9 (配列番号806), D303-BE3 (配列番号807), D303-BE4 (配列番号808), D303-BE7 (配列番号809), D303-BF1 (配列番号810), D303-BF6 (配列番号811), D303-BG2 (配列番号812)およびD303-BG11 (配列番号813)の核酸配列である。
図173-37は、D303-BH1 (配列番号814), D303-BH6 (配列番号815), D414-AG2 (配列番号816), D35-33 (配列番号817), D35-34 (配列番号818)およびD35-35 (配列番号819)の核酸配列である。
図173-38は、D35-41 (配列番号820), D35-43 (配列番号821), D35-51 (配列番号822)およびD35-AC4 (配列番号823)の核酸配列である。
図173-39は、D35-AC12 (配列番号824), D35-AE2 (配列番号825), D35-AE6 (配列番号826), D35-AF1 (配列番号827), D35-AF3 (配列番号828)およびD35-AG3 (配列番号829)の核酸配列である。
図173-40は、D35-BA5 (配列番号830), D35-BA12 (配列番号831), D35-BB1 (配列番号832), D35-BB3 (配列番号833)およびD35-BB10 (配列番号834)の核酸配列である。
図173-41は、D35-BB12 (配列番号835), D55-AA8 (配列番号836), D55-AB1 (配列番号837), D55-AB5 (配列番号838)およびD55-AB6 (配列番号839)の核酸配列である。
図173-42は、D55-AB7 (配列番号840), D55-AB10 (配列番号841), D55-AA2 (配列番号842), D55-AC2 (配列番号843)およびD55-AC5 (配列番号844)の核酸配列である。
図173-43は、D55-AC7 (配列番号845), D55-BA7 (配列番号846), D55-BA8 (配列番号847), D55-BA10 (配列番号848), D55-BA11 (配列番号849)およびD55-BB9 (配列番号850)の核酸配列である。
図173-44は、D55-BB10 (配列番号851), D55-BB12 (配列番号852), D55-BC4 (配列番号853), D55-BC5 (配列番号854), D55-AA6 (配列番号855)およびD56-AE5 (配列番号856)の核酸配列である。
図173-45は、D56-AA2 (配列番号857), D56-AA4 (配列番号858), D56-AA8 (配列番号859), D56-AA9 (配列番号860), D56-AB1 (配列番号861)およびD56-AB7 (配列番号862)の核酸配列である。
図173-46は、D56-AB9 (配列番号863), D56-AC9 (配列番号864), D56-AD3 (配列番号865), D56-AG8 (配列番号866)およびD56-AH1 (配列番号867)の核酸配列である。
図173-47は、D56-AH10 (配列番号868), D56-AE2 (配列番号869), D57-AB2 (配列番号870), D57-AB5 (配列番号871)およびD57-AB6 (配列番号872)の核酸配列である。
図173-48は、D57-AB8 (配列番号873), D57-AB11 (配列番号874), D57-AB12 (配列番号875), D57-AC1 (配列番号876), D57-AC4 (配列番号877)およびD57-AC12 (配列番号878)の核酸配列である。
図173-49は、D57-AD5 (配列番号879), D57-AD8 (配列番号880), D57-AD9 (配列番号881), D57-AE1 (配列番号882), D57-AE2 (配列番号883)およびD57-AE7 (配列番号884)の核酸配列である。
図173-50は、D57-AF2 (配列番号885), D57-AE12 (配列番号886), D57-AF3 (配列番号887), D57-AF5 (配列番号888)およびD57-AF9 (配列番号889)の核酸配列である。
図173-51は、D57-AG5 (配列番号890), D57-AG7 (配列番号891), D57-AG11 (配列番号892)およびD57-AH10 (配列番号893)の核酸配列である。
図173-52は、D58-AA3 (配列番号894), D58-AA5 (配列番号895), D58-AB3 (配列番号896), D58-AB5 (配列番号897)およびD58-AC1 (配列番号898)の核酸配列である。
図173-53は、D58-AC9 (配列番号899), D58-AC11 (配列番号900), D58-AD2 (配列番号901)およびD58-AD5 (配列番号902)の核酸配列である。
図173-54は、D58-AD7 (配列番号903), D58-AD8 (配列番号904), D58-AD10 (配列番号905), D58-AE1 (配列番号906)およびD58-AE2 (配列番号907)の核酸配列である。
図173-55は、D58-AE5 (配列番号908), D58-AE9 (配列番号909), D58-AE10 (配列番号910), D58-AE11 (配列番号911)およびD58-AF3 (配列番号912)の核酸配列である。
図173-56は、D58-AF6 (配列番号913), D58-AH4 (配列番号914), D58-AH7 (配列番号915), D58-AH9 (配列番号916)およびD58-AH10 (配列番号917)の核酸配列である。
図173-57は、D58-BA5 (配列番号918), D58-BA7 (配列番号919), D58-BB7 (配列番号920), D58-BC5 (配列番号921), D58-BD3 (配列番号922)およびD58-BD7 (配列番号923)の核酸配列である。
図173-58は、D58-BD8 (配列番号924), D58-BD10 (配列番号925), D58-BE2 (配列番号926), D58-BE11 (配列番号927)およびD58-BF1 (配列番号928)の核酸配列である。
図173-59は、D58-BF2 (配列番号929), D58-BG3 (配列番号930), D58-BG5 (配列番号931), D58-BG8 (配列番号932), D58-BG10 (配列番号933)およびD58-BG12 (配列番号934)の核酸配列である。
図173-60は、D58-BH10 (配列番号935), D58-BH8 (配列番号936), D58-BH2 (配列番号937), D60-AA1 (配列番号938), D60-AA2 (配列番号939)およびD60-AA3 (配列番号940)の核酸配列である。
図173-61は、D60-AA5 (配列番号941), D60-AA6 (配列番号942), D60-AA7 (配列番号943), D60-AA8 (配列番号944), D60-AA10 (配列番号945)およびD60-AA11 (配列番号946)の核酸配列である。
図173-62は、D60-AA12 (配列番号947), D60-AB3 (配列番号948), D60-AB5 (配列番号949), D60-AB6 (配列番号950), D60-AB7 (配列番号951)およびD60-AB8 (配列番号952)の核酸配列である。
図173-63は、D60-AB11 (配列番号953), D60-AC3 (配列番号954), D60-AC5 (配列番号955), D60-AC7 (配列番号956), D60-AC8 (配列番号957)およびD60-AC11 (配列番号958)の核酸配列である。
図173-64は、D60-AC12 (配列番号959), D60-AD3 (配列番号960), D60-AD4 (配列番号961), D60-AD5 (配列番号962), D60-AD7 (配列番号963)およびD60-AE1 (配列番号964)の核酸配列である。
図173-65は、D60-AE4 (配列番号965), D60-AE6 (配列番号966), D60-AE8 (配列番号967), D60-AE12 (配列番号968), D60-AF5 (配列番号969)およびD60-AF8 (配列番号970)の核酸配列である。
図173-66は、D60-AF11 (配列番号971), D60-AG1 (配列番号972), D60-AG10 (配列番号973), D60-AG12 (配列番号974), D60-AH1 (配列番号975)およびD60-AH5 (配列番号976)の核酸配列である。
図173-67は、D60-AH6 (配列番号977), D60-AH9 (配列番号978), D60-AH10 (配列番号979), D60-AH11 (配列番号980)およびD63-AA12 (配列番号981)の核酸配列である。
図173-68は、D64-4 (配列番号982), D64-AB4 (配列番号983), D64-AB10 (配列番号984), D65-AA6 (配列番号985)およびD65-AA7 (配列番号986)の核酸配列である。
図173-69は、D65-AA9 (配列番号987), D65-AB4 (配列番号988), D65-AB5 (配列番号989), D65-AB8 (配列番号990), D65-AB9 (配列番号991)およびD65-AB11 (配列番号992)の核酸配列である。
図173-70は、D65-AC1 (配列番号993), D65-AC6 (配列番号994), D65-AC10 (配列番号995), D65-AC11 (配列番号996), D65-AD3 (配列番号997)およびD65-AE1 (配列番号998)の核酸配列である。
図173-71は、D65-AE2 (配列番号999), D65-AE10 (配列番号1000), D65-AE11 (配列番号1001), D65-AE12 (配列番号1002), D65-AF1 (配列番号1003)およびD65-AF5 (配列番号1004)の核酸配列である。
図173-72は、D65-AF7 (配列番号1005), D65-AG11 (配列番号1006), D65-CE1 (配列番号1007), D65-CE2 (配列番号1008), D65-CE7 (配列番号1009)およびD65-CE9 (配列番号1010)の核酸配列である。
図173-73は、D65-CE12 (配列番号1011), D65-CF3 (配列番号1012), D65-CF10 (配列番号1013), D65-CF12 (配列番号1014), D65-CG2 (配列番号1015), D65-CG5 (配列番号1016)およびD65-CH3 (配列番号1017)の核酸配列である。
図173-74は、D65-CH4 (配列番号1018), D65-CH6 (配列番号1019), D65-CH8 (配列番号1020), D65-CH9 (配列番号1021), D65-CH11 (配列番号1022)およびD65-CH12 (配列番号1023)の核酸配列である。
図173-75は、D66-AA4 (配列番号1024), D66-AA5 (配列番号1025), D66-AA6 (配列番号1026), D66-AA9 (配列番号1027)およびD66-AB5 (配列番号1028)の核酸配列である。
図173-76は、D66-AB1 (配列番号1029), D66-AB7 (配列番号1030), D66-AC1 (配列番号1031), D66-AC2 (配列番号1032)およびD66-AC4 (配列番号1033)の核酸配列である。
図173-77は、D66-AC7 (配列番号1034), D66-AD1 (配列番号1035), D66-AD3 (配列番号1036)およびD66-AD6 (配列番号1037)の核酸配列である。
図173-78は、D66-AD8 (配列番号1038), D66-AE1 (配列番号1039), D66-AE3 (配列番号1040), D66-AE6 (配列番号1041), D66-AE8 (配列番号1042)およびD66-AF3 (配列番号2263)の核酸配列である。
図173-79は、D66-AF5 (配列番号1043), D66-AF8 (配列番号1044), D66-AF9 (配列番号1045)およびD66-AG1 (配列番号1046)の核酸配列である。
図173-80は、D66-AG4 (配列番号1047), D66-AG5 (配列番号1048), D66-AH4 (配列番号1049), D66-AH5 (配列番号1050), D66-AH7 (配列番号1051)およびD66-AH8 (配列番号1052)の核酸配列である。
図173-81は、D66-AH9 (配列番号1053), D66-BA3 (配列番号1054), D66-BA8 (配列番号1055)およびD66-BB1 (配列番号1056)の核酸配列である。
図173-82は、D66-BB2 (配列番号1057), D66-BB3 (配列番号1058), D66-BB5 (配列番号1059)およびD66-BB7 (配列番号1060)の核酸配列である。
図173-83は、D66-BB9 (配列番号1061), D66-BB10 (配列番号1062), D66-BC6 (配列番号1063), D66-BD1 (配列番号1064)およびD66-BD2 (配列番号1065)の核酸配列である。
図173-84は、D66-BD9 (配列番号1066), D67-AA2 (配列番号1067), D67-AA3 (配列番号1068), D67-AB1 (配列番号1069)およびD67-AC5 (配列番号1070)の核酸配列である。
図173-85は、D67-AD1 (配列番号1071), D67-AD4 (配列番号1072), D67-AD6 (配列番号1073), D67-AE2 (配列番号1074)およびD67-AE6 (配列番号1075)の核酸配列である。
図173-86は、D67-AF6 (配列番号1076), D67-AG1 (配列番号1077), D67-AG3 (配列番号1078), D67-AG5 (配列番号1079)およびD67-AG6 (配列番号1080)の核酸配列である。
図173-87は、D69-AA5 (配列番号1081), D69-AB1 (配列番号1082), D69-AB8 (配列番号1083), D69-AB9 (配列番号1084)およびD69-AC4 (配列番号1085)の核酸配列である。
図173-88は、D70A-AB10 (配列番号1086), D70A-AC2 (配列番号1087), D70A-AC3 (配列番号1088), D70A-AD3 (配列番号1089), D70A-AD5 (配列番号1090)およびD70A-AD6 (配列番号1091)の核酸配列である。
図173-89は、D70A-AD11 (配列番号1092), D70A-AE10 (配列番号1093), D70A-AF6 (配列番号1094), D70A-AF8 (配列番号1095), D70A-AF10 (配列番号1096), D70A-AH5 (配列番号1097)およびD70A-AH8 (配列番号1098)の核酸配列である。
図173-90は、D70A-BA3 (配列番号1099), D70A-BA6 (配列番号1100), D70A-BA10 (配列番号1101), D70A-BB8 (配列番号1102)およびD70A-BB11 (配列番号1103)の核酸配列である。
図173-91は、D70A-BC7 (配列番号1104), D70A-BD8 (配列番号1105), D70A-BE1 (配列番号1106), D70A-BE5 (配列番号1107), D70A-BE6 (配列番号1108)およびD70A-BE8 (配列番号1109)の核酸配列である。
図173-92は、D70A-BF2 (配列番号1110), D70A-BF3 (配列番号1111), D70A-BF10 (配列番号1112), D70A-BG9 (配列番号1113), D70A-BH8 (配列番号1114)およびD70-AE2 (配列番号1115)の核酸配列である。
図173-93は、D70-AE6 (配列番号1116), D70-AF3 (配列番号1117), D70-AG10 (配列番号1118), D70-AH7 (配列番号1119), D70-BE6 (配列番号1120)およびD70-BE7 (配列番号1121)の核酸配列である。
図173-94は、D70A-BC12 (配列番号1122), D72-AB2 (配列番号1123), D72-AB6 (配列番号1124), D73A-AA12 (配列番号1125)およびD73A-AB4 (配列番号1126)の核酸配列である。
図173-95は、D73A-AB9 (配列番号1127), D73A-AB11 (配列番号1128), D73A-AC1 (配列番号1129), D73A-AC3 (配列番号1130)およびD73A-AC8 (配列番号1131)の核酸配列である。
図173-96は、D73A-AD3 (配列番号1132), D73A-AE1 (配列番号1133), D73A-AE3 (配列番号1134), D73A-AE4 (配列番号1135), D73A-AE5 (配列番号1136)およびD73A-AE9 (配列番号1137)の核酸配列である。
図173-97は、D73A-AE10 (配列番号1138), D73A-AF3 (配列番号1139), D73A-AF4 (配列番号1140), D73A-AF7 (配列番号1141), D73A-AF8 (配列番号1142)およびD73A-AG11 (配列番号1143)の核酸配列である。
図173-98は、D73A-AH1 (配列番号1144), D73A-AH5 (配列番号1145), D73A-AH9 (配列番号1146), D73A-AH12 (配列番号1147), D73A-BA9 (配列番号1148)およびD73A-BB3 (配列番号1149)の核酸配列である。
図173-99は、D73A-BB9 (配列番号1150), D73A-BE1 (配列番号1151), D73A-BF3 (配列番号1152), D73A-BG1 (配列番号1153)およびD73A-BG3 (配列番号1154)の核酸配列である。
図173-100は、D73A-BG5 (配列番号1155), D73A-BH1 (配列番号1156), D73-AC1 (配列番号1157), D73-AD8 (配列番号1158)およびD73-AD12 (配列番号1159)の核酸配列である。
図173-101は、D80-AB2 (配列番号1160), D81-AA5 (配列番号1161), D81-AB4 (配列番号1162), D81-AB6 (配列番号1163)およびD81-AC5 (配列番号1164)の核酸配列である。
図173-102は、D82-AA8 (配列番号1165), D82-AC9 (配列番号1166), D82-AH9 (配列番号1167)およびD83-AD10 (配列番号1168)の核酸配列である。
図173-103は、D83-AG10 (配列番号1169), D84-AD3 (配列番号1170), D84-AE1 (配列番号1171), D84-AF4 (配列番号1172), D84-AG1 (配列番号1173)およびD87-AA1 (配列番号1174)の核酸配列である。
図173-104は、D87-AA3 (配列番号1175), D87A-AA1 (配列番号1176), D87A-AB1 (配列番号1177), D87A-AB3 (配列番号1178), D87A-AC1 (配列番号1179)およびD87A-AC3 (配列番号1180)の核酸配列である。
図173-105は、D87A-AF2 (配列番号1181), D87A-AG1 (配列番号1182), D87A-AH1 (配列番号1183), D87A-AH3 (配列番号1184), D87-AB2 (配列番号1185)およびD88-AA10 (配列番号1186)の核酸配列である。
図173-106は、D88-AB3 (配列番号1187), D88-AB6 (配列番号1188), D88-AB7 (配列番号1189), D88-AB8 (配列番号1190), D88-AC5 (配列番号1191)およびD88-AC9 (配列番号1192)の核酸配列である。
図173-107は、D88-AD8 (配列番号1193), D88-AE5 (配列番号1194), D88-AE6 (配列番号1195), D88-AE8 (配列番号1196)およびD91-AA4 (配列番号1197)の核酸配列である。
図173-108は、D92-AD9 (配列番号1198), D92-AE9 (配列番号1199), D92-AF8 (配列番号1200), D92-AG10 (配列番号1201), D92-AH9 (配列番号1202)およびD93-AA1 (配列番号1203)の核酸配列である。
図173-109は、D93-AA2 (配列番号1204), D93-AB1 (配列番号1205), D93-AC3 (配列番号1206), D93-AC4 (配列番号1207)およびD93-AD1 (配列番号1208)の核酸配列である。
図173-110は、D93-AE3 (配列番号1209), D93-AE4 (配列番号1210), D93-AF3 (配列番号1211), D93-AG1 (配列番号1212), D93-AH2 (配列番号1213)およびD93-AH3 (配列番号1214)の核酸配列である。
図173-111は、D93-AH4 (配列番号1215), D93-BA10 (配列番号1216), D93-BA12 (配列番号1217), D93-BD11 (配列番号1218), D93-BE11 (配列番号1219)およびD93-BF12 (配列番号1220)の核酸配列である。
図173-112は、D94-AA2 (配列番号1221), D94-AA3 (配列番号1222), D94-AB1 (配列番号1223), D94-AB2 (配列番号1224)およびD94-AC3 (配列番号1225)の核酸配列である。
図173-113は、D94-AD1 (配列番号1226), D94-AE1 (配列番号1227), D94-AE3 (配列番号1228), D94-AG2 (配列番号1229)およびD94-AH1 (配列番号1230)の核酸配列である。
図173-114は、D94-AH2 (配列番号1231), D94-AH3 (配列番号1232), D95-AC1 (配列番号1233), D95-AD2 (配列番号1234), D96-AA3 (配列番号1235)およびD96-AA4 (配列番号1236)の核酸配列である。
図173-115は、D96-AA7 (配列番号1237), D96-AB7 (配列番号2264), D96-AC5 (配列番号1238), D96-AC6 (配列番号1239)およびD96-AD6 (配列番号1240)の核酸配列である。
図173-116は、D96-AE6 (配列番号1241), D96-AG3 (配列番号1242), D96-AH8 (配列番号1243), D97-AA1 (配列番号1244), D97-AB1 (配列番号1245)およびD97-AB3 (配列番号1246)の核酸配列である。
図173-117は、D97-AD1 (配列番号1247), D97-AD2 (配列番号1248), D97-AD4 (配列番号1249), D97-AE1 (配列番号1250)およびD97-AE2 (配列番号1251)の核酸配列である。
図173-118は、D97-AE4 (配列番号1252), D97-AF3 (配列番号1253), D97-AG2 (配列番号1254), D97-AG3 (配列番号1255)およびD97-AH1 (配列番号1256)の核酸配列である。
図173-119は、D97-AH2 (配列番号1257), D97-AH4 (配列番号1258), D98-AB2 (配列番号1259), D98-AE3 (配列番号1260)およびD98-AF1 (配列番号1261の核酸配列)である。
図173-120は、D98-AH2 (配列番号1262), D99-AC5 (配列番号1263), D99-AC8 (配列番号1264), D99-AD2 (配列番号1265), D99-AD3 (配列番号1266)およびD99-AD4 (配列番号1267)の核酸配列である。
図173-121は、D99-AD6 (配列番号1268), D99-AE1 (配列番号1269), D99-AE5 (配列番号1270), D99-AE6 (配列番号1271), D99-AE7 (配列番号1272)およびD99-AE8 (配列番号1273)の核酸配列である。
図173-122は、D99-AF1 (配列番号1274), D99-AF5 (配列番号1275), D99-AF7 (配列番号1276), D99-AG2 (配列番号1277), D99-AG4 (配列番号1278), D99-AG7 (配列番号1279)およびD99-AH2 (配列番号1280)の核酸配列である。
図173-123は、D99-AH10 (配列番号1281), D99-DA3 (配列番号1282), D99-DB5 (配列番号1283), D99-DC2 (配列番号1284)およびD99-DC3 (配列番号1285)の核酸配列である。
図173-124は、D99-DD5 (配列番号1286), D99-DG4 (配列番号1287), D100A-AA4 (配列番号1288)およびD101-BG2 (配列番号1289)の核酸配列である。
図173-125は、D101A-AC2 (配列番号1290), D101A-AD1 (配列番号1291), D101A-AD2 (配列番号1292), D101A-AE1 (配列番号1293)およびD101A-AF1 (配列番号1294)の核酸配列である。
図173-126は、D101C-AA1 (配列番号1295), D101C-AB1 (配列番号1296), D101C-AC1 (配列番号1297), D101C-AD3 (配列番号1298)およびD101C-BD12 (配列番号1299)の核酸配列である。
図173-127は、D101C-BE12 (配列番号1300), D101C-BF12 (配列番号1301), D101C-BG12 (配列番号1302)およびD101D-AB6 (配列番号1303)の核酸配列である。
図173-128は、D101D-AC5 (配列番号1304), D101D-AG5 (配列番号1305), D101D-AG6 (配列番号1306), D101D-AH4 (配列番号1307)およびD101D-AH6 (配列番号1308)の核酸配列である。
図173-129は、D101D-BB11 (配列番号1309), D101D-BD11 (配列番号1310), D107-AA3 (配列番号1311), D107-AB2 (配列番号1312), D107-AC2 (配列番号1313)およびD107-AC3 (配列番号1314)の核酸配列である。
図173-130は、D107-AD2 (配列番号1315), D107-AD3 (配列番号1316), D107-AF1 (配列番号1317), D107-AH1 (配列番号1318), D108-AA6 (配列番号1319)およびD108-AB4 (配列番号1320)の核酸配列である。
図173-131は、D108-AB5 (配列番号1321), D108-AC6 (配列番号1322), D108-AD6 (配列番号1323), D108-AF6 (配列番号1324), D109-AA7 (配列番号1325)およびD109-AA8 (配列番号1326)の核酸配列である。
図173-132は、D109-AA9 (配列番号1327), D109-AB8 (配列番号1328), D109-AC7 (配列番号1329), D109-AC8 (配列番号1330), D109-AC9 (配列番号1331)およびD109-AE7 (配列番号1332)の核酸配列である。
図173-133は、D109-AF9 (配列番号1333), D109-AH7 (配列番号1334), D110-AB11 (配列番号1335), D110-AF10 (配列番号1336), D111-AA2 (配列番号1337)およびD111-AB1 (配列番号1338)の核酸配列である。
