JP5240965B2 - 硫酸化糖脂質の分析方法及び装置 - Google Patents
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フィルターを用いた粒子逸脱防止手法では、急激な圧力変化に伴い、膜からの粒子の離脱やフィルターを通して粒子の流出も見られるため、高流速で使用することは不可能である。そのため、本目的である生体中の微量成分の前処理時間の短縮はなし得がたい。
上記の如く、フィルター内部に処理時に用いる溶液や、溶出時の目的成分が残存してしまうことが多い。特に、微量な目的成分の抽出時の溶出液の残存は、目的成分の大幅なロスになってしまう。これを解決するためには、溶出するに十分な溶液量を加えることにより可能であるが、溶出液の増量は試料の希釈を意味し、これは、後の検出操作での感度の低下をもたらす原因となるため、本目的である生体中の微量成分の精製には適していない。
また、前処理溶出溶液量が多くなってしまうと、溶出された成分にさらに処理を行う場合、更に濃縮する必要が生じてしまい、上記のような現象が起きるので現実的に使えない。
微量生体試料から、硫酸化糖脂質成分だけを選択的に精製する工程と、さらに精製された硫酸化糖脂質成分をリゾ体化し、リゾ体化により生じた不純物を除去する工程より成ることを特徴とする硫酸化糖脂質の分析方法。
疎水性相互作用:水分子と親和性の少ない非極性基が水溶液中で互いに集まろうとする相互作用のこと。
本発明においては、生体試料から種々の処理を施して抽出した脂質類には、目的物質である脂質類(非極性物質)の他に、元来の試料中に含まれていた極性物質や抽出工程に添加した塩類(極性物質)が多量に存在している。これらの混合物から、脂質類のみを精製するためには、脂質類と同様の非極性物質であるアルキル鎖(例えば、オクダデシル基)などを修飾した固相抽出剤に試料溶液を接触させることにより、脂質類をアルキル鎖(固相)に吸着させた後、塩類などの非極性物質を洗い流し、吸着されていた目的成分(脂質類)を溶出することで、精製としている。
そこで、本発明では、表面積の増大に伴った通液抵抗の上昇や、固相内容量の増大を最小限に抑えることのできる構造である「3次元網目構造の貫通孔を有した単一の構造物」で、かつ「アルキル鎖などの非極性官能基を容易に修飾できる物質特性」を持つモノリス構造体を使用した。
更に、このモノリス構造体は強度が高いため、液体を往復して通液させる工程を繰り返す方法をとることが可能である。この方法を用いることにより、固相抽出の対象物質を含む溶液が少量の場合でも、固相抽出剤と溶液の接触回数が多くなり、希釈されず、高効率に精製できる。
基本的には、スルーポア径が小さいほど、接触面積が増えるが、液体を流す際の通液抵抗も上昇する。市販の手動ピペッターを用いる場合には、出し入れの液抵抗から10μm〜30μm程度のスルーポアが望まれる。本目的に応じた自動化装置では、ポンプなどを用いた通液が可能であるため、より高い通液抵抗が生じても使用可能であるため、3μm〜15μm程度とスルーポアを小さくし、接液面積を大きくすることが可能である。
即ち、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシランなどを単独または混合してから行うゾル‐ゲル合成によるモノリスやケイ素水酸化物、ケイ酸塩などによる焼成ガラスをエッチングして作るモノリス構造体などが適している。
例えば、硫酸化糖脂質の一種であるスルファチドSM4s(d18:1−C24:0h)(図2A)と、スルファチドSM4s(t18:0−C24:1)(図2B)は、二重結合の位置及び水酸化修飾の位置が異なるにも関らず、組成式はともにC48H93NO12Sとなり、モノアイソトピックで計算した分子量は907.6、MALDI・TOF・MSのネガティブモードで測定し検出される脱プロトン分子のm/zは906.6と全く同じである。つまりは、このような分子種の判別は、生体内から抽出・精製された硫酸化糖脂質をそのまま質量分析計を用いて分析するのでは区別することができない。
しかし、この同一分子量を示す硫酸化糖脂質を化学処理し、脂肪酸部分を切り離し、リゾ体化することにより、二重結合及び水酸化修飾の違いにより、分子量に差異が生じ、分子種を同定することが可能である。
