JP5237126B2 - ライゲーションアッセイを用いてハイスループットシークエンスに基づき遺伝子関連配列を検出する方法 - Google Patents
ライゲーションアッセイを用いてハイスループットシークエンスに基づき遺伝子関連配列を検出する方法 Download PDFInfo
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Description
工程(b)は、第1のプローブ及び第2のプローブを標的配列とハイブリダイズさせ、
工程(c)は、上記第1のプローブ及び第2のプローブの標的特異的区間がそれぞれ、標的配列上の本質的に隣接する区間とハイブリダイズし、それによりライゲートしたプローブが得られる、ハイブリダイズする場合の、第1のプローブ及び第2のプローブをライゲートし、
工程(d)は、任意選択で、ライゲートしたプローブを第1のプライマー及び第2のプライマーで増幅する工程であって、単位複製配列が得られ、
工程(e)は、ライゲートしたプローブ又は単位複製配列をハイスループットシークエンシング技術に付す工程であって、ライゲートしたプローブ又は単位複製配列の識別子配列を少なくとも含む、ヌクレオチド配列の少なくとも一部を求める、ハイスループットシークエンシング技術に付し、
工程(f)は上記工程(e)のヌクレオチド配列中の識別子配列の有無を判定することによって、試料中の標的ヌクレオチド配列の存在を同定する。
その最広義において、標的配列は対象とする任意のヌクレオチド配列であり得る。標的配列は、例えば、或る特定の病気(aliment)又は遺伝子構造(genetic make up)又は疾患を示すか、これに関連するか、又はこれを表すので、標的配列の判定/検出が望まれる任意の配列であり得る。標的配列は、好ましくは、多型を含有するか、表すか、又はこれに関連するヌクレオチド配列である。本明細書における多型という語は、或る集団において、二つ以上の遺伝的に求められる代替的な配列又はアレルが生じることを指す。多型マーカー又は部位は、配列分散が生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは、少なくとも二つのアレルを有し、それぞれ選択集団の1%を超える頻度で、より好ましくは、10%又は20%を超える頻度で生じる。多型遺伝子座は一つの塩基対と同じくらいの小ささであり得る。
核酸試料において、標的を含む核酸は対象とする任意の核酸であり得る。試料中の核酸は通常DNAの形態ではあるが、試料中に含有されるヌクレオチド配列情報は、例えば、RNA(RiboNucleic Acid)、ポリA+RNA、cDNA、ゲノムDNA、ミトコンドリア若しくは葉緑体DNA等のオルガネラDNA、合成核酸、DNAライブラリ(BAC(細菌人工染色体)ライブラリ/プールされたBACクローン等)、クローンバンク、又はそれらの任意の選択若しくは組合せを含む、核酸の任意の供給源由来であり得る。核酸試料中のDNAは二本鎖、一本鎖、及び一本鎖DNAに変性された二本鎖DNAであり得る。二本鎖配列の変性により二つの一本鎖断片が生じ、その一方又は両方はそれぞれの鎖に対して特異的なプローブによって分析され得る。好ましい核酸試料は、cDNA、ゲノムDNA、制限断片、アダプタとライゲートした制限断片、増幅したアダプタとライゲートした制限断片、AFLP(登録商標)断片、又はAFLP(登録商標)鋳型の前増幅で得られる断片上の標的配列を含む。
試料は、二つ以上の異なる標的配列を含有することが好ましい。即ち、二つ以上とは、試料中の標的配列の量ではなく同一性を指す。特に、試料は、少なくとも二つの異なる標的配列、特に、少なくとも100個、好ましくは少なくとも250個、より好ましくは少なくとも500個、より特に好ましくは少なくとも1000個、好ましくは少なくとも2500個、より好ましくは少なくとも5000個、また最も好ましくは少なくとも10000個のさらなる標的配列を含む。実際には、分析され得る試料中の標的配列の数は、とりわけ、検出され得る単位複製配列の数によって制限される。現在利用されている検出方法では、比較的多数の標的配列が可能である。
標的配列と相補的なオリゴヌクレオチドプローブの区間は、試料中の各標的配列に対して、一対の第1のプローブ及び第2のプローブが提供されることにより、プローブがそれぞれ、標的配列の一部と相補的な末端の区間(それぞれ、標的配列の第1の部分及び第2の部分)を含有し、且つ好ましくは、標的配列の対応する相補的部分が互いに本質的に隣接して位置するように設計される。
「パドロック(Padlock:南京錠)」
本発明の或る特定の実施形態では、環化可能プローブ又はパドロックプローブを使用し得る。この場合、第1のプローブ及び第2のプローブを一つのプローブに組み合わせる。環化可能なプローブは、標的配列とアニーリングした場合、及びライゲートした場合に、標的配列にトポロジー的にロックされた環状構造を有する直鎖オリゴヌクレオチドである。或る特定の実施形態では、ライゲーション工程後、且つ増幅、好ましくはPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)増幅前の試料のエキソヌクレアーゼ処理は、任意のライゲートしていない環状プローブを除去し、且つ任意のライゲートしていないプローブが増幅しないようにする働きがある。環化可能なプローブ自体は、例えば、特許文献13(欧州特許第745140号公報)、又は非特許文献2(Van Eijk et al, Nucleic Acids Research, 2004, 32, e47)により、当該技術分野において既知である。既知のプローブは一般的に、ローリングサークル増幅、又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅され、コンカテマーを生じる。さらに、既知の環化可能なプローブにおけるプライマー結合部位は、環化したプローブ全体が、任意の標的特異的区間を含んで増幅されるように配向される。PCR増幅の間、コンカテマー産物を回避するために、特許文献33(国際公開第WO03/052142号公報)に記載された種類の二つのプライマー結合部位の間のライゲーションプローブに、ブロック修飾を組み込み得る。
