JP5273658B2 - リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法 - Google Patents
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Description
このように、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質を分離する際には、金属キレートカラムを用いたクロマトグラフィーを適用するが、金属キレートカラムがリン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質に対する特異性が低いため、多くの酸性ペプチドも同時に濃縮されてしまうといった問題がある。この問題を解決するために、従来、ペプチドのカルボキシル基をエステル化することにより、金属キレートカラムにおけるリン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質に対する特異性を向上させる試みがなされている。しかしながら、エステル化反応の制御が困難であり、当該方法は一般的に利用されるには至らず、実用化されていない。
また、金属イオンに代えてチタニウムやジルコニウム等の酸化物を充填したカラムを利用して、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質を分離する手法も開示されている(特許文献1及び特許文献2)。しかしながら、これら酸化物を充填したカラムを用いてもリン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質に対する特異性は不十分であり、上述した問題を解決することは困難である。そこで、サリチル酸誘導体を酸性ペプチドに対する競合剤として使用して、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質に対する特異性を向上させる試みが報告されている(非特許文献2)。
しかしながら、サリチル酸誘導体を競合剤として使用する場合には以下の問題がある。第1に、サリチル酸誘導体の脂溶性がペプチドと重複しているため、一般に使用される逆相クロマトグラフィーでサリチル酸誘導体とリン酸化ペプチドとを分離できないといった問題がある。この問題は、分離後に質量分析を行う場合、質量分析計を汚染するといった問題にも繋がる。第2に、確かにリン酸化ペプチドに対する特異性は向上しているものの、多くの非リン酸化ペプチドも同時に分離・濃縮してしまうといった問題がある。
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、酸化金属を充填した分離手段を用いてリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化ペプチドを分離するに際して、酸性ペプチドにおけるカルボン酸の吸着を防止し、且つ、リン酸化ペプチド及びリン酸化ペプチドにおけるリン酸基の吸着を阻害しない物質を見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
(1)リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を、酸化金属を充填した分離手段にアリファティックヒドロキシカルボン酸の存在下で供給する工程を含むリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(2)上記アリファティックヒドロキシカルボン酸は、αヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする(1)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(3)上記分離手段から溶出した溶液を逆相クロマトグラフィーに供することによって、上記リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質と上記アリファティックヒドロキシカルボン酸とを分離する工程を更に含む(1)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(4)上記αヒドロキシカルボン酸は親水性であることを特徴とする(1)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(5)上記酸化金属は、酸化チタニウム、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム及び二酸化ケイ素からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする(1)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(6)上記酸化金属は、連続多孔質構造を有することを特徴とする(1)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(7)上記酸化金属は、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、示差熱熱重量分析において130℃で15分間加熱した後、毎分40℃で800℃まで昇温した時の昇温過程での重量減少が3〜70mg/gであることを特徴とする(1)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(8)上記重量減少が4〜20mg/gであることを特徴とする(7)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(9)上記(1)乃至(8)いずれかに記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法によって分離された、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を質量分析装置に供し、分離されたリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の質量を測定する工程を含む、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の質量分析方法。
