JP5242223B2 - 培養観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、培養細胞を培養しながら観察するための培養観察装置に関するものである。

分子生物や生物物理の研究では、培養細胞を用いた研究が流行になっている。培養細胞の培養環境は、光学顕微鏡が使用される通常の室内環境とは異なるため、通常の室内環境では培養細胞に悪影響を与える。このようなことから、細胞の培養に適した環境に維持する培養装置に光学顕微鏡を組み合わせることにより、細胞を培養しながら細胞の観察を可能にした培養顕微鏡装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。このような培養実験を長期的に行う場合、標本容器内の培養細胞を所定の待機時間の間隔をおいて断続的かつ時系列的に顕微鏡で撮影するタイムラプス観察方式が用いられることが多い。

このような培養細胞の実験においては、実験中の培養細胞に外的刺激を与えるために薬液を投与したり、攪拌したり、あるいは、長期に亘る実験においては、劣化した培地を交換したりする操作（これらの操作をまとめて、薬液操作という）をしたい場面が生じることがある。培養装置の内部（培養空間）は、細胞の培養に適した環境に維持されているため、培養装置に設けた扉を開放し、標本容器の蓋を手で開けた上でのピペットを用いた薬液操作では、培養空間内の環境が大きく変化してしまい、環境の変化に敏感な細胞にとっては大きなダメージとなる。

そこで、培養空間の環境を変化させることなく培養細胞に対する薬液操作を可能とするため、培養装置外部からの操作によって標本容器の蓋部材を着脱する着脱機構を培養装置内の所定位置に設けた培養顕微鏡装置が提案されている（例えば、特許文献２参照）。

特開２００６−１１４１５号公報 特開２００７−１１１０３４号公報

しかしながら、特許文献２に記載のものは、標本容器を着脱位置に移動させて着脱機構を手動操作して蓋部材を取り外した後、標本容器を液体供給手段がセットされている液体供給位置に移動させて液体供給を行い、液体供給後に再び標本容器を着脱位置に戻して着脱機構で蓋部材を取り付けなくてはならない。このため、培養空間内であっても蓋部材を取り外した状態のまま標本容器を移動させているため、異物の混入や水分蒸発の可能性があり、好ましくない。特に、タイムラプス観察において実験中の環境変化は、実験の信頼性に影響を与えてしまうため、好ましくない。また、薬液操作が複雑で標本容器の移動制御も複雑である。さらには、特許文献２に記載のものは、蓋部材の着脱を手動操作で行うものであり、対象となる標本容器が蓋部材の着脱位置に移動したことを確認した後に、蓋部材の着脱操作を注意深く行う必要があり、操作性の悪いものである。したがって、設定されたタイムスケジュールに従ってタイムラプス観察方式で観察を行う場合に併用しにくいものである。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡単な構成・制御で所望の標本容器の開閉蓋を自動的に開閉させることで培養空間内の環境変化を極力抑制しつつ、タイムラプス観察方式に併用して所望の標本容器に対する薬液操作が可能な培養観察装置を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる培養観察装置は、培養細胞を培養しながら観察するための培養観察装置であって、環境が管理されて培養細胞を培養する培養空間を形成し、一部に操作開口が形成された培養装置と、前記培養空間内に収容されて、培養細胞と培地を収容しヒンジ式の開閉蓋で閉塞された複数の標本容器を位置決めして保持する標本トレーと、待機期間を挟んで光軸上の観察位置に順次位置付けられる前記標本容器中の培養細胞を断続的に観察する顕微鏡と、前記標本トレーを前記顕微鏡の光軸に直交する平面に沿って２次元的に移動させる移動手段と、前記顕微鏡による観察可能軌跡の範囲外に設定されて前記操作開口から操作可能な薬液操作位置に、薬液操作が指定された任意の前記標本容器を位置付けるための前記移動手段による前記標本トレーの観察可能軌跡の範囲を超える移動に連動して該標本容器の前記開閉蓋を開閉する蓋開閉機構と、前記標本容器の指定を伴い薬液操作が指示されたとき前記蓋開閉機構を動作させるために前記移動手段を制御する蓋開閉制御手段と、を備えることを特徴とする。

また、本発明にかかる培養観察装置は、上記発明において、前記蓋開閉制御手段は、指定された任意の前記標本容器の前記蓋開閉機構による前記開閉蓋の開放に先立ち、前記顕微鏡による観察状況を確認して開放動作の開始タイミングを決定することを特徴とする。

また、本発明にかかる培養観察装置は、上記発明において、前記蓋開閉機構は、観察可能軌跡の範囲を超える前記標本トレーの移動量に応じて前記開閉蓋の開放量が可変自在であり、前記蓋開閉制御手段は、薬液操作の指定時に設定された前記開閉蓋の開放量となるように観察可能軌跡の範囲を超える前記移動手段による前記標本トレーの移動量を制御することを特徴とする。

また、本発明にかかる培養観察装置は、上記発明において、前記蓋開閉機構は、観察可能軌跡の範囲を超える前記標本トレーの移動の速度に応じて前記開閉蓋の開閉速度が可変自在であり、前記蓋開閉制御手段は、薬液操作の指定時に設定された前記開閉蓋の開閉速度となるよう観察可能軌跡の範囲を超えるに前記移動手段による前記標本トレーの移動の速度を制御することを特徴とする。

