JP5259305B2 - Cell analysis apparatus and cell analysis method - Google Patents

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本発明は細胞分析装置及び細胞分析方法に関する。さらに詳しくは、フローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射し、当該測定試料からの光を利用して測定試料に含まれる細胞の分析を行う細胞分析装置及び細胞分析方法に関する。   The present invention relates to a cell analyzer and a cell analysis method. More specifically, the present invention relates to a cell analysis apparatus and a cell analysis method for irradiating a measurement sample flowing through a flow cell with laser light and analyzing cells contained in the measurement sample using light from the measurement sample.

フローサイトメトリー法を用いて、血球を含む測定試料にレーザ光を照射し、測定試料からの散乱光や蛍光を利用して、血液中の白血球および当該白血球の核を測定する分析装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
前記特許文献１に記載のフローサイトメトリー法は、１０μｍ前後の大きさの白血球を測定するために用いられている。したがって、特許文献１に記載の分析装置においては、例えば子宮頸部の上皮細胞のように、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞を高精度に測定することは困難であった。 There is known an analyzer that uses a flow cytometry method to irradiate a measurement sample containing blood cells with laser light, and to measure the white blood cells in the blood and the nuclei of the white blood cells using scattered light and fluorescence from the measurement sample. (For example, refer to Patent Document 1).
The flow cytometry method described in Patent Document 1 is used for measuring leukocytes having a size of about 10 μm. Therefore, in the analyzer described in Patent Document 1, it has been difficult to accurately measure cells having a size of about 20 to 100 μm, such as cervical epithelial cells.

特開平２−９３３４２号公報Japanese Patent Laid-Open No. 2-93342

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、フローサイトメトリー法を用いて、子宮頚部から採取した２０〜１００μｍ程度の大きさを有する上皮細胞を高精度に測定することができる細胞分析装置及び細胞分析方法を提供することを目的としている。
This invention is made | formed in view of such a situation, The epithelial cell which has a magnitude | size about 20-100 micrometers extract | collected from the cervix can be measured with high precision using the flow cytometry method. An object of the present invention is to provide a cell analyzer and a cell analysis method.

本発明の細胞分析装置は、子宮頸部から採取した上皮細胞を分析するための細胞分析装置であって、核が染色された前記上皮細胞を含む測定試料を流すフローセルと、このフローセルを流れる測定試料に光を照射する光源部と、前記測定試料の流れ方向の径が４〜７μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成し得る光学系と、前記測定試料からの光を受光し、前記フローセルを流れる測定試料からの散乱光を検出する散乱光検出器および前記フローセルを流れる測定試料からの蛍光を検出する蛍光検出器を有する受光部と、前記散乱光検出器から出力される散乱光信号から前記上皮細胞の大きさを反映した値を取得するとともに、前記蛍光検出器から出力される蛍光信号から前記上皮細胞の核の大きさを反映した値を取得する信号処理部とを備え、前記信号処理部が、前記上皮細胞の大きさを反映した値として、散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、前記上皮細胞の核の大きさを反映した値として、蛍光信号のパルス幅を取得するように構成されていることを特徴としている。
Cell analyzer of the present invention, measured a cell analyzer for analyzing epithelial cells collected from the cervix, flowing a flow cell for flowing a measurement sample containing the epithelial cells nuclei are stained, the flow cell A light source unit for irradiating the sample with light, a beam spot having a diameter of 4 to 7 μm in the flow direction of the measurement sample, and a diameter of 300 to 600 μm in the direction perpendicular to the flow of the measurement sample are connected to the flow cell. An optical system that can be formed on a flowing measurement sample, a scattered light detector that receives light from the measurement sample, detects scattered light from the measurement sample flowing through the flow cell, and fluorescence from the measurement sample flowing through the flow cell. a light receiving unit which have a fluorescence detector for detecting acquires the value reflecting the size of the epithelial cells from the scattered light signal output from the scattered light detector, the fluorescent As a signal processing section from the fluorescence signal outputted from the output unit to retrieve the value reflecting the size of nuclei of the epithelial cells, the signal processing unit, reflecting the size of the epithelial cells value, scattering In addition to acquiring the pulse width of the optical signal, the pulse width of the fluorescent signal is acquired as a value reflecting the size of the nucleus of the epithelial cell .

本発明の細胞分析方法は、子宮頸部から採取され、核が染色された上皮細胞を含む測定試料をフローセルに流し、前記測定試料に光を照射して、当該測定試料からの光を利用して前記上皮細胞を分析する細胞分析方法であって、前記測定試料の流れ方向の径が４〜７μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成し、前記測定試料から散乱光及び蛍光を検出する検出工程と、前記散乱光から生成された散乱光信号から前記上皮細胞の大きさを反映した値を取得するとともに、前記蛍光から生成された蛍光信号から前記上皮細胞の核の大きさを反映した値を取得する取得工程と、を備え、前記上皮細胞の大きさを反映した値として、散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、前記上皮細胞の核の大きさを反映した値として、蛍光信号のパルス幅を取得することを特徴としている。

In the cell analysis method of the present invention, a measurement sample containing epithelial cells collected from the cervix and stained with nuclei is passed through a flow cell , light is irradiated to the measurement sample, and light from the measurement sample is used. a cell analysis method for analyzing the epithelial cells Te, wherein a diameter of 4 to 7 [mu] m in the direction of flow of the measurement sample, the diameter in the direction perpendicular to the flow of the measurement sample beam spot is 300~600μm A detection process for detecting scattered light and fluorescence from the measurement sample formed on the measurement sample flowing through the flow cell, and obtaining a value reflecting the size of the epithelial cells from the scattered light signal generated from the scattered light And obtaining a value reflecting the size of the nucleus of the epithelial cell from the fluorescence signal generated from the fluorescence, and as a value reflecting the size of the epithelial cell, It obtains the pulse width, as the value reflecting the size of nuclei of the epithelial cells, is characterized by obtaining a pulse width of the fluorescence signal.

本発明の細胞分析装置及び細胞分析方法によれば、フローサイトメトリー法を用いて、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞を高精度に測定することができる。   According to the cell analysis device and the cell analysis method of the present invention, cells having a size of about 20 to 100 μm can be measured with high accuracy using a flow cytometry method.

以下、添付図面を参照しつつ、本発明の細胞分析装置及び細胞分析方法の実施の形態を詳細に説明する。
［細胞分析装置の全体構成］
図１は、本発明の一実施の形態に係る細胞分析装置１０の斜視説明図である。この細胞分析装置１０は、患者から採取した細胞を含む測定試料をフローセルに流し、このフローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射し、測定試料からの光（前方散乱光、側方蛍光など）を検出・分析することで、前記細胞に癌・異型細胞が含まれているか否かを判断するのに用いられ、具体的には、子宮頸部の上皮細胞を用いて子宮頸癌をスクリーニングするのに用いられる。細胞分析装置１０は、試料の測定などを行う装置本体１２と、この装置本体１２に接続され、測定結果の分析などを行うシステム制御部１３とを備えている。 Hereinafter, embodiments of a cell analysis device and a cell analysis method of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
[Overall configuration of cell analyzer]
FIG. 1 is a perspective explanatory view of a cell analyzer 10 according to an embodiment of the present invention. The cell analyzer 10 flows a measurement sample containing cells collected from a patient through a flow cell, irradiates the measurement sample flowing through the flow cell with laser light, and emits light (forward scattered light, side fluorescence, etc.) from the measurement sample. By detecting and analyzing, it is used to determine whether the cells contain cancer or atypical cells. Specifically, cervical cancer is screened using cervical epithelial cells. Used for. The cell analysis apparatus 10 includes an apparatus main body 12 that performs sample measurement and the like, and a system control unit 13 that is connected to the apparatus main body 12 and performs analysis of measurement results.

