JP5258512B2

JP5258512B2 - DNA polymerase mutant with enhanced exonuclease activity

Info

Publication number: JP5258512B2
Application number: JP2008280392A
Authority: JP
Inventors: 洋一西田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2008-10-30
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2028-10-30
Also published as: JP2010104304A

Description

本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。詳細には、ＤＮＡポリメラーゼに存する７０６位のアルギニンを電荷を持たないアミノ酸(例えばアラニン)、もしくは、負の電荷を持つアミノ酸（例えばグルタミン酸）に置換することにより得られる、エキソヌクレアーゼ活性を上昇させたＤＮＡポリメラーゼ変異体、それをコードするＤＮＡ、ならびにかかる変異体の用途等に関する。 The present invention relates to a DNA polymerase mutant. Specifically, the exonuclease activity obtained by substituting 706 arginine in DNA polymerase with an amino acid having no charge (for example, alanine) or an amino acid having a negative charge (for example, glutamic acid) was increased. The present invention relates to a DNA polymerase mutant, DNA encoding the same, use of such a mutant, and the like.

ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート鎖上にハイブリダイズしたプライマー鎖の３’−ＯＨ基と新生鎖として導入する塩基の５’−リン酸基をホスホジエステル結合で連結する活性を有する酵素であり、生体内ではＤＮＡの複製や修復に関与している。従来遺伝子増幅技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が開発され、用いられている。ＰＣＲ法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて温度サイクリング反応を行って、標的遺伝子を増幅あるいは検出する方法である。ＰＣＲ法の効率を上げるためにさらなる耐熱性ポリメラーゼが検索され、市販もされている。 A DNA polymerase is an enzyme having an activity of linking a 3′-OH group of a primer strand hybridized on a template strand and a 5′-phosphate group of a base introduced as a nascent strand by a phosphodiester bond. It is involved in DNA replication and repair. As a conventional gene amplification technique, a polymerase chain reaction (PCR) method has been developed and used. The PCR method is a method for amplifying or detecting a target gene by performing a temperature cycling reaction using a thermostable DNA polymerase. In order to increase the efficiency of the PCR method, further thermostable polymerases have been searched and marketed.

ＤＮＡポリメラーゼは数千塩基以上にも及ぶテンプレートに対して、精確にテンプレート上の各塩基に対合する塩基を順番に一つずつプライマー鎖に結合して行き、二本鎖ＤＮＡを作成する。その合成速度は、in vivoで毎秒数千塩基にも及ぶとされている。特に、細胞***の際には核内のＤＮＡを全て複製する必要があるが、このとき主要な役割を果たすのが複製型ＤＮＡポリメラーゼという種類のＤＮＡポリメラーゼである。膨大な遺伝情報を短い時間で複製する必要があるため、時折テンプレートに対合しない誤った塩基（ミスマッチ塩基）が導入されることがある。そのため複製型ＤＮＡポリメラーゼには上に述べた塩基を導入する二本鎖ＤＮＡ合成（５’→３’ポリメラーゼ機能）の働きのほかに誤って導入されたミスマッチ塩基を取り除く３’→５’エキソヌクレアーゼ機能がある。ミスマッチ塩基はＤＮＡ配列情報を次世代に誤って伝えるため取り除かれなければならず、複製型ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’ポリメラーゼ機能と３’→５’エキソヌクレアーゼ機能のバランスをとりながら、エラーを最小化し、精確なＤＮＡ複製を行う。 DNA polymerase binds each base on the template accurately to the primer strand one by one with respect to a template of several thousand bases or more to create double-stranded DNA. Its synthesis rate is estimated to reach several thousand bases per second in vivo. In particular, during cell division, it is necessary to replicate all DNA in the nucleus. At this time, a DNA polymerase of a kind called a replicative DNA polymerase plays a major role. Since a large amount of genetic information needs to be replicated in a short time, an incorrect base (mismatch base) that does not match the template is occasionally introduced. Therefore, in addition to the function of double-stranded DNA synthesis (5 ′ → 3 ′ polymerase function) for introducing the above-mentioned bases into replicative DNA polymerase, 3 ′ → 5 ′ exonuclease that removes mismatched bases introduced by mistake. There is a function. Mismatch bases must be removed in order to misrepresent DNA sequence information to the next generation, and replicative DNA polymerases can generate errors while balancing the 5 '→ 3' polymerase function and the 3 '→ 5' exonuclease function. Minimize and perform accurate DNA replication.

ところが、この複製型ＤＮＡポリメラーゼを用いても、複製の忠実度（fidelity）は１００％にならない。今後、より長尺なＤＮＡ合成が求められるようになり、また、並列化も進むことで一つ一つのＤＮＡポリメラーゼの働きの正確さが求められるようになる。本発明は、複製型ＤＮＡポリメラーゼの変異体と、その反応補助因子ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を併用することにより、５’→３’ポリメラーゼ機能と３’→５’エキソヌクレアーゼ機能の平衡を３’→５’エキソヌクレアーゼ側に偏らせて、より忠実度の高いＤＮＡ複製を行うものである。 However, even when this replication type DNA polymerase is used, the fidelity of replication is not 100%. In the future, longer DNA synthesis will be required, and with the progress of parallelization, the accuracy of the action of each DNA polymerase will be required. In the present invention, the equilibrium between 5 ′ → 3 ′ polymerase function and 3 ′ → 5 ′ exonuclease function is balanced with 3 ′ → by using a replicative DNA polymerase mutant and its reaction cofactor DNA clamp (PCNA) together. It is biased toward the 5 ′ exonuclease side to perform DNA replication with higher fidelity.

本発明が解決すべき課題は、反応補助因子ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）と協働させることにより３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を増強したＤＮＡポリメラーゼ、特に、耐熱性を有するＤＮＡポリメラーゼを得ることであった。 The problem to be solved by the present invention is to obtain a DNA polymerase having enhanced 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity by cooperating with a reaction cofactor DNA clamp (PCNA), in particular, a DNA polymerase having heat resistance. It was.

本発明者は、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ね、ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ複合体の結晶構造解析を行い、その相互作用部位と、それにより安定化される両分子の相対配置、可動範囲を決定することに成功した。その結果、ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ間に主に二箇所の相互作用部位が存在することを見出し、うち一方の相互作用を不活化することで、ＤＮＡクランプとＤＮＡポリメラーゼを協働させた場合において、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が相対的に上昇することを見出した。 The present inventor has conducted extensive research in view of the above circumstances, and has analyzed the crystal structure of the DNA clamp / DNA polymerase complex, and determined the interaction site and the relative arrangement and movable range of both molecules stabilized thereby. Successfully determined. As a result, it was found that there are mainly two interaction sites between the DNA clamp / DNA polymerase, and by inactivating one of the interactions, when the DNA clamp and the DNA polymerase cooperate, It has been found that 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity is relatively increased.

３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を上昇させるため、不活化する方の相互作用部位で主要な役割を果たしているアミノ酸はＤＮＡポリメラーゼでは７０６位のアルギニンである。アルギニンは正の静電荷を持つアミノ酸であるが、このアミノ酸を電荷を持たないアミノ酸（アラニン）、負の静電荷を持つアミノ酸（グルタミン酸）、同じ正の静電荷を持つアミノ酸（リジン）に置換した際、前二者（アラニン、グルタミン酸）において反応補助因子との相互作用強度が大きく変化することを確認し、かつ正の静電荷を持つアミノ酸（リジン）に置換した場合は大きな相互作用強度変化が見出されなかったことから、７０６位のアルギニンの正の静電荷がこの相互作用部位で重要であること見出した。 In order to increase 3 '→ 5' exonuclease activity, the amino acid that plays a major role at the inactive interaction site is arginine at position 706 in DNA polymerase. Arginine is an amino acid with a positive electrostatic charge, but this amino acid was replaced with an amino acid with no charge (alanine), an amino acid with a negative electrostatic charge (glutamic acid), or an amino acid with the same positive electrostatic charge (lysine). On the other hand, it was confirmed that the interaction strength with the reaction cofactor in the former two (alanine, glutamic acid) changed greatly, and when the amino acid (lysine) having a positive electrostatic charge was substituted, the interaction strength changed greatly. Since it was not found, it was found that the positive electrostatic charge of arginine at position 706 is important at this interaction site.

