JP5284958B2

JP5284958B2 - 前立腺癌と良性前立腺肥大症とを識別する方法

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Inventors: 純子天野; 清子平野; 一路杉本
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Description

本発明は、前立腺癌と良性前立腺肥大症とを識別する新規な方法に関する。より詳細には、本発明は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の糖鎖構造の差異に基いて、前立腺癌と良性前立腺肥大症とを識別する新規な方法に関する。

前立腺癌（prostate carcinoma：以下「ＰＣ」と称する）は男性の主要な死亡原因の１つである。前立腺特異抗原（prostate specific antigen：以下「ＰＳＡ」と称する）はＰＣに対する最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている（たとえば、非特許文献1参照）。ＰＳＡは、約２６ｋＤａの分子量を有する２３７個のアミノ酸残基からなるタンパク部分と、該タンパク部分のアミノ酸残基（たとえばＡｓｎ^４５など）に結合した糖鎖部分とから構成される約３０ｋＤａの分子量を有する糖タンパク、またはその誘導体もしくは類似体である。糖鎖部分は、ＰＳＡの分子量の約８％を示す。ＰＣの初期診断に対する血清ＰＳＡ試験の有用性は既に多くの文献に記載されているが、良性前立腺肥大症（benign prostatic hyperplasia：以下「ＢＰＨ」と称する）に罹患している男性とＰＣに罹患している男性との間に、グレーゾーン（gray zone）と呼ばれるＰＣまたはＢＰＨの何れとも判断できない領域がある（たとえば、非特許文献２参照）。この問題を解決するために、これまでにいくつかの試み（たとえば、ＰＳＡ密度、ＰＳＡ勾配（年間増加度）、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡの比などによる識別）が実施されてきたが、２つの病変（lesions）の間にはかなり重複する点がある。

最近、コンカナバリンＡ、植物凝集素Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）およびＰＨＡ−Ｌ４を用いた連続的レクチンアフィニティークロマトグラフィー法を用いた研究において、ＰＳＡのアスパラギン（Ｎ）に結合する糖鎖の構造が、ＰＣ組織とＢＰＨ組織との間で相違するという結果が報告された（非特許文献３参照）。この報告は、ＰＳＡ中のＮ−結合糖鎖がヒト前立腺における癌化の過程で変化すること、ならびにＰＳＡ中のＮ−結合糖鎖がＰＣの診断ツールとして役立つ可能性があることを記載している。

ＰＳＡの構造を検出する方法として、ＰＳＡの糖鎖に結合する結合分子を用いるいくつかの免疫学的方法が提案されてきている。たとえば、ＰＳＡをレクチンと接触させ、ＰＳＡの糖鎖とレクチンとの親和性に基づいて分別されたＰＳＡを測定することによって、ＰＣとＢＰＨとを識別する方法が報告されている（特許文献１参照）。この報告において、ＰＳＡの糖鎖とレクチン（イヌエンジュ(Maackia amurensis)レクチンなど）との親和性の差異は、糖鎖末端のシアル酸のコンフォメーションに基づくと記載されている。しかしながら、ＰＣまたはＢＰＨに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖の具体的構造を決定していない。また、ＰＳＡ糖鎖に対するフコース付加に関しては、ＰＣおよびＢＰＨ間で相違を見いだしていない。

また、ＰＳＡ中に少なくとも三分岐の糖鎖が存在するかどうかに基づいてＰＣを検定する方法が報告されている（特許文献２参照）。この方法においては、少なくとも三分岐の糖鎖に結合するが、一分岐および二分岐の糖鎖とは結合しない結合分子を用いる。用いることができる結合分子は、レクチン（ＰＨＡ−Ｌなど）および抗体を含む。

別のアプローチとして、ＰＳＡ糖鎖中のフコースに注目したいくつかの報告がなされている。たとえば、ＰＳＡ糖鎖中のフコースの含有量を測定し、該含有量が異常に増加している際にＰＣと診断する方法が提案されている（特許文献３参照）。

あるいはまた、ＰＳＡを含む標的糖タンパク質の糖鎖の糖プロファイルを決定することにより、被験者の臨床状態を評価する方法が提案されている（特許文献４参照）。該文献は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を用いた解析において、ＰＣに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖が、正常なＰＳＡ糖鎖とは異なるフコシル化構造を有することを記載している。しかしながら、ＰＣに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖の具体的構造を記載していない。

さらに、ＰＳＡ中のフコース結合糖鎖およびフコース非結合糖鎖の含有量に注目した報告がなされている（非特許文献４参照）。該報告は、顕著に高い血清中のＰＳＡ濃度（１．８μｇ／ｍＬ）を有する被験者の１例のみのＰＳＡ糖鎖構造をＨＰＬＣにて解析し、フコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖の含有量の比が５．２５（８４／１６）であることを記載している。一方で、さらに高濃度の血清ＰＳＡ濃度（１０μｇ／ｍＬ以上）を有するＰＣに罹患している被験者２名の血清ＰＳＡから調製された糖ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳによる解析が発表されている（非特許文献１１参照）。ここで、フコース結合糖鎖の含有量はそれぞれ１００％及び６４％を示し、フコース結合糖鎖の方がフコース非結合糖鎖に比べて多いと発表されている。

しかしながら、ＢＰＨに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖の構造は未だ解明されておらず、ＰＳＡ糖鎖の具体的な構造に基づいてＢＰＨとＰＣとを識別することは、これまでなされていない。

特開２００２−５５１０８号公報特表２０００−５１４９１９号公報英国特許出願公開第２３６１０６０号明細書特表２００６−５１５９２７号公報 Stamey他, N. Engl. J. Med., 317, 909-916 (1987) Catalona他, j. Am. Med. Assoc, 279, 1542-1547 (1998) Sumi他, J. Chromatogr. B, 727, 9-14 (1994) Tabares他, Glycobiology, 16(2), 132-145 (2006) Peter他, Anal. Biochem., 273(1), 98-104 (1999) Kawinski他, Prostate, 50(3):145-153 (2002) Bindukumar他, J. Chromatogr. B, Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci., 813(1-2), 113-120 (2004) Zhang他, Clin. Chem., 41(11), 1567-1573 (1995) Okada他, Biochim. Biophys. Acta, 1525(1-2), 149-160 (2001) Peracaula他, Glycobiology, 13(6), 457-470 (2003) Tajiri他, Glycobiology Advance Access published October 23, 2007 <http://glycob.oxfordjournals.org/cgi/reprint/cwm117v1>

したがって、本発明の課題は、ＢＰＨまたはＰＣに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖の具体的な構造を決定することにより、ＰＳＡの糖鎖構造に基づいてＢＰＨとＰＣとを的確に識別する方法を提供することである。