また、上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、酸化金属を充填した分離手段を用いてリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化ペプチドを分離するに際して、酸化金属として特徴的な物性を有する酸化チタンを使用することによって、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離効率を向上できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
(10) リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、示差熱熱重量分析において130℃で15分間加熱した後、毎分40℃で800℃まで昇温した時の昇温過程での重量減少が3〜70mg/gである酸化チタンを充填した分離手段に供給する工程を含む、
リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(11) 上記酸化チタンは、上記重量減少が4〜20mg/gであることを特徴とする(10)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(12) アリファティックヒドロキシカルボン酸の存在下で上記試料を上記分離手段に供給することを特徴とする(10)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(13)上記酸化チタンは、連続多孔質構造を有することを特徴とする(10)記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
(14)アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、示差熱熱重量分析において130℃で15分間加熱した後、毎分40℃で800℃まで昇温した時の昇温過程での重量減少が3〜70mg/gである酸化チタンを主成分とするクロマトグラフィー用固定相。
(15)上記重量減少が4〜20mg/gであることを特徴とする(14)記載のクロマトグラフィー用固定相。
(16)上記酸化チタンは、連続多孔質構造を有することを特徴とする(14)記載のクロマトグラフィー用固定相。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−222316号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図1bは、トリプシンによる消化処理後の試料を、キレートとして乳酸を添加した系で測定した結果を示すクロマトグラムである。
図1cは、図1bに示したクロマトグラムにおける保持時間33.6分におけるMSスペクトルの強度を測定した結果を示すMSスペクトラムである。
図1dは、図1dに示したMSスペクトラムにおけるm/zが830.7であるピークについてMS/MSスペクトルの強度を測定した結果を示すMS/MSスペクトラムである。
図2aは、リンゴ酸のLC−MSにおける保持時間を測定した結果を示すクロマトグラムである。
図2bは、酒石酸のLC−MSにおける保持時間を測定した結果を示すクロマトグラムである。
図2cは、クエン酸のLC−MSにおける保持時間を測定した結果を示すクロマトグラムである。
図2dは、2,5−ジヒドロキシ安息香酸のLC−MSにおける保持時間を測定した結果を示すクロマトグラムである。
図3は、非リン酸化タンパク質及びリン酸化タンパク質を分離濃縮する実験例(実施例3)の結果として示すSDS−PAGE写真である。
図4は、実施例5で作製したC2−チタニア−C2の構造を有するリン酸化ペプチド濃縮用チップを撮影した写真である。
図5は、実施例6で使用した酸化チタンについて、TG−DTA装置を用いて熱分析の結果として得られたTG−DTA曲線を示す特性図である。
図6は、重量減少量とリン酸化ペプチド濃縮率とをそれぞれ横軸と縦軸としたグラフに、表6に示した結果をプロットした結果を示す特性図である。
本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法は、試料中に含まれるリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を、他の成分から分離して濃縮する方法である。ここで、試料とは、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を含む組成であれば特に限定されないが、例えば、複数種類のタンパク質を含む溶液、単数或いは複数種類のタンパク質を消化酵素によって処理することで得られるペプチドを含む溶液、複数のタンパク質及び複数のペプチドを含む溶液を挙げることができる。また、試料としては、培養細胞等からタンパク質成分を抽出した細胞抽出物や、ヒトを含む動物個体等から採取した組織からタンパク質成分を抽出した組織抽出物をそのまま使用することもできる。
より具体的に特定のタンパク質におけるリン酸化状態を測定する場合、当該タンパク質を例えばトリプシン等の消化酵素で処理した溶液を使用することができる。詳細を後述するが、このようにして得られた溶液に対して本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法を適用することで、トリプシン処理後のペプチド群からリン酸化ペプチドを選択的に分離して濃縮することができる。
また、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法においては、タンパク質及びペプチドとしては、何ら限定されず、如何なる細胞由来のタンパク質及びペプチドを分離対象とすることができる。また、タンパク質の等電点にも限定されず、如何なる等電点のタンパク質も分離対象とすることができる。