図２は、図１に示される細胞分析装置１０の構成を示すブロック図である。細胞分析装置１０の装置本体１２は、測定試料から細胞や核のサイズなどの情報を検出するための光学検出部３と、信号処理回路４と、測定制御部１６と、モータ、アクチュエータ、バルブなどの駆動部１７と、各種センサ１８とを備えている。信号処理回路４は、光学検出部３の出力をプリアンプ（図示せず）により増幅したものに対して増幅やフィルタ処理等を行うアナログ信号処理回路と、アナログ信号処理回路の出力をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータと、デジタル信号に対して所定の波形処理を行うデジタル信号処理回路とを備えている。また、測定制御部１６が、センサ１８の信号を処理しつつ駆動部１７の動作を制御することにより、測定試料の吸引や測定が行われる。子宮頸癌をスクリーニングする場合、測定試料としては、患者の子宮頸部から採取した細胞（上皮細胞）に遠心（濃縮）、希釈（洗浄）、攪拌（タッピング）、ＰＩ染色などの公知の処理を施して調製されたものを用いることができる。調製された測定試料は試験管に収容され、装置本体１２のピペット（図示せず）下方位置に設置され、当該ピペットにより吸引されてフローセルに供給される。上記ＰＩ染色は、蛍光染色液であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により行われる。ＰＩ染色では核に選択的に染色が施されるため、核からの蛍光が検出可能となる。   FIG. 2 is a block diagram showing the configuration of the cell analyzer 10 shown in FIG. The apparatus main body 12 of the cell analyzer 10 includes an optical detection unit 3 for detecting information such as the size of cells and nuclei from a measurement sample, a signal processing circuit 4, a measurement control unit 16, a motor, an actuator, a valve, and the like. Drive unit 17 and various sensors 18. The signal processing circuit 4 is an analog signal processing circuit that performs amplification, filter processing, etc. on the output of the optical detection unit 3 amplified by a preamplifier (not shown), and converts the output of the analog signal processing circuit into a digital signal. And a digital signal processing circuit that performs predetermined waveform processing on the digital signal. In addition, the measurement control unit 16 controls the operation of the driving unit 17 while processing the signal of the sensor 18 so that the measurement sample is sucked or measured. When screening for cervical cancer, the sample to be measured is a well-known process such as centrifugation (concentration), dilution (washing), stirring (tapping), PI staining, etc. What was prepared by giving can be used. The prepared measurement sample is accommodated in a test tube, placed at a position below the pipette (not shown) of the apparatus main body 12, sucked by the pipette, and supplied to the flow cell. The PI staining is performed with propidium iodide (PI) which is a fluorescent staining solution. In PI staining, the nucleus is selectively stained, so that fluorescence from the nucleus can be detected.

［測定制御部の構成］
測定制御部１６は、マイクロプロセッサ２０、記憶部２１、Ｉ／Ｏコントローラ２２、センサ信号処理部２３、駆動部制御ドライバ２４、及び外部通信コントローラ２５などを備えている。記憶部２１は、ＲＯＭ、ＲＡＭなどからなり、ＲＯＭには、駆動部１７を制御するための制御プログラム、及び、制御プログラムの実行に必要なデータが格納されている。マイクロプロセッサ２０は、制御プログラムをＲＡＭにロードし、又はＲＯＭから直接実行することが可能である。 [Configuration of measurement control unit]
The measurement control unit 16 includes a microprocessor 20, a storage unit 21, an I / O controller 22, a sensor signal processing unit 23, a drive unit control driver 24, an external communication controller 25, and the like. The storage unit 21 includes a ROM, a RAM, and the like. The ROM stores a control program for controlling the drive unit 17 and data necessary for executing the control program. The microprocessor 20 can load the control program into the RAM or execute it directly from the ROM.

マイクロプロセッサ２０には、センサ１８の信号がセンサ信号処理部２３及びＩ／Ｏコントローラ２２を通じて伝達される。マイクロプロセッサ２０は、制御プログラムを実行することにより、センサ１８の信号に応じて、Ｉ／Ｏコントローラ２２及び駆動部制御ドライバ２４を介して駆動部１７を制御することができる。
マイクロプロセッサ２０が処理したデータや、マイクロプロセッサ２０の処理に必要なデータは、外部通信コントローラ２５を介してシステム制御部１３などの外部の装置との間で送受信される。 The signal of the sensor 18 is transmitted to the microprocessor 20 through the sensor signal processing unit 23 and the I / O controller 22. The microprocessor 20 can control the drive unit 17 via the I / O controller 22 and the drive unit control driver 24 according to the signal of the sensor 18 by executing the control program.
Data processed by the microprocessor 20 and data necessary for the processing of the microprocessor 20 are transmitted / received to / from an external device such as the system control unit 13 via the external communication controller 25.

［システム制御部の構成］
図３は、システム制御部１３のブロック図である。システム制御部１３は、パーソナルコンピュータなどからなり、本体２７と、表示部２８と、入力部２９とから主に構成されている。本体２７は、ＣＰＵ２７ａと、ＲＯＭ２７ｂと、ＲＡＭ２７ｃと、ハードディスク２７ｄと、読出装置２７ｅと、入出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース２７ｆと、画像出力インターフェース２７ｇと、から主に構成されている。これらの間は、バス２７ｈによって通信可能に接続されている。 [System controller configuration]
FIG. 3 is a block diagram of the system control unit 13. The system control unit 13 includes a personal computer and the like, and mainly includes a main body 27, a display unit 28, and an input unit 29. The main body 27 mainly includes a CPU 27a, a ROM 27b, a RAM 27c, a hard disk 27d, a reading device 27e, an input / output (I / O) interface 27f, and an image output interface 27g. These are connected to be communicable by a bus 27h.

ＣＰＵ２７ａは、ＲＯＭ２７ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ２７ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＲＯＭ２７ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されており、ＣＰＵ２７ａに実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータなどが格納されている。ＲＡＭ２７ｃは、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ２７ｃは、ＲＯＭ２７ｂ及びハードディスク２７ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ２７ａの作業領域として利用される。   The CPU 27a can execute a computer program stored in the ROM 27b and a computer program loaded in the RAM 27c. The ROM 27b is configured by a mask ROM, PROM, EPROM, EEPROM, or the like, and stores a computer program executed by the CPU 27a, data used for the same, and the like. The RAM 27c is configured by SRAM, DRAM, or the like. The RAM 27c is used to read out computer programs recorded in the ROM 27b and the hard disk 27d. Further, when these computer programs are executed, they are used as a work area of the CPU 27a.

ハードディスク２７ｄは、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ２７ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及びそのコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。例えば、ハードディスク２７ｄには、米マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）などのグラフィカルユーザーインターフェース環境を提供するオペレーティングシステムがインストールされている。
また、ハードディスク２７ｄには、細胞分析装置１０の測定制御部１６への測定オーダ（動作命令）の送信、装置本体１２で測定した測定結果の受信及び処理、処理した分析結果の表示などを行う操作プログラムがインストールされている。この操作プログラムは、当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。 The hard disk 27d is installed with various computer programs to be executed by the CPU 27a, such as an operating system and application programs, and data used for executing the computer programs. For example, an operating system that provides a graphical user interface environment such as Windows (registered trademark) manufactured and sold by Microsoft Corporation is installed in the hard disk 27d.
The hard disk 27d has operations for transmitting a measurement order (operation command) to the measurement control unit 16 of the cell analyzer 10, receiving and processing the measurement result measured by the apparatus body 12, and displaying the processed analysis result. The program is installed. This operation program is assumed to operate on the operating system.

読出装置２７ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されており、可搬型記録媒体に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。Ｉ／Ｏインターフェース２７ｆは、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成されている。Ｉ／Ｏインターフェース２７ｆには、キーボード及びマウスからなる入力部２９が接続されており、ユーザーが入力部２９を使用することにより、パーソナルコンピュータにデータを入力することが可能である。また、Ｉ／Ｏインターフェース２７ｆは、装置本体１２と接続されており、装置本体１２との間でデータ等の送受信を行うことが可能である。
画像出力インターフェース２７ｇは、ＬＣＤ又はＣＲＴなどで構成された表示部２８に接続されており、ＣＰＵ２７ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部２８に出力するようになっている。表示部２８は、入力された映像信号にしたがって、画像（画面）を表示する。 The reading device 27e is configured by a flexible disk drive, a CD-ROM drive, a DVD-ROM drive, or the like, and can read a computer program or data recorded on a portable recording medium. The I / O interface 27f is, for example, a serial interface such as USB, IEEE 1394, or RS-232C, a parallel interface such as SCSI, IDE, or IEEE 1284, or an analog interface including a D / A converter, an A / D converter, or the like. It is configured. An input unit 29 including a keyboard and a mouse is connected to the I / O interface 27f, and the user can input data to the personal computer by using the input unit 29. The I / O interface 27f is connected to the apparatus main body 12, and can transmit and receive data and the like with the apparatus main body 12.
The image output interface 27g is connected to a display unit 28 composed of an LCD or a CRT, and outputs a video signal corresponding to the image data given from the CPU 27a to the display unit 28. The display unit 28 displays an image (screen) according to the input video signal.

