JP5256214B2 - Method for converting lactose containing whey or lactose into arabitol - Google Patents
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Description
本願発明は、ホエイの有効利用の技術分野に属する。また、本願発明は、糖アルコールの製造の技術分野にも属する。より具体的には、ホエイを用いて糖アルコールを製造する方法の技術分野に属する。 The present invention belongs to the technical field of effective use of whey. The present invention also belongs to the technical field of sugar alcohol production. More specifically, it belongs to the technical field of a method for producing a sugar alcohol using whey.
近年のチーズの生産量の拡大に伴い、チーズホエイが余剰となってきている。ホエイは、乳糖、可溶性タンパク質、脂質、塩類などから構成されており、限外濾過(UF)膜分離によって獲得されるホエイタンパク質濃縮物(WPC)や、ホエイUF透過液から分離される乳糖は、商業規模で製品として活用されている。しかし、脱乳糖ホエイUF透過液では、固形分の70%程度を乳糖が占めるが、その乳糖を依然として未利用の状態としており、その有効な利用法を創出することが課題となっている。 With the expansion of cheese production in recent years, cheese whey has become surplus. Whey is composed of lactose, soluble proteins, lipids, salts, etc. Whey protein concentrate (WPC) obtained by ultrafiltration (UF) membrane separation and lactose separated from whey UF permeate, It is used as a product on a commercial scale. However, in lactated whey UF permeate, lactose accounts for about 70% of the solid content, but the lactose is still unused, and there is a problem of creating an effective usage method.
ホエイUF透過液に発酵原料のデキストロースを加えてから、ワイン酵母を作用させ、遠心分離、濾過、脱塩によって、ワイン(アルコールの濃度:9.5%)を製造する方法が考案されている(Palmer, 1979、非特許文献1)。また、乳糖を100g/Lで含むホエイ調製液に、Lactobacillus sp. RKY2を作用させ、乳酸を91g/Lで生成させる方法が考案されている(Kim et al., 2005、非特許文献2)。さらに、天然高分子原料としてのチーズホエイの用途開発を提案する研究も見られる(Fialho et al., 1999、非特許文献3)。 A method of producing wine (alcohol concentration: 9.5%) by adding dextrose, a fermentation raw material, to whey UF permeate and then allowing wine yeast to act, centrifugation, filtration, and desalination has been devised (Palmer, 1979, Non-Patent Document 1). Further, a method has been devised in which Lactobacillus sp. RKY2 is allowed to act on a whey preparation solution containing lactose at 100 g / L to produce lactic acid at 91 g / L (Kim et al., 2005, Non-Patent Document 2). Furthermore, there are also studies that propose the development of uses for cheese whey as a natural polymer raw material (Fialho et al., 1999, Non-Patent Document 3).
ホエイUF透過液や脱乳糖ホエイUF透過液に含まれる乳糖は、新たな資源として注目され始めているが、商業規模や工業化の視点では、まだ十分に検討されていない。 Lactose contained in whey UF permeate and delactose whey UF permeate has begun to attract attention as a new resource, but has not yet been fully examined from the viewpoint of commercial scale and industrialization.
他方、糖アルコールでは、例えば、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、ソルビトールは甘味料として利用されており、アラビトールは医薬品製造用原料、食品添加剤として注目されており、ラクチトールは食品増量剤、食品添加剤、タンパク質の熱安定性保護添加剤として利用されている。 On the other hand, in sugar alcohols, for example, xylitol, erythritol, lactitol, sorbitol are used as sweeteners, arabitol is attracting attention as a raw material for pharmaceutical production, food additive, lactitol is a food extender, food additive, It is used as a heat-stable protective additive for proteins.
現在まで、ホエイを用いて多糖アルコールを工業的(商業的)に製造する方法は十分に研究されておらず、乳糖からキシリトールを製造する公知の経路は開拓されていない。但し、乳糖に対して、b-ガラクトシダーゼを作用させ、グルコース、ガラクトースを獲得する技術は既に確立されており、また、グルコースを出発原料としてキシリトールを製造する公知の経路(Ohnishi et al., 1969、非特許文献4;Mayer et al., 2002、非特許文献5;Suzuki et al., 2002、非特許文献6;Sonoko et al., 2000、非特許文献7)、組換えDNA技術(Harkki et al., 1997、非特許文献8;Povelainea et al.,2006、非特許文献9)もある。即ち、Ohnishiらは、Debaryomyces hanseniiによりグルコースをアラビトールに変換、次いでAcetobacter suboxydansによりアラビトールをキシルロースに変換、更にCandida guilliermondiiによりキシルロースをキシリトールに変換している。Mayerらは、同様な手法を用いて、グルコースをキシルロースとした後に、キシリトールデヒドロゲナーゼを作用させ、キシリトールを獲得している。Povelaineaらは、Bacillus subtilisを組換え、収率20%でグルコースをキシリトールに変換している。これら文献以外にも、当該経路上の中間物質であるアラビトールの生産に関して、公知の生物変換、触媒変換技術がある。例えば、酵母Saccharomyces rouxiiを標識グルコースに作用させた実験より、アラビトールは、リブロース-5-リン酸を代謝中間物質とし、これを脱リン酸化して生じるリブロースから誘導されることが公知となっている(Ingram et al., 1965、非特許文献10)。また、酵母Candida famata R28がグルコース(10%)からアラビトール(5%)を生成することが報告されている(Ahmed et al., 1999、非特許文献11)。ルテニウム触媒をアラビノン酸、ラクトンに作用させ、アラビトールを獲得した例もある(Fabre et al., 2002、非特許文献12)。食品用のキシリトールの生産を意識し、組換え菌の使用を前提とした研究例を除外すると、これらの組合せより、乳糖からキシリトールを獲得する経路は、図1のように要約できる。いずれも、ガラクトース又はグルコースを経由することを必須とするものである。
従来技術では、ホエイに含まれる乳糖をキシリトールへ変換しようとすると、「乳糖→グルコース(+ガラクトース)→アラビトール→キシルロース→キシリトール」という変換経路しか存在しなかった。つまり、β-ガラクトシダーゼを用いて、乳糖をグルコースとガラクトースへ変換する工程が必須であり、このグルコースをアラビトールへ変換していた。このとき、未反応のグルコースや不要なガラクトースが不純物として反応液中に存在し、それらを分離する操作が必要であった。 In the prior art, when converting lactose contained in whey to xylitol, there was only a conversion pathway of “lactose → glucose (+ galactose) → arabitol → xylulose → xylitol”. That is, a step of converting lactose into glucose and galactose using β-galactosidase is essential, and this glucose was converted into arabitol. At this time, unreacted glucose and unnecessary galactose existed in the reaction solution as impurities, and an operation for separating them was necessary.
また、アラビトールは医薬品製造用原料、食品添加剤として注目されていながら、効率的な製造方法が確立していなかった。 Moreover, although arabitol has been attracting attention as a raw material for pharmaceutical production and a food additive, an efficient production method has not been established.
そこで、本発明は、乳糖をアラビトールへ直に変換することで、反応液中へのグルコースやガラクトースの発生を防止し、不純物を分離する操作が不要となる方法の開発を課題とする。 Therefore, an object of the present invention is to develop a method in which lactose is directly converted into arabitol, thereby preventing generation of glucose and galactose in the reaction solution and eliminating an operation for separating impurities.
また、本発明は、乳糖の消費活性を有する好浸透圧性の酵母であるKluyveromyces属に注目し、高濃度の乳糖をエタノールと糖アルコール(糖のカルボニル基が還元された多価アルコール)に変換する方法の開発も課題とする。 The present invention also focuses on the genus Kluyveromyces, which is a osmotic yeast having lactose consumption activity, and converts high-concentration lactose into ethanol and sugar alcohol (polyhydric alcohol in which the carbonyl group of sugar is reduced). Method development is also an issue.