第1の実施の形態
本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法において、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を、酸化金属を充填した分離手段に供給する際にアリファティックヒドロキシカルボン酸を存在させる。アリファティックヒドロキシカルボン酸は、当該試料に予め添加されていても良いし、当該試料を分離手段に供給する前に当該分離手段に予め単独で供給されていても良い。また、アリファティックヒドロキシカルボン酸は、当該試料に予め添加され、且つ、当該試料を分離手段に供する前に当該分離手段に予め単独で供給されていることが好ましい。
ここでアリファティックヒドロキシカルボン酸とは、脂肪族系の骨格を有するヒドロキシカルボン酸を意味し、消極的には骨格に芳香族環を有しないヒドロキシカルボン酸を意味する。ここで、ヒドロキシカルボン酸としては、αヒドロキシカルボン酸であることが好ましいが、β位やγ位に水酸基を有するヒドロキシカルボン酸であっても良い。
具体的に、アリファティックヒドロキシカルボン酸としては、グリコール酸(glycolic acid)、乳酸(lactic acid)、リンゴ酸(malic acid)、酒石酸(tartaric acid)及びクエン酸(citric acid)といったαヒドロキシカルボン酸を挙げることができる。また、αヒドロキシカルボン酸は、光学異性体が存在する場合があるが、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法においては、いずれのエナンチオマーを使用しても良いし、両エナンチオマーの混合物(例えばラセミ体)として使用しても良い。なお、アリファティックヒドロキシカルボン酸としては、βヒドロキシプロパン酸等のβヒドロキシカルボン酸を使用することもできる。また、アリファティックヒドロキシカルボン酸は、上記で例示した具体的な化合物を単独で使用しても良いし、複数種類を混合して使用しても良い。
本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法において、分離手段とは、酸化金属を充填することができ、酸化金属を充填した部分に試料を供給することによって試料に含まれるリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を選択的に保持し、酸性ペプチド等とリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質とを分離することができる装置を意味する。分離手段の一例としては、クロマトグラフィー用の分離カラムを使用することができる。分離カラムは、注入口と溶出口とを有する筒状の部材から構成され、筒状の部材の内部に酸化金属を充填することができる。分離カラムとしては、如何なる形状、サイズ、材料からなるものであってもよく、なんら限定されない。
ここで、分離手段に使用する酸化金属とは、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質の一方又は両方に対して親和性を有することが知られているあらゆる物質を含む意味である。中でも、酸化金属としては、酸化チタニウム、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、ベーマイト及び二酸化ケイ素を挙げることができる。本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法においては、これら酸化金属を単独で用いても良いし、複数種類を混合して用いても良い。特に、酸化金属としては、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質に対する親和性の高さから酸化チタニウム及び酸化ジルコニウムを単独又は混合して使用することが好ましい。
これら酸化金属の製造方法は、従来公知の手法を適用することができる。また、酸化金属を分離手段に充填する際、各種イオン交換樹脂、無機イオン交換体、樹脂、活性炭、モンモリロナイト等の粘土質化合物を担体として酸化金属を充填してもよい。
特に、分離手段に使用する酸化金属としては、モノリス構造を有する酸化金属を主体とすることもできる。ここでモノリス構造とは、三次元ネットワーク状の骨格と、骨格によって形成される空隙(マクロポア又はスルーポアと呼ばれる)によって構成される構造を意味する。すなわち、モノリス構造とは、この空隙によって構成される連続多孔質構造を意味する。なお、モノリス構造を構成する骨格は、数十nmの孔(メゾポアと呼ばれる)を有する材料であっても良いし、当該孔のない材料であっても良い。「モノリス構造を有する酸化金属を主体とする」とは、分離手段に使用する酸化金属の一部がモノリス構造をとっていなくても良いことを意味し、例えば酸化金属全体の80%、好ましくは90%、より好ましくは95%がモノリス構造を有する酸化金属であることを意味する。
モノリス構造を有する酸化金属は、従来公知の手法によって取得することができる。例えば、Junko Konishiらの“Monolithic TiO2 with Controlled Multiscale Porosity via a Template−Free Sol−Gel Process Accompanied by Phase Separation”Chem.Mater.,Vol.18,No.25,2006に開示された方法によってモノリス構造を有する酸化チタンを作製することができる。より詳細には、塩酸、ホルムアミド及び水を含む溶液をチタニウムプロポキシド(titaniumn−propoxide:Ti(OnPr)4)に氷温で撹拌しながら加える。約5分間、撹拌した後、均一に撹拌された溶液をテストチューブに注入し、30℃でゲル化させる。得られたゲル状物質を30〜60℃で24時間程度放置する。その後、60℃で約7日間真空乾燥することによってモノリス構造を有する酸化チタンを作製することができる。なお、真空乾燥後のゲルを300〜700℃程度の温度条件で熱処理しても良い。