或る特定の実施形態では、検出すべき各所定の標的配列に対して、好ましくは少なくとも、二つのプローブの対が、対になった各プローブが標的配列の一部とハイブリダイズすることが可能であり、且つ対になったそれぞれのプローブがさらに、両方のプローブが互いにハイブリダイズすることが可能であるように、対になった他のプローブの対応区間と相補的な区間をそれぞれ含むように設計される。対になった二つのプローブは、互いにハイブリダイズする場合、それぞれが標的配列にもハイブリダイズすることが可能であるように設計される。互いにハイブリダイズする場合、二つのプローブは、標的ヌクレオチド配列を検出するためのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイで使用される場合は、パドロックプローブを模擬するか、又はパドロックプローブとして作用する一方、その後の増幅工程及び検出工程においては、プローブは直鎖ライゲーション産物として機能する。この種のプローブは「キーロック」と呼ばれており、とりわけ、特許文献30(国際公開第WO2004111271号公報)に開示されている。
「Tm(℃)=4×G/C+2×A/T−5」
ここで、「G」,「C」,「A」,「T」は、オリゴマーでのグアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)、チミン(T)それぞれのクレオチドの数である。
本発明の或る特定の実施形態では、特許文献31(国際公開第WO2005/021794号公報)に記載されている一組のプローブを使用する。標的配列を第1のプローブ及び第2のプローブに接触させるが、ここで、第1のプローブは、標的配列と相補的な第1の標的特異的区間を含有し、且つ第1のプローブは、好ましくは任意選択の第1のタグ区間中に第1のプライマー結合配列を含有しない。第2のプローブは、第2の標的特異的区間及び第2のタグ区間を含有するが、ここで、第2のタグ区間は第2のプライマー結合配列を含有する。第2のタグ区間は、第2のプライマー結合配列と第2の標的特異的区間との間に識別子を含有し得る。二つのプローブのハイブリダイゼーション及びライゲーションの後、又はそれと同時に、第1の標的特異的区間(の一部)とハイブリダイズすることが可能な区間を含有し、且つプライマー結合区間を含有する区間をさらに含有する複合プローブが得られる。複合プローブは、ライゲートした第1のプローブ及び第2のプローブとハイブリダイズする。ライゲートした第1のプローブ及び第2のプローブに沿った複合プローブの伸長により、第1のプライマー結合部位及び第2のプライマー結合部位と結合し得る第1のプライマー及び第2のプライマーを使用して続けて増幅され得る伸長した複合プローブが得られる。得られた単位複製配列は、本明細書中に記載のハイスループットシークエンシング技術を使用して検出することができ、試料中の標的配列は、識別子の有無によって同定され得る。
或る特定の実施形態では、特許文献32(国際公開第WO2005/118847号公報)に記載されている一組のプローブを使用する。本実施形態では、標的配列を第1のプローブ及び第2のプローブに接触させる。第1のプローブは、第1の標的特異的区間を含有し、好ましくはそれから構成される。即ち、第1のプライマー結合配列を含み得る第1のタグ区間を含有しない。第1の標的特異的区間は、好ましくは潜在的なライゲーション点から遠位の末端に、ビオチン等のエキソヌクレアーゼ、又はホスホロモノチオエート、ホスホロジチオエート及びホスホロアミデート修飾等の修飾ヌクレオチド、並びにPNA(ペプチド核酸)及びLNA(ロックト核酸)に対してプローブを耐性にする手段を含有し得る(また、この点に関してより詳細には、特許文献32(国際公開第WO2005/118847号公報)を参照されたい)。第2のプローブは、第2の標的特異的区間及び第2のタグ区間を含有する。第2のタグ区間は、典型的には第1のプライマー結合配列及び第2のプライマー結合配列、並びに間欠的に位置する識別子を含有する。
タグ区間という用語は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが不可能なプローブの部分を指すために使用される。通常、タグ区間は、識別子及びプライマー結合部位を含有し、場合によっては、本明細書中の他の部分で概説するように、クランプ区間を含有する。
線形的であれ指数的であれ、プライマー結合配列をプローブに組み込むことにより、増幅を容易にすることができる。プライマー結合部位は、好ましくは、標的特異的区間以外のプローブ部分、好ましくは、標的配列と本質的に非相補的なタグ区間に位置する。プライマー結合部位は、プライマーに結合して、プライマー伸長又は増幅を開始させることが可能である。好ましくは、プローブ対群の中で、プライマー結合部位は普遍的である。即ち、プライマー結合部位の所定の群のみがプローブに組み込まれることにより、限られた数のプライマーからの多重プライマー伸長又は増幅が可能になる。このプライマーは、例えば、AFLP(登録商標)(特許文献39「欧州特許第0534858号公報」参照)から既知であるような、3ダッシュ末端に一つ又は複数の選択的塩基を含むプライマーである。プローブ対群の間では、プライマー結合部位は異なり得る。或る特定の実施形態では、異なるプライマー結合部位に結合することが可能なプライマーの「Tm」は、プローブ対群の間で異なり得る。
或る特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブはさらに、識別子又は識別子配列を含む。識別子配列は、可変配列のオリゴヌクレオチド配列である。識別子の長さは1〜30ヌクレオチド、好ましくは2〜20ヌクレオチド、より好ましくは3〜10ヌクレオチド、最も好ましくは4〜6ヌクレオチドで変化する。識別子は独自の配列である。独自の特徴は、非特許文献4(Iannone et al. Cytometry, 2000, 39: pp. 131-140)によって記載される種類のZIPコード配列として説明され得る。6ヌクレオチドの識別子には、最大4096個(=46個)の独自の組合せが作製され得る。好ましくは、識別子は、3ダッシュ末端に、2塩基GC(又は他の規定の短くてGC豊富(G/C-rich)な)アンカー配列を含有して、均等な結合親和性及び増幅効率を保証する。また、明瞭な配列認識を保証するために、識別子は二つの同一連続塩基を含有しないことが好ましく、一組の識別子で使用されるすべての識別子は少なくとも二つの塩基が異なることがさらに好ましい。複数の試料を使用する場合、特異的な識別子の組を使用して、各試料を同定し得ることが好ましい。