本発明者らは「乳糖→アラビトール→キシルロース→キシリトール」という変換経路のうち、特に「乳糖→アラビトール」という変換を可能にする酵母を見出して、本願発明を完成させた。 The present inventors have found a yeast that enables the conversion of “lactose → arabitol” among the conversion pathways of “lactose → arabitol → xylulose → xylitol” and completed the present invention.
本発明では、乳糖をアラビトールへ直に変換でき、グルコースやガラクトースが菌体外(反応液中)に存在しないため、不純物を分離する操作が不要となる。 In the present invention, lactose can be directly converted into arabitol, and glucose and galactose are not present outside the cells (in the reaction solution), so that an operation for separating impurities is unnecessary.
これにより、安価で大量に得られる乳糖から医薬品製造用原料、食品添加剤となるアラビトールを大量に提供でき、更に、アラビトールを経てキシリトールへ変換することで、ホエイの有効利用が可能となる。 This makes it possible to provide a large amount of arabitol, which is a raw material for pharmaceutical production and a food additive, from lactose obtained in a large amount at a low price, and further, by converting it into xylitol via arabitol, whey can be effectively used.
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-001592号、2008-157574号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。 This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Applications Nos. 2008-001592 and 2008-157574, which are the basis of the priority of the present application.
1.乳糖から糖アルコールへの変換
本発明者らは、ホエイに多量に含まれる乳糖の有効利用として、種々の用途のある糖アルコールへの変換を検討した。糖アルコールには、例えば、糖尿病の予防や治療に用いられる、ソルビトール、マルチトール、歯牙のう蝕防止に用いられる、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、ダイエットに用いられる、エリスリトールなどが含まれる。図2には、乳糖からエタノールや糖アルコールへの代謝経路の可能性を示す。乳糖から生成する6炭糖は、グルコース、及びガラクトースであるが、ガラクトースがグルコースに異性化されると、グルコースはEmbden-Myerhof-Parnas(EMP)pathwayを経由し、条件が整えば、エタノール、グリセロール、エリスリトールに変換され得る。また、グルコースはPentose phosphate pathway(PPP)を経由し、5炭糖に変換され、条件が整えば、アラビトール、キシリトールなどの5炭糖の糖アルコールに変換され得る。グルコースから糖アルコールへの変換では、乳糖から糖アルコールへの変換では、グリセロールの事例が報告されているが、他の糖アルコールの事例は余り見受けられない。そこで、本発明者らは、乳糖を糖アルコールに変換できる微生物を探索することとした。1. Conversion of Lactose to Sugar Alcohol The present inventors examined conversion to sugar alcohols having various uses as effective utilization of lactose contained in a large amount in whey. Sugar alcohols include, for example, sorbitol, maltitol, erythritol, xylitol, lactitol, erythritol, which are used for prevention of dental caries, and used for diet. FIG. 2 shows the possibility of metabolic pathways from lactose to ethanol and sugar alcohol. The 6 carbon sugars produced from lactose are glucose and galactose, but when galactose is isomerized to glucose, the glucose passes through the Embden-Myerhof-Parnas (EMP) pathway, and if conditions are met, ethanol, glycerol Can be converted to erythritol. In addition, glucose is converted into pentose via the Pentose phosphate pathway (PPP), and can be converted into pentose sugar alcohols such as arabitol and xylitol if conditions are met. In the conversion of glucose to sugar alcohol, the case of glycerol has been reported in the conversion of lactose to sugar alcohol, but there are not many cases of other sugar alcohols. Therefore, the present inventors have decided to search for microorganisms that can convert lactose into sugar alcohol.
2.好浸透圧性の微生物から乳糖を糖アルコールに変換する能力を有する微生物の探索
好浸透圧性の微生物は一般に糖アルコールを生成する傾向があると言われており、Kluyveromyces属の活用は、乳糖から有価物質を導出する可能性があると考える。そこで、本発明者らは、Kluyveromyces属の菌体を高濃度の乳糖に作用させ、エタノールや糖アルコールへの変換の可能性を評価し、有価物質の導出のために、培養の操作変数を検討した。その結果、糖アルコールの特にアラビトールへの変換に優れた菌株として、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及びKluyveromyces lactis NBRC 1903を見出した。2. Search for microorganisms capable of converting lactose to sugar alcohol from osmophilic microorganisms It is said that osmotic microorganisms generally have a tendency to produce sugar alcohols, and the utilization of the genus Kluyveromyces is a valuable substance from lactose We think that there is a possibility of deriving. Therefore, the present inventors made the cells of the genus Kluyveromyces act on lactose at a high concentration, evaluated the possibility of conversion to ethanol and sugar alcohol, and examined the culture operating variables to derive valuable substances. did. As a result, Kluyveromyces lactis NBRC 0433 and Kluyveromyces lactis NBRC 1903 were found as strains excellent in the conversion of sugar alcohols into arabitol.
3.ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖からアラビトールへの変換
ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物の成分を含む水溶液又は乳糖を含む高浸透圧培地(例えば、乳糖が4重量%以上、好適には、乳糖の濃度が100g/L以上で190g/L以下の浸透圧を示す流体)を、例えば、20〜39℃、好適には、30〜37℃、より好適には、35〜37℃で、24h以上、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及び/又はKluyveromyces lactis NBRC 1903で処理すること、具体的には、好気的に培養することで、乳糖をアラビトールに変換することができる。3. Whey, whey UF permeate, delactose whey UF permeate, whey hydrolyzate-containing lactose content or conversion from lactose to arabitol Whey, whey UF permeate, delactose whey UF permeate, whey hydrolyzate components An aqueous solution containing lactose or a hyperosmotic medium containing lactose (for example, a fluid exhibiting an osmotic pressure of lactose concentration of 4% by weight or more, preferably lactose of 100 g / L or more and 190 g / L or less), for example, 20 Treatment with Kluyveromyces lactis NBRC 0433 and / or Kluyveromyces lactis NBRC 1903 at ˜39 ° C., preferably 30-37 ° C., more preferably 35-37 ° C. for 24 h or longer, specifically aerobic Lactose can be converted to arabitol by culturing in an intensive manner.
具体的には、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及び/又はKluyveromyces lactis NBRC 1903の培養条件として、乳糖の初期濃度(含量)が100g/L以上の水溶液となるように調製した、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖を含む高浸透圧水溶液に、窒素源を加えた培地を調製し、20〜39℃、好適には、30〜37℃、より好適には、35〜37℃で、好気的条件を設定し、24h以上で当該菌を培養することが望ましい。ここで、乳糖含有物としては、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などのいずれか1種又は2種以上の混合物、これらの濃縮液、希釈液、粉末の水溶液のいずれか1種又は2種以上の混合物、あるいは、これら原液、濃縮液、希釈液、粉末のいずれか2種以上の混合物であってもよい。なお、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物では、通常、固形分濃度は、それぞれ6〜6.5、5〜5.5、5〜5.5、6〜6.5重量%であり、いずれも、乳糖濃度は、4〜5重量%である。窒素源としては、アンモニア又は硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、その他無機・有機含窒素化合物、又は酵母抽出物(酵母エキス)、ホエイ、ホエイ加水分解物、カゼイン加水分解物などを用いることができる。塩類としては、塩化ナトリウム塩及び/又は塩化カリウム塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いることができる。 Specifically, as a culture condition of Kluyveromyces lactis NBRC 0433 and / or Kluyveromyces lactis NBRC 1903, whey, whey UF permeate, dehydration prepared so that the initial concentration (content) of lactose is an aqueous solution of 100 g / L or more. Prepare a medium containing a lactose whey UF permeate, whey hydrolyzate or other lactose-containing material or a high osmotic pressure solution containing lactose and a nitrogen source, 20-39 ° C, preferably 30-37 ° C, more Preferably, aerobic conditions are set at 35 to 37 ° C., and the bacterium is cultured for 24 hours or longer. Here, as the lactose-containing material, one or a mixture of two or more of whey, whey UF permeate, delactose whey UF permeate, whey hydrolyzate, concentrated solution, diluted solution, powder Any one or a mixture of two or more of aqueous solutions, or a mixture of any two or more of these stock solutions, concentrated solutions, diluents, and powders may be used. In addition, in whey, whey UF permeate, delactose whey UF permeate, and whey hydrolyzate, the solid content concentration is usually 6 to 6.5, 5 to 5.5, 5 to 5.5, and 6 to 6.5% by weight, respectively. In any case, the lactose concentration is 4 to 5% by weight. Nitrogen sources include ammonia or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other inorganic and organic nitrogen-containing compounds, or yeast extract (yeast extract), whey, whey hydrolysate, and casein hydrolysis. Things can be used. As the salts, sodium chloride salt and / or potassium chloride salt, magnesium chloride, calcium chloride and the like can be used.
