JP5275737B2 - Immunochromatographic method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標識抗体を用いたイムノクロマトグラフ方法に関する。 The present invention relates to an immunochromatographic method using a labeled antibody.
尿、血液等の生体試料中に存在する被験物質の存在を定性的にあるいは定量的に測定する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。その中でもイムノクロマトグラフィー法は、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、一般的によく利用されている。 As a method for qualitatively or quantitatively measuring the presence of a test substance present in a biological sample such as urine or blood, an immunological measurement method is widely used. Among them, the immunochromatography method is commonly used because it is easy to operate and can be measured in a short time.
イムノクロマトグラフィー法で用いられている免疫反応としては、競合型反応、サンドイッチ型反応が広く使われている。その中でも、イムノクロマトグラフィー法ではサンドイッチ型反応が主流であり、その典型例においては、試料中の抗原よりなる被験出物質を検出するために、以下のような操作が行われる。（１）被験出物質である抗原に対する抗体により感作させた微粒子を固相微粒子としてクロマトグラフ媒体に固定化することにより、あるいはこの抗体そのものをクロマトグラフ媒体に直接固定化することにより、反応部位を有するクロマトグラフ媒体を調整する。（２）一方、標識微粒子に被験出物質と特異的に結合可能な抗体を感作させて感作標的微粒子を調整する。（３）この感作標識微粒子を、試料と共に、クロマトグラフ媒体上でクロマトグラフ的に移動させる。 Competitive reactions and sandwich reactions are widely used as immune reactions used in immunochromatography. Among them, the sandwich type reaction is the mainstream in the immunochromatography method. In a typical example, the following operation is performed in order to detect a test substance consisting of an antigen in a sample. (1) Reaction sites by immobilizing microparticles sensitized with an antibody against the test substance antigen as solid phase microparticles or by immobilizing the antibody itself directly to the chromatographic medium A chromatographic medium having (2) On the other hand, sensitized target fine particles are prepared by sensitizing a labeled fine particle with an antibody capable of specifically binding to the test substance. (3) The sensitized labeled fine particles are moved chromatographically on the chromatographic medium together with the sample.
以上の操作により、クロマトグラフ媒体に形成された反応部位において、固定化された抗体が固定化試薬となり、これに被験出物質である抗原を介して感作標識微粒子特異的に結合し、その結果、感作標識微粒子が反応部位に捕捉されることにより生ずるシグナルの有無または程度を目視で判定することにより、試料中の被験出物質の存在の有無または量を測定する。 Through the above operation, the immobilized antibody becomes an immobilization reagent at the reaction site formed on the chromatographic medium, and specifically binds to the sensitized label fine particles via the antigen as the test substance. The presence / absence or amount of the test substance in the sample is measured by visually determining the presence / absence or degree of signal generated by capturing the sensitized labeling microparticles at the reaction site.
このようなイムノクロマトグラフィー法において、標識微粒子を調製するための微粒子としては、コロイド状金属粒子またはコロイド状金属酸化物粒子、コロイド状非金属粒子および染料粒子が用いられている。また、標識として、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を用いられている場合もある。 In such an immunochromatography method, colloidal metal particles or colloidal metal oxide particles, colloidal nonmetal particles, and dye particles are used as fine particles for preparing labeled fine particles. In some cases, an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase is used as a label.
イムノクロマトグラフィー法の中には、感度が低いために抗原が検出されない（偽陰性）問題を回避するために、検出シグナルを増幅させる方法が行われる場合がある。シグナル増幅の方法として、標識としてアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を用いる場合があるが、金属コロイド標識及び金属硫化物標識からなる群から選んだ標識に銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感することによって検出を行う場合もある。 In some immunochromatography methods, a detection signal is amplified in order to avoid the problem that the antigen is not detected due to low sensitivity (false negative). As a signal amplification method, an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase may be used as a label, but a compound containing silver in a label selected from the group consisting of a metal colloid label and a metal sulfide label, and a reducing agent for silver ions In some cases, detection is performed by sensitization using.
イムノクロマトグラフ方法でシグナルを増幅する時、増幅する時の時間がかかり、かつ増幅後ムラが発生する問題がある。本発明は、増幅時間を短縮し、増幅後のムラを低減したイムノクロマトグラフ方法を提供することを解決すべき課題とした。 When a signal is amplified by an immunochromatographic method, there are problems that it takes time to amplify and unevenness occurs after amplification. This invention made it the subject which should be solved to provide the immunochromatography method which shortened amplification time and reduced the nonuniformity after amplification.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、金属コロイド標識物質及び金属硫化物標識物質を使用したイムノクロマトストリップに検体を滴下し展開させた後、検体の展開方向と銀増幅液の展開方向を異なる方向にして増幅させることで、検出ラインに直接、もしくは検出ラインごく近傍に増幅液を接触させることができ、その結果、シグナルの増幅時間の短縮と増幅後のムラの減少を達成できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have dropped a sample on an immunochromatographic strip using a metal colloid labeling substance and a metal sulfide labeling substance and developed the specimen, and then the specimen development direction and silver amplification. By amplifying the solution in different directions, the amplification solution can be brought into contact with the detection line directly or in the immediate vicinity of the detection line. As a result, the signal amplification time is shortened and unevenness after amplification is reduced. I found that I can achieve. The present invention has been completed based on the above findings.
即ち、本発明によれば、被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識化物質とを、これらを混合させた状態で多孔性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、または被験物質に対する第一の結合物質への結合性がある物質、を有する多孔性担体上の反応部位において該被験物質と該標識化物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法において、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いて増感することによって被験物質の検出を行うことを含み、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とを異なる方向にして展開を行うことを特徴とするイムノクロマトグラフ方法が提供される。 That is, according to the present invention, a test substance and a labeled substance modified with a first binding substance for the test substance are developed on a porous carrier in a state where they are mixed, and a test substance for the test substance is obtained. Detecting the test substance by capturing the test substance and the labeled substance at a reaction site on a porous carrier having a second binding substance or a substance capable of binding to the first binding substance to the test substance A test substance is detected by sensitizing with an amplification liquid containing a silver-containing compound and a reducing agent for silver ions, and the development direction of the test substance and the amplification liquid There is provided an immunochromatographic method characterized in that the development is performed in a direction different from the development direction.
好ましくは、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが45度から170度である。
好ましくは、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが60度から150度である。
好ましくは、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが垂直である。
好ましくは、第一の結合物質及び／又は第二の結合物質が抗体である。
好ましくは、多孔質担体がニトロセルロースである。
Preferably, the development direction of the test substance and the development direction of the amplification solution are 45 degrees to 170 degrees.
Preferably, the development direction of the test substance and the development direction of the amplification solution are 60 degrees to 150 degrees.
Preferably, the developing direction of the test substance and the developing direction of the amplification solution are perpendicular.
Preferably, the first binding substance and / or the second binding substance is an antibody.
Preferably, the porous carrier is nitrocellulose.
好ましくは、標識物質が金属粒子である。
好ましくは、標識物質が、金、銀、白金、又はそれらの化合物である。
好ましくは、平均粒子サイズが1μｍ以上20μｍ以下のサイズを有する標識物質を検出する。
好ましくは、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感するための反応時間が７分以内である。
好ましくは、検出部位の標識物質の数が1×106／ｍｍ3以下である。
Preferably, the labeling substance is a metal particle.
Preferably, the labeling substance is gold, silver, platinum, or a compound thereof.
Preferably, a labeling substance having an average particle size of 1 μm or more and 20 μm or less is detected.
Preferably, the reaction time for sensitization using a silver-containing compound and a reducing agent for silver ions is within 7 minutes.
Preferably, the number of labeling substances at the detection site is 1 × 10 6 / mm 3 or less.
本発明では、増幅液との接触面と検出ラインまでの距離を短くすることで、増幅時間の短縮することができ、かつ、増幅時のムラを減少させることができるので、短時間で明瞭な測定結果を得ることができる。 In the present invention, by shortening the distance between the contact surface with the amplification liquid and the detection line, the amplification time can be shortened and unevenness during amplification can be reduced. Measurement results can be obtained.
金属コロイド標識物質及び金属硫化物標識物質を使用したイムノクロマトストリップに検体を滴下し展開させた後、前記の銀を含む増幅液を用いて増感する場合、前記標識物質と前記増幅液を接触させる必要がある。この方法として、（１）前記標識物質の存在部位に前記増幅液を滴下する、（２）イムノクロマトストリップ全体を前記増幅液に浸す、（３）イムノクロマトストリップの一部を前記増幅液に接触させ、毛細管現象を利用して吸上げる、などがある。しかしながら、前記工程（１）、（２）の場合、イムノクロマトストリップが水分を含んでいる状態では増幅液に接触させても平衡に達するまで時間がかかってしまい、増感するのに時間がかかってしまう。そのため、時間を短縮するためには、一度イムノクロマトストリップを乾燥させる必要がある。これに対し、前記工程（３）の場合、毛細管現象によりイムノクロマトストリップ中に存在する液体が次々に吸水パッドに吸収されていくので、液体の交換も迅速に行われる。この結果、前記工程（１）、（２）と比べ、標識の増感にかかる時間が短縮される。 When a specimen is dropped and developed on an immunochromatographic strip using a metal colloid labeling substance and a metal sulfide labeling substance and then sensitized with the amplification solution containing silver, the labeling material and the amplification solution are brought into contact with each other. There is a need. As this method, (1) the amplification solution is dripped at the site where the labeling substance is present, (2) the whole immunochromato strip is immersed in the amplification solution, (3) a part of the immunochromatographic strip is brought into contact with the amplification solution, For example, sucking up using capillary action. However, in the case of the steps (1) and (2), when the immunochromatographic strip contains water, it takes time to reach equilibrium even if it is brought into contact with the amplification solution, and it takes time to sensitize. End up. Therefore, in order to shorten the time, it is necessary to dry the immunochromatographic strip once. On the other hand, in the case of the step (3), the liquid present in the immunochromatographic strip is successively absorbed by the water absorption pad due to the capillary phenomenon, so that the liquid is also exchanged quickly. As a result, as compared with the steps (1) and (2), the time required for label sensitization is shortened.
また、前記工程（３）の場合に関しても、増幅液とイムノクロマトストリップとの接触面から検出ラインまでの距離が離れていると、増幅液が検出ラインまで達するのに時間がかかってしまう。増幅液とイムノクロマトストリップとの接触面から検出ラインまでの距離を短くする方法としては、検体の展開方向と増幅液の展開方向を異なる方向にする方法がある。これにより、検出ラインの一部を直接、もしくは検出ラインのごく近傍を増幅液に接触させることが可能になり、増幅液との接触面と検出ラインまでの距離が短縮でき、増幅時間の短縮に成功した。 Also in the case of the step (3), if the distance from the contact surface between the amplification solution and the immunochromato strip to the detection line is long, it takes time for the amplification solution to reach the detection line. As a method for shortening the distance from the contact surface between the amplification solution and the immunochromatographic strip to the detection line, there is a method in which the development direction of the specimen and the development direction of the amplification solution are different. This makes it possible to contact a part of the detection line directly or in the vicinity of the detection line with the amplification solution, shortening the distance between the contact surface with the amplification solution and the detection line, and shortening the amplification time. Successful.
本発明は、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが45度から170度の間なら、何度でも可能である。 The present invention can be performed any number of times as long as the direction of development of the test substance and the direction of development of the amplification solution are between 45 degrees and 170 degrees.
また、標識物質のシグナルを増幅させる場合、イムノクロマトストリップの検出ライン以外に存在する前記標識物質のシグナルも増幅させてしまい、ムラが生じる場合がある。この問題は、上記のように検出ラインに直接、もしくは検出ラインごく近傍に増幅液を接触させることで、解決することができる。 In addition, when the signal of the labeling substance is amplified, the signal of the labeling substance existing outside the detection line of the immunochromatographic strip is also amplified, resulting in unevenness. This problem can be solved by bringing the amplification solution into contact with the detection line directly or in the vicinity of the detection line as described above.
