JP5282286B2

JP5282286B2 - Tumor examination method

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Publication number: JP5282286B2
Application number: JP2009128487A
Authority: JP
Inventors: ナナ川崎; 大輔高倉; 則貴橋井; 照英山口
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2009-05-28
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2029-05-28
Also published as: JP2010276435A

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for inspecting a tumor by using a new tumor marker. <P>SOLUTION: The method is characterized by causing a sialyl Lewis-x containing hnRNP A3 to be the tumor marker. In the inspection method, various tumors such as a pancreas cancer, a large bowel cancer, a breast cancer and a leukemia can be simultaneously inspected. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、腫瘍マーカーを用いた腫瘍の検査方法に関し、より詳細には特定の核内タンパク質を腫瘍マーカーに用いた腫瘍の検査方法に関する。 The present invention relates to a method for examining a tumor using a tumor marker, and more particularly to a method for examining a tumor using a specific nuclear protein as a tumor marker.

糖タンパク質の糖鎖は、癌化に伴い変化することが知られている。表１に示すように、癌に特異的に発現する様々な糖鎖や糖タンパク質が腫瘍マーカーとして利用されている。 It is known that sugar chains of glycoproteins change with canceration. As shown in Table 1, various sugar chains and glycoproteins that are specifically expressed in cancer are used as tumor markers.

２型糖鎖の中に、糖鎖構造ＮｅｕＮＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ→Ｒのシアリルルイスｘがある。このシアリルルイスｘは、接着分子セレクチンのリガンドであることが知られている。また、肺癌、卵巣癌、膵癌、大腸癌、胆道癌等の癌になると、細胞中や血中のシアリルルイスｘ濃度が上昇することが報告されている。そのため、現在、腫瘍マーカーとしてＳＬＸ、ＣＳＬＥＸ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９等が臨床応用されている。 Among the type 2 sugar chains, there is sialyl Lewis x of the sugar chain structure NeuNAcα2 → 3Galβ1 → 4 (Fucα1 → 3) GlcNAc → R. This sialyl Lewis x is known to be a ligand for the adhesion molecule selectin. In addition, it has been reported that sialyl Lewis x concentration in cells and blood increases when cancers such as lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colon cancer, biliary tract cancer and the like occur. Therefore, SLX, CSLEX, NCC-ST-439, etc. are currently clinically applied as tumor markers.

しかし、これらの腫瘍マーカーは、良性疾患でも増加することがあることから、前記診断では癌組織を特異的に検出することが難しい。ＳＬＸは、非癌疾患での偽陽性率が比較的低いといわれているが、ＳＬＸ値が高くても、正確な診断を期するために他の腫瘍マーカー（例えばＣＡ１９−９）の併用、その他の生理学検査、顕微鏡での組織検査、Ｘ線画像診断、内視鏡検査等が必要である。 However, since these tumor markers may increase even in benign diseases, it is difficult to specifically detect cancer tissue in the diagnosis. Although SLX is said to have a relatively low false positive rate in non-cancer diseases, it can be used in combination with other tumor markers (for example, CA19-9) for accurate diagnosis even if the SLX value is high. Physiological examination, Microscopic histological examination, X-ray image diagnosis, Endoscopy etc. are necessary.

シアリルルイスｘ含有糖タンパク質として、表２に示す複数の膜タンパク質が、これまでに同定されている。しかし、癌との関連性が示唆されているタンパク質は、ＣＤ４４やＭＵＣ１等の一部に限られる。 As sialyl Lewis x-containing glycoproteins, a plurality of membrane proteins shown in Table 2 have been identified so far. However, proteins that are suggested to be related to cancer are limited to a part of CD44, MUC1, and the like.

以上のとおり、腫瘍マーカーとしての糖タンパク質には、共通する糖鎖部分構造（糖鎖癌抗原）があることが明らかにされているが、腫瘍マーカーのタンパク質部分は、ほとんどが同定されていないのが現状である。癌細胞に特異的に発現しているシアリルルイスｘ含有糖タンパク質を同定すれば、従来よりも陽性的中率の高い癌診断法、治療効果判定法、転移予測法、予後の判定法等を提供できるものと考える。 As described above, it has been clarified that glycoproteins as tumor markers have a common sugar chain partial structure (glycan cancer antigen), but most protein parts of tumor markers have not been identified. Is the current situation. By identifying sialyl Lewis x-containing glycoproteins that are specifically expressed in cancer cells, it is possible to provide cancer diagnostic methods, therapeutic effect judgment methods, metastasis prediction methods, prognostic judgment methods, etc. with a higher positive predictive value than before. Think of things.

そこで、本発明は、癌細胞に特異的に発現しているシアリルルイスｘ含有糖タンパク質を見つけ出し、それを腫瘍マーカーとする腫瘍の検査方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for examining a tumor by finding a sialyl Lewis x-containing glycoprotein that is specifically expressed in cancer cells and using it as a tumor marker.

本発明者らは、抗シアリルルイスｘ抗体を用いて、様々な細胞のスクリーニングを行った結果、癌細胞の核画分に複数のシアリルルイスｘ含有タンパク質があることを見出した。そのうちの２つは、２次元電気泳動とＬＣ／ＭＳ／ＭＳでｈｎＲＮＰ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ヘテロ核リボ核酸タンパク質）Ａ１及びＡ３であると同定された。これらは主要な核タンパク質として核内に発現しているタンパク質である。一方、正常ヒト細胞の核画分において、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ１及びシアリルルイスｘ含有Ａ３の有無を調べたところ、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ１の発現を確認することができたが、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３は検出されなかった。これらの知見を総合して本発明者らは、癌細胞特異的に核内のｈｎＲＮＰＡ３にシアリルルイスｘが結合することを見出して、以下の発明を完成させた。すなわち、本発明は、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３を腫瘍マーカーとすることを特徴とする、腫瘍の検査方法を提供する。 As a result of screening various cells using an anti-sialyl Lewis x antibody, the present inventors have found that there are a plurality of sialyl Lewis x-containing proteins in the nuclear fraction of cancer cells. Two of them were identified as hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) A1 and A3 by two-dimensional electrophoresis and LC / MS / MS. These are proteins expressed in the nucleus as the main nucleoprotein. On the other hand, when the presence or absence of sialyl Lewis x-containing hnRNP A1 and sialyl Lewis x-containing A3 was examined in the nuclear fraction of normal human cells, the expression of sialyl Lewis x-containing hnRNP A1 was confirmed, but sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 was Not detected. By combining these findings, the present inventors have found that sialyl Lewis x binds to hnRNP A3 in the nucleus in a cancer cell-specific manner, and completed the following invention. That is, the present invention provides a method for examining a tumor, wherein sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 is used as a tumor marker.