この時、アラビトールの生産を促すためには浸透圧を高めることが肝要であり、乳糖の初期濃度は、水溶液中の乳糖(あるいは乳糖一水和物)の溶解度の限界に相当する190g/L〜200g/L程度にすることが望ましい。また、浸透圧を高めるには、塩化ナトリウム塩及び/又は塩化カリウム塩を0〜30g/L、或いは0.3〜1.0 Mol/Lで含むように調製することが望ましい。好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウムが重量比で3:7に含む複合塩を、その濃度が15g/L以上、好適には、0.3〜1.0mol/L、より好適には、0.5〜1.0mol/Lとなるように調製する。 At this time, in order to promote the production of arabitol, it is important to increase the osmotic pressure, and the initial concentration of lactose is 190 g / L, which corresponds to the limit of solubility of lactose (or lactose monohydrate) in aqueous solution. It is desirable to make it about 200g / L. Moreover, in order to raise osmotic pressure, it is desirable to prepare so that a sodium chloride salt and / or a potassium chloride salt may be included at 0-30 g / L, or 0.3-1.0 Mol / L. Preferably, the composite salt containing sodium chloride and potassium chloride at a weight ratio of 3: 7 has a concentration of 15 g / L or more, preferably 0.3 to 1.0 mol / L, more preferably 0.5 to 1.0 mol / L. Prepare to be L.
更に、温度は、重要条件で、増殖上限温度に近い温度に保つことが望ましく、例えば、35〜37℃、より好適には、37℃とすることが出来る。 Furthermore, it is desirable that the temperature be kept at a temperature close to the upper limit temperature for growth under important conditions.
また、D-アラビトールの生産を高めるためには、好気条件が低下しないようにすることが望ましい。例えば、培養溶液に空気を通気して処理する、培養溶液を穏やかに振盪させて処理する、又は前記溶液中の前記微生物の菌体濃度を高めた後に穏やかに振盪させて処理することができる。具体的には、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物の成分を含む水溶液又は乳糖を含む高浸透圧培地(例えば、乳糖が4重量%以上、好適には、乳糖の濃度が100g/L以上で190g/L以下の浸透圧を示す流体)で、例えば、好適には、35〜37℃で、一定時間、例えば、24h、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及び/又はKluyveromyces lactis NBRC 1903を好気的に培養してから、遠心分離処理や膜分離処理などを適用して菌体濃度を上げた後に穏やかに振盪させて処理することができる。 In order to increase the production of D-arabitol, it is desirable not to lower the aerobic conditions. For example, the culture solution can be treated by aeration of air, the culture solution can be treated by gently shaking, or the microorganism can be treated by gently shaking after increasing the concentration of the microorganism in the solution. Specifically, whey, whey UF permeate, delactose whey UF permeate, aqueous solution containing components of whey hydrolyzate or hyperosmotic medium containing lactose (for example, lactose is 4% by weight or more, preferably Fluid having a lactose concentration of 100 g / L or more and 190 g / L or less), for example, preferably at 35 to 37 ° C. for a certain period of time, for example, 24 h, Kluyveromyces lactis NBRC 0433 and / or Kluyveromyces lactis After culturing NBRC 1903 aerobically and increasing the bacterial cell concentration by applying a centrifugal separation treatment or a membrane separation treatment, it can be treated by gently shaking.
酵母抽出液の濃度は、振盪フラスコレベルの好気的条件(中位の好気的条件、微好気的条件ともいう)では40g/L程度、気泡塔反応器レベルの好気的条件(高位の好気的条件)では5〜10g/L程度にすることが望ましい。酵母抽出液に代えて、グルタミン酸を添加して用いることもでき、グルタミン酸は、例えば、2〜10g/L、好適には、およそ5g/Lを添加することができる。 本発明によれば、副産物としてのグルコースやガラクトースを菌体外(反応液中)へ産生させずに、乳糖からアラビトールを産生することができる。 The concentration of the yeast extract is about 40 g / L under the aerobic condition at the shake flask level (also called the medium aerobic condition or the microaerobic condition), and the aerobic condition at the bubble column reactor level (high level). (Aerobic condition) is preferably about 5 to 10 g / L. Instead of the yeast extract, glutamic acid can be added and used. For example, 2 to 10 g / L, preferably about 5 g / L of glutamic acid can be added. According to the present invention, arabitol can be produced from lactose without producing glucose or galactose as by-products outside the cells (in the reaction solution).
4.ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖からキシリトールの生産
前記の「3.ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖からアラビトールへの変換」により生産された、アラビトールを、更にキシルロースに変換し、引き続き、キシリロースをキシリトールに変換することができる。4). Production of xylitol from whey, whey UF permeate, delactose whey UF permeate, whey hydrolyzate and other lactose-containing substances or lactose “3. Whey, whey UF permeate, delactose whey UF permeate, whey hydrolysate The arabitol produced by the lactose-containing product such as a degradation product or the conversion of lactose to arabitol can be further converted to xylulose and subsequently xylylose can be converted to xylitol.
4−1.アラビトールからキシルロースへの変換
アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物を用いて、アラビトールを処理することで、キシルロースに変換することができる。4-1. Conversion from arabitol to xylulose By treating arabitol with a microorganism having an ability to convert arabitol to xylulose, it can be converted to xylulose.
アラビトールをキシルロースへ変換できる菌株では、種々の微生物が既に知られており、Acetobacter属に属する微生物、Gluconobacter属に属する微生物、Klebsiella属に属する微生物などが挙げられる。 As a strain capable of converting arabitol into xylulose, various microorganisms are already known, and examples include microorganisms belonging to the genus Acetobacter, microorganisms belonging to the genus Gluconobacter, microorganisms belonging to the genus Klebsiella, and the like.