また、分離手段に使用する酸化金属としては、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、示差熱熱重量分析において130℃で15分間加熱した後、毎分40℃で800℃まで昇温した時の昇温過程での重量減少が3〜70mg/gである酸化チタンであることが特に好ましい。さらに、当該重量減少が4〜20mg/gである酸化チタンを分離手段に使用することがより好ましい。
当該重量減少が3〜70mg/gである酸化チタンを使用することによってリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を保持する能力がより向上し、その結果、試料中に含まれるリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の濃縮効率を向上させることができる。特に、当該重量減少が4〜20mg/gである酸化チタンを使用した場合には、試料中に含まれるリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の濃縮効率を更に向上させることができる。
また、この場合、酸化チタンとしては、アナターゼ結晶及び非晶質の両方を含んでいるものであってもよい。また、酸化チタンとしては、アナターゼ結晶からなるものであってもよい。
よって、分離手段には、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、当該重量減少が4〜20mg/gである酸化チタンを使用することが最も好ましい。アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、当該重量減少が4〜20mg/gである酸化チタンを分離手段に使用することによって、例えば、細胞抽出物及び組織抽出物等の組成が複雑な試料を適用した場合でも、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質について高い濃縮効率を達成することができる。
以上、説明したように、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法では、アリファティックヒドロキシカルボン酸によって酸化金属を処理した後に、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を酸化金属に接触させている。これにより、酸化金属におけるリン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質に対する特異性をより向上させることがでる。したがって、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法においては、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質以外の例えば酸性ペプチド等からリン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質を効率よく分離することができる。
また、アリファティックヒドロキシカルボン酸は、親水性の高い低分子であることから、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の溶出時間と重複することがなく、通常の逆相クロマトグラフィー用カラムによって除去することができる。例えば、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を分離した後、質量分析計に供してリン酸化ペプチドやリン酸化タンパク質の質量を測定する場合、質量分析計を汚染することを防止できる。したがって、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法における分離手段の後段に逆相クロマトグラフィー用カラムを介して質量分析装置を配置することで、質量分析装置を汚染することなく一連のプロセスでリン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質の質量測定を行うことができる。
なお、質量分析装置としては、特に限定されず、如何なる原理を適用した質量分析装置を使用することができる。一般に質量分析装置は、試料導入部と、試料導入部から導入された試料に含まれるペプチドやタンパク質をイオン化するイオン源と、イオン源によってイオン化されたペプチドやタンパク質を分離する分析部と、分析部で分離されたイオンを増感して検出する検出部と、検出部で検出した値からマススペクトルを生成するデータ処理部とから構成されている。試料導入部には液体クロマトグラフィー用カラムを使用することが好ましい。イオン源としては、特に限定されないが、電子イオン化法、化学イオン化法、電界脱離法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法及びエレクトロスプレーイオン化法といった原理を適用したものを挙げることができる。分析部としては、特に限定されないが、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型を挙げることができ、これらを組み合わせたタンデム型であっても良い。
本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法によって分離されたリン酸化ペプチドやリン酸化タンパク質は、特に、イオントラップ型及びタンデム型といった質量分析装置を使用することが好ましい。イオントラップ型やタンデム型質量分析装置を使用した場合には、MS/MSスペクトルによりリン酸化部位まで決定できる場合があるからである。
第2の実施の形態