これまでに、ｈｎＲＮＰｓが糖タンパク質であることや、核内にシアリルルイスｘ含有タンパク質が存在することは知られていなかった。また、ｈｎＲＮＰＡ１及びＡ２／Ｂ１は、それぞれ、表３に示すように、大腸癌及び肺癌で増加することから、診断マーカーとしての可能性が期待されている。しかし、シアリルルイスｘ糖鎖の付加したｈｎＲＮＰＡ３が腫瘍マーカーとして有用であることは全く認識されていなかった。 To date, it has not been known that hnRNPs are glycoproteins or that sialyl Lewis x-containing proteins are present in the nucleus. Moreover, since hnRNP A1 and A2 / B1 increase in large intestine cancer and lung cancer as shown in Table 3, respectively, the possibility as a diagnostic marker is expected. However, it was not recognized at all that hnRNP A3 to which sialyl Lewis x sugar chain was added was useful as a tumor marker.

また、特開２００８−１６４５１７には、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いたメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法によって、大腸癌、肺癌及び乳癌等の癌を検出することが記載されている。本発明の腫瘍の検査方法は、シアリルルイスｘ糖鎖が結合したｈｎＲＮＰである点で特開２００８−１６４５１７に記載の発明と相違する。しかも、腫瘍マーカーとして機能するには、ｈｎＲＮＰがｈｎＲＮＰＡ３であることが必須であるところ、特開２００８−１６４５１７はすべてのｈｎＲＮＰを対象とする。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-164517 describes that cancers such as colorectal cancer, lung cancer and breast cancer are detected by an immunological analysis method of methylated hnRNP using an antibody that binds to a methylated amino acid residue. Yes. The method for examining a tumor of the present invention is different from the invention described in JP-A-2008-164517 in that it is hnRNP to which a sialyl Lewis x sugar chain is bound. Moreover, in order to function as a tumor marker, it is essential that hnRNP is hnRNP A3. JP 2008-164517 A covers all hnRNPs.

前記腫瘍マーカーの検出には、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を用いることが好ましい。該シアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、例えば抗シアリルルイスｘ抗体である。 For detection of the tumor marker, sialyl Lewis x sugar chain binding molecules are preferably used. The sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule is, for example, an anti-sialyl Lewis x antibody.

前記腫瘍の検査方法は、ｈｎＲＮＰＡ３発現細胞を被検試料とすることが好ましい。 The tumor testing method preferably uses hnRNP A3-expressing cells as a test sample.

本発明の検査方法は、例えば膵癌、大腸癌、乳癌、白血病等の診断、治療効果の判定及び予後の予測に有用である。 The test method of the present invention is useful, for example, for diagnosis of pancreatic cancer, colon cancer, breast cancer, leukemia, etc., determination of therapeutic effect, and prediction of prognosis.

シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の糖タンパク質は、例えばＴ８４（大腸癌肺転移部位由来）細胞、ＨＴ−２９（大腸癌原発部位由来）細胞、ＢｘＰＣ−３（膵癌原発部位由来）細胞、Ｃａｐａｎ−１（膵癌肝転移部位由来）細胞、ＺＲ−７５−３０（乳癌腹水転移部位由来）細胞、ＴＨＰ１（急性単球性白血病細胞由来）細胞、ＫＵ８１２（慢性骨髄性白血病細胞由来骨髄芽球様）細胞等において発現する。したがって、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３を腫瘍マーカーとして用いれば、膵癌、大腸癌、乳癌、白血病等を含む様々な腫瘍を同時に検査することが可能である。 Examples of glycoproteins of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 include T84 (derived from colon cancer lung metastasis site) cells, HT-29 (derived from colon cancer primary site) cells, BxPC-3 (derived from pancreatic cancer primary site) cells, and Capan-1 (pancreatic cancer). Expression in liver metastasis site) cells, ZR-75-30 (derived from breast cancer ascites metastasis site) cells, THP1 (derived from acute monocytic leukemia cells) cells, KU812 (chronic myeloid leukemia cell derived myeloblast-like) cells, etc. To do. Therefore, if sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 is used as a tumor marker, various tumors including pancreatic cancer, colon cancer, breast cancer, leukemia and the like can be simultaneously examined.

本明細書の実施例に示すように、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ１は、正常細胞と癌細胞のどちらにも発現している。シアリルルイスｘ糖鎖のみを判定する従来の腫瘍マーカーは、ｈｎＲＮＰＡ１も検出するであろうから、陽性率の低下を招くことになる。一方、本発明の腫瘍の検査方法は、シアリルルイスｘを含有するｈｎＲＮＰＡ３が癌組織のみに発現することに基づく。本発明の腫瘍マーカーを用いた腫瘍の検査方法は、従来の腫瘍マーカー（例えばＳＬＸ）を用いた検査方法よりも陽性率を高くすると予想される。 As shown in the Examples of the present specification, sialyl Lewis x-containing hnRNP A1 is expressed in both normal cells and cancer cells. Conventional tumor markers that determine only sialyl Lewis x sugar chains will also detect hnRNP A1, leading to a decrease in positive rates. On the other hand, the tumor testing method of the present invention is based on the fact that hnRNP A3 containing sialyl Lewis x is expressed only in cancer tissues. The tumor testing method using the tumor marker of the present invention is expected to have a higher positive rate than the conventional testing method using a tumor marker (for example, SLX).