本発明による増幅操作は、被験物質を展開させた後に行う。その際、イムノクロマトストリップに付属していたパッド類をはずしても良いし、はずさなくても良く、さらに、増幅液の展開方向の下流に新たにパッド類を取り付けても良いし、取り付けなくても良い。また、増幅操作の際、ストリップ上流を増幅液に接触させるために、一部切断しても良いし、切断しなくても良く、その際、ストリップ上流に新たにパッド類を取り付けても良いし、取り付けなくても良い。 The amplification operation according to the present invention is performed after the test substance is developed. At this time, the pads attached to the immunochromatographic strip may or may not be removed, and further pads may or may not be attached downstream in the development direction of the amplification solution. good. Further, in the amplification operation, in order to bring the upstream of the strip into contact with the amplification solution, a part of the strip may be cut or may not be cut. In this case, a new pad may be attached to the upstream of the strip. It is not necessary to attach it.
本発明のイムノクロマトグラフ方法においては好ましくは、検出時に平均粒子サイズが1μｍ以上20μｍ以下のサイズを有する標識物質を検出することができる。検出時の標識の平均粒子サイズは、3μｍ以上20μｍ以下がさらに好ましい。 In the immunochromatography method of the present invention, preferably, a labeling substance having an average particle size of 1 μm or more and 20 μm or less can be detected during detection. The average particle size of the label at the time of detection is more preferably 3 μm or more and 20 μm or less.
検出時の標識の平均粒子サイズを本発明の範囲にする方法については、以下の手段があり、その手段を単独で使用してもかまわないし、組み合わせて使用してもかまわない。手段1としては、増幅時間があげられる。増幅時間は長い方が粒子サイズを大きくする事が出来る。また、手段2としては、還元剤の還元力の強さが上げられる。還元剤の還元力の強さが強いほど、粒子サイズを大きくする事が出来る。一方、還元剤の強さが強すぎると、検出前の標識以外の部分で新たな粒子が発生してしまう為、詳細なコントロールが必要である。例えば、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋の比率で還元剤の強さをコントロールする等の工夫が必要である。手段3としては、例えば銀イオンの様に、標識に付着してサイズを大きくする物質の濃度が上げられる。物質の濃度が濃いほど、粒子サイズを大きくする事が出来る。また、手段4としては、増幅温度があげられる、増幅温度は還元物質の種類、量、サイズを大きくする物質の濃度等により、最適温度が存在する。これらの組み合わせで、検出時の平均粒子サイズを1μｍ以上20μｍ以下にすることが重要である。なお、検出時の粒子サイズを本発明の1μｍ以上の大きさにすることは、特に7分以下の短時間では、非常に困難であるが、上記の条件を鋭意検討し、増幅をコントロールする事で、安定的に大きくする手段を見出すに至り、本発明の微量物資を検出するイムノクロマトキットの発明に至った。 As a method for bringing the average particle size of the label at the time of detection into the range of the present invention, there are the following means, and these means may be used alone or in combination. Means 1 include amplification time. The longer the amplification time, the larger the particle size. Further, as means 2, the strength of the reducing agent can be increased. The stronger the reducing power of the reducing agent, the larger the particle size. On the other hand, if the reducing agent is too strong, new particles are generated in portions other than the label before detection, and therefore detailed control is required. For example, it is necessary to devise such as controlling the strength of the reducing agent by the ratio of Fe2 + and Fe3 +. As the means 3, for example, the concentration of a substance that adheres to the label and increases its size, such as silver ions, is increased. The higher the concentration of the substance, the larger the particle size. Means 4 includes an amplification temperature. The amplification temperature has an optimum temperature depending on the kind, amount, and concentration of the substance that increases the size of the reducing substance. With these combinations, it is important that the average particle size at the time of detection is 1 μm or more and 20 μm or less. Although it is very difficult to make the particle size at the time of detection 1 μm or more of the present invention, especially in a short time of 7 minutes or less, the above conditions should be studied carefully to control amplification. Thus, a means for stably increasing the size was found, and the invention of an immunochromatography kit for detecting a trace amount of the present invention was reached.
好ましくは、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感するための反応時間は７分以内である。さらに好ましくは5分以内である。特に好ましくは90秒以下である。 Preferably, the reaction time for sensitization with a silver-containing compound and a reducing agent for silver ions is within 7 minutes. More preferably, it is within 5 minutes. Particularly preferably, it is 90 seconds or less.
好ましくは、検出部位の標識物質の数は1×106／ｍｍ3以下、さらに好ましくは1×105／ｍｍ3以下、特に好ましくは1×104／ｍｍ3以下である。 Preferably, the number of labeling substances at the detection site is 1 × 10 6 / mm 3 or less, more preferably 1 × 10 5 / mm 3 or less, and particularly preferably 1 × 10 4 / mm 3 or less.
また、本発明で用いるイムノクロマトキット、及びイムノクロマト方法に関する説明は、以下の通りである。 Moreover, the description regarding the immunochromatography kit and the immunochromatography method used by this invention is as follows.
１．イムノクロマト
一般に、イムノクロマトグラフ方法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被験出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
1. Immunochromatography In general, the immunochromatography method is a method for determining and measuring an analyte simply, quickly, and specifically by the following method. That is, a chromatographic carrier having at least one reaction site containing an immobilization reagent (antibody, antigen, etc.) that can bind to an analyte is used as a stationary phase. On the chromatographic carrier, a dispersion liquid in which a detection label modified by a reagent capable of binding to the analyte is dispersed is used as a moving layer to move chromatographically in the chromatographic carrier, and the analysis target The product reaches the reaction site while specifically binding to the detection label. In the reaction site, the immobilization reagent part is only present when the analyte is present in the analyte solution by specifically binding the complex of the analyte and the label for detection to the immobilization reagent. This is a technique for qualitatively and quantitatively analyzing the presence of a test substance in a liquid to be analyzed by visual observation or using an appropriate instrument.
本発明におけるイムノクロマトグラフ方法を行う装置は、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を内蔵していてもよく、前記固定化試薬に結合した前記分析対象物と検出用標識物の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度イムノクロマトグラフを行うことができる。 The apparatus for performing the immunochromatography method in the present invention may contain a compound containing silver and a reducing agent for silver ions, and a complex of the analyte bound to the immobilized reagent and a label for detection. The signal can be amplified by an amplification reaction using as a nucleus, and as a result, high sensitivity can be achieved. According to the present invention, a rapid and highly sensitive immunochromatograph can be performed.
２．被験試料
本発明のイムノクロマトグラフ方法で分析することのできる被験試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは***物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
2. Test sample The test sample that can be analyzed by the immunochromatographic method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that may contain an analyte, for example, a biological sample, particularly Animal (especially human) body fluids (eg blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose or sputum) or feces (eg feces), organs, tissues, mucous membranes and skin, Mention may be made of squeezed specimens (swabs), gargles or animals and plants themselves or their dried bodies that are considered to contain them.
３．被験試料の前処理
本発明のイムノクロマトグラフ方法では、前記被験試料をそのままで、あるいは、前記被験試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
3. Pretreatment of test sample In the immunochromatography method of the present invention, the test sample is used as it is, or in the form of an extract obtained by extracting the test sample with an appropriate extraction solvent, and further, the extraction The solution can be used in the form of a diluted solution obtained by diluting the solution with an appropriate diluent, or in the form obtained by concentrating the extract using an appropriate method. As the solvent for extraction, a solvent (for example, water, physiological saline, or buffer solution) used in usual immunological analysis methods, or direct antigen-antibody reaction by diluting with the solvent It is also possible to use a water-miscible organic solvent capable of
４．構成
本発明のイムノクロマトグラフ方法において使用することのできるイムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。また、ストリップの幅、形状に関しても、特に限定されるものでもなく、操作しやすい幅であれば問題ない。例えば、図１に模式的に従来のイムノクロマトグラフ用ストリップの平面図を模式的に示す。図２に図１で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
4). Structure The immunochromatographic strip that can be used in the immunochromatographic method of the present invention is not particularly limited as long as it is an immunochromatographic strip that can be used in a normal immunochromatographic method. Also, the width and shape of the strip are not particularly limited, and there is no problem as long as the width is easy to operate. For example, FIG. 1 schematically shows a plan view of a conventional immunochromatographic strip. FIG. 2 is a longitudinal sectional view schematically showing a longitudinal section of the immunochromatographic kit shown in FIG.
本発明のイムノクロマトグラフ用ストリップ１０は、展開方向（図１において矢印Ａで示す方向）の上流から下流に向かって、試料添加パッド５、標識化物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）２、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）３、及び吸収パッド４がこの順に、粘着シート５上に配置されている。 The immunochromatographic strip 10 of the present invention comprises a sample addition pad 5, a labeled substance holding pad (for example, a colloidal gold antibody holding pad) 2, from upstream to downstream in the developing direction (direction indicated by arrow A in FIG. 1), A chromatographic carrier (for example, an antibody-immobilized membrane) 3 and an absorption pad 4 are arranged on the adhesive sheet 5 in this order.
前記クロマトグラフ担体３は、補足部位３ａを有し、分析対象物と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾーン（検出部と記載することもある）３１を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール部と記載することもある）３２を更に有する。さらに、検出ゾーン３１およびコントロールゾーン３２は、増幅のための有機銀塩と銀イオンのための還元剤を含有する。 The chromatographic carrier 3 includes a detection zone (which may be referred to as a detection unit) 31 that has a supplementary site 3a and is an area in which an antibody or antigen that specifically binds to an analyte is immobilized. If desired, it further has a control zone (which may be referred to as a control part) 32 which is a region where a control antibody or antigen is immobilized. Furthermore, the detection zone 31 and the control zone 32 contain an organic silver salt for amplification and a reducing agent for silver ions.
前記標識化物質保持パッド２は、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。 The labeling substance holding pad 2 is prepared by preparing a suspension containing the labeling substance, applying the suspension to an appropriate absorbent pad (for example, a glass fiber pad), and then drying the suspension. be able to.
前記試料添加パッド１としては、例えばグラスファイバーパットを用いることができる。 As the sample addition pad 1, for example, a glass fiber pad can be used.
４−１．検出用標識物
検出用標識物は、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができる。例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子（又はコロイド）の平均粒径は、０．００１〜１０μｍ（より好ましくは０．００１〜１μｍ）の範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１〜500nmが好ましく、特に強い色調が得られる５〜100nmがさらに好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓ． Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４１，２０，（１９７３）等）により金コロイド粒子を調製することができる。
4-1. Label for detection Colored particles used for immunoagglutination can be used as the label for detection. For example, a metal such as a metal colloid can be used. The average particle diameter of the carrier particles (or colloid) is preferably in the range of 0.001 to 10 μm (more preferably 0.001 to 1 μm). Liposomes and microcapsules containing pigments can also be used as colored particles. Any conventionally known colored metal colloid can be used as colored particles for labeling. Examples thereof include a gold colloid, a silver colloid, a platinum colloid, an iron colloid, an aluminum hydroxide colloid, and a composite colloid thereof, and a gold colloid, a silver colloid, a platinum colloid, and a composite colloid thereof are preferable. In particular, gold colloid and silver colloid are preferable in that the gold colloid is red and the silver colloid is yellow at appropriate particle sizes. The average particle size of the metal colloid is preferably about 1 to 500 nm, and more preferably 5 to 100 nm, at which a particularly strong color tone can be obtained. The metal colloid and the specific binding substance can be bound according to a conventionally known method (for example, The Journal of Histochemistry and Cytology, Vol. 30, No. 7, pp 691-696, (1982)). That is, a metal colloid and a specific binding substance (for example, an antibody) are mixed in an appropriate buffer at room temperature for 5 minutes or more. After the reaction, the target metal colloid-labeled specific binding substance can be obtained by dispersing the precipitate obtained by centrifugation in a solution containing a dispersant such as polyethylene glycol. When gold colloid particles are used as the metal colloid, commercially available products may be used. Alternatively, colloidal gold particles can be prepared by a conventional method, for example, a method of reducing chloroauric acid with sodium citrate (Nature Phys. Sci., Vol. 241, 20, (1973), etc.).