図173-134は、D111-AB3 (配列番号1339), D111-AC3 (配列番号1340), D111-AD1 (配列番号1341), D111-AF1 (配列番号1342)およびD111-AG3 (配列番号1343)の核酸配列である。
図173-135は、D111-AH1 (配列番号1344), D111-AH2 (配列番号1345), D112-AD6 (配列番号1346), D112-AE6 (配列番号1347)およびD112-AF5 (配列番号1348)の核酸配列である。
図173-136は、D112-AG5 (配列番号1349), D112-AH4 (配列番号1350), D113-AA9 (配列番号1351), D113A-AC3 (配列番号1352)およびD113A-AD1 (配列番号1353)の核酸配列である。
図173-137は、D113A-AD3 (配列番号1354), D113A-AF3 (配列番号1355), D113A-AG2 (配列番号1356), D113A-AH2 (配列番号1357), D113-AB9 (配列番号1358)およびD113-AC7 (配列番号1359)の核酸配列である。
図173-138は、D113-AD8 (配列番号1360), D113-AD9 (配列番号1361), D113-AE7 (配列番号1362), D113-AF8 (配列番号1363)およびD113-AF9 (配列番号1364)の核酸配列である。
図173-139は、D113-AG7 (配列番号1365), D113-AG9 (配列番号1366), D114-AE10 (配列番号1367), D114-AF11 (配列番号1368)およびD115-AA6 (配列番号1369)の核酸配列である。
図173-140は、D133-AA7 (配列番号1370), D133-AE8 (配列番号1371), D133-AF9 (配列番号1372), D133-AG8 (配列番号1373), D138-AD10 (配列番号1374)およびD139-AD1 (配列番号1375)の核酸配列である。
図173-141は、D140-AA4 (配列番号1376), D140-AD4 (配列番号1377), D140-AF4 (配列番号1378), D141-AA7 (配列番号1379), D141-AB7 (配列番号1380)およびD142-AB11 (配列番号1381)の核酸配列である。
図173-142は、D142-AC10 (配列番号1382), D142-AE10 (配列番号1383), D142-AE11 (配列番号1384), D142-AF10 (配列番号1385), D144-AA1 (配列番号1386)およびD144A-AA9 (配列番号1387)の核酸配列である。
図173-143は、D144A-AB12 (配列番号1388), D144A-AC9 (配列番号1389), D144A-AC10 (配列番号1390), D144A-AD12 (配列番号1391), D144A-AE12 (配列番号1392)およびD144A-AF11 (配列番号1393)の核酸配列である。
図173-144は、D144A-AF12 (配列番号1394), D144A-AG11 (配列番号1395), D144A-AH9 (配列番号1396), D144A-AH11 (配列番号1397)およびD144-AE4 (配列番号1398)の核酸配列である。
図173-145は、D144-AH3 (配列番号1399), D145-AA8 (配列番号1400), D145-AC10 (配列番号1401), D145-AD7 (配列番号1402), D145-AD9 (配列番号1403)およびD145-AD10 (配列番号1404)の核酸配列である。
図173-146は、D145-AE7 (配列番号1405), D145-AF7 (配列番号1406), D145-AF8 (配列番号1407), D145-AG8 (配列番号1408), D145-AG9 (配列番号1409)およびD145-AG10 (配列番号1410)の核酸配列である。
図173-147は、D145-AH9 (配列番号1411), D146-BB2 (配列番号1412), D146-BC1 (配列番号1413), D146-BD1 (配列番号1414)およびD146-BD2 (配列番号1415)の核酸配列である。
図173-148は、配列D146-BF2 (配列番号1416), D147-AE2 (配列番号1417), D150-AA2 (配列番号1418), D150-AC2 (配列番号1419)およびD150-AD1 (配列番号1420)の核酸である。
図173-149は、D151-AA1 (配列番号1421), D152-AA2 (配列番号1422), D152-AB2 (配列番号1423), D152-AC1 (配列番号1424), D152-AD2 (配列番号1425)およびD152-AG2 (配列番号1426)の核酸配列である。
図173-150は、D152-AH2 (配列番号1427), D153-AA7 (配列番号1428), D153-AB2 (配列番号1429), D153-AF2 (配列番号1430), D153-AF7 (配列番号1431)およびD153-AF9 (配列番号1432)の核酸配列である。
図173-151は、の核酸配列D153-AG6 (配列番号1433), D153-AG7 (配列番号1434), D153-AG9 (配列番号1435), D153-AH6 (配列番号1436)およびD153-AH9 (配列番号1437)である。
図173-152は、D154-AC2 (配列番号1438), D154-AE9 (配列番号1439), D155-AB1 (配列番号1440), D155-AC1 (配列番号1441)およびD155-AC2 (配列番号1442)の核酸配列である。
図173-153は、D155-AE1 (配列番号1443), D155-AE2 (配列番号1444), D155-AF1 (配列番号1445), D155-AF2 (配列番号1446)およびD155-AH2 (配列番号1447)の核酸配列である。
図173-154は、D156-AB1 (配列番号1448), D156-AC3 (配列番号1449), D156-AC4 (配列番号1450), D156-AD3 (配列番号1451)およびD156-AF2 (配列番号1452)の核酸配列である。
図173-155は、D156-AF4 (配列番号1453), D156-AG1 (配列番号1454), D156-AG2 (配列番号1455), D156-AG4 (配列番号1456)およびD156-AH1 (配列番号1457)の核酸配列である。
図173-156は、D157-AG4 (配列番号1458), D158-AB8 (配列番号1459), D158-AD5 (配列番号1460), D158-AD6 (配列番号1461)およびD158-AD8 (配列番号1462)の核酸配列である。
図173-157は、D158-AE8 (配列番号1463), D159-AD2 (配列番号1464), D160-AB4 (配列番号1465), D160-AC4 (配列番号1466)およびD160-AE4 (配列番号1467)の核酸配列である。
図173-158は、D160-AF4 (配列番号1468), D160-AH4 (配列番号1469), D161-AE5 (配列番号1470), D161-AH5 (配列番号1471), D164-AB1 (配列番号1472)およびD164-AB3 (配列番号1473)の核酸配列である。
図173-159は、D164-AC1 (配列番号1474), D164-AC2 (配列番号1475), D164-AC5 (配列番号1476), D164-AE1 (配列番号1477)およびD164-AF1 (配列番号1478)の核酸配列である。
図173-160は、D165-AH8 (配列番号1479), D177-BB7 (配列番号1480), D178-AA6 (配列番号1481), D178-AD5 (配列番号1482)およびD180-AA9 (配列番号1483)の核酸配列である。
図173-161は、D181-AB6 (配列番号1484), D181-AC6 (配列番号1485), D181-AD7 (配列番号1486), D181-AG7 (配列番号1487)およびD181-AH6 (配列番号1488)の核酸配列である。
図173-162は、D182-AA1 (配列番号1489), D182-AA2 (配列番号1490), D182-AA4 (配列番号1491), D182-AB2 (配列番号1492)およびD182-AC2 (配列番号1493)の核酸配列である。
図173-163は、D182-AC4 (配列番号1494), D182-AD1 (配列番号1495), D182-AD3 (配列番号1496), D182-AF1 (配列番号1497)およびD182-AF4 (配列番号1498)の核酸配列である。
図173-164は、D182-AG1 (配列番号1499), D183-AC8 (配列番号1500), D185-AB10 (配列番号1501), D185-AC10 (配列番号1502), D185-AF10 (配列番号1503)およびD185-BA1 (配列番号1504)の核酸配列である。
図173-165は、D185-BB3 (配列番号1505), D186-AA3 (配列番号1506), D186-AB4 (配列番号1507), D186-AC2 (配列番号1508), D186-AC3 (配列番号1509)およびD186-AD2 (配列番号1510)の核酸配列である。
図173-166は、D186-AD3 (配列番号1511), D186-AE3 (配列番号1512), D187-AB2 (配列番号1513), D187-AB3 (配列番号1514), D187-AC4 (配列番号1515), D187-AE4 (配列番号1516)およびD187-AF4 (配列番号1517)の核酸配列である。
図173-167は、D187-AG1 (配列番号1518), D187-AG2 (配列番号1519), D187-AG3 (配列番号1520), D187-AH2 (配列番号1521), D184-AA1 (配列番号1522)およびD188-AC7 (配列番号1523)の核酸配列である。
図173-168は、D188-AC8 (配列番号1524), D188-AD8 (配列番号1525), D188-AE8 (配列番号1526), D188-AF6 (配列番号1527), D188-AG5 (配列番号1528)およびD188-AG7 (配列番号1529)の核酸配列である。
図173-169は、D188-AH7 (配列番号1530), D189-AA12 (配列番号1531), D189-AB10 (配列番号1532), D189-AE9 (配列番号1533), D189-AE12 (配列番号1534)およびD189-AF12 (配列番号1535)の核酸配列である。
図173-170は、D189-AG10 (配列番号1536), D190-BA6 (配列番号1537), D190-BD6 (配列番号1538), D190-BF6 (配列番号1539), D190-BG6 (配列番号1540)およびD190-BH6 (配列番号1541)の核酸配列である。
図173-171は、D191-BC5 (配列番号1542), D191-BD5 (配列番号1543), D191-BF5 (配列番号1544), D191-BG5 (配列番号1545)およびD194-AA1 (配列番号1546)の核酸配列である。
図173-172は、D194-AA2 (配列番号1547), D194-AB1 (配列番号1548), D194-AB2 (配列番号1549), D194-AC1 (配列番号1550)およびD194-AC2 (配列番号1551)の核酸配列である。
図173-173は、D194-AD1 (配列番号1552), D194-AD2 (配列番号1553), D194-AD3 (配列番号1554), D194-AE1 (配列番号1555)およびD194-AE2 (配列番号1556)の核酸配列である。
図173-174は、D194-AE3 (配列番号1557), D194-AF1 (配列番号1558), D194-AF2 (配列番号1559), D194-AG2 (配列番号1560)およびD194-AG3 (配列番号1561)の核酸配列である。
図173-175は、D194-AH1 (配列番号1562), D194-AH2 (配列番号1563), D194-AH3 (配列番号1564), D195-AB6 (配列番号1565), D195-AD5 (配列番号1566)およびD195-AE4 (配列番号1567)の核酸配列である。
図173-176は、D195-AE5 (配列番号1568), D195-AG5 (配列番号1569), D195-AH5 (配列番号1570), D196-AD7 (配列番号1571)およびD196-AF7 (配列番号1572)の核酸配列である。
図173-177は、D196-AG7 (配列番号1573), D197-AE8 (配列番号1574), D198-AB9 (配列番号1575), D198-AC9 (配列番号1576)およびD198-AF9 (配列番号1577)の核酸配列である。
図173-178は、D199-AA10 (配列番号1578), D199-AB10 (配列番号1579), D199-AD10 (配列番号1580), D199-AF10 (配列番号1581)およびD199-AG10 (配列番号1582)の核酸配列である。
図173-179は、D200-AB11 (配列番号1583), D200-AC11 (配列番号1584), D200-AD11 (配列番号1585), D200-AE11 (配列番号1586)およびD200-AG11 (配列番号1587)の核酸配列である。
図173-180は、D200-AH11 (配列番号1588), D201-AD12 (配列番号1589), D201-AE12 (配列番号1590), D201-AF12 (配列番号1591), D201-AG12 (配列番号1592)およびD203-BE11 (配列番号1593)の核酸配列である。
図173-181は、D203-BF11 (配列番号1594), D204-AA1 (配列番号1595), D204-AA2 (配列番号1596), D204-AA4 (配列番号1597)およびD204-AB1 (配列番号1598)の核酸配列である。
図173-182は、D204-AB3 (配列番号1599), D204-AC1 (配列番号1600), D204-AC2 (配列番号1601), D204-AC4 (配列番号1602)およびD204-AD1 (配列番号1603)の核酸配列である。
図173-183は、D204-AD2 (配列番号1604), D204-AD3 (配列番号1605), D204-AD4 (配列番号1606), D204-AE3 (配列番号1607)およびD204-AE4 (配列番号1608)の核酸配列である。
図173-184は、D204-AF1 (配列番号1609), D204-AF3 (配列番号1610), D204-AF4 (配列番号1611), D204-AG1 (配列番号1612)およびD204-AG2 (配列番号1613)の核酸配列である。
図173-185は、D204-AG3 (配列番号1614), D203-BA11 (配列番号1615), D204-AG4 (配列番号1616), D204-AH2 (配列番号1617)およびD204-AH1 (配列番号1618)の核酸配列である。
図173-186は、D204-AH3 (配列番号1619), D205-BC9 (配列番号1620), D205-BD9 (配列番号1621), D206-CB3 (配列番号1622), D206-CE3 (配列番号1623)およびD206-CF3 (配列番号1624)の核酸配列である。
図173-187は、D206-CG1 (配列番号1625), D206-CH1 (配列番号1626), D210-BF4 (配列番号1627)およびD210-BF6 (配列番号1628)の核酸配列である。
図173-188は、D210-BH6 (配列番号1629), D211-BA9 (配列番号1630), D211-BB8 (配列番号1631), D211-BB9 (配列番号1632), D211-BC9 (配列番号1633)およびD211-BD8 (配列番号1634)の核酸配列である。
図173-189は、D211-BD9 (配列番号1635), D211-BE7 (配列番号1636), D211-BE8 (配列番号1637)およびD211-BF8 (配列番号1638)の核酸配列である。
図173-190は、D211-BF9 (配列番号1639), D211-BG8 (配列番号1640), D211-BH7 (配列番号1641), D212-BB11 (配列番号1642)およびD212-BB12 (配列番号1643)の核酸配列である。
図173-191は、D212-BD10 (配列番号1644), D212-BD11 (配列番号1645), D212-BE10 (配列番号1646), D212-BE11 (配列番号1647), D212-BF10 (配列番号1648)およびD212-BF11 (配列番号1649)の核酸配列である。
図173-192は、D213-BD1 (配列番号1650), D213-BF2 (配列番号1651), D214-AA1 (配列番号1652), D214-AA3 (配列番号1653)およびD214-AC1 (配列番号1654)の核酸配列である。
図173-193は、D214-AE1 (配列番号1655), D214-AE3 (配列番号1656), D214-AG1 (配列番号1657), D214-AH2 (配列番号1658)およびD214-AH3 (配列番号1659)の核酸配列である。
図173-194は、D216-AB7 (配列番号1660), D216-AC8 (配列番号1661), D216-AH9 (配列番号1662), D219-BA1 (配列番号1663), D219-BB1 (配列番号1664)およびD219-BB2 (配列番号1665)の核酸配列である。
図173-195は、D219-BC1 (配列番号1666), D219-BD1 (配列番号1667), D219-BD2 (配列番号1668), D219-BE1 (配列番号1669), D219-BE2 (配列番号1670)およびD219-BF2 (配列番号1671)の核酸配列である。
図173-196は、D219-BH1 (配列番号1672), D220-BF6 (配列番号1673), D220-BD6 (配列番号1674), D223-BC11 (配列番号1675)およびD221-BC7 (配列番号1676)の核酸配列である。
図173-197は、D227-AE3 (配列番号1677), D223-BB10 (配列番号1678), D221-BF9 (配列番号1679), D229-AD2 (配列番号1680), D229-AE2 (配列番号1681), D229-AF2 (配列番号1682)およびD229-AG1 (配列番号1683)の核酸配列である。
図173-198は、D229-AH1 (配列番号1684), D230-AB1 (配列番号1685), D230-AC1 (配列番号1686), D230-AC2 (配列番号1687), D230-AF2 (配列番号1688)およびD230-AG1 (配列番号1689)の核酸配列である。
図173-199は、D230-AG2 (配列番号1690), D231-AA1 (配列番号1691), D231-AA2 (配列番号1692), D231-AA3 (配列番号1693), D231-AC1 (配列番号1694)およびD231-AC2 (配列番号1695)の核酸配列である。
図173-200は、D231-AD2 (配列番号1696), D231-AE1 (配列番号1697), D231-AG2 (配列番号1698), D231-AH1 (配列番号1699), D231-AH2 (配列番号1700)およびD231-AH3 (配列番号1701)の核酸配列である。
図173-201は、D232-AD4 (配列番号1702), D232-AE5 (配列番号1703), D232-AE6 (配列番号1704)およびD232-AF5 (配列番号1705)の核酸配列である。
図173-202は、D233-AA7 (配列番号1706), D233-AA8 (配列番号1707), D233-AB7 (配列番号1708), D233-AC7 (配列番号1709)およびD233-AC8 (配列番号1710)の核酸配列である。
図173-203は、D233-AH9 (配列番号1711), D234-AA11 (配列番号1712), D234-AC11 (配列番号1713), D234-AD11 (配列番号1714), D238-AA2 (配列番号1715)およびD239-BC3 (配列番号1716)の核酸配列である。
図173-204は、D239-BD4 (配列番号1717), D239-BD6 (配列番号1718), D239-BE4 (配列番号1719), D240-BB7 (配列番号1720)およびD241-BC9 (配列番号1721)の核酸配列である。
図173-205は、D241-BE9 (配列番号1722), D242-BA11 (配列番号1723), D242-BB11 (配列番号1724), D242-BB12 (配列番号1725), D242-BC12 (配列番号1726)およびD242-BF12 (配列番号1727)の核酸配列である。
図173-206は、D242-BG12 (配列番号1728), D242-BH11 (配列番号1729), D244-AA5 (配列番号1730), D244-AA6 (配列番号1731), D244-AF6 (配列番号1732)およびD245-AE7 (配列番号1733)の核酸配列である。
図173-207は、D245-AE8 (配列番号1734), D245-AF7 (配列番号1735), D246-AA12 (配列番号1736), D248-AG4 (配列番号1737)およびD249-AG9 (配列番号1738)の核酸配列である。
図173-208は、D250-AE10 (配列番号1739), D251-AF2 (配列番号1740), D251-AG2 (配列番号1741), D252-AA5 (配列番号1742)およびD252-AB5 (配列番号1743)の核酸配列である。
図173-209は、D252-AC5 (配列番号1744), D252-AD5 (配列番号1745), D252-AF4 (配列番号1746), D252-AF5 (配列番号1747), D252-AG5 (配列番号1748)およびD254-AE2 (配列番号1749)の核酸配列である。
図173-210は、D254-AG2 (配列番号1750), D255-AA5 (配列番号1751), D255-AA6 (配列番号1752), D255-AD5 (配列番号1753)およびD255-AD6 (配列番号1754)の核酸配列である。
図173-211は、D255-AF5 (配列番号1755), D255-AG5 (配列番号1756), D256-AA10 (配列番号1757)およびD256-AB10 (配列番号1758)の核酸配列である。
図173-212は、D256-AC10 (配列番号1759), D256-AE10 (配列番号1760), D256-AF9 (配列番号1761), D256-AF10 (配列番号1762)およびD256-AG10 (配列番号1763)の核酸配列である。
図173-213は、D256-AH10 (配列番号1764), D258-AC5 (配列番号1765), D263-AE12 (配列番号1766), D263-AF12 (配列番号1767)およびD263-AH12 (配列番号1768)の核酸配列である。
図173-214は、D264-AA1 (配列番号1769), D264-AA2 (配列番号1770), D264-AA3 (配列番号1771), D264-AB2 (配列番号1772)およびD264-AC3 (配列番号1773)の核酸配列である。
図173-215は、D264-AD3 (配列番号1774), D264-AE1 (配列番号1775), D264-AE2 (配列番号1776)およびD264-AE3 (配列番号1777)の核酸配列である。
図173-216は、D264-AF2 (配列番号1778), D264-AG2 (配列番号1779), D264-AH2 (配列番号1780)およびD265-AA4 (配列番号1781)の核酸配列である。
図173-217は、D265-AA6 (配列番号1782), D265-AC5 (配列番号1783), D265-AC6 (配列番号1784)およびD265-AD4 (配列番号1785)の核酸配列である。
図173-218は、D265-AD5 (配列番号1786), D266-AB7 (配列番号1787), D266-AB8 (配列番号1788), D266-AC9 (配列番号1789)およびD266-AD7 (配列番号1790)の核酸配列である。
図173-219は、D267-AD10 (配列番号1791), D268-AA2 (配列番号1792), D268-AC3 (配列番号1793), D268-AD1 (配列番号1794)およびD268-AD2 (配列番号1795)の核酸配列である。
図173-220は、D268-AD3 (配列番号1796), D268-AE3 (配列番号1797), D268-AG2 (配列番号1798)およびD268-AG3 (配列番号1799)の核酸配列である。
図173-221は、D269-AA5 (配列番号1800), D269-AD4 (配列番号1801), D269-AE4 (配列番号1802), D269-AF5 (配列番号1803), D269-AF6 (配列番号1804)およびD270-AA8 (配列番号1805)の核酸配列である。
図173-222は、D270-AB9 (配列番号1806), D270-AD8 (配列番号1807), D270-AD9 (配列番号1808), D270-AE9 (配列番号1809)およびD270-AF8 (配列番号1810)の核酸配列である。
図173-223は、D271-AG11 (配列番号1811), D271-AH11 (配列番号1812), D276-AD5 (配列番号1813)およびD276-AG6 (配列番号1814)の核酸配列である。
図173-224は、D276-AH4 (配列番号1815), D276-AH6 (配列番号1816), D277-AE8 (配列番号1817), D277-AF9 (配列番号1818)およびD277-AH9 (配列番号1819)の核酸配列である。
図173-225は、D278-AF10 (配列番号1820), D279-AA3 (配列番号1821), D279-AB2 (配列番号1822), D279-AC1 (配列番号1823)およびD279-AD2 (配列番号1824)の核酸配列である。
図173-226は、D279-AE1 (配列番号1825), D279-AE3 (配列番号1826), D279-AG3 (配列番号1827), D279-BA1 (配列番号1828)およびD279-BA2 (配列番号1829)の核酸配列である。
図173-227は、D279-BB3 (配列番号1830), D279-BC2 (配列番号1831), D279-BD2 (配列番号1832), D279-BE2 (配列番号1833)およびD279-BF3 (配列番号1834)の核酸配列である。
図173-228は、D279-BG1 (配列番号1835), D279-BH3 (配列番号1836), D280-AB5 (配列番号1837), D280-AB6 (配列番号1838)およびD280-AC4 (配列番号1839)の核酸配列である。
図173-229は、D280-AC6 (配列番号1840), D280-AD4 (配列番号1841), D280-AD5 (配列番号1842), D280-AD6 (配列番号1843)およびD280-AE4 (配列番号1844)の核酸配列である。