シアリルルイスｘを糖鎖抗原とする従来の腫瘍マーカー（例えばＳＬＸ）は、細胞膜に存在するシアルルルイスｘ付加糖タンパク質や糖脂質を測定する。一方、本発明の腫瘍の検査方法は、シアルルルイスｘが付加したｈｎＲＮＰＡ３という核内タンパク質を測定する。核内タンパク質を検査対象とすることは、核内タンパク質が関与する癌の悪性度の判定、治療効果の判定や転移等の予測に利用できるという点で好都合である。したがって、本発明の腫瘍の検査方法は、特に癌患者を治療した後の予後の観察に有用である。 A conventional tumor marker (for example, SLX) using sialyl Lewis x as a sugar chain antigen measures sialyl Lewis x-added glycoprotein and glycolipid present in the cell membrane. On the other hand, the tumor testing method of the present invention measures an intranuclear protein called hnRNP A3 added by sialul Lewis x. Examining nuclear proteins is advantageous in that it can be used to determine the malignancy of cancers involving nuclear proteins, to determine therapeutic effects, and to predict metastasis. Therefore, the tumor testing method of the present invention is particularly useful for observation of prognosis after treating cancer patients.

シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる腫瘍マーカーは、様々な検査手法（例えばウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法）や診断キットの中に取り入れることが容易である。また、シアリルルイスｘを糖鎖抗原とするＳＬＸ、ＣＳＬＥＸ等の従来の診断法に追加することにより、これらの診断法を補完することが期待される。 A tumor marker comprising sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 can be easily incorporated into various examination methods (for example, Western blot method and ELISA method) and diagnostic kits. In addition, it is expected to supplement these diagnostic methods by adding to conventional diagnostic methods such as SLX and CSLEX using sialyl Lewis x as a sugar chain antigen.

抗シアリルルイスｘ抗体を用いた癌細胞（二種類の大腸癌、乳癌、二種類の膵癌、及び二種類の白血病細胞）、並びに正常細胞（乳腺上皮細胞、気管支上皮細胞、表皮角化細胞、血管内皮細胞、及び線維芽細胞）の核画分のウエスタンブロットを示す。核内タンパク質であるヒストンＨ１タンパク質の発現量が同程度の癌細胞及び正常細胞の両方において、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ１の発現が確認された。一方、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の発現は、癌細胞で明瞭に観測されたが、正常細胞では発現していないか、あっても非常に僅かであった。なお、図１の正常細胞側に現れた３箇所のＨＴ−２９バンドは、ポジティブコントロールを意味する。Cancer cells (two types of colorectal cancer, breast cancer, two types of pancreatic cancer, and two types of leukemia cells) using anti-sialyl Lewis x antibodies, and normal cells (breast epithelial cells, bronchial epithelial cells, epidermal keratinocytes, vascular endothelium) 2 shows a Western blot of nuclear fractions of cells and fibroblasts). Expression of sialyl Lewis x-containing hnRNP A1 was confirmed in both cancer cells and normal cells in which the expression level of histone H1 protein, which is a nuclear protein, was comparable. On the other hand, the expression of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 was clearly observed in cancer cells, but was not expressed in normal cells or very little if any. The three HT-29 bands appearing on the normal cell side in FIG. 1 mean a positive control.

以下に、本発明の腫瘍の検査方法の一実施の形態をより詳細に説明する。本発明の腫瘍の検査方法は、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３という糖タンパク質を腫瘍マーカーとすることを特徴とする。上記糖タンパク質のベースとなるｈｎＲＮＰＡ３（分子量３９ｋＤａ）には、４種類のアイソフォームが存在する。本発明の腫瘍の検査方法には、この４種のアイソフォームのいずれも対象とすることができる。 Hereinafter, an embodiment of the tumor testing method of the present invention will be described in more detail. The method for examining a tumor of the present invention is characterized in that a glycoprotein called sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 is used as a tumor marker. There are four types of isoforms in hnRNP A3 (molecular weight 39 kDa) which is the base of the glycoprotein. Any of these four types of isoforms can be used in the tumor testing method of the present invention.

シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の被検試料は、生体由来でｈｎＲＮＰＡ３発現細胞が含まれるものならば特に制限されない。被検試料の具体例としては、臓器、組織、細胞等の生体組織の細胞、血液、血球、血漿、血清、髄液、関節液、腹水、糞便、尿等が挙げられる。これらの検体から常法（例えば実施例に記載の方法）に基づいて核タンパク質を抽出する。被検試料は、好ましくは、組織または細胞から抽出された核タンパク質である。 The test sample of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 is not particularly limited as long as it is derived from a living body and contains hnRNP A3-expressing cells. Specific examples of the test sample include cells of biological tissues such as organs, tissues, cells, blood, blood cells, plasma, serum, spinal fluid, joint fluid, ascites, stool, urine and the like. A nucleoprotein is extracted from these specimens based on a conventional method (for example, the method described in Examples). The test sample is preferably a nucleoprotein extracted from tissue or cells.

上記腫瘍マーカーを使用した腫瘍の検査方法の具体例は、被検試料をシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させて、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる複合体を形成させ、次いで、該複合体を検出することからなる。 A specific example of a tumor testing method using the tumor marker is to react a test sample with a sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule to form a complex consisting of sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3, It then consists of detecting the complex.

シアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、シアリルルイスｘ糖鎖に特異的に結合する分子のすべてが含まれる。その例としては、抗シアリルルイスｘ抗体やレクチンが挙げられ、好ましくは抗シアリルルイスｘ抗体である。 Sialyl Lewis x sugar chain-binding molecules include all molecules that specifically bind to sialyl Lewis x sugar chains. Examples thereof include anti-sialyl Lewis x antibodies and lectins, and preferably anti-sialyl Lewis x antibodies.