また、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法は、上述したようにアリファティックヒドロキシカルボン酸の存在下に試料を酸化金属に接触させる手法に限定されない。すなわち、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法は、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、示差熱熱重量分析において130℃で15分間加熱した後、毎分40℃で800℃まで昇温した時の昇温過程での重量減少が3〜70mg/gである酸化チタンを充填した分離手段に供給する手法であっても良い。換言すると、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、示差熱熱重量分析において130℃で15分間加熱した後、毎分40℃で800℃まで昇温した時の昇温過程での重量減少が3〜70mg/gである酸化チタンを主成分とする固定相を備えるクロマトグラフィー装置を使用することによって、試料に含まれるリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を効率よく分離することができる。
このとき、クロマトグラフィー用固定相は、上述した第1の実施の形態と同様に、アリファティックヒドロキシカルボン酸によって処理した後に試料を接触させても良いが、本形態においてはアリファティックヒドロキシカルボン酸を接触させることは必須ではない。但し、アリファティックヒドロキシカルボン酸を酸化チタンに接触させた場合には、上述した場合と同様な効果を得られるので好ましい。
上述した第1の実施の形態と同様に、当該重量減少が3〜70mg/gである酸化チタンを使用することによってリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を保持する能力がより向上し、その結果、試料中に含まれるリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の濃縮効率を向上させることができる。特に、当該重量減少が4〜20mg/gである酸化チタンを使用した場合には、試料中に含まれるリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の濃縮効率を更に向上させることができる。
また、この場合、酸化チタンとしては、アナターゼ結晶及び非晶質の両方を含んでいるものであってもよい。また、酸化チタンとしては、アナターゼ結晶からなるものであってもよい。
よって、クロマトグラフィー用固定相には、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、当該重量減少が4〜20mg/gである酸化チタンを使用することが最も好ましい。アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、当該重量減少が4〜20mg/gである酸化チタンを分離手段に使用することによって、例えば、細胞抽出物及び組織抽出物等の組成が複雑な試料を適用した場合でも、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質について高い濃縮効率を達成することができる。
なお、本実施の形態においても、上記酸化チタンは、モノリス構造を有するものを使用することもできる。また、本実施の形態においても、本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法によって分離されたリン酸化ペプチドやリン酸化タンパク質は、特に、イオントラップ型及びタンデム型といった質量分析装置を使用することで、MS/MSスペクトルによりリン酸化部位まで決定できる。
以下、実施例を用いて本発明に係るリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の分離方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
先ず、α−casein(Sigma社,Cat.No.C6780)、fetuin(Sigma社,Cat.No.F2379)及びphosvitin(Sigma社,Cat.No.P1253)それぞれ50μgを用い、尿素(Bio−Rad社Cat.No.161−0731)8Mを含む0.05MのTris緩衝液(pH9.0,Sigma社)20μLで溶解し、1mg/mLディチオスレイトール(和光純薬Cat.No.040−29223:DTT)を1μL加え、37℃で30分インキュベーションして各タンパク質中のシステイン残基を還元した。その後、5mg/mLのヨードアセトアミド(和光純薬Cat.No.091−02153)を1μL加え、37℃で30分インキュベーションしてシステイン残基をアルキル化した。そこに1mg/mLのLys−C(和光純薬Cat No.125−05061)を1μL加え、37℃で4時間インキュベーションし、タンパク質を消化した。
次に、80mLの50mM炭酸水素アンモニウム緩衝液を加えた後、1mg/mLのトリプシン(プロメガ社製、Cat.No.V511C)を1μL加え、37℃で10時間インキュベーションし、Lys−C消化ペプチド及び未消化タンパク質を更に消化した。消化後1%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液を10μL加え、トリプシンを失活させた。次に、予めアセトニトリルで洗浄後に0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)水溶液でコンディショニングしておいたEmpore C18−HD disk cartridge(3M社)を用いて、消化処理後の溶液を脱塩した。その後、遠心濃縮を行い、100μLの5%アセトニトリルを含む0.1%TFA水で再溶解した。以上のようにして得られた溶液(3種)を等量ずつ混合し、リン酸化ペプチド濃縮実験用試料溶液とした。