或る特定の実施形態では、プローブを試料中の標的配列と接触してハイブリダイズさせる。続けて、オリゴヌクレオチドプローブ対を、試料中の標的配列の好ましくは隣接した相補的部分にアニーリングさせる。相補的標的配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの特異的アニーリングに関する方法及び条件は当該技術分野において既知である(例えば、非特許文献5(Sambrook and Russel「分子クローニング:実験マニュアル(第3版)」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)を参照)。通常、オリゴヌクレオチドプローブ及び標的配列の混合後、核酸を、塩緩衝液中で短時間(例えば、30秒〜5分)のインキュベーション(概して94℃〜96℃)によって変性させる。次に、変性プローブ及び標的配列を含有する試料を、プローブ及び標的配列の特異的アニーリングに最適なハイブリダイゼーション温度に冷却させる。これは通常、プローブの相補的区間(標的区間)と(標的配列における)その相補的配列との間のハイブリッドの融解温度よりも約5℃低い。対の二つのプローブのうち一つの、又は複数の標的配列を有する試料中での、非特異的又は非効率的なハイブリダイゼーションを防止するために、一つの試料内で、標的配列と相補的なプローブの区間は、試料中に存在する異なる標的配列間で同様、好ましくは同一の融解温度を有することが好ましい。
標的特異的区間が、標的配列上の相補的部分と互いに本質的に隣接してアニーリングされる、一対の第1のオリゴヌクレオチドプローブ及び第2のオリゴヌクレオチドプローブ、又は環化可能なプローブの5ダッシュリン酸基化末端及び3ダッシュ水酸基化末端はそれぞれ連結されて、当該技術分野において既知の任意の好適な手段によって共有結合を形成する。プローブの末端は、リガーゼ、好ましくはDNAリガーゼによって酵素的に連結されて、ホスホジエステル結合を形成し得る。DNAリガーゼは、相補鎖での隣接部位で結合した二つのポリヌクレオチド鎖(の末端)間のホスホジエステル結合の形成を触媒することが可能な酵素である。DNAリガーゼは通常、ATP(EC 6.5.1.1)(アデノシン三リン酸)又はNAD(EC 6.5.1.2)(ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド)を、二本鎖DNAにおけるニックを封鎖するための補因子として必要とする。
例えば、インデルの同定を対象とする、代替的な実施形態では、第1のプローブ及び第2のプローブの標的相補的区間の末端はそれぞれ、ギャップがそのままであるようにアニーリングされ得る。或る特定の実施形態では、標的ヌクレオチド配列の第1の部分及び第2の部分は隣接して位置しない。即ち、第1のプローブ及び第2のプローブの第1の標的特異的区間及び第2の標的特異的区間は、隣接して位置する標的ヌクレオチド配列の第1の部分及び第2の部分とはハイブリダイズしない。これは、例えば、とりわけ、特許文献6(米国特許第5521065号公報)並びに特許文献42〜44(欧州特許第185494号公報、米国特許第5692223号公報、及び国際公開第WO03054311号公報)に開示されている、他の様々な種類の本技術とは根本的に異なる。このギャップは、好適な(第3の)(オリゴ)ヌクレオチドで充填され、ライゲートされ得る。
本発明の方法では、当該技術分野において既知の任意の好適な核酸増幅法によって、連結プローブは増幅されて、標的ヌクレオチド配列を表す増幅された(検出可能な)連結プローブ(単位複製配列)を含む増幅試料を生成する。核酸増幅法は通常、一つ又は二つのプライマー、dNTP、及び(DNA)ポリメラーゼを利用する。好ましい増幅方法がPCRである。「PCR」すなわち「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的DNA部分のインビトロでの酵素的増幅のための迅速な手順である。増幅されるDNAは、試料を加熱することによって変性する。DNAポリメラーゼ及び過剰なデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で、標的配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは新しいDNA合成をプライムする。ポリメラーゼは、鎖置換活性を発現しないか、又は少なくとも有意に発現しないDNAポリメラーゼであることが好ましい。その例は、アンプリターク(Amplitaq:登録商標)及びアンプリタークゴールド(Amplitaq Gold:登録商標)(供給業者Perkin Elmer)、並びにアキュプライム(Accuprime:登録商標)(供給業者Invitrogen)である。1ラウンドの合成により、親鎖と同様に、変性及びアニーリングでプライマーとハイブリダイズし得る、明確な長さを有する新しい鎖が生じる。変性、アニーリング、及び合成の第2のサイクルは、別個の二本鎖産物、正確にプライマー末端間の長さを共に構成する二つの一本鎖産物を生成する。この別個の産物は、各増幅ラウンドに伴って指数的に蓄積する。約20〜30サイクルにわたって、別個の断片の何百万倍の増幅が達成され得る。
連結プローブは、プライマー結合部位に対応するプライマー対を使用して増幅される。或る特定の実施形態では、プライマー対は、一つのプライマーのみを含有し、増幅は、指数的というよりもむしろ線形的である。或る特定の実施形態では、対は、第1のプライマー結合区間とアニーリング可能であり、且つ増幅又は伸長を開始可能な第1のプライマーを含む。或る特定の実施形態では、対はさらに、第2のプライマー結合区間とアニーリング可能であり、且つ増幅又は伸長を開始可能な第2のプライマーを含む。或る特定の実施形態では、第2のプライマーは、プローブ中の第2のプライマー結合部位と同一の配列を有する。好ましい実施形態では、プライマーのうち少なくとも一つ、又は同一のプライマー対は、試料中の二つ以上の異なる連結プローブの増幅に、好ましくは、試料中のすべての連結プローブの増幅に使用される。かかるプライマーは、これらのプライマーが、対応するユニバーサルプライマー結合部位を含有するすべての連結プローブ、結果的には、ユニバーサルプライマー結合部位を含有するすべてのライゲートしたプローブの増幅をプライムすることが可能であるので、ユニバーサルプライマーと称されることが多い。