本発明に係るＰＣとＢＰＨとの識別方法は、（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する工程とを含み、該標識化ＰＳＡ誘導体中のフコース非結合糖鎖のシグナル強度とフコース結合糖鎖のシグナル強度との比が１．０を越える際に前立腺癌であると識別し、１．０以下である際に良性前立腺肥大症であると識別することを特徴とする。ここで、工程（２）で調製されるＰＳＡ誘導体は、ＰＳＡ由来の糖鎖または糖ペプチドであってもよい。

以上のような工程を採ることによって、血清中ＰＳＡ濃度がほぼ同レベルの被験者についても、そのＰＳＡ糖鎖中のフコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖とのシグナル強度比Ｒを測定することによって、ＰＣとＢＰＨとを高精度で識別できる。また、ＰＣおよびＢＰＨの両方において、フコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖のシグナル強度比Ｒは血清ＰＳＡ濃度とは全く相関がなく、ＰＣにおいてはＲは１．０より大きく、ＢＰＨにおいてはＲは１．０以下である。

したがって、現行のＰＣのスクリーニングに繁用されている血清中ＰＳＡ濃度を測定する方法において高いＰＳＡ値（４ｎｇ／ｍＬ以上）を示し、苦痛な２次検査である針生検を受けていた被験者についても、本発明を適用することによって不必要な検査を回避することができる。また、年齢とともに血清中ＰＳＡ濃度が上昇することが知られている。よって、特に高齢化社会において、本発明の方法によって高精度でＰＣとＢＰＨとを識別することは、医学に貢献するのみならず、医療経済にも良好な効果を奏する。

図１は、実施例１で得られたネガティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。図２は、実施例１において、ｍ／ｚ＝２０７７のピークＰ_２Ａをプリカーサーイオンとして得られるネガティブイオンＭＳ^２スペクトルを示す図である。図３は、実施例１において、ｍ／ｚ＝１９３１のピークＰ_２Ｂをプリカーサーイオンとして得られるネガティブイオンＭＳ^２スペクトルを示す図である。図４は、実施例１５で得られたネガティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。図５は、実施例１７で得られたポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。図６は、実施例２０で得られたポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。図７Ａは、実施例２１で得られた、ＰＳＡ由来の糖ペプチドのポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。図７Ｂは、実施例２１で得られた、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体由来の糖ペプチドのポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。図８は、実施例２２で得られたポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。

本発明に係るＰＣとＢＰＨとの識別方法は、（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する工程とを含み、該標識化ＰＳＡ誘導体中のフコース結合糖鎖のシグナル強度とフコース非結合糖鎖のシグナル強度との比が１．０を越える際に前立腺癌であると識別し、１．０以下である際に良性前立腺肥大症であると識別することを特徴とする。

工程（１）において、被験者由来の試料から、ＰＳＡを精製する。工程（１）において用いられる被験者由来の試料は、血液（血清および血漿を含む）、尿、および***（精漿）などの体液、および前立腺細胞を含む。好ましくは、試料は血清である。工程（１）は、当該技術において知られている任意の方法で実施することができる。

たとえば、工程（１）において被験者由来の血清を試料として用いる場合、磁性ビーズを用いた免疫沈降法を用いてＰＳＡの精製を行うことができる（非特許文献５参照）。たとえば、（ａ）ストレプトアビジン被覆された磁性ビーズにビオチン化ジゴキシゲニン抗体を結合させた抗体磁性ビーズを作製し、（ｂ）抗体磁性ビーズに対してジゴキシゲニン標識されたＰＳＡ抗体を添加してインキュベーションを行い、（ｃ）被験者由来の血清を添加して免疫沈降を行う。次いで、ジゴキシゲニンリジン塩酸塩を加えて、沈降させた抗体磁性ビーズに結合した化合物を溶出させ、次いでドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてＰＳＡを分離し、ＰＳＡ由来ペプチドを得る。前述の文献によれば、得られたＰＳＡ由来ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法による解析を行うために、被験者由来の試料中に約７．６μｇのＰＳＡが必要であった。

あるいはまた、工程（１）において被験者由来の血清を試料として用いる場合、数種のアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせた方法を用いることができる。たとえば、被験者由来の血清に対して、親イオウ吸着に基づくアフィニティークロマトグラフィー（フラクトゲル(Fractogel)（登録商標） EMD TA）、アフィニティークロマトグラフィー（Cibacron Blue 3GA）、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡセファロースCL-4B）、およびアフィニティークロマトグラフィー（HiTrapヘパリンカラムＨＰＬＣ）を行う（非特許文献４参照）。得られた溶離液をエタノールアミンで処理して、遊離のＰＳＡを得る。遊離のＰＳＡを前述の免疫沈降法を用いて処理し、ＰＳＡ誘導体を得る。前述の文献によれば、得られたＰＳＡ誘導体の解析を行うために、被験者由来の試料中に約６３μｇのＰＳＡが必要であった。

さらに、工程（１）における試料として被験者由来の血清を用いる場合、１工程の親イオウ吸着に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＰＳＡの精製を実施することができる（非特許文献６参照）。たとえば、3S, T-gelスラリー（フラクトゲル（登録商標） EMD TA）を用いるクロマトグラフィーによって、ヒト***、前立腺癌患者の血清、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）培養液の上清からＰＳＡを精製し、ウェスタンブロット法を用いて、遊離形態またはα１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）等との複合体状態を同定することができる。あるいはまた、被験者由来の***を試料として用いる場合、親イオウ吸着に基づくアフィニティークロマトグラフィーとゲル濾過を組み合わせることによって、ＰＳＡを精製してもよい（非特許文献７参照）。たとえば、親イオウ吸着に基づくアフィニティークロマトグラフィー（フラクトゲル（登録商標） TA 650(S)）と、ゲル濾過（Ultrogel AcA-54）とを組み合わせることができる。この組み合わせ方法では、遊離のＰＳＡを７２％の収率で回収することができた。

あるいはまた、工程（１）における試料として被験者由来の***を用いる場合、以下の方法を用いてＰＳＡの精製を行うことができる（非特許文献８および９参照）。たとえば、硫酸アンモニウムの添加による沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Phenyl-Sepharose-HPカラム）、ゲル濾過（Sephacryl S-200カラム）、およびアニオン交換クロマトグラフィー（Resourse Qカラム）を順次行うことによって、ＰＳＡを精製することができる。この方法において、試料中に３３．９ｍｇのＰＳＡが含まれる場合、最終的なＰＳＡの回収率が３０．１％であったことが報告されている。