抗シアリルルイスｘ抗体は、常法に基づいて、ウサギ、ラット、マウス等の動物にシアリルルイスｘ糖鎖又はそれを含む物質を免疫してポリクローナル抗体を作製する方法、また、常法に基づいて、例えばシアリルルイスｘ糖鎖又はそれを含む物質で予め免疫された抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて得られる自律増殖能を持ったハイブリドーマが産出するモノクローナル抗体でもよい。さらに、抗原結合活性を有する限り、組換え抗体やこれらの抗体のフラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ領域等）でもよい。抗体フラグメントは、抗体をタンパク質分解酵素で分解し、精製することにより得られる。本発明の方法には、これらの抗体を一種単独に用いてもよく、あるいは二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、抗シアリルルイスｘ抗体は、市販されているものを制限なく使用可能である。 The anti-sialyl Lewis x antibody is a method for producing a polyclonal antibody by immunizing animals such as rabbits, rats, and mice with a sialyl Lewis x sugar chain or a substance containing the same based on a conventional method. It may be a monoclonal antibody produced by a hybridoma having an autonomous proliferation ability obtained by cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells previously immunized with a sialyl Lewis x sugar chain or a substance containing the same. Furthermore, as long as it has antigen-binding activity, it may be a recombinant antibody or a fragment of these antibodies (for example, F (ab ') 2, Fab region, etc.). Antibody fragments are obtained by decomposing and purifying antibodies with proteolytic enzymes. In the method of the present invention, these antibodies may be used singly or in combination of two or more. As the anti-sialyl Lewis x antibody, a commercially available one can be used without limitation.

また、前記レクチンの候補としては、イヌエンジュレクチンＭＡＭ（Ｍａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓｍｉｔｏｇｅｎ；Ｓｉａα２−３Ｇａｌを認識する）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ；Ｆｕｃα１−２，３，６を認識する）、小麦胚芽レクチンＷＧＡ（Ｗｈｅａｔｇｅｒｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；シアル酸を認識する）等が挙げられる。 The candidate lectins include dog endectin MAM (recognizing Macackia amurensis mitogen; Siaα2-3Gal), yellow chawantake lectin AAL (Aleuria aurantia; recognizing Fucα1-2, 3, 6), wheat germ lectin WGA ( Wheat germ agglutinin (which recognizes sialic acid).

腫瘍マーカーの検出を容易にするため、予めシアリルルイスｘ糖鎖結合分子を標識しておくことが好ましい。シアリルルイスｘ結合分子の標識物質としては、検出方法に基づいて、^３２Ｐ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^４５Ｃａ、^３Ｈ、^１４Ｃ等の放射性同位体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ユーロピウム、ナフチルアミン等の蛍光物質、ルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光物質、フェノール、ナフトール、アントラセン等の紫外線吸収物質、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等の酵素、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシルのスピンラベル化剤、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド等が使用可能である。 In order to facilitate the detection of the tumor marker, it is preferable to label the sialyl Lewis x sugar chain binding molecule in advance. As a labeling substance for sialyl Lewis x-binding molecules, radioisotopes such as ³² P, ¹³¹ I, ³⁵ S, ⁴⁵ Ca, ³ H, and ¹⁴ C, Cy3, Cy5, rhodamine, fluorescein, dansyl, fluorescein are used. Fluorescent materials such as olescamine, coumarin, europium, naphthylamine, luminescent materials such as luciferin, isoluminol, luminol, bis (2,4,6-trifluorophenyl) oxalate, ultraviolet absorbing materials such as phenol, naphthol, anthracene, alkali Enzymes such as phosphatase, β-galactosidase, luciferase, peroxidase, microperoxidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, malate dehydrogenase, 4-amino-2,2, , 6-Tetramethylpiperidine-1-oxyl, 3-amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl, 2,6-di-t-butyl-α- (3,5-di- Spin labeling agents such as t-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadiene-1-ylidene) -p-tolyloxyl, gold colloid, silver colloid, platinum colloid, and the like can be used.

標識したシアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、シグナルの検出に利用できる物質、例えばジゴキシン、ジゴキシゲニン、ビオチン、ペニシリン、トリニトロフェニル、ジニトロフェニルのようなハプテン、ペプチド、レクチン等を結合させたものでもよい。例えば、ＬＡＢ法、ＡＢＣ法及びＬＳＡＢ法では、ビオチンを結合した抗体（ビオチン化抗体）を被検試料と反応させ、さらに酵素等で標識したアビジンやストレプトプトアビジンを前記ビオチン化抗体と反応させることにより、検出感度を増加させることができる。 The labeled sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule may be obtained by binding a substance that can be used for signal detection, for example, a hapten such as digoxin, digoxigenin, biotin, penicillin, trinitrophenyl, and dinitrophenyl, a peptide, a lectin, and the like. For example, in the LAB method, ABC method, and LSAB method, a biotin-conjugated antibody (biotinylated antibody) is reacted with a test sample, and avidin or streptopavidin labeled with an enzyme or the like is further reacted with the biotinylated antibody. Thus, the detection sensitivity can be increased.

前記シアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、複合体の検出方法に基づいて、適宜、担体に固定化してもよい。固定化担体の材質には、金属、ガラス、セラミックス、シリコーン、ポリスチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等の合成高分子が挙げられる。担体の形状は、多孔性粒子、ビーズ、チューブ、ファイバー、プレート等が挙げられる。 The sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule may be appropriately immobilized on a carrier based on a complex detection method. Examples of the material of the immobilization carrier include synthetic polymers such as metal, glass, ceramics, silicone, polystyrene resin, polyvinyl chloride resin, polypropylene resin, acrylic resin, and polymethyl methacrylate resin. Examples of the shape of the carrier include porous particles, beads, tubes, fibers, and plates.

上記で形成されたシアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる複合体を検出するには、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、凝集法、免疫沈降法等の免疫学的測定法を使用することができる。その測定原理も、サンドイッチ法、競合法等が取り得る。以下のその具体例を示す。 In order to detect the complex composed of sialyl Lewis x sugar chain binding molecule-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 formed as described above, immunological methods such as Western blotting, EIA, RIA, ELISA, FIA, aggregation method, immunoprecipitation method, etc. Measurement methods can be used. The measurement principle can be the sandwich method, the competitive method, or the like. Specific examples are shown below.