該処理には、アラビトールを含む培地で、前記の微生物を培養する方法(手段)を採用することもできるが、前記の微生物を担体に固定した固定化菌体を用いることもできる。例えば、アラビトールを含む培地で、Gluconobacter oxydans NBRC 3172を培養することで、アラビトールをキシルロースに変換することができる。具体的に、前培養では、バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、Gluconobacterの前培養用の培地(マンニトール:50g/L、ペプトン:10g/L、酵母抽出物:10g/L)の50mLを入れてから、Gluconobacter oxydans NBRC 3172を植菌し、30℃、200rpm、48hで振盪式の培養を行った後に、遠心分離で上清を除去して集菌し、蒸留水で洗浄して調製することで、本培養に供する方法(手段)を採用することができる。本培養では、アラビトールを30g/Lで含む水溶液に、当該菌をOD600(600nmの吸光度)が20になるように植菌し、30℃で培養を行って反応を進める。これにより、アラビトールをキシルロースへ変換することができる。この変換効率は100%近くになる。なお、Ohmomoらは、Gluconobacter suboxydans Kawai株をκ-カラギーナンに固定化した生体触媒を用い、アラビトールからキシルロースへの変換を実施している(Ohmomo,S., Y.Tozawa and K.Ueda : “Biotransformation of D-Arabitol to D-Xylulose by Gluconobacter suboxydans Immobilized within k-Carrageenan,” J. Ferment. Technol., 61, 373-378 (1983))。 For the treatment, a method (means) for culturing the above-mentioned microorganism in a medium containing arabitol can be adopted, but an immobilized microbial cell in which the above-mentioned microorganism is immobilized on a carrier can also be used. For example, arabitol can be converted to xylulose by culturing Gluconobacter oxydans NBRC 3172 in a medium containing arabitol. Specifically, for pre-culture, 50 mL of Gluconobacter pre-culture medium (mannitol: 50 g / L, peptone: 10 g / L, yeast extract: 10 g / L) is placed in an Erlenmeyer flask with baffle (500 mL). After inoculating Gluconobacter oxydans NBRC 3172, incubating at 30 ° C, 200rpm, 48h, and removing the supernatant by centrifugation, collecting the cells, and washing with distilled water Thus, the method (means) used for the main culture can be employed. In the main culture, the bacterium is inoculated into an aqueous solution containing arabitol at 30 g / L so that the OD600 (absorbance at 600 nm) is 20, and the reaction is carried out by culturing at 30 ° C. Thereby, arabitol can be converted into xylulose. This conversion efficiency is close to 100%. Ohmomo et al. Performed conversion of arabitol to xylulose using a biocatalyst in which the Gluconobacter suboxydans Kawai strain was immobilized on κ-carrageenan (Ohmomo, S., Y. Tozawa and K. Ueda: “Biotransformation of D-Arabitol to D-Xylulose by Gluconobacter suboxydans Immobilized within k-Carrageenan, ”J. Ferment. Technol., 61, 373-378 (1983)).
4−2.キシルロースからキシリトールへの変換
キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物を用いて、キシルロースを処理することで、キシリトールに変換することができる。4-2. Conversion of xylulose to xylitol It can be converted to xylitol by treating xylulose with a microorganism having the ability to convert xylulose to xylitol.
キシルロースをキシリトールへ変換できる菌株では、公知の微生物として、Kluyveromyces属に属する微生物、Candida属に属する微生物、Zygosaccharomyces属に属する微生物、Debaryomyces属に属する微生物、Pichia属に属する微生物などが挙げられる。具体的には、Kluyveromyces lactis NBRC 1903、Candida shehatae IAM 12953、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548、Zygosaccharomyces rouxii IAM 12879、Candida melibiosica NBRC 10238、Debaryomyces hansenii IAM 12837、Candida mogii NBRC 0436、Pichia farinose IAM 12223、Pichia stipitis IAM 12952などが含まれる。 Examples of known microorganisms that can convert xylulose to xylitol include microorganisms belonging to the genus Kluyveromyces, microorganisms belonging to the genus Candida, microorganisms belonging to the genus Zygosaccharomyces, microorganisms belonging to the genus Debaryomyces, microorganisms belonging to the genus Pichia, and the like. Specifically, Kluyveromyces lactis NBRC 1903, Candida shehatae IAM 12953, Kluyveromyces marxianus ATCC 26548, Zygosaccharomyces rouxii IAM 12879, Candida melibiosica NBRC 10238, Debaryomyces hansenii IAM 12837, Candida moP 223 Is included.
該処理には、キシルロースを含む培地で、前記の微生物を培養する方法(手段)を採用することもできるが、前記の微生物を担体に固定した固定化菌体を用いることもできる。例えば、キシルロースを含む培地で、Kluyveromyces lactis NBRC 1903及び/又はCandida shehatae IAM 12953を培養することで、キシルロースをキシリトールに変換することができる。具体的に、まず、アラビトールを30g/Lで含む水溶液に、G. oxydans NBRC 3172を植菌して作用させ、キシルロースを調製した。次に、前培養では、試験管(20mL)に、キシリトールの生産用の培地(キシルロース:30g/L、酵母抽出物:3g/L、硫酸アンモニウム:5g/L、リン酸水素二カリウム:2g/L、硫酸マグネシウム七水和物:1g/L)の2mLを入れてから、Kluyveromyces lactis NBRC 1903及び/又はCandida shehatae IAM 12953を植菌し、30℃、200rpm、24hで振盪式の培養を行った後に、その前培養後の培養液の0.9mLを分取し、遠心分離で上清を除去して集菌し、前記したキシリトールの生産用の培地の0.9mLを新たに添加し、30℃で培養を行って反応を進める。これにより、キシルロースからキシリトールへの生物変換を実施した。実際の実験では、培養条件として静置培養又は中位の好気的培養を採用した。静置培養では、3hおきに一時撹拌し、9h後に試料を採取した。好気的培養では、200rpmで振盪式の培養を行った。なお、Suihkoらは、酵母のSaccharomyces cerevisiae VTT-C-76029、Candida tropicalie ATCC 1369又はPachysolen tannophilusを、アルギン酸ゲルに固定化した生体触媒を用い、キシルロースからキシリトールへの変換を実施している(Suihko,M-L., and K.Poutanen : “D-Xylulose Fermentation by Free and Immobilized SACCHAROMYCES CEREVISIAE Cells,” Biotechnol. Lett., 6, 189-194 (1984))。
For the treatment, a method (means) for culturing the microorganism in a medium containing xylulose can be adopted, but an immobilized microbial cell in which the microorganism is immobilized on a carrier can also be used. For example, xylulose can be converted to xylitol by culturing Kluyveromyces lactis NBRC 1903 and / or Candida shehatae IAM 12953 in a medium containing xylulose. Specifically, first, G. oxydans NBRC 3172 was inoculated and acted on an aqueous solution containing arabitol at 30 g / L to prepare xylulose. Next, in the pre-culture, in a test tube (20 mL), xylitol production medium (xylulose: 30 g / L, yeast extract: 3 g / L, ammonium sulfate: 5 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 2 g /
乳糖からアラビトールを産生できる菌体の探索
本実施例では、酵母であるKluyveromyces lactis var. lactis NBRC 0433及びNBRC 1903、Kluyveromyces marxianus NBRC 1735及びNBRC 10005(独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門(NBRC)より購入した)、並びにKluyveromyces marxianus ATCC 26548及びATCC 52486(American Type Culture Collection(ATCC)より購入した)を用いた。各種の菌株は、寒天プレート(グルコース:2%、酵母抽出物:1%、ペプトン:2%、寒天:2%)に、277K(ケルビン。以下、同じ)で保存した。In this example, the yeasts Kluyveromyces lactis var. Lactis NBRC 0433 and NBRC 1903, Kluyveromyces marxianus NBRC 1735 and NBRC 10005 (independent administrative agency, National Institute of Biotechnology, (Purchased from the Genetic Resource Department (NBRC)), and Kluyveromyces marxianus ATCC 26548 and ATCC 52486 (purchased from the American Type Culture Collection (ATCC)). Various strains were stored on agar plates (glucose: 2%, yeast extract: 1%, peptone: 2%, agar: 2%) at 277K (Kelvin, hereinafter the same).
実験に供試する菌体の調製に、前培養では、試験管(20mL)に、培地(乳糖一水和物:10g/L、酵母抽出物:3g/L、硫酸アンモニウム:5g/L、リン酸水素二カリウム:2g/L、硫酸マグネシウム七水和物:1g/L)の5mLを入れてから、各種の菌株を植菌し、200rpm、303K、12hで振盪式の培養を行った。そして、本培養では、試験管(20mL)に、高濃度の乳糖を含む基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)の5 mLを入れてから、各種の菌株を植菌し、200rpm、303K、72hで振盪式の培養を行った。 For preparation of cells to be used in the experiment, in the preculture, in a test tube (20 mL), medium (lactose monohydrate: 10 g / L, yeast extract: 3 g / L, ammonium sulfate: 5 g / L, phosphoric acid After adding 5 mL of dipotassium hydrogen: 2 g / L, magnesium sulfate heptahydrate: 1 g / L), various strains were inoculated and cultured at 200 rpm, 303 K, 12 h by shaking. In the main culture, put 5 mL of basic medium (lactose monohydrate: 200 g / L, yeast extract: 10 g / L) containing high-concentration lactose into a test tube (20 mL), The strain was inoculated and cultured with shaking at 200 rpm, 303K, 72h.