次に200μL用ピペットチップとEmpore C8ディスクを用いてC8−StageTip(自家製、J.Rappsilber,Y.Ishihama,M.Mann,Anal Chem 75(2003)663)を作製し、3mgのチタニア(titansphere(GL Sciences,Tokyo,Japan))又はジルコニア(Zirchrom−PHASE(Zirchrom,Anoka,MN,USA))を上部にさらに充填して分離用カラムを構築した。また、表1に示した種々のヒドロキシカルボン酸を300mg/mLになるように、80%アセトニトリル及び0.1%TFAを含む水溶液で溶解した溶液Aを準備した。そして、分離用カラムを20μLの溶液Aで洗浄し、その後、それぞれ2.5μgのタンパク質相当量のペプチド混合物を含むリン酸化ペプチド濃縮実験用試料溶液15μLと溶液A100μLを混合し、分離用カラムにロードした。その後、20μLの溶液A、80%アセトニトリル及び0.1%TFAを含む水溶液20μLで分離用カラムを洗浄した後、0.5%アンモニア水40μLをロードして、リン酸化ペプチドを溶出させた。次に、得られた溶出液を遠心濃縮した後、1%TFA及び5%アセトニトリルを含む水溶液10μLで溶解し、LC−MS用試料溶液とした。
次に、得られたLC−MS用試料溶液についてLC(C18 column)/MS(Applied Biosystems/MDS−Sciex QSTAR XL)システムを用いて測定を行った。HPLC条件として、C18シリカゲル(ReproSil−Pur 120 C18−AQ,3μm)を充填した自家製のエレクトロスプレー一体型カラム(Y.Ishihama,J.Rappsilber,J.S.Andersen,M.Mann,J Chromatogr A 979(2002)233.)0.1 x 150mmに移動相Aとして0.5%酢酸水、移動相Bとして80%アセトニトリルを含む0.5%酢酸水を用いて、初期B濃度を5%として、最初の15分間で直線的に30%、その後5分間で直線的に100%とし、その後移動相Bを100%にして5分間維持、その後移動相Bを5%として35分後に次のサンプルを注入した。送液にはアジレントテクノロジー社のAgilent 1100 nanopumpを用い、500nL/minの流速で分析を行った。LC−MS用試料溶液をCTC社のオートサンプラーPALによって5μL注入し、試料を一度インジェクターのサンプルループに注入した後に分析カラムに送り込んだ。Proxeon社製XYZステージを装備したApplied Biosystems|MDS−Sciex社のQSTAR XLに日京テクノス社に特注したカラムホルダーを装着し、エレクトロスプレー一体型カラムの位置を任意に調整できるようにした。ESI電圧として2.4kVをカラムのポンプ側のバルコ社製金属コネクターを通して印加した。測定は、Information dependent acquisitionモードで、1秒間のSurveyスキャンの後、最大3つのMSMSスキャン(各0.6秒)を行った。MSMS modeからSurvey scanへのスイッチは1スペクトルとした。
得られたデータについては、Mascot(Matrixscience社)およびSwiss−Protデータベースを用いてタンパク質の自動同定を行った。目的ピークの定量はAB社Analyst QS v1.1を用いて行った。結果を表1に示す。また、代表的なリン酸化ペプチド同定例を図1に示す。なお図1中(a)はキレートなしの系で測定した結果であり、(b)はキレートとして乳酸を添加した系で測定した結果である。
なお、ヒドロキシカルボン酸試薬としては以下のものを使用した。
グリコール酸:WAKO 071−01512
DL−乳酸:WAKO 128−00056
L−乳酸:WAKO 129−02666
リンゴ酸:WAKO 138−07512
L−酒石酸:WAKO 203−00052
クエン酸:WAKO 036−05522
β−hydroxypropionic acid(β−HPA):東京化成 H0297
2,5−dihydroxybenzoic acid(2,5−DHB):Aldrich 149357−10G
図2から判るように、LC−MSにおける2,5−DHBは、トリプシン消化ペプチドが溶出する18−35分の範囲に溶出していることがわかる。一方、アリファティックヒドロキシカルボン酸であるリンゴ酸、酒石酸及びクエン酸は、試料溶媒と同じくほとんどC18に保持されていないことがわかる。以上の結果から、アリファティックヒドロキシカルボン酸をキレートとして使用しても逆相前処理カラムで除去できることが明かとなった。これに対して、2,5−DHBは、それができないため、例えばLC−MSシステムを用いた質量分析プロセスにおいて不安定化させる要因となることが考えられた。不安定化とは、例えばカラムの詰まり、ペプチドのイオン化の妨げ、質量分析計の汚れによる感度低下を含む意味である。
先ず、非リン酸化タンパク質であるウシ血清アルブミン(BSA)(和光純薬、CatNo016−15091)1mg、リン酸化タンパク質であるα−カゼイン(SIGMA Cat No C6780)0.1mg及び分子量マーカーキット(GE healthcare Cat.No 17−0446−01、バイアル1本あたりphosphorylase b 67μg、BSA 83μg、obalbumin 147μg、carbonic anhydrase 83μg、trypsin inhibitor 80μg、a−lactalbumin 116μgを含む)を30mM MES(4−morpholineethanesulfonic acid)緩衝液(pH=6.0)、8M尿素、0.25% CHAPS(3−[(3−cholamidopropyl)dimethylammonio]−1−propanesulfonate)溶液0.5mLに溶解し、試料溶液(A)とした。1.5mLチューブにZirchrom社製ジルコニア(non−porous,0.5μm径)3mgを入れ、30mM MES緩衝液(pH=6.0)、8M尿素、0.25% CHAPS溶液50μLで洗浄した後、0.2Mヒドロキシカルボン酸、30mM MES緩衝液(pH=6.0)、8M尿素、0.25% CHAPS溶液25μLと試料溶液(A)25μLを混合し、チューブに添加した。37℃で30分攪拌した後、15000Gで1分間遠心し、溶液を回収した。0.2Mの種々のアリファティックヒドロキシカルボン酸、30mM MES緩衝液(pH=6.0)、8M尿素、0.25% CHAPS溶液50μLおよび30mM MES緩衝液(pH=6.0)、8M尿素、0.25% CHAPS溶液50μLで洗浄し、1%アンモニア水、8M尿素、0.25% CHAPS溶液50μLで懸濁させ10分間、37℃で攪拌した後、15000Gで1分間遠心し、溶液を回収し、試料溶液とした。試料溶液をSDS−PAGE(4−20%グラジエントゲル、第一化学薬品 301506)で分析し、クマシーブリリアントブルー(CBB)染色により、検出を行った。結果を図3に示す。