図173-230は、D280-AE5 (配列番号1845), D280-AE6 (配列番号1846), D280-AF5 (配列番号1847), D280-AF6 (配列番号1848)およびD280-AG4 (配列番号1849)の核酸配列である。
図173-231は、D280-AG5 (配列番号1850), D280-AG6 (配列番号1851), D280-AH4 (配列番号1852), D280-AH5 (配列番号1853)およびD280-BC4 (配列番号1854)の核酸配列である。
図173-232は、D280-BD4 (配列番号1855), D280-BE4 (配列番号1856), D280-BE6 (配列番号1857)およびD280-BF4 (配列番号1858)の核酸配列である。
図173-233は、D280-BG4 (配列番号1859), D280-BH4 (配列番号1860), D280-BH6 (配列番号1861), D281-AA8 (配列番号1862)およびD281-AD7 (配列番号1863)の核酸配列である。
図173-234は、D281-AD8 (配列番号1864), D281-AE7 (配列番号1865), D281-AE8 (配列番号1866), D281-AE9 (配列番号1867), D281-AG7 (配列番号1868)およびD282-AB10 (配列番号1869)の核酸配列である。
図173-235はD282-AB11 (配列番号1870), D282-AD10 (配列番号1871), D282-AH11 (配列番号1872), D282-BA10 (配列番号1873), D282-BB10 (配列番号1874)およびD282-BD10 (配列番号1875)、の核酸配列である。
図173-236は、D288-AB3 (配列番号1876), D289-AA4 (配列番号1877), D289-AA6 (配列番号1878), D289-AB4 (配列番号1879)およびD289-AB6 (配列番号1880)の核酸配列である。
図173-237は、D289-AD4 (配列番号1881), D289-AE4 (配列番号1882), D289-AE6 (配列番号1883), D289-AF4 (配列番号1884)およびD289-AF6 (配列番号1885)の核酸配列である。
図173-238は、D289-AG4 (配列番号1886), D289-AG6 (配列番号1887), D289-AH4 (配列番号1888), D289-AH6 (配列番号1889)およびD290-AA7 (配列番号1890)の核酸配列である。
図173-239は、D290-AA8 (配列番号1891), D290-AA9 (配列番号1892), D290-AB7 (配列番号1893), D290-AB9 (配列番号1894)およびD290-AC8 (配列番号1895)の核酸配列である。
図173-240は、D290-AC9 (配列番号1896), D290-AD7 (配列番号1897), D290-AD8 (配列番号1898), D290-AD9 (配列番号1899)およびD291-AA12 (配列番号1900)の核酸配列である。
図173-241は、D291-AB10 (配列番号1901), D291-AB11 (配列番号1902), D291-AC12 (配列番号1903), D291-AD11 (配列番号1904)およびD291-AD12 (配列番号1905)の核酸配列である。
図173-242は、D291-AE10 (配列番号1906), D291-AE12 (配列番号1907), D291-AF10 (配列番号1908), D291-AF12 (配列番号1909)およびD291-AG11 (配列番号1910)の核酸配列である。
図173-243は、D291-AG12 (配列番号1911), D291-AH11 (配列番号1912), D292-AA2 (配列番号1913), D292-AA3 (配列番号1914), D292-AB2 (配列番号1915)およびD292-AC2 (配列番号1916)の核酸配列である。
図173-244は、D292-AD1 (配列番号1917), D292-AD2 (配列番号1918), D292-AE1 (配列番号1919), D292-AE2 (配列番号1920), D292-AF1 (配列番号1921), D292-AF3 (配列番号1922)およびD292-AH3 (配列番号1923)の核酸配列である。
図173-245は、D291-AA10 (配列番号1924), D294-AB7 (配列番号1925), D294-AB8 (配列番号1926), D294-AB9 (配列番号1927)およびD294-AC7 (配列番号1928)の核酸配列である。
図173-246は、D294-AC8 (配列番号1929), D294-AE9 (配列番号1930), D294-AG8 (配列番号1931), D294-AH7 (配列番号1932)およびD295-AA3 (配列番号1933)の核酸配列である。
図173-247は、D295-AB1 (配列番号1934), D295-AB2 (配列番号1935), D295-AC2 (配列番号1936), D295-AC3 (配列番号1937)およびD295-AD1 (配列番号1938)の核酸配列である。
図173-248は、D295-AD2 (配列番号1939), D295-AE3 (配列番号1940), D295-AF1 (配列番号1941), D295-AF2 (配列番号1942)およびD295-AG3 (配列番号1943)の核酸配列である。
図173-249は、D295-AH1 (配列番号1944), D296-AA6 (配列番号1945), D296-AE5 (配列番号1946), D296-AF5 (配列番号1947)およびD296-AG4 (配列番号1948)の核酸配列である。
図173-250は、D296-AG5 (配列番号1949), D297-AA7 (配列番号1950), D297-AA8 (配列番号1951), D297-AB7 (配列番号1952)およびD297-AE7 (配列番号1953)の核酸配列である。
図173-251は、D297-AF7 (配列番号1954), D298-AA10 (配列番号1955), D298-AB11 (配列番号1956), D298-AF11 (配列番号1957)およびD298-AG12 (配列番号1958)の核酸配列である。
図173-252は、D35-40 (配列番号1959), D35-AC6 (配列番号1960), D35-BB2 (配列番号1961), D55-AB9 (配列番号1962)およびD55-BB1 (配列番号1963)の核酸配列である。
図173-253は、D55-BB2 (配列番号1964), D55-BB3 (配列番号1965), D55-BB7 (配列番号1966), D56-AA1 (配列番号1967), D56-AE4 (配列番号1968)およびD56-AE9 (配列番号1969)の核酸配列である。
図173-254は、D56-AD1 (配列番号1970), D56-AG12 (配列番号1971), D56-AH11 (配列番号1972), D57-AA5 (配列番号1973)およびD57-AA7 (配列番号1974)の核酸配列である。
図173-255は、D57-AB10 (配列番号1975), D57-AC2 (配列番号1976), D57-AC3 (配列番号1977), D57-AC6 (配列番号1978), D57-AC9 (配列番号1979)およびD57-AC11 (配列番号1980)の核酸配列である。
図173-256は、D57-AD3 (配列番号1981), D57-AE4 (配列番号1982), D57-AE6 (配列番号1983), D57-AE9 (配列番号1984)およびD57-AF4 (配列番号1985)の核酸配列である。
図173-257は、D57-AF11 (配列番号1986), D57-AG3 (配列番号1987), D57-AH11 (配列番号1988), D58-AB2 (配列番号1989), D58-AC8 (配列番号1990)およびD58-AG9 (配列番号1991)の核酸配列である。
図173-258は、D58-BA9 (配列番号1992), D58-BB9 (配列番号1993), D58-BC1 (配列番号1994), D58-BC10 (配列番号1995), D58-BC11 (配列番号1996)およびD58-BD4 (配列番号1997)の核酸配列である。
図173-259は、D58-BE8 (配列番号1998), D58-BF4 (配列番号1999), D60-AB4 (配列番号2000), D60-AC4 (配列番号2001), D60-AD11 (配列番号2002)およびD60-AF9 (配列番号2003)の核酸配列である。
図173-260は、D65-AB6 (配列番号2004), D65-AC3 (配列番号2005), D65-AC9 (配列番号2006), D65-AC12 (配列番号2007), D65-AE3 (配列番号2008)およびD65-AG1 (配列番号2009)の核酸配列である。
図173-261は、D65-CE10 (配列番号2010), D65-CE11 (配列番号2011), D65-CF11 (配列番号2012), D65-CH5 (配列番号2013), D66-AA1 (配列番号2014)およびD66-AA3 (配列番号2015)の核酸配列である。
図173-262は、D66-AE5 (配列番号2016), D66-AF1 (配列番号2017), D66-AG2 (配列番号2018), D66-AG6 (配列番号2019)およびD66-AH3 (配列番号2020)の核酸配列である。
図173-263は、D66-BA11 (配列番号2021), D66-BD6 (配列番号2022), D66-BD8 (配列番号2023), D67-AA5 (配列番号2024), D67-AD3 (配列番号2025)およびD67-AE1 (配列番号2026)の核酸配列である。
図173-264は、D67-AE4 (配列番号2027), D67-AG4 (配列番号2028), D68-AF3 (配列番号2029), D70A-AE1 (配列番号2030), D70A-AG7 (配列番号2031)およびD70A-BC6 (配列番号2032)の核酸配列である。
図173-265は、D70A-BF7 (配列番号2033), D70A-BF8 (配列番号2034), D70A-BH1 (配列番号2035), D70A-BH3 (配列番号2036)およびD73A-AA1 (配列番号2037)の核酸配列である。
図173-266は、D73A-AA3 (配列番号2038), D73A-AA5 (配列番号2039), D73A-AA6 (配列番号2040), D73A-AA8 (配列番号2041), D73A-AA9 (配列番号2042)およびD73A-AB1 (配列番号2043)の核酸配列である。
図173-267は、D73A-AB3 (配列番号2044), D73A-AB5 (配列番号2045), D73A-AB10 (配列番号2046), D73A-AC2 (配列番号2047)およびD73A-AC5 (配列番号2048)の核酸配列である。
図173-268は、D73A-AC11 (配列番号2049), D73A-AC12 (配列番号2050), D73A-AD7 (配列番号2051), D73A-AD10 (配列番号2052), D73A-AE6 (配列番号2053)およびD73A-AE7 (配列番号2054)の核酸配列である。
図173-269は、D73A-AE8 (配列番号2055), D73A-AE12 (配列番号2056), D73A-AF5 (配列番号2057), D73A-AF6 (配列番号2058), D73A-AF12 (配列番号2059)およびD73A-AG4 (配列番号2060)の核酸配列である。
図173-270は、D73A-AG6 (配列番号2061), D73A-AG10 (配列番号2062), D73A-AH2 (配列番号2063), D73A-AH3 (配列番号2064)およびD73A-AH10 (配列番号2065)の核酸配列である。
図173-271は、D93-AD3 (配列番号2066), D97-AD3 (配列番号2067), D97-AE3 (配列番号2068), D97-AF1 (配列番号2069)およびD113-AH8 (配列番号2070)の核酸配列である。
図173-272は、D114-AA10 (配列番号2071), D114-AC11 (配列番号2072), D131-AD1 (配列番号2073), D133-AD7 (配列番号2074)およびD139-AD2 (配列番号2075)の核酸配列である。
図173-273は、D139-AF2 (配列番号2076), D144A-AB10 (配列番号2077), D144A-AE9 (配列番号2078), D144A-AG12 (配列番号2079), D145-AC7 (配列番号2080)およびD145-AH7 (配列番号2081)の核酸配列である。
図173-274は、D150-AA3 (配列番号2082), D150-AG3 (配列番号2083), D151-AG3 (配列番号2084), D153-AA8 (配列番号2085), D153-AB7 (配列番号2086)およびD153-AC9 (配列番号2087)の核酸配列である。
図173-275は、D153-AF8 (配列番号2088), D155-AA2 (配列番号2089), D155-AG2 (配列番号2090), D156-AH3 (配列番号2091), D159-AA2 (配列番号2092)およびD164-AD1 (配列番号2093)の核酸配列である。
図173-276は、D181-AG6 (配列番号2094), D182-AB1 (配列番号2095), D182-AF2 (配列番号2096), D185-AE10 (配列番号2097), D186-AH3 (配列番号2098)およびD188-AC6 (配列番号2099)の核酸配列である。
図173-277は、D188-AF5 (配列番号2100), D189-AD12 (配列番号2101), D258-AG6 (配列番号2102), D194-AA3 (配列番号2103), D194-AB3 (配列番号2104), D198-AD9 (配列番号2105)およびD198-AE9 (配列番号2106)の核酸配列である。
図173-278は、D203-BB11 (配列番号2107), D203-BC11 (配列番号2108), D204-AA3 (配列番号2109), D204-AF2 (配列番号2110), D206-CB1 (配列番号2111)およびD214-AB1 (配列番号2112)の核酸配列である。
図173-279は、D214-AF2 (配列番号2113), D216-AA7 (配列番号2114), D216-AD7 (配列番号2115), D219-BA2 (配列番号2116), D219-BF1 (配列番号2117)およびD229-AB2 (配列番号2118)の核酸配列である。
図173-280は、D230-AD2 (配列番号2119), D230-AE2 (配列番号2120), D234-AE12 (配列番号2121), D241-BG10 (配列番号2122), D249-AA9 (配列番号2123)およびD255-AC5 (配列番号2124)の核酸配列である。
図173-281は、D270-AE7 (配列番号2125), D270-AE8 (配列番号2126), D276-AH5 (配列番号2127), D279-AA2 (配列番号2128)およびD279-AB3 (配列番号2129)の核酸配列である。
図173-282は、D279-AC2 (配列番号2130), D279-AC3 (配列番号2131), D279-AD3 (配列番号2132)およびD279-AE2 (配列番号2133)の核酸配列である。
図173-283は、D279-AG2 (配列番号2134), D279-AH3 (配列番号2135), D280-BF6 (配列番号2136), D281-AB8 (配列番号2137)およびD281-AC7 (配列番号2138)の核酸配列である。
図173-284は、D282-AG10 (配列番号2139), D288-AC2 (配列番号2140), D289-AC6 (配列番号2141), D290-AB8 (配列番号2142)およびD291-AD10 (配列番号2143)の核酸配列である。
図173-285は、D291-AE11 (配列番号2144), D291-AH12 (配列番号2145), D292-AB3 (配列番号2146), D292-AD3 (配列番号2147), D292-AE3 (配列番号2148)およびD294-AE7 (配列番号2149)の核酸配列である。
図173-286は、D419-AH11 (配列番号2150), D295-AE2 (配列番号2151), D295-AG2 (配列番号2152), D295-AH2 (配列番号2153), D295-AH3 (配列番号2154)およびD296-AD4 (配列番号2155)の核酸配列である。
図173-287は、D296-AF4 (配列番号2156), D296-AG6 (配列番号2157), D297-AD7 (配列番号2158), D297-AG7 (配列番号2159)およびD298-AD11 (配列番号2160)の核酸配列である。
図173-288は、D418-AH9 (配列番号2161), D418-AG10 (配列番号2162), D416-AA6 (配列番号2163), D414-AA2 (配列番号2164)およびD269-AD5 (配列番号2165)の核酸配列である。
図173-289は、D268-AE1 (配列番号2166), D258-AF6 (配列番号2167), D256-AG9 (配列番号2168), D255-AH6 (配列番号2169)およびD255-AE5 (配列番号2170)の核酸配列である。
図173-290は、D419-AE11 (配列番号2171), D142-AA10 (配列番号2172), D140-AH4 (配列番号2173), D66-AF7 (配列番号2174)およびD66-AA7 (配列番号2175)の核酸配列である。
図173-291は、D65-AF9 (配列番号2176), D65-AB3 (配列番号2177), D65-AB2 (配列番号2178), D144A-AA12 (配列番号2179)およびD64-7 (配列番号2180)の核酸配列である。
図173-292は、D109-BF9 (配列番号2181), D109-BG9 (配列番号2182), D118-AA11 (配列番号2183), D142-AB11(5’) (配列番号2184)およびD142-AE10(5’) (配列番号2185)の核酸配列である。
図173-293は、D207-AH5 (配列番号2186), D231-AA1(5’) (配列番号2187), D232-AD4(5’) (配列番号2188), D232-AE6(5’) (配列番号2189)およびD288-AA3 (配列番号2190)の核酸配列である。
図173-294は、D289-AE6 (配列番号2191), D290-AC7 (配列番号2192), D58-AA2 (配列番号2193)の核酸配列である。
詳細な説明
伝統的には、いずれかの新規の望ましい植物生殖質の開発は多数の段階を含むものであった。植物育種は、現在の生殖質の問題および弱点の分析および明確化、計画目標の確立ならびに特定の育種対象の明確化から開始される。次の段階は、計画目標に合致した形質を有する生殖質の選択である。該目標は、親生殖質からの望ましい形質の、改良された組合せを、単一の品種において組合せることである。望ましい形質には、例えば、より高い種収量、耐病性、耐虫性、干ばつおよび熱に対する耐性、ならびにより良好な農学的品質が含まれる。しかし、販売および流通の最終段階につながるこれらの過程には、最初の交配を行ってから6〜12年間を要しうる。したがって、新規品種の開発は、厳密な将来的計画、資源の効率的利用および最低限の方針変更を要する、時間のかかるプロセスである。
現代の植物育種には遺伝的形質転換による植物品種の改良が益々重要になっている。商業的な関心が持たれうる遺伝子、例えば、耐病性、耐虫性または品質改良の特定の望ましい植物形質を付与する遺伝子が、種々の遺伝子導入技術により作物種に組込まれうる。遺伝子発現を操作しうることは、形質転換植物における新規特性を得るための手段を提供する。いくつかの場合には、高い又は上昇したレベルの遺伝子発現が望ましいであろう。例えば、それ自体が耐病性、収量、香味または任意の他の商業的に望ましい植物属性を最大にするタンパク質の産生を増強することが望ましい。同様に、例えば遺伝子サイレンシングによる内因性遺伝子発現の調節は、より貴重な植物または植物製品を与えうる。
タバコの熟成または乾燥(キュアリング)中に、エチレン誘導性または老化関連遺伝子であると特定された遺伝子(例えば、配列番号4、40、44、52、54、60、70、104、138、140、158、162、188、212、226、234および288の配列を有するもの)のいずれかの活性化、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、最終産物の品質特性(例えば、耐病性、耐虫性、品質の改良、香りの修飾、香味の修飾など)に影響を及ぼすテルペノイド、ポリフェノール、アルカロイドなどを含む多数の二次代謝産物の形成に関与するそれらの代謝経路に影響を及ぼしうる。本明細書中に特定されている遺伝子により同様に影響を受けるものとしては、老化過程で蓄積する乾物の率およびタイプまたは老化過程の植物内の乾物の分配に関連した代謝経路が挙げられうる。デンプン蓄積、リグニン形成、セルロース析出および糖輸送の率およびタイプにおける変化が示されうるであろう。本明細書中に特定されている遺伝子の制御は、老化速度、葉内および単一植物の葉間の老化の均一性ならびに人工的または自然手段による老化の誘導の決定に関与するそれらの代謝経路にも影響を及ぼしうる。本明細書中に特定されている遺伝子を刺激または活性化する老化誘導性物質または作用因子には、例えば、化学物質、例えば薄い過酸化物、殺虫剤、除草剤、成長調節物質、熱処理、創傷、またはガス、例えばオゾン、および二酸化炭素の濃度上昇が含まれる。
タバコの構成的に発現される又はエチレンもしくは老化により誘導される配列の特定
本発明においては、変換体(converter)および非変換体Nicotiana系統のNicotiana組織からRNAを抽出した。ついで、抽出されたRNAをcDNAの作製に使用した。ついで本発明の核酸配列を、2つの方法を用いて作製した。
第1の方法においては、ポリA富化RNAを植物組織から抽出し、cDNAを逆転写PCRにより作製した。ついで該一本鎖cDNAを使用して、縮重プライマーおよびオリゴd(T)プライマーを用いてp450特異的PCR集団を得た。該プライマー設計は、他の植物のp450遺伝子配列の高度に保存されたモチーフに基づくものであった。特異的縮重プライマーの具体例は特許出願公開US 2004/0111759 A1、US 2004/0117869 A1およびUS 2004/0103449 A1の図1に記載されている(該特許出願公開を参照により本明細書に組み入れることとする)。適当なサイズのインサートを含有するプラスミドからの断片の配列を更に分析した。これらのインサートのサイズは、典型的には、使用するプライマーに応じて約300〜約800ヌクレオチドの範囲である。
第2の方法においては、まず、cDNAライブラリーを構築した。該プラスミド内のcDNAを使用して、縮重プライマーおよびT7プライマーを用いてp450特異的PCR集団を得た。第1の方法の場合と同様に、適当なサイズのインサートを含有するプラスミドからの断片の配列を更に分析した。
高レベルのノルニコチンを産生することが知られているNicotiana植物系統(変換体(converter))および低レベルのノルニコチンを有する植物系統を出発材料として使用することが可能である。ついで葉を植物から摘出し、エチレンで処理して、本明細書で定義されているp450酵素活性を活性化することが可能である。当技術分野で公知の技術を用いて、全RNAを抽出する。ついで、図161に記載のとおりのオリゴd(T)プライマー(配列番号2260)と共にPCR(RT-PCR)を用いて、cDNA断片を作製することが可能である。ついで、本明細書中の実施例に更に詳しく記載されているとおり、cDNAライブラリーを構築することが可能である。
p450型酵素の保存領域を縮重プライマーの鋳型として使用した。それらの具体例を図161に示す。縮重プライマーを使用して、p450特異的バンドをPCRにより増幅した。p450様酵素を示すバンドをDNA配列決定により特定した。BLAST検索、アライメントまたは適当な候補を特定するための他の手段を用いて、PCR断片を特徴づけした。
特定された断片からの配列情報を用いて、PCRプライマーを作製した。cDNAライブラリ−内のプラスミドプライマーと組合されたこれらのプライマーを使用して、完全長p450遺伝子をクローニングした。得られたすべての断片クローンおよびいくつかの場合には完全長クローンに関する示差的発現を調べるために、ラージスケールサザン逆分析を行った。本発明のこの態様においては、すべてのクローン化インサートをスクリーニングするために、クローン化DNA断片にハイブリダイズするプローブとして、種々の組織からの標識された全cDNAを使用して、これらのラージスケールリバースサザンアッセイを行うことが可能である。クローン化p450断片および完全長クローンを特徴づけるために、非放射性および放射性(P32)ノーザンブロットアッセイも用いた。
所望のレベルのp450酵素を発現する植物細胞が得られたら、当技術分野でよく知られた方法および技術を用いて該細胞から植物組織および全植物を再生させることが可能である。ついで該再生植物を通常の手段により再生させ、通常の植物育種技術を用いて該導入遺伝子を他の株および栽培品種に導入することが可能である。
エチレン誘導性または老化関連遺伝子、例えば、配列番号4、40、44、52、54、60、70、104、138、140、158、162、188、212、226、234および288において特定されているものは、種々のタバコ製品にとって重要なタバコ葉の品質パラメーターの重要な決定因子である酵素をコードしうる。該タバコ製品には、湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコ、ビーディ(bidi)および同様の喫煙製品が含まれる。葉の品質パラメーターには、視覚的属性、例えば色、表面規則性、テクスチャーまたは斑入りにより示される構造的または物理的特性;葉身:中骨の比、油性度(oiliness)、巻きタバコ充填能、かさ密度、水分保持能および柔軟性;香味、芳香、発酵能、枯上がり(burn)速度、枯上がり(burn)温度、人工香味剤の吸収および放出に関連した化学的または生化学的形質;ならびにタールまたは粒状物、アルカロイドおよび他の属性を含むタバコ成分の生成が含まれうる。これらのエチレン誘導性または老化関連遺伝子から生じる酵素反応は、タバコ葉の収量および品質に影響を及ぼす病原体または昆虫相互作用に影響を及ぼす二次代謝産物をも産生しうる。例えば、Wagnerら(Nature Biotechnology, 19:371-374, 2001)は、p450ヒドロキシラーゼ遺伝子の抑制が、アブラムシ耐性に影響を及ぼす二次代謝産物であるセムブラチエン-オール(cembratiene-ol)の蓄積を著しく増強することを示した。
抗体の生成