或る特定の実施形態では、本発明の増幅工程において使用されるプライマーの一つ又は複数は選択プライマーである。選択的プライマーは、本明細書中では、プローブにおけるプライマー結合部位と相補的なそのユニバーサル配列の他に、いわゆる「選択的ヌクレオチド」を含む領域を含有するプライマーと定義される。選択的ヌクレオチドを含有する領域は、ユニバーサルプライマーの3ダッシュ末端に位置する。選択的ヌクレオチドの原理は、異なる文脈、即ち、DNAフィンガープリント法ではあるが、とりわけ、特許文献50(欧州特許第534858号公報)及び非特許文献21(Vos et al., Nucleic Acid Research, 1995, vol. 23, 4407-4414)に開示されている。選択的ヌクレオチドは、プライマー結合配列に隣接して位置する(ライゲートした)プローブにおけるヌクレオチドと相補的である。選択的ヌクレオチドは概して、プライマー結合配列として描写される(ライゲートした)プローブにおける領域の一部を形成することはない。選択的ヌクレオチドを含有するプライマーは「+Nプライマー」として示され、ここで「N」はプライマーの3ダッシュ末端に存在する選択的ヌクレオチドの数を表し、「N」は好ましくは「A」、「C」、「T」、又は「G」の中から選択される。
本明細書中で使用される「単位複製配列」という用語は、連結プローブの増幅工程の産物を指す。したがって、本明細書中で使用される「単位複製配列」という用語は、増幅した連結プローブを指す。二つの標的特異的区間がリガーゼを用いて連結されるライゲーション工程の後、連結又はライゲートしたプローブは、一つ又は複数のプライマー及びポリメラーゼと組み合わされ、増幅されて、単位複製配列を生成する。ライゲートしたプローブ、プライマー、ポリメラーゼ及び/又は他のパラメータ及び変数は、増幅が結果として連結プローブの増幅した線形表現をもたらすようになっている。好ましくは、単位複製配列は、増幅した連結プローブのモノマー表現である。或る特定の実施形態では、単位複製配列は、第1のプライマー及び任意選択の第2のプライマー、並びに間に位置する識別子(複数可)のヌクレオチドを含み、好ましくはそれから構成される。本発明の各種実施形態は、この点においてさらなる詳細を提供する(図2参照)。
「HTS」と略されることの多い、ハイスループットシークエンシング又はハイスループットスクリーニングは、特に、生物学及び化学の分野に関連した科学実験用の方法である。現代のロボット工学及び他の専門化した実験ハードウェアの組合せによって、研究者は大量の試料を同時に効率的にスクリーニングすることが可能となる。
或る特定の実施形態では、シークエンシングは、上記特許文献51〜56(国際公開第WO03/004690号、同第WO03/054142号、同第WO2004/069849号、同第WO2004/070005号、同第WO2004/070007号、及び同第WO2005/003375号)(すべて454 Life Sciences名義)(これらは参照により本明細書中に援用される)に開示されている装置及び/又は方法を使用して実施されることが好ましい。記載されている技術は、1回の操作での4000万塩基のシークエンシングを可能にし、競合技術よりも100倍速く、且つ安価である。シークエンシング技術は、大まかには5工程:1)一本鎖DNA(ssDNA)のライブラリを作製するための、DNAの断片化及び特異的なアダプタのライゲーション、2)「ssDNA」のビーズへのアニーリング、油中水型マイクロリアクタにおけるビーズの乳化、及び個々の「ssDNA」分子をビーズ上で増幅させるためのエマルジョンPCRの実施、3)表面上に増幅した「ssDNA」分子を含有するビーズの選択/濃縮、4)ピコタイター(PicoTiter:登録商標)プレートにおける、DNA担持ビーズの沈着、及び5)ピロリン酸光シグナルの生成による100,000ウェルでの同時シークエンシングから構成される。以下、本方法をより詳細に説明する。
(a)アダプタと結合した断片をビーズにアニーリングする(各ビーズは単一のアダプタと結合した断片とアニーリングする)工程と、
(b)ビーズを油中水型マイクロリアクタ中で乳化させる(各油中水型マイクロリアクタは単一のビーズを含む)工程と、
(c)ビーズをウェルに充填する(各ウェルは単一のビーズを含む)工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程と、を含む。
ハイスループットシークエンシング法の一つは、非特許文献24(ソレクサ(Solexa)(英国)(www.solexa.co.uk))の技術が利用可能であり、とりわけ、特許文献57〜75(国際公開第WO0006770号公報、国際公開第WO0027521号公報、国際公開第WO0058507号公報、国際公開第WO0123610号公報、国際公開第WO0157248号公報、国際公開第WO0157249号公報、国際公開第WO02061127号公報、国際公開第WO03016565号公報、国際公開第WO03048387号公報、国際公開第WO2004018497号公報、国際公開第WO2004018493号公報、国際公開第WO2004050915号公報、国際公開第WO2004076692号公報、国際公開第WO2005021786号公報、国際公開第WO2005047301号公報、国際公開第WO2005065814号公報、国際公開第WO2005068656号公報、国際公開第WO2005068089号公報、及び国際公開第WO2005078130号公報)に記載されている。
各DNA試料に対して、30個のSNP遺伝子座(それぞれ二つのアレルを含む)を検出するように設計されたプローブセットを使用して、ライゲーション工程を実施する。増幅プライマー配列は、ソレクサハイスループットシークエンシングシステムの表面上に位置するハイブリダイズする配列に基づく。特に、P5配列(PBS2)は、TS2とハイブリダイズするプローブの5ダッシュ部分に位置する。P7配列(PBS1)は、TS1とハイブリダイズするプローブの3ダッシュ末端に位置する。
サンガーシークエンシングを使用して、増幅したライゲーション産物のシークエンス系検出を実施した。
Claims (24)
- 一つ又は複数の試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列をハイスループットで検出する方法であって、該方法が、
各標的ヌクレオチド配列に対して、第1のプローブ及び第2のプローブを提供する際、
該第1のプローブが、その3ダッシュ(3’)末端の標的特異的区間、及び前記標的ヌクレオチド配列と非相補的であり、且つ第1のプライマー結合配列を含む、第1のタグ区間を含み、
該第2のプローブが、その5ダッシュ(5’)末端の第2の標的特異的区間、及び前記標的ヌクレオチド配列と非相補的であり、且つ第2のプライマー結合配列を含む、第2のタグ区間を含み、
前記第1のタグ区間若しくは前記第2のタグ区間、又は両方が、前記第1のプライマー結合配列又は前記第2のプライマー結合配列のそれぞれと、前記第1の標的特異的区間又は前記第2の標的特異的区間のそれぞれとの間に位置する識別子配列を含有しており、