本発明にかかる培養観察装置は、所望の標本容器に対する薬液操作に際しては、ヒンジ式の開閉蓋を備える複数の標本容器を保持した標本トレーを、指定された所望の標本容器が薬液操作位置に位置付けられるように移動手段によって観察可能軌跡の範囲を超えるように移動させ、この標本トレーの移動に連動する蓋開閉機構によって開閉蓋を自動的に開閉させ、その薬液操作位置で操作開口から薬液操作を行えばよく、よって、いわゆるタイムラプス観察にも用いる移動手段による標本トレーの移動範囲を切換えるだけの簡単な構成・制御で所望の標本容器の開閉蓋を自動的に開閉させることで培養空間内の環境変化を極力抑制しつつ、タイムラプス観察方式に併用して所望の標本容器に対する薬液操作を行えるという効果を奏する。

以下、図面を参照して本発明にかかる培養観察装置を実施するための最良の形態について説明する。

図１は、本発明の実施の形態にかかる培養観察装置の全体構成例の概略を示す縦断正面図であり、図２は、その培養装置の一部を拡大して示す概略縦断側面図である。本実施の形態の培養観察装置１００は、培養細胞を培養しながら観察するための装置であって、概略的には、培養細胞を培養するための培養装置（インキュベータ）２００と、培養細胞を観察するための顕微鏡３００とを組み合わせて構成されている。

培養装置２００は、ベース筐体１０２上に固定載置された主筐体１０４と副筐体１０６とにより密閉されて培養細胞を培養する培養空間２０２を形成することにより構成されている。ここで、培養装置２００を構成する主筐体１０４の手前正面側は開口され、図２に示すように、ガラス製の内扉１０８とその外側に位置する例えば鉄製の筐体扉１１０との二重扉構造により開閉自在に閉塞されている。また、主筐体１０４は、培養空間２０２を覆うように埋め込まれたヒータ２０４や、培養空間２０２内に配置されて加湿水を含んだ加湿パッド２０６を備えている。さらに、培養空間２０２は、バルブ２０８を介してＣＯ_２ボンベ２１０に連結されている。

このような構成の培養装置２００は、培養観察装置１００の使用時には、後述するコントローラによるヒータ２０４やバルブ２０８の制御によって培養空間２０２の環境が、例えば温度３７℃、湿度９５％、炭酸ガス濃度５％となり、副筐体１０６の内部温度が３７℃に維持される。

また、培養観察装置１００は、培養空間２０２内に収容された標本トレー４００と、副筐体１０６に取り付けられて標本トレー４００を水平面内で２次元的に移動させるための移動手段となる水平移動機構５００とを備えている。標本トレー４００は、詳細は後述するが、培養細胞と培地を収容した複数個、本実施の形態では８個の標本容器４２０を同一円周上で均等の間隔で位置決めして保持する。水平移動機構５００は、標本トレー４００を回転させるためのモータ５０２と、標本トレー４００およびモータ５０２を一体に支持して標本トレー４００を図１中の左右方向となるＸ方向に直線移動させるリニアモータ５０４とからなる。これにより、水平移動機構５００は、標本トレー４００を回転させたり直線移動させたりするＸθステージとして構成されている。なお、副筐体１０６には、モータ５０２の軸のＸ方向への移動を可能にするための貫通孔１０６ａが形成されている。

また、顕微鏡３００は、副筐体１０６に支持されて標本トレー４００に対向する鉛直方向に光軸が設定された対物レンズ３０２と、この対物レンズ３０２を上下動させるためのリニアモータによる準焦機構３０４と、光軸上に配設された変倍結像レンズ３０６と、変倍結像レンズ３０６により結像される培養細胞の拡大像を撮像するＣＣＤカメラ３０８とを備える。変倍結像レンズ３０６は、電動ターレット構造となっており、電動で倍率変更が可能とされている。また、顕微鏡３００は、光軸上の培養細胞を上方から透過照明するための赤色発光のＬＥＤ３１０を含む照明光学系３１２と、光軸上の培養細胞を下方から選択的に落射照明する青色発光のＬＥＤ３１４および緑色発光のＬＥＤ３１６を含む照明光学系３１８とを備えている。なお、ＣＣＤカメラ３０８等が内蔵されるベース筐体１０２は、室温＋５〜１０℃程度の温度に維持される。

さらに、本実施の形態の培養観察装置１００は、外部に設けられたパソコン６１０による指令の下に装置全体を制御するコントローラ６００を備えている。このコントローラ６００は、例えば水平移動機構５００、準焦機構３０４、ヒータ２０４、ＬＥＤ３１０，３１４，３１６等を制御するもので、後述する薬液操作時には水平移動機構５００の動作を制御する蓋開閉制御手段として機能する。