更にこれまでの研究から、５’→３’ポリメラーゼ機能を果たす場合のＤＮＡポリメラーゼ分子内の基質ＤＮＡの結合角と、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を果たす場合のＤＮＡポリメラーゼ分子内の基質ＤＮＡの結合角は共に明らかにされている。これらをわれわれの解明したＤＮＡクランプ/ＤＮＡポリメラーゼ複合体に重ね合わせて比較すると、５’→３’ポリメラーゼ機能を果たす場合の基質のみが複合体内でＤＮＡクランプと適正な位置関係になる一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を果たす場合の基質は複合体内でＤＮＡクランプと適正な位置関係となりえない。ところが上述の不活化すべき相互作用部位を解消した場合、基質ＤＮＡはＤＮＡクランプと適正な位置関係となりえる。よって我々は７０６位のアルギニンに変異を導入した変異体について３’→５’エキソヌクレアーゼを野生型と比較してみた。その結果、ＤＮＡクランプ・ＤＮＡポリメラーゼ変異体を協働させた場合において、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が相対的に上昇することを見出したのである。図１に、複合体結晶構造解析により明らかとなった、上述の相互作用の不活化による３’→５’エキソヌクレアーゼ活性上昇のメカニズムについて概念図を示した。 Furthermore, from previous studies, the binding angle of the substrate DNA in the DNA polymerase molecule when performing the 5 ′ → 3 ′ polymerase function and the substrate DNA in the DNA polymerase molecule when performing the 3 ′ → 5 ′ exonuclease function Both bond angles are revealed. When these are superimposed on our elucidated DNA clamp / DNA polymerase complex and compared, only the substrate when performing the 5 ′ → 3 ′ polymerase function is in an appropriate positional relationship with the DNA clamp in the complex, while 3 ′ → Substrate for 5 ′ exonuclease function cannot be in proper positional relationship with DNA clamp in the complex. However, if the interaction site to be inactivated is eliminated, the substrate DNA can be in an appropriate positional relationship with the DNA clamp. Therefore, we compared the 3 '→ 5' exonuclease with the wild type for the mutant in which mutation was introduced into the 706th arginine. As a result, it was found that the 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity was relatively increased when the DNA clamp / DNA polymerase mutant was allowed to cooperate. FIG. 1 is a conceptual diagram showing the mechanism of 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity increase due to inactivation of the above-mentioned interaction, which was clarified by the complex crystal structure analysis.

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（２）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（３）中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（４）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（５）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（６）ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（７）好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ変異体である、（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
（９）（８）記載のＤＮＡを組み込んだ組換えベクター。
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
（１１）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キット。
（１２）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
（１３）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
（１４）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
（１５）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＰＣＲ用キット。
（１６）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
（１７）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＤＮＡシーケンシング用キット。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A DNA polymerase mutant having enhanced 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity when cooperating with a DNA clamp, which is 706 of the amino acid sequence of wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus by homology analysis A DNA polymerase mutant characterized in that an amino acid identified as corresponding to the position arginine is substituted with an amino acid other than a positively charged amino acid.
(2) The DNA polymerase variant according to (1), wherein the amino acid specified to correspond to arginine at position 706 is substituted with a neutral amino acid, a hydrophilic amino acid, or an acidic amino acid.
(3) The neutral amino acid is selected from alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine, tryptophan and cysteine, the hydrophilic amino acid is selected from serine, asparagine, glutamine and threonine, and the acidic amino acid is tyrosine, aspartic acid And the DNA polymerase variant according to (2), which is selected from glutamic acid.
(4) The DNA polymerase mutant according to (1), wherein the amino acid identified as corresponding to 706th arginine is substituted with alanine or glutamic acid.
(5) The DNA polymerase mutant according to (1), wherein an amino acid specified to correspond to arginine at position 706 is substituted with aspartic acid.
(6) The DNA polymerase according to any one of (1) to (5), wherein arginine at position 706 of the amino acid sequence of a wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus is substituted with an amino acid other than a positively charged amino acid Mutant.
(7) The DNA according to any one of (1) to (5), which is a DNA polymerase mutant of a wild type DNA polymerase derived from a thermophilic bacterium, a hyperthermophilic bacterium, a thermophilic archaebacterium, or a hyperthermophilic archaebacterium. Polymerase variant.
(8) DNA encoding the DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7).
(9) A recombinant vector incorporating the DNA according to (8).
(10) A PCR method comprising using the DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7).
(11) A PCR kit comprising the DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7).
(12) A DNA sequencing method comprising using the DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7).
(13) A DNA sequencing kit comprising the DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7).
(14) A PCR method using a DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7) and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.
(15) A PCR kit comprising a DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7) and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.
(16) A DNA sequencing method comprising using the DNA polymerase variant according to any one of (1) to (7) and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.
(17) A DNA sequencing kit comprising a DNA polymerase mutant according to any one of (1) to (7) and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.

本発明により、ＤＮＡクランプと併用した場合、３’→５’エキソヌクレアーゼが相対的に上昇し、結果的にＤＮＡ複製の忠実度が上昇する。好熱性の生物に由来するＤＮＡポリメラーゼの変異体を用いた場合には、忠実度が高く、かつ耐熱性が優れたＤＮＡ複製系が得られる。さらに、それらをコードするＤＮＡ、ならびにかかるＤＮＡポリメラーゼ、および好ましくはＤＮＡクランプを用いるＰＣＲ法、ＤＮＡシーケンシング法およびそのためのキットが提供される。したがって、より迅速かつ正確なＰＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。また本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いると、より長尺なＤＮＡをテンプレートとした系での遺伝子操作を行うことができる。 According to the present invention, when used in combination with a DNA clamp, 3 '→ 5' exonuclease is relatively increased, resulting in increased fidelity of DNA replication. When a mutant of DNA polymerase derived from a thermophilic organism is used, a DNA replication system with high fidelity and excellent heat resistance can be obtained. In addition, DNA encoding them, as well as PCR methods, DNA sequencing methods and kits therefor, using such DNA polymerases and preferably DNA clamps are provided. Therefore, a more rapid and accurate PCR method can be performed, and efficient gene amplification, point mutation detection, and the like can be performed. In addition, when the DNA polymerase mutant of the present invention is used, genetic manipulation can be performed in a system using a longer DNA as a template.

１．ＤＮＡポリメラーゼ変異体
本発明は、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡクランプの相互作用部位に存するアルギニン、もしくは他のポリメラーゼの相当するアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換することによって得られるＤＮＡポリメラーゼ変異体を提供するものである。この相互作用部位は複合体の構造を堅固にしていると考えられるが、その反面、３’→５’エキソヌクレアーゼ反応に関しては抑制的に機能しており、そのことによりＤＮＡ複製における忠実度が低減されている。そこで、この相互作用部位に存するＤＮＡポリメラーゼの正電荷アミノ酸に上記の変異を導入し、ＤＮＡクランプと併用することにより、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および忠実度を向上させることができる。 1. DNA polymerase mutant The present invention relates to arginine present at the interaction site between a wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus and a DNA clamp, or an amino acid corresponding to another polymerase to an amino acid other than a positively charged amino acid. The present invention provides a DNA polymerase mutant obtained by substitution. This interaction site is thought to have a strong structure of the complex, but on the other hand, it functions repressively with respect to the 3 ′ → 5 ′ exonuclease reaction, thereby reducing fidelity in DNA replication. Has been. Therefore, the 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity and fidelity of the enzyme can be improved by introducing the mutation described above into the positively charged amino acid of the DNA polymerase present at this interaction site and using it together with the DNA clamp.

