JP5277497B2 - 土壌から抽出したrnaの精製法 - Google Patents
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以下の手順に従って、図21に示す3種類の土壌(腐植物質を多量に含む火山灰土壌)から腐植物質を抽出し、次いで濃縮して腐植物質抽出液を得た。
大腸菌(DH−5α)を、LB培地(1L当たり10g tryptone,5g yeast extract,10g NaCl)中で一晩培養し、この培養液を8000×gにて5分間遠心分離し、菌体を沈殿として回収した。1Lの培養液から集菌したE.coliを5mlの1%NaClに懸濁した。このE.coli菌体液50μlを1サンプル分として試験に使用した。このE.coli菌体液に、RNA抽出用溶液(SDS溶液(2% SDS,100mM Tris−HCl(pH8.0),50mM EDTA(pH8.0))またはグアニジンチオシアネート溶液(4Mグアニジンチオシアネート,25mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0),1% N−ラウロイルサルコシンナトリウム塩))を添加し、次いで10分間の振とうした。この溶液を8000×gにて10分間遠心分離し、上清をRNA抽出液として得た。
cetyltrimethylammmonium bromide (sigma-aldrich)をミリQ水に溶解して、10%CTAB溶液を調製した。分子量8000および58000のpolyvinylpyrorridoneをミリQ水に溶解、10%ポリビニルピロリドン溶液を調製した。4M CH3COONaを、酢酸を用いてpH4.0,4.5,5.0または5.5に調整し、オートクレーブ処理して酢酸ナトリウム溶液を調製した。5M NaCl溶液および10M LiCl溶液を調製した。polyethylene glycol MW 8000 (sigma-aldrich)をミリQ水に溶解して、オートクレーブ処理して20%PEG溶液を調製した。
RNA抽出液500μlに対し、10%CTAB溶液、10%ポリビニルピロリドン溶液(MW 8000)、10%ポリビニルピロリドン溶液(MW 58000)、5M NaCl、4M CH3COONa(pH4.0,4.5,5.0または5.5)を所定の濃度になるように添加した。この溶液をVortaxで30秒間攪拌した後、65℃で10分間インキュベートした。この溶液を室温に戻し、次いで等量のクロロホルムを添加した。この溶液をvortaxで30秒間攪拌し、12,000×gにて15分間遠心分離し、上清を回収した。この精製工程によって、腐植物質の除去および除タンパクを行い得る。
(I)PEGを使用する回収
上記精製工程において回収した上清500μlに、20%PEG溶液、20% PEG/4M LiCl溶液、10M LiCl、20%PEG/3M Tris−HCl(pH8.0)溶液または3M Tris−HCl(pH8.0)溶液を添加して、所定の濃度の溶液を調製した。得られた溶液を攪拌した後に、20000×g、4℃で30分間遠心分離した。得られた沈殿を70%エタノールで洗浄した後、50μl〜100μlのTEに溶解してRNA溶液とした。
上記精製工程において回収した上清500μlに、10M LiCl溶液または3M Tris−HCl(pH8.0)溶液を添加して、所定の濃度の溶液を調製した。得られた溶液を攪拌した後に、20000×g、4℃で30分間遠心分離した。得られた沈殿を70%エタノールで洗浄した後、50μl〜100μlのTEに溶解してRNA溶液とした。
上記精製工程において回収した上清500μlにミリQ水を添加して等量の2−プロパノールと完全に混合する濃度まで希釈した。この希釈溶液に等量の2−プロパノールを添加し、得られた溶液を攪拌し、次いで、20000×g、4℃で30分間遠心分離した。得られた沈殿を70%エタノールで洗浄した後、50μl〜100μlのTEに溶解してRNA溶液とした。
土壌から抽出される腐植物質は暗褐色であり、可視光の波長領域全域に非特徴的な光吸収特性を有している。腐植物質の定量には一般的に400nmにおける吸光度(ABS)が用いられる。本研究においても同様に405nmのABSを測定することによって腐植物質の量を測定した。ABSの値が低いほど溶液中の腐植物質の混入が少ない(腐植物質の除去率が高い)。
DNAとRNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルを染色した後にrRNA部分の蛍光を測定してRNAを定量した。アガロースゲルの濃度は1.5%で作製した。電気泳動を、×0.5 TAE緩衝液中で50Vにて30分間行った。ゲルの染色を、SYBR GreenIIで1時間行った。BAS3000(富士写真フィルム社製)を用いて、473nm励起および532nm以下の蛍光をカットしてDNAおよびRNAを定量的に検出した。画像処理を、Image Gaugeを用いて23S rRNAおよび16S rRNAのrRNAバンドの輝度を計測した。なお、各ゲルには、4〜5段階の標準としてλDNAのHindIII消化物を0.05μg〜0.25μgを同時に電気泳動し、λDNAのHindIII消化物を基準にした検量線に基づいてRNA量を定量した。