本発明によれば、検出用標識物として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマー粒子標識を用いるイムノクロマトグラフにおいて、前記金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、前記分析対象物と検出用標識物の複合体の形成後に、有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、分析対象物の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。また、本発明における増幅反応は非常に早いため、標識に用いた金属コロイドの大きさに関係なく、良好な性質を示す。 According to the present invention, in an immunochromatograph using a metal colloid label or a metal sulfide label, other metal alloy label (hereinafter sometimes referred to as a metal-based label), or a polymer particle label containing a metal as a label for detection, The signal of the metallic label can be amplified. Specifically, after the complex of the analyte and the label for detection is formed, a reducing agent is brought into contact with silver ions and silver ions supplied from a silver-containing compound such as an organic silver salt. When the silver ions are reduced to produce silver particles, the silver particles are deposited on the metal label using the metal label as a nucleus, so that the metal label is amplified and analysis of the analyte is enhanced. Sensitivity can be implemented. Therefore, in the immunochromatography method of the present invention, the reaction of depositing on the label of the immune complex is carried out using silver particles generated by the reducing action of silver ions by the reducing agent, and thus the amplified signal is analyzed. Except for the above, conventionally known immunochromatographic methods can be applied as they are. In addition, since the amplification reaction in the present invention is very fast, it exhibits good properties regardless of the size of the metal colloid used for labeling.
４−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被験物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。
4-2. Binding substance In the present invention, the labeling substance is modified with a first binding substance for the test substance. The first binding substance has an affinity for the test substance, such as an antibody against the test substance (antigen), an antigen to the test substance (antibody), an aptamer to the test substance (protein, low molecular weight compound, etc.), etc. Any compound can be used.
本発明では、多孔性担体は、（ａ）被験物質に対する第二の結合物質、又は（ｂ）第一の結合物質への結合性を有する物質を有している。 該被験物質に対する第二の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでも良いし、同一のものでもよい。 In the present invention, the porous carrier has (a) a second binding substance for the test substance, or (b) a substance having binding properties to the first binding substance. The second binding substance to the test substance includes, for example, an antibody to the test substance (antigen), an antigen to the test substance (antibody), an aptamer to the test substance (protein, low molecular compound, etc.), and the like. Any compound having an affinity for it may be used. Further, the second binding substance and the first binding substance may be different or the same.
被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質とは、被験物質そのものでも良いし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被験物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などがそれにあたる。 The substance having the binding property to the first binding substance with respect to the test substance may be the test substance itself or a compound having a site recognized by the first binding substance. For example, a derivative of the test substance and a protein (for example, BSA) And the like).
好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／または第二の結合物質が抗体である。
本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
Preferably, the first binding substance is an antibody and / or the second binding substance is an antibody.
In the immunochromatographic method of the present invention, the antibody having specificity for the analyte is not particularly limited. For example, an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with the analyte, An immunoglobulin fraction purified from the antiserum, a monoclonal antibody obtained by cell fusion using spleen cells of an animal immunized with the analyte, or a fragment thereof [eg, F (ab ′) 2, Fab, Fab ′ or Fv] can be used. These antibodies can be prepared by a conventional method.
断片化抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウスIgG、マウスIgM、ラットIgG、ラットIgM、ウサギIgG、ウサギIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツジIgM等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはFab、F(ab')2等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。 Fragmented antibodies can be used regardless of the animal species or subclass. For example, antibodies that can be used in the present invention are mouse IgG, mouse IgM, rat IgG, rat IgM, rabbit IgG, rabbit IgM, goat IgG, goat IgM, sheep IgG, sheep IgM, and the like, polyclonal or monoclonal Applicable to both. A fragmented antibody is a molecule derived from a complete antibody having at least one antigen-binding site, and specifically, Fab, F (ab ′) 2, and the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzyme or chemical treatment or using genetic engineering techniques.
４−３．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
4-3. Chromatographic carrier The chromatographic carrier is preferably a porous carrier. In particular, a nitrocellulose film, a cellulose film, an acetylcellulose film, a polysulfone film, a polyethersulfone film, a nylon film, a glass fiber, a nonwoven fabric, a cloth, or a thread is preferable.
通常クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾーンを作製する。検出用物質は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。また、この検出用物質は、１種類の担体に２種類以上固定化することも可能である。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。 Usually, a detection zone is prepared by immobilizing a detection substance on a part of a chromatographic carrier. The detection substance may be directly immobilized on a part of the chromatographic carrier by physical or chemical bonding, or the detection substance may be physically or chemically bonded to fine particles such as latex particles. The fine particles may be trapped and immobilized on a part of the chromatographic carrier. Further, two or more kinds of detection substances can be immobilized on one kind of carrier. The chromatographic carrier is preferably used after immobilizing the detection substance and then subjecting it to nonspecific adsorption prevention treatment by treatment with an inactive protein or the like.
４−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
4-4. Sample addition pad Examples of the material of the sample addition pad include, but are not limited to, cellulose filter paper, glass fiber, polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nylon, and cotton cloth having uniform characteristics. The sample addition unit not only accepts a sample containing the added analysis target, but also has a function of filtering insoluble matter particles and the like in the sample. In addition, in order to prevent the analyte in the sample from adsorbing nonspecifically on the material of the sample addition part and reducing the accuracy of the analysis, the material constituting the sample addition part is preliminarily nonspecific. In some cases, the anti-adsorption treatment is used.
４−５．標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
4-5. Labeling substance holding pad Examples of the material of the labeling substance holding pad include cellulose filter paper, glass fiber, and non-woven fabric. The labeling substance holding pad is impregnated with a predetermined amount of the detection label prepared as described above and dried. To do.
４−６．吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
4-6. Absorption pad The absorption pad is a part that absorbs and removes unreacted labeling substances that are not insolubilized in the detection part of the chromatographic carrier while the added sample is physically absorbed by the chromatographic movement. Cellulose filter paper, non-woven fabric Water-absorbing materials such as cloth and cellulose acetate are used. The chromatographic speed after the chromatographic tip of the added sample reaches the absorber varies depending on the material, size, etc. of the absorbent, so it is possible to set a speed that suits the measurement of the analyte. it can.
５．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法及び競合法について説明する。
（サンドイッチ法）
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第1抗体を、予め標識化しておく。第２抗体を、適当な不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、被験物質（抗原）を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と接触させると、その被験試料中に被験物質が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第1抗体を更に接触させると、被験試料中に被験物質が存在する場合には、固定化第2抗体と被験物質（抗原）と標識化第1抗体とからなる免疫複合体が形成される。
5. Hereinafter, the sandwich method and the competitive method, which are specific embodiments of the chromatographic method of the present invention, will be described.
(Sandwich method)
The sandwich method is not particularly limited. For example, the test substance can be analyzed by the following procedure. First, a first antibody and a second antibody having specificity for a test substance (antigen) are prepared in advance by the method described above. The first antibody is labeled in advance. A second antibody is immobilized on a suitable insoluble carrier (for example, a nitrocellulose membrane, a glass fiber membrane, a nylon membrane, or a cellulose membrane), and a test sample that may contain a test substance (antigen) ( Or when the test substance is present in the test sample, an antigen-antibody reaction occurs. This antigen-antibody reaction can be performed in the same manner as a normal antigen-antibody reaction. At the same time as or after the antigen-antibody reaction, when an excessive amount of the labeled first antibody is further contacted, if the test substance is present in the test sample, the immobilized second antibody, the test substance (antigen) and the label An immune complex consisting of the first antibody is formed.
サンドイッチ法では、固定化第２抗体と分析対象物（抗原）と第１抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第１抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化第２抗体を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第１抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化第１抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時に薄膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第１抗体の標識からの信号を増幅する。 In the sandwich method, after the reaction between the immobilized second antibody, the analyte (antigen), and the first antibody is completed, the labeled first antibody that did not form the immune complex is removed. By supplying a metal ion and a reducing agent to a region where the immobilized second antibody is immobilized on the insoluble thin film support, a signal from the label of the labeled first antibody that forms the immune complex is amplified. Alternatively, a metal ion and a reducing agent are added to the labeled first antibody and simultaneously added to the thin film support, thereby amplifying the signal from the label of the labeled first antibody that has formed the immune complex.
（競合法）
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。
(Competitive law)
The competitive method is not particularly limited. For example, the test substance can be analyzed by the following procedure. The competition method is known as a technique for detecting an antigen of a low molecular weight compound that cannot be assayed by the sandwich method.
まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体を予め調製しておく。また、第１抗体を、予め金属コロイドなどで標識化しておく。第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物を、適当な不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定しておく。被験物質（抗原）を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と接触させると、その被験試料中に被験物質が存在しない場合には、標識化された第一抗体と、第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物とにより、不溶性担体上の抗原抗体反応が起きる。一方、被験物質が存在する場合には、標識された第1抗体に被験物質（抗原）が結合するため、その後の第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物との、第一の不溶性担体上の抗原抗体反応が阻害され、抗原抗体反応による結合が起こらない。 First, a first antibody having specificity for a test substance (antigen) is prepared in advance. In addition, the first antibody is previously labeled with a metal colloid or the like. A test substance itself having a binding property to the first antibody, or a compound having a site similar to the test substance and having the same epitope for the first antibody as the test substance is treated with an appropriate insoluble carrier (for example, a nitrocellulose membrane). Glass fiber membrane, nylon membrane, cellulose membrane or the like). When contacted with a test sample (or an extract thereof) that may contain a test substance (antigen), if the test substance is not present in the test sample, the labeled first antibody and the first antibody An antigen-antibody reaction on an insoluble carrier occurs by the test substance itself having a binding property to the test substance or a compound having the same epitope for the first antibody as the test substance. On the other hand, if the test substance is present, the test substance (antigen) binds to the labeled first antibody, and therefore has the binding ability to the subsequent first antibody, or similar to the test substance itself or the test substance The antigen-antibody reaction on the first insoluble carrier with a compound having a specific site and having the same epitope for the first antibody as the test substance is inhibited, and binding due to the antigen-antibody reaction does not occur.
第一抗体に対して結合性を有する固定化物と標識化された第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性支持体における固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅して検出することもできる。あるいは、標識化第1抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時に薄膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅し、検出・測定することもできる。 After the reaction between the immobilized product having the binding property to the first antibody and the labeled first antibody is completed, the labeled first antibody that did not form the immune complex is removed. In addition, by supplying a metal ion and a reducing agent to the fixed region of the insoluble support, a signal from the label of the labeled first antibody that forms the immune complex can be amplified and detected. Alternatively, by adding a metal ion and a reducing agent to the labeled first antibody and simultaneously adding it to the thin film support, the signal from the label of the labeled first antibody forming the immune complex is amplified and detected.・ It can also be measured.
６．増幅液
本発明において、使用することのできる増幅液とは、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液のことである。
本発明では、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、どんなものでも増幅液として用いることができる。また、使用する増幅液の粘度が変わると増幅に必要な時間は変わるが、標識の信号を検出できるようになる増幅時間を検討することで、解決できる。
6). Amplification solution In the present invention, the amplification solution that can be used is a general book in the field of photographic chemistry (for example, “Basics of Revised Photographic Engineering-Silver Salt Photography Edition” (Japan Photographic Society, Corona), It is a so-called developer as described in “Photochemistry” (Akira Sakurai, Photographic Publishing Co., Ltd.), “Latest Prescription Handbook” (Shinichi Kikuchi et al., Amiko Publishing Co., Ltd.).
In the present invention, any so-called physical developer that contains silver ions in the solution and is reduced mainly by metal colloids or the like in which the silver ions in the solution become the core of development is used as the amplification solution. be able to. Further, when the viscosity of the amplification solution used changes, the time required for amplification changes, but this can be solved by examining the amplification time at which the signal of the label can be detected.
７．銀を含む化合物
本発明で用いる銀含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。
7). Compound containing silver As the silver-containing compound used in the present invention, an organic silver salt, an inorganic silver salt, or a silver complex can be used.
本発明に用いられる有機銀塩は、還元可能な銀イオンを含む有機化合物である。本発明で用いられる、還元可能な銀イオンを含む化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体など何でも良い。例えば、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀などが知られている。
また還元剤の存在下で５０℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する銀塩または配位化合物であってもよい。
The organic silver salt used in the present invention is an organic compound containing a reducible silver ion. The compound containing reducible silver ions used in the present invention may be any organic silver salt, inorganic silver salt, or silver complex. For example, silver nitrate, silver acetate, silver lactate, silver butyrate and the like are known.
Further, it may be a silver salt or a coordination compound that forms metallic silver that is relatively stable to light when heated to 50 ° C. or higher in the presence of a reducing agent.