［光学検出部の構成］
図４は、光学検出部３の構成を示す図である。図において、レンズ系（光学系）５２は、光源である半導体レーザ５３から放射されたレーザ光を、フローセル５１を流れる測定試料に集光し、集光レンズ５４は測定試料中の細胞の前方散乱光を散乱光検出器であるフォトダイオード５５に集光する。上記レンズ系５２は、簡単のために単一のレンズとして図示しているが、より詳細には、図８及び図９に示すように、半導体レーザ５３側からコリメータレンズ５２ａ、シリンダーレンズ系（平凸シリンダーレンズ５２ｂ＋両凹シリンダーレンズ５２ｃ）及びコンデンサレンズ系（コンデンサレンズ５２ｄ＋コンデンサレンズ５２ｅ）からなるレンズ群として構成することができる。 [Configuration of optical detector]
FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration of the optical detection unit 3. In the figure, a lens system (optical system) 52 condenses laser light emitted from a semiconductor laser 53 as a light source on a measurement sample flowing through the flow cell 51, and a condensing lens 54 forward scatters the cells in the measurement sample. Light is condensed on a photodiode 55 which is a scattered light detector. Although the lens system 52 is illustrated as a single lens for the sake of simplicity, more specifically, as shown in FIGS. 8 and 9, the collimator lens 52a and the cylinder lens system (flat plane) are arranged from the semiconductor laser 53 side. It can be configured as a lens group composed of a convex cylinder lens 52b + biconcave cylinder lens 52c) and a condenser lens system (condenser lens 52d + condenser lens 52e).

図８に示されるように、光学検出部３を側面から見ると、半導体レーザ５３から発せられた放射状のレーザ光は、コリメータレンズ５２ａで平行光に変換され、平凸シリンダーレンズ５２ｂ及び両凹シリンダーレンズ５２ｃを屈折することなく通過し、コンデンサレンズ５２ｄ及びコンデンサレンズ５２ｅによりフローセル５１を流れる測定試料中の第１集光点Ａに集光される。   As shown in FIG. 8, when the optical detector 3 is viewed from the side, the radial laser light emitted from the semiconductor laser 53 is converted into parallel light by the collimator lens 52a, and the plano-convex cylinder lens 52b and the biconcave cylinder are converted. The light passes through the lens 52c without being refracted, and is condensed by the condenser lens 52d and the condenser lens 52e on the first condensing point A in the measurement sample flowing through the flow cell 51.

一方、図９に示されるように、光学検出部３を上方から見ると、半導体レーザ５３から発せられた放射状のレーザ光は、コリメータレンズ５２ａで平行光に変換され、平凸シリンダーレンズ５２ｂにより測定試料の流れに直交する方向に収束され、両凹シリンダーレンズ５２ｃにより測定試料の流れに直交する方向に発散され、コンデンサレンズ５２ｄ及びコンデンサレンズ５２ｅによりフローセル５１の後方の第２集光点Ｂに集光される。   On the other hand, as shown in FIG. 9, when the optical detection unit 3 is viewed from above, the radial laser light emitted from the semiconductor laser 53 is converted into parallel light by the collimator lens 52a and measured by the plano-convex cylinder lens 52b. The sample is converged in a direction orthogonal to the sample flow, diverged in the direction orthogonal to the measurement sample flow by the biconcave cylinder lens 52c, and collected at the second condensing point B behind the flow cell 51 by the condenser lens 52d and the condenser lens 52e. Lighted.

このようなレンズ系５２により、第１集光点Ａにおけるビーム形状（半導体レーザ５３側から見たビーム形状）は、測定試料の流れ方向に収束し、測定試料の流れに直交する方向に延びた長楕円形状となる。具体的には、フローセル５１を流れる測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットが、その第１集光点Ａを測定試料の流れ方向を通る平面上に形成しつつ、フローセル５１を流れる測定試料に照射される。   With such a lens system 52, the beam shape at the first focusing point A (beam shape seen from the semiconductor laser 53 side) converges in the flow direction of the measurement sample and extends in a direction perpendicular to the flow of the measurement sample. It becomes an elliptical shape. Specifically, a beam spot whose diameter in the flow direction of the measurement sample flowing through the flow cell 51 is 3 to 8 μm and whose diameter in the direction orthogonal to the flow of the measurement sample is 300 to 600 μm is the first condensing point A. Is irradiated on the measurement sample flowing through the flow cell 51 while forming the sample on a plane passing through the flow direction of the measurement sample.

なお、フローセル５１を流れる測定試料上に形成される光（ビームスポット）を、測定試料の流れ方向の径を３〜８μｍに形成し、測定試料の流れに直交する方向の径を３００〜６００μｍに形成することができるのであれば、レンズ系５２は上記の構成に限定されるものではなく、適宜変更してもよい。   The light (beam spot) formed on the measurement sample flowing through the flow cell 51 is formed so that the diameter of the measurement sample in the flow direction is 3 to 8 μm, and the diameter in the direction orthogonal to the flow of the measurement sample is 300 to 600 μm. The lens system 52 is not limited to the above configuration as long as it can be formed, and may be changed as appropriate.

他の集光レンズ５６は前記細胞又は細胞中の核の側方散乱光と側方蛍光とをダイクロイックミラー５７に集光する。ダイクロイックミラー５７は、側方散乱光を散乱光検出器であるフォトマルチプライヤ５８へ反射し、側方蛍光を蛍光検出器であるフォトマルチプライヤ５９の方へ透過させる。これらの光は、測定試料中の細胞や核の特徴を反映したものとなっている。そして、フォトダイオード５５、フォトマルチプライヤ５８及びフォトマルチプライヤ５９は、検出した光を電気信号に変換し、それぞれ、前方散乱光信号（ＦＳＣ）、側方散乱光信号（ＳＳＣ）及び側方蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。これらの出力は、図示しないプリアンプにより増幅された後、前述した信号処理回路４（図２）に供される。   The other condensing lens 56 condenses the side scattered light and the side fluorescence of the cell or the nucleus in the cell on the dichroic mirror 57. The dichroic mirror 57 reflects side scattered light to the photomultiplier 58 that is a scattered light detector, and transmits side fluorescence toward the photomultiplier 59 that is a fluorescence detector. These lights reflect the characteristics of cells and nuclei in the measurement sample. The photodiode 55, the photomultiplier 58, and the photomultiplier 59 convert the detected light into an electrical signal, and the forward scattered light signal (FSC), the side scattered light signal (SSC), and the side fluorescent signal, respectively. (SFL) is output. These outputs are amplified by a preamplifier (not shown) and then supplied to the signal processing circuit 4 (FIG. 2).

信号処理回路４でフィルタ処理やＡ／Ｄ変換処理等の信号処理が施されて得られた前方散乱光データ、側方散乱光データ及び側方蛍光データ（ＳＦＬ）は、マイクロプロセッサ２０によって、外部通信コントローラ２５を介して、前述したシステム制御部１３へ送られる。システム制御部１３では、前方散乱光データ、側方散乱光データ及び側方蛍光データに基づいて、細胞や核を分析するためのスキャッタグラムが作成される。また、システム制御部１３は、信号処理回路４から受信した測定データを用いて、測定試料中の細胞が異常であるか否か、具体的には、癌化した細胞又は異型細胞であるか否かを判断する。
なお、光源として、前記半導体レーザに代えてガスレーザを用いることもできるが、低コスト、小型、且つ低消費電力である点で半導体レーザを採用することが好ましく、半導体レーザの採用により製品コストを低減させるとともに、装置の小型化及び省電力化を図ることができる。本実施の形態では、ビームを狭く絞ることに有利な波長の短い青色半導体レーザを用いている。青色半導体レーザは、ＰＩ等の蛍光励起波長に対しても有効である。なお、半導体レーザのうち、低コスト且つ長寿命であり、メーカーからの供給が安定している赤色半導体レーザを用いてもよい。 Forward scattered light data, side scattered light data, and side fluorescence data (SFL) obtained by performing signal processing such as filter processing and A / D conversion processing in the signal processing circuit 4 are externally transmitted by the microprocessor 20. The data is sent to the above-described system control unit 13 via the communication controller 25. The system control unit 13 creates a scattergram for analyzing cells and nuclei based on the forward scattered light data, the side scattered light data, and the side fluorescence data. In addition, the system control unit 13 uses the measurement data received from the signal processing circuit 4 to determine whether the cells in the measurement sample are abnormal, specifically, whether the cells are cancerous cells or atypical cells. Determine whether.
As a light source, a gas laser can be used in place of the semiconductor laser. However, it is preferable to use a semiconductor laser in terms of low cost, small size, and low power consumption. In addition, the apparatus can be reduced in size and power can be saved. In this embodiment, a blue semiconductor laser having a short wavelength, which is advantageous for narrowing the beam, is used. Blue semiconductor lasers are also effective for fluorescence excitation wavelengths such as PI. Of the semiconductor lasers, a red semiconductor laser that has a low cost and a long life and is stably supplied from the manufacturer may be used.