図3に示すSDS−PAGE写真において、レーン1及び2はアリファティックヒドロキシカルボン酸として乳酸を使用したサンプルであり、レーン3及び4はアリファティックヒドロキシカルボン酸としてグルクロン酸を使用したサンプルであり、レーン5及び6はアリファティックヒドロキシカルボン酸としてグリセリン酸ヘミカルシウム含水塩を使用したサンプルであり、レーン7及び8はアリファティックヒドロキシカルボン酸に代えてグルタミン酸ナトリウム及びアスパラギン酸カリウムを使用したサンプルであり、レーン9及び10はアリファティックヒドロキシカルボン酸を添加していないサンプルである。
図3から判るように、アリファティックヒドロキシカルボン酸を加えていないレーン9及び10と比較して、種々のアリファティックヒドロキシカルボン酸を加えたレーン1〜6では非リン酸化タンパク質であるBSA、炭酸脱水酵素(carbonic anhydrase)、トリプシンインヒビター(trypsin inhibitor)及びα−ラクトアルブミン(α−lactalbumin)が減っており、一方でリン酸化タンパク質であるα−カゼイン(α−casein)は濃縮が可能であった。中でもレーン3及び4(グルクロン酸添加)は非リン酸化タンパク質がほとんど検出されず、高い選択性を示した。特に、アリファティックヒドロキシカルボン酸としてグルクロン酸を用いた場合(レーン3及び4)と、水酸化アルミニウムとの組み合わせで効果があるとの報告(Wolschin,Fら、Proteomics,5,4389−4397,2005)があるグルタミン酸、アスパラギン酸を添加した場合(レーン7及び8)とを比較すると、グルクロン酸を用いた場合にはオボアルブミンのバンドは若干薄いけれども、BSAの除去率については明らかに改善していることがわかった。
本実施例において試料溶液は、実施例1の試料溶液と同一のものを用いた。チタニアモノリスは、GLサイエンス社よりプロトタイプを入手した。このチタニアモノリスは、表面積が75.2m2/gであり、細孔径が17.6nmであった。
まず、1.5mL用バイアルに1mgのチタニアモノリスを加え、50μLの300mg/mL乳酸を含む80%アセトニトリル、0.1%TFA水溶液(溶液A)で分散させ、2000gで遠心処理し、上清を除いた。各タンパク質消化物2.5gを含む試料溶液(7.5μL)と溶液A(50μL)とをチタニアモノリスに加え、25℃で20分間浸透した。その後2000gで遠心処理し、上清を除いた。50μLの溶液Aおよび80%アセトニトリル、0.1%TFA水溶液でそれぞれ洗浄した後、0.5%アンモニア水50μLで2回溶出させ、遠心濃縮した後、1%TFA、5%アセトニトリルを含む水溶液10μLで溶解し、LC−MS用試料溶液とした。コントロールとして、乳酸を用いないこと以外はまったく同一の条件でLC−MS用試料溶液を調製した。
本実施例においてLC−MS測定は実施例1と同一の条件で測定した。結果を表2及び表3に示す。
まず、ヒト子宮頸癌由来HeLa細胞を常法に従い9cm径の培養皿で培養した後、細胞をダウンスホモジナイザーに移し、ホスファターゼ阻害剤カクテル1及び2(Sigma社、Cat No P2850及びP5726)とプロテアーゼ阻害剤(Sigma社、Cat No P8340)を加え、10ストロークでホモジナイズした。1,500gで10分間遠心処理をした後、その上清を取り出し、遠心濃縮した。尿素(Bio−Rad社Cat.No.161−0731)8Mを含む0.05M Tris緩衝液(pH9.0,Sigma社)20μLで溶解し、1mg/mLディチオスレイトール(和光純薬Cat.No.040−29223:DTT)を1μL加え、37℃で30分インキュベーションしてタンパク質中のシステイン残基を還元した。その後、5mg/mLのヨードアセトアミド(和光純薬Cat.No.091−02153)を1μL加え、37℃で30分インキュベーションしてシステイン残基をアルキル化した。そこに1mg/mLのLys−C(和光純薬Cat No.125−05061)を1μL加え、37℃で4時間インキュベーションしタンパク質を消化した。80mLの50mM炭酸水素アンモニウム緩衝液を加えた後、1mg/mLのトリプシン(プロメガ社製、Cat.No.V511C)を1μL加え、37℃で10時間インキュベーションし、Lys−C消化ペプチドおよび未消化タンパク質を消化した。消化後1%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液を10μL加え、トリプシンを失活させた。あらかじめアセトニトリルで洗浄後0.1%TFA水溶液でコンディショニングしておいたEmpore C18−HD disk cartridge(3M社)で脱塩し、試料溶液とした。
次に10μL用ピペットチップとEmpore C2ディスクを用いてC2−StageTip(自家製、J.Rappsilber,Y.Ishihama,M.Mann,Anal Chem 75(2003)663)を作製し、1mgのチタニアを上部に充填した。さらにEmpore C2ディスクをその上部に充填し、C2−チタニア−C2の構造を有するリン酸化ペプチド濃縮用チップを作製した(図4)。