さらに、工程（１）における試料として被験者由来のアンドロゲン依存性のＬＮＣａＰを用いる場合、限外濾過と各種クロマトグラフィーとを組み合わせた方法によって、ＰＳＡを精製することができる（非特許文献１０参照）。たとえば、適切な手段で培養したＬＮＣａＰを含む培養液の限外濾過（５ｋＤａカットオフ・ポリスルホン膜(Millipore)）、アフィニティークロマトグラフィ（Cibacron Blue 3GA）、ゲル濾過（Biogel P60）、アフィニティークロマトグラフィ（Cibacron Blue 3GA）、および逆相クロマトグラフィー（214TP-RP C4、HPLC使用）を順次行うことによって、ＰＳＡを精製することができる。

次いで、工程（２）において、精製されたＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する。本発明における「ＰＳＡ誘導体」とは、ＰＳＡから分離される糖鎖および糖ペプチドを意味する。たとえば、ＰＳＡに対して、エンドプロテアーゼ（サーモリシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、プロリン特異的エンドペプチダーゼ、プロテアーゼＶ８，プロテイナーゼＫ、アミノペプチダーゼＭ，カルボキシペプチダーゼＢなど）またはペプチド結合開裂剤を作用させて糖ペプチドを形成し、糖ペプチドを工程（３）で使用してもよい。

別法として、ＰＳＡを酵素的に処理して遊離の糖鎖を形成してもよい。あるいはまた、ＰＳＡから誘導された前述の糖ペプチドを酵素的に処理して遊離の糖鎖を形成してもよい。このようにして得られた糖鎖を工程（３）で使用してもよい。この酵素的処理においては、たとえば、ペプチドＮ−グリカナーゼ（PNGase F、PNGase A）、エンドグリコシダーゼ（EndoH, EndoF）、および／または１つまたは複数のプロテアーゼ（トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃなど）を用いることができる。あるいはまた、ＰＳＡまたはＰＳＡから誘導された糖ペプチドを化学的手段（無水ヒドラジンによる分解、還元的または非還元的β−脱離など）を用いて処理して、遊離の糖鎖を形成してもよい。このようにして得られる遊離の糖鎖を、以下の工程（３）で使用してもよい。また、シアリダーゼ処理または酸加水分解を行なってシアル酸を除去した糖鎖および糖ペプチドを用いてもよい。

また、工程（１）の最終段階で電気泳動を行い、ＰＳＡのバンドを切り出した場合、切り出したバンドに対して上記の反応剤を作用させてゲル内消化を行い、糖ペプチドおよび／または糖鎖を生成してもよい。

工程（３）において、ＰＳＡ誘導体を標識する。標識化合物としては、ナフタレン、アントラセン、ピレンなどの縮合多環炭化水素部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、必要に応じて該縮合多環炭化水素部分と該反応性官能基とを連結するスぺーサー部分とを有する化合物を用いることができる。縮合多環炭化水素部分は、好ましくはピレンである。反応性官能基は、シアル酸のカルボキシ基または糖の還元末端との反応性を有し、たとえばジアゾメチル基、アミノ基、ヒドラジド基などを含む。スペーサー部分は、たとえば直鎖または分岐状のアルキレン基などを含む。本発明において用いることができる標識化合物は、１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ）、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（ＰＢＨ）、１−ピレン酢酸ヒドラジド、１−ピレンプロピオン酸ヒドラジド、アミノピレン（構造異性体を含む）、１−ピレンメチルアミン、１−ピレンプロピルアミン、１−ピレンブチルアミンなどを含む。最も好ましく用いられる標識化合物は、ＰＤＡＭである。

工程（３）は、ＰＳＡ誘導体および標識化合物を混合し、加熱することによって行うことができる。加熱は、たとえば４０〜５０℃の範囲内の温度で実施することができる。任意選択的に、水溶性カルボジイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの促進剤の存在下で、標識を行ってもよい。より好適には、ＭＡＬＤＩ法にて用いられるターゲットプレート上にＰＳＡ誘導体の溶液を滴下して乾燥させ、その上に標識化合物の溶液を滴下して加熱乾燥させることによって、標識を実施することができる。

工程（４）において、標識されたＰＳＡ誘導体を質量分析法（ＭＳ）により分析する。ＭＳにおいて用いることができるイオン化部は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）型、またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）型の装置を含む。本発明においては、ピレンなどの縮合多環炭化水素基を結合することによって、ＭＡＬＤＩ法における標識されたＰＳＡ誘導体のイオン化効率が、未標識のＰＳＡ誘導体と比較して向上する。また、本発明の標識されたＰＳＡ誘導体は、ＥＳＩ法の適用がより容易である。なぜなら、ＰＳＡ誘導体は親水性が高く、ＥＳＩ法に用いる試料の有機溶液を得るのが困難であるのに比較して、本発明の標識されたＰＳＡ誘導体は、縮合多環炭化水素基の導入によって有機溶媒に可溶性となっているためである。

ＭＳにおいて用いることができる分離部は、飛行時間型（ＴＯＦ型）、二重収束型、四重極収束型等の当該技術において知られている任意の装置を含む。特に、ＭＳ^ｎ（ｎ≧２）分析を行うことを考慮して、イオントラップを有する装置を用いることが便利である。特に好適な装置は、四重極イオントラップ−飛行時間型（ＱＩＴ−ＴＯＦ）である。ここで、飛行時間型装置として、リニア型、リフレクトロン型または周回型のいずれの装置を用いてもよい。

次いで、得られたＭＳスペクトルにおいて、フコースの有無に相当する分子量差１４６ＤａのピークＰ_１およびＰ_２の対を選定する。ここで、Ｐ_１はフコース結合糖鎖に相当するより大きな分子量のピークを意味し、Ｐ_２はフコース非結合糖鎖に相当するより小さな分子量のピークを意味する。そして、フコース結合糖鎖およびフコース非結合糖鎖に相当するピークのシグナル強度Ｓ（Ｐ_１）およびＳ（Ｐ_２）を求め、その比Ｒ＝Ｓ（Ｐ_２）／Ｓ（Ｐ_１）を計算する。得られたＲが１より大きい場合、被験者がＰＣに罹患していると識別し、得られたＲが１以下である場合、被験者がＢＰＨに罹患していると識別する。本工程において得られるＭＳスペクトルにおいて、分子量差１４６Ｄａの複数のピーク対を選定して、上記の識別手順を実施してもよい。あるいはまた、標識化合物および／またはシアル酸残基などが質量分析装置中で脱離したピークで、分子量差１４６Ｄａのピーク対を選定し、上記の識別手順を実施してもよい。