本発明では、光学系である前記レンズ系５２によって、特定の大きさのビームスポットが形成される。具体的には、フローセル５１を流れる測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍである、略楕円形のビームスポットが測定試料上に形成される。図５はビームスポットを通過する細胞の説明図であり、図において上下方向がフローセルを流れる測定試料の流れ方向である。図５において、右側のビームスポットは血液中の赤血球や白血球を検出するのに用いられている従来の一般的装置におけるビームスポットであり、左側のビームスポットは本発明の細胞分析装置の光学系により形成されるビームスポットである。作図上、ビームスポットの長手方向の寸法は、これと直交する方向（図において上下方向）の寸法に比べて縮小して描いているが、本発明の実際のビームスポットは、非常に細長い断面形状を呈している。   In the present invention, a beam spot having a specific size is formed by the lens system 52 which is an optical system. Specifically, a substantially elliptical beam spot having a diameter in the flow direction of the measurement sample flowing through the flow cell 51 of 3 to 8 μm and a diameter in the direction orthogonal to the flow of the measurement sample is 300 to 600 μm is formed on the measurement sample. Formed. FIG. 5 is an explanatory diagram of cells passing through the beam spot, and the vertical direction in the figure is the flow direction of the measurement sample flowing through the flow cell. In FIG. 5, the right beam spot is a beam spot in a conventional general apparatus used for detecting red blood cells and white blood cells in blood, and the left beam spot is obtained by the optical system of the cell analyzer of the present invention. This is a beam spot to be formed. In the drawing, the longitudinal dimension of the beam spot is drawn to be smaller than the dimension in the direction perpendicular to the beam spot (vertical direction in the figure), but the actual beam spot of the present invention has a very elongated cross-sectional shape. Presents.

子宮頸部の上皮細胞の大きさは約６０μｍであり、また核の大きさは５〜７μｍである。この細胞が癌化・異型化すると細胞***の頻度が異常に多くなり、核は１０〜１５μｍの大きさとなる。これにより、Ｎ／Ｃ比（核の大きさ／細胞の大きさ）が正常な細胞に比べて大きくなる。したがって、細胞と核の大きさを検出することによって、細胞が癌化・異型化したか否かの判断指標とすることができる。   The size of epithelial cells in the cervix is about 60 μm, and the size of the nucleus is 5 to 7 μm. When these cells become cancerous or atypical, the frequency of cell division increases abnormally, and the nucleus becomes 10 to 15 μm in size. This increases the N / C ratio (nucleus size / cell size) compared to normal cells. Therefore, by detecting the size of the cells and nuclei, it can be used as an index for determining whether or not the cells have become cancerous or atypical.

そこで、本実施の形態では、フローセルを流れる測定試料からの散乱光をフォトダイオード５５で検出するとともに、フローセルを流れる測定試料からの蛍光をフォトマルチプライヤ５９で検出し、信号処理回路４で、フォトダイオード５５から出力された散乱光信号から測定対象細胞の大きさを反映した値である散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、フォトマルチプライヤ５９から出力された蛍光信号から測定対象細胞の核の大きさを反映した値である蛍光信号のパルス幅を取得している。図１０は光学検出部３により検出された光の信号波形を示す図であり、縦軸は検出された光の強度を示し、横軸は光の検出時間を示している。図１０に示されるように、パルス幅とは信号波形の幅を表し、本実施の形態では、ベースラインより大きい強度を示す信号波形の幅をパルス幅として用いている。ベースラインは適宜設定することができる。散乱光信号のパルス幅は、測定対象細胞がフローセル中の感知領域を通過している間の通過時間を示し、蛍光信号のパルス幅は、測定対象細胞の核がフローセル中の感知領域を通過している間の通過時間を示す。この信号処理回路４で得られた、測定対象細胞の大きさを反映した値（散乱光信号のパルス幅）及び測定対象細胞の核の大きさを反映した値（蛍光信号のパルス幅）に基づいて、測定対象細胞が異常であるか否かを分析部であるシステム制御部１３で行うように構成されている。具体的には、システム制御部１３は、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値が所定の閾値より大きい場合に、測定対象細胞が異常であると判定する。   Therefore, in the present embodiment, the scattered light from the measurement sample flowing through the flow cell is detected by the photodiode 55, and the fluorescence from the measurement sample flowing through the flow cell is detected by the photomultiplier 59, and the signal processing circuit 4 The pulse width of the scattered light signal, which is a value reflecting the size of the measurement target cell, is acquired from the scattered light signal output from the diode 55, and the nucleus of the measurement target cell is acquired from the fluorescence signal output from the photomultiplier 59. The pulse width of the fluorescence signal, which is a value reflecting the magnitude, is acquired. FIG. 10 is a diagram illustrating a signal waveform of light detected by the optical detection unit 3. The vertical axis indicates the detected light intensity, and the horizontal axis indicates the light detection time. As shown in FIG. 10, the pulse width represents the width of the signal waveform, and in this embodiment, the width of the signal waveform indicating the intensity greater than the baseline is used as the pulse width. The baseline can be set as appropriate. The pulse width of the scattered light signal indicates the transit time while the measurement target cell passes through the sensing area in the flow cell, and the pulse width of the fluorescence signal indicates that the nucleus of the measurement target cell passes through the sensing area in the flow cell. The transit time is shown. Based on the value obtained by the signal processing circuit 4 that reflects the size of the measurement target cell (pulse width of the scattered light signal) and the value that reflects the size of the nucleus of the measurement target cell (pulse width of the fluorescence signal) Thus, the system control unit 13 that is an analysis unit determines whether or not the measurement target cell is abnormal. Specifically, the system control unit 13 determines that the measurement target cell is abnormal when a value obtained by dividing the pulse width of the fluorescence signal by the pulse width of the scattered light signal is larger than a predetermined threshold.

ビームスポットにおける、測定試料の流れ方向の径を３〜８μｍとしていることから、核検出のＳ／Ｎ比を向上させることができ、核の大きさを高精度に検出することができる。本実施の形態では、核にＰＩ染色を施し、核の大きさを反映した値として核からの蛍光信号のパルス幅を用いているが、ＰＩ染色では、核以外に細胞膜も若干染色され、また、染色に用いた染料の残りがフローセルを流れることから、核以外からも蛍光が生じる。そのため、蛍光検出器であるフォトマルチプライヤ５９は、核以外からのノイズとなる蛍光も検出することになる。しかしながら、光学検出部３のレンズ系５２によりビームスポットにおける測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍと小さくされるため、核から生じる蛍光と核以外から生じる蛍光とをより明確に峻別することができる。すなわち、核の大きさ（５〜７μｍ）を考慮してビームスポットの径を３〜８μｍと小さくすることによって、ノイズを減らして蛍光信号のパルスの立ち上がりをシャープにしてパルス幅を精度よく測定することができる。その結果、核の大きさを高精度に検出することができる。   Since the diameter of the measurement sample in the beam spot in the flow direction is 3 to 8 μm, the S / N ratio for detecting the nucleus can be improved, and the size of the nucleus can be detected with high accuracy. In the present embodiment, PI staining is performed on the nucleus, and the pulse width of the fluorescence signal from the nucleus is used as a value reflecting the size of the nucleus. However, in PI staining, the cell membrane is also slightly stained in addition to the nucleus. Since the remainder of the dye used for dyeing flows through the flow cell, fluorescence is generated from other than the nucleus. Therefore, the photomultiplier 59 that is a fluorescence detector also detects fluorescence that is noise from other than the nucleus. However, since the diameter of the measurement sample in the beam spot in the flow direction of the beam spot is reduced to 3 to 8 μm by the lens system 52 of the optical detection unit 3, the fluorescence generated from the nucleus and the fluorescence generated from other than the nucleus can be distinguished more clearly. it can. That is, considering the size of the nucleus (5 to 7 μm), the diameter of the beam spot is reduced to 3 to 8 μm, thereby reducing noise and sharpening the rise of the pulse of the fluorescent signal, and measuring the pulse width with high accuracy. be able to. As a result, the size of the nucleus can be detected with high accuracy.