本発明に用いられる有機銀塩は、アゾ−ル化合物の銀塩およびメルカプト化合物の銀塩より選ばれる化合物がであってもよい。好ましくは、アゾ−ル化合物としては含窒素ヘテロ環化合物であり、より好ましくはトリアゾ−ル化合物およびテトラゾ−ル化合物である。メルカプト化合物は、メルカプト基またはチオン基を分子内に少なくとも１つ有する化合物である。 The organic silver salt used in the present invention may be a compound selected from a silver salt of an azole compound and a silver salt of a mercapto compound. Preferably, the azole compound is a nitrogen-containing heterocyclic compound, more preferably a triazole compound or a tetrazole compound. The mercapto compound is a compound having at least one mercapto group or thione group in the molecule.
本発明における窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩は、好ましくはイミノ基を有する化合物の銀塩である。代表的な化合物としては次にあげるものであるが、これらの化合物に限定されることはない。１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、又はベンゾトリアゾ−ルおよびその誘導体の銀塩（例えば、メチルベンゾトリアゾ−ル銀塩又は５−クロロベンゾトリアゾ−ル銀塩）、米国特許第４，２２０，７０９に記載されているフェニルメルカプトテトラゾ−ルのような１Ｈ−テトラゾ−ル化合物、米国特許第４，２６０，６７７に記載のイミダゾ−ルおよびイミダゾ−ル誘導体。この種の銀塩のうち、特に好ましい化合物はベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩、又はこれらの２つ以上の混合物である。 The silver salt of the nitrogen-containing heterocyclic compound in the present invention is preferably a silver salt of a compound having an imino group. Representative compounds are listed below, but are not limited to these compounds. Silver salt of 1,2,4-triazole, or silver salt of benzotriazole and its derivatives (eg, methylbenzotriazole silver salt or 5-chlorobenzotriazole silver salt), US Pat. 1H-tetrazole compounds such as phenyl mercaptotetrazole described in US Pat. No. 4,220,709, and imidazole and imidazole derivatives described in US Pat. No. 4,260,677. Among such silver salts, particularly preferred compounds are silver salts of benzotriazole derivatives or mixtures of two or more thereof.
本発明に用いられる窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩として最も好ましくは、ベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩である。 The silver salt of the nitrogen-containing heterocyclic compound used in the present invention is most preferably a silver salt of a benzotriazole derivative.
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物は、好ましくは５つまたは６つの原子を含むヘテロ環化合物である。この場合に環中の原子の少なくとも１つは窒素原子であり、その他の原子は炭素、酸素、硫黄原子である。このようなヘテロ環化合物としてはトリアゾ−ル類オキサゾ−ル類、チアゾ−ル類、チアゾリン類、イミダゾ−ル類、ジアゾ−ル類、ピリジン類、およびトリアジン類が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。 The compound having a mercapto group or thione group in the present invention is preferably a heterocyclic compound containing 5 or 6 atoms. In this case, at least one of the atoms in the ring is a nitrogen atom, and the other atoms are carbon, oxygen, and sulfur atoms. Such heterocyclic compounds include, but are not limited to, triazoles, oxazoles, thiazoles, thiazolines, imidazoles, diazoles, pyridines, and triazines. I don't mean.
メルカプト基またはチオン基を持つ化合物の銀塩のうち代表的な化合物を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない。 Representative examples of the silver salt of a compound having a mercapto group or a thione group are listed below, but are not limited thereto.
３−メルカプト−４−フェニル−１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−ベンズイミダゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−５−アミノチアゾ−ルの銀塩、メルカプトトリアジンの銀塩、２−メルカプトベンゾオキサゾ−ルの銀塩、および米国特許第４，１２３，２７４記載の化合物の銀塩。 Silver salt of 3-mercapto-4-phenyl-1,2,4-triazole, silver salt of 2-mercapto-benzimidazole, silver salt of 2-mercapto-5-aminothiazol, silver of mercaptotriazine Salts, silver salts of 2-mercaptobenzoxazole, and silver salts of the compounds described in US Pat. No. 4,123,274.
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物としては、ヘテロ環を含まない化合物を用いることも出来る。ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体としては、総炭素数が１０以上の脂肪族または芳香族炭化水素化合物が好ましい。
ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体のうち有用な化合物としては以下に挙げるものがあるが、これらに制限されるわけではない。
チオグリコ−ル酸銀塩（例えば炭素原子数１２から２２までのアルキル基を持つＳ−アルキルチオグリコ−ル酸の銀塩）、ジチオカルボン酸の銀塩（たとえばジチオ酢酸の銀塩又はチオアミドの銀塩）
As the compound having a mercapto group or thione group in the present invention, a compound containing no heterocycle can also be used. As the mercapto or thione derivative not containing a heterocyclic ring, an aliphatic or aromatic hydrocarbon compound having a total carbon number of 10 or more is preferable.
Among the mercapto or thione derivatives that do not contain a heterocycle, useful compounds include the following, but are not limited thereto.
Silver salt of thioglycolate (for example, silver salt of S-alkylthioglycolic acid having an alkyl group having 12 to 22 carbon atoms), silver salt of dithiocarboxylic acid (for example, silver salt of dithioacetic acid or silver salt of thioamide) )
カルボン酸の銀塩を持つ有機化合物もまた好ましく用いられる。例えば、直鎖のカルボン酸である。具体的には、Ｃ数６〜２２のカルボン酸が好ましく用いられる。加えて芳香族カルボン酸の銀塩である。芳香族カルボン酸とその他のカルボン酸の例として、以下の化合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
置換または無置換の安息香酸銀（例えば３，５−ジヒドロキシ安息香酸銀、ｏ−メチル安息香酸銀、ｍ−メチル安息香酸銀、ｐ−メチル安息香酸銀、２，４−ジクロロ安息香酸銀、アセタミド安息香酸銀、およびｐ−フェニル安息香酸銀）、タンニン酸銀、フタル酸銀、テレフタル酸銀、サリチル酸銀、フェニル酢酸銀、又はピロメリット酸銀。
An organic compound having a silver salt of carboxylic acid is also preferably used. For example, a linear carboxylic acid. Specifically, a C 6-22 carboxylic acid is preferably used. In addition, it is a silver salt of an aromatic carboxylic acid. Examples of aromatic carboxylic acids and other carboxylic acids include, but are not limited to, the following compounds.
Substituted or unsubstituted silver benzoate (eg, silver 3,5-dihydroxybenzoate, silver o-methylbenzoate, silver m-methylbenzoate, silver p-methylbenzoate, silver 2,4-dichlorobenzoate, acetamide Silver benzoate and silver p-phenylbenzoate), silver tannate, silver phthalate, silver terephthalate, silver salicylate, silver phenylacetate, or silver pyromellitic acid.
本発明においては米国特許第３，３３０，６６３に記載されたようなチオエ−テル基を含む脂肪酸銀もまた好ましく用いられる。エ−テルまたはチオエ−テル結合を含む炭化水素鎖を有するか、α−位（炭化水素基の上）またはオルト位（芳香族基の上）に立体的に遮蔽された置換基を有する可溶性のカルボン酸銀も用いることができる。これらは、塗布溶媒中で溶解性が向上し、光散乱が少ない塗布物になる。
そのような銀のカルボン酸塩は、米国特許第５，４９１，０５９に記載されている。ここで記載されている銀塩の混合物はどれでも、本発明においては必要に応じて使うことができる。
米国特許第４，５０４，５７５に記載のスルホン酸塩の銀塩もまた、本発明の態様においては使用することが出来る。
In the present invention, fatty acid silver containing a thioether group as described in US Pat. No. 3,330,663 is also preferably used. Soluble having a hydrocarbon chain containing an ether or thioether bond or having a sterically shielded substituent in the α-position (above the hydrocarbon group) or the ortho-position (above the aromatic group) Silver carboxylate can also be used. These have improved solubility in a coating solvent and become a coated product with little light scattering.
Such silver carboxylates are described in US Pat. No. 5,491,059. Any of the silver salt mixtures described herein can be used as needed in the present invention.
The silver salts of sulfonates described in US Pat. No. 4,504,575 can also be used in embodiments of the present invention.
さらに、本発明においては例えば米国特許第４，７６１，３６１と米国特許第４，７７５，６１３に記載のアセチレンの銀塩も使用することが出来る。米国特許第６，３５５，４０８に記載のコア−シェル型銀塩として提供されることもできる。これらの銀塩は、一つ以上の銀塩から成るコアと一つ以上の異なる銀塩からなるシェルで構成される。 Further, in the present invention, for example, acetylene silver salts described in US Pat. No. 4,761,361 and US Pat. No. 4,775,613 can be used. It can also be provided as a core-shell type silver salt as described in US Pat. No. 6,355,408. These silver salts are composed of a core made of one or more silver salts and a shell made of one or more different silver salts.
本発明中において、非感光性銀源としてもう一つ有用なものは米国特許６４７２１３１に記載の２つの異なった銀塩から構成される銀の二量体合成物である。そのような非感光性の銀の二量体合成物は２つの異なる銀塩から成る。前記二種の銀塩が直鎖の飽和炭化水素基を銀の配位子として含む場合にはそれら配位子の炭素原子数の差が６以上である。
有機銀塩は、銀として一般に０．００１モル／ｍ2〜０．２モル／ｍ2、好ましくは０．００１モル／ｍ2〜０．０５モル／ｍ2含有される。
In the present invention, another useful non-photosensitive silver source is a silver dimer composition composed of two different silver salts described in US Pat. No. 6,472,131. Such non-photosensitive silver dimer composites consist of two different silver salts. When the two kinds of silver salts contain a linear saturated hydrocarbon group as a silver ligand, the difference in the number of carbon atoms of the ligands is 6 or more.
The organic silver salt is generally contained in an amount of 0.001 mol / m 2 to 0.2 mol / m 2 , preferably 0.001 mol / m 2 to 0.05 mol / m 2 as silver.
本発明に用いられる無機銀塩、もしくは銀錯体は、還元可能な銀イオンを含む化合物である。好ましくは、還元剤の存在下で５０℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する無機銀塩、もしくは銀錯体である。
本発明に用いられる無機銀塩は、例えば、ハロゲン化銀（塩化銀、臭化銀、塩臭化銀、ヨウ化銀、塩ヨウ化銀、塩ヨウ臭化銀、およびヨウ臭化銀等）、チオ硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、チオシアン酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、および亜硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩等が挙げられる。
The inorganic silver salt or silver complex used in the present invention is a compound containing a reducible silver ion. Preferably, it is an inorganic silver salt or silver complex that forms metallic silver that is relatively stable to light when heated to 50 ° C. or higher in the presence of a reducing agent.
The inorganic silver salt used in the present invention is, for example, silver halide (silver chloride, silver bromide, silver chlorobromide, silver iodide, silver chloroiodide, silver chloroiodobromide, silver iodobromide, etc.) Silver salts of thiosulfates (eg, sodium, potassium, or ammonium salts), silver salts of thiocyanate (eg, sodium, potassium, or ammonium salts), and sulfites (eg, sodium) Salt, potassium salt, or ammonium salt).
本発明に用いられる無機銀塩は、好ましくはハロゲン化銀である。
本発明に用いられるハロゲン化銀の粒子形成方法は、写真業界でよく知られており、例えば、リサーチディスクロージャー１９７８年６月の第１７０２９号、及び米国特許第３，７００，４５８号に記載されている方法を用いることができるが、具体的にはゼラチンあるいは他のポリマー溶液中に銀供給化合物（例えば、硝酸銀）及びハロゲン供給化合物を添加することにより調製される。
The inorganic silver salt used in the present invention is preferably silver halide.
Silver halide grain formation methods used in the present invention are well known in the photographic industry and are described, for example, in Research Disclosure No. 17029, June 1978, and US Pat. No. 3,700,458. Can be used, but is specifically prepared by adding a silver-feeding compound (eg, silver nitrate) and a halogen-feeding compound into gelatin or other polymer solution.
ハロゲン化銀の粒子サイズは、検査ノイズを小さくする上で微細であることが好ましく、具体的には０．２０μｍ以下、より好ましくは０．１０μｍ以下、更に好ましくはナノ粒子の範囲がよい。ここでいう粒子サイズとは、ハロゲン化銀粒子の投影面積（平板粒子の場合は主平面の投影面積）と同面積の円像に換算したときの直径をいう。 The grain size of silver halide is preferably fine in order to reduce inspection noise, specifically 0.20 μm or less, more preferably 0.10 μm or less, and still more preferably in the range of nanoparticles. The grain size here means the diameter when converted into a circular image having the same area as the projected area of silver halide grains (in the case of tabular grains, the projected area of the main plane).