（実施例１）
（ａ）工程１ＰＳＡの単離
最初に血清中の免疫グロブリンの除去を行った。４ｍＬのプロテインＡアガロース(PIERCE)をディスポーザブルプラスティックカラム(PIERCE)に充填し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて平衡化した。プロテインＡアガロース充填カラムに対して、ＢＰＨと診断された被験者（Ｔ−１３）の血清およびＰＢＳの混合物を添加し、２倍のカラムボリューム（ＣＶ）のＰＢＳにて洗浄した。この担体に結合しないＰＳＡを含む画分を採取し、最終濃度が１ＭになるようにＮａ_２ＳＯ_４を加えた。

次に、血清中の主要タンパクであるアルブミンの除去を行った。１ｍＬのフラクトゲル（商標） EMD TA(S)(Merck)をディスポーザブルプラスティックカラムに充填し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４（１Ｍ）含有）にて平衡化させた。フラクトゲル充填カラムに対して上述のＰＳＡを含む画分を添加し、送液ポンプを用いて７ＣＶの同緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、吸着したタンパクを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４不含）にて溶出し、ＰＳＡを含む画分を得た。

次に、血清中のＰＳＡとα_１−アンチキモトリプシンとの複合体（ＰＳＡ−ＡＣＴ）から、ＰＳＡを遊離させた。前述のＰＳＡを含む画分に同量の４Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ１０．５）を加え、最終のエタノールアミン濃度を２Ｍとし、２５℃において１４時間にわたって振盪して、反応させた。その後、反応混合物を氷浴で冷却しながら、２Ｍの塩酸を加え、反応混合物を中和した。

次に、ＰＳＡ抗体を用いた免疫沈降を行った。最初に、ダイナビーズ（登録商標）プロテインＧ(Invitrogen)に対して市販の抗ヒトＰＳＡ・ウサギポリクローナル抗体(DAKO社製)を結合させ、続いてジメチルピメルイミデート（ＤＭＰ、PIERCE）を用いて処理して抗体と磁気ビーズを架橋させて、抗体磁気ビーズを得た。前述の中和された反応混合物に対して、ＰＳＡ抗体磁気ビーズを添加し、４℃にて１時間にわたって振盪した。続いて、ＰＳＡ抗体磁気ビーズを、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回、およびＰＢＳで１回洗浄した。さらに、ＰＳＡ抗体磁気ビーズに１Ｍプロピオン酸を加え、４℃にて４０分間にわたって振盪し、ＰＳＡ抗体磁気ビーズに吸着したタンパクを溶出させて回収した。溶出したタンパクを遠心式濃縮機（SpeedVac）を用いて乾固させた。

乾固させたタンパクを、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ、栄研化学）および電気泳動にて分析した結果、最初の血清中に含まれていたＰＳＡの約５０％を回収できることが判明した。以上の工程は２日以内に完了することができ、簡便かつ迅速な工程でありながら、高収率である。

０．１２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）に対して、１０％のメルカプトエタノール、４％のＳＤＳ、１０％のショ糖、０．００４％のブロモフェノールブルーを添加して、サンプルバッファーを調製した。２０μＬのサンプルバッファーに対して工程１で精製したＰＳＡを添加し、３分間にわたって１００℃に加熱し、そして氷浴中に静置して冷却した。得られたサンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動による分離した。電気泳動による分離後、ポリアクリルアミドゲルを純水で軽く洗浄し、引き続いてSYPRO（登録商標） Ruby (Invitrogen)による染色を行なった。染色されたタンパク質を含むゲルを切り出し、１．５ｍＬチューブに移した。切り出したゲルを純水、５０％アセトニトリル水溶液、およびアセトニトリルを用いて順次洗浄し、そしてゲルを乾燥させた。

また、別途、４〜１０ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ濃度を有する血清１ｍＬを用いて上記の手順を繰り返したところ、ウエスタンブロットにてＰＳＡのバンドが強く観察された。この結果から、このように低い濃度のＰＳＡであっても、前述の方法によって効率よく精製することが可能であることが証明された。

（ｂ）工程２糖鎖（ＰＳＡ誘導体）の調製
工程（ａ）で得られた乾燥ゲルの入ったチューブに対して、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）および２５ｍＭの炭酸水素アンモニウムを含む水溶液（ｐＨ８．０）を加え、遮光条件下１時間にわたって５６℃で振盪して還元反応を行い、チューブ内の溶液を除去した。チューブに対して５５ｍＭのヨードアセトアミドを含む水溶液を加えて、遮光条件下４５分間にわたって室温で振盪してアルキル化反応を行い、チューブ内の溶液を除去した。還元およびアルキル化を行ったゲルを、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）、およびアセトニトリルで洗浄し、その後、ゲルを乾燥させた。

上記により得られたゲルに、リシルエンドペプチダーゼ（登録商標）溶液（２５０ｎｇ、和光純薬（質量分析グレード）、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を加えて、４５分間にわたって氷中で静置し、ゲルを膨潤させた。その後、１８時間にわたって３７℃において、反応混合物を緩やかに撹拌した。７５％アセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）を加えて２０分間にわたって振盪して抽出を行い、溶液を回収した。

回収した溶液を遠心式濃縮機によって乾固させた。残渣に対して、１μｇのフェタブロックＳＣ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を加え、引き続いて１単位（１単位／μＬ）のペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（Sigma）を加えて、１８時間にわたって３７℃で振盪した。振盪終了後、反応混合物に１μＬのトリフルオロ酢酸１％水溶液を添加した。オクタデシル（Ｃ１８）シリカ担体が充填されたＣ１８チップを用いた反応混合物の吸引および排出を繰り返して、ペプチドを吸着させて反応混合物中の糖鎖と分離し、糖鎖画分を得た。続いて、７０％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を用いてＣ１８チップからペプチドを溶出させて、ペプチド画分を得た。得られたペプチド画分からは、ＰＳＡに由来するペプチドが検出された。

マイクロスピンカラムに３０ｍｇのカーボングラファイト（ＧＬサイエンス）を充填して洗浄した。グラファイト充填マイクロスピンカラムに対して糖鎖画分を加え、さらに洗浄液として５％アセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸）を加え、遠心分離（３００×ｇ、１分〜２分）により洗浄した。洗浄液を除去した後に、５０％アセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸）を加え、遠心分離（３００×ｇ、１分〜２分）を行い、糖鎖を溶出させ、糖鎖溶出液を得た。回収した糖鎖溶出液を遠心式濃縮機を用いて乾固させ、２μＬの純水に再溶解させて、糖鎖溶液を得た。