（電気泳動−ウエスタンブロット−免疫染色）
被検試料中のシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３を、電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動）で分離し、ウエスタンブロット法により、あるいはＨＰＬＣ、ゲル濾過、分子量分画等で分離し、ドットブロット法によりニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜に転写する。次いで、アルブミンやスキムミルクでブロッキング処理をする。そして、標識した抗シアリルルイスｘ抗体との反応性を調べることで、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の存在を調べる。適宜、染色された部分を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析等で詳細に同定する。 (Electrophoresis-Western blot-immunostaining)
The sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 in the test sample is separated by electrophoresis (for example, SDS-PAGE, isoelectric focusing), by Western blotting, or by HPLC, gel filtration, molecular weight fractionation, Transfer to nitrocellulose membrane or PVDF membrane by dot blot method. Next, blocking treatment is performed with albumin or skim milk. Then, the presence of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 is examined by examining the reactivity with the labeled anti-sialyl Lewis x antibody. The stained part is appropriately identified in detail by LC / MS / MS, MALDI-TOF / MS analysis or the like.

（ＥＬＩＳＡ−免疫染色）
被検試料を上記担体に接触させて吸着させる。スキムミルク、アルブミン等のブロッキング剤を担体に吸着させてブロッキングする。次いで、酵素で標識済みの抗シアリルルイスｘ抗体を反応させ、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−抗シアリルルイスｘ抗体からなる複合体を形成させた後、洗浄する。シアリルルイスｘ糖鎖結合分子が標識されていない場合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識済みの二次抗体を作用させる。酵素の基質（発色、発光色素等）を添加して、酵素反応物を検出する。適宜、染色された部分を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析等で詳細に同定する。 (ELISA-immunostaining)
A test sample is brought into contact with the carrier and adsorbed. Blocking is performed by adsorbing a blocking agent such as skim milk or albumin on a carrier. Next, the enzyme-labeled anti-sialyl Lewis x antibody is reacted to form a complex consisting of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-anti-sialyl Lewis x antibody, followed by washing. When the sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule is not labeled, a secondary antibody labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase is allowed to act. Enzyme substrate (color development, luminescent dye, etc.) is added to detect the enzyme reaction product. The stained part is appropriately identified in detail by LC / MS / MS, MALDI-TOF / MS analysis or the like.

本発明の腫瘍の検査方法は、前記シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３に対して、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子、及び、ｈｎＲＮＰＡ３と結合する抗体を反応させるものでもよい。それには、まず、抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体を被検試料と反応させ、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体からなる複合体を得る。次に、該複合体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子とを反応させ、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体からなる複合体を得る。該複合体を、ＨＰＬＣ、電気泳動、ゲル濾過、分子量分画等で分離して、検出する。この場合、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を上記したような標識手段で標識しておく。 In the method for examining a tumor of the present invention, the sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 may be reacted with a sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule and an antibody that binds to hnRNP A3. For this purpose, first, an anti-hnRNP A3 antibody is reacted with a test sample to obtain a complex comprising sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-anti-hnRNP A3 antibody. Next, the complex is reacted with a sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule to obtain a complex consisting of sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-anti-hnRNP A3 antibody. The complex is separated and detected by HPLC, electrophoresis, gel filtration, molecular weight fractionation or the like. In this case, the sialyl Lewis x sugar chain binding molecule is labeled with the labeling means as described above.

上記方法は、抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体及びシアリルルイスｘ糖鎖結合分子の反応順序を逆転させてもよい。すなわち、被検試料をシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させ、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる複合体を得る。次に、該複合体と抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体とを反応させ、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体からなる複合体を得る。この場合、抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体を適宜の手段で予め標識化しておく。その標識物質は、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子で例示したものと同様である。 The above method may reverse the reaction sequence of the anti-hnRNP A3 antibody and the sialyl Lewis x sugar chain binding molecule. That is, the test sample is reacted with a sialyl Lewis x sugar chain binding molecule to obtain a complex consisting of sialyl Lewis x sugar chain binding molecule-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3. Next, the complex is reacted with an anti-hnRNP A3 antibody to obtain a complex composed of sialyl Lewis x sugar chain binding molecule-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-anti-hnRNP A3 antibody. In this case, the anti-hnRNP A3 antibody is labeled in advance by an appropriate means. The labeling substance is the same as that exemplified for the sialyl Lewis x sugar chain binding molecule.

シアリルルイスｘ糖鎖結合分子には、前記した抗シアリルルイスｘ抗体等前記したものを使用する。抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体は、ｈｎＲＮＰＡ３に特異的に結合する抗体であれば特に限定されない。抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体には、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３のシアリルルイスｘにシアリルルイス結合タンパク質が結合したｈｎＲＮＰＡ３を認識しなくなるようなもの、シアリルルイスｘの付加の有無にかかわらず認識するものも含まれる。抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体は、市販されているものを制限なく使用できる。 As the sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule, those described above such as the above-mentioned anti-sialyl Lewis x antibody are used. The anti-hnRNP A3 antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically binds to hnRNP A3. Anti-hnRNP A3 antibodies include those that no longer recognize hnRNP A3 in which sialyl Lewis binding protein is bound to sialyl Lewis x of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3, and those that recognize regardless of the addition of sialyl Lewis x. A commercially available anti-hnRNP A3 antibody can be used without limitation.

抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体又はシアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、複合体の検出方法に基づいて、適宜、前記した担体に固定化してもよい。 The anti-hnRNP A3 antibody or sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule may be appropriately immobilized on the above-described carrier based on the detection method of the complex.

上記で形成されたシアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−抗ｈｎＲＮＰＡ３−からなる複合体を検出するには、ウエスタンブロット、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、凝集法、免疫沈降法等の免疫学的測定法を使用することができる。その測定原理も、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等が取り得る。シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の二価抗原としての性質を活用するので、サンドイッチ法が有利である。 To detect the complex formed of sialyl Lewis x sugar chain binding molecule-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-anti-hnRNP A3- formed in the above, Western blot, EIA, RIA, ELISA, FIA, aggregation method, immunoprecipitation method, etc. The immunoassay method can be used. The measurement principle can be the sandwich method, competitive method, two-antibody method, and the like. The sandwich method is advantageous because it utilizes the properties of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 as a divalent antigen.