ペプチドのアミノ酸配列を誘導し、他のクローンとの対比において特有であり抗原性であるペプチド領域を選択することにより、ペプチド特異的抗体を製造した。担体タンパク質に結合した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を産生させた。これらの抗体を使用して、植物組織に関してウエスタンブロット分析または他の免疫学的方法を行った。また、ペプチドのアミノ酸配列を誘導し、他のクローンとの対比において特有であり潜在的に抗原性であるペプチド領域を選択することにより、いくつかの完全長クローンに関して、ペプチド特異的抗体を製造した。担体タンパク質に結合した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を産生させた。これらの抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を行った。
遺伝子発現のダウンレギュレーションおよび酵素活性の改変
ポリペプチドの発現の低下を伴う植物を、標準的な遺伝子サイレンシング法(総説としては、Arndt and Rank, Genome 40:785-797, 1997; TurnerおよびSchuch, Journal of Chemical Technology and Biotechnology 75:869-882, 2000; ならびにKlinkおよびWolniak, Journal of Plant Growth Regulation 19(4):371-384, 2000を参照されたい)により作製した。特に、タバコニコチンデメチラーゼ核酸配列(例えば、配列番号4、5、7、8および9、またはそれらの断片、例えば配列番号1および62の配列)および実質的に同一な核酸配列(例えば、配列番号188の配列)を使用して、任意のNicotiana種におけるタバコ表現型またはタバコ代謝産物、例えばノルニコチンを改変することが可能である。タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子の発現の低下は、例えばRNA干渉(RNAi)(Smithら, Nature 407:319-320, 2000; Fireら, Nature 391:306-311, 1998; Waterhouseら, PNAS 95:13959-13964, 1998; Stalbergら, Plant Molecular Biology 23:671-683, 1993; Brignettiら, EMBO J. 17:6739-6746, 1998; Allenら, Nature Biotechnology 22: 1559-1566, 2004);ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング(「VIGS」)(Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology, 2:109-113, 1999; Cogoni and Macino, Genes Dev 10: 638-643, 2000; Ngelbrechtら, PNAS 91:10502-10506, 1994);センス配向で植物内因性遺伝子を導入することによる標的遺伝子のサイレンシング(Jorgensenら, Plant Mol Biol 31: 957-973, 1996);アンチセンス遺伝子の発現;相同組換え(Ohlら, Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, 1994);Cre /lox(Qinら, PNAS 91: 1706-1710, 1994; Koshinskyら, The Plant Journal 23: 715-722, 2000; Chouら, Plant and Animal Genome VII Conference Abstracts. San Diego, CA, 17-21 January, 1999);遺伝子トラップおよびT-DNAタギング(Burnsら, Genes Dev. 8: 1087-1105, 1994; Spradlingら, PNAS 92:10824-10830, 1995; Skarnesら, Bio/Technology 8, 827-831, 1990; Sundaresanら, Genes Dev. 9: 1797-1810, 1995);ならびにタバコポリペプチドの発現のダウンレギュレーションまたはその酵素活性の低下を引き起こす、科学分野において利用可能なその他の可能な遺伝子サイレンシング系のいずれかを用いて達成されうる。本明細書中で更に詳しく説明するとおり、本明細書中に記載の核酸配列のいずれかは、本明細書に記載の技術および当技術分野において見出される他の技術を用いてダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションされうる。典型的な方法を以下に更に詳しく説明する。
RNA干渉
RNA干渉(「RNAi」)は、植物などの多数の生物における強力かつ特異的な翻訳後遺伝子サイレンシングを誘導するために一般に適用可能な方法である(例えば、Bosherら, Nat. Cell Biol. 2:E31-36, 2000; およびTavernarakisら, Nat. Genetics 24:180-183, 2000を参照されたい)。RNAiは、細胞内または細胞外環境内への、部分的または完全な二本鎖特性を伴うRNAの導入を含む。抑制性RNAを産生するよう標的遺伝子(例えば、タバコニコチンデメチラーゼ)の部分からのヌクレオチド配列が選択される点で、抑制は特異的である。選択された部分は一般には標的遺伝子のエキソンを含むが、選択された部分は非翻訳領域(UTR)およびイントロン(例えば、配列番号7の配列、または所望の植物遺伝子からの核酸配列、例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列)をも含みうる。
例えば、二本鎖形成能を有するRNAを産生する形質転換ベクターを構築するためには、2つの核酸配列(一方はセンス配向、もう一方はアンチセンス配向)を、機能しうる形で連結し、強力なウイルスプロモーター、例えばCaMV 35Sまたはキャッサバ・ブラウン・ストリーク・ウイルス(cassava brown streak virus)(CBSV)から単離されたプロモーターの制御下に配置することが可能である。しかし、内因性プロモーター、例えば配列番号8の配列を有するニコチンデメチラーゼプロモーター、または転写を駆動するその断片の使用も望ましいであろう。そのような構築物中に含まれるタバコニコチンデメチラーゼ核酸配列の長さは、望ましくは、少なくとも25ヌクレオチドであるが、完全長までのタバコニコチンデメチラーゼを含む配列を含みうる。
二本鎖形成能を有するRNAを産生する構築物は、アグロバクテリウムに媒介される形質転換(Chuangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990, 2000)により、植物(例えば、タバコ植物)のゲノム内に導入されて、タバコニコチンデメチラーゼにおける特異的かつ遺伝可能な遺伝的干渉を引き起こしうる。該二本鎖RNAは細胞の中へ(すなわち、細胞内に)直接的に導入されることも可能であり、あるいは細胞外において、例えば、該二本鎖RNAを含有する溶液に種子、実生または植物を浸けることにより導入されうる。
運搬された二本鎖RNA物質の量に応じて、RNAiは、標的遺伝子に関する機能の部分的または完全な喪失をもたらしうる。標的細胞の少なくとも99%における遺伝子発現の低下または喪失が得られうる。一般には、より低い量の注入物質、およびdsRNAの投与後の、より長い時間が、細胞の、より小さな割合における抑制を引き起こす。
RNAiにおいて使用するRNAは重合リボヌクレオチドの1以上の鎖を含むことが可能であり、それは、リン酸-糖バックボーンまたはヌクレオシドに対する修飾を含みうる。該二本鎖構造は、単一の自己相補的RNA鎖により又は2つの相補的RNA鎖により形成されることが可能であり、RNA二本鎖形成は細胞の内部または外部で開始されうる。該RNAは、少なくとも1コピー/細胞の運搬を可能にする量で導入されうる。しかし、より多い量(例えば、少なくとも5、10、100、500または1000コピー/細胞)の二本鎖物質は、より効率的な抑制をもたらしうる。該RNAの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝的抑制のために標的化される点で、抑制は配列特異的である。抑制のためには、標的遺伝子の部分と同一のヌクレオチド配列を含有するRNAが好ましい。標的配列と比較した場合に挿入、欠失および単点変異を有するRNA配列も抑制に有効でありうる。例えば、配列同一性は、当技術分野で公知のアライメントアルゴリズムおよび該ヌクレオチド配列間の差(%)の算出により最適化されうる。あるいは、該RNAの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の一部にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列として機能的に定められうる。
また、RNAiに使用されるRNAはin vivoまたはin vitroで合成されうる。例えば、該細胞内の内因性RNAポリメラーゼはin vivoでの転写をもたらすことが可能であり、あるいはクローン化RNAポリメラーゼはin vivoまたはin vitroでの転写に使用されうる。in vivoでのトランスジーンまたは発現構築物からの転写のためには、RNA鎖を転写させるために調節領域が使用されうる。
三本鎖干渉
タバコ遺伝子の調節領域(例えば、プロモーターまたはエンハンサー領域)に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞内での該タバコ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることによっても、内因性タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子発現、または所望の植物遺伝子からの核酸断片(例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列)の発現がダウンレギュレーションされうる(全般的には、Helene, Anticancer Drug Des. 6:569-584, 1991; Heleneら, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36, 1992; およびMaher, Bioassays 14:807-815, 1992)。
転写の抑制のための三重らせんの形成において使用される核酸分子は、好ましくは、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般には相当な大きさのプリンまたはピリミジン伸長が二重らせんの一方の鎖上に存在することを要するフーグスティーン型塩基対形成則による三重らせん形成の促進をもたらすはずである。ヌクレオチド配列はピリミジンに基づくものでありうる。これは、生じる三重らせんの3本の会合鎖を横切るTATおよびCGCトリプレットを与えるであろう。ピリミジンに富む(ピリミジンリッチ)分子は、二重らせんの一本鎖のプリンリッチ領域に対する塩基相補性を、その鎖に対して平行配向で与える。また、プリンリッチ(例えば、G残基の伸長を含有する)核酸分子が選択されうる。これらの分子は、GC対に富むDNA二重らせんと共に三重らせんを形成し、この場合、該プリン残基の大多数は標的二重らせんの一本鎖上に位置して、三重らせん内の三本鎖を横切るCGCトリプレットを与える。
あるいは、三重らせん形成のために標的化されうる潜在的配列を、「スイッチバック(switchback)」核酸分子を生成させることにより増加させることが可能である。スイッチバック分子は、交互の5'-3'、3'-5'様態で合成される。これにより、それらは、二重らせんの最初の1つの鎖と塩基対形成し、ついで他方と塩基対形成して、二重らせんの一方の鎖上の相当な大きさのプリンまたはピリミジン伸長の存在の必要性を排除する。
リボザイム
リボザイムは、酵素として作用するRNA分子であり、他のRNA分子を切断するよう設計されうる。リボザイムは、実質的に任意の標的RNAと特異的に対形成しホスホジエステルバックボーンを特定の位置で切断して標的RNAを機能的に不活性化するよう設計されうる。この過程においてはリボザイム自体は消費されず、複数のコピーのmRNA標的分子を切断するよう触媒的に作用しうる。したがって、リボザイムは、タバコニコチンデメチラーゼの発現をダウンレギュレーションするための手段としても使用されうる。標的RNA特異的リボザイムの設計および使用はHaseloffら(Nature 334:585-591, 1988)に記載されている。好ましくは、リボザイムは、該リボザイムの活性部位の両側に、標的配列(例えば、タバコニコチンデメチラーゼ、または所望の植物遺伝子からの核酸断片、例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列)に相補的な少なくとも20個の連続的ヌクレオチドを含む。
また、RNA切断活性をアンチセンスRNAに付与して該アンチセンス構築物の有効性を増強するために、リボザイム配列をアンチセンスRNA内に含有させることも可能である。
相同組換え
遺伝子置換技術は、与えられた遺伝子の発現をダウンレギュレーションするためのもう1つの望ましい方法である。遺伝子置換技術は相同組換えに基づくものである(Schnableら, Curr. Opinions Plant Biol. 1:123-129, 1998)。関心のある酵素(例えば、タバコニコチンデメチラーゼ、または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列によりコードされるポリペプチド)の核酸配列を、酵素機能を低下させるために変異誘発(例えば、挿入、欠失、重複または置換)により操作することが可能である。ついで、改変された配列をゲノム内に導入して、相同組換えにより既存遺伝子(例えば、野生型遺伝子)を該配列で置換することが可能である(Puchtaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-5060, 1996; およびKempinら, Nature 389: 802-803, 1997)。あるいは、内因性タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子は、デメチラーゼ活性を有さない遺伝子(例えば、配列番号188の配列)で置換されうる。
共抑制
遺伝子発現のサイレンシングのためのもう1つの望ましい方法は共抑制(co-suppression)(センス抑制とも称される)である。この技術は、センス配向で配置された核酸(例えば、所望の植物遺伝子からの核酸断片、例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列)の導入を含むものであり、標的遺伝子の転写を有効に阻止することが示されている(例えば、Napoliら, Plant Cell, 2:279-289, 1990およびJorgensenら, 米国特許第5,034,323号を参照されたい)。
一般には、センス抑制は、導入された配列の転写を含む。しかし、導入された配列がコード配列自体を含有しないが、イントロンもしくは非翻訳配列または他のそのような配列が、抑制すべき内因性遺伝子の一次転写産物中に存在する配列と実質的に同一である場合にも、共抑制が生じうる。導入される配列は、一般には、抑制のために標的化される内因性遺伝子と実質的に同一である。そのような同一性は典型的には約50%より大きいが、より高い同一性(例えば、80%または更には95%)が好ましい。なぜなら、それらはより有効な抑制を引き起こすからである。共抑制の効果は、相同性または実質的な相同性を示す類似遺伝子ファミリー内の他のタンパク質に対して適用されうる。1つの植物からの遺伝子からのセグメントは、例えば異なる植物種における相同遺伝子の発現を抑制するために直接的に使用されうる。
センス抑制においては、導入配列は、絶対的というほどの同一性は要求されず、一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAとの対比において完全長である必要はない。完全長より短い配列における、より高い配列同一性は、より低い同一性の、より長い配列を補償する。さらに、導入される配列は、同じイントロンまたはエキソンパターンを有する必要はなく、非コードセグメントの同一性は同様に有効でありうる。少なくとも50塩基対の配列が好ましく、より長い導入配列が好ましい(例えば、Jorgensenら, 米国特許第5,034,323号に記載されている方法を参照されたい)。
アンチセンス抑制
アンチセンス技術においては、所望の植物遺伝子からの核酸セグメント(例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列)をクローニングし、発現制御領域に機能しうる形で連結して、RNAのアンチセンス鎖が合成されるようにする。ついで該構築物を植物内に形質転換し、RNAのアンチセンス鎖を産生させる。植物細胞においては、アンチセンスRNAは遺伝子発現を抑制することが示されている。
アンチセンス抑制において導入すべき核酸セグメントは、一般には、抑制すべき内因性遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であるが、同一である必要はない。本明細書に開示されているタバコニコチンデメチラーゼの核酸配列は、標的遺伝子に対して相同性または実質的な相同性を示す遺伝子ファミリー内の他のタンパク質に対して該抑制効果が適用されるように設計されたベクター内に含まれうる。1つの植物からの遺伝子からのセグメントは、例えば異なるタバコ品種における相同遺伝子の発現を抑制するために直接的に使用されうる。
導入される配列は、一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAとの対比において完全長である必要はない。一般には、より短い配列の使用を補償するために、より高い相同性が用いられうる。さらに、導入される配列は、同じイントロンまたはエキソンパターンを有する必要はなく、非コードセグメントの相同性は同様に有効であろう。一般には、そのようなアンチセンス配列は、通常、少なくとも15塩基対、好ましくは約15〜200塩基対、より好ましくは200〜2,000塩基対またはそれ以上の長さであろう。該アンチセンス配列は、抑制すべき遺伝子の全部または一部に対して相補的でありうる。当業者に理解されるとおり、アンチセンス配列が結合する個々の部位およびアンチセンス配列の長さは、所望の抑制の度合およびアンチセンス配列の特有性によって異なるであろう。植物の負調節性アンチセンスヌクレオチド配列を発現する転写構築物は、転写の方向に、プロモーター、センス鎖上でアンチセンスRNAをコードする配列、および転写終結領域を含む。アンチセンス配列は、例えばvan der Krolら (Gene 72: 45-50, 1988); Rodermelら (Cell 55: 673-681, 1988); Molら (FEBS Lett. 268: 427-430, 1990); WeigelおよびNilsson (Nature 377: 495-500, 1995); Cheungら, (Cell 82: 383-393, 1995); ならびにShewmakerら (米国特許第5,107,065号)に記載されているとおりに構築し発現させることが可能である。
ドミナントネガティブ体
タバコ遺伝子産物のドミナントネガティブ遺伝子産物をコードするトランスジーンを発現するトランスジェニック植物は、該トランスジーンが該トランスジェニック植物におけるタバコ遺伝子産物をダウンレギュレーションすることを示すために、人工的環境において又は圃場においてアッセイされうる。ドミナントネガティブトランスジーンは当技術分野で公知の方法に従い構築される。典型的には、ドミナントネガティブ遺伝子は、過剰発現されると野生型酵素の活性を損なうタバコ遺伝子産物の変異負調節性ポリペプチドをコードする。
変異体
タバコ遺伝子産物の発現または酵素活性の低下を伴う植物は、標準的な変異法を用いることによっても作製されうる。そのような変異誘発法には、限定的なものではないが、エチルメチルスルファートでの種子の処理(HilderingおよびVerkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding. Pergamon press, pp 317-320, 1965)またはUV照射、X線および高速中性子照射(例えば、Verkerk, Neth. J. Agric. Sci. 19:197-203, 1971; およびPoehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold, New York (3.sup.rd ed), 1987を参照されたい)、トランスポゾンの使用(Fedoroffら, 1984; 米国特許第4,732,856および米国特許第5,013,658号)ならびにT-DNA挿入法(Hoekemaら, 1983; 米国特許第5,149,645号)が含まれる。タバコ遺伝子内に存在しうる変異のタイプには、例えば点変異、欠失、挿入、重複および逆位が含まれる。そのような変異は、望ましくは、タバコ遺伝子のコード領域内に存在するが、タバコ遺伝子のプロモーター領域およびイントロンまたは非翻訳領域内の変異も望ましいであろう。
例えば、T-DNA挿入変異誘発は、遺伝子の発現をダウンレギュレーションする、タバコ遺伝子内の挿入変異を作製するために用いられうる。理論的には、任意の与えられた遺伝子における挿入を95%の確率で得るためには、約100,000個の独立したT-DNA挿入が必要である(McKinnet, Plant J. 8: 613-622, 1995; およびForsthoefelら, Aust. J. Plant Physiol. 19:353-366, 1992)。植物のT-DNAタグ付き系統は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析を用いてスクリーニングされうる。例えば、1つのプライマーをT-DNAの一方の末端に対して設計し、もう1つのプライマーを、目的の遺伝子に対して設計することが可能であり、両方のプライマーを該PCR分析に使用することが可能である。PCR産物が全く得られない場合には、関心のある遺伝子内に挿入は存在しない。これに対して、PCR産物が得らた場合には、関心のある遺伝子内に挿入が存在する。
変異タバコ遺伝子産物の発現は、標準的な方法(例えば、本明細書に記載されている方法)により評価することが可能であり、所望により、該非変異酵素の発現と比較することが可能である。非変異植物と比較した場合、タバコ遺伝子産物をコードする遺伝子の発現の低下を伴う変異植物は、本発明の望ましい実施形態である。本明細書に記載の任意の核酸配列内に変異を有する植物は、本明細書に記載の育種計画において使用されうる。
構成的またはエチレンもしくは老化誘導性配列の過剰発現
Nicotiana系統またはその系統の植物から製造されるタバコ製品における望ましい形質を増強するために、本発明の核酸配列(例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列またはその断片)の過剰発現を用いることが可能である。特に、二次代謝産物から生じる望ましい香味および芳香産物の生合成を増強するために、本発明の核酸配列の過剰発現およびそれらの翻訳産物を使用することが可能である。タバコポリペプチドをコードする核酸配列の更なる過剰発現を用いて、Nicotiana系統内の該ポリペプチドの発現を増強することが可能である。
本発明の核酸を過剰発現させることによりNicotiana系統に付与されうる更なる望ましい形質には、青枯病、グランビレ枯病(Granville wilt)、立枯病、ジャガイモウイルスY、タバコモザイクウイルス、タバコ腐食(etch)ウイルス、タバコ葉脈斑紋(vein mottling)ウイルス、アルファルファモザイクウイルス、野火病、根こぶ線虫、南(Southern)根こぶ線虫、シスト線虫、黒根病、青かび病、レース0タバコ疫病菌およびレース1タバコ疫病菌に対する耐性が含まれる。本発明の核酸配列を発現させることによりNicotiana植物において増強されうる他の望ましい形質には、収量および/または等級の増加、乾燥性、収穫性、保持能、葉品質または乾燥特性の向上、丈の増加または減少、成熟時間の変化(例えば、早熟、早熟ないし中生、中生、中生ないし晩熟または晩熟)、柄のサイズの増加または減少、ならびに植物当たりの葉数の増加または減少が含まれる。
植物プロモーター
望ましいプロモーターは、カリモウイルスプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)プロモーターまたはキャッサバ葉脈モザイクウイルス(CsVMV)プロモーターである。これらのプロモーターはほとんどの植物組織において高レベルの発現をもたらし、これらのプロモーターの活性はウイルスコード化タンパク質に依存的ではない。CaMVは35Sおよび19Sの両方のプロモーターの入手源である。これらのプロモーターを使用する植物発現構築物の具体例は当技術分野において公知である。トランスジェニック植物のほとんどの組織においては、CaMV35Sプロモーターは強力なプロモーターである。CaMVプロモーターは単子葉植物においても非常に活性である。さらに、このプロモーターの活性はCaMV35Sプロモーターの重複により更に増強(すなわち、2〜10倍)されうる。
他の有用な植物プロモーターには、限定的なものではないが、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス(FMV)プロモーター、コメアクチンプロモーターおよびユビキチンプロモーター系が含まれる。
典型的な単子葉植物プロモーターには、限定的なものではないが、イネリナイエローモットルウイルス、サトウキビバドナウイルスプロモーター、イネツングロバシリフォルム(tungro bacilliform)ウイルスプロモーター、トウモロコシストリーク(streak)ウイルス要素、およびコムギ萎縮病ウイルスプロモーターが含まれる。
ある用途には、タバコ遺伝子産物、例えばドミナントネガティブ変異遺伝子産物を、適当な組織において、適当な量で、または適当な生育時点で産生させることが望ましいかもしれない。この目的には、環境、ホルモンおよび/または発育刺激のような誘導性シグナルに応答して調節されることが示されている遺伝子プロモーター群(それぞれはその調節配列において具現化されるそれ自身の異なる特性を有する)が存在する。これらには、限定的なものではないが、熱調節性遺伝子発現、光調節性遺伝子発現(例えば、エンドウrbcS-3A;トウモロコシrbcSプロモーター;エンドウにおいて見出されるクロロフィルa/b結合性タンパク質遺伝子;またはArabssuプロモーター)、ホルモン調節性遺伝子発現(例えば、コムギのEm遺伝子からのアブシジン酸(ABA)応答配列;オオムギおよびArabidopsisのABA誘導性HVA1およびHVA22ならびにrd29Aプロモーター)ならびに創傷誘導性遺伝子発現(例えば、wunlのもの)、器官特異的遺伝子発現(例えば、塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子;記載されているトウモロコシからの23kDaゼイン遺伝子;またはインゲンマメβ-ファセオリン遺伝子)をもたらす遺伝子プロモーター、または病原体誘導性プロモーター(例えば、PR-1、prp-1またはβ-1,3グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性wirlaプロモーターおよび線虫誘導性プロモーター、タバコおよびパセリのそれぞれTobRB7-5AおよびHmg-1)が含まれる。
植物発現ベクター
典型的には、植物発現ベクターは、(1)5'および3'調節配列の転写制御下のクローン化植物遺伝子ならびに(2)優性選択マーカーを含む。そのような植物発現ベクターは、所望により、プロモーター調節領域(例えば、誘導性もしくは構成的、病原体もしくは創傷誘導性、環境もしくは発生調節性、または細胞もしくは組織特異的発現を付与するもの)、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、RNAプロセシングシグナル、転写終結部位および/またはポリアデニル化シグナルをも含有しうる。