そして、培養細胞の観察時には、標本トレー４００の回転に伴い対物レンズ３０２の光軸上となる観察位置Ｐ１に位置付けられた標本容器４２０中の培養細胞が顕微鏡３００によって観察される。観察対象となる標本容器４２０は、水平移動機構５００のモータ５０２によって標本トレー４００を所定量回転させることにより切換えられる。また、培養細胞内の観察箇所は、水平移動機構５００のリニアモータ５０４によって標本トレー４００を対物レンズ３０２の光軸に直交する平面に沿ってＸ方向に移動させることにより調整される。例えば、標本容器４２０内の培養細胞は、１ｍｍ角の大きさであり、標本容器４２０の回転軌跡が細胞中心位置に設定されている場合であれば、観察位置Ｐ１に位置付けられた標本容器４２０をリニアモータ５０４によってＸ方向に±０．５ｍｍ直線移動させれば、１ｍｍ角の培養細胞の全範囲の観察が可能となる。

次に、標本トレー４００、標本容器４２０および蓋開閉機構等について説明する。図３は、標本トレー４００周りの構成例を示す分解斜視図であり、図４は、蓋閉塞状態を示す斜視図であり、図５は、蓋開放状態を示す斜視図である。なお、図３では、８個中、１個の標本容器４２０のみ図示する。

まず、培養細胞と培地を収容する標本容器４２０は、例えば直径３５ｍｍのシャーレ状のプラスチック容器からなり、その底部には例えば直径１０ｍｍの開口が形成され、この開口は顕微鏡分野で広く使用されている例えば厚さ０．１７ｍｍのカバーガラスで閉塞されている。培養細胞と培地は、このカバーガラス上に収容される。また、標本容器４２０は、その上部開口を閉塞するヒンジ式の開閉蓋４２２を備えている。この開閉蓋４２２は、ヒンジピン４２４で連結された上蓋４２６と下蓋４２８とからなる。開閉蓋４２２を閉じた状態では下蓋４２８の上面と上蓋２８６の下面とが密着接合し、また、下蓋４２８に対して上蓋４２６がヒンジピン４２４を中心として回転可能な状態に配設されている。ここで、標本トレー４００に固定するための下蓋４２８の底面側の凹部を標本容器４２０に被せるように開閉蓋４２２を設置する。また、上蓋４２６と下蓋４２８には、それぞれ円形の開口部４２６ａ，４２８ａが形成されている。上蓋４２６の開口部４２６ａには、例えばガラス等の透明部材４２７が開口部４２６ａを塞ぐように固定されている。開閉蓋４２２を閉じた状態でこれら開口部４２６ａ（透明部材４２７）、開口部４２８ａを通して顕微鏡観察時の透過照明光を培養細胞に照射できるように構成されている。

また、標本トレー４００は、標本容器４２０を保持する複数、例えば８個の収容凹部４０２を有する。これら収容凹部４０２は、８個の標本容器４２０を同一円周上で均等の間隔で位置決めして保持するように標本トレー４００の外寄りの同一円周上の位置に均等の間隔で同一形状に形成され、中央部には、透光用の開口部４０３が形成されている。また、標本トレー４００は、収容凹部４０２の両側に配設されて、下蓋４２８の上面周辺を押圧することで標本容器４２０の底面を収容凹部４０２の上面に押し付ける板ばね等のばね性部材４０４を備えている。開閉蓋４２２を被せた状態の標本容器４２０と下蓋４２８は、標本トレー４００の収容凹部４０２にばね性部材４０４で押圧された状態で設置され、上蓋４２６はヒンジピン４２４を中心として下蓋４２８に対して開閉回動可能な状態となっている。

ここで、各標本容器４２０は、標本トレー４００上においてヒンジピン４２４側が内周側となり上蓋４２６が外周側に向けて開閉するように位置決めして保持される。このため、標本トレー４００は、各収容凹部４０２の内周側にピンガイド４０６を備え、ピンガイド４０６の標本容器４２０側の外周面４０６ａが、標本容器４２０を標本トレー４００上に設置する際の開閉蓋４２２の突き当て面（位置決め面）とされている。開閉蓋４２２を外周面４０６ａに突き当てることによって、回転する標本トレー４００に対してその回転軸中心から半径方向の距離を精度よく設置することが可能となる。また、ピンガイド４０６において、突き当て面となる外周面４０６ａに直交し、光軸方向と平行な左右２つの面４０６ｂは、開閉蓋４２２が標本トレー４００の回転方向に大きくがたつくことがないように、下蓋４２８のヒンジピン４２４間に形成された切り欠き部４２８ｂとの間の寸法差が０．５ｍｍ程度となるように形成されている。ピンガイド４０６と開閉蓋４２２とをこのような関係で構成することで、標本トレー４００に標本容器４２０を容易かつ精度よく位置決めして設置することが可能となる。

また、本実施の形態の培養観察装置１００は、標本容器４２０の上蓋４２６を自動的に開閉するための蓋開閉機構４４０を備えている。この蓋開閉機構４４０は、各上蓋４２６に対応させてピンガイド４０６毎に設けられたピン４４２と、各ピン４４２に対応させて標本トレー４００の裏面に所定位置関係で設けられた突起４４４と、副筐体１０６の表面上の特定位置の１箇所に設けられたリンク構造の伝達部材４４６とからなる。