このように、生体試料から抽出されたままの硫酸化糖脂質の質量分析結果と、それを化学処理したものの質量分析結果を比較することにより、硫酸化糖脂質の異性体(分子)を正確に判別することが可能である。
硫酸化糖脂質のような微量成分を、MALDI・TOF・MSを用いて上記方法に則り分析する場合、その感度はMALDI・TOF・MS分析の前処理にあたる脱塩操作(難イオン化塩の除去)の如何に依存する。即ち、イオン化を容易ならしめる工程が非常に重要である。
本発明に於ける硫酸化糖脂質の場合では、異性体間の分離が重要で、化学結合基を導入し易いシラノール基を持つシリカゲルなどが有効である。
(1) 微量生体試料(生体組織、血液、体液等)からの総脂質画分の分離
(2) 総脂質画分から、硫酸化糖脂質を豊富に含む画分の分離
(3) 硫酸化糖脂質画分の選択的な精製(MALDI・TOF・MS分析の前処理)
(4) 硫酸化糖脂質画分の一部をMALDI・TOF・MSによる質量分析
(5) (4)の硫酸化糖脂質画分の化学処理によるリゾ硫酸化糖脂質への分解
(6) リゾ硫酸化糖脂質の塩などの不純物除去(MALDI・TOF・MS分析の前処理)
(7) リゾ硫酸化糖脂質のMALDI・TOF・MSによる質量分析
(8) (4)、(7)の質量分析結果からの硫酸化糖脂質の同定
上記行程(3)、(6)のMALDI・TOF・MS分析の前処理においては、本方法を用いる。本方法に用いる処理剤としては、主として硫酸化糖脂質の抽出過程で含まれた難イオン化性の塩の脱塩能力を持ち、微量な目的成分の処理過程での希釈を最小限に抑え、濃縮効果を持ち、かつ迅速・簡便に操作することができるものが望ましい。この条件を満たすものとして、例えばシリカゲル等の無機系材料を用いた多孔質体で、望ましいのは1μmから100μm以下の貫通孔を有し、nmサイズの細孔(メソポア)を有する二重細孔構造に形成したモノリス構造体であり、これに更にアルキル鎖を化学結合により修飾したものが使用される。又、これらモノリス構造体を汎用ピペッター用のピペットチップ内に嵌合した硫酸化糖脂質分析用前処理材を用いた。
上記行程(8)では、(7)で得られた、リゾ体の情報を基に、(4)で得られた結果から、脂肪酸の構造を同定する。
結果を図3に示す。図3のとおり、10〜40mgという微量な生体試料中からの抽出・精製物の一部だけを用いてスルファチドSM4S(図3A)、SM3(図3B),SM2(図3C)を検出することが出来た。
結果を図4に示す。図4のとおり、リゾスルファチドSM4S(図4A)、SM3(図4B)、SM2(図4C)を検出することが出来た。
SM4S:sulfated galactosylceramide(図5A)
SM3:sulfated lactosylceramide(図5B)
SM2:sulfated gangliosylceramide(図5C)
強度の高いピークとして、SM4Sでは878.6、892.6、906.6が(図3A)、SM3では、1042.7、1056.7、1070.7が(図3B)、SM2では1245.8、1259.8、1273.8が(図3C)それぞれ検出された。それぞれのグループ内でm/zは、それぞれ14.0ずつ異なっており、これはメチレン(‐CH2‐)一単位の差に値する。
加えて小さなピークとして、SM4Sでは850.6、862.6、890.6、924.6が(図3A)、SM3では、996.6、1014.6、1024.6、1052.7、1084.7が(図3B)、SM2では1199.7、1217.7、1227.7、1255.8、1271.8、1287.8が(図3C)それぞれ検出された。
このような関係が、892.6(SM4s)と1056.7(SM3)、906.6(SM4s)と1070.7(SM3)の間でも見られる。
一方、それぞれのマイナーなピークを比較すると、890.6(SM4s)と1052.7(SM2)の差は、162.1となり、1052.7(SM3)と1255.8(SM2)の差は203.1となる。このことは、スルファチドが同一のセラミドを持つことを示している。これと同様の関係が、862.6(SM4s)/1024.6(SM3)/1227.7(SM2)でも見られる。