すなわち、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体である。 That is, the DNA polymerase mutant of the present invention is a DNA polymerase mutant having enhanced 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity when cooperating with a DNA clamp, and is a wild-type derived from Pyrococcus furiosus by homology analysis. A DNA polymerase variant characterized in that an amino acid identified as corresponding to 706th arginine in the amino acid sequence of the type DNA polymerase is substituted with an amino acid other than a positively charged amino acid.

ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するとは、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと協働させた場合に、野生型のＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡクランプと協働させた場合と比較して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が増強されていることをさす。換言すれば、ＤＮＡクランプ共存下の本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体が、ＤＮＡクランプ共存下の野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が増強されていることをさす。 Having enhanced 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity when cooperating with DNA clamp means that when the DNA polymerase variant of the present invention is cooperating with DNA clamp, wild type DNA polymerase and DNA This indicates that the 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity is enhanced as compared with the case of cooperating with the clamp. In other words, the DNA polymerase mutant of the present invention in the presence of a DNA clamp has an enhanced 3 '→ 5' exonuclease activity as compared to the wild type DNA polymerase in the presence of a DNA clamp.

ＤＮＡクランプは、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）とも称され、ＤＮＡポリメラーゼの合成持続性を増大させる因子としてが知られている。ＰＣＮＡはＤＮＡを囲む形でトライマーを形成し、ＤＮＡポリメラーゼと結合してその合成持続性を高める。 DNA clamp, also called proliferating cell nuclear antigen (PCNA), is known as a factor that increases the duration of DNA polymerase synthesis. PCNA forms a trimer in the form of surrounding DNA and binds to DNA polymerase to increase its synthesis persistence.

本発明にかかるピロコッカス・フリオサスの野生型ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される。 The nucleotide sequence and amino acid sequence of Pyrococcus furiosus wild-type DNA polymerase according to the present invention are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.

本発明において「ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸」は、ホモロジー解析に基づいて特定される。より具体的には、「配列番号２のアミノ酸配列を参照配列としたときの７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸」を意味し、任意のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列Ｚを配列番号２のアミノ酸配列とアラインメントしたときに、配列番号２のアミノ酸配列の１番目の塩基から数えて７０６番目のアミノ酸に対してアラインされる（すなわち、アラインメントにおいて同じ縦列に整列される）、アミノ酸配列Ｚ中のアミノ酸を意味する。なお、ホモロジー解析としては、例えばLimpan-Pearson法のような任意の公知のホモロジー解析法を利用することができる。 In the present invention, the “amino acid specified as corresponding to 706th arginine in the amino acid sequence of the wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus” is specified based on homology analysis. More specifically, it means “an amino acid identified as corresponding to arginine at position 706 when the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is used as a reference sequence”, and the amino acid sequence Z of any DNA polymerase is represented by the amino acid of SEQ ID NO: 2. Amino acids in amino acid sequence Z that are aligned with the 706th amino acid from the first base of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (ie, aligned in the same column in the alignment) when aligned with the sequence Means. As the homology analysis, any known homology analysis method such as the Limpan-Pearson method can be used.

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のもととなるＤＮＡポリメラーゼは、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸としてアルギニンまたはリジンを有するものであればよく、その起源はいずれのものであってもよい。好ましくは複製型ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＰＣＲ法の効率および信頼性を向上させること等を考慮すると、反応性および耐熱性がいずれも向上したＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を得るためのＤＮＡポリメラーゼ、およびこれと併用するＤＮＡクランプとしては、例えば好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが好ましい。このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定される正電荷アミノ酸（アルギニンまたはリジン）を、正電荷を持たない他のアミノ酸、とりわけ負電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）に置換しＤＮＡクランプと併用することにより、ＤＮＡ複製における忠実度ならびに耐熱性が優れたＤＮＡ複製系を得ることができる。 The DNA polymerase that is the basis of the DNA polymerase variant of the present invention is any DNA polymerase that has arginine or lysine as an amino acid specified to correspond to arginine at position 706 of the amino acid sequence of the wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus. Well, its origin can be anything. Preferably, replicating DNA polymerase is used. In view of improving the efficiency and reliability of the PCR method, it is preferable to use a DNA polymerase having improved reactivity and heat resistance. Therefore, as a DNA polymerase for obtaining the DNA polymerase mutant of the present invention and a DNA clamp used in combination therewith, for example, DNA derived from a thermophilic bacterium, a hyperthermophilic bacterium, a thermophilic archaebacterium or a hyperthermophilic archaebacterium Polymerases and DNA clamps are preferred. In such a thermostable DNA polymerase, a positively charged amino acid (arginine or lysine) identified as corresponding to 706th arginine in the amino acid sequence of Pyrococcus furiosus-derived wild-type DNA polymerase by homology analysis has no positive charge. By substituting with other amino acids, in particular negatively charged amino acids (aspartic acid or glutamic acid) and using in combination with a DNA clamp, a DNA replication system having excellent fidelity and heat resistance in DNA replication can be obtained.

特に好ましいＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプとしては好熱性細菌（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等）、超好熱性細菌（例えば、サーモトガ・マリテマ（Thermotoga maritima）等）、好熱性古細菌（例えば、サーモプラズマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）等）または超好熱性古細菌（例えば、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）等）由来のものが挙げられ、超好熱性細菌または超好熱性古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが最も好ましい。最も好ましいＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプの例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが挙げられる。 Particularly preferred DNA polymerases and DNA clamps include thermophilic bacteria (eg, Bacillus stearothermophilus), hyperthermophilic bacteria (eg, Thermotoga maritima), thermophilic archaea ( Examples include those derived from thermoplasma volcanium) or hyperthermophilic archaea (eg, Aeropyrum pernix), and DNA derived from hyperthermophilic bacteria or hyperthermophilic archaea. Most preferred are polymerases and DNA clamps. Examples of the most preferred DNA polymerases and DNA clamps include wild type DNA polymerases and DNA clamps from Pyrococcus furiosus.

ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定される正電荷アミノ酸を置換するアミノ酸は、正電荷を有しないアミノ酸（正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸）であれば特に制限されない。例えば、中性アミノ酸（アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン）、親水性アミノ酸（セリン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン）、または酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン）である。アミノ酸置換は当業者に公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくは部位特異的突然変異法を用いて行う。アミノ酸置換については変異導入アミノ酸のコドンを変異後のアミノ酸のコドンに置換することによって行うことができる。 The amino acid that replaces the positively charged amino acid identified as corresponding to 706th arginine in the amino acid sequence of the wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus by homology analysis is an amino acid that does not have a positive charge (an amino acid other than a positively charged amino acid). ) Is not particularly limited. For example, with neutral amino acids (alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine, tryptophan, cysteine), hydrophilic amino acids (serine, asparagine, glutamine, threonine), or acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid, tyrosine) is there. Amino acid substitution can be performed using methods known to those skilled in the art, but is preferably performed using site-directed mutagenesis. The amino acid substitution can be performed by substituting the codon of the mutated amino acid with the codon of the amino acid after the mutation.

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の具体例としては、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸、特に、電荷を有しないアミノ酸（中性アミノ酸、例えばグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、特にアラニン）または負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、特にグルタミン酸）に置換されているＤＮＡポリメラーゼ変異体が挙げられる。 Specific examples of the DNA polymerase mutant of the present invention include amino acids other than the amino acid having a positive charge at the 706th arginine in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus, particularly those having a charge. Non-amino acids (neutral amino acids such as glycine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine, tryptophan, cysteine, especially alanine) or negatively charged amino acids (acidic amino acids such as aspartic acid, glutamic acid, tyrosine, especially glutamic acid) DNA polymerase mutants that have been described.