ビームスポットにおける前記流れ方向の径を３μｍよりも小さくしようとすると、レンズ系５２の焦点距離を短くする必要があり、レーザ光の強度が安定な領域（焦点深度）が浅くなる。図１１は、測定試料の流れ方向におけるビーム形状を示す図である。図１１に示されるように、焦点深度は、ビーム径がビームスポットにおけるビーム径Ｄの１．１倍になるまでの領域を示し、ビーム径が大きくなるにつれて光の強度は弱くなる。焦点深度が浅くなると、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞の核にレーザ光を安定的に照射することができなくなる。一方、前記流れ方向の径が８μｍよりも大きくなると、核以外から生じるノイズとなる蛍光の検出割合が大きくなる。そのため、蛍光信号のパルスの立ち上がりがなだらかになり、蛍光信号のパルス幅の範囲がぼやけてしまうため、測定精度が低下する。また、複数の細胞の核がビームスポット内を同時に通過する頻度が多くなり、この点からも測定精度が低下する。そのため、上記の焦点深度を考慮して、ビームスポットにおける、測定試料の流れ方向の径を選定するのが好ましい。具体的には、測定試料の流れ方向に絞られたレーザ光の焦点深度が２０〜１１０μｍとなるようにビームスポットを形成するのが好ましい。なお、レーザ光を安定的に核に照射するためには、ビームスポットの上記流れ方向の径は、３．５〜７．５μｍであることが好ましく、より好ましいのは４〜７μｍである。   In order to make the diameter of the beam spot in the flow direction smaller than 3 μm, it is necessary to shorten the focal length of the lens system 52, and the region where the intensity of the laser light is stable (focus depth) becomes shallow. FIG. 11 is a diagram showing a beam shape in the flow direction of the measurement sample. As shown in FIG. 11, the depth of focus indicates a region until the beam diameter becomes 1.1 times the beam diameter D at the beam spot, and the light intensity decreases as the beam diameter increases. When the depth of focus becomes shallow, it becomes impossible to stably irradiate the nucleus of a cell having a size of about 20 to 100 μm with laser light. On the other hand, when the diameter in the flow direction is larger than 8 μm, the detection ratio of fluorescence that becomes noise generated from other than the nucleus increases. For this reason, the rise of the pulse of the fluorescence signal becomes smooth and the range of the pulse width of the fluorescence signal is blurred, so that the measurement accuracy is lowered. Further, the frequency of the nuclei of a plurality of cells passing through the beam spot at the same time increases, and the measurement accuracy also decreases from this point. For this reason, it is preferable to select the diameter in the flow direction of the measurement sample in the beam spot in consideration of the depth of focus. Specifically, it is preferable to form the beam spot so that the focal depth of the laser light focused in the flow direction of the measurement sample is 20 to 110 μm. In order to stably irradiate the nucleus with laser light, the diameter of the beam spot in the flow direction is preferably 3.5 to 7.5 μm, and more preferably 4 to 7 μm.

また、ビームスポットにおける、測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍの範囲にあることから、子宮頸部の上皮細胞（約６０μｍ程度）全体をレーザビームの安定領域（ガウス分布をなすレーザ光のピーク強度を１とすると、強度が０．９５以上となる領域のこと）を通過させることができる。これにより、細胞から安定した散乱光を得ることができ、細胞の大きさを高精度に測定することができる。流れに直交する方向の径が３００μｍよりも小さくなると、レーザビームの安定領域が狭くなり、細胞からの安定した散乱光が得られなくなる。一方、流れに直交する方向の径が６００μｍよりも大きくなると、中心付近のレーザ光の強度が弱くなり、やはり安定した散乱光が得られなくなる。なお、細胞から安定した散乱光を得るためには、測定試料の流れに直交する方向の径は、３５０〜５５０μｍであることが好ましい。   Further, since the diameter of the beam spot in the direction orthogonal to the flow of the measurement sample is in the range of 300 to 600 μm, the entire epithelial cell of the cervix (about 60 μm) forms a stable region of the laser beam (Gaussian distribution). When the peak intensity of the laser beam is 1, it is possible to pass a region where the intensity is 0.95 or more. Thereby, stable scattered light can be obtained from the cells, and the size of the cells can be measured with high accuracy. If the diameter in the direction orthogonal to the flow is smaller than 300 μm, the stable region of the laser beam becomes narrow and stable scattered light from the cells cannot be obtained. On the other hand, when the diameter in the direction orthogonal to the flow is larger than 600 μm, the intensity of the laser light near the center becomes weak, and stable scattered light cannot be obtained. In order to obtain stable scattered light from the cells, the diameter in the direction orthogonal to the flow of the measurement sample is preferably 350 to 550 μm.

［細胞分析方法］
つぎに、細胞分析装置１０（図１）を用いた細胞分析方法の実施の形態について説明する。 [Cell analysis method]
Next, an embodiment of a cell analysis method using the cell analyzer 10 (FIG. 1) will be described.

まず、フローセルに流す測定試料の調製が使用者の手動により行われる。具体的には、患者の子宮頸部から採取した細胞（上皮細胞）に遠心（濃縮）、希釈（洗浄）、攪拌、ＰＩ染色などの公知の処理を施すことで測定試料が調製される。ついで、使用者により、調製された測定試料が試験管（図示せず）に収容され、試験管が装置本体のピペット（図示せず）下方位置に設置される。   First, a measurement sample to be passed through the flow cell is manually prepared by the user. Specifically, a measurement sample is prepared by subjecting cells (epithelial cells) collected from the cervix of a patient to known processes such as centrifugation (concentration), dilution (washing), stirring, and PI staining. Next, the prepared measurement sample is accommodated in a test tube (not shown) by the user, and the test tube is installed at a position below the pipette (not shown) of the apparatus main body.

次に、図１２及び図１３を参照して、システム制御部１３の処理の流れについて説明する。まず、システム制御部１３の電源が入れられると、システム制御部１３のＣＰＵ２７ａは、システム制御部１３に格納されているコンピュータプログラムの初期化を行う（ステップＳ１）。次に、ＣＰＵ２７ａは、使用者からの測定指示を受け付けたか否かを判断し（ステップＳ２）、測定指示を受け付けた場合には、Ｉ／Ｏインターフェイス２７ｆを介して、測定開始信号を装置本体１２に送信する（ステップＳ３）。測定指示を受け付けなかった場合には、ＣＰＵ２７ａは、ステップＳ６の処理に移行する。   Next, a processing flow of the system control unit 13 will be described with reference to FIGS. First, when the system control unit 13 is turned on, the CPU 27a of the system control unit 13 initializes a computer program stored in the system control unit 13 (step S1). Next, the CPU 27a determines whether or not a measurement instruction from the user has been accepted (step S2). When the measurement instruction is accepted, the CPU 27a sends a measurement start signal via the I / O interface 27f. (Step S3). If the measurement instruction has not been accepted, the CPU 27a proceeds to the process of step S6.

測定開始信号が装置本体１２に送信されると、装置本体１２において、試験管に収容された測定試料がピペットにより吸引されて図４に示すフローセル５１に供給される。そして、フローセル５１を流れる測定試料にレーザ光が照射され、測定試料からの前方散乱光がフォトダイオード５５により検出され、側方散乱光がフォトマルチプライヤ５８で検出され、側方蛍光がフォトマルチプライヤ５９により検出される。   When the measurement start signal is transmitted to the apparatus main body 12, in the apparatus main body 12, the measurement sample accommodated in the test tube is sucked by the pipette and supplied to the flow cell 51 shown in FIG. Then, the measurement sample flowing through the flow cell 51 is irradiated with laser light, forward scattered light from the measurement sample is detected by the photodiode 55, side scattered light is detected by the photomultiplier 58, and side fluorescence is photomultiplier. 59.