そして、DL−乳酸(和光純薬、CatNo128−00056)を300mg/mLになるように80%アセトニトリル、0.1%TFAを含む水溶液で溶解した(溶液A)。20μLの溶液Aでリン酸化ペプチド濃縮用チップを洗浄し、チップのコンディショニングを行った。試料溶液と溶液Aを1:1で混合し、リン酸化ペプチド濃縮用チップにロードした。20μLの溶液A及び80%アセトニトリル、0.1%TFAを含む20μLの水溶液で洗浄した後、0.5%アンモニア水50μLで溶出させ、遠心濃縮した後、1%TFA,5%アセトニトリルを含む水溶液10μLで溶解し、LC−MS用試料溶液とした。
この試料溶液についてLC(C18 column)/MS(ThermoFisher LTQ−orbitrap)システムを用いての測定を行った。HPLC条件として、C18シリカゲル(ReproSil−Pur 120 C18−AQ,3μm)を充填した自家製のエレクトロスプレー一体型カラム(Y.Ishihama,J.Rappsilber,J.S.Andersen,M.Mann,J Chromatogr A 979(2002)233.)0.1 x 150mmに移動相Aとして0.5%酢酸水、移動相Bとして80%アセトニトリルを含む0.5%酢酸水を用いて、初期B濃度を5%として、最初の5分間で直線的に10%、その後60分間で直線的に40%とし、その後5分間で直線的に100%とし、その後移動相Bを100%にして10分間維持、その後移動相Bを5%として30分後に次のサンプルを注入した。送液にはダイオネクス社のUltimate3000システムを用い、500nL/minの流速で分析を行った。試料溶液をCTC社のオートサンプラーHTC−PALによって5μL注入し、試料を一度インジェクターのサンプルループに注入した後に分析カラムに送り込んだ。日京テクノス社製ナノLC−MSインターフェースにエレクトロスプレー一体型カラムを装着した。ESI電圧として2.4kVをカラムのポンプ側のバルコ社製金属コネクターを通して印加した。測定は、data dependentモードで、orbitrapにおけるsurveyスキャンの後、ion trapで最大10つのMSMSスキャンを行った。MSMS modeからSurvey scanへのスイッチは1スペクトルとした。
得られたデータについては、Mascot(Matrix science社)およびSwiss−Protデータベースを用いてペプチドの同定を行った。目的ピークの定量は三井情報開発のMass Navigator v1.2を用いて行った。結果を表4に示す。
各酸化チタン試料について上記熱分析を行い、130℃から800℃までの昇温過程において130℃時からの重量減少が最大になった時の重量減少量を測定し、単位秤取量当たりの重量減少量を算出した。
また、熱分析とは別に、これら酸化チタンを用いた以外は実施例1と同一の条件でリン酸化ペプチド濃縮を行い、リン酸化ペプチド濃縮率(%)を次式に従って算出した。リン酸化ペプチド濃縮率(%)=(リン酸化ペプチドの全ピーク面積)/(ペプチドの全ピーク面積)×100。その結果を表6に示す。なお、表6に示した結果において結晶形は、粉末X線パターンで評価した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (9)
- リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を、酸化金属を充填した分離手段にアリファティックヒドロキシカルボン酸の存在下で供給する工程を含む、
リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。 - 上記アリファティックヒドロキシカルボン酸は、αヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする請求項1記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
- 上記分離手段から溶出した溶液を逆相クロマトグラフィーに供することによって、上記リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質と上記アリファティックヒドロキシカルボン酸とを分離する工程を更に含む、請求項1記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
- 上記αヒドロキシカルボン酸は親水性であることを特徴とする請求項2記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
- 上記酸化金属は、酸化チタニウム、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム及び二酸化ケイ素からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
- 上記酸化金属は、連続多孔質構造を有することを特徴とする請求項1記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
- 上記酸化金属は、アナターゼ結晶及び/又は非晶質を含み、示差熱熱重量分析において130℃で15分間加熱した後、毎分40℃で800℃まで昇温した時の昇温過程での重量減少が3〜70mg/gであることを特徴とする請求項1記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
- 上記重量減少が4〜20mg/gであることを特徴とする請求項7記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法。
- 請求項1乃至8いずれか一項記載のリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の分離方法によって分離された、リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質を含む試料を質量分析装置に供し、分離されたリン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の質量を測定する工程を含む、
リン酸化ペプチド及び/又はリン酸化タンパク質の質量分析方法。
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