（免疫沈降−ウエスタンブロット−免疫染色）
被検試料を抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体と反応させ、抗ｈｎＲＮＰＡ３−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる複合体を形成させる。複合体をプロテインＡセファロースビーズ等に付着させ、遠心分離で沈殿を回収する。沈殿物から複合体を適当な方法（ＳＤＳ等）で抽出する。得られた複合体を電気泳動にかけ、膜に転写する。膜をブロッキングした後、標識したシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させ、抗ｈｎＲＮＰＡ３−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−シアリルルイスｘ糖鎖結合分子からなる複合体を形成させる。その後、前記複合体を標識化物質に基づいてシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３を検出する。 (Immunoprecipitation-Western blot-Immunostaining)
A test sample is reacted with an anti-hnRNP A3 antibody to form a complex composed of anti-hnRNP A3-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3. The complex is attached to protein A sepharose beads or the like, and the precipitate is recovered by centrifugation. The complex is extracted from the precipitate by an appropriate method (SDS or the like). The resulting complex is subjected to electrophoresis and transferred to a membrane. After blocking the membrane, it is reacted with a labeled sialyl Lewis x sugar chain binding molecule to form a complex consisting of an anti-hnRNP A3-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-sialyl Lewis x sugar chain binding molecule. Thereafter, sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 is detected from the complex based on the labeling substance.

（ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）−免疫染色）
抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体を上記担体に固定する。次に、スキムミルク、アルブミン等のブロッキング剤で担体をブロッキングする。抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体を固定した担体に被検試料を添加し、抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる複合体を形成させる。洗浄後、酵素標識済みのシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させ、抗ｈｎＲＮＰＡ３−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−シアリルルイスｘ糖鎖結合分子からなる複合体を形成させた後、洗浄する。シアリルルイスｘ糖鎖結合分子が標識されていない場合は、酵素標識済みの二次抗体を作用させる。酵素の基質（発色、発光色素等）を添加して、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３を含有する酵素反応物を検出する。上記操作は、担体への固体化を抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体に替えてシアリルルイスｘ糖鎖結合分子にしてもよい。 (ELISA (sandwich method)-immunostaining)
Anti-hnRNP A3 antibody is immobilized on the carrier. Next, the carrier is blocked with a blocking agent such as skim milk or albumin. A test sample is added to a carrier on which an anti-hnRNP A3 antibody is immobilized to form a complex consisting of an anti-hnRNP A3 antibody-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3. After washing, it is reacted with an enzyme-labeled sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule to form a complex composed of an anti-hnRNP A3-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule, and then washed. When the sialyl Lewis x sugar chain binding molecule is not labeled, an enzyme-labeled secondary antibody is allowed to act. Enzyme substrate (color development, luminescent dye, etc.) is added to detect the enzyme reaction product containing sialyl Lewis x-containing hnRNP A3. In the above operation, solidification on a carrier may be replaced with an anti-hnRNP A3 antibody to form a sialyl Lewis x sugar chain binding molecule.

シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３−抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体からなる複合体を定量するには、当業分野で公知の方法を用いることができる。例えば、予め濃度既知のシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３を含む標準液について、標識物質量（測定値）とｈｎＲＮＰＡ３濃度との関係を表す検量線を作成しておくことにより、被検試料中のシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３を定量することができる。 Methods known in the art can be used to quantify the complex consisting of sialyl Lewis x sugar chain-binding molecule-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3-anti-hnRNP A3 antibody. For example, for a standard solution containing sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 having a known concentration in advance, a calibration curve representing the relationship between the amount of the labeled substance (measured value) and the hnRNP A3 concentration is prepared, whereby sialyl Lewis x in the test sample is prepared. The contained hnRNP A3 can be quantified.

前記方法で、被検試料と抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子との複合体、又は、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の量で腫瘍の有無を判定する基準の一例を、以下に説明する。 An example of a criterion for determining the presence or absence of a tumor by the amount of the test sample, the complex of the anti-hnRNP A3 antibody and the sialyl Lewis x sugar chain binding molecule, or the sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 by the above method will be described below.

例えば、被検試料と抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体との複合体の量を求める。この複合体は、ｈｎＲＮＰＡ３の総量を意味する。ｈｎＲＮＰＡ３複合体に対するシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３複合体の割合が有意に高くなっていれば、ｈｎＲＮＰＡ３へのシアリルルイスｘ糖鎖の付加が進んでいることを意味し、腫瘍が発生していると判断される。同様に、ｈｎＲＮＰＡ３の総量に対するシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の割合が高くなっていれば、腫瘍が発生していると判断される。 For example, the amount of the complex between the test sample and the anti-hnRNP A3 antibody is determined. This complex refers to the total amount of hnRNP A3. If the ratio of the sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 complex to the hnRNP A3 complex is significantly high, it means that the addition of sialyl Lewis x sugar chains to hnRNP A3 is advanced, and it is judged that a tumor has occurred. Is done. Similarly, if the ratio of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 to the total amount of hnRNP A3 is high, it is determined that a tumor has occurred.

被検試料と抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体との複合体（すなわち、ｈｎＲＮＰＡ３の総量）と、被検試料と抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子との複合体の量（すなわち、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の量）は、別々に測定してもよいし、同時に測定してもよい。 Complex of test sample and anti-hnRNP A3 antibody (ie, total amount of hnRNP A3), and amount of complex of test sample, anti-hnRNP A3 antibody and sialyl Lewis x sugar chain binding molecule (ie, sialyl Lewis x-containing hnRNP A3) may be measured separately or simultaneously.

別法として、予め、健常者の被検試料（以下、対照試料）を用いて、対照試料と抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子の複合体とシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３の量を求めておく。実際の被検試料の値を、対照試料のものと比較する。被検試料の測定値が対照試料の値と比べて有意に高ければ、腫瘍が発生していると判断される。 Alternatively, the amount of hnRNP A3 containing a control sample, a complex of anti-hnRNP A3 antibody, sialyl Lewis x sugar chain binding molecule, and sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 is obtained in advance using a test sample (hereinafter referred to as a control sample) of a healthy person deep. The actual test sample value is compared to that of the control sample. If the measured value of the test sample is significantly higher than that of the control sample, it is determined that a tumor has occurred.

本発明は、また、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる腫瘍マーカーを提供する。この腫瘍マーカーは、癌の発生する臓器の検索やこの腫瘍マーカーを検出するための診断マーカーのスクリーニング等の研究に有用である。 The present invention also provides a tumor marker consisting of sialyl Lewis x-containing hnRNP A3. This tumor marker is useful for studies such as searching for organs in which cancer occurs and screening for diagnostic markers for detecting this tumor marker.