菌体の濃度の測定では、カルチャー(菌体培養物)より試料を採取し、分光光度計(島津製作所、UV-120-02)を用いて、波長600nmの濁度(OD600)より求めた。NBRC1903株のカルチャーでは、OD600が乾燥菌体の濃度で0.225g/Lに相当した。 In the measurement of the bacterial cell concentration, a sample was collected from the culture (bacterial cell culture) and obtained from the turbidity (OD600) at a wavelength of 600 nm using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation, UV-120-02). In the culture of the NBRC1903 strain, OD600 corresponds to 0.225 g / L in terms of the dry cell concentration.
菌株の特性の評価では、試験管(20mL)に、基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)の2mLを入れてから、K. lactis NBRC 0433株、K. lactis NBRC1903株、K. marxianus NBRC1735株、K. marxianus NBRC 10005株、K. marxianus ATCC 26548株、K. marxianus ATCC 52486株を、それぞれ菌体の初期濃度でOD600が0.05になるように植菌し、200rpm、303K、72hで振盪培養を行った。 In the evaluation of the characteristics of the strain, 2 mL of the basic medium (lactose monohydrate: 200 g / L, yeast extract: 10 g / L) was put into a test tube (20 mL), then K. lactis NBRC 0433 strain, K Lactis NBRC1903 strain, K. marxianus NBRC1735 strain, K. marxianus NBRC 10005 strain, K. marxianus ATCC 26548 strain, K. marxianus ATCC 52486 strain were inoculated so that the OD600 would be 0.05 at the initial cell concentration. And shaking culture at 200 rpm, 303 K, 72 h.
糖や糖アルコールの分析では、試料を遠心分離して菌体を沈降させた後に、その上清を精密濾過(細孔径:0.2μm)した溶液を用いた。その溶液へ高速液体クロマトグラフィー(島津製作所、LC-10AD)と示差屈折計検出器(RID-6A)を適用して、糖や糖アルコールの濃度を測定した。高速液体クロマトグラフィーには、順相モードと配位子交換モードで分離するSZ5532カラム(6.0×150mm)(昭和電工)を用いて、カラムの温度を333Kとした。移動相には、アセトニトリル/水(75/25)を用いて、流量を1.0mL/minとした。糖や糖アルコールの同定や濃度の測定では、標準液を用いて流出ピークを事前に作成し、そのピークを比較対照に用いた。その結果を表1に示す。
K. lactis NBRC0433株、K. lactis NBRC1903株、K. marxianus NBRC1735株の菌体(3種)で、乳糖の消費活性が特に高く、代謝生成物として、エタノールとグリセロールが検出された。乳糖の反応率は、K. lactis NBRC0433株で91.3%、K. lactis NBRC1903株で89.1%、K. marxianus NBRC1735株で73.9%であった。これら3種の菌株で、エタノールの生成量は類似していたが、K. lactis NBRC0433株で最も高濃度であり、その濃度は59.3g/Lに達していた。 Lactose consumption activity was particularly high in cells of K. lactis NBRC0433, K. lactis NBRC1903, and K. marxianus NBRC1735, and ethanol and glycerol were detected as metabolites. The reaction rate of lactose was 91.3% for K. lactis NBRC0433, 89.1% for K. lactis NBRC1903, and 73.9% for K. marxianus NBRC1735. In these three strains, the amount of ethanol produced was similar, but the highest concentration was found in K. lactis NBRC0433, and the concentration reached 59.3 g / L.
そして、K. lactis NBRC 0433株、K. lactis NBRC 1903株の菌体(2種)では、代謝生成物として、アラビトールも検出された。アラビトールの生成は、既往の研究では報告されておらず、全く新しい知見である。 In addition, arabitol was also detected as a metabolite in K. lactis NBRC 0433 strain and K. lactis NBRC 1903 strain cells (2 species). The production of arabitol has not been reported in previous studies and is a completely new finding.
一方、K. marxianus NBRC 10005株、K. marxianus ATCC 26548株、K. marxianus ATCC 52486株の菌体(3種)で、乳糖の消費活性が低く、反応溶液中に代謝生成物は検出されなかった。これら3種の菌株は、乳糖に対してkluyver negative(炭素源を消費できるが、発酵できない性質)である可能性がある。 On the other hand, in the cells of K. marxianus NBRC 10005 strain, K. marxianus ATCC 26548 strain, and K. marxianus ATCC 52486 strain (3 species), lactose consumption activity was low and no metabolite was detected in the reaction solution . These three strains may be kluyver negative (property that can consume carbon source but cannot be fermented) against lactose.
糖代謝に及ぼす培地成分の影響
糖代謝に及ぼす培地成分の影響を検討する本実施例では、K. lactis NBRC1903株を用いた。Effect of medium components on sugar metabolism In this example for examining the effect of medium components on sugar metabolism, K. lactis NBRC1903 strain was used.
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、実施例1で用いた基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)の50mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.0104になるように植菌し、200rpm、303K、所定時間で振盪培養を行った。フラスコの蓋には通気性の良いシリコ栓を用いた。その結果を図3に示す。
実施例2(図3)では、エタノールは31.5g/L、グリセロールは3.11g/L、アラビトールは3.67g/Lに達していた。実施例1(表1)と比較すると、実施例2(図3)では、好気的条件が向上していることで、エタノールの生成量が低下し、グリセロールの生成量が向上している。アラビトールの生成量は、実施例1と実施例2で同等であった。 In Example 2 (FIG. 3), ethanol reached 31.5 g / L, glycerol reached 3.11 g / L, and arabitol reached 3.67 g / L. Compared with Example 1 (Table 1), in Example 2 (FIG. 3), the aerobic conditions are improved, so that the amount of ethanol produced is reduced and the amount of glycerol produced is improved. The amount of arabitol produced was the same in Example 1 and Example 2.
乳糖の添加の影響
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、実施例1で用いた基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)で複合塩(硫酸アンモニウム:41.5g/L、リン酸二水素カリウム:3g/L、リン酸水素二カリウム:1g/L、硫酸マグネシウム七水和物:1g/L)を添加して調製した溶液の50mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、実施例2と同じ条件にして培養を行った。培養の開始から12h後と24h後に、乳糖一水和物:250 g/Lを、それぞれ10mLずつで添加した。その結果を図4に示す。Effect of lactose addition In a conical flask (500 mL) with baffle, complex salt (ammonium sulfate: 41.5 g) in the basic medium (lactose monohydrate: 200 g / L, yeast extract: 10 g / L) used in Example 1 / L, potassium dihydrogen phosphate: 3 g / L, dipotassium hydrogen phosphate: 1 g / L, magnesium sulfate heptahydrate: 1 g / L) The lactis NBRC1903 strain was cultured under the same conditions as in Example 2. Lactose monohydrate: 250 g / L was added at 10 mL each, 12 h and 24 h after the start of culture. The result is shown in FIG.
実施例2(図3)と比較すると、実施例3(図4)では、エタノールは24.5g/Lと低い反面、グリセロールは7.21g/L、アラビトールは8.43g/Lと大幅に向上していた。乳糖の添加は、EMP pathway(Embden-Myerhof Parnas pathway)を辿る代謝反応を抑制し、PPP(Pentose phosphate pathway)への代謝反応を促進したと考えられる。 Compared to Example 2 (FIG. 3), in Example 3 (FIG. 4), ethanol was low at 24.5 g / L, but glycerol was significantly improved to 7.21 g / L and arabitol to 8.43 g / L. . It is thought that the addition of lactose suppressed the metabolic reaction following the EMP pathway (Embden-Myerhof Parnas pathway) and promoted the metabolic reaction to PPP (Pentose phosphate pathway).