（ｃ）工程３糖鎖（ＰＳＡ誘導体）の標識
ＭＡＬＤＩ用ターゲットプレートの上に、工程２で得られた糖鎖溶液０．５μＬを滴下し、風乾させた。次に、ターゲットプレート上に、１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ、５００ｐｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、約２５分間にわたって４０℃に加熱し、乾燥させた。この操作によって、ターゲットプレート上に、ＰＤＡＭで標識された糖鎖が得られた。

（ｄ）工程４ＭＳ分析
工程３で得られた標識糖鎖を担持したターゲットプレートに対して、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）の５０％アセトニトリル溶液（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬを滴下し、室温において乾燥させた。

得られたターゲットプレートをＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ装置ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ（島津製作所／Kratos社製）に設置し、ＭＳ分析を行った。定量的な比較を行うために、ターゲットプレート上の試料の広がりよりも大きい外周で囲まれた領域をラスタースキャンし、有意な全シグナルを積算した。得られたＭＳスペクトルの代表例を図１に示す。

別途、種々のイオンをプリカーサーイオンとして用いたＭＳ^２分析を行った結果、図１中のｍ／ｚ＝２５８２のピークＰ_１Ａが式Ａに示すフコース結合糖鎖に相当し、ｍ／ｚ＝２４３６のピークＰ_２Ａが式Ｂに示すフコース非結合糖鎖に相当することが判明した。なお、式中の「Pyrene」は、ＰＤＡＭによるピレン標識部（１−ピレニルメチル基）を示し、左中括弧(open brace)は、左側に示した部分構造が、右側に示した部分構造のいずれかに結合していることを示す。また、式中、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を示し、Ｇａｌはガラクトースを示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを示し、Ｆｕｃはフコースを示し、およびＭａｎはマンノースを示す。

ピークＰ_１ＡおよびＰ_２Ａのシグナル強度Ｓ（Ｐ_１Ａ）およびＳ（Ｐ_２Ａ）を求め、その比Ｒ＝Ｓ（Ｐ_２Ａ）／Ｓ（Ｐ_１Ａ）を計算して、Ｒ＝０．６９という数値が得られた。

図1中のｍ／ｚ＝２０７７のピークＰ_２Ａをプリカーサーイオンとして得られるＭＳ^２スペクトルを図２に示す。ピークＰ_２Ａのイオンは、Ｎ−アセチルノイラミン酸およびフコースが１個ずつ結合した２本鎖構造を有することが推定された。さらに、以下の考察に基づいて、それらの付加位置を決定した。図２のスペクトルにおいて、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃが遊離したｍ／ｚ＝１７０９のピークが検出されたが、ＧｌｃＮＡｃのみが遊離したｍ／ｚ＝１８５６のピークが検出できなかったことから、フコースは還元末端のＧｌｃＮＡｃに結合していることが分かった。また、図２のスペクトルにおいて、Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃに相当するｍ／ｚ＝６５５のピーク、およびＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎに相当するｍ／ｚ＝８１７のピークなどが検出されたことから、Ｎ−アセチルノイラミン酸は、非還元末端に結合していることが分かった。さらに、ＤイオンであるＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−Ｍａｎに相当するｍ／ｚ＝９６１のピークが検出されたことから、Ｍａｎの６位側の分岐構造にＮ−アセチルノイラミン酸が結合する異性体が存在することも明らかとなった。加えて、ｍ／ｚ＝１３１６、ｍ／ｚ＝１１１３、およびｍ／ｚ＝７９９などのピーク群を検出したことにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸がα２−６結合している異性体（式Cに示す構造）と、Ｎ−アセチルノイラミン酸がα２−３結合している異性体（式Dに示す構造）とが混在していることが判明した。

図1中のｍ／ｚ＝１９３１のピークＰ_２Ｂをプリカーサーイオンとして得られるＭＳ^２スペクトルを図３に示す。ピークＰ_２Ｂのイオンは、フコースを持たず、Ｎ−アセチルノイラミン酸が１個結合した２本差構造を有することが推定された。ＤイオンであるＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−Ｍａｎに相当するｍ／ｚ＝９６１のピークがほとんど検出され無いことから、Ｍａｎの３位側の分岐構造にＮ−アセチルノイラミン酸が結合する異性体が主であることが分かった。また、ｍ／ｚ＝１３１６およびｍ／ｚ＝７９９などのピーク群に代ってｍ／ｚ＝８３５のピークが顕著に検出されたことから、Ｎ−アセチルノイラミン酸がα２−３結合している異性体（式Ｆに示す構造）と、Ｎ−アセチルノイラミン酸がα２−６結合している異性体（式Ｅに示す構造）が主であることが解明できた。

加えて、式Ａ〜Ｆに示した構造の他に、Ｇａｌ残基がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基に置換されている構造も検出された。

このように、本発明の方法により、ＢＰＨ患者由来の血清ＰＳＡの糖鎖構造の詳細が初めて明らかとなった。

（実施例２〜１６）
ＢＰＨと診断され、匿名化され識別コードを付した３名の被験者の血清（実施例２〜４）、ならびに生検によりＰＣと診断され、匿名化され識別コードを付した１２名の被験者の血清（実施例５〜１６）を用いて、実施例１の手順を繰り返した。なお、医療機関の倫理審査を受け承認され、被験者には説明をし同意を得ている。

それぞれの被験者の血清中ＰＳＡ濃度およびフコース非結合糖鎖（ｍ／ｚ＝２４３６）／フコース結合糖鎖（ｍ／ｚ＝２５８２）のシグナル強度比Ｒを、以下の第１表に示す。また、ピレン標識部および１つのＮ−アセチルノイラミン酸残基が脱離したフコース非結合糖鎖（ｍ／ｚ＝１９３１）／フコース結合糖鎖（ｍ／ｚ＝２０７７）のシグナル強度比も同様のＲ値を示した。

ＰＣと診断された被験者の血清を用いた場合の代表例として、実施例１で用いた血清と同程度の血清中ＰＳＡ濃度を有する血清を用いた実施例１５で得られたＭＳスペクトルを図４に示す。実施例１と同様の手順によるＭＳ^２分析によって、実施例１５においても式Ａ〜Ｆに示した構造を有する糖鎖の存在が確認された。

加えて、式Ａ〜Ｆに示した構造の他に、Ｇａｌ残基がＧａｌＮＡｃ残基に置換されている構造も検出された。また、ＰＣと診断された被験者の血清からは、２本鎖構造の糖鎖に加えて、より高度に分岐した３本鎖および４本鎖の糖鎖も検出された。さらに、２本鎖、３本鎖および４本鎖の糖鎖のいずれにおいても、Ｇａｌ残基がＧａｌＮＡｃ残基に置換されている構造も検出された。