２．ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ
本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡの塩基配列では、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸をコードする塩基配列が別のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。具体的には、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡにおいて、当該野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンをコードする塩基配列が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。 2. DNA encoding a DNA polymerase mutant
The present invention provides DNA encoding the DNA polymerase variant of the present invention. In this DNA base sequence, a base sequence encoding an amino acid identified as corresponding to 706th arginine in the amino acid sequence of wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus was replaced with a base sequence encoding another amino acid by homology analysis. Has been. Specifically, in the DNA encoding Pyrococcus furiosus-derived wild type DNA polymerase, the base sequence encoding arginine at position 706 of the amino acid sequence of the wild type DNA polymerase encodes an amino acid other than the positively charged amino acid. The base sequence is replaced.

塩基配列の置換は、野生型のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡに部位特異的に変異を導入することにより、行うことができる。部位特異的な変異導入は既知のどのような方法を用いてもよく、例えばインビトロジェン社のＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍのような市販のキットを用いて実施することができる。 Substitution of the base sequence can be carried out by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a wild type DNA polymerase. Any known method may be used for site-directed mutagenesis. For example, a commercially available kit such as GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System of Invitrogen Corporation may be used.

３．ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクター
本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼ変異体ＤＮＡをプラスミドＤＮＡやファージＤＮＡなどのベクターＤＮＡに挿入した組換えベクターを提供する。 3. Recombinant Vector Incorporating DNA Encoding DNA Polymerase Mutant The present invention provides a recombinant vector in which the DNA polymerase mutant DNA is inserted into vector DNA such as plasmid DNA or phage DNA.

前記プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ｐＹＥ５２等）などが、ファージＤＮＡとしてはＭ１３ファージ、λファージ等が挙げられる。 Examples of the plasmid DNA include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pHY300PLK, etc.), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24, YCp50, pYE52). Etc.), and examples of phage DNA include M13 phage and λ phage.

前記ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。この時挿入されるＤＮＡ断片はＰＣＲ法等を利用して作製することが可能である。 For the insertion of the DNA of the present invention into the vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then inserted into an appropriate restriction enzyme site or a multicloning site of the vector DNA and ligated to the vector. Is done. The DNA fragment inserted at this time can be prepared using a PCR method or the like.

宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに異なる。また、必要であればエンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー）等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。また、市販の発現ベクターシステム、例えばノバジェン社のｐＥＴベクターシステムやポストゲノム研究所のｐＵＲＥベクターシステムなども利用できる。 In order to express a foreign gene in a host, it is necessary to arrange an appropriate promoter before the structural gene. The promoter is not particularly limited, and any promoter known to function in the host can be used. In addition, about a promoter, it differs for every host in the transformant mentioned later. If necessary, a cis element such as an enhancer (for example, CMV enhancer, SV40 enhancer), a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a terminator sequence and the like may be arranged. Commercially available expression vector systems such as the pET vector system from Novagen and the pURE vector system from Post Genome Laboratories can also be used.

このようなＤＮＡポリメラーゼ変異体を発現しうるプラスミドの例としては、本発明により得られたｐＥＴ１５ｂ−ＰｆｕＰｏｌＲ７０６Ａ、ｐＥＴ１５ｂ−ＰｆｕＰｏｌＲ７０６Ｅが挙げられ、これらとＤＮＡクランプを併用して、耐熱性ならびにＤＮＡ複製における忠実度の優れたＤＮＡポリメラーゼ変異体を製造することができる。 Examples of plasmids capable of expressing such DNA polymerase mutants include pET15b-PfuPolR706A and pET15b-PfuPolR706E obtained by the present invention, and these are used in combination with DNA clamps for heat resistance and faithful DNA replication. It is possible to produce a DNA polymerase mutant having an excellent degree.

４．ＤＮＡポリメラーゼ変異体の合成
次いで、前記ベクターをＤＮＡポリメラーゼが発現しうるように宿主中に導入し、ＤＮＡポリメラーゼ変異体発現系を作製する。ここで宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されず、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など既知の宿主のいずれでも発現ベクターのシステムを適合させることにより利用できる。 4). Synthesis of DNA Polymerase Mutant Next, the vector is introduced into a host so that the DNA polymerase can be expressed, thereby producing a DNA polymerase mutant expression system. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention, and any known host such as Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells can be used by adapting the expression vector system.

例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、その他ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ１９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を挙げることができる。 For example, Escherichia genus such as Escherichia coli, Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas genus such as Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti genus Rhizobium meliloti, etc. Saccharomyces cervisiae, Schizosaccharomyces. Pombe, yeasts such as Pichia pastoris, other animal cells such as COS cells, CHO cells, Sf19, Sf21, etc. Of insect cells.

大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株、Ｂ株等が挙げられ、枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４、２０７−２１等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の上記宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。また、ｔａｃプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。また、アクチンプロモーターも使用できる。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、エレクトロポレーション法などが利用できる。 When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector of the present invention can autonomously replicate in the bacterium, and at the same time, is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. preferable. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Examples of Escherichia coli include Escherichia coli K12 strain and B strain, and examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis MI 114 and 207-21. A promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in said host in such as E. coli, for example, trp promoter, lac promoter, P _L promoter, such as P _R promoter, promoters derived from Escherichia coli or phage and the like . An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used. An actin promoter can also be used. The method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited, and electroporation method and the like can be used.

酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を挙げることができる。酵母へのベクターの導入方法は、特に限定されず、エレクトロポレーション法などが利用できる。 When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris and the like are used. The promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, etc. Can be mentioned. The method for introducing a vector into yeast is not particularly limited, and an electroporation method or the like can be used.

またＴ７プロモーター等を利用して試験管内で蛋白質を合成する無細胞蛋白質合成系も利用できる。無細胞蛋白質合成系としては、例えばＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所）などが使用できる。細胞系での蛋白質合成は、細胞培養が必要であるため、操作が煩雑でバイオハザードの問題があることに加えて、合成蛋白質による培養細胞系の生育阻害の問題もある。これに対して無細胞蛋白質合成系には、（１）生細胞取扱い時に生じる全ての問題（細胞の培養の煩雑さ等）から開放される、（２）細胞にとって有害となる蛋白質も生産できる、（３）操作が比較的簡単で、短時間で目的蛋白質を得ることができるため、ハイスループット化が可能である、（４）簡単に非天然型アミノ酸の導入ができるので目的蛋白質の標識も容易である、という利点がある。 A cell-free protein synthesis system that synthesizes proteins in vitro using the T7 promoter or the like can also be used. As a cell-free protein synthesis system, for example, PURE SYSTEM (Post Genome Research Institute) can be used. Protein synthesis in a cell system requires cell culture, so that the operation is complicated and there is a problem of biohazard. In addition, there is a problem of growth inhibition of the cultured cell system by the synthetic protein. On the other hand, the cell-free protein synthesis system can produce (1) all the problems that occur when handling living cells (complexity of cell culture, etc.), and (2) can produce proteins that are harmful to cells. (3) The operation is relatively simple and the target protein can be obtained in a short time, so that high throughput can be achieved. (4) Non-natural amino acids can be easily introduced, so that the target protein can be easily labeled. There is an advantage that it is.