本発明は、また、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる腫瘍マーカーを検査するための腫瘍検査用試薬又はキットを提供する。試薬は、腫瘍マーカーを検査することができるあらゆるものを含む。具体的には、腫瘍検査用試薬又はキットは、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を含む。該キットは、さらに抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体を含むことが好ましい。これらのキットによれば、腫瘍の検査工程を簡略化できるため、大量の検体を短時間に検査することができる。 The present invention also provides a tumor test reagent or kit for testing a tumor marker comprising sialyl Lewis x-containing hnRNP A3. Reagents include anything that can be tested for tumor markers. Specifically, the reagent or kit for tumor examination contains a sialyl Lewis x sugar chain binding molecule. The kit preferably further comprises an anti-hnRNP A3 antibody. According to these kits, the tumor inspection process can be simplified, so that a large amount of specimens can be inspected in a short time.

上記腫瘍検査用試薬又はキットには、この分野で公知の試薬を含めることができる。その例としては、緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、安定化剤、防腐剤等が挙げられる。 The reagent or kit for tumor examination may contain a reagent known in this field. Examples thereof include buffers, reaction accelerators, saccharides, proteins, salts, stabilizers, preservatives and the like.

〔実施例１〕
ヒト大腸癌上皮由来Ｔ８４細胞株からの核タンパク質の抽出を、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅｒｃｈ，１９８９，１７，６４１９に記載の方法に準じて以下のように行った。ヒト大腸癌上皮由来Ｔ８４細胞株（ＡＴＣＣより入手）の凍結細胞を氷上で融解させ、抽出液Ａ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＥＧＴＡ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭＳＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ）を３００μＬ加え、ピペッティングにより懸濁した。氷上で１５分間インキュベートした後、１８．７５μｌの１０％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０を加え、１０秒間ｖｏｌｔｅｘミキサーにより撹拌した。４℃、５００×ｇで３分間遠心した後、上清を細胞質由来タンパク質として回収した。再び、ペレットに３００μＬの抽出液Ａを加え、ピペッティングにより懸濁した後、４℃、５００×ｇで１分間遠心し、上清を回収した。この操作を２回繰り返した。 [Example 1]
Extraction of nucleoprotein from human colon cancer epithelium-derived T84 cell line was performed as follows according to the method described in Nucleic Acid Research, 1989, 17, 6419. Frozen cells of human colon cancer epithelium-derived T84 cell line (obtained from ATCC) were thawed on ice, and extracted solution A (10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0 300 μL of 5 mM PMSF (Proteinase Inhibitor Cocktail) was added and suspended by pipetting. After incubation on ice for 15 minutes, 18.75 μl of 10% Nonidet P40 was added and stirred for 10 seconds with a vortex mixer. After centrifugation at 4 ° C. and 500 × g for 3 minutes, the supernatant was recovered as a cytoplasm-derived protein. Again, 300 μL of Extract A was added to the pellet and suspended by pipetting, and then centrifuged at 4 ° C. and 500 × g for 1 minute to collect the supernatant. This operation was repeated twice.

ペレットに２００μｌの抽出液Ｂ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９，４００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ピペッティングにより懸濁した。４℃で１５分間ｖｏｌｔｅｘミキサーにより撹拌した後、４℃、１５，０００×ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を核タンパク質として回収した。 200 μl of Extract B (20 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, Proteinase inhibitor cocktail) was added to the pellet and suspended by pipetting. After stirring with a voltex mixer for 15 minutes at 4 ° C., the mixture was centrifuged at 15,000 × rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered as nucleoprotein.

抽出した核タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、エレクトロブロッティング法によりＰＶＤＦ膜に核タンパク質を転写した。転写されたタンパク質を、蛍光色素Ｃｙ５を用いて標識した後、蛍光イメージアナライザー（製品名Ｔｙｐｈｏｏｎ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて測定した。また、核タンパク質に含まれるシアリルルイスｘのキャリアタンパク質を、マウス抗シアリルルイスｘモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、登録商標）を用いたウエスタンブロット法で検出した。なお、二次抗体には、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ、登録商標）を用いた。核タンパク質画分のウエスタンブロッティングの結果、３５ｋＤａ近傍及び４２ｋＤａ近傍にシアリルルイスｘ（ｓＬｅｘ）由来の明瞭なシグナルが検出された。 After the extracted nucleoprotein was separated by SDS-PAGE, the nucleoprotein was transferred to a PVDF membrane by electroblotting. The transcribed protein was labeled with the fluorescent dye Cy5, and then measured using a fluorescent image analyzer (product name Typhoon, manufactured by GE Healthcare Bioscience). Further, sialyl Lewis x carrier protein contained in the nuclear protein was detected by Western blotting using a mouse anti-sialyl Lewis x monoclonal antibody (Chemicon, registered trademark). As the secondary antibody, an HRP-labeled goat anti-mouse IgM antibody (American Qualex, registered trademark) was used. As a result of Western blotting of the nucleoprotein fraction, clear signals derived from sialyl Lewis x (sLex) were detected in the vicinity of 35 kDa and 42 kDa.

ヒト大腸癌上皮由来Ｔ８４細胞株の場合と同様に、以下の癌細胞：
ヒト膵癌由来ＢｘＰＣ−３細胞株（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１６８７）、
ヒト膵癌由来Ｃａｐａｎ−１細胞株（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＴＢ−７９）、
ヒト大腸癌由来ＨＴ−２９細胞株（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＴＢ−３８）、
ヒト乳癌由来ＺＲ−７５−３０細胞株（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５０４）、
急性単球性白血病細胞由来ＴＨＰ１細胞株（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ−２０２）、及び、
慢性骨髄性白血病細胞由来骨髄芽球様ＫＵ８１２細胞株（ＪＣＲＢ０１０４）
の核タンパク質画分についても、ウエスタンブロッティング解析を実施した。表４に癌細胞の特徴を示し、そして図１にウエスタンブロットの結果を示す。 As with the human colon cancer epithelium-derived T84 cell line, the following cancer cells:
Human pancreatic cancer-derived BxPC-3 cell line (ATCC No. CRL-1687),
Human pancreatic cancer-derived Capan-1 cell line (ATCC No. HTB-79),
HT-29 cell line derived from human colon cancer (ATCC No. HTB-38),
Human breast cancer-derived ZR-75-30 cell line (ATCC No. CRL-1504),
An acute monocytic leukemia cell-derived THP1 cell line (ATCC No. TIB-202), and
Chronic myeloid leukemia cell-derived myeloblast-like KU812 cell line (JCRB0104)
Western blotting analysis was also performed on the nucleoprotein fraction. Table 4 shows the characteristics of the cancer cells, and FIG. 1 shows the results of the Western blot.