植物発現ベクターは、所望により、RNAプロセシングシグナル、例えばイントロン(これは、効率的なRNA合成および蓄積に重要であることが示されている)をも含有しうる。RNAスプライス配列の位置は植物におけるトランスジーン発現のレベルに劇的な影響を及ぼしうる。この事実を考慮すると、遺伝子発現のレベルを改変するためには、トランスジーン内のタバコニコチンデメチラーゼコード配列の上流または下流にイントロンを配置することが可能である。
発現ベクターは、前記の5'調節制御配列に加えて、一般には植物遺伝子の3'領域内に存在する調節制御領域をも含みうる。例えば、mRNAの安定性を増加させるために、3'ターミネーター領域を発現ベクター内に含有させることが可能である。1つのそのようなターミネーター領域は、ジャガイモのPI-IIターミネーター領域に由来するものでありうる。また、他の一般に使用されるターミネーターはオクトピンまたはノパリンシンターゼシグナルに由来する。
植物発現ベクターは、典型的には、形質転換された細胞を特定するための優性選択マーカー遺伝子をも含有する。植物系のための有用な選択遺伝子には、トランスポゾンTn5のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子(AphII)、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。光合成に必要な遺伝子も光合成欠損株における選択マーカーとして使用されうる。最後に、除草剤耐性をコードする遺伝子が選択マーカーとして使用されうる。有用な除草剤耐性遺伝子には、酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードし広域スペクトル除草剤Basta(登録商標)(Bayer Cropscience Deutschland GmbH, Langenfeld, Germany)に対する耐性を付与するbar遺伝子が含まれる。他の選択マーカーには、他のそのような除草剤、例えばグリホセートなど、およびイミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン除草剤、クロロスルフロン、ブロモキシニル、ダラポンなどに対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。さらに、メトトレキセートのような分子と共に、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子が使用されうる。
選択マーカーの効率的な使用は、個々の選択因子に対する植物細胞の感受性の決定、および形質転換細胞の全てではなくともほとんどを有効に殺すこの因子の濃度の測定により促進される。タバコの形質転換に対する抗生物質の有用な濃度のいくつかには、例えば20〜100μg/ml(カナマイシン)、20〜50μg/ml(ハイグロマイシン)または5〜10μg/ml(ブレオマイシン)が含まれる。除草剤耐性に関する形質転換体の選択のための有用な方法は、例えばVasil (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II, III Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, New York, 1984)により記載されている。
選択マーカーに加えて、レポーター遺伝子を使用することが望ましいであろう。いくつかの場合には、レポーター遺伝子は選択マーカーの非存在下で使用される。レポーター遺伝子は、典型的には受容生物または組織内に存在せず発現もされない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には、いくつかの表現型変化または酵素特性をもたらすタンパク質をコードする。そのような遺伝子の具体例は、参照により本明細書に組み入れるWeisingら (Ann. Rev. Genetics 22:421, 1988)に記載されている。好ましいレポーター遺伝子には、限定的なものではないがグルクロニダーゼ(GUS)遺伝子およびGFP遺伝子が含まれる。
植物発現ベクターの構築後、植物宿主内に該ベクターを導入してトランスジェニック植物を作製するためにいくつかの標準的な方法が利用可能である。これらの方法には、(1)Agrobacterium媒介形質転換(A. tumefaciensまたはA. rhizogenes)(例えば、LichtensteinおよびFuller In: Genetic Engineering, vol 6, PWJ Rigby編, London, Academic Press, 1987; ならびにLichtenstein, C.P.およびDraper, J., In: DNA Cloning, Vol II, D.M. Glover編, Oxford, IRI Press, 1985; 米国特許第4,693,976, 4,762,785, 4,940,838, 5,004,863, 5,104,310, 5,149,645, 5,159,135, 5,177,010, 5,231,019, 5,463,174, 5,469,976および5,464,763号; ならびに欧州特許第0131624, 0159418, 0120516, 0176112, 0116718, 0290799, 0292435, 0320500および0627752号、ならびに欧州特許出願番号0267159および0604622を参照されたい)、(2)粒子運搬系(例えば、米国特許第4,945,050および5,141,131号を参照されたい)、(3)マイクロインジェクション法、(4)ポリエチレングリコール(PEG)法、(5)リポソーム媒介DNA取り込み、(6)エレクトロポレーション法(例えば、WO 87/06614ならびに米国特許第5,384,253, 5,472,869, 5,641,664, 5,679,558, 5,712,135, 6,002,070および6,074,877号を参照されたい)、(7)ボルテックス法、または(8)いわゆるウイスカーズ(whiskers)法(例えば、Coffeeら, 米国特許第5,302,523および5,464,765号を参照されたい)が含まれる。発現ベクターで形質転換されうる植物組織のタイプには、胚組織、カルス組織IおよびII型、胚軸、***組織などが含まれる。
植物組織内への導入後、当技術分野で公知の任意の手段により構造遺伝子の発現をアッセイすることが可能であり、転写されたmRNAとして、または合成されたタンパク質として、またはタバコにおける二次アルカロイドの化学分析による代謝産物モニターにより測定される生じた遺伝子サイレンシングの量として、発現を測定することが可能である(本明細書中に記載のとおり;参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,583,021号も参照されたい)。植物組織のin vitro培養のための、そして多くの場合には全植物への再生のための技術が公知である(例えば、米国特許第5,595,733および5,766,900号を参照されたい)。導入された発現複合体を商業的に有用な栽培品種へ移すための方法は当業者に公知である。
所望のレベルの望ましい遺伝子産物を発現する植物細胞が得られたら、当技術分野でよく知られた方法および技術を用いて、植物組織および全植物をそれから再生させることが可能である。ついで、再生された植物を通常の手段により生殖させ、導入された遺伝子を通常の植物育種技術により他の株および栽培品種へ移すことが可能である。
トランスジェニックタバコ植物はゲノム遺伝子の任意の部分の核酸をダウンレギュレーションまたは過剰発現のための異なる配向(例えば、それぞれアンチセンス配向またはセンス配向)で含みうる。Nicotiana系統内の遺伝子産物の発現を増強するためには、完全長タバコ遺伝子のアミノ酸配列の全体または機能的部分をコードする核酸配列の過剰発現が望ましい。
タバコ遺伝子の転写または翻訳レベルの測定
遺伝子発現は、例えば、タバコ遺伝子または遺伝子断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用する標準的なノーザンブロット分析(Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (2001),およびSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., (1989))により測定されうる。RNA発現レベルの測定は、定量的rtPCR(Kawasakiら, in PCR Technology: Principles and Applications of DNA Amplification (H. A. Erlich編) Stockton Press (1989); Wangら in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innisら編) Academic Press (1990); ならびにFreemanら, Biotechniques 26:112-122および124-125, 1999)を含む逆転写PCR(rtPCR)によっても補助されうる。タバコ遺伝子の発現を測定するための更なるよく知られた技術には、in situハイブリダイゼーションおよび蛍光in situハイブリダイゼーション(例えば、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (2001)を参照されたい)が含まれる。前記の標準的な技術は、植物間、例えば、タバコ遺伝子内に変異を有する植物と対照植物との間で発現レベルを比較するためにも有用でありうる。
所望により、同じ一般的アプローチおよび標準的なタンパク質分析技術、例えばブラッドフォードアッセイ、分光光度アッセイ、および免疫学的検出技術、例えば所望のポリペプチドに特異的な抗体でのウエスタンブロット法または免疫沈降を用いて、タバコ遺伝子の発現(例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列またはそれらの断片)をタンパク質産生のレベルで測定することが可能である(Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (2001), およびSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., (1989))。
本明細書に記載の任意のポリペプチドの活性は、当技術分野における標準的な方法を用いてアッセイされうる。例えば、p450の活性は、典型的には、蛍光に基づくアッセイ(例えば、Donatoら, Drug Metab Dispos. 32: 699-706, 2004を参照されたい)を用いてアッセイされる。特に、ニコチンデメチラーゼの活性は、酵母ミクロソームアッセイを用いて、本明細書に記載されているとおりにアッセイされうる。
タバコ遺伝子産物のモジュレーターの特定
また、cDNAの単離は、遺伝子産物の発現を上昇または低下させる分子の特定を促進する。1つのアプローチにおいては、タバコmRNAを発現する細胞(例えば、原核細胞、例えば大腸菌(E. coli)または真核細胞、例えば酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞もしくは植物細胞)の培地に候補分子を種々の濃度で加える。ついで、例えば本明細書に記載されているような標準的な方法を用いて、遺伝子産物の発現を候補分子の存在下および非存在下で測定する。
候補モジュレーターは、精製(または実質的に精製)された分子であることが可能であり、あるいは化合物混合物の1つの成分でありうる。混合化合物アッセイにおいては、単一の化合物または最小化合物混合物がタバコニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を改変することが示されるまで、候補化合物プール(例えば、標準的な精製技術、例えばHPLCにより得られたもの)の次第に小さくなる亜群に対して遺伝子産物の発現を試験する。本発明の1つの実施形態においては、遺伝子産物の発現の低下を促進する分子が特に望ましいと考えられる。遺伝子産物の発現または活性のレベルで有効であることが見出されたモジュレーターは、イン・プランタ(in planta)において有用であると証明されうる。
農業用には、本明細書に開示されている方法を用いて特定された分子、化合物または物質は、植物の茎葉上への噴霧剤または粉剤として施用される化学物質として使用されうる。該分子、化合物または物質は、植物に何らかの利益をもたらす別の分子と共に植物に施用されうる。
用途
本明細書に記載の任意の配列に対応する内因性遺伝子の調節、例えば遺伝子サイレンシングは、より貴重な植物または植物製品を与えうる。特に、エチレンにより誘導される又は老化に関連しているものとして本明細書中で特定されている配列(例えば、配列番号4、40、44、52、54、60、70、104、138、140、158、162、188、212、226、234および288の配列または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列もしくはそれらの断片を有するもの)を使用して、最終産物の品質特性に影響を及ぼすテルペノイド、ポリフェノール、アルカロイドなどを含む多数の二次代謝産物の形成に関与する代謝経路に影響を及ぼすことが可能である。同様に、本明細書中で特定されている遺伝子は、老化過程で蓄積する乾物の率およびタイプまたは老化過程の植物内の乾物の分配に関連した代謝経路を調節するために使用されうる。本明細書中で特定されている遺伝子の調節は、老化速度、葉内および単一植物の葉間の老化の均一性ならびに本明細書中で特定されている遺伝子を刺激または活性化して葉または他の植物成分を含む製品または製造品の質を制御する物質または活性による老化の誘導の決定に関与する代謝経路に影響を及ぼすためにも用いられうる。
本明細書に記載の遺伝子のプロモーター領域は、作物の品質を改良し又は特定の形質を増強する任意の望ましい遺伝子産物の発現を駆動するために使用されうる。二次代謝産物から生じる香味および芳香産物の生合成に関与する特有の遺伝子を発現させるために、植物内への導入のための構築物において、植物の生活環の特定の期間中に発現される誘導性プロモーターが使用されうる。また、末端用途特性に影響を及ぼす構造的炭水化物またはタンパク質の発現を上昇または修飾するために、タバコ遺伝子プロモーターが使用されうる。更に、タバコ遺伝子プロモーターは、栄養製品、医薬物質または産業用物質の生合成に関与する遺伝子を含む異種遺伝子と組合されうるであろう。プロモーター配列の調節は、アルカロイド生合成および/または他の経路に関与する遺伝子を含む内因性タバコ遺伝子をダウンレギュレーションするために用いられうる。望ましくは、タバコ遺伝子プロモーター領域または他の転写調節領域は、植物内のノルニコチン含量およびニトロソアミンレベルのような化学的特性を改変するために用いられる。また、当技術分野における標準的な方法を用いてプロモーター配列内で容易に特定されうるプロモーターモチーフを用いて、タバコ遺伝子産物(例えば、p450)の発現に関連した又はそれを調節する因子を特定することが可能である。
更に、本発明の配列(例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列もしくはそれらの断片)のいずれかは、本明細書に記載の標準的な方法を用いて遺伝子産物(例えば、p450)の遺伝子発現を低下させ又はその酵素活性を改変する方法において使用されうる。そのような技術には、限定的なものではないがRNA干渉、三本鎖干渉、リボザイム、相同組換え、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング、アンチセンスおよび共抑制技術、ドミナントネガティブ遺伝子産物の発現、標準的な変異誘発技術を用いる変異遺伝子の生成が含まれる。例えば、植物病原体相互作用および耐病性に関連した脂肪酸を改変するために、あるいは選択された脂肪酸の植物プロフィールを改変して該植物または植物成分の香味または芳香を改変するために、p450発現の低下またはp450酵素活性の改変が用いられうる。
更に、他のタバコNicotiana種における関連遺伝子に関するスクリーニングのための又は植物が対応内因性遺伝子内に変異を有するかどうかを決定するための、関連遺伝子、プロモーターまたは調節領域を単離するための遺伝的マーカーとして、プロモーター、コード配列、イントロンまたは3'UTRまたはそれらの断片などのタバコ遺伝子の任意の部分が標準的な方法により使用されうる。また、特定の遺伝子の移入または喪失を追跡するために育種操作による遺伝子の流れをモニターするために、タバコ遺伝子の一部が使用されうる。
例えば、Nicotiana tabacumは、その他のNicotiana種のいくつかと同様に異質四倍体であり、元の遺伝子が存在するゲノムとは異なる親ゲノム内の相同遺伝子または関連遺伝子を特定するために使用されうるであろう。関連遺伝子に関するマーカーは、既存のタバコ生殖質、交雑により生じた分離または合成集団、変異誘発処理または種々の組織培養法により生じた集団をスクリーニングするためにも使用されうるであろう。したがって、本明細書に記載の核酸配列(例えば、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列またはそれらの断片)は、耐病性、耐虫性、香味および芳香特性、除草剤耐性、葉収量を増加させる又は葉に影響を及ぼす又は構造的形質もしくは繊維含量に関連した植物成分(例えば、リグニン、セルロースなど)に影響を及ぼす或いは望ましくない成分に関連した品質因子に関与する遺伝子を特定し又はそれに影響を及ぼすために使用されうる。
製品
ニトロソアミン含量の低下を伴うタバコ製品は、当技術分野で公知の標準的な方法により、本明細書に記載の任意のタバコ植物材料を使用して製造される。1つの実施形態においては、タバコ製品は、乾燥タバコ植物から得られたタバコ植物材料を使用して製造される。乾燥タバコ植物は、低下したニコチンデメチラーゼ活性を含有しうる。あるいは乾燥タバコ植物は、低下したニコチンデメチラーゼ活性を含有するよう育種されたものでありうる。例えば、乾燥タバコ植物は、ニコチンデメチラーゼの変異発現を伴うものとして特定されたタバコ植物を含む交配から得られたタバコ植物でありうる。望ましくは、タバコ製品は、約5 mg/g未満、約4.5 mg/g未満、約4.0 mg/g未満、約3.5 mg/g未満、約3.0 mg/g未満、約2.5 mg/g未満、約2.0 mg/g未満、約1.5 mg/g未満、約1.0 mg/g未満、約750 μg/g未満、約500 μg/g未満、約250 μg/g未満、約100 μg/g未満、約75 μg/g未満、約50 μg/g未満、約25 μg/g未満、約10 μg/g未満、約7.0 μg/g未満、約5.0 μg/g未満、約4.0 μg/g未満、約2.0 μg/g未満、約1.0 μg/g未満、約0.5 μg/g未満、約0.4 μg/g未満、約0.2 μg/g未満、約0.1 μg/g未満、約0.05 μg/g未満または約0.01 μg/g未満の、低下した量のノルニコチンまたはNNNを含有し、あるいは、ここで、それに含有される全アルカロイド含量に対する二次アルカロイドの比率(%)は90%未満、70%未満、50%未満、30%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1.5%未満、1%未満、0.75%未満、0.5%未満、0.25%未満または0.1%未満である。「低下した量(量の低下)」なる表現は、ノルニコチンまたはNNNの低下のためにトランスジェニックにされていない同様に加工された同品種由来の野生型タバコ植物または植物成分またはタバコ製品において見出されるものより低い、タバコ植物または植物成分またはタバコ製品におけるノルニコチンまたはNNNまたはそれらの両方の量を意味する。1つの具体例においては、ノルニコチンまたはNNNまたはそれらの両方の減少が本明細書に記載の方法により得られたのか
どうかを判定するための対照として、同様に加工された同品種の野生型タバコ植物を使用する。もう1つの具体例においては、標準的な方法を用いて、例えば、遺伝子または遺伝子産物(例えば、ニコチンデメチラーゼ)または特定の遺伝子内変異の存在または非存在をモニターすることにより、ニトロソアミン含量の低下を伴う植物を評価する。更にもう1つの具体例においては、育種計画から得られた植物のニトロソアミン含量を、ニトロソアミン量の低下を伴う植物を育種するために使用した受容系統または供与系統またはそれらの両方のニトロソアミン含量と比較する。必要に応じて、当技術分野で公知の他の適当な対照も使用される。ノルニコチンおよびNNNまたはそれらの両方のレベルは、タバコ分野においてよく知られた方法に従い測定される。
以下の実施例は、本発明を実施するための方法を例示するものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の例示に過ぎないと理解されるべきであり、そのような本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
植物組織の開発およびエチレン処理
植物の成長
植物をポット内に播種し、温室内で4週間成長させた。該4週齢実生を個々のポットに移植し、該温室内で2ヶ月間成長させた。成長中に、150ppmのNPK肥料を含有する水で該植物に1日2回灌水した。大きくなった緑葉を植物から切断して、後記のとおりにエチレン処理を行った。
細胞系78379
タバコ系統78379は、University of Kentuckyにより公開されたバーレータバコ系統であり、それを植物材料源として使用した。100個の植物を、タバコの成長の分野における標準体として培養し、移植し、異なる番号(1〜100)で識別した。推奨されているとおりに施肥および圃場管理を行った。
それらの100個の植物の4分の3がニコチンの20〜100%をノルニコチンへと変換した。それらの100個の植物の4分の1はニコチンの5%未満をノルニコチンへと変換した。植物番号87は最低の変換率(2%)を示し、一方、植物番号21は100%の変換を示した。3%未満の変換率の植物は非変換体として分類された。遺伝的および表現型相違を調べるために、植物番号87および植物番号21の自己受粉種子ならびに交配(21×87および87×21)種子を得た。自殖した21からの植物は変換体であり、87からの自殖の99%は非変換体であった。87からの植物の残りの1%は低い変換率(5〜15%)を示した。正逆交雑からの植物はすべて変換体であった。
細胞系4407
Nicotiana系統4407は、バーレー系統であり、それを植物材料源として使用した。均一かつ代表的な植物(100個)を選抜し、番号で識別した。それらの100個の植物のうちの97個は非変換体であり、3個は変換体であった。植物番号56は最低の変換率(1.2%)を示し、一方、植物番号58は最高レベルの変換率(96%)を示した。これらの2つの植物を使用して自己受粉種子ならびに交配種子を得た。
自殖した58からの植物は変換体:非変換体の比3:1で分離した。植物58-33および58-25は、それぞれホモ接合変換体およびホモ接合非変換変換体として特定された。58-33の安定な変換がその後代の分析により確認された。
細胞系PBLB01
PBLB01は、ProfiGen, Inc.により開発されたバーレー系統であり、それを植物材料源として使用した。PBLB01の原種から変換体植物を選抜した。
エチレン処理方法
緑葉を2〜3ヶ月の温室栽培植物から切断し、それに0.3% エチレン溶液(Prep brand Ethephon (Rhone-Poulenc))を噴霧した。各噴霧葉を、加湿器を備えた乾燥棚内に吊るし、プラスチックで覆った。該処理中に、該サンプル葉にエチレン溶液を定期的に噴霧した。エチレン処理の約24〜48時間後、RNA抽出のために葉を集めた。葉代謝産物およびより詳細な対象成分(例えば、種々のアルカロイド)の濃度を測定するための代謝成分分析のために、別の小サンプルを採取した。
一例として、アルカロイド分析を以下のとおりに行うことが可能であった。0.5mlの2N NaOH、ならびに内部標準としてのキノリンおよびt-ブチルエーテルを含有する5mlの抽出溶液と共に、サンプル(0.1g)を150rpmで振とうした。サンプルを、FID検出器を備えたHP 6890 GC上で分析した。該検出器および注入器には250℃の温度を用いた。5% フェノールおよび95% メチルシリコンで架橋された溶融シリカよりなるHPカラム(30m-0.32nm-1mm)を、10℃/分(min)で110〜185℃の温度勾配で使用した。該カラムは、キャリヤーガスとしてヘリウムを使用して、100℃、1.7cm3min-1 の流速、40:1のスプリット比、2:1の注入容量で、該カラムを運転した。
RNAの単離
RNA抽出のために、2月齢の温室栽培植物からの中葉を、前記のとおりにエチレンで処理した。その0および24〜48時間のサンプルをRNA抽出に使用した。いくつかの場合には、花の頭部の除去の10日後の植物から、老化過程中の葉サンプルを採取した。これらのサンプルも抽出に使用した。Rneasy Plant Mini Kit(登録商標)(Qiagen, Inc., Valencia, California)を該製造業者のプロトコールに従い使用して、全RNAを単離した。
DEPCで処理された乳鉢および乳棒を使用して、組織サンプルを液体窒素下で粉砕して微粉末を得た。約100マイクログラムの粉砕組織を1.5mlの無菌エッペンドルフチューブに移した。すべてのサンプルが集まるまで、このサンプルチューブを液体窒素中に配置した。ついで、該キットとして提供されている450μlのバッファーRLTを(メルカプトエタノールの添加と共に)各チューブに加えた。該サンプルを激しくボルテックスし、56℃で3分間インキュベートした。ついでライセートを、2ml収集チューブ内に配置されたQIAshredder(登録商標)遠心カラムに適用し、最大速度で2分間遠心分離した。流出物を集め、0.5容量のエタノールを該清澄化ライセートに加えた。該サンプルを十分に混合し、2ml収集チューブ内に配置されたRneasy(登録商標)小型遠心カラムに移した。該サンプルを10,000rpmで1分間遠心分離した。つぎに700μlのバッファーRW1をRneasy(登録商標)カラム上にピペッティングし、10,000rpmで1分間遠心分離した。バッファーRPEを新しい収集チューブ内のRneasy(登録商標)カラム上にピペッティングし、10,000rpmで1分間遠心分離した。バッファーRPEを再びRneasy(登録商標)カラムに加え、最大速度で2分間遠心分離して、該膜を乾燥させた。エタノールキャリーオーバーを除去するために、該膜を別の収集チューブ内に配置し、最大速度で更に1分間遠心分離した。該Rneasy(登録商標)カラムを新たな1.5ml収集チューブ内に移し、40μlのRNアーゼ非含有水を該Rneasy(登録商標)膜上に直接的にピペッティングした。この最終溶出チューブを10,000rpmで1分間遠心分離した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計により全RNAの定性および定量分析を行った。