５．合成ＤＮＡポリメラーゼの精製
合成したＤＮＡポリメラーゼ変異体を精製回収するためには透析、限外ろ過、各種のカラムクロマトグラフィーなど既存の精製システムが利用できる。合成したＤＮＡポリメラーゼ変異体の量が少量（５００ｎｇ程度）の場合、ＤＮＡポリメラーゼ変異体蛋白質にタグ配列を導入し、このタグ配列に対するアフィニティーを利用してＤＮＡポリメラーゼ変異体を回収する方法が望ましい。例えば、無細胞蛋白質合成系であるＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭでＤＮＡポリメラーゼを合成した場合、タグ配列としてＳｔｒｅｐ−ｔａｇ配列やＦｌａｇ−ｔａｇ配列などを導入すればＤＮＡポリメラーゼ変異体を回収することができる。回収されたＤＮＡポリメラーゼ変異体の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡクランプと協働させて（ＤＮＡクランプの存在下で）測定することにより評価することができる。 5. Purification of synthetic DNA polymerase In order to purify and recover the synthesized DNA polymerase mutant, existing purification systems such as dialysis, ultrafiltration, and various column chromatography can be used. When the amount of the synthesized DNA polymerase mutant is small (about 500 ng), it is desirable to introduce a tag sequence into the DNA polymerase mutant protein and recover the DNA polymerase mutant using the affinity for the tag sequence. For example, when DNA polymerase is synthesized by PURE SYSTEM, which is a cell-free protein synthesis system, a DNA polymerase mutant can be recovered by introducing a Strep-tag sequence, a Flag-tag sequence, or the like as a tag sequence. The 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity of the recovered DNA polymerase mutant can be evaluated by measuring in the presence of the DNA clamp (in the presence of the DNA clamp).

６．本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いるＰＣＲ法、ＤＮＡシーケンシング法およびそのためのキット
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法、および本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キットを提供する。上述のごとく、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体、特に耐熱性に優れたものはＰＣＲ法に用いることにより威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにＤＮＡ複製における忠実度が優れた本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと併用すれば、より迅速かつ信頼性に富むＰＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ変異体と併用するＤＮＡクランプは、用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のものであることが好ましい。同生物種由来とは、ＤＮＡポリメラーゼ変異体のもととなったＤＮＡポリメラーゼが由来する生物種と同じ生物種に由来することをさす。 6). PCR method using the DNA polymerase variant of the present invention, DNA sequencing method and kit for the same The present invention, in a further aspect, uses the DNA polymerase variant of the present invention, and the DNA of the present invention. A PCR kit comprising a polymerase mutant is provided. As described above, the DNA polymerase mutant of the present invention, particularly one having excellent heat resistance, exhibits its power when used in the PCR method. That is, if the DNA polymerase mutant of the present invention having excellent heat resistance and fidelity in DNA replication is used in combination with a DNA clamp, a more rapid and reliable PCR method can be performed, and efficient gene amplification, Mutation detection and the like can be performed. The DNA clamp used in combination with the DNA polymerase mutant is preferably derived from the same species as the DNA polymerase mutant to be used. The term “derived from the same species” means derived from the same species as the species from which the DNA polymerase from which the DNA polymerase mutant was derived.

例えば、ＤＮＡポリメラーゼ変異体として、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いる場合、ＤＮＡクランプとしてピロコッカス・フリオサス由来のものを併用するのが好ましい。ピロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡクランプとしては、例えば、配列番号１０または１２のアミノ酸配列からなるＤＮＡクランプが挙げられる。配列番号１０または１２のアミノ酸配列において、１または数個（２個または３個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡクランプとしての活性を有する蛋白質も用いることができる。かかるＰＣＲ法を行うためのキットは、その必須構成成分として本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含み、好ましくはさらに該ＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプを含む。 For example, when using a DNA polymerase mutant having an amino acid sequence in which arginine at position 706 of the amino acid sequence of wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus is substituted with an amino acid other than a positively charged amino acid, as the DNA polymerase mutant It is preferable to use a combination of Pyrococcus furiosus as a DNA clamp. Examples of the DNA clamp derived from Pyrococcus furiosus include a DNA clamp consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. A protein comprising an amino acid sequence in which one or several (2 or 3) amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12, and having activity as a DNA clamp is also used. Can do. A kit for performing such a PCR method contains the DNA polymerase mutant of the present invention as an essential component, and preferably further contains a DNA clamp derived from the same species as the DNA polymerase mutant.

本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法、および本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キットを提供する。ＤＮＡ複製における忠実度が優れた本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと併用すれば、より迅速かつ信頼性に富むＰＣＲ法を行うことができ、結果として迅速かつ信頼性に富むＤＮＡシーケンシングを行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ変異体と併用するＤＮＡクランプは、用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のものであることが好ましい。かかるＤＮＡシーケンシング法を行うためのキットは、その必須構成成分として本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含み、好ましくはさらに該ＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプを含む。 In a further aspect, the present invention provides a DNA sequencing method characterized by using the DNA polymerase variant of the present invention, and a DNA sequencing kit comprising the DNA polymerase variant of the present invention. If the DNA polymerase mutant of the present invention having excellent fidelity in DNA replication is used in combination with a DNA clamp, a more rapid and reliable PCR method can be performed, resulting in a rapid and reliable DNA sequencing. It can be carried out. The DNA clamp used in combination with the DNA polymerase mutant is preferably derived from the same species as the DNA polymerase mutant to be used. A kit for performing such a DNA sequencing method includes the DNA polymerase mutant of the present invention as an essential component, and preferably further includes a DNA clamp derived from the same species as the DNA polymerase mutant.

本発明のＰＣＲ用キットおよびＤＮＡシーケンシング用キットには、通常、キットの取扱説明書が添付され、さらに、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨに保つための緩衝成分などのＤＮＡポリメラーゼの反応に必要な試薬が含まれていてもよい。 The PCR kit and DNA sequencing kit of the present invention are usually accompanied by instruction manuals of the kit, and further include DNA polymerases such as dNTP, magnesium chloride, and buffer components for keeping the reaction solution at an appropriate pH. Reagents necessary for the reaction may be contained.

以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。 EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the examples should not be construed as limiting the scope of the present invention.

（実施例１）７０６位アミノ酸変異導入ＤＮＡポリメラーゼの調製
（１）ピロコッカス・フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ゲノムＤＮＡの調製
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓＤＳＭ３６３８はＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨより入手し、文献（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、第２１巻、２５９−２６５ページ）の方法に従って培養した。５００ｍｌの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これを緩衝液Ｌ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ）１０ｍｌに懸濁し、１０％ＳＤＳを１ｍｌ加えた。撹拌の後、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ加えて、５５℃で６０分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲＮａｓｅＡを加えて３７℃で６０分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。０．７５ｍｇのＤＮＡが得られた。 (Example 1) Preparation of DNA polymerase introduced with 706 amino acid mutation (1) Preparation of P. furiosus genomic DNA Furiosus DSM3638 was obtained from Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH and cultured according to the method of the literature (Nucleic Acids Research, Vol. 21, pages 259-265). About 1.2 g of cells were obtained from 500 ml of the culture solution. This was suspended in 10 ml of Buffer L (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl), and 1 ml of 10% SDS was added. After stirring, 50 ml of proteinase K (20 mg / ml) was added and allowed to stand at 55 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the reaction solution was sequentially extracted with phenol, phenol / chloroform, and chloroform, and then ethanol was added to insolubilize the DNA. The recovered DNA was dissolved in 1 ml of TE solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA), 0.75 mg of RNase A was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the reaction solution was extracted once again with phenol, phenol / chloroform, and chloroform, and then DNA was collected by ethanol precipitation. 0.75 mg of DNA was obtained.