（評価）
表１に示したように、ＰＣと診断された被験者の血清に由来する試料は、１．０より大きいフコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖のシグナル強度比Ｒを示し、フコース非結合糖鎖を多く含有することを見出した。それに対して、ＢＰＨと診断された被験者の血清に由来する試料のシグナル強度比Ｒは１．０以下であった。すなわち、ＢＰＨと診断された被験者の血清中には、フコース結合糖鎖がフコース非結合糖鎖よりも多く存在することが初めて明らかになった。

さらに、実施例２〜４および９〜１０の比較、ならびに実施例１と実施例１４との比較から明らかなように、血清中ＰＳＡ濃度がほぼ同レベルの試料であっても、そのＰＳＡ上の糖鎖中のフコース非結合糖鎖およびフコース結合糖鎖の量の関係は、ＰＣの場合とＢＰＨの場合とでは全く異なるという結果を見出した。

さらに、驚くべきことに、ＰＣにおいてもＢＰＨにおいても、フコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖のシグナル強度比Ｒは血清ＰＳＡ濃度とは全く相関がないことが見いだされた。この結果は、本発明の方法が、ＰＳＡ濃度に依存することなしにＰＣとＢＰＨとを精度よく区別できることを示している。したがって、本発明の方法は、１〜１２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４〜５０ｎｇ／ｍＬの血清中ＰＳＡ濃度の範囲の試料に適用できる。特に、グレーゾーンと呼ばれる血清中ＰＳＡ濃度の範囲（４〜１０ｎｇ／ｍＬ）においてさえ、本発明の方法は高精度でのＰＣとＢＰＨとの区別に有効である。

（実施例１７）
本実施例は、前述の実施例における糖鎖に代えて糖ペプチドを用いることができることを示す例である。

標準品ＰＳＡ（CHEMICON）を用いて、実施例１の工程１に記載の第５の段階の電気泳動、および工程２に記載のＤＴＴによる還元、ヨードアセトアミドによるアルキル化、洗浄および乾燥の工程を実施し、乾燥ゲルを得た。この時、工程２記載のＤＴＴによる還元およびヨードアセトアミドによるアルキル化を行なわなくてもよい。

次に、乾燥ゲルに対して、１〜１００単位のサーモリシン（Calbio Chem）の２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を加えて、４５分間にわたって氷浴中で静置して、ゲルを膨潤させた。膨潤したゲルを１８時間にわたって５６℃で軽く攪拌した。ゲルに対して、抽出液（７０〜８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液）を加えて２０分間にわたって振盪し、溶液を回収した。

洗浄した２５ｍｇのZIC（登録商標）HILIC固相カラム充填剤（SeQuant）に対して、回収した溶液を加えた。続いて、８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液を加えて洗浄し、そして０．１％トリフルオロ酢酸の水溶液を用いて糖ペプチドを溶出させた。糖ペプチド溶出液を遠心式濃縮機によって乾固させ、次いで固形物を２μＬの純水に溶解させて糖ペプチド溶液を得た。

得られた糖ペプチド溶液に対して実施例１の工程３と同様の手順を適用して、糖ペプチドの標識を行った。次いで、得られたターゲットプレートに対して実施例１の工程４の手順を適用して、ＭＳ分析を行った。ＭＳ分析によって、ＰＳＡ由来のペプチド４３−４７に糖鎖が結合した糖ペプチドが検出された。得られたＭＳスペクトルを図５に示した。図５に示すように、フコースの有無に対応する１４６Ｄａの分子量差を有する、４つのフコース結合糖ペプチド（Ｐ_１）およびフコース非結合糖ペプチド（Ｐ_２）の対が見いだされた。

Ｐ_１Ａ（ｍ／ｚ＝２８９１．２）／Ｐ_２Ａ（ｍ／ｚ＝２７４５．２）
Ｐ_１Ｂ（ｍ／ｚ＝２６７７．２）／Ｐ_２Ｂ（ｍ／ｚ＝２５３１．２）
Ｐ_１Ｃ（ｍ／ｚ＝２４２７．１）／Ｐ_２Ｃ（ｍ／ｚ＝２２８１．０）
Ｐ_１Ｄ（ｍ／ｚ＝２３８６．１）／Ｐ_２Ｄ（ｍ／ｚ＝２２４０．０）

いずれの対においても、フコース非結合糖ペプチド／フコース結合糖ペプチドのシグナル強度比Ｒ’が１．０以下であった。また、本実施例で用いた標準品ＰＳＡに対して実施例１の工程１に記載の第５の段階の電気泳動、および工程２〜４と同様の手順を適用して糖鎖構造を解析した。得られたフコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖のシグナル強度比Ｒは１．０以下であった。

以上のように、ＰＳＡ誘導体として糖ペプチドを用いた場合であっても、標識後のＭＳ分析において、フコースの有無に相当する１４６Ｄａの分子量差を有するフコース非結合糖ペプチドおよびフコース結合糖ペプチドのピーク対を検出することができた。さらに、糖ペプチドのピーク対のシグナル強度比Ｒ’は、糖鎖のピーク対のシグナル強度比Ｒと同様の結果を示した。したがって、実施例１〜１６に示したフコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖のシグナル強度比Ｒと同様に、フコース非結合糖ペプチド／フコース結合糖ペプチドのシグナル強度比Ｒ’を求めることによって、ＰＣとＢＰＨとを高精度で区別することが可能であると考えられる。

また、糖ペプチドを用いる場合、糖鎖にペプチドが結合していることによって、ＰＳＡの同定および糖鎖付加位置の確認が可能となる。このことによって、他の糖タンパク質が混在する場合であっても、フコース非結合糖ペプチド／フコース結合糖ペプチドのシグナル強度比Ｒ’を正確に求めることが可能となる。

（実施例１８）
サーモリシンの炭酸水素アンモニウム水溶液に代えて、２００ｎｇのエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭのＤＴＴ、および０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する）を用い、ゲル内消化の反応温度を３７℃に変更したことを除いて、実施例９の手順を反復した。

ＭＳ分析において、ＰＳＡ由来のペプチド４５−５３に糖鎖が結合した糖ペプチドが検出された。実施例１７と同様にフコースの有無に相当する１４６Ｄａの分子量差を有するフコース非結合糖ペプチド／フコース結合糖ペプチドのピーク対を検出することができた。

（実施例１９）
ＢＰＨまたはＰＣに罹患している患者の血清から、実施例１にしたがって工程１を実施してＰＳＡを精製し、その後、実施例１７または１８の手順にしたがって工程２を実施することによって、糖ペプチドを調製することができる。さらに実施例１７または１８の手順にしたがって工程３および４を実施することによって、フコースの有無に相当する１４６Ｄａの分子量差を有するフコース非結合糖ペプチド／フコース結合糖ペプチドのピーク対を検出することができる。