Origotex(登録商標)ポリA+RNA精製キット(Qiagen Inc.)を該製造業者のプロトコールに従い使用して、ポリ(A)RNAを単離した。250μlの最大容量中の約200μgの全RNAを使用した。その250μlの全RNAに容量250μlのバッファーOBBおよび15μlのOligotex(登録商標)懸濁液を加えた。内容物をピペッティングにより十分に混合し、加熱ブロック上で70℃で3分間インキュベートした。ついで該サンプルを室温で20分間放置した。最大速度で2分間の遠心分離により、Oligotex(登録商標):mRNA複合体をペレット化した。50mlを除くすべての該懸濁液を該ミクロ遠心チューブから除去した。該サンプルをOBBバッファーで更に処理した。該Oligotex(登録商標):mRNAペレットを、ボルテックスすることにより400μlのバッファーOW2に再懸濁させた。この混合物を、新たなチューブ内に配置された小さな遠心カラム上に移し、最大速度で1分間遠心分離した。該遠心カラムを新たなチューブに移し、更に400μlのバッファーOW2を該カラムに加えた。ついで該チューブを最大速度で1分間遠心分離した。該遠心カラムを最終的な1.5mlのミクロ遠心チューブに移した。該サンプルを60μlの加温(70℃)バッファーOEBで溶出した。ポリA産物を変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計により分析した。
逆転写PCR
SuperScript逆転写酵素を製造業者のプロトコール(Invitrogen, Carlsbad, California)に従い使用して、第1鎖cDNAを得た。ポリA+富化RNA/オリゴdTプライマー混合物は5μg未満の全RNA、1μlの10mM dNTP混合物、1μlのオリゴd(T) 12-18 (0.5μg/μl)および10μlまでのDEPC処理水よりなるものであった。各サンプルを65℃で5分間インキュベートし、ついで氷上で少なくとも1分間配置した。以下の成分のそれぞれを順番に加えることにより、反応混合物を調製した:2μl 10×RTバッファー, 4μlの25 mM MgCl2, 2μlの0.1 M DTTおよび1μlのRNアーゼOUT Recombinant RNase Inhibitor。9μlの反応混合物の添加物を各RNA/プライマー混合物にピペッティングし、穏やかに混合した。それを42℃で2分間インキュベートし、1μlのSuper Script II RTを各チューブに加えた。該チューブを42℃で50分間インキュベートした。該反応を70℃で15分間で終結させ、氷上で冷却した。該サンプルを遠心分離により集め、1μlのRNアーゼHを各チューブに加え、37℃で20分間インキュベートした。200pmolのフォワードプライマーおよび100pmolのリバースプライマー(18ntのオリゴd(T)およびそれに続く1個のランダムな塩基)を使用して、第2のPCRを行った。
反応条件は94℃で2分間、ついで94℃で1分間、45℃〜60℃で2分間、72℃で3分間の40サイクルのPCR、および72℃で更に10分間の伸長であった。1%アガロースゲルを使用する電気泳動により、10μlの該増幅サンプルを分析した。正しいサイズの断片をアガロースゲルから精製した。
PCR断片集団の作製
実施例3からのPCR断片をpGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, Wisconsin)内に該製造業者の指示に従い連結した。連結産物をJM109コンピテント細胞内に形質転換し、青/白選択のためにLB培地プレート上でプレーティングした。コロニーを選択し、1.2mlのLB培地を含有する96ウェルプレート内で37℃で一晩成長させた。選択したすべてのコロニーの凍結ストックを作製した。Wizard SV Miniprepキット(Promega)と共にBeckman's Biomeck 2000ミニプレップ・ロボティックスを用いて、プレートからプラスミドDNAを精製した。プラスミドDNAを100μlの水で溶出し、96ウェルプレート内で保存した。プラスミドをEcoR1で消化し、1%アガロースゲルを使用して分析して、DNAの量およびインサートのサイズを確認した。CEQ 2000シークエンサー(Beckman, Fullerton, California)を使用して、400〜600bpのインサートを含有するプラスミドを配列決定した。BLAST検索により該配列をGenBankデータベースと整列させた(例えば、図159A〜159Kを参照されたい)。p450関連断片を特定し、更に分析した。あるいは、p450断片をサブトラクションライブラリーから単離した。これらの断片も、前記のとおりに分析した。
cDNAライブラリーの構築
以下のとおり、エチレンで処理された葉から全RNAを調製することにより、cDNAライブラリーを構築した。まず、修飾された酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコールを用いて、タバコ系統58-33のエチレン処理葉から全RNAを抽出した。1グラムの組織を使用し、それを粉砕し、ついで、5mlのフェノール (pH 5.5) および5mlのクロロホルムが加えられた5mlの抽出バッファー(100 mM Tris-HCl, pH 8.5; 200 mM NaCl; 10mM EDTA; 0.5% SDS)中でボルテックスするよう、該プロトコールを修飾した。抽出されたサンプルを遠心分離し、上清を取っておいた。上清が透明になるまで、この抽出工程を2〜3回反復した。微量のフェノールを除去するために、約5mlのクロロホルムを加えた。3倍容量のエタノールおよび1/10容量の3M NaOAc (pH 5.2)を加え、-20℃で1時間保存することにより、合わせた上清画分からRNAを沈殿させた。Corexガラス容器に移した後、該RNA画分を9,000rpm、4℃で45分間遠心分離した。該ペレットを70%エタノールで洗浄し、9,000RPM、4℃で5分間遠心した。該ペレットの乾燥後、該ペレット化RNAを0.5mlのRNアーゼ非含有水に溶解した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計により全RNAをそれぞれ定性および定量分析した。
得られた全RNAを使用し、以下のプロトコールによりオリゴ(dT)セルロースプロトコール (Invitrogen)およびミクロ遠心カラム (Invitrogen)を使用してポリA+RNAを単離した。約20mgの全RNAを2回精製に付して、高品質のポリA+RNAを得た。mRNAの高品質性を保証するために、既知完全長遺伝子の変性ホルムアルデヒドゲルおよびそれに続くRT-PCRを行うことにより、ポリA+RNA産物を分析した。
つぎに、ポリA+RNAを鋳型として使用し、cDNA合成キット、ZAP-cDNA合成キットおよびZAP-cDNA Gigapack IIIゴールドクローニングキット (Stratagene, La Jolla, California)を使用してcDNAライブラリーを得た。該方法は、示されているとおりの該製造業者のプロトコールに従い行った。約8μgのポリA+RNAを使用してcDNAライブラリーを構築した。該一次ライブラリーの分析は約2.5×106〜1×107 pfuを示した。IPTGおよびX-galを使用する相補性アッセイにより該ライブラリーの品質バックグラウンド試験を完了した。この場合、組換えプラークはバックグラウンド反応の100倍以上で発現された。
ランダムPCRによる該ライブラリーの、より定量的な分析は、インサートcDNAの平均サイズが約1.2kbであることを示した。該方法は2工程のPCR法を用いるものであった。第1工程では、p450断片から得た予備配列情報に基づいてリバースプライマーを設計した。設計されたリバースプライマーおよびT3(フォワード)プライマーを使用して、cDNAライブラリーから対応遺伝子を増幅した。PCR反応をアガロース電気泳動に付し、高分子量の対応バンドを切り出し、精製し、クローニングし、配列決定した。第2工程においては、リバースプライマー(p450の3'UTRから設計したもの)と共に、フォワードプライマーとしてp450の5'UTRおよび開始コード領域から設計した新たなプライマーを、後続のPCRにおいて使用して、完全長p450クローンを得た。
該p450断片は、リバースプライマー以外は、実施例3に記載の構築されたcDNAライブラリーからのPCR増幅により得た。cDNAインサートの下流の該プラスミド上に位置するT7プライマーをリバースプライマーとして使用した。実施例4に記載のとおりに、PCR断片を単離し、クローニングし、配列決定した。
構築されたcDNAライブラリーから、このPCR法により完全長p450遺伝子を単離した。遺伝子特異的リバースプライマー(p450断片の下流配列から設計されたもの)およびフォワードプライマー(ライブラリープラスミド上のT3)を使用して完全長遺伝子を得た。PCR断片を単離し、クローニングし、配列決定した。必要に応じて、第2のPCR工程を行った。この第2の工程においては、p450クローンの3'UTRから設計したリバースプライマーと共に、クローン化p450の5'UTRから設計した新たなフォワードプライマーを、後続PCR反応において使用して、完全長p450クローンを得た。ついで該クローンを配列決定した。
クローン化断片の特徴づけ - リバースサザンブロット分析
示差的発現を検出するために、前記実施例において特定されたすべてのp450クローン上で、非放射性ラージスケールリバースサザンブロットアッセイを行った。異なるp450クラスター間の発現のレベルは非常に異なることが観察された。更に、高い発現を示すクローン上でリアルタイム検出を行った。
非放射性サザンブロット法は以下のとおりに行った。
1)実施例2に記載のとおりに、Qiagen Rnaeasyキットを使用して、エチレンで処理された及び処理されていない変換体(58-33)および非変換体(58-25)葉から全RNAを抽出した。
2)前記工程で得たポリA+富化RNAに由来する一本鎖cDNAをビオチン尾部標識することにより、プローブを作製した。この標識一本鎖cDNAは、プライマー (Promega)としてビオチン化オリゴdTを使用すること以外は実施例3に記載のとおりの変換体および非変換体全RNA(Invitrogen)のRT-PCRにより作製した。これらを、クローン化DNAにハイブリダイズさせるためのプローブとして使用した。
3)プラスミドDNAを制限酵素EcoR1で消化し、アガロースゲル上で泳動させた。ゲルを同時に乾燥させ、2つのナイロンメンブレン(Biodyne B)にトランスファーした。1つのメンブレンを変換体プローブでハイブリダイズさせ、もう1つを非変換体プローブでハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション前にメンブレンをUV架橋(自動架橋セッティング, 254nm, Stratagene, Stratalinker)に付した。
あるいは、p-GEMプラスミド、T3およびSP6の両アーム上に位置する配列をプライマーとして使用して、該インサートを各プラスミドからPCR増幅した。96ウェルReady-to-run アガロースゲル上で泳動させることにより、PCR産物を分析した。確認されたインサートを2つのナイロンメンブレン上にドット化(dot)した。1つのメンブレンを変換体プローブでハイブリダイズさせ、もう1つを非変換体プローブでハイブリダイズさせた。
4)該膜をハイブリダイズさせ、洗浄ストリンジェンシーを変更すること以外は製造業者(Enzo MaxSence kit, Enzo Diagnostics, Inc, Farmingdale, NY)の指示に従い洗浄した。該膜をハイブリダイゼーションバッファー(界面活性剤およびハイブリダイゼーション増強剤を含有する2×SSC緩衝化ホルムアミド)で42℃で30分間、プレハイブリダイズさせ、10μlの変性プローブで42℃で一晩ハイブリダイズさせた。ついで該膜を1×ハイブリダイゼーション洗浄バッファー中、室温で10分間(1回)および68℃で15分間(4回)洗浄した。該検出法のための該膜の準備は整った。
5)それらの洗浄された膜を、製造業者の検出指示書(Enzo Diagnostics, Inc.)に記載されているとおりにアルカリホスファターゼ標識およびそれに続くNBT/BCIP比色検出により検出した。該膜を1×ブロッキング溶液で室温で1時間ブロッキングし、1×検出試薬で10分間(3回)洗浄し、1×前現像(predevelopment)反応バッファーで5分間(2回)洗浄し、ついで該ドットが出現するまで、現像溶液中、30〜45分間、該ブロットを現像した。すべての試薬は製造業者(Enzo Diagnostics, Inc)から入手した。また、KPLサザンハイブリダイゼーションおよび検出キットを製造業者の指示(KPL, Gaithersburg, Maryland)に従い使用して、ラージスケールリバースサザンアッセイを行った。
クローンのキャラクタライゼーション - ノーザンブロット分析
サザンブロット分析の代わりに、ノーザンブロットアッセイの実施例において記載されているとおりに、いくつかの膜をハイブリダイズさせ検出した。以下のとおりに、Nicotianaにおいて示差的に発現されたmRNAを検出するために、ノーザンハイブリダイゼーションを用いた。
クローン化p450(Megaprime DNA Labelling Systems, Amersham Biosciences)からプローブを調製するために、ランダムプライミング法を用いた。以下の成分を混合した:25ngの変性DNA鋳型;4ulの各未標識dTTP、dGTPおよびdCTP;5μlの反応バッファー;P32標識dATPおよび2ulのクレノウI;ならびにH2O(該反応液を50μlに調整する)。該混合物を37℃で1〜4時間インキュベートし、2μlの0.5M EDTAで停止させた。使用前に95℃で5分間のインキュベーションにより、該プローブを変性させた。
いくつかのペアのタバコ系統の、エチレンで処理された及び処理されていない新鮮な葉から、RNAサンプルを調製した。いくつかの場合には、ポリA+富化RNAを使用した。約15μgの全RNAまたは1.8μgのmRNA(実施例5に記載のとおりのRNAおよびmRNA抽出の方法)をDEPC H2O (5〜10μl)で等容量にした。同じ容量のローディングバッファー(1×MOPS; 18.5% ホルムアルデヒド; 50% ホルムアミド; 4 % Ficoll400; ブロモフェノールブルー)および0.5μlのEtBr (0.5 μg/μl)を加えた。ついで電気泳動による該RNAの分離のための準備において、該サンプルを変性させた。
サンプルを、1×MOPバッファー(0.4 M モルホリノプロパン硫酸; 0.1M 酢酸Na-3×H2O; 10mM EDTA; NaOHでpH 7.2に調節)を含有するホルムアルデヒドゲル(1% アガロース, 1×MOPS, 0.6M ホルムアルデヒド)上の電気泳動に付した。10×SSCバッファー(1.5M NaCl; 0.15M クエン酸Na)中、毛管法により、RNAを24時間にわたってHybond-N+メンブレン(Nylon, Amersham Pharmacia Biotech)トランスファーした。ハイブリダイゼーションの前に、RNAサンプルを含有するメンブレンをUV架橋させた(自動架橋セッティング, 254nm, Stratagene, Stratalinker)に付した。
該メンブレンを5〜10mlのプレハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC; 50% ホルムアルミド; 5×デンハルト液; 1% SDS; 100μg/ml 熱変性せん断非相同DNA)で42℃で1〜4時間プレハイブリダイズさせた。古いプレハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たなプレハイブリダイゼーションバッファーおよびプローブを加えた。該ハイブリダイゼーションは42℃で一晩行った。該膜を2×SSCで室温で15分間洗浄し、ついで2×SSCで洗浄した。
以下の表1に示すとおり、ノーザンブロットおよびリバースサザンブロットは、非誘導植物との対比においてどの遺伝子がエチレン処理により誘導されたかを決定するのに有用であった。興味深いことに、該変換体および非変換体において、必ずしもすべての断片が同様に影響を受けたわけではなかった。シトクロムp450断片のいくつかを部分的に配列決定して、それらの構造関連性を決定した。ついで、目的の完全長遺伝子クローンを単離し特徴づけるために、この情報を用いた。
エチレン処理により誘導された変換体および非変換体バーレー系統から得たタバコ組織上で完全長クローンを使用して、ノーザン分析を行った。この分析を用いて、エチレン誘導性非変換体バーレー系統との対比においてエチレン誘導性変換体系統における発現の上昇を示す完全長クローンを特定した。そのように行うことにより、変換体系統と非変換体系統との間の葉成分における生化学的相違を比較することにより、完全長クローンの機能関連性が決定されうる。
以下の表2に示すとおり、+により示される非変換体処理組織の発現と比較して、変換体エチレン処理組織においては、6個のクローンが、++および+++により示される有意に高い発現を示した。これらのクローンの全ては、エチレン処理されていない変換体および非変換体系統において、発現をほとんど又は全く示さなかった。
クローン化遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫検出
3個のp450クローンからの20〜22アミノ酸長に対応するペプチド領域を、(1)他のクローンに対して、より低い相同性を有する又は相同性を有さないこと、および(2)良好な親水性および抗原性を有することに関して選択した。それぞれのp450クローンから選択したペプチド領域のアミノ酸配列を以下に列挙する。該合成ペプチドをKHL(キーホールリンペットヘモシアニン)と共役させ、ついでウサギに注射した。4回目の注射(Alpha Diagnostic Intl. Inc. San Antonio, TX)の2週間後および4週間後に抗血清を集めた。
D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG (配列番号2266)
D90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNY (配列番号163)
D89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY (配列番号2267)
ウエスタンブロット分析により、タバコ植物組織からの標的タンパク質に対する交差活性に関して抗血清を検査した。変換体および非変換体系統のエチレン処理(0〜40時間)中葉から粗タンパク質抽出物を得た。RC DC Protein Assay Kit (BIO-RAD)を該製造業者のプロトコールに従い使用して、該抽出物のタンパク質濃度を測定した。
2μgのタンパク質を各レーン上にローディングし、Laemmli SDS-PAGE系を使用して該タンパク質を10%〜20%勾配ゲル上で分離した。Trans-Blot Semi-Dry セル(BIO-RAD)を使用して該タンパク質をゲルからPROTRAN Nitrocellulose Transfer Membranes (Schleicher & Schuell)にトランスファーした。ECL Advance Western Blotting Detection Kit (Amersham Biosciences)を使用して、標的p450タンパク質を検出し可視化した。該合成KLHコンジュゲートに対する一次抗体をウサギにおいて調製した。ペルオキシダーゼに共役した、ウサギIgGに対する二次抗体を、Sigmaから購入した。一次抗体および二次抗体は共に1:1000の希釈度で使用した。抗体は、該ウエスタンブロット上の単一のバンドに対して強力な反応性を示した。このことは、該抗血清が、関心のある標的ペプチドに対して単一特異性であったことを示している。また、抗血清はKLH共役合成ペプチドに対して交差反応性であった。
核酸の同一性、単離された核酸断片の構造関連性およびGeneChip(登録商標)ハイブリダイゼーション
100個を超えるクローン化p450断片を、それらの構造関連性を決定するためのノーザンブロット分析と共に配列決定した。該アプローチは、p450遺伝子のカルボキシル末端付近に位置する2つの共通のp450モチーフのいずれかに基づくフォワードプライマーを使用するものであった。該フォワードプライマーはシトクロムp450モチーフFXPERF (配列番号2268)またはGRRXCP(A/G) (配列番号2269)に対応するものであった。リバースプライマーとしては、ポリA尾部またはpGEMプラスミドの両アーム上に位置するプラスミドSP6またはT7からの標準的なプライマーを使用した。用いたプロトコールを以下に説明する。
製造業者のプロトコール(Beckman Coulter)に従い出発二本鎖DNAの濃度を推定するために、分光光度法を用いた。該鋳型を適当な濃度まで水で希釈し、95℃で2分間の加熱により変性させ、ついで氷上に配置した。該配列決定反応は、0.5〜10μlの変性DNA鋳型、2μlの1.6pmolのフォワードプライマー、8μlのDTCS Quick Start Master Mixを使用して氷上で調製し、全容量を水で20μlにした。熱サイクルプログラムは以下のサイクルの30サイクルよりなるものであった:96℃で20秒間、50℃で20秒間および60℃で4分間ならびにそれに続く4℃での維持。
5μlの停止バッファー(等容量の3M NaOAcおよび100mM EDTAおよび1μlの20mg/ml グリコーゲン)を加えることにより、該配列決定反応を停止させた。該サンプルを60μlの冷95%エタノールで沈殿させ、6000×gで6分間遠心分離した。エタノールを捨てた。該ペレットを200μlの冷70%エタノールで2回洗浄した。該ペレットが乾燥した後、40μlのSLS溶液を加え、該ペレットを再懸濁させた。鉱油層を重層し、更なる分析のために該サンプルをCEQ 8000 Automated Sequencer上に配置した。
核酸配列を確認するために、p450遺伝子のFXPERF (配列番号2268) またはGRRXCP(A/G)(配列番号2269)領域に対するフォワードプライマー、あるいはプラスミドまたはポリA尾部に対するリバースプライマーを使用して、該核酸配列を両方向に再び配列決定した。すべての配列決定は両方向に少なくとも2回行った。
シトクロムp450断片の核酸配列を、GRRXCP(A/G) (配列番号2269)モチーフをコードする領域の後の第1核酸から終止コドンまでに対応するコード領域に関してお互いに比較した。p450タンパク質間の遺伝的多様性の指標として、この領域を選択した。他の植物種の場合と同様に、70遺伝子を超える多数の遺伝的に異なるp450遺伝子が観察された。核酸配列の比較に際して、該遺伝子は、配列同一性に基づいて、異なる配列群内に配置されうることが判明した。p450メンバーの最良の特有の群分けは、75%またはそれ以上の核酸同一性配列を有する配列であることが見出された(例えば、参照により本明細書に組み入れるUS 2004/0162420特許出願公開のTable 1を参照されたい)。同一性(%)の減少は有意に大きな群を与えた。好ましい群分けは、81%またはそれ以上の核酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、91%またはそれ以上の核酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99%またはそれ以上の核酸同一性を有する配列で認められた。それらの群のほとんどは少なくとも2個のメンバーを、そしてしばしば3個以上のメンバーを含有していた。他のものは反復的には見出されなかった。このことは、採用したアプローチが、使用した組織において低発現mRNAおよび高発現mRNAの両方を単離し得たことを示唆している。
75%またはそれ以上の核酸同一性に基づき、2つのシトクロムp450群が、該群該のものとは遺伝的に異なるかつてのタバコシトクロム遺伝子に対して核酸配列同一性を含有することが判明した。群23は、表3Aで用いるパラメーターにおいて、GenBank配列GI:1171579 (配列番号2270) (CAA64635)およびGI:14423327 (配列番号2271) (またはAAK62346)に対して核酸同一性を示した。GI:1171579 (配列番号2270)は群23のメンバーに対して96.9%〜99.5%の範囲の核酸同一性を有し、一方、GI:14423327 (配列番号2271)はこの群に対して95.4%〜96.9%の範囲の同一性を示した。群31のメンバーは、GI:14423319 (配列番号2272) (AAK62342)のGenBankに報告されている配列に対して76.7%〜97.8%の核酸同一性を有していた。表3Aのその他のp450同一性群はいずれも、既に報告されているNicotiana p450遺伝子に対して、表3Aにおいて用いるパラメーター同一性を含有していなかった。
Nicotiana植物からの各群の追加的なメンバーを優先的に同定し単離するためには、群に関して、適当な核酸縮重プローブでコンセンサス配列を誘導することが可能であろう。
表3A:Nicotiana p450核酸配列同一性群
群 断片
1 D58-BG7 (配列番号10), D58-AB1 (配列番号12); D58-BE4 (配列番号16)
2 D56-AH7 (配列番号18); D13a-5 (配列番号20)
3 D56-AG10 (配列番号22); D35-33 (配列番号24); D34-62 (配列番号26)
4 D56-AA7 (配列番号28); D56-AE1 (配列番号30); 185-BD3 (配列番号152)
5 D35-BB7 (配列番号32); D177-BA7 (配列番号34); D56A-AB6 (配列番号36); D144-AE2 (配列番号38)
6 D56-AG11 (配列番号40); D179-AA1 (配列番号42)
7 D56-AC7 (配列番号44); D144-AD1 (配列番号46)
8 D144-AB5 (配列番号48)
9 D181-AB5 (配列番号50); D73-AC9 (配列番号52)
10 D56-AC12 (配列番号54)
11 D58-AB9 (配列番号56); D56-AG9 (配列番号58); D56-AG6 (配列番号60); D35-BG11 (配列番号62); D35-42 (配列番号64); D35-BA3 (配列番号66); D34-57 (配列番号68); D34-52 (配列番号70); D34-25 (配列番号72)
12 D56-AD10 (配列番号74)
13 56-AA11 (配列番号76)
14 D177-BD5 (配列番号78); D177-BD7 (配列番号92)
15 D56A-AG10 (配列番号80); D58-BC5 (配列番号82); D58-AD12 (配列番号84)
16 D56-AC11 (配列番号86); D35-39 (配列番号88); D58-BH4 (配列番号90); D56-AD6 (配列番号96)
17 D73A-AD6 (配列番号98); D70A-BA11 (配列番号100)
18 D70A-AB5 (配列番号104); D70A-AA8 (配列番号106)
19 D70A-AB8 (配列番号108); D70A-BH2 (配列番号110); D70A-AA4 (配列番号112)
20 D70A-BA1 (配列番号114); D70A-BA9 (配列番号116)
21 D70A-BD4 (配列番号118)
22 D181-AC5 (配列番号120); D144-AH1 (配列番号122); D34-65 (配列番号124)
23 D35-BG2 (配列番号126)
24 D73A-AH7 (配列番号128)
25 D58-AA1 (配列番号130); D185-BC1 (配列番号142); D185-BG2 (配列番号144)
26 D73-AE10 (配列番号132)
27 D56-AC12 (配列番号134)
28 D177-BF7 (配列番号136); D185-BE1 (配列番号146); D185-BD2 (配列番号148)
29 D73A-AG3 (配列番号138)
30 D70A-AA12 (配列番号140); D176-BF2 (配列番号94)
31 D176-BC3 (配列番号154)
32 D176-BB3 (配列番号 156)
33 D186-AH4 (配列番号14)