（２）ｐｏｌ遺伝子・ｐｃｎａ遺伝子のクローン化
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡからｐｏｌ遺伝子と予想される領域をＰＣＲで増幅した。ｐｏｌ遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるＡＴＧに合わせてＮｃｏＩ認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にＳｐｈＩ認識配列を導入した。ＰｙｒｏＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を３０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。１ｓｔＰＣＲ産物を鋳型として、同じ条件で２ｎｄＰＣＲを行い、その産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ社）に組み込み、ＤＮＡシークエンサー（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔａｒ社）を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、ＮｃｏＩ−ＳｐｈＩで切断してｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターから切り出したｐｏｌ遺伝子をｐＥＴ１５ｂベクター（ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に挿入し、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを得た。 (2) Cloning of pol gene and pcna gene The region predicted to be the pol gene from the furiosus genomic DNA was amplified by PCR. An NcoI recognition sequence was incorporated into the forward primer in accordance with the predicted ATG of the translation initiation codon of the pol gene. The SphI recognition sequence was introduced into the reverse primer immediately after the stop codon. Using PyroBEST DNA polymerase (Takara Bio Inc.), the gene of interest was amplified under PCR conditions in which heat denaturation was performed at 95 ° C., annealing at 55 ° C., and extension reaction at 72 ° C. for 30 cycles. Using the 1st PCR product as a template, 2nd PCR was performed under the same conditions, the product was incorporated into a pGEM-T easy vector (Promega), and the nucleotide sequence of the inserted fragment region was confirmed using a DNA sequencer (Beckman Coulter). went. Thereafter, the pol gene cleaved with NcoI-SphI and excised from the pGEM-T easy vector was inserted into the pET15b vector (EMD Bioscience) to obtain a plasmid pET15b-pol.

プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｐｃｎａも同様の手順にて取得した。 Plasmid pET21a-pcna was obtained in the same procedure.

このプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを鋳型として７０６位のアルギニンをアラニンに置換した変異体（Ｒ７０６Ａ）を作製するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。変異体（Ｒ７０６Ａ）作製用プライマーセット５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＣＡＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１５）、５’−ＴＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１６）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅し、目的のＲ７０６Ａプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ａ）を得ることができた。 In order to produce a mutant (R706A) in which arginine at position 706 was substituted with alanine using this plasmid pET15b-pol as a template, mutation sites were introduced by the following procedure by site-directed mutagenesis. Heat denaturation using a primer set 5′-GGATACATAGTACTTGCAGGGCGATGGTCCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 15), 5′-TGGACCATCGCCTGCAAGTACTAGTATCC-3 ′ (SEQ ID NO: 16) and PyroBEST DNA polymerase (Takara Bio Inc.) for producing a mutant (R706A) The target gene was amplified under PCR conditions of 95 ° C., annealing 55 ° C., and extension reaction 72 ° C. for 20 cycles to obtain the target R706A plasmid (pET15b-polR706A).

つぎに、７０６位のアルギニンをグルタミン酸に置換させた変異体（Ｒ７０６Ｅ）を作成するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを鋳型として変異体（Ｒ７０６Ｅ）作製用プライマーセット５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１７）、５’−ＴＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１８）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅し、目的のＲ７０６Ｅプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ｅ）を得ることができた。 Next, in order to create a mutant (R706E) in which arginine at position 706 was substituted with glutamic acid, mutation sites were introduced by the site-directed mutagenesis method according to the following procedure. Primer set 5′-GGATACATAGACTACTGAGAGCGATGGTCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 17), 5′-TGGACCATCGTCCTCAAGTACACTATTATCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 18), and PyroBEST DNA Polymerase (Takara Biotechnology), using plasmid pET15b-pol as a template The target gene was amplified under PCR conditions in which 20 cycles of heat denaturation at 95 ° C., annealing at 55 ° C., and extension reaction at 72 ° C. were performed, and the target R706E plasmid (pET15b-polR706E) could be obtained.

（３）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型ポリメラーゼ、および７０６位のアルギニンに変異を導入したポリメラーゼ（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の大量発現系の構築および精製
以下、無処理（野生型）ポリメラーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、７０６位のアルギニンに変異を導入したポリメラーゼ（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）についても、最初に用いるプラスミドがｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６ＡおよびｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ａになるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、精製することができた。 (3) P.I. Construction and purification of a large-scale expression system of furiosus-derived wild-type polymerase and polymerases (R706A, R706E) in which mutations are introduced into 706th arginine Hereinafter, construction and purification of a large-scale expression system for untreated (wild-type) polymerase are described However, with regard to polymerases (R706A, R706E) in which mutations were introduced into 706th arginine, the other procedures were exactly the same except that the first plasmids used were pET15b-polR706A and pET15b-polR706A. Could be purified.

プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌによってコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１コドンプラスＲＩＬをトランスフォーム（形質転換）して、１００μｇ・ｍＬ^−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ^−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。 The plasmid pET15b-pol was transformed (transformed) with BL21 codon plus RIL from the competent cell STRATAGENE, and Luria-Bertani medium in the presence of 100 μg · mL ⁻¹ ampicillin and 20 μg · mL ⁻¹ chloramphenicol was used. The culture was performed at 37 ° C. When the culture turbidity (absorbance at 660 nm) reached 0.6, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 1 mM to induce protein expression. After further culturing for 6 hours, the cells were collected with a centrifuge. The cells were suspended in Tris-HCl buffer (pH 8), subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged. The supernatant was heat-treated at 80 ° C. for 20 minutes and centrifuged. Polyethyleneimine was added to the supernatant to a final concentration of 0.15% (w / v), and nucleic acid components were removed by centrifugation. Ammonium sulfate was added to this solution so as to be 80% saturated, and then centrifuged to collect a precipitate.

沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＳＰ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．１−０．２Ｍでの溶出画分を採取した。つぎにこの画分を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＱ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、同じくＮａＣｌ濃度０．１−０．２Ｍでの溶出画分を採取した。この溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨｉＬｏａｄ２６／６０、ＧＥヘルスケア社）を用いて、流速１ｍｌ／分で分離操作を行い、８０分辺りに溶出されるメインピークを採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度であることを確認することができた。このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を容易に得られることがわかった。 The precipitate was dissolved in Tris-HCl buffer (pH 8) and separated using cation exchange chromatography (HiTrap SP, 5 ml; GE Healthcare), and eluted at a NaCl concentration of 0.1-0.2M. Fractions were collected. Next, this fraction was subjected to a separation operation using anion exchange chromatography (HiTrap Q, 5 ml; GE Healthcare), and an eluted fraction at a NaCl concentration of 0.1 to 0.2 M was collected. This solution was concentrated, and separation operation was performed at a flow rate of 1 ml / min using a gel filtration column (Superdex 200 HiLoad 26/60, GE Healthcare), and a main peak eluted around 80 minutes was collected. When this solution was electrophoresed, it was confirmed that the protein had a purity of 99% or more. Thus, it was found that the DNA polymerase mutant of the present invention can be easily obtained.

天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。実施例１で得られた野生型のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。実施例１で得られた変異体Ｒ７０６Ａをコードする塩基配列を配列番号５に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。実施例１で得られた変異体Ｒ７０６Ｅをコードする塩基配列を配列番号７に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。 The base sequence of the DNA encoding the natural Pyrococcus furiosus DNA polymerase is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence of the DNA encoding the wild type DNA polymerase obtained in Example 1 is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 4. The base sequence encoding mutant R706A obtained in Example 1 is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 6. The base sequence encoding mutant R706E obtained in Example 1 is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 8.

（４）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）の大量発現系の構築および精製
プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｐｃｎａによってコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１コドンプラスＲＩＬを形質転換して、１００μｇ・ｍＬ^−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ^−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１０％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。 (4) P.I. Construction and purification of a large-scale expression system of furiosus-derived wild-type DNA clamp (PCNA) Plasmid pET21a-pcna was transformed into competent cell STRATAGENE BL21 codon plus RIL, and 100 μg · mL ⁻¹ ampicillin and 20 μg · mL ⁻¹ Culturing was performed at 37 ° C. using Luria-Bertani medium in the presence of chloramphenicol. When the culture turbidity (absorbance at 660 nm) reached 0.6, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 1 mM to induce protein expression. After further culturing for 6 hours, the cells were collected with a centrifuge. The cells were suspended in Tris-HCl buffer (pH 8), subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged. The supernatant was heat-treated at 80 ° C. for 20 minutes and centrifuged. Polyethyleneimine was added to the supernatant to a final concentration of 0.10% (w / v), and nucleic acid components were removed by centrifugation. Ammonium sulfate was added to this solution so as to be 80% saturated, and then centrifuged to collect a precipitate.

沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＨｅｐａｒｉｎ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．５〜０．６Ｍでの溶出画分を採取した。つぎにこの画分を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＱ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．４〜０．５Ｍでの溶出画分を採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度であることを確認した。このように、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を得た。 The precipitate is dissolved in Tris-HCl buffer (pH 8) and subjected to separation using affinity chromatography (HiTrap Heparin, 5 ml; GE Healthcare), and the fraction eluted at a NaCl concentration of 0.5 to 0.6M. Were collected. Next, this fraction was subjected to a separation operation using anion exchange chromatography (HiTrap Q, 5 ml; GE Healthcare), and an elution fraction at a NaCl concentration of 0.4 to 0.5 M was collected. When this solution was subjected to electrophoresis, it was confirmed that the purity of the protein was 99% or more. Thus, a DNA clamp (PCNA) was obtained.

天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号９に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。実施例１で得られた野生型のＤＮＡクランプをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。 The base sequence of DNA encoding the natural Pyrococcus furiosus DNA clamp (PCNA) is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of the protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 10. The base sequence of the DNA encoding the wild type DNA clamp obtained in Example 1 is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of the protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 12.

（実施例２）７０６位のアルギニンに変異導入したＤＮＡポリメラーゼ変異体の反応活性の野生型との比較
野生型ＤＮＡポリメラーゼと変異体のプライマー伸長活性をＤＮＡクランプ存在・非存在下で比較した。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、これに２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせたものを基質として用いた。反応溶液は２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２００μＭｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ（５μＣｉｏｆ［α３２Ｐ］ｄＴＴＰ｝］）を含み、７０℃、１分間予め熱しておいて、１０ｎＭＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始した。７０℃、２分間反応を行った後、アガロースゲルを用いて泳動し、オートラジオグラフィーにより泳動パターンの解析を行った。 (Example 2) Comparison of reaction activity of wild- type DNA polymerase and mutant with the wild-type DNA polymerase mutant mutated to 706th arginine The primer extension activities of wild-type DNA polymerase and mutant were compared in the presence or absence of DNA clamp. M13mp18 single-stranded DNA was used as a template, and 20-mer oligo DNA was hybridized thereto as a substrate. The reaction solution was 20 mM TrisHCl (pH 8.8), 100 mM NaCl, 2 mM MgSO ₄ , 10 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 200 μM deoxyribonucleoside triphosphates (5 μCiofTα32P ]) And preheated at 70 ° C. for 1 minute, and 10 nM DNA polymerase was added to start the reaction. After reacting at 70 ° C. for 2 minutes, electrophoresis was performed using an agarose gel, and the electrophoresis pattern was analyzed by autoradiography.

図２に、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長反応の結果（レーン１）と、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび各種変異体（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の伸長反応の結果を示す（レーン２〜４）。ＤＮＡクランプ添加によるプライマー伸長反応の上昇は野生型、各変異体とも大差なく５’→３’ポリメラーゼ活性には変異による影響は大きくないことがわかった。 FIG. 2 shows the results of the primer extension reaction of wild type DNA polymerase in the absence of DNA clamp (PCNA) (lane 1), the wild type DNA polymerase in the presence of DNA clamp (PCNA), and various mutants (R706A, The result of the extension reaction of R706E) is shown (lanes 2 to 4). The increase in the primer extension reaction due to the addition of the DNA clamp was not significantly different between the wild type and the mutants, and it was found that the 5 ′ → 3 ′ polymerase activity was not greatly affected by the mutation.

野生型ＤＮＡポリメラーゼと変異体の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をＤＮＡクランプ存在・非存在下で比較した。基質としてはＨｐａＩ処理を行ったｐＥＴ２１ａを用いた。反応溶液は２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５％ｖ／ｖグリセロール、０．５ｎＭ基質ｐＥＴ２１ａで、これに１．５ｎＭのＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始した。６０℃、１時間反応を行った後、反応停止溶液として、９８％脱イオン化ホルムアミド、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルーを含んだ溶液を添加することにより反応を停止し、反応産物を、アガロースゲルで泳動した。ゲルをＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（インビトロジェン社）染色後、フルオロイメージャー５９５（ＧＥヘルスケア社）を用いて泳動パターンの解析を行った。 The 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity of the wild type DNA polymerase and the mutant was compared in the presence or absence of a DNA clamp. As the substrate, pET21a treated with HpaI was used. The reaction solution was 20 mM TrisHCl (pH 8.8), 100 mM NaCl, 2 mM MgSO ₄ , 10 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 5% v / v glycerol, 0.5 nM substrate pET21a, and 1.5 nM DNA polymerase was added thereto. The reaction was started by addition. After reacting at 60 ° C. for 1 hour, the reaction is stopped by adding a solution containing 98% deionized formamide, 1 mM EDTA, 0.1% xylene cyanol, 0.1% bromophenol blue as a reaction stop solution. The reaction product was run on an agarose gel. After the gel was stained with SYBRgreen (Invitrogen), the electrophoretic pattern was analyzed using a fluoroimager 595 (GE Healthcare).

図３にＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在・非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体（Ｒ７０６Ｅ）の、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を示す。ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下では両者とも同等で非常に弱い活性を示すが（レーン２、４）、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下では、野生型では活性の僅かな増強しか見られないのに対し、変異体（Ｒ７０６Ｅ）では３’→５’エキソヌクレアーゼ活性増強の度合いは変異体の数倍以上と見積もられた。このことからこのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）とＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を協調させてＤＮＡ複製を行うことで通常より３’→５’エキソヌクレアーゼ機能が亢進した状態で、ＤＮＡ複製を継続できるため、従来より信頼性の高いＤＮＡを高速で行うことが可能となる。 FIG. 3 shows changes in 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity of wild-type DNA polymerase and mutant (R706E) in the presence or absence of DNA clamp (PCNA). In the absence of DNA clamp (PCNA), both are equivalent and very weakly active (lanes 2 and 4), but in the presence of DNA clamp (PCNA), only a slight increase in activity is seen in the wild type. In contrast, in the mutant (R706E), the degree of enhancement of 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity was estimated to be several times that of the mutant. From this, DNA replication can be continued in a state in which the 3 ′ → 5 ′ exonuclease function is enhanced by performing DNA replication in cooperation with this DNA polymerase mutant (R706E) and DNA clamp (PCNA), It becomes possible to perform highly reliable DNA at a higher speed than before.

（実施例３）本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の耐熱性
実施例２で使用したＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプは、野生型、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性蛋白質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、８５℃、２０分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体は野生型に遜色のない耐熱性を示した。 (Example 3) Heat resistance of the DNA polymerase mutant of the present invention The DNA polymerase and DNA clamp used in Example 2 intentionally denatured the non-heat resistant protein in the initial stage of purification of both wild type and mutant, In order to simplify the subsequent purification operation, heat treatment was performed at 85 ° C. for 20 minutes. In such heat treatment, the mutant exhibited heat resistance comparable to the wild type.