まず、ピン４４２は、上下端が球面状に加工された円柱状のものであり、ピンガイド４０６に形成された光軸に平行な貫通孔４５０によって上下方向に摺動可能に設けられている。なお、ピン４４２は、自重により落下、脱落しないように両端側が抜け止めリング４４８により抜け止めされている。このようなピン４４２は、ヒンジピン４２４の中心軸と標本容器４２０との間で、ピン４４２を上昇させたときに上蓋４２６の底面側において基部側受け部４２６ｂに接触する位置に配置され、ピン４４２を上下動させることで上蓋４２６を開閉できるように構成されている。すなわち、通常は自重で下降しているピン４４２を上昇させて上蓋４２６の基部側受け部４２６ｂにピン４４２の上端を接触させる。そして、ピン４４２をさらに上昇させると、上蓋４２６の基部側受け部４２６ｂを持ち上げる方向に外力が加わり、上蓋４２６はヒンジピン４２４を中心に上方に回転し始め、上蓋４２６が開放され、標本容器４２０の内部は、周辺雰囲気に開放される。この際、回転角度の変化に伴いピン４２４の上端の基部側受け部４２６ｂに対する接触位置が変化しても、球面状に形成されているため、滑らかに押上げることができる。

なお、上蓋４２６が回転して開放する角度は９０度未満となるようにピン４４２の押上げ量（上昇量）が規制され、上蓋４２６が開きっぱなしにならないように構成されている。上蓋４２６のヒンジピン４２４付近にストッパを設けて最大開放角を規制するようにしてもよい。９０度未満の開放角であれば、開いた上蓋４２６の自重が常にピン４２４にかかっており、ピン４２４が下降するとピン４２４の上端に基部側受け部４２６ｂが接触したまま上蓋４２６は自重で閉じる方向に回転する。

また、本実施の形態では、光軸上となる観察位置Ｐ１とは略９０度異なり内扉１０８に最も近い正面手前側の標本容器４２０付近の位置が薬液操作位置Ｐ２として設定されている。この薬液操作位置Ｐ２は、顕微鏡３００による観察可能軌跡の範囲外に設定されている。伝達部材４４６は、このような薬液操作位置Ｐ２付近の特定位置に位置させて副筐体１０６の表面と平行な平面上で回転軸４５２を中心に回転自在に設けられている。ここで、略Ｌ字状に形成された伝達部材４４６の一端には、標本トレー４００の回転軸方向に凸部４５４が形成されている。この凸部４５４は、両側に斜面４５４ａ，４５４ｂを有する。また、標本トレー４００の裏面の円筒状の突起４４４は、標本トレー４００が薬液操作位置Ｐ２に位置付けられて回転するときに伝達部材４４６の凸部４５４の斜面４５４ａに接触可能で、通常の観察時には標本トレー４００が回転しても伝達部材４４６の凸部４５４に干渉しない特定位置に設けられている。また、伝達部材４４６の他端上面側には、ピン４４２の球面状の下端が接触可能な斜面４５６が回転軸４５２を中心とする円弧に沿って形成されている。ピンガイド４０６に支持されたピン４４２は、標本トレー４００が薬液操作位置Ｐ２に位置付けられて伝達部材４４６が突起４４４によって回転するときに斜面４５６に接触可能で、通常の観察時には標本トレー４００が回転しても斜面４５６に干渉しない位置に設定されている。

後述するタイムラプス観察を含め、標本トレー４００上の複数の標本容器４２０を順次連続して観察する場合には、突起４４４やピン４４２は、最大限の観察可能軌跡上を移動する場合がある。すなわち、本実施の形態の場合であれば、図３を参照すれば、標本トレー４００が回転軸Ｐ０を中心に回転する円周軌跡上を含み、回転軸がＰ０からＸ方向に±５ｍｍずれた位置を中心に回転する円周軌跡の範囲内が、最大限の観察可能軌跡の範囲内であり、上述の薬液操作位置Ｐ２は、このような観察可能軌跡の範囲外で正面手前位置に設定されている。具体的には、所望の標本容器４２０を正面手前位置に位置させた状態で、リニアモータ５０４により標本トレー４００をＸ方向に例えば７ｍｍ直線移動させた位置に設定され、そのときの標本トレー４００の回転軸がＰ０´の位置となるように設定されている。

すなわち、標本トレー４００が回転軸Ｐ０並びにＸ方向に±５ｍｍずれた位置を中心に回転する場合には、図３（ｂ）に示すような位置関係となり、突起４４４が伝達部材４４６の凸部４５４に干渉せず、ピン４４２も斜面４５６に干渉しないが、薬液操作のために標本トレー４００の回転軸がＰ０´の位置にずれて回転する場合には、図３（ａ）に示すように突起４４４やピン４４２も通常の位置からＸ方向に寸法ｄ＝７ｍｍずれた位置関係となり、突起４４４が伝達部材４４６の凸部４５４に干渉し、ピン４４２が斜面４５６に干渉するように設定されている。