（実施例２０）
実際にＰＣに罹患している患者（Ｎ-46、ＰＳＡ濃度１．６μｇ／ｍＬ）の血清をもちいて、実施例１７の手順にしたがって、ゲル内でサーモリシン処理を行なった。ゲル抽出液を遠心式濃縮機によって乾固させた。得られた固形物を０．８％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、８０℃、３０分にわたって静置し、脱シアル酸化反応を行った。脱シアル酸化されたサンプルを遠心式濃縮機によって乾固させた。得られた固形物を５％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液に溶解した。オクタデシル（Ｃ１８）シリカが充填されたＣ１８チップを用いた反応混合物の吸引および排出を繰り返して、ペプチドを吸着させて糖ペプチド画分を得た。得られた糖ペプチド画分にアセトニトリルを加えて、アセトニトリルの最終濃度を８０％になるように調整し、ZIC（登録商標）HILIC固相カラム充填剤（SeQuant）による精製、引き続き工程３および４を実施例１７と同様に行なった。その結果、得られたＭＳスペクトルを図６に示す。フコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖のシグナル強度比は確かに１．０より大きい値を示した。この結果は、糖鎖解析の結果と一致していた。

（実施例２１）
実施例１の工程１に記載のＰＳＡ単離、および工程２に記載のＤＴＴによる還元、ヨードアセトアミドによるアルキル化の工程を実施せずに、市販品ＰＳＡ（CHEMICON）５０ｎｇまたはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体（CORTEX BIOCHEM）５０ｎｇに対して、１０単位のサーモリシン（Calbio）の２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を直接加えて、１８時間にわたって５６℃で静置反応させた。

サーモリシン消化された溶液を遠心式濃縮機によって乾固させた。得られた固形物を０．８％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、８０℃、３０分にわたって静置し、脱シアル酸化反応を行った。脱シアル酸化されたサンプルを遠心式濃縮機によって乾固させた。得られた固形物を５％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液に溶解した。オクタデシル（Ｃ１８）シリカが充填されたＣ１８チップを用いた反応混合物の吸引および排出を繰り返して、ペプチドを吸着させて反応混合物中の糖ペプチドと分離し、糖ペプチド画分を得た。得られた糖ペプチド画分にアセトニトリルを加えて、アセトニトリルの最終濃度を８０％になるように調整した。洗浄した２５ｍｇのZIC（登録商標）HILIC固相カラム充填剤（SeQuant）に対して、糖ペプチド画分を加えた。続いて、８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液を加えて洗浄し、そして０．１％トリフルオロ酢酸の水溶液を用いて糖ペプチドを溶出させた。糖ペプチド溶出液を遠心式濃縮機によって乾固させ、次いで固形物を2μＬの純水に溶解させて糖ペプチド溶液を得た。

得られた糖ペプチド溶液に対して実施例１の工程３と同様の手順を適用して、糖ペプチドの標識を行った。次いで、得られたターゲットプレートに対して実施例１の工程４の手順を適用して、ＭＳ分析を行った。ＭＳ分析によって、ＰＳＡ由来のペプチド４３−４７に糖鎖が結合した糖ペプチドがＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ複合体から同様に検出された。得られたＭＳスペクトルを図７Ａおよび図７Ｂに示した。図７ＡはＰＳＡ由来の糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図であり、図７ＢはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体由来の糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。図７Ａおよび図７Ｂに示すように、フコースの有無に対応する１４６Ｄａの分子量を有する、２つのフコース結合糖ペプチド（Ｐ_１）およびフコース非結合糖ペプチド（Ｐ_２）の対が見いだされた。

Ｐ_１Ａ（ｍ／ｚ＝２３８６．１）／Ｐ_２Ａ（ｍ／ｚ＝２２４０．０）
Ｐ_１Ｂ（ｍ／ｚ＝２６００．１）／Ｐ_２Ｂ（ｍ／ｚ＝２４５４．０）

このように、実施例１のようにＰＳＡ−ＡＣＴ複合体から遊離ＰＳＡを調製しなくても、複合体から糖ペプチドを直接的に調製して、ＰＳＡのフコース結合糖ペプチドおよびフコース非結合糖ペプチドを検出することができた。この方法は、工程が少なくなるので、簡便迅速となる上、糖ペプチドの回収率が向上する。したがって、この方法は臨床試料への適用に好ましい。

（実施例２２）
本実施例は、実施例２１と同様に、実施例１の工程１に記載のＰＳＡ単離、および工程２に記載のＤＴＴによる還元、ヨードアセトアミドによるアルキル化の工程を実施することなしに、患者血清の分析を行った例である。

最初に、ＰＣに罹患している患者（Ｎ−９９、ＰＳＡ濃度９０．３ｎｇ／ｍＬ）の血清から、免疫グロブリンの除去を行った。３ｍＬのプロテインＡアガロース担体（PIERCE）をＰＢＳを用いて平衡化した。これをディスポーザブルプラスティックカラム（PIERCE）に充填し、被験者（Ｎ−９９）の血清およびＰＢＳの混合物を添加し、４℃にて３０分間にわたって振盪した。この担体に結合しないＰＳＡを含む画分を回収した。さらに、分離したプロテインＡアガロース担体を、担体の３倍の体積（３ＣＶ）のＰＢＳにて洗浄し、洗浄液をＰＳＡ含有画分に加えた。ＰＳＡ含有画分に対して、最終濃度が１ＭになるようにＮａ_２ＳＯ_４を加えた。

次に、ＰＳＡ含有画分から、血清中の主要タンパクであるアルブミンを除去した。２．５ｍＬのフラクトゲル（商標）EMD TA(S)（Merck）をディスポーザブルプラスティックカラムに充填し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４（１Ｍ）含有）にて平衡化させた。フラクトゲル（商標）充填カラムに対して上記にて得られた画分を添加し、送液ポンプを用いて７ＣＶの同緩衝液をカラムに送液し、アルブミンを流出させた。次いで、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４不含）を用いて、フラクトゲル（商標）充填カラムから吸着したタンパクを溶出させ、ＰＳＡを含む画分を得た。

次いで、ＰＢＳにて平衡化させた２ｍＬのプロテインＡアガロース担体に対してこの画分を添加し、４℃にて３０分間にわたって振盪することにより、免疫グロブリンのさらなる除去を行った。プロテインＡアガロース担体に結合しないＰＳＡを含む画分を回収した。さらに分離したプロテインＡアガロース担体を、担体の３倍の体積（３ＣＶ）のＰＢＳにて洗浄し、洗浄液をＰＳＡ含有画分に加えた。この画分を、次の免疫沈降に用いた。