チオ硫酸銀、チオシアン酸銀、および亜硫酸銀等もハロゲン化銀と同様の粒子形成方法により銀供給化合物（例えば、硝酸銀）及びチオ硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、チオシアン酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、および亜硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）を混合することにより調製される。 Silver thiosulfate, silver thiocyanate, silver sulfite, and the like can be obtained from a silver supply compound (for example, silver nitrate) and thiosulfate (for example, sodium salt, potassium salt, or ammonium salt) by the same grain forming method as silver halide. It is prepared by mixing a silver salt, a silver salt of thiocyanate (for example, sodium salt, potassium salt, or ammonium salt) and a sulfite (for example, sodium salt, potassium salt, or ammonium salt).
また、一般に増幅液中の銀イオン濃度が高すぎると、増幅液中で銀イオンが還元されてしまうので、それを防ぐ為に錯化剤を用いて銀イオンが錯体を形成するようにしてもよい。このような錯化剤としては、グリシン、ヒスチジンのようなアミノ酸及び複素環式塩基や、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、プリン、ピリジン、アミノピリジン、ニコチンアミド、キノリン、その他類似の芳香族複素環式系が知られており、例えばヨーロッパ特許第0293947号中に記載されている。また、錯塩形成剤としては、チオ硫酸塩やチオシアン酸塩なども用いることができる。本発明に用いられる銀錯体の具体例としては、例えば、チオ硫酸塩と銀イオンの錯体、チオシアン酸塩と銀イオンの錯体、またはこれらの複合銀錯体、および、シュガーチオン誘導体と銀イオンの錯体、環状イミド化合物（例えば、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸など）と銀イオンの錯体、１，１−ビススルホニルアルカン類と銀イオンの錯体である。本発明に用いられる好ましい銀錯体は、環状イミド化合物（例えば、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸など）と銀イオンの錯体である。 In general, if the silver ion concentration in the amplification solution is too high, silver ions are reduced in the amplification solution. To prevent this, silver ions may form a complex using a complexing agent. Good. Such complexing agents include amino acids and heterocyclic bases such as glycine and histidine, imidazole, benzimidazole, pyrazole, purine, pyridine, aminopyridine, nicotinamide, quinoline, and other similar aromatic heterocyclic groups. Systems are known and are described, for example, in EP 0293947. Further, as the complex salt forming agent, thiosulfate and thiocyanate can be used. Specific examples of the silver complex used in the present invention include, for example, a thiosulfate and silver ion complex, a thiocyanate and silver ion complex, or a complex silver complex thereof, and a sugar thione derivative and a silver ion complex. And a complex of a cyclic imide compound (for example, uracil, urazole, 5-methyluracil, barbituric acid, etc.) and silver ion, or a complex of 1,1-bissulfonylalkane and silver ion. A preferable silver complex used in the present invention is a complex of a cyclic imide compound (for example, uracil, urazole, 5-methyluracil, barbituric acid, etc.) and silver ion.
本発明に用いられる銀錯体は、通常知られている塩形成反応により調製することができる。例えば、水もしくは水混和性溶媒中で水溶性銀供給体（例えば、硝酸銀）と銀錯体に対応する配位子化合物とを混合することにより調製される。調製された銀錯体は、透析法もしくは限外濾過法などの公知の脱塩方法により副成する塩類を除去して用いることが出来る。 The silver complex used in the present invention can be prepared by a generally known salt forming reaction. For example, it is prepared by mixing a water-soluble silver supplier (for example, silver nitrate) and a ligand compound corresponding to the silver complex in water or a water-miscible solvent. The prepared silver complex can be used after removing by-product salts by a known desalting method such as dialysis or ultrafiltration.
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に０．００１モル／ｍ2〜０．２モル／ｍ2、好ましくは０．０１モル／ｍ2〜０．０５モル／ｍ2含有される。 The inorganic silver salt or silver complex is generally contained in an amount of 0.001 mol / m 2 to 0.2 mol / m 2 , preferably 0.01 mol / m 2 to 0.05 mol / m 2 as silver.
また、無機銀塩または銀錯体を使用する場合は、無機銀塩もしくは銀錯体の溶剤を含有することが好ましい。本発明に用いられる溶剤としては、上記の銀錯体の項で説明した銀錯体を形成する配位子として用いられる化合物が好ましく用いられる。例えば、チオ硫酸塩、チオシアン酸塩、シュガーチオン誘導体、環状イミド化合物、および１，１−ビススルホニルアルカン類糖である。本発明に用いられる溶剤として、より好ましくは、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸などの環状イミド化合物である。本発明に用いられる溶剤は、銀イオンに対してモル比で０．１モル〜１０モルの範囲で好ましく用いられる。 Moreover, when using inorganic silver salt or a silver complex, it is preferable to contain the solvent of an inorganic silver salt or a silver complex. As the solvent used in the present invention, a compound used as a ligand for forming the silver complex described in the section of the silver complex is preferably used. For example, thiosulfate, thiocyanate, sugar thione derivative, cyclic imide compound, and 1,1-bissulfonylalkane sugar. The solvent used in the present invention is more preferably a cyclic imide compound such as uracil, urazole, 5-methyluracil, and barbituric acid. The solvent used in the present invention is preferably used in the range of 0.1 to 10 moles with respect to silver ions.
８．銀イオンのための還元剤
銀イオンのための還元剤は、銀（Ｉ）イオンを銀に還元することができる無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元
性金属塩、還元性金属錯塩が知られており、本発明に用いることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe+2を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。
本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
8). Reducing agent for silver ions The reducing agent for silver ions can be any inorganic or organic material that can reduce silver (I) ions to silver, or a mixture thereof.
As the inorganic reducing agent, there are known reducing metal salts and reducing metal complex salts whose valence can be changed by metal ions such as Fe 2+ , V 2+ , Ti 3+ , etc., and can be used in the present invention. it can. When using an inorganic reducing agent, it is necessary to complex or reduce the oxidized ions to remove or render them harmless. For example, in a system using Fe + 2 as a reducing agent, a complex of Fe3 + which is an oxide can be formed using citric acid or EDTA and rendered harmless.
In this system, it is preferable to use such an inorganic reducing agent, more preferably a metal salt of Fe2 +.
また、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料は、たとえば米国特許第６，０２０，１１７号（バウアーほか）で記述されるように、本発明において用いることができる。 Further, developing agents used in wet silver halide photographic light-sensitive materials (for example, methyl gallate, hydroquinone, substituted hydroquinone, 3-pyrazolidones, p-aminophenols, p-phenylenediamines, hindered phenols, amidoximes , Azines, catechols, pyrogallols, ascorbic acid (or derivatives thereof, and leuco dyes), and other materials apparent to those skilled in the art, for example, see US Pat. , 020, 117 (Bauer et al.) Can be used in the present invention.
「アスコルビン酸還元剤」はアスコルビン酸、その誘導体との複合体を意味する。アスコルビン酸還元剤は下記のように多くの文献において記載されており、例えば米国特許第５，２３６，８１６号（Ｐｕｒｏｌほか）とその中で引用されている文献が挙げられる。 “Ascorbic acid reducing agent” means a complex of ascorbic acid and its derivatives. Ascorbic acid reducing agents are described in many documents as described below, for example, US Pat. No. 5,236,816 (Purol et al.) And the literature cited therein.
本発明における還元剤として、アスコルビン酸還元剤が好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含む。そのような化合物は含む以下にあげるものであるが、これらに限定されるわけではない。
Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸）、たとえば米国特許第５，４９８，５１１、ＥＰ−Ａ−０５８５，７９２、ＥＰ−Ａ−０５７３７００、ＥＰ−Ａ−０５８８４０８、米国特許第５，０８９，８１９、米国特許第５，２７８，０３５、米国特許第５，３８４，２３２、米国特許第５，３７６，５１０、ＪＰ７−５６２８６、米国特許第２，６８８，５４９、およびＲｅｓｅａｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ３７１５２（１９９５年３月）に記載されているような化合物。
As the reducing agent in the present invention, an ascorbic acid reducing agent is preferable. Useful ascorbic acid reducing agents include ascorbic acid analogs, isomers and derivatives thereof. Such compounds include, but are not limited to, those listed below.
D- or L-ascorbic acid and sugar derivatives thereof (eg, γ-lactoascorbic acid, glucoascorbic acid, fucoscorbic acid, glucoheptascorbic acid, maltoascorbic acid), sodium salt of ascorbic acid, potassium salt of ascorbic acid, Isoascorbic acid (or L-erythroascorbic acid), salts thereof (eg, alkali metal salts, ammonium salts or salts known in the art), enediol type ascorbic acid, enaminol type ascorbic acid, thioeno- Type ascorbic acid), e.g. U.S. Pat. No. 5,498,511, EP-A-0585,792, EP-A-0573700, EP-A-0588408, U.S. Pat. No. 5,089,819, U.S. Pat. 278,035, US patent 5,384,232, U.S. Pat. No. 5,376,510, JP7-56286, U.S. Patent No. 2,688,549, and Reseach Disclosure37152 compound as described in (March 1995).
これらの化合物のうち、好ましくは、Ｄ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）であり、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。 Among these compounds, D, L or D, L-ascorbic acid (and its alkali metal salt) or isoascorbic acid (or its alkali metal salt) is preferable, and a sodium salt is a preferable salt. A mixture of these reducing agents can be used as necessary.
ヒンダードフェノール類も単独で、または一つ以上の硬調化還元剤とコントラスト強化剤と組み合わせて好ましく用いられる。
ヒンダードフェノールは、ベンゼン環上に一つだけの水酸基を有し、少なくとも一つの置換基を水酸基に対してオルト位に有する化合物である。ヒンダードフェノール還元剤は複数の水酸基を別々のベンゼン環に持っていれば、複数の水酸基を有していて構わない。
ヒンダードフェノール還元剤は、たとえば、ビナフトール類（すなわちジヒドロキシビナフトール類）、ビフェノール類（すなわちジヒドロキシビフェノール類）、ビス（ヒドロキシナフチル）メタン類、ビス（ヒドロキシフェニル）メタン類（すなわちビスフェノール類）、ヒンダ−ドフェノール類、およびヒンダードナフトール類が挙げられ、これらは置換されていて構わない。
Hindered phenols are also preferably used alone or in combination with one or more contrast reducing agents and contrast enhancing agents.
A hindered phenol is a compound having only one hydroxyl group on the benzene ring and having at least one substituent in the ortho position relative to the hydroxyl group. The hindered phenol reducing agent may have a plurality of hydroxyl groups as long as it has a plurality of hydroxyl groups in separate benzene rings.
Hindered phenol reducing agents include, for example, binaphthols (ie dihydroxybinaphthols), biphenols (ie dihydroxybiphenols), bis (hydroxynaphthyl) methanes, bis (hydroxyphenyl) methanes (ie bisphenols), hinders Examples include dophenols and hindered naphthols, which may be substituted.
代表的なビナフトール類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１，１’−ビ−２−ナフトール、１，１’−ビ−４−メチル−２−ナフトール、および米国特許第３，０９４，４１７号と米国特許第５，２６２，２９５号に記載されている化合物。
Representative binaphthols are the following compounds, but are not limited thereto.
1,1′-bi-2-naphthol, 1,1′-bi-4-methyl-2-naphthol, and described in US Pat. No. 3,094,417 and US Pat. No. 5,262,295 Compound.
代表的なビフェノール類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）−４−メチル−６−ｎ−ヘキシルフェノール、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラ−ｔ−ブチルビフェニル、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラメチルビフェニル、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
Representative biphenols are the compounds listed below, but are not limited thereto.
2- (2-Hydroxy-3-tert-butyl-5-methylphenyl) -4-methyl-6-n-hexylphenol, 4,4'-dihydroxy-3,3 ', 5,5'-tetra-t -Butylbiphenyl, 4,4'-dihydroxy-3,3 ', 5,5'-tetramethylbiphenyl, and compounds described in US Pat. No. 5,262,295.