酵母抽出物の濃度の影響(中位の好気的条件における培養)
試験管(20mL)に、実施例1で用いた基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)で酵母抽出物の濃度を変化させて調製した溶液の2mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.010になるように植菌し、200rpm、303K、72hで(往復式の)振盪培養を行った。このとき、中位の好気的条件で培養したこととなる。その結果を図5に示す。Effect of yeast extract concentration (culture under moderate aerobic conditions)
In a test tube (20 mL), add 2 mL of the solution prepared by changing the concentration of the yeast extract in the basic medium used in Example 1 (lactose monohydrate: 200 g / L, yeast extract: 10 g / L). Then, the K. lactis NBRC1903 strain was inoculated so that the OD600 was 0.010 at the initial cell concentration, and shake culture (reciprocating) was performed at 200 rpm, 303 K, 72 h. At this time, the cells were cultured under moderate aerobic conditions. The result is shown in FIG.
酵母抽出物が40g/Lの場合に、アラビトールは最大値で12.7g/Lに達していた。 When the yeast extract was 40 g / L, arabitol reached a maximum value of 12.7 g / L.
酵母抽出物の濃度の影響(高位の好気的条件における培養)
気泡塔反応器(30mmfx200mm)に、実施例1で用いた基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)で酵母抽出物の濃度を変化させて調製した溶液の20mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.02になるように植菌し、反応器の底部より空気を100 mL/minで連続的に供給しながら、303K、72hで培養を行った。このとき、高位の好気的条件で培養したこととなる。その結果を図6に示す。Effect of yeast extract concentration (culture under high aerobic conditions)
In a bubble column reactor (30 mmfx200 mm), a solution prepared by changing the concentration of the yeast extract in the basic medium (lactose monohydrate: 200 g / L, yeast extract: 10 g / L) used in Example 1 After injecting 20 mL, inoculate K. lactis NBRC1903 strain so that the OD600 is 0.02 at the initial cell concentration, and continuously supplying air at 100 mL / min from the bottom of the reactor, For 72 hours. At this time, the cells were cultured under high aerobic conditions. The result is shown in FIG.
酵母抽出物が5〜10g/Lの場合に、アラビトールは最大値で9g/Lに達していた。 When the yeast extract was 5 to 10 g / L, arabitol reached a maximum value of 9 g / L.
ホエイからアラビトールの生産
ホエイからアラビトールの生産を検討した。ホエイUF透過液の粉末を含む培地を調製し、K. lactis NBRC1903株を植菌し、振盪培養を行った。その結果を図7に示す。Production of arabitol from whey Production of arabitol from whey was examined. A medium containing powder of whey UF permeate was prepared, inoculated with K. lactis NBRC1903 strain, and cultured with shaking. The result is shown in FIG.
ホエイUF透過液の粉末のみを含む培地では、ホエイUF透過液の粉末の初期濃度を250 g/Lに調製した。この培地では、K. lactis NBRC 1903株の増殖を確認できた。アラビトールは最大値で4.15 g/Lに達していた。 In a medium containing only whey UF permeate powder, the initial concentration of whey UF permeate powder was adjusted to 250 g / L. In this medium, growth of K. lactis NBRC 1903 strain was confirmed. The maximum amount of arabitol reached 4.15 g / L.
複合塩濃度の影響
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、実施例1で用いた基本培地で複合塩(塩化ナトリウムと塩化カリウムを重量比で3:7に調整した)の濃度を変化させて調製した培地の50mLを加えてから、K. lactis NBRC1903株を植菌し、50rpm、303K、90hで振盪培養を行い、複合塩の濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した。その結果を図8に示す。Effect of complex salt concentration Prepared by changing the concentration of complex salt (sodium chloride and potassium chloride adjusted to 3: 7 by weight ratio) in the basic medium used in Example 1 in a baffled Erlenmeyer flask (500 mL). After adding 50 mL of the prepared medium, K. lactis NBRC1903 strain was inoculated and cultured by shaking at 50 rpm, 303 K, 90 h, and the influence of the complex salt concentration on arabitol production was examined. The result is shown in FIG.
複合塩の濃度が向上すると、アラビトールの生産量は向上し、複合塩の濃度が30g/Lの場合に、アラビトールは最大値で2.1g/Lに達していた。 As the concentration of the complex salt increased, the production of arabitol increased, and when the concentration of the complex salt was 30 g / L, the maximum value of arabitol reached 2.1 g / L.
塩濃度の影響
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、実施例1で用いた基本培地で複合塩(塩化ナトリウムと塩化カリウムを重量比で変化させて調整した)の濃度を変化させて調製した培地の50mLを加えてから、K. lactis NBRC1903株を植菌し、50rpm、303K、90hで振盪培養を行い、各塩の濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した。その結果を図9に示す。Effect of salt concentration Medium prepared by changing the concentration of complex salt (adjusted by changing the weight ratio of sodium chloride and potassium chloride) with the basic medium used in Example 1 in an Erlenmeyer flask with baffle (500 mL) After adding 50 mL of the solution, K. lactis NBRC1903 strain was inoculated and cultured with shaking at 50 rpm, 303 K, 90 h, and the influence of the concentration of each salt on arabitol production was examined. The result is shown in FIG.
塩化ナトリウムは10g/Lの場合に、アラビトール生産量は最大値で2.1g/Lに達していた。一方、塩化カリウムは30g/Lの場合に、アラビトール生産量は最大値で2.2g/Lに達していた。 When sodium chloride was 10 g / L, arabitol production reached a maximum of 2.1 g / L. On the other hand, when potassium chloride was 30 g / L, the arabitol production reached a maximum of 2.2 g / L.
初期の乳糖濃度がD-アラビトール生産に及ぼす影響
初期の乳糖(一水和物)濃度を20〜200g/Lとし、酵母抽出物を濃度が40g/Lとなるように添加した培地の2mLに、 K. lactis NBRC1903を植菌し、200rpmの振盪条件下、303Kで回分培養した。その結果を図13に示す。Effect of initial lactose concentration on D-
■が残存乳糖、◆が菌体、●がD-アラビトール、▼がグリセロール、△がエタノールの濃度を示す。D-アラビトール生成に関し、初期の乳糖濃度は極めて重要であり、初期の乳糖濃度が100g/L以上の場合にだけ、D-アラビトール生産が確認できた。初期の乳糖濃度が100、200g/Lの時の168h後におけるD-アラビトール生産量は、それぞれ0.62 g/L、18.0g/Lであった。補足実験として初期の乳糖濃度200g/Lで、K. lactis NBRC1903を培養し、乳糖濃度が125g/Lとなった24h後に、乳糖を添加して150g/Lとし、浸透圧を上げて培養を行った。D-アラビトール生産量は13.1g/Lに低下した。次に、初期の乳糖濃度200g/LでK. lactis NBRC1903を培養し、乳糖濃度が初期濃度の1/10程度に低下した72h後に、乳糖を添加して100g/Lとし、浸透圧を上げて培養を継続させた。D-アラビトール生産量は17.1g/Lとなった。さらに、初期の乳糖濃度が100g/Lで、K. lactis NBRC1903を培養し、乳糖濃度が初期濃度の1/10程度に低下した24h後に、乳糖を添加して100g/Lとし、浸透圧を上げて培養を継続させた。D-アラビトール生産量は8.01g/L(上記の0.62g/Lの10倍以上)にまで向上した。初期のD-アラビトール生産は、高乳糖濃度が齎す高浸透圧に対する、K. lactis NBRC1903の細胞応答のように見受けられる。高浸透圧に対する、酵母Saccharomyces cereviaeの細胞応答では、グリセロールの蓄積が報告されている。但し、図13では、K. lactis NBRC1903の細胞外のグリセロール濃度は余り向上していないことが分かる。 ■ indicates residual lactose, ◆ indicates bacterial cells, ● indicates D-arabitol, ▼ indicates glycerol, and Δ indicates the concentration of ethanol. Regarding the production of D-arabitol, the initial lactose concentration is extremely important, and D-arabitol production was confirmed only when the initial lactose concentration was 100 g / L or more. When the initial lactose concentrations were 100 and 200 g / L, the production amounts of D-arabitol after 168 hours were 0.62 g / L and 18.0 g / L, respectively. As a supplementary experiment, K. lactis NBRC1903 was cultured at an initial lactose concentration of 200 g / L, and after 24 hours when the lactose concentration reached 125 g / L, lactose was added to 150 g / L, and the osmotic pressure was increased and cultured. It was. D-arabitol production decreased to 13.1 g / L. Next, K. lactis NBRC1903 was cultured at an initial lactose concentration of 200 g / L, and after 72 hours when the lactose concentration decreased to about 1/10 of the initial concentration, lactose was added to 100 g / L to increase the osmotic pressure. The culture was continued. D-arabitol production was 17.1 g / L. Furthermore, K. lactis NBRC1903 was cultured at an initial lactose concentration of 100 g / L, and after 24 hours when the lactose concentration dropped to about 1/10 of the initial concentration, lactose was added to 100 g / L to increase the osmotic pressure. The culture was continued. D-arabitol production increased to 8.01 g / L (more than 10 times the above 0.62 g / L). Early D-arabitol production appears to be the cellular response of K. lactis NBRC1903 to the high osmotic pressure that high lactose concentrations imply. Glycerol accumulation has been reported in the cellular response of the yeast Saccharomyces cereviae to hyperosmolarity. However, in FIG. 13, it can be seen that the extracellular glycerol concentration of K. lactis NBRC1903 is not significantly improved.