エチレン活性化後に同質遺伝子系統に近い非変換体と変換体との間の示差的発現パターンを有する遺伝子を特定するために、GeneChip(登録商標)マイクロアレイハイブリダイゼーション(Affymetrix Inc.; Santa Clara, CA)を使用した。チップサイズは18ミクロンであり、アレイフォーマットは100〜2187であり、528個のプローブセット(11,628個のプローブ)を収容する。マイクロアレイの結果を、独立して証明するために、7個のペアのハイブリダイゼーションを用いた。これらは、4407-33/4407-25の未処理バーレータバコサンプルの1個のペア(変換体/非変換体)、エチレン処理された4407-33/4407-25サンプルの4個のペア、エチレン処理されたいぶし(dark)タバコNL Madole/181の1個のペア、ニコチン変換に関して同質に近い系統のもう1個のペア、および4407=33/25の天然で老化した葉の1個のペア(表3B)よりなるものであった。
Genome Explorations, Inc. (Memphis, TN)による検出装置を使用して作成したエクスプレッションレポートにより示されるとおり、全14セットのハイブリダイゼーションは成功した。メインレポートは、ノイズ、スケール因子、バックグラウンド、全プローブセット、存在する及び存在しないプローブセットの数および比率(%)、ハウスキーピング対照のシグナル強度の分析を含んでいた。ついで、ソフトウェアGCOSを他のソフトウェアと共に使用して、該データを分析し、表示した。処理ペア間のシグナル比較を行い、すべてのハイブリダーゼーションのすべてのそれぞれのプローブに関する全体のデータをまとめ、発現データも分析した。シグナル強度に基づく結果は、2つの遺伝子(D121-AA8およびD120-AH4)および1つの断片(D121-AA8の部分断片であるD35-BG11)だけが、エチレン処理変換体系統において、非変換体系統と比較した場合に、再現可能な誘導を受けることを示した。変換体系統、例えばバーレータバコ品種4407-33における遺伝子のシグナルは、関連非変換体同質遺伝子系統4407-25における遺伝子のシグナルに対する比として測定された。エチレン処理を行わなかった場合には、すべての遺伝子に関する非変換体シグナルに対する変換体シグナルの比は1.00に近かった。バックグラウンドの相違の影響を排除するために、正規化されたシグナル比も計算した。正規化シグナル比は、処理ペア比を対応非ペア比で割り算することにより得られる。エチレン処理および分析に際して、2つの遺伝子(D121-AA8およびD120-AH4)は、4つの異なる分析による測定では、非変換体系統との対比において変換体系統において誘導されることが確認された。これらの2つの遺伝子は99.8%の相対相同性を共有し、変換体品種におけるそれらの相対ハイブリダイゼーションシグナルはそれらの非変換体対応物におけるシグナルより約2〜22倍高かった。正規化された比に基づけば、2つのアクチン様内部対照クローンは変換体系統においては誘導されなかった。また、断片(D35-BG11)(そのコード領域の全体はD121-AA8およびD120-AH4遺伝子内に含有されている)は、ペアになった同質遺伝子変換体および非変換体系統の同じサンプルにおいて高度に誘導された。更に、D121-AA8およびD120-AH4遺伝子は同質遺伝子いぶし(dark)タバコペアNL Madoleおよび181の変換体系統において強力に誘導された(8〜28倍)。したがって、このことは、変換体系統におけるこれらの遺伝子のエチレン誘導がイン・プランタ(in planta)応答であったことを示している。4407-33/25の天然老化サンプルハイブリダイゼーションから行った比較においても、同じ遺伝子が特定された。D121-AA8に特異的なプライマーを使用するこれらの材料のRT-PCRアッセイは、この遺伝子に関するマイクロアレイの結果を証明した。
これらの結果に基づき、D121-AA8遺伝子(そのcDNA配列は配列暗号5の配列である; 図4)が、関心のあるタバコニコチンデメチラーゼ遺伝子として特定された。p450の命名法を考慮すると、D121-AA8はCYP82Eファミリー内のp450に最も類似していることが確認された(The Arabidopsis Genome Initiative (AGI) and The Arabidopsis Information Resource (TAIR); Frank, Plant Physiol. 110:1035-1046, 1996; Whitbredら, Plant Physiol. 124:47-58, 2000); SchopferおよびEbel, Mol. Gen. Genet. 258:315-322, 1998; ならびにTakemotoら, Plant Cell Physiol. 40:1232-1242, 1999)。
酵素活性の生化学的分析
生化学的分析(例えば、参照により本明細書に組み入れる既に出願されている出願に記載されているもの)は、配列番号5の配列がタバコニコチンデメチラーゼ(配列番号3;図3および4)をコードしていることを確認している。
特に、以下のとおり、酵母細胞内で異種発現されるp450の酵素活性をアッセイすることにより、候補クローンD121-AA8の機能をニコチンデメチラーゼのコード遺伝子として確認した。
1.酵母発現ベクターの構築
タバコニコチンデメチラーゼをコードするcDNA(D121-AA8)の推定タンパク質コード配列D120-AH4、D121-AA8、208-AC-8およびD208-AD9を酵母発現ベクターpYeDP60内にクローニングした。適当なBamHIおよびMfeI部位(以下の下線部)を、翻訳開始コドン(ATG)の上流または停止コドン(TAA)の下流にこれらの配列を含有するPCRプライマーにより導入した。増幅されたPCR産物上の該ベクター上のMfeIはEcoRI部位に適合性である。D121-AA8 cDNAを増幅するために使用したプライマーは5’-TAGCTACGCGGATCCATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’ (配列番号2194)および5’-CTGGATCACAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC-3’ (配列番号2297)であった。6個のヒスチジンを含む該タンパク質のC末端の更に9個のアミノ酸をコードする配列のセグメントを、誘導された際の6-Hisタグ付きp450の発現を促進するためにリバースプライマー内に組込んだ。酵素消化の後、GAL10-CYC1プロモーターに対してセンス配向で、PCR産物をpYeDP60ベクター内に連結した。該酵母発現ベクターの適切な構築を制限酵素分析およびDNA配列決定により確認した。また、p450タンパク質の発現を酵母ミクロソームの界面活性剤相に関してSDS-PAGEゲル電気泳動上で可視化した。遺伝子配列に基づけば、p450タンパク質の予想サイズは59kDであり、結果をゲル分析により確認した。
2.酵母形質転換
Arabidopsis NADPH-シトクロムp450レダクターゼATR1を発現するよう修飾されたWAT11酵母系をpYeDP60-p450 cDNAプラスミドで形質転換した。50μlのWAT11酵母細胞浮遊液を、0.2cmの電極間隙を有するキュベット内で〜1μgのプラスミドDNAと混合した。Eppendorfエレクトロポレーター (Model 2510)により2.0kVの1パルスを加えた。細胞をSGIプレート(5g/L バクトカザミノ酸, アミノ酸を含有しない6.7 g/L 酵母窒素塩基, 20 g/L グルコース, 40 mg/L DL-トリプトファン, 20 g/L 寒天)上に広げた。ランダムに選択したコロニー上で直接的に行ったPCR分析により形質転換体を確認した。
3.形質転換酵母細胞内でのp450発現
単一酵母コロニーを使用して、それを30ml SGI培地(5g/L バクトカザミノ酸, アミノ酸を含有しない6.7 g/L 酵母窒素塩基, 20 g/L グルコース, 40 mg/L DL-トリプトファン)に接種し、30℃で約24時間成長させた。この培養のアリコートを1000mLのYPGE培地(10 g/L 酵母エキス, 20 g/L バクトペプトン, 5 g/L グルコース, 30 ml/L エタノール)内に1:50希釈し、Diastix尿分析試薬片(Bayer, Elkhart, IN)の比色変化による表示でグルコースが完全に消費されるまで成長させた。DL-ガラクトースを2%の最終濃度まで加えることによりクローン化P450の誘導を開始した。in vivo活性アッセイまたはミクロソーム調製に使用する前に、該培養を更に20時間成長させた。
pYeDP60-CYP71D20(Nicotiana tabacumにおける5-エピ-アリストロケンおよび1-デオキシカプシジオールのヒドロキシル化を触媒するp450)を発現するWAT11酵母細胞を、p450発現および酵素活性アッセイのための対照として使用した。
p450の酵母発現の有効性を詳細に評価するために、還元CO差分光法(reduced CO difference spectroscopy)を行った。還元COスペクトルは、全4種のp450形質転換酵母系統から、450nmタンパク質においてピークを示した。対照の未形質転換酵母細胞またはブランクのベクター対照酵母細胞に由来する対照ミクロソームにおいては、類似したピークは観察されなかった。これらの結果は、pYeDP60-CYP 450を含有する酵母系においてp450タンパク質が有効に発現されたことを示した。酵母ミクロソームにおける発現p450タンパク質の濃度は45〜68 nmole/mg全タンパク質であった。
4.in vitro酵素アッセイ
酵母培養にDL-ニコチン(ピロリジン-2-14C)を供給することにより、形質転換された酵母細胞におけるニコチンデメチラーゼ活性をアッセイした。14C標識ニコチン(54 mCi/mmol)を55μMの最終濃度で75μlのガラクトース誘導培養に加えた。該アッセイ培養を、14mlのポリプロピレンチューブ中、振とうしながら6時間インキュベートし、900μlのメタノールで抽出した。遠心後、20μlの該メタノール抽出物をrp-HPLCで分離し、ノルニコチン画分をLSCにより定量した。
WAT11(pYeDP60-CYP71D20)の対照培養はニコチンをノルニコチンへ変換しなかった。このことは、WAT11酵母株が、ニコチンからノルニコチンへの生物変換の過程を触媒する内因性酵素活性を含有していないことを示している。これとは対照的に、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子を発現する酵母は、検出可能な量のノルニコチンを産生した。これは配列番号4または配列番号5の翻訳産物のニコチンデメチラーゼ活性を示している。
5.酵母ミクロソームの調製
ガラクトースによる20分間の誘導の後、酵母細胞を遠心分離により集め、TES-Mバッファー(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.6 M ソルビトール, 10 mM 2-メルカプトエタノール)で2回洗浄した。該ペレットを抽出バッファー(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.6 M ソルビトール, 2 mM 2-メルカプトエタノール, 1% ウシ血清アルブミン, プロテアーゼインヒビターカクテル (Roche) (錠剤1個/50 ml))に再懸濁させた。ついで細胞をガラスビーズ(直径0.5mm, Sigma)で破壊し、細胞抽出物を20,000×gで20分間遠心分離して細胞残渣を除去した。上清を100,000×gで60分間の超遠心分離に付した。得られたペレットはミクロソーム画分を含有していた。該ミクロソーム画分をTEG-Mバッファー (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 20% グリセロールおよび1.5 mM 2-メルカプトエタノール)に1mg/mLのタンパク質濃度で懸濁させた。ミクロソーム調製物を、使用するまで液体窒素冷凍機内で保存した。
6.酵母ミクロソーム調製物における酵素活性アッセイ
酵母ミクロソーム調製物でのニコチンデメチラーゼ活性アッセイを行った。特に、DL-ニコチン(ピロリジン-2-14C)をMoravek Biochemicalsから得、それは54 mCi/mmolの比活性を有していた。クロルプロマジン(CPZ)および酸化型シトクロムc(cyt.C)(共にP450インヒビターである)をSigmaから購入した。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)は、NADPH:シトクロムP450レダクターゼを介した、シトクロムP450に対する典型的な電子供与体である。対照インキュベーションにはNADPHを除いた。通常の酵素アッセイはミクロソームタンパク質(約1mg/ml)、6 mM NADPHおよび55 μM 14C標識ニコチンを含むものであった。CPZおよびCyt.Cの濃度は、それらを使用した場合には、それぞれ1mMおよび100μMであった。反応を25℃で1時間行い、それぞれ25μlの反応混合物への300μlのメタノールの添加により停止させた。遠心分離後、20μlの該メタノール抽出物を、VarianからのInertsil ODS-3 3 μ (150×4.6 mm)クロマトグラフィーカラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)系(Agilent)で分離した。イソクラティック移動相はメタノールと50mMリン酸カリウムバッファー(pH6.25)との60:40(v/v)の比の混合物であり、流速は1ml/分であった。真正非標識ノルニコチンとの比較により決定されたノルニコチンのピークを集め、定量のために2900トリカーボ(tri-carb)Liquid Scintillation Counter (LSC) (Perkin Elmer)に付した。ニコチンデメチラーゼの活性は、1時間のインキュベーションにわたる14C標識ノルニコチンの産生に基づいて計算される。
CYP71D20を発現する対照酵母細胞からのミクロソーム調製物、ならびに遺伝子D120-AH4、D208-AC8およびD208-AD9で形質転換された3つの試験p450酵母培養物において、p450様活性が観察された。しかし、該対照およびそれらの3つの試験p450はノルニコチン変換形成を全く示さなかった。このことは、それらが、ニコチンのデメチル化を触媒しうる内因性または誘導性酵素を含有していなかったことを示唆している。これとは対照的に、HPLCおよびLSC分析からの結果は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子(D121-AA8)を発現する酵母細胞から得たミクロソームサンプルを使用した場合には、ニコチンのデメチル化から生じた検出可能な量のノルニコチンを示した。これらの結果は、ニコチンデメチラーゼ活性がD121-AA8遺伝子産物から生じることを示している。ニコチンデメチラーゼ活性はNADPHを要し、p450特異的インヒビターにより抑制されることが示され、これは、タバコニコチンデメチラーゼがp450であることに符合する。タバコニコチンデメチラーゼ(D121-AA8)に関する酵素活性は、放射能強度およびタンパク質濃度による計算では約10.8pKat/mgタンパク質であった。該酵母細胞に関して得られた一連の典型的な酵素アッセイの結果を以下の表(表4)に示す。
D121-AA8酵母細胞由来のミクロソームを使用するアッセイからNADPHを除いた場合には、ニコチンデメチラーゼ活性の阻止が生じた。したがって、ノルニコチンは形成しなかった(表4)。2つの公知P450インヒビターであるクロルプロマジン(CPZ, 1mM)および酸化型シトクロムc(cytC, 100μM)を別々に該酵素アッセイ混合物中に加え、1時間インキュベートした後でメタノール停止溶液を加えた場合には、ニコチンデメチラーゼ活性が有意に低下した(表4)。総合すると、これらの実験は、D121-AA8が、酵母内で発現されるとニコチンからノルニコチンへの変換を触媒するシトクロムp450タンパク質をコードしていることを示した。
単離された核酸断片の関連アミノ酸配列同一性
実施例8からシトクロムp450断片に関して得られた核酸配列のアミノ酸配列を演繹した。該演繹領域はGXRXCP(A/G) (配列番号2273)配列モチーフの直後のアミノ酸からカルボキシル末端または終止コドンまでに対応するものであった。該断片の配列同一性を比較したところ、70%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列に関して、特有の群分けが見られた。好ましい群分けは、80%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、90%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で認められた。それらの特有の核酸配列のいくつかは他の断片に対して完全なアミノ酸同一性を有することが見出されたため、同一アミノ酸を有する唯一のメンバーを報告した。
表5の群19に関するアミノ酸同一性は、それらの核酸配列に基づけば、3つの異なる群に対応した。群メンバーのアミノ酸配列およびそれらの同一性を図159Hに示す。アミノ酸の相違が示されている。
植物を使用する遺伝子クローニングおよび機能研究のために、各アミノ酸同一性群の少なくとも1つのメンバーを選択した。また、ノーザンおよびサザン分析により評価した場合にエチレン処理または他の生物学的相違により異なって影響される群メンバーを、遺伝子クローニングおよび機能研究のために選択した。遺伝子クローニング、発現研究および全植物評価を補助するために、配列同一性および特異な配列に基づき、ペプチド特異的抗体を調製することが可能である。
完全長クローンの関連アミノ酸配列同一性
実施例5においてクローニングされた完全長Nicotiana遺伝子の核酸配列をそれらの全アミノ酸配列に関して演繹した。カルボキシル末端におけるUXXRXXZ (配列番号2274)、PXRFXF (配列番号2275)またはGXRXC (配列番号2276)(ここで、UはEまたはKであり、Xは任意のアミノ酸であり、ZはP、T、SまたはMである)に対応する3つの保存されたp450ドメインモチーフの存在により、シトクロムp450遺伝子を特定した。お互いに対して及び公知タバコ遺伝子に対して完全長配列を比較するBLASTプログラムを使用して、アミノ酸同一性に関してすべてのp450遺伝子を特徴づけした。該プログラムはNCBIスペシャル(special)BLASTツール(tool)(Align two sequences (b12seq), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html)を使用するものであった。2つの配列を、核酸配列に関してはフィルター無しでBLASTNで、アミノ酸配列に関してはBLASTPで整列させた。それらのアミノ酸同一性(%)に基づき、各配列を同一性群に群分けした。この場合、該群分けは、別のメンバーに対して少なくとも85%の同一性を共有するメンバーを含有するものであった。好ましい群分けは、90%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、95%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で認められた。これらの基準を用いて、25個の特有の群を特定した。それらを表6に示す。完全長ニコチンデメチラーゼ遺伝子のアミノ酸配列は、配列番号5(図4)に記載の配列を有するように演繹された。
アミノ酸同一性に関して表6で用いたパラメーターにおいては、3つの群は、公知タバコ遺伝子に対して85%またはそれ以上の同一性を含有することが判明した。群5のメンバーはGeneBank配列GI:14423327 (配列番号2271) (またはAAK62346)に対して完全長配列に関して96%までのアミノ酸同一性を有していた。群23はGI:14423328 (配列番号2277) (またはAAK62347)に対して93%までのアミノ酸同一性を、群24はGI:14423318 (配列番号2278) (またはAAK62343
;配列番号2300)に対して92%の同一性を有していた。
カルボキシル末端付近のGXRXC p450ドメイン (配列番号2276)とUXXRXXZ p450ドメイン (配列番号2274)との間の高度に保存されたアミノ酸相同性に基づき、完全長遺伝子を更に群分けした。図160A〜160Eに示すとおり、個々のクローンを保存ドメイン間の配列相同性に基づいて整列させ、種々の同一性群内に配置した。いくつかの場合には、該クローンの核酸配列は特有なものであったが、該領域に関するアミノ酸配列は同一であった。好ましい群分けは、90%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、95%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で認められた。この最終的な群分けは、2つの異なる群に分類された群17(表6)以外はクローンの全アミノ酸配列に関する同一性に基づくものに類似していた。
表7におけるアミノ酸同一性に関して用いたパラメーターにおいては、3つの群は、公知タバコ遺伝子に対して90%またはそれ以上の同一性を含有することが判明した。群5のメンバーはGeneBank配列GI:14423326 (配列番号2279) (またはAAK62346)に対して完全長配列に関して93.4%までのアミノ酸同一性を有していた。群23はGI:14423328 (配列番号2277) (またはAAK62347)に対して91.8%までのアミノ酸同一性を、群24はGI:14423318 (配列番号2278) (またはAAK62342)に対して92%の同一性を有していた。
タバコP450特異的ドメインの1以上を欠くNicotianaシトクロムP450クローン
4個のクローンは、表6に報告されている他のタバコシトクロム遺伝子に対して90%〜99%の範囲の高い核酸相同性を有していた。それらの4個のクローンには、D136-AD5 (配列番号292)、D138-AD12 (配列番号294)、D243-AB3 (配列番号298)およびD250-AC11 (配列番号300)が含まれた。しかし、ヌクレオチドフレームシフトにより、これらの遺伝子は3個のC末端シトクロームp450ドメインの1以上を含有しておらず、表6または表7に示す同一性群から除外された。
1つのクローンD95-AG1のアミノ酸同一性は、表6または表7においてp450タバコ遺伝子を群分けするのに用いた第3のドメインGXRXC (配列番号2276)を含有していなかった。このクローンの核酸配列は他のタバコシトクロム遺伝子に対して低い相同性を有し、したがって、このクローンはNicotianaのシトクロームp450遺伝子の新規群に相当する。
タバコの品質の調節の改変におけるNicotianaシトクロムP450断片およびクローンの使用
タバコp450核酸断片または全遺伝子の使用は、タバコ表現型またはタバコ成分の改変、そしてより重要なものとして代謝産物の改変を伴う植物の特定および選択において有用である。ダウンレギュレーション(例えば、アンチセンス配向)または過剰発現(例えば、センス配向)などのための配向で、本明細書に記載のものから選ばれる核酸断片または完全長遺伝子を組込む種々の形質転換系により、トランスジェニックタバコ植物を作製することが可能である。完全長遺伝子に対する過剰発現のためには、本発明に記載の完全長遺伝子の全体または機能的部分またはアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が望ましい。そのような核酸配列は、望ましくは、ある酵素の発現を増強してNicotianaにおける表現型効果をもたらすのに有効である。ホモ接合であるNicotiana系統は、一連の戻し交配により得られ、当業者に一般に利用可能な技術を用いて内因性p450 RNA、転写産物、p450発現ペプチドおよび植物代謝産物の濃度を分析することとなど(これらに限定されるものではない)により、表現型変化に関して評価される。タバコ植物において示される変化は、選択された関心のある遺伝子の機能的役割に関する情報を提供し、あるいは好ましいNicotiana植物種として有用である。
変換体バーレータバコからのゲノムタバコニコチンデメチラーゼのクローニング
Qiagen Plant Easyキットを前記実施例に記載のとおりに(該製造業者の説明も参照されたい)使用して、変換体バーレータバコ植物系統4407-33(Nicotiana tabacum品種4407系統)からゲノムDNAを抽出した。
前記実施例においてクローニングした5'プロモーターおよび3'UTR領域に基づいて、プライマーを設計した。フォワードプライマーは5’-GGC TCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3’ (配列番号2280) および5’- TCT CTA AAG TCC CCT TCC -3’ (配列番号2288)であり、リバースプライマーは5’-GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACA AAC CTT TAT ATA TTA GC-3’ (配列番号2281)および5’- CCA GCA TTC CTC AAT TTC -3’ (配列番号2289)であった。100μlの反応混合物を使用して4407-33ゲノムDNAにPCRを適用した。Pfx高忠実度酵素をPCR増幅に使用した。電気泳動後に1%アガロースゲル上でPCR産物を可視化した。約3.5kbの分子量を有する単一のバンドが観察され、それを該ゲルから切り出した。ゲル精製キット(Qiagen; based on manufacturer’s procedure)を使用して、生じたバンドを精製した。精製されたDNAを酵素XbaI(NEB; 製造業者の指示に従い使用する)で消化した。同じ方法を用いてpBluescriptプラスミドをXbaIで消化した。該断片をゲル精製し、pBluescriptプラスミド内に連結した。該連結混合物をコンピテント細胞GMlO9内に形質転換し、青/白選択を伴う100mg/lのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレーティングした。白色コロニーを拾い、アンピシリンを含有する10mlのLB液体培地内で成長させた。DNAをミニプレップにより抽出した。CEQ2000シークエンサー(Beckman, Fullerton, California)を製造業者の説明に従い使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。T3およびT7プライマーならびに8個の他の内部プライマーを配列決定に使用した。該配列を集合させ、分析して、ゲノム配列(配列番号4; 図3)を得た。該ゲノム配列に基づき、変換体および非変換体の両方のタバコ系統におけるニコチンデメチラーゼ遺伝子は転移因子を含有しないことが確認された。
配列番号5の配列と配列番号4との比較は該遺伝子のコード部分コードの単一のイントロン(配列番号7の配列として特定される; 図5)の決定を可能にした。図2に示すとおり、タバコニコチンデメチラーゼのゲノム構造は、単一のイントロンに隣接する2つのエキソンを含む。第1エキソンは配列番号4のヌクレオチド2010-2949に伸長し、これは配列番号3のアミノ酸1-313をコードし、第2エキソンは配列番号4のヌクレオチド3947-4562に伸長し、これは配列番号3のアミノ酸314-517をコードしている。したがって、イントロンは配列番号4のヌクレオチド2950-3946に伸長している。該イントロン配列を図5に示す。それは配列番号7の配列である。ゲノムDNA配列の翻訳産物を配列番号3の配列として図3に示す。タバコニコチンデメチラーゼアミノ酸配列は、小胞体膜アンカーモチーフを含有する。
変換体タバコからの5'隣接配列(配列番号8)および3'UTR(配列番号9)のクローニング
A.変換体タバコ葉組織からの全DNAの単離