前記識別子が二つ以上の同一連続塩基を含有しない、及び/又は前記対応する識別子が、二つ以上の試料、又は二つ以上の遺伝子座/アレルの組合せに対応し、少なくとも二つの異なるヌクレオチドを含有する、
各標的ヌクレオチド配列に対して、該第1のプローブ及び該第2のプローブを提供する工程(a)と、
前記第1のプローブ及び前記第2のプローブそれぞれの前記第1の標的特異的区間及び第2の標的特異的区間を、前記標的配列とハイブリダイズさせる工程(b)と、
前記第1のプローブ及び前記第2のプローブの前記標的特異的区間それぞれを、前記標的配列上の本質的に隣接する区間とハイブリダイズする際、前記第1のプローブ及び前記第2のプローブをライゲートしてライゲートしたプローブを得る工程(c)と、
任意選択で、前記ライゲートしたプローブを増幅させて、第1のプライマー及び第2のプライマーで、単位複製配列を得る工程(d)と、
前記ライゲートしたプローブ又は単位複製配列をハイスループットシークエンシング技術に付して、該ライゲートしたプローブ又は該単位複製配列で前記識別子配列(複数可)を少なくとも含む前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を求める工程(e)と、
前記試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在を、前記工程(e)の前記ヌクレオチド配列における前記識別子配列の有無を判定することによって同定する工程(f)と、
を含むことを特徴とする標的ヌクレオチド配列のハイスループット検出方法。 - 前記第1及び第2のプローブが環化可能なプローブ(複数)で置換されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び第2のプローブ(複数)が、キーロック(Keylock)プローブであり、それぞれがクランプ区間を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第1のプローブが、第1の標的特異的区間を含有する一方、第1のプライマー結合配列を含有しない第1のプローブで置換され、且つ該第1のプローブの前記第1の標的特異的区間及びプライマー結合区間(の一部)とハイブリダイズすることが可能な区間を含有する複合プローブが提供され、且つ該複合プローブの伸長により増幅可能な伸長した複合プローブが得られる、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第1のプローブが、第1の標的特異的区間を含有し、プライマー結合配列を含有せず、且つライゲーション点から遠位にある、エキソヌクレアーゼ耐性区間を含有し、且つ前記第2のプローブが、第2の標的特異的区間、第1及び第2のプライマー結合配列、並びに間欠的に位置する識別子を含む第2のタグ区間を含有する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び前記第2のプローブが前記標的配列上の非隣接区間とアニーリングし、且つ、前記第1及び前記第2の標的特異的区間と隣接すると共に、その間にある該標的配列とアニーリングする第3のプローブが提供される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び前記第2のプローブが前記標的配列上の非隣接区間とアニーリングし、且つポリメラーゼ及びヌクレオチドを提供して該第1及び第2のプローブ間のギャップを充填する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 実行されるシークエンシングがハイスループットシークエンシングである、ことを特徴とする請求項1〜7のいずれか一つに記載の方法。
- 前記ハイスループットシークエンシングが固体支持体上で実施される、ことを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記ハイスループットシークエンシングが合成によるシークエンシングに基づく、ことを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記ハイスループットシークエンシングが、
前記ライゲートしたプローブ又は単位複製配列をビーズにアニーリングする(各ビーズは、単一のライゲートしたプローブ又は単位複製配列にアニーリングする)工程と、
前記ビーズをマイクロリアクタ中で乳化させる(各油中水型マイクロリアクタは、単一のビーズを含む)工程と、
エマルジョンPCR(ポリメラゼ連鎖反応)を実施して、ライゲートしたプローブ又は単位複製配列をビーズ表面上で増幅させる工程と、
任意選択で、増幅されたシークエンシング・アダプタ・ライゲートした断片を含有するビーズを選択/濃縮する工程と、
前記ビーズをウェルに充填する(各ウェルは単一のビーズを含む)工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程と、
を含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 前記ハイスループットシークエンシングが、
前記ライゲートしたプローブ又は単位複製配列をビーズにアニーリングする(各ビーズは、単一のライゲートしたプローブ又は単位複製配列にアニーリングする)工程と、
前記ビーズをマイクロリアクタ中で乳化させる(各油中水型マイクロリアクタは、単一のビーズを含む)工程と、
エマルジョンPCRを実施して、ライゲートしたプローブ又は単位複製配列をビーズ表面上で増幅させる工程と、
任意選択で、増幅したシークエンシングアダプタとライゲートした断片を含有するビーズを選択/濃縮する工程と、
前記ビーズをウェルに充填する(各ウェルは単一のビーズを含む)工程と、
標識した可逆性終止ヌクレオチドを使用して、前記増幅したライゲートしたプローブ又は単位複製配列の前記ヌクレオチド配列を求める工程と、
を含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 前記ハイスループットシークエンシングが、
前記ライゲートしたプローブ又は単位複製配列を、第1のプライマー及び第2のプライマー又は第1のプライマー結合配列及び第2のプライマー結合配列をそれぞれ含有する表面にアニーリングする工程と、
ブリッジ増幅を実施して、増幅したライゲートしたプローブ又は単位複製配列のクラスタ(集団)を得る工程と、
標識した可逆性終止ヌクレオチドを使用して、前記増幅しライゲートしたプローブ又は単位複製配列の前記ヌクレオチド配列を求める工程と、