ついで、光学検出部３から出力された前方散乱光信号（ＦＳＣ）、側方散乱光信号（ＳＳＣ）、蛍光信号（ＳＦＬ）が信号処理回路４に供され、信号処理回路４で所定の処理が施されて得られた測定データは、外部通信コントローラ２５を介して、システム制御部１３に送信される。   Next, the forward scattered light signal (FSC), the side scattered light signal (SSC), and the fluorescence signal (SFL) output from the optical detection unit 3 are provided to the signal processing circuit 4, and predetermined processing is performed in the signal processing circuit 4. The measurement data obtained by the transmission is transmitted to the system control unit 13 via the external communication controller 25.

一方、システム制御部１３のＣＰＵ２７ａは、装置本体１２から、外部通信コントローラ２５を介して測定データを受信したか否かを判断し（ステップＳ４）、測定データを受信した場合には、細胞分析処理を実行する（ステップＳ５）。測定データを受信しなかった場合には、ＣＰＵ２７ａは、ステップＳ６の処理に移行する。   On the other hand, the CPU 27a of the system control unit 13 determines whether or not measurement data has been received from the apparatus main body 12 via the external communication controller 25 (step S4). Is executed (step S5). When the measurement data is not received, the CPU 27a proceeds to the process of step S6.

細胞分析処理の後、ＣＰＵ２７ａは、シャットダウン指示を受け付けたか否かを判断し（ステップＳ６）、シャットダウン指示を受け付けた場合には、処理を終了する。シャットダウン指示を受け付けなかった場合には、ＣＰＵ２７ａは、ステップＳ２の処理に戻る。   After the cell analysis process, the CPU 27a determines whether or not a shutdown instruction has been received (step S6). If the shutdown instruction has been received, the process ends. When the shutdown instruction is not accepted, the CPU 27a returns to the process of step S2.

次に、図１３を参照して、ステップＳ５の細胞分析処理について説明する。まず、ＣＰＵ２７ａは、装置本体１２から受信した測定データをハードディスク２７ｄに記憶する（ステップＳ５１）。   Next, the cell analysis process in step S5 will be described with reference to FIG. First, the CPU 27a stores the measurement data received from the apparatus main body 12 in the hard disk 27d (step S51).

次に、ＣＰＵ２７ａは、測定データに含まれる前方散乱光データの特徴パラメータ情報（散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ））及び側方蛍光データの特徴パラメータ情報（蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ））から、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値（ＦＳＣＷ／ＳＦＬＷ）を取得し（ステップＳ５２）、取得した値をＲＡＭ２７ｃに記憶する（ステップＳ５３）。   Next, the CPU 27a uses the characteristic parameter information (pulse width (FSCW) of the scattered light signal) of the forward scattered light data and the characteristic parameter information (pulse width (SFLW) of the fluorescent signal) of the side fluorescence data included in the measurement data. Then, a value (FSCW / SFLW) obtained by dividing the pulse width of the fluorescence signal by the pulse width of the scattered light signal is acquired (step S52), and the acquired value is stored in the RAM 27c (step S53).

そして、ＣＰＵ２７ａは、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値（ＦＳＣＷ／ＳＦＬＷ）を、所定の閾値Ｔと比較することにより、細胞が異常細胞か否かを判別する（ステップＳ５４）。ここで、次の式（１）が成立している場合は、対象の細胞は異常細胞であり、式（１）が成立していない場合は、対象の細胞は正常細胞である。
ＦＳＣＷ／ＳＦＬＷ≦Ｔ・・・（１） Then, the CPU 27a compares the value obtained by dividing the pulse width of the fluorescence signal by the pulse width of the scattered light signal (FSCW / SFLW) with a predetermined threshold T to determine whether the cell is an abnormal cell (step). S54). Here, when the following formula (1) is satisfied, the target cell is an abnormal cell, and when the formula (1) is not satisfied, the target cell is a normal cell.
FSCW / SFLW ≦ T (1)

以上の実施の形態では、散乱光から求められる細胞の大きさを反映する値と、蛍光から求められる核の大きさを反映する値とから、細胞の癌化・異型化を判断しているが、核の大きさと、この核に含まれるＤＮＡ量とから細胞の癌化・異型化を判断することもできる。以下、核の大きさと、核中のＤＮＡ量とから細胞の癌化・異型化を判断する第２実施形態について説明する。   In the above embodiment, the canceration / atypification of the cell is determined from the value reflecting the cell size obtained from the scattered light and the value reflecting the nucleus size obtained from the fluorescence. It is also possible to determine whether a cell is cancerous or atypical from the size of the nucleus and the amount of DNA contained in the nucleus. Hereinafter, a second embodiment for determining whether a cell is cancerous or atypical from the size of the nucleus and the amount of DNA in the nucleus will be described.

第２実施形態では、装置本体１２において、フローセルを流れる測定試料からの蛍光がフォトマルチプライヤ５９で検出され、信号処理回路４で、フォトマルチプライヤ５９から出力された蛍光信号に基づいて、測定対象細胞の核の大きさを反映した値と、核中のＤＮＡ量を反映した値とが取得される。細胞の核の大きさを反映する値としては、前述したように、蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）とすることができ、また、核中のＤＮＡ量を反映する値としては蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）とすることができる。図１０に示されるように、蛍光信号のパルスの面積（蛍光量）は、ベースラインと蛍光信号波形とで囲まれた部分の面積を表す。ベースラインは適宜設定することができる。細胞が癌化・異型化すると、細胞***が活発化する結果、ＤＮＡ量が多くなるとともに核自体の大きさが大きくなる。したがって、核の大きさとＤＮＡ量の両者を癌化・異型化の指標とすることにより、細胞が癌化・異型化したか否かを高精度に判断することができる。   In the second embodiment, in the apparatus main body 12, the fluorescence from the measurement sample flowing through the flow cell is detected by the photomultiplier 59, and the signal processing circuit 4 performs measurement based on the fluorescence signal output from the photomultiplier 59. A value reflecting the size of the cell nucleus and a value reflecting the amount of DNA in the nucleus are obtained. As described above, the value that reflects the size of the cell nucleus can be the pulse width (SFLW) of the fluorescence signal, and the value that reflects the amount of DNA in the nucleus is the value of the pulse of the fluorescence signal. It can be an area (SFLI). As shown in FIG. 10, the pulse area (fluorescence amount) of the fluorescence signal represents the area of the portion surrounded by the baseline and the fluorescence signal waveform. The baseline can be set as appropriate. When cells become cancerous and atypical, cell division is activated, resulting in an increase in the amount of DNA and an increase in the size of the nucleus itself. Therefore, by using both the size of the nucleus and the amount of DNA as indicators of canceration / atypification, it is possible to determine with high accuracy whether or not the cell has become cancerous / atypia.

図６は、大部分が癌化・異型化していない正常な細胞である測定試料を測定することにより得られたＤＮＡ量の分布例を示しており、横軸において、出現頻度がピークを迎えるＤＮＡ量を「１」とし、その２倍のＤＮＡ量を「２」としている。右側のピークは正常な細胞***をしている細胞によるものである。細胞が癌化・異型化して異常な細胞***が行われるようになると、上記「２」で示される位置よりも右側のＤＮＡ量を有する細胞の分布が多くなる。   FIG. 6 shows an example of the distribution of the amount of DNA obtained by measuring a measurement sample that is a normal cell that is mostly non-cancerous and atypical. The DNA whose appearance frequency reaches a peak on the horizontal axis. The amount is “1”, and the doubled DNA amount is “2”. The peak on the right is due to cells undergoing normal cell division. When cells become cancerous or atypical and abnormal cell division occurs, the distribution of cells having a DNA amount on the right side of the position indicated by “2” increases.

システム制御部１３のＣＰＵ２７ａは、信号処理回路４で得られた、核の大きさを反映した蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）及び核のＤＮＡ量を反映した蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）を含む測定データを外部通信コントローラ２５を介して装置本体１２から受信すると、第２細胞分析処理を実行する。   The CPU 27a of the system control unit 13 obtains the pulse width (SFLI) of the fluorescent signal reflecting the size of the nucleus and the area (SFLI) of the pulse of the fluorescent signal reflecting the amount of DNA of the nucleus obtained by the signal processing circuit 4. When the included measurement data is received from the apparatus main body 12 via the external communication controller 25, the second cell analysis process is executed.

図１４は、システム制御部１３のＣＰＵ２７ａによる第２細胞分析処理を示すフローチャートである。以下、図１４を参照して、第２細胞分析処理について説明する。まず、ＣＰＵ２７ａは、装置本体１２から受信した測定データをハードディスク２７ｄに記憶する（ステップＳ５０１）。   FIG. 14 is a flowchart showing the second cell analysis processing by the CPU 27a of the system control unit 13. Hereinafter, the second cell analysis process will be described with reference to FIG. First, the CPU 27a stores the measurement data received from the apparatus main body 12 in the hard disk 27d (step S501).