引き続いて、免疫沈降に使用する抗ＰＳＡ抗体ビーズの作製を行った。NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を、１ｍＭのＨＣｌで３回洗浄した。次に、洗浄後のビーズに対して、市販の抗ヒトＰＳＡ・ウサギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）を添加し、その混合物を室温にて３０分間にわたって振盪し、抗体とビーズとの架橋を行った。続いて、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍのモノエタノールアミン溶液を加え、３０分間にわたって振盪して、残余の活性基のマスキングを行った。得られた抗ＰＳＡ抗体ビーズを、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、および、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）で、交互に３回洗浄した。次いで、抗ＰＳＡ抗体ビーズを、ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、抗ＰＳＡ抗体ビーズを０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄し、使用時まで４℃にて保存した。

次に、免疫沈降を行った。前述のアルブミンおよびグロブリンを除去したＰＳＡ含有画分に対して、０．１ｍｌの抗ＰＳＡ抗体ビーズを添加し、４℃にて１時間にわたって振盪した。続いて、抗ＰＳＡ抗体ビーズを、Micro Bio-Spinクロマトグラフィーカラム（バイオ・ラッドラボラトリーズ社）に移した。抗ＰＳＡ抗体ビーズカラムを、ＰＢＳで４回、０．０２％のTween-20を含むＰＢＳで３回、および蒸留水で２回洗浄した。さらに、抗ＰＳＡ抗体ビーズカラムに１Ｍプロピオン酸を加え、抗体ビーズに吸着したタンパクを溶出させて回収した。１Ｍプロピオン酸での溶出を１０回にわたって行い、合わせた溶出液を遠心式濃縮機（SpeedVac (SAVANT)）を用いて乾固させた。

乾固させたタンパクを、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ、栄研化学）および電気泳動にて分析した結果、最初の血清中に含まれていたＰＳＡの約７０％を回収できることが判明した。以上の工程は２日以内に完了することができ、簡便かつ迅速な工程でありながら、高収率である。

次に、サーモリシンによるタンパク質の酵素消化を行った。乾固させたタンパクを５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）に溶解し、５０単位のサーモリシン（Calbio）を加えて、１８時間にわたって５６℃で静置した。反応混合物を遠心式濃縮機によって乾固させた。得られた固形物を０．８％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、４０分間にわたって８０℃で静置し、脱シアル酸化反応を行った。脱シアル酸化されたサンプルを遠心式濃縮機によって乾固させて、糖ペプチド画分を得た。

続いて、カーボングラファイト充填カートリッジであるIntersep GC 50mg（ＧＬサイエンス）を用いて、得られた糖ペプチド画分の粗精製および脱塩を行った。最初に、カートリッジに対して、１ＭのＮａＯＨ水溶液、蒸留水、３０％酢酸水溶液、蒸留水、８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液、ならびに５％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液を順次送液し、充填されたカーボングラファイトの洗浄および平衡化を行った。次に、乾固した糖ペプチド画分を、５％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液に溶解し、カートリッジに送液した。糖ペプチド画分を吸着させたカートリッジに対して、蒸留水、５％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液を順次送液し、糖ペプチド画分の粗精製および脱塩を行った。その後に、カートリッジに対して、８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液を送液して、吸着した糖ペプチドを溶出した。この糖ペプチドを含む溶出液を回収し、遠心式濃縮機によって乾固させた。

Sepharose CL-4B（シグマアルドリッチ社）を用いて、糖ペプチドの精製を行った。使用前に、Sepharoseを５０％エタノール水溶液で５回洗浄し、次いで、ブタノール：蒸留水：エタノール＝４：１：１の混合溶液で５回洗浄した。乾固させた粗精製の糖ペプチドを、同混合溶液に溶解させた。その溶液に対して、洗浄したSepharoseを６μＬ加え、１時間にわたって室温にて震盪して、糖ペプチドをSepharoseに吸着させた。続いて、前述の混合溶液を用いて、９回にわたってSepharoseを洗浄した。糖ペプチドの吸着したSepharoseに５０％エタノール水溶液を加え、３０分間にわたって室温で震盪して、糖ペプチドを溶離させた。溶離した糖ペプチドを含む溶液を回収し、遠心式濃縮機によって乾固させた。次いで、得られた固形物を５％アセトニトリル水溶液４μＬに溶解した。

得られた糖ペプチド溶液に対して実施例１の工程３と同様の手順を適用して、糖ペプチドの標識を行った。次いで、得られたターゲットプレートに対して実施例１の工程４の手順を適用して、ＭＳ分析を行った。ＭＳ分析によって、確かにＰＳＡ由来のペプチド４３−４７に糖鎖が結合した糖ペプチドが検出された。得られたＭＳスペクトルを図８に示した。フコースの有無に対応する１４６Ｄａの分子量を有する、２つのフコース結合糖ペプチド（Ｐ_１）およびフコース非結合糖ペプチド（Ｐ_２）が見いだされた。

Ｐ_１（ｍ／ｚ＝２３８６．４）／Ｐ_２（ｍ／ｚ＝２２４０．３）

被験者の血清中ＰＳＡ上のフコース非結合糖鎖（ｍ／ｚ＝２２４０．３）／フコース結合糖鎖（ｍ／ｚ＝２３８６．４）のシグナル強度比Ｒは１．２３であった。

以上のように、９０．３ｎｇ／ｍＬの低いＰＳＡ濃度を有する前立腺癌患者の血清からの糖ペプチドを、ＭＳによって検出することに初めて成功した。また、低いＰＳＡ濃度を有する前立腺癌患者の血清中のＰＳＡにおいても、１０００ｎｇ／ｍｌ以上という高いＰＳＡ濃度を有する前立腺癌患者の血清中のＰＳＡと同様に、フコース非結合糖鎖／フコース結合糖鎖のシグナル強度比が１．０より大きいことが明らかになった。

Claims

（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、
（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、
（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、
（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する工程と
を含み、該標識化ＰＳＡ誘導体中のフコース非結合糖鎖のシグナル強度とフコース結合糖鎖のシグナル強度との比が１．０を越える際に前立腺癌であると識別し、１．０以下である際に良性前立腺肥大症であると識別することを特徴とする、前立腺癌と良性前立腺肥大症とを識別する方法。
工程（２）において調製されるＰＳＡ誘導体が、ＰＳＡ由来の糖鎖であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
工程（２）において調製されるＰＳＡ誘導体が、ＰＳＡ由来の糖ペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。