代表的なビス（ヒドロキシナフチル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
４，４’−メチレンビス（２−メチル−１−ナフト−ル）、米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
Representative bis (hydroxynaphthyl) methanes are the following compounds, but are not limited thereto.
4,4′-Methylenebis (2-methyl-1-naphthol), a compound described in US Pat. No. 5,262,295.
代表的なビス（ヒドロキシフェニル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
ビス（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）メタン（ＣＡＯ−５）、１，１’−ビス（２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルフェニル）−３，５，５−トリメチルヘキサン（ＮＯＮＯＸまたはＰＥＲＭＡＮＡＸ ＷＳＯ）、１，１’−ビス（３，５−ｄｉ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）メタン、２，２’−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、４，４’−エチリデン−ビス（２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノ−ル）、２，２’−イソブチリデン−ビス（４，６−ジメチルフェノ−ル）（ＬＯＷＩＮＯＸ ２２１Ｂ４６）、２，２’−ビス（３，５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
Representative bis (hydroxyphenyl) methanes are the compounds listed below, but are not limited thereto.
Bis (2-hydroxy-3-tert-butyl-5-methylphenyl) methane (CAO-5), 1,1′-bis (2-hydroxy-3,5-dimethylphenyl) -3,5,5-trimethyl Hexane (NONOX or PERMANAX WSO), 1,1′-bis (3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl) methane, 2,2′-bis (4-hydroxy-3-methylphenyl) propane, 4,4'-ethylidene-bis (2-t-butyl-6-methylphenol), 2,2'-isobutylidene-bis (4,6-dimethylphenol) (LOWINOX 221B46), 2,2'- Bis (3,5-dimethyl-4-hydroxyphenyl) propane and the compounds described in US Pat. No. 5,262,295.
代表的なヒンダードフェノールは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２，６−ジ−ｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，４−ジ−ｔ−ブチルフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，６−ジメチルフェノール、および２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノール。
Representative hindered phenols are the compounds listed below, but are not limited thereto.
2,6-di-t-butylphenol, 2,6-di-t-butyl-4-methylphenol, 2,4-di-t-butylphenol, 2,6-dichlorophenol, 2,6-dimethylphenol, and 2-t-butyl-6-methylphenol.
代表的なヒンダードナフトールは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１−ナフトール、４−メチル−１−ナフトール、４−メトキシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール、２−メチル−１−ナフトール、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
Representative hindered naphthols are the following compounds, but are not limited thereto.
1-naphthol, 4-methyl-1-naphthol, 4-methoxy-1-naphthol, 4-chloro-1-naphthol, 2-methyl-1-naphthol, and compounds described in US Pat. No. 5,262,295 .
その他、下記の化合物の還元剤として開示されている。
アミドキシム類（例えばフェニルアミドキシム）、２−チエニルアミドキシム、ｐ−フェノキシフェニルアミドキシム、脂肪族カルボン酸アリルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ（例えば２，２’−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオニル−β−フェニルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ）、ポリヒドロキシベンゼンとヒドロキシルアミン、レダクトンおよびヒドラジンの少なくとも一方の組み合わせ（たとえばヒドロキノンとビス（エトキシエチル）ヒドロキシルアミンの組み合わせ）、ピペリジ−４−メチルフェニルヒドラジン、ヒドロキサム酸（例えばフェニルヒドロキサム酸、ｐ−ヒドロキシフェニルヒドロキサム酸、およびｏ−アラニンヒドロキサム酸）、アジンとスルホンアミドフェノール類の組合せ（たとえばフェノチアジンと２，６−ジクロロ−４−ベンゼンスルホンアミドフェノール）、α−シアノフェニル酢酸誘導体（例えばエチル−α−シアノ−２−メチルフェニル酢酸、エチル−α−シアノフェニル酢酸）、ビス−ｏ−ナフトール（例えば２，２’−ジヒドロキシ−１−ビナフチル、６，６’−ジブロモ−２，２’−ジヒドロキシ−１，１’−ビナフチル、ビス（２−ヒドロキシ−１−ナフチル）メタン）、
In addition, they are disclosed as reducing agents for the following compounds.
Amidoximes (eg phenylamidoxime), 2-thienylamidoxime, p-phenoxyphenylamidoxime, combinations of aliphatic carboxylic acid allyl hydrazide and ascorbic acid (eg 2,2′-bis (hydroxymethyl) -propionyl-β-phenylhydrazide and Combinations of ascorbic acid), at least one of polyhydroxybenzene and hydroxylamine, reductone and hydrazine (for example, a combination of hydroquinone and bis (ethoxyethyl) hydroxylamine), piperidi-4-methylphenylhydrazine, hydroxamic acid (for example, phenylhydroxam) Acid, p-hydroxyphenyl hydroxamic acid, and o-alanine hydroxamic acid), combinations of azines and sulfonamidophenols (for example, Phenothiazine and 2,6-dichloro-4-benzenesulfonamidophenol), α-cyanophenylacetic acid derivatives (eg ethyl-α-cyano-2-methylphenylacetic acid, ethyl-α-cyanophenylacetic acid), bis-o-naphthol (For example, 2,2′-dihydroxy-1-binaphthyl, 6,6′-dibromo-2,2′-dihydroxy-1,1′-binaphthyl, bis (2-hydroxy-1-naphthyl) methane),
ビス−ナフト−ルと１，３−ジヒドロキシベンゼン誘導体の組み合わせ（例えば２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，４−ジヒドロキシアセトフェノン）、５−ピラゾロン（例えば３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン）、レダクトン類（例えばジメチルアミノヘキソ−スレダクトン、アンヒドロジヒドロ−アミノヘキソ−スレダクトン、またはアンヒドロジヒドロ−ピペリドン−ヘキソースレダクトン）、インダン−１，３−ジオン類（例えば２−フェニルインダン−１，３−ジオン）、クロマン類（例えば２，２−ジメチル−７−ｔ−ブチル−６−ヒドロキシクロマン）、１，４−ジヒドロキシピリジン類（例えば２，６−ジメトキシ−３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロピリジン）、アスコルビン酸誘導体（１−アスコルビン酸パルミテ−ト、アスコルビン酸ステアレ−ト）、不飽和アルデヒド（ケトン）、３−ピラゾリドン類。 A combination of bis-naphthol and a 1,3-dihydroxybenzene derivative (for example, 2,4-dihydroxybenzophenone, 2,4-dihydroxyacetophenone), 5-pyrazolone (for example 3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone), Reductones (eg, dimethylaminohexo-reductone, anhydrodihydro-aminohexo-reductone, or anhydrodihydro-piperidone-hexose reductone), indan-1,3-diones (eg, 2-phenylindan-1,3) -Diones), chromans (eg 2,2-dimethyl-7-t-butyl-6-hydroxychroman), 1,4-dihydroxypyridines (eg 2,6-dimethoxy-3,5-dicarbethoxy-1,4) -Dihydropyridine), ascorbic acid derivatives (1- Ascorbic acid Parumite - DOO, ascorbic acid Suteare - g), unsaturated aldehydes (ketones), 3-pyrazolidones.
本発明に用いることのできる還元剤として、米国特許第５，４６４，７３８に記載されるようなスルホニルヒドラジンを含む置換ヒドラジンがある。この他の有用な還元剤は、例えば、米国特許第３，０７４，８０９、米国特許第３，０９４，４１７、米国特許第３，０８０，２５４および米国特許第３，８８７，４１７に記載されている。米国特許第５，９８１，１５１に記載の補助還元剤もまた有用である。 Reducing agents that can be used in the present invention include substituted hydrazines including sulfonyl hydrazines as described in US Pat. No. 5,464,738. Other useful reducing agents are described, for example, in US Pat. No. 3,074,809, US Pat. No. 3,094,417, US Pat. No. 3,080,254, and US Pat. No. 3,887,417. Yes. Also useful are the auxiliary reducing agents described in US Pat. No. 5,981,151.
還元剤として、ヒンダードフェノール還元剤とその他以下に挙げるような様々な補助還元剤から選ばれる化合物と組み合わせて用いられる場合もある。さらにコントラスト強化剤を加えた３成分の還元剤の混合物もまた有用である。補助還元剤としては米国特許第５，４９６，６９５に記載のトリチルヒドラジド、ホルミル−フェニルヒドラジドを用いることができる。 The reducing agent may be used in combination with a hindered phenol reducing agent and other compounds selected from various auxiliary reducing agents as listed below. Also useful are mixtures of three-component reducing agents with contrast enhancing agents. As the auxiliary reducing agent, trityl hydrazide and formyl-phenyl hydrazide described in US Pat. No. 5,496,695 can be used.
コントラスト強化剤を還元剤とともに用いることができる。コントラスト強化剤としては例えば、下記の化合物が有用であるが、これらに限定されるわけではない。
ヒドロキシルアミン（ヒドロキシルアミンとアルキルとアリ−ル置換誘導体を含む）、米国特許第５，５４５，５０５に記載のアルカノールアミンとフタル酸アンモニウム、米国特許第５，５４５，５０７に記載のヒドロキサム酸化合物、米国特許第５，５５８，９８３に記載のＮ−アシルヒドラジン化合物、米国特許第５，６３７，４４９に記載の水素原子ドナー化合物。
Contrast enhancing agents can be used with reducing agents. For example, the following compounds are useful as the contrast enhancer, but are not limited thereto.
Hydroxylamine (including hydroxylamine and alkyl and aryl substituted derivatives), alkanolamine and ammonium phthalate as described in US Pat. No. 5,545,505, hydroxamic acid compound as described in US Pat. No. 5,545,507, N-acylhydrazine compounds described in US Pat. No. 5,558,983 and hydrogen atom donor compounds described in US Pat. No. 5,637,449.
全ての還元剤と有機銀塩の組み合わせが等しく効果があるわけではない。好ましい組合せの一つは、有機銀塩としてベントリアゾ−ルの銀塩又はその置換化合物、又はその混合物と、還元剤としてアスコルビン酸型還元剤である。 Not all reducing agents and organic silver salt combinations are equally effective. One of the preferable combinations is a silver salt of benzotriazole or an organic compound thereof, a substituted compound thereof, or a mixture thereof, and an ascorbic acid type reducing agent as a reducing agent.
本発明における還元剤は、有機銀中の銀に対して１質量％〜１０質量％（乾燥質量）含まれる。多層構造において、還元剤が有機銀塩を含む層以外の層に加えられるならば、わずかに割合は高く、およそ２質量％〜１５質量％がより望ましい。補助還元剤は、およそ０．００１質量％〜１．５質量％（乾燥重）含まれる。 The reducing agent in the present invention is contained in an amount of 1% by mass to 10% by mass (dry mass) with respect to silver in the organic silver. In a multilayer structure, if the reducing agent is added to a layer other than the layer containing the organic silver salt, the proportion is slightly higher, more preferably about 2% to 15% by weight. The auxiliary reducing agent is contained in an amount of approximately 0.001% by mass to 1.5% by mass (dry weight).
９．その他の助剤
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅液に最適なｐＨに調整することができる。
9. Other auxiliaries Other auxiliaries for the amplification solution may include buffers, preservatives such as antioxidants or organic stabilizers, and rate regulators. As a buffering agent, for example, a buffering agent using acetic acid, citric acid, sodium hydroxide or any salt thereof, tris (hydroxymethyl) aminomethane, or a buffering agent used for general chemical experiments is used. Can do. These buffers can be used as appropriate to adjust the pH to the optimum value for the amplification solution.