次に、ＣＰＵ２７ａは、測定データに含まれる側方蛍光データの特徴パラメータ情報（蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）及び蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ））をＲＡＭ２７ｃに読み出す（ステップＳ５０２）。   Next, the CPU 27a reads the characteristic parameter information (fluorescence signal pulse width (SFLW) and fluorescence signal pulse area (SFLI)) of the side fluorescence data included in the measurement data into the RAM 27c (step S502).

次に、ＣＰＵ２７ａは、蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）を縦軸にとり、蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）を横軸にとったＳＦＬＷ−ＳＦＬＩスキャッタグラムを作成する（ステップＳ５０３）。ＳＦＬＷ−ＳＦＬＩスキャッタグラムの一例を図７に示す。図７は、ＤＮＡ量と核の大きさとの関係を示しており、左下の領域に分布しているのが正常な細胞群である。細胞が癌化・異型化すると、核が大きくなるとともに、ＤＮＡ量も多くなることから、癌化・異型化した細胞は、図７において右上の領域に分布する。したがって、ＤＮＡ量及び核の大きさについて領域Ｇに含まれる細胞を癌・異型細胞と判断することができる。   Next, the CPU 27a creates an SFLW-SFLI scattergram having the fluorescent signal pulse width (SFLW) on the vertical axis and the fluorescent signal pulse area (SFLI) on the horizontal axis (step S503). An example of the SFLW-SFLI scattergram is shown in FIG. FIG. 7 shows the relationship between the amount of DNA and the size of the nucleus, and normal cells are distributed in the lower left region. When cells become cancerous / atypical, the nucleus becomes larger and the amount of DNA increases, so the cells that have become cancerous / atypical are distributed in the upper right region in FIG. Therefore, the cells contained in the region G with respect to the amount of DNA and the size of the nucleus can be determined as cancer / atypical cells.

続いて、ＣＰＵ２７ａは、蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）を所定の閾値Ｍと比較し、蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）を所定の閾値Ｎと比較することにより、細胞が異常細胞か否かを判別する（ステップＳ５０４）。具体的には、ＣＰＵ２７ａは、次の式（２）(３)の両方が成立している場合は、対象の細胞を異常細胞と判定し、式（２）(３)の少なくとも一方が成立していない場合は、対象の細胞を正常細胞と判定する。
ＳＦＬＷ≧Ｍ・・・（２）
ＳＦＬＩ≧Ｎ・・・（３） Subsequently, the CPU 27a compares the pulse width (SFFL) of the fluorescence signal with a predetermined threshold M, and compares the area (SFLI) of the pulse of the fluorescence signal with the predetermined threshold N to determine whether or not the cell is an abnormal cell. Is determined (step S504). Specifically, when both of the following expressions (2) and (3) are satisfied, the CPU 27a determines that the target cell is an abnormal cell, and at least one of expressions (2) and (3) is satisfied. If not, the target cell is determined as a normal cell.
SFLW ≧ M (2)
SFLI ≧ N (3)

なお、今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれる。   The embodiment disclosed this time should be considered as illustrative in all points and not restrictive. The scope of the present invention is shown not by the above description of the embodiment but by the scope of claims for patent, and further includes meanings equivalent to the scope of claims for patent and all modifications within the scope.

たとえば、本実施の形態では、子宮頸部の細胞の癌化・異型化を検出しているが、本発明はこれに限られない。口腔細胞、膀胱や咽頭など他の上皮細胞、さらには臓器の細胞の癌化・異型化を検出するのに用いてもよい。   For example, in the present embodiment, canceration / atypification of cervical cells is detected, but the present invention is not limited to this. It may be used to detect canceration or atypia of oral cells, other epithelial cells such as bladder and pharynx, and organ cells.

また、本実施の形態では、測定対象細胞の大きさを反映した値として散乱光信号のパルス幅を用い、測定対象細胞の核の大きさを反映した値として蛍光信号のパルス幅を用いているが、本発明はこれに限られない。測定対象細胞の大きさを反映した値として散乱光信号のパルスの高さを用い、測定対象細胞の核の大きさを反映した値として蛍光信号のパルスの高さを用いてもよい。   In this embodiment, the pulse width of the scattered light signal is used as a value reflecting the size of the measurement target cell, and the pulse width of the fluorescence signal is used as a value reflecting the size of the nucleus of the measurement target cell. However, the present invention is not limited to this. The pulse height of the scattered light signal may be used as a value reflecting the size of the measurement target cell, and the pulse height of the fluorescence signal may be used as a value reflecting the size of the nucleus of the measurement target cell.

また、本実施の形態では、測定対象細胞の核の大きさを示す値を測定対象細胞の大きさを示す値で除した値が所定の閾値よりも大きい場合に、測定対象細胞を異常と判定しているが、本発明はこれに限られない。測定対象細胞の大きさを示す値を測定対象細胞の核の大きさを示す値で除した値が所定の閾値よりも小さい場合に、測定対象細胞を異常と判定してもよい。   In the present embodiment, when the value obtained by dividing the value indicating the size of the nucleus of the measurement target cell by the value indicating the size of the measurement target cell is greater than a predetermined threshold, the measurement target cell is determined to be abnormal. However, the present invention is not limited to this. When the value obtained by dividing the value indicating the size of the measurement target cell by the value indicating the size of the nucleus of the measurement target cell is smaller than a predetermined threshold, the measurement target cell may be determined to be abnormal.

本発明の細胞分析装置の一実施の形態の斜視説明図である。It is a perspective explanatory view of one embodiment of a cell analysis device of the present invention. 図１に示される細胞分析装置の構成を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the structure of the cell analyzer shown by FIG. システム制御部を構成するパソコンのブロック図である。It is a block diagram of the personal computer which comprises a system control part. 光学検出部の構成を示す図である。It is a figure which shows the structure of an optical detection part. ビームスポットを通過する細胞の説明図である。It is explanatory drawing of the cell which passes a beam spot. ＤＮＡ量の分布例を示す図である。It is a figure which shows the example of distribution of DNA amount. ＤＮＡ量と核の大きさとの関係を示すスキャッタグラムである。It is a scattergram which shows the relationship between the amount of DNA and the size of a nucleus. 光学検出部の側面図である。It is a side view of an optical detection part. 光学検出部の平面図である。It is a top view of an optical detection part. 信号波形と特徴パラメータとの関係を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the relationship between a signal waveform and a characteristic parameter. 測定試料の流れ方向におけるビーム形状を示す図である。It is a figure which shows the beam shape in the flow direction of a measurement sample. システム制御部のＣＰＵによる処理の流れを示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the flow of the process by CPU of a system control part. システム制御部のＣＰＵにより細胞分析処理を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows a cell analysis process by CPU of a system control part. システム制御部のＣＰＵによる第２細胞分析処理を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the 2nd cell analysis process by CPU of a system control part.

符号の説明Explanation of symbols

３ 光学検出部
４ 信号処理回路
１０ 細胞分析装置
１２ 装置本体
１３ システム制御部
１６ 測定制御部
２７ 本体
２８ 表示部
２９ 入力部
５１ フローセル
５２ レンズ系
５３ 半導体レーザ
５４ 集光レンズ
５５ フォトダイオード
５６ 集光レンズ
５７ ダイクロイックミラー
５８ フォトマルチプライヤ
５９ フォトマルチプライヤ DESCRIPTION OF SYMBOLS 3 Optical detection part 4 Signal processing circuit 10 Cell analyzer 12 Apparatus main body 13 System control part 16 Measurement control part 27 Main body 28 Display part 29 Input part 51 Flow cell 52 Lens system 53 Semiconductor laser 54 Condensing lens 55 Photodiode 56 Condensing lens 57 Dichroic mirror 58 Photomultiplier 59 Photomultiplier

Claims (11)