本発明により、ＤＮＡ複製において高信頼性で、高速に複製反応を行うことができる系が得られるので、本発明は、生化学の研究分野、研究用試薬分野、診断用試薬分野、製薬分野などにおいて利用可能である。 According to the present invention, a system capable of performing a replication reaction with high reliability and high speed in DNA replication can be obtained. Therefore, the present invention can be applied to biochemical research fields, research reagent fields, diagnostic reagent fields, pharmaceutical fields, etc. Is available in

ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ複合体の結晶構造解析を行った結果、その相互作用部位と、それにより安定化される両分子の相対配置、可動範囲を決定した。その結果、ＤＮＡクランプ・ＤＮＡポリメラーゼ間に主に二箇所の相互作用部位が存在することを見出した。図１は両相互作用を維持した状態は５’→３’ポリメラーゼ機能を発現しやすい相対配置を呈するのに対し（図上段）、うち一方の相互作用（２ｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｓｉｔｅ）を不活化することで、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が発現しやすい相対配置を惹き起こす。これは、２ｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｓｉｔｅを不活化したＤＮＡ複製系においては忠実度が上昇することを示唆する（図下段）。As a result of analyzing the crystal structure of the DNA clamp / DNA polymerase complex, the interaction site, the relative arrangement of both molecules stabilized by the interaction site, and the movable range were determined. As a result, it was found that there are mainly two interaction sites between the DNA clamp and the DNA polymerase. In FIG. 1, the state in which both interactions are maintained exhibits a relative arrangement in which the 5 ′ → 3 ′ polymerase function is easily expressed (upper part of the figure), while one of the interactions (2nd interacting site) is inactivated. It causes a relative arrangement in which 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity is easily expressed. This suggests that fidelity is increased in the DNA replication system in which the 2nd interacting site is inactivated (bottom of the figure). ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長反応の結果（レーン１）と、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび各種変異体（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の伸長反応の結果を示す（レーン２〜４）。ＤＮＡクランプがない場合（レーン１）に比べてプライマー伸長はＤＮＡクランプの添加により大幅に促進される。うち、野生型における促進効果が一番高く（レーン２）、変異体ではＲ７０６Ａ（レーン３）、Ｒ７０６Ｅ（レーン４）の順に少しずつ効果が低くなるが、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）による促進の程度に比べて殆ど無視できる程度の減少である。Results of primer extension reaction of wild type DNA polymerase in the absence of DNA clamp (PCNA) (lane 1), and extension of wild type DNA polymerase and various mutants (R706A, R706E) in the presence of DNA clamp (PCNA) The results of the reaction are shown (lanes 2-4). Compared to the absence of DNA clamp (lane 1), primer extension is greatly facilitated by the addition of DNA clamp. Among them, the promotion effect in the wild type is the highest (lane 2), and in the mutant, the effect decreases gradually in the order of R706A (lane 3) and R706E (lane 4), but to the extent of promotion by DNA clamp (PCNA) Compared to this, the decrease is almost negligible. ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在・非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体（Ｒ７０６Ｅ）の、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を示す。レーン１はポリメラーゼを入れないｎｕｌｌレーンで未反応基質ＤＮＡの長さを表す。図中下方が、よりエキソヌクレアーゼ活性が高いことを示す。ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を入れない場合、野生型（レーン２）、Ｒ７０６Ｅ（レーン４）共に、同程度の低いエキソヌクレアーゼ活性しか示さない一方で、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を添加すると、共に活性は増大し（レーン３、５）、特に変異体Ｒ７０６Ｅでは野生型の二倍程度のエキソヌクレアーゼ活性を呈する（レーン５）。これはＲ７０６Ｅで有意にエキソヌクレアーゼ活性がより増大し、この系でより忠実度の高い複製を行うことが可能であることを示している。The change of 3 '-> 5' exonuclease activity of wild type DNA polymerase and mutant (R706E) in the presence / absence of DNA clamp (PCNA) is shown. Lane 1 is a null lane that does not contain polymerase and represents the length of unreacted substrate DNA. The lower part of the figure indicates that the exonuclease activity is higher. Without DNA clamp (PCNA), both wild type (lane 2) and R706E (lane 4) show similar low exonuclease activity, while addition of DNA clamp (PCNA) increases both activities. In particular, the mutant R706E exhibits about twice the exonuclease activity of the wild type (lane 5). This indicates that R706E significantly increases exonuclease activity, allowing more fidelity replication in this system.

配列表フリーテキスト
配列番号１は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号２は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号４は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードする塩基配列である。
配列番号６は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号７は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードする塩基配列である。
配列番号８は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号９は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードする塩基配列である。
配列番号１０は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号１１は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードする塩基配列である。
配列番号１２は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号１３はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１４はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１５はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１６はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。 Sequence Listing Free Text SEQ ID NO: 1 is a base sequence encoding a wild-type Pyrococcus furiosus DNA polymerase.
SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the wild-type Pyrococcus furiosus DNA polymerase.
SEQ ID NO: 3 is the nucleotide sequence encoding the wild-type Pyrococcus furiosus DNA polymerase obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the wild-type Pyrococcus furiosus DNA polymerase obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 5 is the nucleotide sequence encoding the Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706A) obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of the Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706A) obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 7 is the nucleotide sequence encoding the Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706E) obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of the Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706E) obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 9 is a nucleotide sequence encoding a wild type Pyrococcus furiosus DNA clamp (PCNA).
SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of the wild type Pyrococcus furiosus DNA clamp (PCNA).
SEQ ID NO: 11 is the base sequence encoding the wild type Pyrococcus furiosus DNA clamp (PCNA) obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of the DNA clamp (PCNA) of wild-type Pyrococcus furiosus obtained in Example 1.
SEQ ID NO: 13 is a primer for amplifying DNA encoding a Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706A).
SEQ ID NO: 14 is a primer for amplifying DNA encoding Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706A).
SEQ ID NO: 15 is a primer for amplifying DNA encoding a Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706E).
SEQ ID NO: 16 is a primer for amplifying DNA encoding a Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutant (R706E).

Claims

ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。 Arginine at position 706 of the amino acid sequence of wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus, which is a DNA polymerase mutant having enhanced 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity when cooperating with DNA clamp A DNA polymerase variant, wherein an amino acid identified as corresponding to is substituted with an amino acid other than a positively charged amino acid.

７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。 The DNA polymerase variant according to claim 1, wherein the amino acid specified to correspond to arginine at position 706 is substituted with a neutral amino acid, a hydrophilic amino acid, or an acidic amino acid.

中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。 Neutral amino acids are selected from alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine, tryptophan and cysteine, hydrophilic amino acids are selected from serine, asparagine, glutamine and threonine, and acidic amino acids from tyrosine, aspartic acid and glutamic acid The DNA polymerase variant according to claim 2, which is selected.

７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。 The DNA polymerase variant according to claim 1, wherein the amino acid specified to correspond to arginine at position 706 is substituted with alanine or glutamic acid.

７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。 The DNA polymerase variant according to claim 1, wherein the amino acid specified to correspond to arginine at position 706 is substituted with aspartic acid.

ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。 The DNA polymerase variant according to any one of claims 1 to 5, wherein arginine at position 706 of the amino acid sequence of a wild-type DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus is substituted with an amino acid other than a positively charged amino acid.

好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。 The DNA polymerase variant according to any one of claims 1 to 5, which is a DNA polymerase variant of a wild-type DNA polymerase derived from a thermophilic bacterium, a hyperthermophilic bacterium, a thermophilic archaebacterium, or a hyperthermophilic archaebacterium. .

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。 DNA encoding the DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7.

請求項８記載のＤＮＡを組み込んだ組換えベクター。 A recombinant vector incorporating the DNA according to claim 8.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法。 A PCR method using the DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キット。 A kit for PCR comprising the DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。 A DNA sequencing method using the DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キット。 A DNA sequencing kit comprising the DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＰＣＲ法。 A PCR method comprising using the DNA polymerase variant according to any one of claims 1 to 7 and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＰＣＲ用キット。 A PCR kit comprising the DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7 and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。 A DNA sequencing method using the DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7 and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＤＮＡシーケンシング用キット。 A DNA sequencing kit comprising a DNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7 and a DNA clamp (PCNA) derived from the same species.