2−プロパノールを使用するRNA回収法が通常よく用いられる。しかし、この方法は抽出液中の塩濃度が高い場合は抽出液と2−プロパノールが混和せず、2層に分かれてしまうため、好ましくない。LiClを使用するRNA回収法もまたよく用いられるが、RNAの回収量がさほどよくない。そこで、本発明者らはさらなるRNA回収法を検討し、試行錯誤の結果、LiClと、通常RNA回収法に使用されることがないPEGとを共存させると、LiCl単独と比較してRNA回収率が向上することを見出した(図1)。
土壌からの腐植物質抽出液とE.coliからのRNA抽出液との混合液からの腐植物質除去効果を検討するに際し、RNA抽出液中の界面活性剤の影響を検討した。その結果、RNA抽出用溶液が4Mグアニジンチオシアネート溶液(図2、3)であっても2%SDS溶液(図4、5、6)であっても有意な差はなかった。
土壌からの腐植物質抽出液とE.coliからのRNA抽出液との混合液からの腐植物質除去効果を検討するに際し、腐植物質除去に用いる物質を検討した。図2、4および5はCTABを用いた場合の腐植物質除去効果、図3(a)および図6はPVPPを用いた場合の腐植物質除去効果を示す。その結果、CTABが好ましいことがわかった。
SDSによりE.coliより調整したRNA抽出液に腐植物質抽出液を混合した溶液からCTABを用いて腐植物質除去を行う際のpHの影響を検討した。その結果、CTABを用いて腐植物質除去を行う際のpHは5.0を下回るとRNA回収量が半減した(図9〜10)。
SDSによりE.coliより調整したRNA抽出液に腐植物質抽出液を混合した溶液からCTABを用いて腐植物質除去を行う際のCTABの濃度を検討した。その結果、2%(w/v)以上のCTABを用いれば、腐植物質除去効率が非常に良好であった(図7〜8、11〜12)。また、塩濃度(Na+イオン濃度)が高くなるにつれて腐植物質除去効率が低下することもわかった(図11〜12)。しかし、[Na+]が0.5Mまたは0.75Mの場合は、2.5%以上のCTABを用いるとRNAが分解し、rRNAのバンドを確認し得えない、もしくは不明瞭となった(図13(b)および図14(b))。さらに、[Na+]が1.0M〜1.25Mの場合は、いずれの濃度のCTABを用いてもRNAが分解しないことがわかった(図15(c))。また、CTAB濃度が2.5%または3%の場合の、塩の種類および濃度によるRNA回収率に対する影響を検討したが、[Na+]が0.75M〜1.25MであればRNA回収率は良好であることがわかった(図16)。
以上の結果より、3%CTAB/1.0M CH3COONaを用いたRNA精製(腐植物質除去)が最適であることがわかった。このRNA溶液からのRNA回収法を検討した。その結果、腐植物質除去効率の観点から、アルカリ条件下のPEG溶液(PEG/Tris−HCl(pH8.0))溶液を用いてRNAを回収する方法が最適であることがわかった(図19〜20)。
Claims (8)
- セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)をRNA抽出液へ添加してRNA溶液を調製した後に除タンパク操作を行う第1工程、およびポリエチレングリコール(PEG)存在下にて第1工程の除タンパク操作を行って得られたRNA溶液からRNAを回収する第2工程を包含するRNA精製法であって、第1工程がpH5.0〜6.5の範囲内で行われ、かつ、第2工程がpH7.0以上にて行われることを特徴とするRNA精製法。
- 前記CTABの濃度が2%(w/v)以上であることを特徴とする請求項1に記載のRNA精製法。
- 前記PEGの濃度が5〜15%(w/v)の範囲内であることを特徴とする請求項1または2のいずれか1項に記載のRNA精製法。
- 第1工程が0.5〜1.25Mの範囲内の塩存在下にて行われることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のRNA精製法。
- 前記RNA抽出液が、SDS抽出またはグアニジンチオシアネート抽出によって得られたものであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のRNA精製法。
- 回収したRNAを限外濾過に供する工程をさらに包含することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載のRNA精製法。
- 前記RNA抽出液が、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも1つに由来することを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載のRNA精製法。
- CTAB、PEG、CTAB使用時に弱酸性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩、および、PEG使用時にアルカリ性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩を備えているRNA精製キットであって、弱酸性環境がpH5.0〜6.5の範囲内であり、かつ、アルカリ性環境がpH7.0以上であることを特徴とするRNA精製キット。
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