子宮頸部から採取した上皮細胞を分析するための細胞分析装置であって、
核が染色された前記上皮細胞を含む測定試料を流すフローセルと、
このフローセルを流れる測定試料に光を照射する光源部と、
前記測定試料の流れ方向の径が４〜７μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成し得る光学系と、
前記測定試料からの光を受光し、前記フローセルを流れる測定試料からの散乱光を検出する散乱光検出器および前記フローセルを流れる測定試料からの蛍光を検出する蛍光検出器を有する受光部と、
前記散乱光検出器から出力される散乱光信号から前記上皮細胞の大きさを反映した値を取得するとともに、前記蛍光検出器から出力される蛍光信号から前記上皮細胞の核の大きさを反映した値を取得する信号処理部と
を備え、
前記信号処理部が、前記上皮細胞の大きさを反映した値として、散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、前記上皮細胞の核の大きさを反映した値として、蛍光信号のパルス幅を取得するように構成されていることを特徴とする細胞分析装置。 A cell analyzer for analyzing epithelial cells collected from the cervix,
A flow cell for flowing a measurement sample containing the epithelial cells in which nuclei are stained ;
A light source unit for irradiating light to a measurement sample flowing through the flow cell;
An optical system capable of forming a beam spot having a diameter in the flow direction of the measurement sample of 4 to 7 μm and a diameter of 300 to 600 μm in a direction perpendicular to the flow of the measurement sample on the measurement sample flowing through the flow cell. When,
A light receiving unit and the receiving light from the measurement sample, which have a fluorescence detector for detecting fluorescence from the measurement sample flowing in the scattered light detector and the flow cell for detecting the scattered light from the measurement sample flowing through the flow cell,
Obtaining a value reflecting the size of the epithelial cell from the scattered light signal output from the scattered light detector, and reflecting the size of the nucleus of the epithelial cell from the fluorescent signal output from the fluorescence detector A signal processing unit for obtaining a value ,
The signal processing unit acquires the pulse width of the scattered light signal as a value reflecting the size of the epithelial cells, and acquires the pulse width of the fluorescent signal as a value reflecting the size of the nucleus of the epithelial cells. A cell analyzer characterized by being configured to do so . 前記信号処理部で得られた、前記上皮細胞の大きさを反映した値及び前記上皮細胞の核の大きさを反映した値に基づいて、前記上皮細胞が異常であるか否かを判定する分析部をさらに備えている請求項１に記載の細胞分析装置。 Obtained in the signal processing unit, the epithelial cells on the basis of the value reflecting the size of the nucleus of the values and the epithelial cells that reflects the size, analysis determined whether the epithelial cells is abnormal cell analyzer according to claim 1, further comprising a part. 前記分析部が、前記散乱光信号のパルス幅および前記蛍光信号のパルス幅の比を取得するように構成されている請求項２に記載の細胞分析装置。 The cell analysis device according to claim 2 , wherein the analysis unit is configured to acquire a ratio between a pulse width of the scattered light signal and a pulse width of the fluorescence signal. 前記信号処理部は、前記蛍光検出器から出力された蛍光信号から、前記上皮細胞の核のＤＮＡ量を反映した値を取得し、
前記信号処理部で得られた、前記上皮細胞の核の大きさを反映した値及び前記上皮細胞の核のＤＮＡ量を反映した値に基づいて、前記上皮細胞が異常であるか否かを判定する分析部をさらに備えている請求項１に記載の細胞分析装置。 Wherein the signal processing unit from said fluorescence signals outputted from the fluorescence detector, obtains a value reflecting the DNA amount of the nucleus of the epithelial cells,
The obtained by the signal processing unit, based on the value reflecting the DNA amount of the nucleus of nuclear size value and the epithelial cells that reflects the epithelial cells, it determines whether the epithelial cells is abnormal The cell analysis device according to claim 1, further comprising an analysis unit configured to perform the analysis. 測定試料の流れ方向に絞られた光の焦点深度が２０〜１１０μｍとなるようにビームスポットが形成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞分析装置。 The cell analysis apparatus according to any one of claims 1 to 4 , wherein the beam spot is formed so that a depth of focus of light focused in a flow direction of the measurement sample is 20 to 110 µm. 前記信号処理部は、前記蛍光検出器から出力された蛍光信号から、前記上皮細胞の核のＤＮＡ量を反映した値を取得し、
前記信号処理部で得られた、前記上皮細胞の核のＤＮＡ量とその出現頻度の分布を指標とし、前記上皮細胞が異常であるか否かを判定する分析部をさらに備えている請求項１に記載の細胞分析装置。 Wherein the signal processing unit from said fluorescence signals outputted from the fluorescence detector, obtains a value reflecting the DNA amount of the nucleus of the epithelial cells,
2. An analysis unit for determining whether or not the epithelial cell is abnormal, using the distribution of the DNA amount of the nucleus of the epithelial cell and the distribution of the appearance frequency obtained by the signal processing unit as an index. The cell analyzer described in 1. 子宮頸部から採取され、核が染色された上皮細胞を含む測定試料をフローセルに流し、前記測定試料に光を照射して、当該測定試料からの光を利用して前記上皮細胞を分析する細胞分析方法であって、
前記測定試料の流れ方向の径が４〜７μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成し、前記測定試料から散乱光及び蛍光を検出する検出工程と、
前記散乱光から生成された散乱光信号から前記上皮細胞の大きさを反映した値を取得するとともに、前記蛍光から生成された蛍光信号から前記上皮細胞の核の大きさを反映した値を取得する取得工程と、を備え、
前記上皮細胞の大きさを反映した値として、散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、前記上皮細胞の核の大きさを反映した値として、蛍光信号のパルス幅を取得することを特徴とする細胞分析方法。 Collected from the uterine cervix, the cells nuclei flowing a measurement sample containing the stained epithelial cells in the flow cell, the by irradiating the measurement sample with light, analyzing the epithelial cells by use of light from the measurement sample An analysis method,
A beam spot having a diameter of 4 to 7 μm in the flow direction of the measurement sample and a diameter of 300 to 600 μm in a direction orthogonal to the flow of the measurement sample is formed on the measurement sample flowing through the flow cell, and the measurement A detection step of detecting scattered light and fluorescence from the sample;
Obtaining a value reflecting the size of the epithelial cell from the scattered light signal generated from the scattered light, and obtaining a value reflecting the size of the nucleus of the epithelial cell from the fluorescence signal generated from the fluorescence An acquisition process,
The pulse width of the scattered light signal is acquired as a value reflecting the size of the epithelial cell, and the pulse width of the fluorescence signal is acquired as a value reflecting the size of the nucleus of the epithelial cell. Cell analysis method. 前記上皮細胞の大きさを反映した値及び前記上皮細胞の核の大きさを反映した値に基づいて、前記上皮細胞が異常であるか否かを判定する判定工程を含む請求項７に記載の細胞分析方法。 Based on the value reflecting the size of the nucleus of the values and the epithelial cells that reflects the size of the epithelial cells, according to claim 7 comprising as determination Engineering whether the epithelial cells is abnormal Cell analysis method. 前記判定工程において、前記散乱光信号のパルス幅および前記蛍光信号のパルス幅の比に基づいて判定を行う請求項８に記載の細胞分析方法。 The cell analysis method according to claim 8 , wherein in the determination step , determination is performed based on a ratio of a pulse width of the scattered light signal and a pulse width of the fluorescence signal. 前記取得工程において、前記蛍光から生成された蛍光信号から前記上皮細胞の核のＤＮＡ量を反映した値を取得し、
前記上皮細胞の核の大きさを反映した値及び前記上皮細胞の核のＤＮＡ量を反映した値に基づいて、前記上皮細胞が異常であるか否かを判定する判定工程を含む請求項７に記載の細胞分析方法。 In the obtaining step obtains a value reflecting the DNA amount of the nucleus of the fluorescent signal or al the epithelial cells generated from the fluorescence,
Based on the value reflecting the DNA amount of the nucleus of the values and the epithelial cells reflecting the size of the nucleus of the epithelial cells according to claim 7 comprising as determination Engineering whether the epithelial cells is abnormal The cell analysis method described in 1. 前記取得工程において、前記蛍光から生成された蛍光信号から前記上皮細胞の核のＤＮＡ量を反映した値を取得し、
前記信号処理部で得られた、前記上皮細胞の核のＤＮＡ量とその出現頻度の分布を指標とし、前記上皮細胞が異常であるか否かを判定する判定工程を含む請求項７に記載の細胞分析方法。 In the obtaining step obtains a value reflecting the DNA amount of the nucleus of the epithelial cells from the fluorescence signal generated from the fluorescence,
The obtained by the signal processing unit, the aforementioned DNA of the nucleus of epithelial cells and index distribution of the occurrence frequency, according to claim 7 comprising as determination Engineering whether the epithelial cells is abnormal Cell analysis method.
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