初期の塩濃度がD-アラビトール生産に及ぼす影響
バッフル付きのフラスコ(500mL)に、液量で50mLの培地を準備した。培地には、乳糖(一水和物)を200g/L、酵母抽出物を10g/Lの他に塩を加えた。この塩は質量比で3:7のNaClとKClを含んだ複合塩であり、その濃度が0〜50g/Lとなるように、NaClとKClを加えて調製した。また、NaCl又はKClの単一塩を濃度が0〜30g/Lの範囲で添加する実験も行った。その結果を図14に示す。図14(D)では、それぞれに条件設定したイオン濃度の合計値 ci=[Na+]+[K+]+[Cl-] (1) に対し、D-アラビトール生産量をプロットした。複合塩、単一塩、いずれの実験結果も一本の曲線状にプロットされているように見受けられる。このことより、イオン濃度に比例する浸透圧に応じて細胞は応答し、D-アラビトールを生成していることが推論される。Effect of initial salt concentration on D-
初期のグルタミン濃度及び培養温度がD-アラビトール生産に及ぼす影響
試験管(20mL)を用いて、液量で2mLの培地(乳糖(一水和物)、200g/L;(NH4)2SO4、3.4g/L;KH2PO0、2g/L;MgSO0・7H0O、1g/L;Glutamine、2〜10g/L;Yeast Nitrogen Base without Amino Acid)に植菌し、温度を303、308、310Kとして、200 rpmで振盪培養を行い、グルタミン濃度と培養温度の影響を調べた。その結果を図15に示す。酵母抽出物を使用した実験に比べると、全体的にD-アラビトール生産量は低いが、培養温度を高めると、D-アラビトール生産量は高まり、310K(37℃)では、グルタミン濃度の5g/Lで、D-アラビトール生産量は17.1g/Lを達していることが分かる。Effect of initial glutamine concentration and culture temperature on D-arabitol production Using a test tube (20 mL), 2 mL of medium (lactose (monohydrate), 200 g / L; (NH 4 ) 2 SO 4 3.4 g / L; KH 2 PO 0 , 2 g / L; MgSO 0 · 7H 0 O, 1 g / L; Glutamine, 2 to 10 g / L; Yeast Nitrogen Base without Amino Acid) Shaking culture was performed at 308 and 310K at 200 rpm, and the effects of glutamine concentration and culture temperature were examined. The result is shown in FIG. Compared to experiments using yeast extract, the overall production of D-arabitol is low, but increasing the culture temperature increases the production of D-arabitol. At 310K (37 ° C), the glutamine concentration is 5 g / L. It can be seen that the production of D-arabitol has reached 17.1 g / L.
菌体濃縮操作と酸素供給操作がD-アラビトール生産に及ぼす影響
K. lactis NBRC1903の濃縮操作と酸素供給操作がD-アラビトール生産量に及ぼす影響を検討した。培地には、乳糖を100g/L又は200g/L;(NH0)0SO0、3.4g/L;KH0PO0、2g/L;MgSO0・7H0O、1g/L;Glutamine、5g/L;Yeast Nitrogen Base without Amino Acidから成る液体で2mLを用いて、温度を310Kとして、200rpmで振盪培養を行った。培養開始から24h後に、遠心分離操作によって菌体濃度を2倍として、培養を継続させた。その結果を図16にを示す。菌体濃縮操作を行い、液量で2mLの培地を用いて、200rpmで振盪培養を継続させたところ、D-アラビトール生産量は、菌体濃縮操作を行わない場合と比べて若干低下した。菌体濃縮操作を行った結果、エタノール濃度が向上して、嫌気性が向上し、D-アラビトール生産量が低下したと考えられた。菌体濃縮操作を行い、液量で1mLの培地を用いて、200rpmで振盪培養を継続させたところ、D-アラビトール生産量は、菌体濃縮操作を行わない場合と比べて向上し、120h後には26.7 g/Lに達した。上記の実施例1と比べて、6.8倍に到る濃度を獲得することができた。Effects of cell concentration and oxygen supply on D-arabitol production
The effects of concentration and oxygen supply operations of K. lactis NBRC1903 on D-arabitol production were examined. The medium contains lactose at 100 g / L or 200 g / L; (NH 0 ) 0 SO 0 , 3.4 g / L; KH 0 PO 0 , 2 g / L; MgSO 0 · 7H 0 O, 1 g / L; Glutamine, 5 g / L; Using 2 mL of a liquid consisting of Yeast Nitrogen Base without Amino Acid, shaking culture was performed at 200 rpm at a temperature of 310K. After 24 hours from the start of the culture, the cell concentration was doubled by centrifugation and the culture was continued. The results are shown in FIG. When the bacterial cell concentration operation was performed and shaking culture was continued at 200 rpm using a 2 mL medium, the D-arabitol production amount was slightly reduced as compared to the case where the bacterial cell concentration operation was not performed. As a result of the bacterial cell concentration operation, it was considered that the ethanol concentration was improved, the anaerobic property was improved, and the production amount of D-arabitol was reduced. When the bacterial cell concentration operation was performed and shaking culture was continued at 200 rpm using 1 mL of the medium in the liquid volume, the D-arabitol production increased compared to the case where the bacterial cell concentration operation was not performed, and after 120 h. Reached 26.7 g / L. Compared to Example 1 above, a concentration as high as 6.8 times could be obtained.
[参考例1]
アラビトールからキシルロースへの変換
本参考例では、アラビトールからキシルロースへの変換を検討した。[Reference Example 1]
Conversion from arabitol to xylulose In this reference example, conversion from arabitol to xylulose was examined.