図３（ｂ）に示すような干渉する位置で、標本トレー４００をリニアモータ５０４によってさらに直線移動させると、突起４４４が伝達部材４４６の一方の斜面４５４ａに接触し、さらに標本トレー４００を直線移動させると突起４４４が斜面４５４ａを押して伝達部材４４６を回転軸４５２周りに反時計方向に回転させる力が働く。このとき、他端に形成された斜面４５６が伝達部材４４６の回転に伴いピン４４２の下端に接触を開始し、標本トレー４００のさらなる直線移動に伴う伝達部材４４６のさらなる回転によって斜面４５６がピン４４２の下端を掬い上げるように作用し、ピン４４２はピンガイド４０６にガイドされて上昇する。これにより、前述したように、上蓋４２６は自動的に開放される。標本トレー４００がさらに直線移動し突起４４４が凸部４５４に接触しているときは、伝達部材４４６が最大限回転した位置であり、連動する斜面４５６はピン４４２を上止点まで押し上げる。標本トレー４００がさらに直線移動すると、突起４４４が他方の斜面４５４ｂに接触し始め伝達部材４４６は斜面４５６がピン４４２から離れる方向に回転し、ピン４４２が下降し始める。突起４４４が斜面４５４ｂから離れる位置まで標本トレー４００が直線移動すると、ピン４４２は最下点まで下がり、上蓋４２６は閉じる。なお、標本トレー４００を逆方向に直線移動させて斜面４５４ａを利用してピン４４２を下降させるようにしてもよい。

このように、本実施の形態の蓋開閉機構４４０は、顕微鏡３００による観察可能軌跡の範囲外に設定された薬液操作位置Ｐ２に、薬液操作が指定された任意の標本容器４２０を位置付けるための水平移動機構５００による標本トレー４００の観察可能軌跡の範囲を超える移動に連動して対象となる標本容器４２０の上蓋４２６を自動的に開閉するように構成されている。

ここで、蓋開閉機構４４０は、斜面４５６によって順次ピン４４２を押し上げて上蓋４２６を順次開放させるものであり、ピン４４２の押上量、すなわち上蓋４２６の開放量は伝達部材４４６の回転量に依存するものであり、観察可能軌跡の範囲を超える標本トレー４００の移動量に応じて上蓋４２６の開放量が可変自在に構成されている。また、蓋開閉機構４４０は、観察可能軌跡の範囲を超える標本トレー４００の移動の速度に応じて上蓋４２６の開閉速度も可変自在に構成されている。

なお、このような薬液操作位置Ｐ２に対応させて、内扉１０８には、図２に示すように、薬液操作位置Ｐ２に位置付けた標本容器４２０に対して操作しやすい斜め上方となる位置にはピペット１２０等が挿入可能な大きさの操作開口１０８ａが形成され、通常は、シリコン製の栓１１２により閉塞されている。

このような構成において、所望の標本容器４２０を指定して薬液操作を行う場合について説明する。本発明において、「薬液操作」とは、前述したように、薬液投与、溶液攪拌、培地交換等の操作をまとめたものである。例えば、薬液投与は、例えばピペット１２０を用いて所望の薬液（試薬）を標本容器４２０中の培養細胞に対して投与する操作をいう。また、攪拌は、例えばピペット１２０を用いて標本容器４２０内の溶液を軽く吸ったり吐いたりして、中の溶液を攪拌する操作をいい、ピペッティングと称される。ピペッティングの場合、標本容器４２０内の溶液の量、培養細胞の位置、供給する試薬の種類や量、粘度に応じて、操作者はピペッティングの方法を自身が所有するピペット１２０に応じて取扱いの手技を最適な状態にコントロールしている。すなわち、ピペット１２０の先端の位置や角度、吐出量や速度などのピペッティング操作を微調整するようにしている。培地交換は、例えばピペット１２０を用いて劣化した培地を吸い取った後、新たな培地を投与する操作をいう。また、薬液操作自体は、手動でも自動でもよい。

いずれの薬液操作にしても、図２に示すように、筐体扉１１０を開き、栓１１２を外して操作開口１０８ａからピペット１２０を挿入して操作を行うが、ガラス製の内扉１０８越しに上蓋４２６が開放されたのを目視確認して内部の様子を見ながら行えるので、操作性のよいものとなる。また、上蓋４２６を開放させる位置が操作開口１０８ａに最も近い薬液操作位置Ｐ２であり、操作性がよい上に、上蓋４２６を開放させたまま標本容器４２０を移動させることもないので、異物の混入や水分蒸発の可能性を極めて少なくすることができる。

つぎに、長期培養において一般的なタイムラプス観察時における薬液操作について説明する。ここで、培養観察装置１００においては、例えば特許文献１等に示されるように、パソコン６１０における観察条件を設定するための観察準備プログラムに従い標本トレー４００の原点出し処理が完了し、原点位置を基準に標本トレー４００上の各標本容器４２０は例えば容器番号により指定可能とされている。また、タイムラプス観察に先立つ観察条件の設定において、使用するＬＥＤの選択、明るさ、倍率、ＣＣＤカメラ３０８の露出時間等の顕微鏡３００の撮影条件、タイムラプスのインターバル時間（待機期間）を含むタイムスケジュール、実験期間等は、予めパソコン６１０によって設定され、パソコン６１０のデータベース上に格納されているものとする。この場合のタイムラプス観察は、同一の標本容器４２０内の培養細胞の複数位置の観察を順次行う多点タイムラプスを含む。これにより、本実施の形態の顕微鏡３００は、設定されたインターバル時間を挟んで光軸上の観察位置Ｐ１に順次位置付けられる標本容器４２０中の培養細胞を断続的に観察するタイムラプス観察を実行するように設定されている。