を含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 前記ハイスループットシークエンシングが、
前記ライゲートしたプローブ又は単位複製配列を、第1のプライマー及び第2のプライマー又は第1のプライマー結合配列及び第2のプライマー結合配列をそれぞれ含有する表面にアニーリングする工程と、
ブリッジ増幅を実施して、増幅しライゲートしたプローブ又は単位複製配列のクラスタを得る工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程と、
を含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 前記識別子が一つの試料識別子である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記識別子が一つの遺伝子座/アレルの組合せ識別子である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記識別子が一つの試料識別子及び一つの遺伝子座/アレル識別子を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記識別子が、1〜30塩基対(bp)である、ことを特徴とする請求項1及び15〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記識別子が、2〜16bpである、ことを特徴とする請求項1及び15〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記識別子が、3〜8bpである、ことを特徴とする請求項1及び15〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記識別子が、4〜6bpである、ことを特徴とする請求項1及び15〜17のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも一つのプライマーが3’アンカー配列を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記識別子配列を、二つ以上の試料、又は二つ以上の遺伝子座/アレルの組合せに対して使用して、SNP(一塩基多型)及び/又はインデル(挿入/欠失)を含む一つ又は複数の配列及び/又は多型について該試料(複数可)の遺伝子型を同定する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ハイスループットシークエンシングに、請求項1及び15〜17のいずれかにおいて定義された識別子を含むライゲーション系アッセイを使用して、一つ又は複数の試料中の一つ又は複数の標的配列の有無を判定する、ことを特徴とする方法。
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US20080070792A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-03-20 | Roland Stoughton | Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis |
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CL2008001682A1 (es) | 2007-06-08 | 2008-12-12 | Monsanto Technology Llc | Metodos para el mejoramiento de plantas mediante el uso de informacion directa de secuencias de acidos nucleicos. |
CN101586150B (zh) * | 2008-05-23 | 2016-09-28 | 陕西佰美基因股份有限公司 | 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途 |
EP2315629B1 (en) | 2008-07-18 | 2021-12-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet libraries |
US8583380B2 (en) * | 2008-09-05 | 2013-11-12 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
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AU2010315303B2 (en) * | 2009-11-03 | 2015-08-06 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Quantitative Nuclease Protection Sequencing (qNPS) |
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WO2011066476A1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Quantalife, Inc. | Methods and compositions for detecting genetic material |
US20110195410A1 (en) * | 2009-12-07 | 2011-08-11 | Gene Check, Inc. | Compositions and methods related to solid phase sequence detection and genotyping |
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EP2534267B1 (en) | 2010-02-12 | 2018-04-11 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
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AU2012214312A1 (en) | 2011-02-09 | 2013-08-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Analysis of nucleic acids |