１０.検出時の平均粒子サイズの算出方法
検出時（増幅後）、テストライン部を切り出し、試料裏面をカーボンペーストで試料台に取り付けた後、断面を切り、カーボン蒸着し、走査型電子顕微鏡にて、形状と大きさを観察する。例えば、日立ハイテクノロジーズ製ＦＥ-ＳＴＥＭ Ｓ-5500で、加速電圧10ＫＶで反射電子による試料表面の観察をＳＥＭで行う事が出来る。その後、シグナル粒子を100粒子選び、粒子の投影面積の円相当直径を測定し、平均値を算出し、検出時の平均粒子サイズとする。
10. Calculation method of the average particle size at the time of detection At the time of detection (after amplification), the test line part is cut out, the back of the sample is attached to the sample stage with carbon paste, the cross section is cut, carbon is evaporated, and the scanning electron microscope is used. And observe the shape and size. For example, with the FE-STEM S-5500 manufactured by Hitachi High-Technologies, the sample surface can be observed by reflected electrons at an acceleration voltage of 10 KV. Thereafter, 100 signal particles are selected, the equivalent circle diameter of the projected area of the particles is measured, the average value is calculated, and the average particle size at the time of detection is obtained.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
比較例１：検体の展開方向と銀増幅液の展開方向を同一方向にして増幅した場合の増幅時間
hCG検出イムノクロマトキットの作成
（１−１）抗hCG抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 7.0 ）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、50 μg / mLの抗hCGモノクローナル抗体（Anti-hCG 5008 SP-5、Medix Biochemica社）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1 %ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2),
0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3）に分散し、再び8000×
ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
Comparative Example 1: Amplification time when amplification is performed with the specimen development direction and the silver amplification solution development direction being the same direction
Preparation of hCG detection immunochromatography kit (1-1) Preparation of gold colloid modified with anti-hCG antibody pH by adding 1 mL of 50 mM KH2PO4 buffer (pH 7.0) to 9 mL of 50 nm diameter gold colloid solution (EM.GC50, BBI) 1 mL of a 50 μg / mL anti-hCG monoclonal antibody (Anti-hCG 5008 SP-5, Medix Biochemica) solution was added to the colloidal gold solution prepared above and stirred. After standing for 10 minutes, 550 μL of 1% polyethylene glycol (PEG Mw. 20000, product number 168-11285, Wako Pure Chemical Industries) aqueous solution was added and stirred, followed by 10% bovine serum albumin (BSA FractionV, product number A-7906, SIGMA) 1.1 mL of aqueous solution was added and stirred. After centrifuging this solution at 8000 × g, 4 ° C. for 30 minutes (himacCF16RX, Hitachi), the supernatant was removed except for about 1 mL, and the gold colloid was redispersed with an ultrasonic washer. After this, 20 mL of colloidal gold stock solution (20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2),
0.05% PEG (Mw. 20000), 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.1% NaN3)
g After centrifugation at 4 ° C. for 30 minutes, the supernatant was removed except for about 1 mL, and the gold colloid was redispersed with an ultrasonic washer to obtain an antibody-modified gold colloid (50 nm) solution.
（１−２）金コロイド抗体保持パットの作成
（１−１）で作成した各抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水により希釈し、520 nmのODが1.5となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
(1-2) Preparation of a colloidal gold antibody retaining pad Each antibody-modified gold colloid prepared in (1-1) was mixed with a gold colloid coating solution (20 mM Tris-Hcl buffer (pH 8.2), 0.05% PEG (Mw. 20000)). ), 5% sucrose) and water, and diluted so that the OD at 520 nm was 1.5. 0.8 mL of this solution was uniformly applied to each glass fiber pad (Glass Fiber Conjugate Pad, Millipore) cut to 8 mm × 150 mm and dried under reduced pressure overnight to obtain a colloidal gold antibody holding pad.
（１−３）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
25 mm×200 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から8 mmの位置に、0.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗hCGモノクローナル抗体（Anti-Alpha subunit 6601 SPR-5、Medix Biochemica社）溶液をインクジェット方式の塗布機（BioDot社）を用いて幅1 mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から12 mmの位置に、0.5 mg / mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 w%スクロースおよび0.05 w%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
(1-3) Preparation of antibody-immobilized membrane (chromatographic carrier)
An antibody-immobilized membrane was prepared by immobilizing an antibody by the following method with respect to a nitrocellulose membrane (with plastic backing, HiFlow Plus HF120, Millipore) cut to 25 mm × 200 mm. Inkjet immobilization anti-hCG monoclonal antibody (Anti-Alpha subunit 6601 SPR-5, Medix Biochemica) solution prepared at a position of 8 mm from the bottom with the long side down and 0.5 mg / mL The coating was applied in a line shape having a width of about 1 mm using a system coating machine (BioDot). Similarly, an anti-mouse IgG antibody for control (anti-mouse IgG (H + L), rabbit F (ab ') 2, part number 566-70621, prepared to be 0.5 mg / mL at a position 12 mm from the bottom) Wako Pure Chemicals) solution was applied in a line. The coated membrane was dried at 50 ° C. for 30 minutes with a hot air dryer. 500 mL of blocking solution (50 wm borate buffer (pH 8.5) containing 0.5 w% casein (milk-derived, product number 030-01505, Wako Pure Chemical Industries)) was placed in a vat and allowed to stand for 30 minutes. After that, transfer to 500 mL of washing / stabilizing solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 0.5 w% sucrose and 0.05 w% sodium cholate) in the same vat, soak for 30 minutes. did. The membrane was removed from the solution and dried overnight at room temperature to obtain an antibody-immobilized membrane.
（１−４）イムノクロマトグラフキットの作製
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）に、（１−３）で作成した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗hCG抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2 mm重なるように2で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4 mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（18 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5 mm重なるように吸収パッド（5 mm×100 mmに切ったセルロース膜（Cellulose Fiber Sample Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を5 mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（CM4000、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、イムノクロマト用ストリップを作成した。これらをプラスチックケース（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトキットとした。
(1-4) Preparation of immunochromatography kit The antibody-immobilized membrane prepared in (1-3) was attached to a back adhesive sheet (ARcare9020, Nipple Technocluster). In this case, the anti-hCG antibody line side is the lower side of the membrane long side. Attach the gold colloid antibody holding pad prepared in 2 so that it overlaps about 2 mm below the antibody-immobilized membrane, and about 4 mm so that the sample addition pad (18 mm x 150 mm below the gold colloid antibody holding pad) A glass fiber pad (Glass Fiber Conjugate Pad, Millipore) cut into mm was pasted and pasted. Further, an absorption pad (cellulose membrane cut to 5 mm × 100 mm (Cellulose Fiber Sample Pad, Millipore)) was overlaid and pasted on the upper side of the antibody-immobilized membrane so as to overlap by about 5 mm. An immunochromatographic strip was prepared by cutting these laminated members by cutting a guillotine cutter (CM4000, NIPPN Technocluster Co., Ltd.) parallel to the short side so that the long side of the member was 5 mm wide. These were put in a plastic case (Nippon Techno Cluster Co., Ltd.) to prepare an immunochromatography kit for testing.
（１−５）銀増幅液の作成
（ｉ）増幅液A-1の作成
水325gに、硝酸鉄（III）九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作成した1mol/Lの硝酸鉄水溶液40mL、クエン酸（和光純薬、038-06925）10.5g、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、Ｃ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ 0.1gを溶解させる。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%,）を40mL加える。この溶液80mLを測りとり、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を11.76g加えこれを増幅液A-1とした。
(1-5) Preparation of silver amplification solution (i) Preparation of amplification solution A-1 Iron (III) nitrate nonahydrate (Wako Pure Chemicals, 095-00995) was dissolved in 325 g of water and prepared. 40mL of 1mol / L iron nitrate aqueous solution, citric acid (Wako Pure Chemical, 038-06925) 10.5g, dodecylamine (Wako Pure Chemical, 123-00246) 0.1g, C9H19-C6H4-O- (CH2CH2O) 50H 0.1g Dissolve. When all are dissolved, add 40 mL of nitric acid (10 wt%) while stirring with a stirrer. 80 mL of this solution was measured, and 11.76 g of ammonium iron (II) sulfate hexahydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 091-00855) was added to obtain an amplification solution A-1.
（ｉｉ）増幅液A-2の作成
硝酸銀溶液10ｍＬ（10ｇの硝酸銀を含む）に水を加えて全体量が100gとなるようにし、増幅液A-2（10重量%硝酸銀水溶液）を作成した。
(Ii) Preparation of amplification solution A-2 Water was added to 10 mL of silver nitrate solution (containing 10 g of silver nitrate) to make the total amount 100 g, and amplification solution A-2 (10 wt% aqueous silver nitrate solution) was prepared.
（ｉｉｉ）増幅液Ａの作成
増幅液A-1 40mLを測りとり、増幅液A-2を4.25mL加え攪拌し、増幅液Ａとした。
(Iii) Preparation of amplification solution A 40 mL of amplification solution A-1 was measured, 4.25 mL of amplification solution A-2 was added, and stirred to obtain amplification solution A.
（２）増幅評価方法
１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにｈＣＧ（リコンビナントｈＣＧ Ｒ−５０６、ロ−ト製薬（株）製）を溶解し、1.8×10-12M、及び1.8×10-13Mの試験用ｈＣＧ溶液を作製した。
各試験用イムノクロマトグラフキットに、各試験用ｈＣＧ溶液を１００μＬ滴下し、10分静置した。10分後にプラスチックケースからストリップを取り出し、500μLの洗浄液（1 ％BSAを含むPBSバッファー）が入ったマイクロチューブに入れた。このまま1時間放置することで、メンブレンの洗浄を行った。その後、予めストリップに固定されている吸水パッドをはずし、その部分に新たに吸水パッド（20 mm×5 mm）を3枚重ねて張り付けた。金コロイド抗体保持パッドから下側を切断し、その部分を下にして増幅液Aを200μL入れたマイクロチューブ（ビーエム機器株式会社、BM4020）に検体滴下部が液に漬かるように立てかけた。増幅液を吸い上げ始めた時点を0分とし、検出ラインが検出できる濃度になるまで増幅を行い、時間を測定した。増幅後直ちに5分間水洗を行った。結果は、表1のようになった。
(2) Amplification evaluation method hCG (recombinant hCG R-506, manufactured by Rohto Pharmaceutical Co., Ltd.) was dissolved in PBS buffer containing 1% by mass BSA, and 1.8 × 10 −12 M and 1.8 × 10 −13 M An hCG solution for test was prepared.
100 μL of each test hCG solution was dropped into each test immunochromatography kit and allowed to stand for 10 minutes. Ten minutes later, the strip was taken out from the plastic case and placed in a microtube containing 500 μL of a washing solution (PBS buffer containing 1% BSA). The membrane was washed by leaving it for 1 hour. Then, the water absorption pad previously fixed to the strip was removed, and three new water absorption pads (20 mm × 5 mm) were overlaid on the part. The lower side was cut from the gold colloidal antibody holding pad, and the portion was placed downward, and placed in a microtube (BM Instrument Co., BM4020) containing 200 μL of the amplification solution A so that the specimen dropping part was immersed in the liquid. The time when the amplification solution started to be sucked was defined as 0 minute, amplification was performed until the detection line reached a detectable concentration, and the time was measured. Immediately after amplification, it was washed with water for 5 minutes. The results are shown in Table 1.
（１−６）検出部位の標識物質数測定
1 ％BSAを含むPBSバッファーを作製し、上記(１−１)から(１−４)の方法により作製したイムノクロマトキットに（１−５）で作製した1.8×10-12M、及び1.8×10-13Mの試験用ｈＣＧ溶液をそれぞれ100 μL点着した。15分後にプラスチックケースからストリップを取り出した。幅2.0mmの「ライン部（検出部位）」を含む部位（ライン部は1mm幅で、その上流0.5mmとその下流0.5mmを含む）と幅2.0mmの「非ライン部」（「ライン部」とコントロール部位の中間部位）を切り出した。各部位の金量定量は、HR-ICP-MS（型番：Element XR、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で測定した。また、切り出した各部位の辺の長さをノギスを用いて測定し、「非ライン部」の標識物質密度から「ライン部（検出部位）」のみの標識物質数を計算した。
(1-6) Measurement of the number of labeled substances at the detection site
A PBS buffer containing 1% BSA was prepared, and 1.8 × 10 −12 M and 1.8 × 10 8 prepared in (1-5) were added to the immunochromatography kit prepared by the method of (1-1) to (1-4) above. Each 100 μL of -13 M test hCG solution was spotted. After 15 minutes, the strip was removed from the plastic case. A part containing a 2.0mm wide "line part (detection part)" (the line part is 1mm wide, including 0.5mm upstream and 0.5mm downstream) and 2.0mm wide "non-line part"("linepart") And the middle part of the control part). The amount of gold in each part was measured by HR-ICP-MS (model number: Element XR, Thermo Fisher Scientific). Further, the length of each side of the cut out part was measured using a caliper, and the number of labeling substances only in the “line part (detection part)” was calculated from the labeling substance density in the “non-line part”.