図６は、タイムラプス観察方式によるタイムラプス取込モード実行中に、パソコン６１０からの指令に基づきコントローラ６００により実行される薬液操作の割込み制御例を示す概略フローチャートである。まず、パソコン６１０からのタイムラプス取込モードの開始指令に基づきこのモードの処理を設定された条件に従い実行する（ステップＳ１００）。このような動作中に、パソコン６１０を通じて薬液操作の指示があるか否かを判定する（ステップＳ１０１）。薬液操作の指示がなければ（ステップＳ１０１：Ｎｏ）、タイムラプス取込モードの実行を継続する（ステップＳ１００）。

パソコン６１０において、薬液操作の指示は、操作者が所望する任意の時点で可能である。この薬液操作の指示に際しては、薬液操作を行いたい所望の標本容器４２０をその容器番号を入力することで指定する。また、薬液操作の指示に際しては、開閉蓋４２２の上蓋４２６の開放量および開閉速度を許容範囲内で任意に指定することができる。特に指定がない場合には、開放量や開閉速度は予め設定されているデフォルト値とされる。さらに、薬液操作の指示に際しては、薬液操作する薬液や操作の種類等も入力される。

パソコン６１０を通じて薬液操作の指示があった場合には（ステップＳ１０１：Ｙｅｓ）、顕微鏡３００によるタイムラプス取込実行中であるか否かを判定する（ステップＳ１０２）。この判定は、パソコン６１０に格納されているタイムラプスのタイムスケジュール等を参照して行われる。実行中でなければ（ステップＳ１０２：Ｎｏ）、ステップＳ１０５に移行する。実行中であれば（ステップＳ１０２：Ｙｅｓ）、観察している現在位置の取込みが終了しているか否かを判定する（ステップＳ１０３）。すなわち、１点のみの観察でもよいが、多点タイムラプス観察において、同一の標本容器４２０中の培養細胞に関して、複数位置の観察が指定されている場合の観察中の位置についての判断である。取込みが終了していなければ（ステップＳ１０３：Ｎｏ）、終了するまで待機する。現在位置の取込みが終了すれば（ステップＳ１０３：Ｙｅｓ）、後続のタイムラプス取込処理を一旦中断させる（ポーズ）（ステップＳ１０４）。すなわち、タイムラプス取込モード実行中において、薬液操作のための割込みを行う。

タイムラプス観察においては、同一位置での観察取込であっても、例えば対物レンズ４２０のフォーカス位置を変えて撮影したり、倍率を変えて撮影したり、培養細胞に対する照明光を変えて撮影したりするため、時間のかかる処理となる。そこで、本実施の形態では、多点タイムラプス観察における残りの撮影位置についての取込みが完了していなくても、薬液操作に関して操作者が薬液投与等を行いたいタイミング（例えば、細胞***のタイミング）を優先させるために、このような割込み処理を行うものである。また、観察中の現在位置の取込み完了まで待機するのは、この位置での観察条件が途中で変わるのを避けるためである。

薬液操作のための割込み処理においては、まず、水平移動機構５００を駆動制御し、指定された標本容器４２０を薬液操作位置Ｐ２に移動させる（ステップＳ１０５）。すなわち、回転軸Ｐ０を中心としてモータ５０２により標本トレー４００を回転させて指定された標本容器４２０を薬液操作位置Ｐ２付近まで移動させ、さらに、リニアモータ５０４により標本トレー４００をＸ方向に寸法ｄ（７ｍｍ）だけ直線移動させて指定された標本容器４２０を薬液操作位置Ｐ２に位置付ける。この状態で、指定された標本容器４２０に対応する突起４４４が伝達部材４４６の斜面４５４ａに接触するピン駆動開始位置となる。

そこで、回転軸Ｐ０´を中心としてリニアモータ５０４により標本トレー４００をさらに所定量直線移動させることで、突起４４４によって伝達部材４４６が作動し、斜面４５６によってピン４４２が上昇し上蓋４２６を開放させる（ステップＳ１０６）。この場合のモータ５０２による標本トレー４００の直線移動量や移動速度は、薬液操作の指示時に指定された開放量、開閉速度となるように制御する。開放量や開閉速度が指定されていない場合には、標本トレー４００の直線移動量や移動速度はデフォルト値となるように制御する。

これにより、図２に示すように、薬液操作位置Ｐ２に位置する指定の標本容器４２０に対する薬液操作が可能となる。そこで、操作者は内扉１０８の操作開口１０８ａを介して指定の標本容器４２０に対してピペット１２０を用いて薬液投与、溶液攪拌、培地交換等の必要な薬液操作を行う。なお、ピペット１２０を操作開口１０８ａに装填しておき、自動的に薬液操作を行わせるようにしてもよい。