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US8712697B2 (en) | 2011-09-07 | 2014-04-29 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Determination of copy number variations using binomial probability calculations |
CN102344961B (zh) * | 2011-09-30 | 2015-12-09 | 北京康旭医学检验所有限公司 | 一种经济的应用大规模平行测序技术检验多目标多基因的方法 |
WO2013106807A1 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Curry John D | Scalable characterization of nucleic acids by parallel sequencing |
RS61631B1 (sr) | 2012-02-17 | 2021-04-29 | Hutchinson Fred Cancer Res | Kompozicije i postupci za preciznu identifikaciju mutacija |
US10289800B2 (en) | 2012-05-21 | 2019-05-14 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Processes for calculating phased fetal genomic sequences |
US20130310262A1 (en) * | 2012-05-21 | 2013-11-21 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Noninvasive detection of robertsonian translocations |
WO2013192292A1 (en) * | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Justin Lamb | Massively-parallel multiplex locus-specific nucleic acid sequence analysis |
CA2878280A1 (en) | 2012-07-19 | 2014-01-23 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Multiplexed sequential ligation-based detection of genetic variants |
US10059983B2 (en) | 2012-09-10 | 2018-08-28 | Genesky Diagnostics (Suzhou) Inc. | Multiplex nucleic acid analysis |
JP6484177B2 (ja) * | 2012-12-07 | 2019-03-13 | インヴァイティ コーポレイションInvitae Corporation | 多重核酸検出方法 |
CN103898199B (zh) * | 2012-12-27 | 2016-12-28 | 上海天昊生物科技有限公司 | 一种高通量核酸分析方法及其应用 |
JP2016513461A (ja) * | 2013-03-12 | 2016-05-16 | カウンシル,インコーポレーテッド | 出生前遺伝子分析システム及び方法 |
US9879313B2 (en) | 2013-06-25 | 2018-01-30 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
US11952622B2 (en) * | 2013-07-18 | 2024-04-09 | The Johns Hopkins University | Analysis of DNA-containing samples and resolution of mixed contributor DNA samples |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
CN106170558B (zh) | 2013-10-21 | 2021-10-29 | 金圣千 | 利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置 |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
EP2947156A1 (en) * | 2014-05-22 | 2015-11-25 | Qiagen GmbH | Optimization of sequencing reactions |
WO2015183836A1 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Brian Haynes | Compositions, methods, and uses related to ntrk2-tert fusions |
WO2015183837A1 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Brian Haynes | Compositions, methods, and uses related to ntrk2-tert fusions |
CN106715711B (zh) * | 2014-07-04 | 2021-09-17 | 深圳华大基因股份有限公司 | 确定探针序列的方法和基因组结构变异的检测方法 |
GB2536446B (en) * | 2015-03-17 | 2020-06-03 | Salisbury Nhs Found Trust | PCR method |
EP4119677B1 (en) | 2015-04-10 | 2023-06-28 | Spatial Transcriptomics AB | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
WO2017044993A2 (en) * | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Affymetrix, Inc. | Nucleic acid analysis by joining barcoded polynucleotide probes |