1.8×10-12M、及び1.8×10-13Mの試験用ｈＣＧ溶液を点着した場合の検出部位の標識物質は、それぞれ1×105／ｍｍ3、1×104／ｍｍ3となった。 When the test hCG solution of 1.8 × 10 −12 M and 1.8 × 10 −13 M is spotted, the labeling substances at the detection site are 1 × 10 5 / mm 3 and 1 × 10 4 / mm 3 , respectively. It was.
比較例２：増幅液を滴下して増幅した場合の増幅時間
比較例1の（1-1）から（1-5）まで同様の操作でイムノクロマトキットを作成した。増幅操作に関しては、増幅液50μLを検出ライン部分に滴下し、増幅液を滴下した時点を0分とし、検出ラインが検出できる濃度になるまで増幅を行い、時間を測定した。増幅後直ちに5分間水洗を行った。結果は、表1のようになった。
Comparative Example 2: Amplification time when amplification was performed by dropping the amplification solution An immunochromatography kit was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 (1-1) to (1-5). Regarding the amplification operation, 50 μL of the amplification solution was dropped onto the detection line portion, the time when the amplification solution was dropped was set to 0 minutes, amplification was performed until the concentration at which the detection line could be detected, and the time was measured. Immediately after amplification, it was washed with water for 5 minutes. The results are shown in Table 1.
比較例３：増幅液に浸すことで増幅した場合の増幅時間
比較例1の（1-1）から（1-5）まで同様の操作でイムノクロマトキットを作成した。増幅操作に関しては、増幅液15mLをバランスディッシュ（44mm×44mm×15mm）に入れ、その中にイムノクロマトストリップを浸すことで増幅させた。増幅液中にストリップを入れた時点を0分とし、検出ラインが検出できる濃度になるまで増幅を行い、時間を測定した。増幅後直ちに5分間水洗を行った。結果は、表1のようになった。
Comparative Example 3: Amplification time when amplified by soaking in an amplification solution An immunochromatography kit was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 (1-1) to (1-5). As for the amplification operation, 15 mL of the amplification solution was placed in a balance dish (44 mm × 44 mm × 15 mm) and amplified by immersing an immunochromato strip therein. The time when the strip was put in the amplification solution was defined as 0 minute, amplification was performed until the concentration at which the detection line could be detected, and the time was measured. Immediately after amplification, it was washed with water for 5 minutes. The results are shown in Table 1.
比較例１、２、３より、増幅液を滴下する、あるいは、ストリップ全体を増幅液に浸すよりも、ストリップの一部を増幅液に接触させ、毛細管現象を利用して吸上げる方が、増幅時間が短縮されることが確認された。 Compared to Comparative Examples 1, 2, and 3, it is more amplifying to draw a portion of the strip in contact with the amplification solution and to suck it up using the capillary phenomenon rather than dropping the amplification solution or immersing the entire strip in the amplification solution. It was confirmed that the time was shortened.
実施例１：検体の展開方向と銀増幅液の展開方向を垂直方向にして増幅した場合の増幅時間
比較例１の（1-1）から（1-3）まで同様の操作でイムノクロマトキットを作成し、（1-4）に関してはストリップ幅が3cmになるように作製し、他の操作は同様に行った。増幅操作は、以下のように実施した。まず、展開後のイムノクロマトストリップから金コロイド抗体保持パッド、試料添加パッド、吸収パッドを取り外した。そして、図３のようにストリップを９０°回転させ、その上端に新たに吸水パッド（20mm×55mm）をセロテープ（登録商標）で貼り付けた。増幅液10mLをバランスディッシュ（44mm×44mm×15mm）に入れ、吸水パッドと反対側のストリップが増幅液に浸るようにすることで増幅させた。増幅液中にストリップを入れた時点を0分とし、検出ラインが検出できる濃度になるまで増幅を行い、時間を測定した。増幅後直ちに吸水パッドをはずし、5分間水洗を行った。結果は、表1のようになった。
Example 1: Amplification time when amplification was performed with the specimen development direction and the silver amplification solution development direction vertical. An immunochromatography kit was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 (1-1) to (1-3). For (1-4), the strip width was 3 cm, and other operations were performed in the same manner. The amplification operation was performed as follows. First, the colloidal gold antibody holding pad, the sample addition pad, and the absorption pad were removed from the developed immunochromatographic strip. Then, as shown in FIG. 3, the strip was rotated by 90 °, and a water absorbing pad (20 mm × 55 mm) was newly attached to the upper end of the strip with cello tape (registered trademark). Amplification solution was amplified by placing 10 mL of the amplification solution in a balance dish (44 mm × 44 mm × 15 mm) and soaking the strip on the opposite side of the water absorption pad in the amplification solution. The time when the strip was put in the amplification solution was defined as 0 minute, amplification was performed until the concentration at which the detection line could be detected, and the time was measured. Immediately after amplification, the water absorbing pad was removed and washed with water for 5 minutes. The results are shown in Table 1.
また、試料裏面をカーボンペーストで試料台に取り付けた後、カーボン蒸着し、日立ハイテクノロジーズ製ＦＥ-ＳＴＥＭ Ｓ-5500で、加速電圧10ＫＶで反射電子による試料表面の観察をＳＥＭで行った。その後、シグナル粒子を100粒子選び、粒子の投影面積の円相当直径を測定し、平均値を算出した結果、平均粒子径は2.8μmであった。 Moreover, after attaching the sample back surface to a sample stand with carbon paste, carbon was vapor-deposited, and the surface of the sample was observed with reflected electrons at an acceleration voltage of 10 KV by SEM using an FE-STEM S-5500 manufactured by Hitachi High Technologies. Thereafter, 100 signal particles were selected, the equivalent circle diameter of the projected area of the particles was measured, and the average value was calculated. As a result, the average particle size was 2.8 μm.
実施例２：検体の展開方向と銀増幅液の展開方向がなす角を45°にして増幅した場合の増幅時間
実施例１と同様に、イムノクロマトキットを作成した。増幅操作は、以下のように実施した。まず、展開後のイムノクロマトストリップから金コロイド抗体保持パッド、試料添加パッド、吸収パッドを取り外した。そして、図４のようにストリップを４５°回転させ、その上端に新たに吸水パッド（20mm×55mm）をセロテープ（登録商標）で貼り付けた。また、吸水パッドとは反対側のストリップは、増幅液に均一に浸るように図４のように切断した。増幅液10mLをバランスディッシュ（44mm×44mm×15mm）に入れ、吸水パッドと反対側のストリップが増幅液に浸るようにすることで増幅させた。増幅液中にストリップを入れた時点を0分とし、検出ラインが検出できる濃度になるまで増幅を行い、時間を測定した。増幅後直ちに吸水パッドをはずし、5分間水洗を行った。結果は、表1のようになった。
Example 2: Amplification time when amplification was performed with the angle formed by the specimen development direction and the silver amplification solution development direction being 45 ° In the same manner as in Example 1, an immunochromatography kit was prepared. The amplification operation was performed as follows. First, the colloidal gold antibody holding pad, the sample addition pad, and the absorption pad were removed from the developed immunochromatographic strip. Then, as shown in FIG. 4, the strip was rotated by 45 °, and a water absorbing pad (20 mm × 55 mm) was newly attached to the upper end of the strip with cello tape (registered trademark). Further, the strip on the side opposite to the water absorption pad was cut as shown in FIG. 4 so as to be uniformly immersed in the amplification solution. Amplification solution was amplified by placing 10 mL of the amplification solution in a balance dish (44 mm × 44 mm × 15 mm) and soaking the strip on the opposite side of the water absorption pad in the amplification solution. The time when the strip was put in the amplification solution was defined as 0 minute, amplification was performed until the concentration at which the detection line could be detected, and the time was measured. Immediately after amplification, the water absorbing pad was removed and washed with water for 5 minutes. The results are shown in Table 1.
実施例３：検体の展開方向と銀増幅液の展開方向をなす角を170°にして増幅した場合の増幅時間
実施例２と同様にして、イムノクロマトキットを作成し、増幅操作はストリップを１７０°回転させ、後は全て実施例３と同様の操作で実験を行った。増幅液中にストリップを入れた時点を0分とし、検出ラインが検出できる濃度になるまで増幅を行い、時間を測定した。増幅後直ちに吸水パッドをはずし、5分間水洗を行った。結果は、表1のようになった。
Example 3: Amplification time when amplification was performed with the angle between the development direction of the specimen and the development direction of the silver amplification solution set at 170 ° In the same manner as in Example 2, an immunochromatography kit was prepared. The experiment was performed in the same manner as in Example 3 after the rotation. The time when the strip was put in the amplification solution was defined as 0 minute, amplification was performed until the concentration at which the detection line could be detected, and the time was measured. Immediately after amplification, the water absorbing pad was removed and washed with water for 5 minutes. The results are shown in Table 1.
実施例１、２、３は、比較例１と比べて増幅液との接触面と検出ラインまでの距離が短くなり、その結果、増幅時間も短縮された。 In Examples 1, 2, and 3, the distance between the contact surface with the amplification solution and the detection line was shorter than in Comparative Example 1, and as a result, the amplification time was also shortened.
比較例４：検体の展開方向と銀増幅液の展開方向を同一方向にして増幅した場合の増幅ムラ
比較例1の（1-1）から（1-5）まで同様の操作でイムノクロマトキットを作成した。増
幅操作に関しては、増幅時間を2分に設定し、他の操作は同様にして行った。結果は、表
２のようになり、増幅ムラが確認された。比較例４の結果を図５に示す。
Comparative Example 4: Amplification unevenness when amplification was performed with the sample development direction and the silver amplification solution development direction set to the same direction. An immunochromatography kit was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 (1-1) to (1-5). did. Regarding the amplification operation, the amplification time was set to 2 minutes, and the other operations were performed in the same manner. The results were as shown in Table 2, and amplification unevenness was confirmed. The result of Comparative Example 4 is shown in FIG.
実施例４：検体の展開方向と銀増幅液の展開方向を垂直方向にして増幅した場合の増幅ムラ
実施例１と同様の操作でイムノクロマトキットを作成した。増幅操作に関しては、増幅時間を2分に設定し、他の操作は同様にして行った。結果は、表２のようになり、増幅ム
ラが確認されなかった。実施例４の結果を図５に示す。
Example 4: Amplification unevenness when amplification was performed with the sample development direction and the silver amplification solution development direction being perpendicular to each other. An immunochromatography kit was prepared in the same manner as in Example 1. Regarding the amplification operation, the amplification time was set to 2 minutes, and the other operations were performed in the same manner. The results were as shown in Table 2, and no amplification unevenness was confirmed. The results of Example 4 are shown in FIG.
１：バック粘着シート
２：金コロイド抗体保持パッド
３：抗体固定化メンブレン
３ａ： 捕捉部位
３１：検出部
３２：コントロール部
４：吸収パッド
５：試料添加パッド
６：増感シート
１０：イムノクロマトグラフキット
1: Back adhesive sheet 2: Gold colloid antibody holding pad 3: Antibody-immobilized membrane 3a: Capture site 31: Detection unit 32: Control unit 4: Absorption pad 5: Sample addition pad 6: Sensitization sheet 10: Immunochromatography kit
Claims (10)
吸水パッドと反対側の多孔性担体を増幅液に浸らせ、毛細管現象を利用して増幅液を反応部位まで展開する際に、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とを45度から170度異なる方向にして展開を行うことで、増幅液と多孔性担体との接触面から反応部位までの距離を短くすることを特徴とするイムノクロマトグラフ方法。 A test substance and a labeled substance modified with a first binding substance for the test substance are developed on a porous carrier in a mixed state, and a second binding substance for the test substance, or a test substance In an immunochromatographic method comprising capturing the test substance and the labeled substance and detecting the test substance at a reaction site on a porous carrier having a substance capable of binding to the first binding substance to Detecting a test substance by sensitizing with an amplification solution containing a silver-containing compound and a reducing agent for silver ions,
When the porous carrier on the opposite side of the water absorption pad is immersed in the amplification solution and the amplification solution is developed to the reaction site using capillary action , the development direction of the test substance and the development direction of the amplification solution are changed from 45 degrees to 170 degrees. An immunochromatographic method characterized in that the distance from the contact surface between the amplification solution and the porous carrier to the reaction site is shortened by performing development in different directions.
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