指定された標本容器４２０に対する薬液操作が完了した旨がパソコン６１０を通じて通知されると（ステップＳ１０７：Ｙｅｓ）、薬液操作情報をパソコン６１０上のデータベースに記憶させるか否かを判定する（ステップＳ１０８）。この判定は、パソコン６１０を通じた操作者の指示に基づいて行われる。記憶させる旨の指示があった場合には（ステップＳ１０８：Ｙｅｓ）、操作時間、標本容器番号、薬液の種類、操作の種類等の薬液操作情報をパソコン６１０側に送信させてデータベースに記憶させる（ステップＳ１０９）。このような薬液操作情報をタイムラプス観察により取込んだタイムラプス画像とともにデータベースに記憶させておくことにより、パソコン６１０上でのタイムラプス画像のレビュー時に、薬液操作した状況（操作時点、実験条件等）を把握することが可能となる。

引き続き、水平移動機構５００を駆動させて標本トレー４００を逆方向に移動させ、ピン４４２を下降させることで指定された標本容器４２０の上蓋４２６を自重で閉塞させる（ステップＳ１１０）。すなわち、ステップモータ５０２により標本トレー４００をＸ方向に直線移動させた分、逆方向に直線移動させて、標本トレー４００を回転軸Ｐ０の位置に戻す。この場合のモータ５０２による標本トレー４００の戻し移動速度は、薬液操作の指示時に指定された開閉速度となるように制御する。開閉速度が指定されていない場合には、標本トレー４００の戻し移動速度はデフォルト値となるように制御する。

そして、薬液操作が指定された他の標本容器４２０があるか否かを判定し（ステップＳ１１１）、あれば（ステップＳ１１１：Ｙｅｓ）、ステップＳ１０５以降の割込み処理を続行させる。指定された他の標本容器４２０がなければ（ステップＳ１１１：Ｎｏ）、一時中断していたタイムラプス取込みを再開させる（ステップＳ１１２）。再開させたタイムラプス取込みは、タイムラプス取込モードの処理が完了するまで継続させる（ステップＳ１１３）。

このように、本実施の形態の培養観察装置１００によれば、所望の標本容器４２０に対する薬液操作に際しては、ヒンジ式の開閉蓋４２２を備える複数の標本容器４２０を保持した標本トレー４００を、指定された所望の標本容器４２０が薬液操作位置Ｐ２に位置付けられるように水平移動機構５００によって観察可能軌跡の範囲を超えるように移動させ、この標本トレー４００の移動に連動する蓋開閉機構４４０によって開閉蓋４２２の上蓋４２６を自動的に開閉させ、その薬液操作位置Ｐ２で操作開口１０８ａから薬液操作を行えばよく、よって、タイムラプス観察にも用いる水平移動機構５００による標本トレー４００の移動範囲を切換えるだけの簡単な構成・制御で所望の標本容器４２０の上蓋４２６を自動的に開閉させることで培養空間２０２内の環境変化を極力抑制しつつ、タイムラプス観察方式に併用して所望の標本容器４２０に対する薬液操作を行うことができる。

また、本実施の形態によれば、薬液操作の指示時に上蓋４２６の開放量や開閉速度の指定も可能であるので、操作内容、操作者の要求等に応じた対応が可能となる。例えば、薬液操作が薬液を投与するだけの場合であれば、上蓋４２６の開放量を少なめに指定することで、薬液投与を支障なく行えるとともに、上蓋４２６が開放された標本容器４２０内への雑菌等の侵入を極力防止して標本容器４２０内の環境変化を少なくすることができる。一方、薬液操作が溶液を攪拌するピペッティングや培地交換の場合であれば、上蓋４２６の開放量を大きめに指定することにより、上蓋４２６開放時の開放空間を大きくすることで、操作性を向上させることができる。このような開放量の指定は、同一の標本容器４２０に対する薬液操作の指示時であっても、その時期によって異ならせることができる。同一の標本容器４２０に対する薬液操作であっても、例えば１回目は単なる薬液投与であるが、長期経過時には培地交換を行うような場合があるためである。また、上蓋４２６の開閉時に標本容器４２０内の培地に振動を与えたくない状況であれば、上蓋４２６の開閉速度を遅めに指定することで、衝撃の少ない上蓋４２６の開閉が可能となる。一方、標本容器４２０内の環境変化を抑えたい場合には、上蓋４２６の開閉速度を速めに指定することで、上蓋４２６を短時間で開閉させ、開放時間を短縮させることで対応できる。

本発明は、上述した実施の形態に限らず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲であれば、種々の変形が可能である。例えば、蓋開閉機構は、図示例の伝達部材４４６を用いた蓋開閉機構４４０に限らず、図７に示すような蓋開閉機構４６０であってもよい。この蓋開閉機構４６０は、ピン４４２と、各ピン４４２に対応させて標本トレー４００の裏面に取り付けられた板ばね部材４６２と、副筐体１０６の表面上の薬液操作位置Ｐ２付近の特定位置に設けられた１つの突起状部材４６４とからなる。板ばね部材４６２は、長手方向が回転移動する標本トレー４００の回転円周方向と一致するように配設されて、一端が標本トレー４００の裏面側に固定され、他端側はピン４４２の下端を受けつつ通常状態ではこのピン４４２が自重で降下しているように斜面４６２ａを有する状態で設けられている。突起状部材４６４は、通常の観察時の標本トレー４００の観察可能軌跡の範囲内の移動では板ばね部材４６２に干渉しないが、指定された標本容器４２０を回転移動、直線移動により薬液操作位置Ｐ２に位置付けたときに図７（ａ）に示すように板ばね部材４２６の固定側に干渉可能となる位置に設定されている。そして、指定された標本容器４２０を薬液操作位置Ｐ２に位置付けた後、さらに標本トレー４００をＸ方向に直線移動させることで、突起状部材４６４が板ばね部材４６２の斜面４２２ａを順次押し上げることで、図７（ｂ）に示すように、ピン４４２を押し上げて上蓋４２６を開放させるものである。