さらに、以下の正常ヒト細胞：
ヒト乳腺上皮細胞（三光純薬（株）より入手）、
ヒト気管支上皮細胞（三光純薬（株）より入手）、
ヒト表皮角化細胞（三光純薬（株）より入手）、
ヒト血管内皮細胞（三光純薬（株）より入手）、及び
ヒト正常２倍体線維芽細胞ＴIG−１−２０（ＪＣＲＢ０５０１）
の核タンパク質画分を用いて、ウエスタンブロッティング解析を実施した。その結果もまた図１に示す。 In addition, the following normal human cells:
Human mammary epithelial cells (obtained from Sanko Junyaku Co., Ltd.),
Human bronchial epithelial cells (obtained from Sanko Junyaku Co., Ltd.),
Human epidermal keratinocytes (obtained from Sanko Junyaku Co., Ltd.),
Human vascular endothelial cells (obtained from Sanko Junyaku Co., Ltd.) and human normal diploid fibroblast TIG-1-20 (JCRB0501)
Western blotting analysis was performed using the nucleoprotein fraction. The results are also shown in FIG.

図１に示すとおり、抗シアリルルイスｘ抗体を用いて癌細胞及び正常ヒト細胞の核画分のシアリルルイスｘ含有タンパク質の発現を調べた結果、癌細胞及び正常細胞に共通するシアリルルイスｘ含有タンパク質と、癌細胞特異的シアリルルイスｘ含有タンパク質が存在した。これとは別に２Ｄ電気泳動とＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った結果、上記の共通する糖タンパク質はシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ１であり、上記の癌特異的糖タンパク質はシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３であることが判明した。また、核に一定量存在するヒストンタンパク質について癌細胞と正常細胞との発現の違いを見たが、差は見られなかった。 As shown in FIG. 1, as a result of examining the expression of sialyl Lewis x-containing protein in the nuclear fraction of cancer cells and normal human cells using anti-sialyl Lewis x antibody, sialyl Lewis x-containing protein common to cancer cells and normal cells, and cancer There was a cell-specific sialyl Lewis x-containing protein. Separately, as a result of performing 2D electrophoresis and LC / MS / MS, it was found that the common glycoprotein was sialyl Lewis x-containing hnRNP A1, and the cancer-specific glycoprotein was sialyl Lewis x-containing hnRNP A3. found. In addition, regarding the histone protein present in a certain amount in the nucleus, the difference in expression between cancer cells and normal cells was observed, but no difference was observed.

以上のことから、同じｈｎＲＮＰファミリーでもシアリルルイスｘの転移と癌化の関係に違いがあり、癌特異的糖タンパク質であるシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３は、腫瘍マーカーとしての利用が充分に可能であることが明らかとなった。 From the above, even in the same hnRNP family, there is a difference in the relationship between sialyl Lewis x metastasis and canceration, and sialyl Lewis x-containing hnRNP A3, which is a cancer-specific glycoprotein, can be sufficiently used as a tumor marker. It became clear.

Ａｎｔｉ−ＳｉａｌｙｌＬｅｗｉｓＸａｎｔｉｂｏｄｙ：抗シアリルルイスｘ抗体
Ａｎｔｉ−ＨｉｓｔｏｎｅＨ１ａｎｔｉｂｏｄｙ：抗ヒストンＨ１抗体
ＨＴ−２９：ヒト大腸癌原発部位由来
Ｔ８４：ヒト大腸癌肺転移部位由来
ＺＲ−７５−３０：ヒト乳癌腹水転移部位由来
Ｃａｐａｎ−１：ヒト膵癌肝転移部位由来
ＢｘＰＣ−３：ヒト膵癌原発部位由来
ＴＨＰ１：ヒト急性単球性白血病細胞由来細胞株由来
ＫＵ８１２：ヒト慢性骨髄性白血病細胞由来 Anti-Sialyl Lewis X antibody: Anti-sialyl Lewis x antibody Anti-Histone H1 antibody: Anti-histone H1 antibody HT-29: Human colon cancer primary site-derived T84: Human colon cancer lung metastasis site-derived ZR-75-30: Human breast cancer ascites metastasis Site-derived Capan-1: Human pancreatic cancer liver metastasis site-derived BxPC-3: Human pancreatic cancer primary site-derived THP1: Human acute monocytic leukemia cell-derived cell line-derived KU812: Human chronic myeloid leukemia cell-derived

Claims

標識された抗シアリルルイスｘ抗体と被検試料とを反応させて、抗シアリルルイスｘ抗体−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰＡ３からなる複合体を形成する工程と、
前記標識された抗シアリルルイスｘ抗体を検出することで前記複合体を検出する工程と、
を備えることを特徴とする腫瘍の検査方法。 Reacting a labeled anti-sialyl Lewis x antibody with a test sample to form a complex comprising anti-sialyl Lewis x antibody-sialyl Lewis x-containing hnRNP A3 ;
Detecting the complex by detecting the labeled anti-sialyl Lewis x antibody;
A method for examining a tumor, comprising:

ｈｎＲＮＰＡ３発現細胞を被検試料とすることを特徴とする、請求項１に記載の腫瘍の検査方法。 The method for examining a tumor according to claim 1, wherein hnRNP A3-expressing cells are used as a test sample.

腫瘍が、膵癌、大腸癌、乳癌及び白血病の少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の腫瘍の検査方法。
The method for examining a tumor according to claim 1 or 2, wherein the tumor is at least one of pancreatic cancer, colon cancer, breast cancer and leukemia.