変換体タバコ4407-33の葉からゲノムDNAを単離した。Qiagen, Inc. (Valencia, Ca)社のDNeasy Plant Mini Kitを該製造業者のプロトコールに従い使用してDNAの単離を行った。その製造業者のマニュアルDneasy’ Plant Mini and DNeasy Plant Maxi Handbook, Qiagen January 2004を参照により本明細書に組み入れることとする。DNA調製の方法は以下の工程を含むものであった。タバコ葉組織(約20mgの乾燥重量)を、液体窒素下で1分間、微粉末に粉砕した。該組織粉末を1.5mlのチューブ内に移した。バッファーAP1(400μl)および4μlのRNアーゼストック溶液(100mg/ml)を最大100mgの粉砕葉組織に加え、激しくボルテックスした。該混合物を65℃で10分間インキュベートし、チューブを反転させることによりインキュベート中に2〜3回混合した。ついでバッファーAP2(130μl)をライセートに加えた。該混合物を混合し、氷上で5分間インキュベートした。該ライセートをQIAshredder Mini Spin Columnにアプライし、2分間(14,000rpm)遠心分離した。該細胞残渣ペレットを乱すことなく、流出画分を新たなチューブに移した。ついでバッファーAP3/E(1.5容量)を清澄化ライセートに加え、ピペッティングにより混合した。存在しうる沈殿物を含む前工程からの混合物(650μl)をDNeasy Mini Spin Columnにアプライした。該混合物を>6000×g(>8000rpm)で1分間遠心分離し、流出物を捨てた。残りのサンプルについて、これを繰返し、流出物および収集チューブを捨てた。DNeasy Mini Spin Columnを新たな2mlの収集チューブ内に配置した。ついでバッファーAW(500μl)をDNeasyカラムに加え、1分間(>8000rpm)遠心分離した。流出物を捨てた。収集チューブを次の工程で再利用した。ついでバッファーAW(500μl)をDNeasyカラムに加え、2分間(>14,000rpm)遠心分離して該メンブレン(膜)を乾燥させた。該DNeasyカラムを1.5mlのチューブに移した。ついでバッファーAE(100μl)をDNeasyメンブレン上にピペッティングした。該混合物を室温(15〜25℃)で5分間インキュベートし、ついで1分間(>8000rpm)遠心分離して溶出させた。
アガロースゲル上でサンプルを泳動させることにより、該DNAの質および量を評価した。
B.構造遺伝子の5'隣接配列のクローニング
配列番号5からの構造遺伝子の5'隣接配列の750ヌクレオチドをクローニングするために、修飾された逆PCR法を用いた。まず、既知配列断片内の制限部位および5'隣接配列の下流の制限部位距離に基づき、適当な制限酵素を選択した。この既知断片に基づき、2つのプライマーを設計した。フォワードプライマーはリバースプライマーの下流に配置した。リバースプライマーは該既知断片の3'部分に配置した。
クローニング操作は以下の工程を含むものであった。
精製されたゲノムDNA(5μg)を、50μlの制限混合物中、20〜40単位の適当な制限酵素(EcoRIおよびSpeI)で消化した。該DNAが完全に消化されたかどうかを確認するために、該反応混合物の1/10容量でのアガロースゲル電気泳動を行った。完全な消化の後に、4℃で一晩の連結により直接的な連結を行った。10μlの消化DNAおよび0.2μlのT4 DNAリガーゼ(NEB)を含有する200μlの反応混合物を4℃で一晩連結させた。人工的な小さな環状ゲノムが得られた後、該連結反応物に対してPCRを行った。50μlの反応混合物中、2つの異なる方向の既知断片からの2個のプライマーおよび10μlの連結反応物を使用して、PCRを行った。45〜56℃のアニーリング温度を用いるグラジエントPCRプログラムを適用した。
PCR反応を調べるために、アガロースゲル電気泳動を行った。所望のバンドを該ゲルから切り出し、QIAGENのQIAquickゲル精製キットを使用して該バンドを精製した。pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI)内に、該製造業者の説明に従い、精製されたPCR断片を連結した。SV Miniprepキット (Promega, Madison, WI)を該製造業者の説明に従い使用して、該形質転換DNAプラスミドをミニプレップにより抽出した。CEQ 2000シークエンサー (Beckman, Fullerton, CA)を使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。5'隣接配列の約758nt(配列番号4のヌクレオチド1241-2009)を前記方法によりクローニングした。
C.構造遺伝子の、より長い5'隣接配列(配列番号8; 図6)のクローニング
構造遺伝子D121-AA8の更なる5'隣接配列をクローニングするために、BD GenomeWalker Universal Kit (Clontech laboratories, Inc., PaloAlto, CA)を該製造業者のユーザーマニュアルに従い使用した。その製造業者のマニュアルBD GenomeWalker August, 2004を参照により本明細書に組み入れることとする。サンプルを0.5%アガロースゲル上で泳動させることにより、タバコゲノムDNAのサイズおよび純度を試験した。タバコ33ライブラリーゲノムウォーキング構築のために、合計4つの平滑末端反応(DRA I, STU I, ECOR V, PVU II)を準備した。消化されたDNAの精製の後、消化されたゲノムDNAをゲノムウォーカーアダプターに連結した。D121-AA8からの遺伝子特異的プライマー(CTCTATTGATACTAGCTGGTTTTGGAC; 配列番号2282)およびアダプタープライマーAP1を使用することにより、それらの4つの消化DNAに一次PCR反応を適用した。該一次PCR産物をネスティッドPCR用の鋳型として直接使用した。該キットにより供給されたアダプターネスティッドプライマーおよび公知クローンD121-AA8(配列番号5)からのネスティッドプライマー(GGAGGGAGAGTATAACTTACGGATTC; 配列番号2283)を該PCR反応において使用した。ゲル電気泳動を行うことにより、PCR産物を調べた。所望のバンドを該ゲルから切り出し、QIAGENのQIAquickゲル精製キットを使用して該バンドを精製した。pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI)内に、該製造業者の説明に従い、精製されたPCR断片を連結した。SV Miniprepキット (Promega, Madison, WI)を該製造業者の説明に従い使用して、該形質転換DNAプラスミドをミニプレップにより抽出した。CEQ 2000シークエンサー (Beckman, Fullerton, CA)を使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。配列番号4のヌクレオチド399-1240を含む5'隣接配列の更に約853ntを前記方法によりクローニングした。
以下のプライマーGWR1A (5’- AGTAACCGATTGCTCACGTTATCCTC -3’) (配列番号2284)およびGWR2A (5’- CTCTATTCAACCCCACACGTAACTG -3’) (配列番号2285)を使用する以外は同じ方法で、第2ラウンドのゲノムウォーキングを行った。配列番号4のヌクレオチド1-398を含む隣接配列の更に約398ntをこの方法によりクローニングした。
調節要素に関する検索は、「TATA」ボックス、「CAAT」ボックスおよび「GAGA」ボックスに加えて、いくつかのMYB様認識部位および器官特異性要素がタバコニコチンデメチラーゼプロモーター領域内に存在することを示した。標準的な方法を用いて特定された推定エリシター応答要素および窒素調節要素も該プロモーター領域内に存在する。
D.構造遺伝子の3'隣接配列のクローニング
構造遺伝子D121-AA8の更なる3'隣接配列をクローニングするために、BD GenomeWalker Universal Kit (Clontech laboratories, Inc., PaloAlto, CA)を該製造業者のユーザーマニュアルに従い使用した。該クローニング手順は、遺伝子特異的プライマー以外は、この実施例の前記C節に記載されているのと同じである。第1プライマーはD121-AA8構造遺伝子の末端の近傍から設計した(5’- CTA AAC TCT GGT CTG ATC CTG ATA CTT -3’) (配列番号2286)。ネスティッドプライマーは、D121-AA8の構造遺伝子のプライマー1の更に下流から設計した(CTA TAC GTA AGG TAA ATC CTG TGG AAC) (配列番号2287)。ゲル電気泳動により、最終的なPCR産物を調べた。所望のバンドを該ゲルから切り出した。QIAGENのQIAquickゲル精製キットを使用して該PCR断片を精製した。pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI)内に、該製造業者の説明に従い、精製されたPCR断片を連結した。SV Miniprepキット (Promega, Madison, WI)を該製造業者の説明に従い使用して、該形質転換DNAプラスミドをミニプレップにより抽出した。CEQ 2000シークエンサー (Beckman, Fullerton, CA)を使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。更に3'隣接配列の約1617ヌクレオチド(配列番号4のヌクレオチド4731-6347)を前記方法によりクローニングした。3'UTR領域の核酸配列を図7に示す。
ニコチンデメチラーゼ遺伝子の存在または非存在に関するNicotiana属のスクリーニング
以下の表8に示すとおり、43種のNicotiana種、49種のNicotiana rustica系統および約600種のNicotiana tabacumをポット内に播種し、生じた植物を温室内で成長させた。
葉サンプルを6週齢の植物から採取した。DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA)を該製造業者のプロトコールに従い使用して、葉からのDNA抽出を行った。
プライマーは、本明細書に記載の5'プロモーターおよび3'UTR領域に基づいて設計した。フォワードプライマーは5’-GGC TCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3’ (配列番号2290)であり、リバースプライマーは5’-GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACA AAC CTT TAT ATA TTA GC-3’ (配列番号2291) (5'隣接領域の -750から180 nt 3’ UTRまで)であった。すべての前記Nicotiana系統から抽出したゲノムDNAをPCR分析に使用した。100μlの反応混合物およびPfx高忠実度酵素をPCR増幅に使用した。種間の相同性がより低かったため、用いたアニーリング温度は54℃であった(この温度は、前記の4407変換体タバコからのゲノム配列のクローニングに用いた温度より2℃低い)。電気泳動後、0.8%アガロースゲル上でPCR産物を可視化した。約3.5kbの分子量を有する単一のバンドが該ゲル上に存在した、または存在しなかった。陽性バンドを有するこの系統は標的遺伝子を有すると評価された。陽性バンドを欠く系統に関しては、更に4つのプライマーセットを使用して4つの追加的なPCR反応を行った。これらのプライマーセットは、該遺伝子の異なる領域から選択した。それらのプライマーセットは以下のとおりであった。
(1)開始コドンから(5’- GCC CAT CCT ACA GTT ACC TAT AAA AAG GAA G -3’)終止コドンまで5’- ACC AAG ATG AAA GAT CTT AGG TTT TAA -3’) (配列番号2293)、
(2)開始コドンの570nt下流から(5’- CTG ATC GTG AAG ATG A -3’) (配列番号2294)イントロンの終わりまで(5’- TGC TGC ATC CAA GAC CA -3’) (配列番号2295)、
(3)イントロンの始まりの300nt下流から(5’- GGG CTA TAT GGA TTC GC -3’)(配列番号2296)イントロンの終わりまで(5’- TGC TGC ATC CAA GAC CA -3’) (配列番号2295)、および
(4)イントロンの始まりの300nt下流から(5’- GGG CTA TAT GGA TTC GC -3’) (配列番号2296)3'UTRまで(5’- AGT CAA TTA TCT TCT ACA AAC CTT TAT ATA TTA GC -3’) (配列番号2195)。
5つの前記PCR反応がすべて正しいバンドを示した場合には、該系統は標的遺伝子を欠いていると評価された。標的ニコチンデメチラーゼ遺伝子に関するゲノムDNA量およびPCR産物の具体例を図8および9に示す。
ニコチンデメチラーゼ遺伝子を欠くものとして特定された生殖質を、栽培タバコとの育種のための原材料として使用する。しかし、図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列またはそれらの断片が同様に使用されうる。異常な又は存在しないニコチンデメチラーゼ遺伝子または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片をドナー源から栽培タバコへ移入するためには、戻し交配または系統育種法のような標準的な育種法と組合された種間または種内交雑法が用いられうる。ニコチンデメチラーゼに関するスクリーニング実験の結果を以下の表9に記載する。ニコチンデメチラーゼに関して陰性である系統をそれ自身または別の陰性系統と交配させることが可能である(例えば、Nicotiana africana × Nicotiana africana、またはNicotiana africana × Nicotiana amplexicaulis、または任意の適当な交配組合せ)。また、当技術分野で公知の標準的なタバコ育種技術により、陰性系統をタバコの任意の実用品種と交配させることも可能である。当技術分野における標準的な方法により、タバコ系統を任意の他の適合植物と交配させることが可能である。
変異の作製または生成およびニコチンデメチラーゼ遺伝子内の遺伝的変異に関するスクリーニング
ニコチンデメチラーゼをコードする配列または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列もしくはそれらの断片により表される任意の他の遺伝子における既存の遺伝的変異または変異を、ゲノム内標的化誘発性局所損傷(targeted induced local lesions in genomes (TILLING))、DNAフィンガープリンティング法、例えば増幅断片長多型(AFLP)および一塩基多型(SNP)を含む分子的技術を用いてスクリーニングする。実際には、既存の遺伝的変異を表す植物集団、例えばトランスジェニック植物(例えば、本明細書に記載の任意のトランスジェニック植物)または生殖組織または他の植物組織を化学的変異誘発、例えばアルキル化剤、例えばエタンメチルスルホナート(EMS)または放射線、例えばX線もしくはγ線に付すことにより作製された植物を使用する。変異誘発された集団を得るためには、変異誘発化合物または放射線の量は、致死または生殖不稔により特徴づけられる閾値レベルより低い変異頻度が得られるよう植物組織の各タイプごとに実験的に決定される。変異誘発処理から生じたM1世代種子の数またはM1植物集団のサイズは、変異の予想頻度に基づいて推定される。M1植物のの後代であるM2世代は、望ましくは遺伝子(例えば、ニコチンデメチラーゼ遺伝子)内の変異に関して評価される集団に相当する。
誘発された又は天然で生じる遺伝的変異を望ましい遺伝子(例えば、ニコチンデメチラーゼ遺伝子)内で検出するためには、耕作(tilling)、DNAフィンガープリンティング、SNPまたは同様の技術が用いられうる。該変異は、欠失、置換、点変異、転座、逆位、重複、挿入または完全なヌル変異から生じうる。これらの技術は、ニコチンデメチラーゼ遺伝子または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片のヌルまたは異類(dissimilar)対立遺伝子を他のタバコ内に移入または育種するためのマーカー補助選別(MA育種計画)において用いられうるであろう。育種家は、ヌルまたは異類対立遺伝子を含有する遺伝子型と農業に望ましい遺伝子型との交雑により分離集団を作製しうるであろう。既に挙げた技術の1つを用いて、ニコチンデメチラーゼ配列または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す核酸配列もしくはそれらの断片から生じたマーカーを使用して、F2または戻し交配世代における植物をスクリーニングしうるであろう。ヌルまたは同類対立遺伝子を有すると特定された植物を戻し交配または自家受粉させて、スクリーニングされうる次の世代を作製することが可能であろう。予想される遺伝パターンまたは用いるMAS技術に応じて、所望の個々の植物の特定を補助するために、戻し交配の各サイクルの前に、選抜された植物を自家受粉させることが必要かもしれない。戻し交配または他の育種法は、反復親の所望の表現型が回復するまで反復されうる。
栽培タバコ内への変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現の交配または移入
A.親系統の選択
変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する供与タバコ系統(例えば、PCRに基づく方法を用いて、ニコチンデメチラーゼ遺伝子を欠く、またはニコチンデメチラーゼに関してヌルである、または酵素活性の改変を伴うニコチンデメチラーゼを発現するものとして特定されるタバコ系統、あるいは遺伝子発現を改変もしくはサイレンシングするトランスジーンを発現するタバコ系統も、ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現に関する変異体であるとみなされる)または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片を特定し、供与親として用いるために選択する。そのような植物は、当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、本明細書に記載のもの)により作製される。他の供与親には、変異誘発され次いで変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子活性または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片によりコードされる遺伝子産物の変異活性を有すると特定されたタバコ植物が含まれる。1つの典型的な供与親としては、neタバコ系統Nicotiana rusticaが挙げられる。
受容(レシピエント)タバコ系統は、典型的には、任意の商業用タバコ品種、例えばNicotiana tabacum TN 90である。他の有用なNicotiana tabacum品種には、BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KT 200, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY 160, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14 x L8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, OXFORD 207, 'Perique' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H4, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, SP 168, SP 172, SP 179, SP 210, SP 220, SP G-28, SP G-70, SP H20, SP NF3, TN 86, TN 97, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA 309またはVA 359が含まれる。そのような品種からの種子も、標準的な化学的または分子的方法を用いてニコチン変換の欠如または存在に関してスクリーニングすることにより得られた起源に由来しうる。そのような商業用品種は、本明細書に記載の方法によりニコチンデメチラーゼ活性を改変するための材料をも提供しうる。当技術分野で公知の他のヌル系統および受容または供与系統も有用であり、本明細書に記載のニコチンデメチラーゼ遺伝子とは異類であると特定された系統も供与親として使用される。また、受容系統は、火力乾燥(フルーキュアリング)、バーレー、いぶし(dark)タバコ、バージニアまたはオリエンタルタバコのための任意のタバコ品種から選択されうる。表10は、Nicotiana tabacumに対して育種適合性を示す典型的なNicotiana種を示す(例えば、APSにより公開されている
Compendium of Tobacco Diseasesまたは日本たばこ産業により公開されている
The Genus Nicotiana Illustratedも参照されたい)。
B.遺伝子導入
標準的な育種法により、供与親を反復的に供与親と交配または交雑させる。標準的な方法により特定される、交雑の成功は、稔性であるか又は所望により反復親と戻し交配されるF1植物を与える。F1植物に由来するF2世代における植物集団を、変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現に関して(例えば、標準的な方法により、例えば、本明細書に記載のニコチンデメチラーゼに関するヌクレオチド配列情報に基づくプライマーを使用するPCRにより、ニコチンデメチラーゼ遺伝子の非存在によりニコチンデメチラーゼを発現しない植物が特定される)または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片の変異体発現に関してスクリーニングする。あるいは、植物アルカロイド含量を評価するための、当技術分野で公知の任意の標準的なスクリーニング法を用いて、ニコチンをノルニコチンへ変換しない植物を特定する。ついで、選択した植物を受容親と交雑させ、第1戻し交配(BC1)世代植物を自家受粉させてBC1F2集団を得、これを変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現(例えば、ニコチンでメチラーゼ遺伝子のヌル形態)に関して再びスクリーニングする。稔性であり受容親に合理的に類似した植物を最終スクリーニングが与えるまで、戻し交配、自家受粉およびスクリーニングの過程を例えば少なくとも4回繰返す。所望により、この植物を自家受粉させ、ついでその後代を再びスクリーニングして、該植物が変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現(例えば、ニコチンデメチラーゼに関してヌル状態を示す植物)または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片の変異体発現を示すことを確認する。所望により、染色体相補および染色体対合関係を確認するするために、選択した植物の細胞遺伝学的分析を行う。標準的な方法、例えば、圃場試験、ニコチンデメチラーゼに関するヌル状態または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片によりコードされるポリペプチドのヌルもしくは促進状態の確認、ならびに乾燥葉の化学的分析(アルカロイドのレベル、特にノルニコチンの含量およびノルニコチン/ニコチン + ノルニコチンの比、または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片において見出されるそれらの遺伝子配列によりもたらされる他のそのような所望の特性を測定するためのもの)を用いて、選択した植物の育種用種子を得る。
受容植物(例えば、N. rustica)と供与親(例えば、TN90)との間の交配から得られた元のF1雑種を該供与植物(例えば、TN90)と交雑または戻し交配させる場合には、この戻し交配の後代を自家受粉させてBC1F2世代を得、これを、ニコチンデメチラーゼのヌルもしくは異類形態または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片によりコードされるポリペプチドのヌルもしくは促進状態に関してスクリーニングする。育種操作のその他の点については、前段落で説明したとおりである。
C.農業上の特性の試験および表現型の確認
該育種および変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現(例えば、ニコチンデメチラーゼに関するヌル状態、または図1、3〜7、10〜158、162〜170、172-1〜172-19および173-1〜173-294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片のヌル状態)に関するスクリーニングから得られた系統を、標準的な圃場法を用いて圃場において評価する。元の受容親(例えば、TN90)を含む対照遺伝子型を加え、登録体を、完全無作為ブロック設計または他の適当な圃場設計において圃場に配置する。タバコのための標準的な農業的実施を行い、例えば、該タバコを収穫し、秤量し、乾燥(キュアリング)の前および途中に化学的および他の一般的な試験のためにサンプル化する。選択された系統の、受容植物(例えば、親系統TN90)に対する類似性を確認するために、データの統計解析を行う。
栽培タバコへの修飾属性の交配(育種)または移入
本明細書に記載の任意の遺伝子、例えば図1、図3〜7、図10〜158、図162〜170、図172-1〜172-19および図173-1〜173-294に示す任意の核酸配列の発現を本明細書に記載の方法により修飾することも可能である。そのような遺伝子は、植物の表現型を修飾するための、例えば香味または芳香またはそれらの両方を改良するための、感覚刺激特性を改良するための、または乾燥性を改良するための基礎となる。ついで、修飾された表現型を有すると特定された植物を、当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、本明細書に記載の方法)による育種プロトコールにおいて使用する。
雑種植物の作製
プロトプラスト融合を用いる、雑種植物の生産のために開発された標準的なプロトプラスト培養法の適用も、変異体遺伝子発現(例えば、変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現)を有する植物を作製するために有用である。したがって、変異体遺伝子発現を有する第1および第2タバコ植物からプロトプラストを作製する。成功裏に得られたプロトプラスト融合体からカルスを培養し、ついで植物を再生させる。生じた後代雑種植物を特定し、標準的な方法により、変異体遺伝子発現に関して選択し、所望により、任意の標準的な育種プロトコールにおいて使用することが可能である。
WO 03/078577、WO 2004/035745、PCT/US/2004/034218およびPCT/US/2004/034065ならびに本明細書中で言及されている全ての他の参考文献、特許、特許出願公開および特許出願を、これらの参考文献、特許、特許出願公開および特許出願のそれぞれが参照により本明細書中に個別に組み入れられている場合と同等に、参照により本明細書に組み入れることとする。
本発明の前記の詳細な説明を考慮すれば、本発明の実施における多数の修飾および変更が当業者に見出されると予想される。したがって、そのような修飾および変更も特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。