US11118216B2 (en) | 2015-09-08 | 2021-09-14 | Affymetrix, Inc. | Nucleic acid analysis by joining barcoded polynucleotide probes |
SG11201811799VA (en) | 2016-07-01 | 2019-02-27 | Kaneka Corp | Primer set, kit and method for detecting two or more target nucleic acids |
WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
CN107217101B (zh) * | 2017-06-30 | 2021-01-08 | 北京市农林科学院 | 适于农作物品种分子身份鉴别和确权鉴定的检测方法 |
EP3447152A1 (en) * | 2017-08-25 | 2019-02-27 | Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology | Accurate and massively parallel quantification of nucleic acid |
CN108004344B (zh) * | 2017-12-20 | 2020-11-03 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种玉米全基因组snp芯片及其应用 |
US11639928B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations |
CN112292460A (zh) | 2018-06-12 | 2021-01-29 | 主基因有限公司 | 核酸扩增方法 |
CN113474466A (zh) | 2019-02-21 | 2021-10-01 | 主基因有限公司 | 多倍体基因分型 |
KR20220038604A (ko) | 2019-05-30 | 2022-03-29 | 래피드 제노믹스 엘엘씨 | 표적 게놈 영역의 유연한 및 고처리량 시퀀싱 |
WO2020243579A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
WO2021072057A1 (en) * | 2019-10-08 | 2021-04-15 | The Johns Hopkins University | Highly multiplexed detection of nucleic acids |
CN116249785A (zh) | 2020-06-02 | 2023-06-09 | 10X基因组学有限公司 | 用于抗原-受体的空间转录组学 |
AU2021283174A1 (en) | 2020-06-02 | 2023-01-05 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid library methods |
EP4162074B1 (en) | 2020-06-08 | 2024-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
WO2022182682A1 (en) | 2021-02-23 | 2022-09-01 | 10X Genomics, Inc. | Probe-based analysis of nucleic acids and proteins |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100267023A1 (en) | 1992-09-24 | 2010-10-21 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
CA2255774C (en) * | 1996-05-29 | 2008-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
US6124092A (en) * | 1996-10-04 | 2000-09-26 | The Perkin-Elmer Corporation | Multiplex polynucleotide capture methods and compositions |
EP1130113A1 (en) * | 2000-02-15 | 2001-09-05 | Johannes Petrus Schouten | Multiplex ligation dependent amplification assay |
EP1319718A1 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-18 | Keygene N.V. | High throughput analysis and detection of multiple target sequences |
GB0304371D0 (en) * | 2003-02-26 | 2003-04-02 | Solexa Ltd | DNA Sequence analysis |
WO2005026389A2 (en) | 2003-08-29 | 2005-03-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Ligation-based method of analysis of single nucleotide polymorphisms on genomic dna |
CA2537134C (en) | 2003-09-02 | 2014-08-19 | Keygene N.V. | Ola-based methods for the detection of target nucleic acid sequences |
EP1602733A1 (en) * | 2004-06-02 | 2005-12-07 | Keygene N.V. | Detection of target nucleotide sequences using an asymmetric oligonucleotide ligation assay |
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