SM4sの分析結果(図3A)と比較すると、図3Aのメジャーピークである878.6、892.6、906.6は、それぞれd18:1−C22:0h、d18:1−C23:0h、d18:1−C24:0hに当てはまる。SM4sの分析結果のマイナーピークである850.6、862.6、924.6は、d18:1−C20:0h、d18:1−C22:0,t18:0−C24:0hが当てはまる。
同様に、従来固相を用いて、0.5〜1gの試料を用いて行った結果では、同様な結果が得られたが、50分の1濃度では、MALDI・TOF・MSでSM3は全く検出できなかった。又、SM4s、SM2に於いては、検出可能ではあったが、モノリス構造体を用いた場合と比して検出強度は低く、特にSM2の同定は困難であった。
本方法を用いることによって、微量のスルファチドが検出でき、構造から同定も可能となった。
この全自動分注システムは、専用チップの脱着機能を持ち、任意の液量を吸引、吐出可能な分注プローブチャンネルを有した複数のアームと、様々な形状の容器を搭載できる容器キャリアーを持ち、シーケンスプログラムを作成することにより、溶液の分注、移送、混合などの様々な工程を自動化することが可能である。
尚、本目的のためには、専用チップにオクタデシル基を修飾したモノリス構造体を融着したものを作製し、使用した。
使用する試薬
メタノール:蒸留水=2:8(以下「C液」という)
メタノール
蒸留水
を事前にキャリアーに用意しておく。
この蒸発乾固したペレットを自動分注システムMicrolab(登録商標)STARのサンプル用ラックにセットした。
1.分注プローブチャンネルにHigh volume Tips(5μl〜1000μl用)を装着し、C液の入った試薬キャリアーに移動し、300μlを吸引する。
2.セットしたサンプルに移動し、溶液を吐出し、サンプル容器内で吸引、吐出を5回繰り返しペレットを溶解させる。
3.分注プローブチャンネルにモノリス構造体を融着した専用チップ(オクタデシル基を化学修飾)を装着させる。
4.メタノールの入った試薬キャリアーに移動し、200μlを吸引し、廃液ポートにて吐出させる。
5.蒸留水の入った試薬キャリアーに移動し、200μlを吸引し、廃液ポートにて吐出させる。
6.C液の入った試薬キャリアーに移動し、200μlを吸引し、廃液ポートにて吐出させる。
7.サンプル用ラックに移動し、上記2.で調製したサンプル溶液内にチップを挿入し、200μlの吸引、吐出工程を3回繰り返させる。
8.蒸留水の入った試薬キャリアーに移動し、200μlの蒸留水を吸引し、廃液ポートにて吐出させる。
9.メタノールの入った試薬キャリアーに移動し、200μlのメタノールを吸引し、新しいサンプル用溶液チューブに移動し、吸引した溶液の吸引、吐出を3回繰り返す。
10.上記9.の溶液を遠心エバポレーターでメタノールを除き、硫酸化糖脂質画分を得る。
Claims (3)
- 骨格の主成分がシリカであり、かつアルキル基を結合させた、難イオン化塩の除去能力を有する3次元網目構造の貫通孔及び細孔を持つモノリス構造体を通じて、10〜40mgの微量生体試料を吸引し吐出する操作を繰り返すことにより、前記微量生体試料から難イオン化塩を除去して硫酸化糖脂質成分だけを選択的に精製し、該精製により得られた硫酸化糖脂質成分をMALDI・TOF・MSで分析することを特徴とする硫酸化糖脂質の分析方法。
- 前記精製により得られた硫酸化糖脂質成分をリゾ体化し、3次元網目構造の貫通孔及び細孔を持つモノリス構造体を通じて、リゾ体化された硫酸化糖脂質成分を吸引し吐出する操作を繰り返すことにより、前記リゾ体化された硫酸化糖脂質成分から難イオン化塩及び極性低分子夾難物を除去してリゾ硫酸化糖脂質成分を得て、得られたリゾ硫酸化糖脂質成分をMALDI・TOF・MSで分析することを特徴とする請求項1に記載の硫酸化糖脂質の分析方法。
- 前記硫酸化糖脂質成分をMALDI・TOF・MSで分析することで得られた該硫酸化糖脂質成分の分子量と、前記リゾ硫酸化糖脂質成分をMALDI・TOF・MSで分析することで得られた該リゾ硫酸化糖脂質成分の分子量の差異を対比することにより、前記微量生体試料中の硫酸化糖脂質の異性体構造を同定することを特徴とする請求項2に記載の硫酸化糖脂質の分析方法。
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