また、本実施の形態では、多点タイムラプス観察の場合であっても、観察中の現在位置でのタイムラプス画像の取込みが完了した時点で、薬液操作のための割込み処理を開始させるよう開放動作の開始タイミングを決定するようにしたが、タイムラプス観察と薬液操作との優先度によっては、観察位置Ｐ１に位置付けられた標本容器４２０中の培養細胞に関して設定された全ての観察位置でのタイムラプス画像の取込みが完了してから、薬液操作のための割込み処理を開始させるよう開放動作のタイミングを決定してもよい。さらには、薬液操作の指示があった時点では、タイムラプス画像の取込み中ではないが、予め設定されているタイムラプス観察のタイムスケジュールを参照することで、直後にタイムラプス画像の取込みが開始される場合であって、タイムラプス観察を優先させたい場合には、このタイムラプス画像の取込みが完了してから、薬液操作のための割込み処理を開始させるよう開放動作のタイミングを決定してもよい。

さらに、移動手段も、Ｘθステージを構成する水平移動機構５００に限らず、例えばＸＹステージを構成する水平移動機構であってもよい。

本発明の実施の形態にかかる培養観察装置の全体構成例の概略を示す縦断正面図である。 培養装置の一部を拡大して示す概略縦断側面図である。 標本トレー周りの構成例を示す分解斜視図である。 蓋閉塞状態を示す斜視図である。 蓋開放状態を示す斜視図である。 タイムラプス取込モード実行中の薬液操作の割込み制御例を示す概略フローチャートである。 蓋開閉機構の変形例を示す概略斜視図である。

符号の説明

１００ 培養観察装置
１０８ａ 操作開口
２００ 培養装置
２０２ 培養室
３００ 顕微鏡
４００ 標本トレー
４２０ 標本容器
４２２ 開閉蓋
４２４ ヒンジピン
４４０ 蓋開閉機構
４６０ 蓋開閉機構
５００ 水平移動機構
６００ コントローラ

Claims (6)

1. 培養細胞を培養しながら観察するための培養観察装置であって、
   環境が管理されて培養細胞を培養する培養空間を形成し、一部に操作開口が形成された培養装置と、
   前記培養空間内に収容されて、培養細胞と培地を収容しヒンジ式の開閉蓋で閉塞された複数の標本容器を位置決めして保持する標本トレーと、
   待機期間を挟んで光軸上の観察位置に順次位置付けられる前記標本容器中の培養細胞を断続的に観察する顕微鏡と、
   前記標本トレーを前記顕微鏡の光軸に直交する平面に沿って２次元的に移動させる移動手段と、
   前記顕微鏡による観察可能軌跡の範囲外に設定された前記操作開口から操作可能な薬液操作位置に、薬液操作が指定された任意の前記標本容器を位置付けるための前記移動手段による前記標本トレーの移動に機械的に連動して、該標本容器の前記開閉蓋を自動的に開閉する蓋開閉機構と、
   前記標本容器の指定を伴い薬液操作が指示されたとき前記蓋開閉機構を動作させるために前記移動手段を制御する蓋開閉制御手段と、
   を備えることを特徴とする培養観察装置。
2. 前記蓋開閉制御手段は、指定された任意の前記標本容器の前記蓋開閉機構による前記開閉蓋の開放に先立ち、前記顕微鏡による観察状況を確認して開放動作の開始タイミングを決定することを特徴とする請求項１に記載の培養観察装置。
3. 前記蓋開閉機構は、観察可能軌跡の範囲を超える前記標本トレーの移動量に応じて前記開閉蓋の開放量が可変自在であり、
   前記蓋開閉制御手段は、薬液操作の指定時に設定された前記開閉蓋の開放量となるように観察可能軌跡の範囲を超える前記移動手段による前記標本トレーの移動量を制御することを特徴とする請求項１または２に記載の培養観察装置。
4. 前記蓋開閉機構は、観察可能軌跡の範囲を超える前記標本トレーの移動の速度に応じて前記開閉蓋の開閉速度が可変自在であり、
   前記蓋開閉制御手段は、薬液操作の指定時に設定された前記開閉蓋の開閉速度となるように観察可能軌跡の範囲を超える前記移動手段による前記標本トレーの移動の速度を制御することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の培養観察装置。
5. 前記蓋開閉機構は、前記標本トレーの移動に連動して前記光軸方向に上下動するピンにより、該標本容器の前記開閉蓋を開閉することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の培養観察装置。
6. 前記蓋開閉機構は、前記標本トレーの直線移動に連動して前記ピンを前記光軸方向に押し上げる伝達部材を有する請求項５に記載の培養観察装置。

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