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、培地(マンニトール:50g/L、酵母抽出物:10g/L、ペプトン:10g/L)の50mLを入れてから、保存培地上にあったGluconobacter oxydans NBRC 3172株を白金耳の先端量だけ植菌し、200rpm、303K、48hで振盪培養を行った。この培養液を遠心分離して洗浄しながら、菌体を沈降濃縮した後に、試験管(20mL)に、アラビトールを30g/Lで含む水溶液の1mLを入れてから、前記で調製したG. oxydans NBRC 3172株を菌体の初期濃度でOD600が20になるように植菌し、200rpm、303K、所定時間で振盪培養を行った。その結果を図10に示す。 Gluconobacter oxydans NBRC 3172 strain on the preservation medium after putting 50mL of medium (mannitol: 50g / L, yeast extract: 10g / L, peptone: 10g / L) into an Erlenmeyer flask with baffle (500mL) Was inoculated by the amount of the tip of the platinum ear, and cultured with shaking at 200 rpm, 303 K, 48 h. After centrifuging and culturing this culture solution, the cells were sedimented and concentrated, and 1 mL of an aqueous solution containing arabitol at 30 g / L was added to a test tube (20 mL), and then the G. oxydans NBRC prepared above was used. The 3172 strain was inoculated so that the OD600 was 20 at the initial concentration of the cells, and shaking culture was performed at 200 rpm, 303K for a predetermined time. The result is shown in FIG.
培養の開始から6h後に、大部分のアラビトールが反応し、キシルロースが生成されていた。そのキシルロースの収率は約100%であった。このとき、微量のキシリトールが副産物で生成されていた。 Six hours after the start of culture, most of the arabitol reacted and xylulose was produced. The xylulose yield was about 100%. At this time, a trace amount of xylitol was produced as a by-product.
[参考例2]
キシルロースからキシリトールへの変換
本参考例では、キシルロースからキシリトールへの変換を検討した。[Reference Example 2]
Conversion of xylulose to xylitol In this reference example, conversion of xylulose to xylitol was examined.
試験管(20mL)に、培地(キシルロース:32.9g/L、キシリトール:0.4g/L、酵母抽出物:3g/L、硫酸アンモニウム:5g/L、リン酸水素二カリウム:2 g/L、硫酸マグネシウム七水和物:1g/L)の2mLを入れてから、Kluyveromyces lactis NBRC 1903株、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548株、Candida melibiosica NBRC 10238株、Candida mogii NBRC 0436株、Candida shehatae IAM 12953株、Zygosaccharomyces rouxii IAM 12879株、Debaryomyces hansenii IAM 12837株、Pichia farinose IAM 12223株、Pichia stipitis IAM 12952株(財団法人応用微生物学研究奨励会(IAM)より購入した)を、それぞれ白金耳の先端量だけ植菌し、200rpm、303K、24hで(往復式の)振盪培養を行った。これらの培養の終了時にOD600は、Kluyveromyces lactis NBRC 1903株で18.7、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548株で27.3、Candida melibiosica NBRC 10238株で32、Candida mogii NBRC 0436株で16.3、Candida shehatae IAM 12953株で30.8、Zygosaccharomyces rouxii IAM 12879株で3.6、Debaryomyces hansenii IAM 12837株で16.6、Pichia farinose IAM 12223株で17.1、Pichia stipitis IAM 12952株で20.7であった。これらの培養液の0.9mLをマイクロテストチューブ(1.5mL)に入れてから、遠心分離して洗浄しながら、菌体を沈降濃縮した後に、前記の培地の0.9mLを新たに加えてから、303Kで静置培養を行った。培養の開始から3h後と6h後に、マイクロチューブ内の培養液を一時撹拌した。その結果を表2に示す。
比較対照の実験として、試験管(20mL)に、前記した菌体を植菌し、200rpm、30℃、所定時間で好気的に振盪培養を行った。 As a comparative control experiment, the above-mentioned cells were inoculated into a test tube (20 mL) and aerobically shaken and cultured at 200 rpm, 30 ° C. for a predetermined time.
キシリトールの生産量は、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548株で0.42g/L、Candida melibiosica NBRC 102388株で0.88 g/L、Candida shehatae IAM 129538株で1.79g/L、Zygosaccharomyces rouxii IAM 128798株で0.15g/L、Pichia farinose IAM 122238株で0.13g/L、Pichia stipitis IAM 129528株で0.10g/Lであった。 Xylitol production was 0.42 g / L for Kluyveromyces marxianus ATCC 26548, 0.88 g / L for Candida melibiosica NBRC 102388, 1.79 g / L for Candida shehatae IAM 129538, 0.15 g / L for Zygosaccharomyces rouxii IAM 128798, The Pichia farinose IAM 122238 strain was 0.13 g / L, and the Pichia stipitis IAM 129528 strain was 0.10 g / L.
一方、Kluyveromyces lactis NBRC 19038株、Candida mogii NBRC 04368株、Debaryomyces hansenii IAM 128378株で、キシリトールは検出できなかった。 On the other hand, xylitol was not detected in Kluyveromyces lactis NBRC 19038 strain, Candida mogii NBRC 04368 strain and Debaryomyces hansenii IAM 128378 strain.
Candida shehatae IAM 129538株を、OD600が30.8となるように集菌し、マイクロテストチューブ(1.5mL)に入れてから、前記の培地の0.9mLを新たに加えてから、静置培養を行った。その結果を図11に示す。 Candida shehatae IAM 129538 strain was collected so that OD600 would be 30.8, put into a micro test tube (1.5 mL), 0.9 mL of the above medium was newly added, and then static culture was performed. The result is shown in FIG.
基本的には静置培養であるが、培養の開始から、3、6、9、12h後に、培養液を一時撹拌した。初期の段階で、キシルロースの32.9g/Lのうち、85.0%が消費され、最終の段階で、キシリトールは6.32g/Lに達していた(初期のキシリトール:0.54g/L)。このとき、キシリトールの収率は0.22であった。副生成物のアラビトールは低濃度であった。 Basically, it was stationary culture, but the culture solution was temporarily stirred 3, 6, 9, 12 hours after the start of the culture. In the initial stage, 85.0% of 32.9 g / L of xylulose was consumed, and in the final stage, xylitol reached 6.32 g / L (initial xylitol: 0.54 g / L). At this time, the yield of xylitol was 0.22. The by-product arabitol was in a low concentration.
本願発明は、糖アルコールの製造の技術分野で利用することができる。 The present invention can be used in the technical field of sugar alcohol production.
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。 All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
Claims (6)
(1)乳糖をアラビトールに変換する能力を有する乳糖資化性・好浸透圧性のKluyveromyces lactisで、乳糖を含有する溶液を処理することによる、アラビトールに変換する工程、
(2)アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物で、アラビトールを含む溶液を処理することによる、アラビトールをキシルロースに変換する工程、
(3)キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物で、キシルロースを含む溶液を処理することによる、キシルロースをキシリトールに変換する工程 A method for producing xylitol from a solution containing lactose, comprising the following steps.
(1) A step of converting lactose into arabitol by treating a lactose-containing solution with lactose assimilating / osmotic Kluyveromyces lactis having the ability to convert lactose into arabitol;
(2) A step of converting arabitol into xylulose by treating a solution containing arabitol with a microorganism having the ability to convert arabitol into xylulose,
(3) A step of converting xylulose into xylitol by treating a solution containing xylulose with a microorganism having the ability to convert xylulose into xylitol.
(1)乳糖をアラビトールに変換する能力を有する乳糖資化性・好浸透圧性のKluyveromyces lactisで、乳糖を含有する溶液を処理することで、副産物としてグルコース及びガラクトースを産生させずに、アラビトールに変換する工程、
(2)アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物で、アラビトールを含む溶液を処理することによる、アラビトールをキシルロースに変換する工程、
(3)キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物で、キシルロースを含む溶液を処理することによる、キシルロースをキシリトールに変換する工程 A method for producing xylitol from a solution containing lactose, comprising the following steps.
(1) Lactose- utilizing and osmotic Kluyveromyces lactis , which has the ability to convert lactose into arabitol, is converted into arabitol without producing glucose and galactose as by-products by treating the solution containing lactose The process of
(2) A step of converting arabitol into xylulose by treating a solution containing arabitol with a microorganism having the ability to convert arabitol into xylulose,
(3) A step of converting xylulose into xylitol by treating a solution containing xylulose with a microorganism having the ability to convert xylulose into xylitol.
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